Статья тк рф перевод: ТК РФ Статья 72.1. Перевод на другую работу. Перемещение / КонсультантПлюс

Содержание

Увольнение работника из-за отказа переводиться на другую работу по медицинским показаниям. Разъясняет Аппарат прокуратуры области

18.05.2021г.

Разъясняет прокурор отдела по обеспечению участия прокуроров в гражданском процессе Т.М. Привороцкая.

Работника, нуждающегося в переводе на другую работу в соответствии с медицинским заключением, работодатель обязан перевести на другую имеющуюся у работодателя работу, не противопоказанную ему по состоянию здоровья (ч. 1 ст. 73 Трудового кодекса Российской Федерации (далее – ТК РФ).

Важными условиями для перевода является выдача заключения в порядке, установленном федеральными законами и иными нормативными правовыми актами Российской Федерации, а также наличие согласия работника на перевод, оформленного в письменном виде.

Порядок оформления и выдачи врачебной комиссией медицинского заключения о состоянии здоровья работника предусмотрен приказом Министерства Здравоохранения РФ от 28.01. 2021 № 29н «Об утверждении Порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 Трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры», приказом Минздрава Свердловской области от 19.10.2007 № 963-п «Об организации деятельности врачебных комиссий в медицинских организациях Свердловской области».

Если работник, нуждающийся в соответствии с медицинским заключением во временном переводе на другую работу, отказывается от предложенной работодателем работы или у работодателя отсутствует соответствующая работа, то работодатель обязан на весь указанный в медицинском заключении срок отстранить работника от работы с сохранением места работы (должности).

Если временный перевод на другую работу необходим работнику более чем на четыре месяца или работник нуждается в постоянном переводе на другую работу и работник отказывается от перевода либо у работодателя отсутствует соответствующая работа, то трудовой договор прекращается по п.

8 ч. 1 ст. 77 ТК РФ.

Особые правила установлены для работников, занимающих должности руководителей организаций (филиалов, представительств или иных обособленных структурных подразделений), их заместителей и главных бухгалтеров и нуждающихся в соответствии с медицинским заключением во временном или в постоянном переводе на другую работу.

Трудовой договор с такими работниками, в случае их отказа от перевода или при отсутствии у работодателя соответствующей работы, прекращается на основании ст.77 ТК РФ независимо от того, на какой срок в соответствии с медицинским заключением необходим им перевод на другую работу. Вместе с тем работодатель имеет право с письменного согласия указанных работников не прекращать с ними трудовой договор, а отстранить их от работы без сохранения заработной платы на срок, определяемый соглашением сторон.

При увольнении по указанному основанию работнику должно быть выплачено выходное пособие в размере двухнедельного среднего заработка (ч. 3 ст. 178 ТК РФ).

По указанному основанию не может быть уволена беременная женщина, поскольку согласно ч. 1 ст. 261 ТК РФ увольнение беременных женщин допускается только в случае ликвидации организации.

Согласно ст. 254 ТК РФ беременным женщинам в соответствии с медицинским заключением и по их заявлению снижаются нормы выработки, нормы обслуживания либо эти женщины переводятся на другую работу, исключающую воздействие неблагоприятных производственных факторов, с сохранением среднего заработка по прежней работе.

До предоставления беременной женщине другой работы, исключающей воздействие неблагоприятных производственных факторов, она подлежит освобождению от работы с сохранением среднего заработка за все пропущенные вследствие этого рабочие дни за счет средств работодателя.

Увольнение работника по п.8 ч.1 ст.77 ТК РФ не зависит от воли работодателя, поскольку в соответствии с ч.2 ст.212 ТК РФ работодатель обязан обеспечить недопущение работников к исполнению ими трудовых обязанностей в случае медицинских противопоказаний.

В соответствии с п.2.1. Определения Конституционного Суда РФ от 14.07.2011 № 887-О-О такое основание увольнения, как отказ работника от перевода на другую работу, необходимого ему в соответствии с медицинским заключением, или отсутствие у работодателя соответствующей работы, предусмотрено в целях недопущения выполнения работником работы, противопоказанной ему по состоянию здоровья, направлено на охрану здоровья работника и поэтому не может рассматриваться как нарушающее его права.

Вместе с тем с целью защиты права работника на труд работодатель обязан предложить все имеющиеся у него вакантные должности, которые он может занимать в соответствии со своим состоянием здоровья.

Нарушение работодателем предусмотренного законом порядка увольнения работника может являться основанием для признания увольнения незаконным в судебном порядке и восстановления его на работе.

Как предоставить отпуск: инструкция для кадровика

Три общих правила

Эти правила определены гл. 19 ТК РФ. О них часто забывают, между тем при проверке это может стать поводом для взыскания.

Правило 1. Работодатель обязан предоставлять сотрудникам оплачиваемый отпуск ежегодно (ст. 122 ТК РФ)

В нарушение этого правила руководители зачастую идут на поводу у сотрудников и предоставляют отпуск, только когда человек сам попросит. Если хотите соблюдать трудовое законодательство, варианта «работник не хочет идти в отпуск, переносит на следующий год» просто не должно быть.

Правило 2. Отдельным категориям сотрудников работодатель обязан предоставлять оплачиваемый отпуск в удобное для них время

К таким категориям относятся несовершеннолетние работники, почетные доноры России, родители трех и более детей в возрасте до 18 лет и пр. Когда будете составлять график отпусков на следующий год, возьмите с них заявление с пожеланием удобного времени отдыха. Но будьте готовы, что даже при наличии заявления сотрудник в любой момент может передумать и попросить отпуск в другое время.

Вопрос. Сотрудник — ветеран боевых действий попросил дать ему ежегодный отпуск с завтрашнего дня. Можно ли отказать со ссылкой на невозможность выплатить отпускные за три дня до начала?

Ответ. Работодатель обязан удовлетворить просьбу работника, так как законодатели не предусмотрели никаких исключений в порядке предоставления отпуска такой категории работников. Это подтверждает судебная практика (Определение Санкт-Петербургского городского суда от 13.02.2012 № 33-1972/2012, Апелляционное определение Московского городского суда от 14.05.2015 по делу № 33-8626).

Правило 3. Право на отпуск за первый год возникает после шести месяцев непрерывной работы у работодателя (ст. 122 ТК РФ). По этой причине не включайте в график на текущий календарный год сотрудников, которые только поступили на работу. Чтобы отпустить новичка в отпуск после шести месяцев работы, вам потребуется только взять с него заявление. Впрочем, по договоренности с работодателем сотрудник может отдохнуть и раньше.

Алгоритм предоставления ежегодного оплачиваемого отпуска по графику отпусков

Составить и утвердить график отпусков

Согласно ст. 123 ТК РФ очередность предоставления оплачиваемых отпусков определяет ежегодный график отпусков. Работодатель утверждает документ с учетом мнения выборного органа первичной профсоюзной организации. Если профсоюза нет — единолично. График нужно утвердить не позднее чем за две недели до начала календарного года. Вы можете использовать унифицированную форму Т-7 или разработать свою.

Предупреждаем риски. Если в графе 5 «Количество календарных дней» указана лишь часть от положенного отпуска, возьмите с работника письменное согласие как доказательство достигнутого соглашения сторон (ст. 125 ТК РФ). Оптимальным вариантом будет заявление с просьбой в следующем календарном году разделить оплачиваемый отпуск на части с указанием продолжительности каждой.

Заявление должно быть оформлено до даты утверждения графика отпусков. Это важно, потому что понятия «ознакомлен» и «согласен» влекут за собой разные правовые последствия. График отпусков — это локальный акт, который работодатель утверждает в одностороннем порядке. Недостаточно просто ознакомить с ним сотрудника, важно заручиться его согласием до утверждения графика.

Заявление от работника о предоставлении части ежегодного отпуска и дальнейшее ее предоставление работодателем рассматривается судьями как доказательство соглашения между работником и работодателем (Решение Пермского краевого суда от 19.04.2017 по делу № 7-674-2017(21-421/2017).

Чек-лист. На что обращают внимание инспекторы ГИТ при проверке графика отпусков:

Дата утверждения графика отпусков	Не позднее чем за две недели до начала календарного года	ч. 1 ст. 123 ТК РФ
Оплачиваемый отпуск на основании графика	Планируется и используется фактически полностью	ст. 123, 124 ТК РФ
Оплачиваемый отпуск на основании графика	Планируется и (или) используется частями на основании достигнутого соглашения сторон, одна из частей — не менее 14 календарных дней	ст. 125 ТК РФ
Ознакомление с графиком отпусков	С графиком отпусков работник ознакомлен под роспись	Письмо Роструда от 01.08.2012 № ПГ/5883-6-1

Ознакомить сотрудников с графиком отпусков под роспись

С одной стороны, в ТК РФ нет нормы, обязывающей работодателя знакомить работников с графиком отпусков под роспись. С другой, специалисты Роструда в Письме от 01.08.2012 № ПГ/5883-6-1 квалифицировали график отпусков как локальный нормативный акт и потребовали выполнения нормы ст. 22 ТК РФ. Актуальная инспекционная и судебная практика подтверждают такой подход: Постановление Верховного Суда РФ от 01.11.2018 № 3-АД18-7, Постановление Калининградского областного суда от 22.04.2016 № 4А-170/2016, Решение Белгородского областного суда от 29.

08.2016 по делу № 7(2)-382/2016.

Как можно ознакомить с графиком отпусков:

Дополнить унифицированную форму Т-7 графой 11, в которой после утверждения графика сотрудники будут ставить свои подписи.
Разработать отдельный лист ознакомления к графику отпусков.

Известить сотрудника о времени начала отпуска

Форма извещения трудовым законодательством не уточнена, но определены два условия (Письмо Роструда от 30.07.2014 № 1693-6-1). Сотруднику нужно сообщить о начале отпуска:

не позднее чем за две недели;
под роспись.

При этом форма документа может быть любая:

извещения в двух экземплярах: один — работнику, второй с отметкой и подписью работника о получении экземпляра — работодателю;
служебная записка;
собственная форма графика отпусков с графой 11 «О времени начала отпуска извещен. Дата. Подпись» и пр.

Последний вариант позволяет убить двух зайцев: известить о начале отпуска и подтвердить, что работник ознакомлен с графиком.

Главное, при выборе способов извещения понимать, что если вы не выполните два основных условия, организацию могут привлечь к административной ответственности по ч. 1 ст. 5.27 КоАП РФ.

Предупреждаем риски. Если отпуск предоставляется в соответствии с графиком отпусков, работник не пишет заявление на отпуск. Это обязанность работодателя известить его. Заявления на отпуск появляются, когда есть отклонения от графика, например, работник хочет отгулять лишь часть отпуска или возникли законные обстоятельства для его переноса.

Издать приказ о предоставлении отпуска и ознакомить с ним работника под роспись

В настоящее время нет ни одного нормативного правового акта, обязывающего работодателей издавать приказ на отпуск. Но на практике большая часть компаний его оформляют. К этому привыкли и проверяющие из ГИТ. Известны случаи, когда работодателей привлекали к ответственности за отсутствие приказа на отпуск или за неознакомление с ним работника. Нельзя сказать, что такая практика правомерна, но она существует (Решение Московского городского суда от 08.02.2019 по делу № 7-648/2019, Решение Верховного Суда РФ от 01.03.2017 № 84-АД17-1).

Поэтому если вы решили оптимизировать кадровое делопроизводство и исключить приказ о предоставлении отпуска из документооборота, учитывайте и такой вариант развития событий.

Для оформления и учета отпусков есть унифицированные формы № Т-6 «Приказ (распоряжение) о предоставлении отпуска работнику» и № Т-6а «Приказ (распоряжение) о предоставлении отпуска работникам» ( Постановление Госкомстата России от 05.01.2004 №1), но вы можете разработать свою форму.

Основанием для приказа является сам график отпусков. В приказе укажите номер и дату, табельный номер, ФИО, должность работника, структурное подразделение, рабочий год, за который предоставляется отпуск.

Рабочий год исчисляется с даты приема на работу, но всегда проверяйте себя: могут быть периоды, которые сдвинут окончание рабочего года.

Вопрос. Если работник принят на работу 1 июня 2020 года, в декабре 2020-го он находился 20 дней в отпуске без содержания, как определить рабочий год для исчисления ежегодного оплачиваемого отпуска?

Ответ. Если работнику предоставлялось 20 дней отпуска без сохранения заработной платы в декабре, то окончание первого рабочего года сдвинется на 6 дней: из 20 дней отпуска без сохранения в рабочий год включаются 14 дней, а окончание отпуска сдвигается на 6 календарных дней (ч. 1 ст. 121 ТК РФ, Письмо Роструда от 14.06.2012 № 854-6-1). Таким образом, первый год закончится не 31 мая, а 6 июня 2021 года. Соответственно, второй рабочий год начнется с 7 июня 2021 года и закончится 6 июня 2022 года.

Срок издания приказа на отпуск законодательством не установлен. Учитывайте время, необходимое для подписания, передачи в бухгалтерию и пр.

Оформить записку-расчет о предоставлении отпуска работнику

Курсы для кадровика

Повышение квалификации, профпереподготовка. Онлайн-тесты. Удостоверения и дипломы

Посмотреть программы

Записка-расчет — необязательный документ, но зачастую она необходима для расчета причитающихся работнику отпускных. Решая вопрос, надо или нет составлять ее, ориентируйтесь на внутренние правила своего работодателя.

Вы можете использовать унифицированную форму
№ Т-60 (Постановление Госкомстата России от 05.01.2004 № 1) или разработать свою. Важно оформить записку-расчет заранее, чтобы бухгалтерия успела выплатить отпускные работнику в срок — не позднее чем за три дня до начала отпуска.

Работники кадровых служб заполняют только первый лист записки-расчета, вносят номер и дату составления записки-расчета, табельный номер, ФИО, должность работника, структурное подразделение, в котором он работает, и период работы, за который предоставляется отпуск. Второй лист содержит расчет оплаты отпуска, начислений и удержаний, а также общей суммы к выплате и заполняется бухгалтерией.

Записка-расчет — это внутренний документ, который необходим только для взаимодействия кадровой службы и бухгалтерии. Ее не нужно выдавать работнику, поэтому оформлять можно только в электронном виде.

Выплатить работнику отпускные

В соответствии с ч. 9 ст. 136 ТК РФ оплата отпуска производится не позднее чем за три дня до его начала. Речь идет именно о календарных днях. Если отпуск начинается в понедельник, последний день для выплаты отпускных — четверг (Письмо Роструда от 14.05.2020 № ПГ/20884-6-1, Письмо Минтруда России от 05.09.2018 № 14-1/ООГ-7157).

Внести сведения об отпуске в личную карточку работника

После 1 сентября 2021 года вопрос, вести или нет личные карточки Т-2 для кадрового учета, работодатель может решить самостоятельно. Единственный нормативный правовой акт, обязывающий вести личные карточки на бумажном носителе, — Постановление Правительства РФ от 16.04.2003 № 225 — с 1 сентября утрачивает силу в связи с Постановлением Правительства РФ от 24.07.2021 № 1250.

Обратите внимание: личная карточка — это единственный документ в кадровом делопроизводстве для учета сведений о предоставляемых отпусках.

Если вы продолжаете их заполнять, то в разделе VIII указывайте вид отпуска — «ежегодный основной оплачиваемый», период работы, за который он предоставляется, количество календарных дней, даты начала и окончания, а также основание — реквизиты приказа об отпуске. С записью в личной карточке знакомить сотрудника не нужно.

Работодатели должны продолжать вести личные карточки Т-2 для целей воинского учета. Минобороны пока не утвердил новую форму.

Внести сведения об отпуске в табель учета рабочего времени

Работодатель обязан вести учет фактически отработанного сотрудниками времени (ст. 91 ТК РФ). Если для этого вы используете унифицированные формы № Т-12 или № Т-13, дни ежегодного основного оплачиваемого отпуска работника отметьте буквенным кодом «ОТ» или цифровым «09».

Внести в график отпусков данные о фактически использованных днях отпуска

Если вы используете унифицированную форму графика отпусков № Т-7, дату фактического начала отпуска ставьте в графе 7. Не надо ждать окончания года, заполняйте в режиме реального времени.

Если фактическая дата отличается от планируемой, обязательно в графе 8 укажите документ, на основании которого отпуск переносится, а в графе 9 — дату переноса отпуска.

Даты могут отличаться только по причинам, названным в ст. 124 ТК РФ, и в случае, когда работник просит предоставить часть отпуска (ст. 125 ТК РФ).

Вместо заключения

Предоставление отпуска требует от кадрового сотрудника знания трудового законодательства и соблюдения определенной последовательности действий.

Главное правило: нельзя нарушать обязательные требования, предусмотренные законодательством. Серьезными нарушениями будет отказаться от графика отпусков или утверждать его позже чем за две недели до начала календарного года, не извещать сотрудников о начале отпуска или не предоставлять отпуск в полном размере. В этих случаях работодатель может быть привлечен к административной ответственности по ч. 1 ст. 5.27 КоАП РФ.

Подробная инструкция поможет оформлять ежегодные отпуска без ошибок, а приведенный ниже чек-лист — проверить себя.

Порядок предоставления основного оплачиваемого отпуска согласно графику

Работник извещен о времени начала отпуска под роспись не позднее чем за две недели до его начала	ч. 3 ст. 123 ТК РФ
Издан приказ о предоставлении отпуска, с которым работник ознакомлен под роспись	сложившаяся практика
Работнику выплачены отпускные не позднее чем за три дня до начала отпуска	ч. 9 ст. 136 ТК РФ
Заполнена графа 7 «Дата фактическая» графика отпусков, она совпадает с графой 6 «Дата запланированная»	ч. 2 ст. 123, ч. 2 ст. 124 ТК РФ
Заполнен раздел VIII «Отпуска» личной карточки Т-2	с 01.09.2021 г. необязательно
За дни нахождения в отпуске в табеле проставляется соответствующий код	ст. 91 ТК РФ

Шпаргалка

В шпаргалке собрана полезная информация из статьи:

График отпусков 55 КБ
Заявление на деление отпуска на части 658.6 КБ
Личная карточка сотрудника 666.9 КБ
Приказ о предоставлении отпуска 687.4 КБ

Скачать

Статья 72.

1 ТК РФ. Перевод на другую работу. Перемещение. Комментарии

В статье 72.1 ТК изложены основные нюансы перемещения/перевода сотрудника на другую позицию. В ней приведено определение понятия перевода, описаны необходимые для него действия, а также указаны ограничения по его использованию нанимателем.

Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ

Содержание ст. 72.1 ТК

В её начале даётся определение перевода. Указывается, что он может иметь следующие формы:

изменение трудовой функции;
и/или соответствующее изменение в подразделении, где задействован работник, если оно упоминается в трудовом договоре;
или перевод внутри организации на иную территорию.

Подчёркнуто, что во всех вариантах сотрудник должен продолжать числиться у того же нанимателя.

Указано, что в любом из трёх упомянутых форматов перевод возможен лишь на основе письменного подтверждения служащего. Исключения касаются ситуаций, разобранных в ст. 72.2 ТК.

Разобран и случай, когда сотрудник высказывает желание перевестись к другому нанимателю на работу постоянного характера. Это возможно по просьбе или с согласия сотрудника. В этой ситуации трудовой договор с прежним нанимателем прекращает действие по ч. 1. ст. 77 ТК. В обоих случаях от желающего перевестись работника требуется оформить своё мнение в письменной форме.

Далее разбираются ситуации с перемещением. Оно отличается тем, что нанимателю не нужно согласие подчинённого. Это возможно, если подчинённый:

перемещается на другое место у того же нанимателя;
перемещается в подразделение организации, территориально находящееся в той же местности;
начинает трудиться на оборудовании, близком к тому, на котором он работал ранее.

Также необходимо, чтобы всё вышеперечисленное не влекло изменения параметров актуального трудового договора.

В заключительной части подчёркивается, что нанимателю запрещается переводить/перемещать подчинённого на должность, которая противопоказана для него по медицинским показателям.

Итак, рассмотренная статья подробно разбирает основные моменты, связанные с переводом/перемещением сотрудника, и определяет, какие ограничения действуют по реализации этих возможностей на практике.

Вопросы по аспектам применения ст. 72.1 ТК

Как можно отличить перевод сотрудника от его перемещения?

Отличия ясно расписаны в рассмотренной статье. Итак, перевод возникает, если:

наниматель перемещает подчинённого на другую позицию, вследствие чего возникает изменение его должностной функции;
в подразделении, где действует подчинённый, возникают значимые изменения, затрагивающие трудовую сферу;
наниматель перемещает подчинённого на другую территорию.

Перемещением являются ситуации, когда:

подчинённый переходит на другое рабочее место, без изменения его должностных обязанностей;
подчинённый переходит на подобную позицию в другое местное подразделение;
подчинённый начинает трудиться на оборудовании, близком к тому, на котором он ранее работал.

Ключевым в их различии является изменение понятий, заранее прописанных сторонами в трудовом договоре. Если они меняются, то речь идёт о переводе. В противном случае – о перемещении.

Какие особенности перевода подчинённого в другое территориальное подразделение нужно учитывать руководителю?

В первую очередь необходимо помнить, что наниматель обязан компенсировать подчинённому затраты на переезд (ст. 169 ТК). Также необходимо понимать, что именно считается другой территорией – для этого нужно изучить Постановление Пленума ВС №2 от 17.03.04. В части 3 этого Постановления как раз рассмотрено понятие другой местности с точки зрения трудового права – оно определено, как территория за пределами установленных границ данного населённого пункта. Помимо этого, руководству нужно иметь в виду, что подчинённый может вовсе отказаться от такого перевода, прекратив трудовые отношения, на что указывает ст. 77 ТК.

Перевод или перемещение по рассматриваемой статье происходят по инициативе нанимателя?

Не обязательно, т. к. подчинённый вправе обратиться к руководству с соответствующей просьбой. Но она рассматривается менеджером именно как предложение, которое он может как удовлетворить, так и отказать в его выполнении. Исключения возможны в ситуациях, которые особо рассмотрены в ТК. Так, как указывает ст. 220 ТК, наниматель обязан обеспечить подчинённого новой работой, если на прежней невозможно трудиться из-за опасностей для жизни/здоровья.

Статья ТКРФ 72.2. Временный перевод на другую работу

Комментарий к статье 72.2

1. Общий принцип стабильности трудового правоотношения (см. ст. ст. 60, 72 и комментарий к ним) распространяет свое действие и на случаи временных переводов на другую работу. Это означает, что, как правило, изменение содержания трудовой функции и (или) обусловленного договором места применения труда осуществляется исключительно по соглашению сторон, заключаемому в письменной форме (о форме соглашения при переводе см. п. 4 комментария к ст. 72 ТК).

Вместе с тем законодателем устанавливаются некоторые дополнительные правила императивного характера, связанные с обеспечением принципа стабильности трудового правоотношения. В силу ч. 1 ст. 72.2 если по окончании срока перевода прежняя работа работнику не предоставлена, а он не потребовал ее предоставления и продолжает работать, то условие о временном характере перевода утрачивает силу и перевод считается постоянным. Таким образом, сам факт допуска работника к работе после наступления даты, обозначенной в соглашении о переводе в качестве момента окончания срока перевода, означает достижение сторонами нового соглашения о том, что новая работа является для работника постоянной. Применительно к переводу для замещения временно отсутствующего работника такое соглашение презюмируется для случая, когда этот работник вышел на работу и в то же время переведенный работник также не освобожден от исполнения работы по переводу.

Следует обратить внимание на то, что данное правило применяется и к тем случаям, когда изменение трудовой функции выразилось в возложении на работника выполнения работ по иной должности, специальности или профессии без освобождения от прежней работы, т. е. в случаях совмещения профессий, должностей или расширении зоны обслуживания (см. ст. 60.2 ТК и комментарий к ней).

Поскольку в ч. 1 ст. 72.2 устанавливаются правила временного перевода на другую работу у того же работодателя, эти правила не распространяются на случаи временного перевода работника к другому работодателю. Следовательно, в последнем случае не требуется в силу закона обязательного письменного оформления соглашения о переводе (хотя письменная форма является целесообразной), исключительно соглашением сторон определяются условия перевода, включая и условие о его продолжительности; соответственно, не действует и правило, установленное указанной статьей относительно трансформации временного перевода в постоянный. В случае если возникнет потребность перехода работника на работу к работодателю по месту перевода, такой переход должен осуществляться по правилам увольнения в порядке перевода к другому работодателю либо путем увольнения работника по собственному желанию с последующим заключением трудового договора с новым работодателем.

2. Работодатель вправе переводить работника на не обусловленную трудовым договором работу для предотвращения экстраординарных случаев, указанных в ч. ч. 2 и 3 ст. 72.2, либо устранения их последствий. В связи с этим Верховный Суд РФ указывает (п. 17 Постановления Пленума от 17 марта 2004 г. N 2), что при применении ч. ч. 2 и 3 ст. 72.2 Кодекса, допускающих временный перевод работника на другую работу без его согласия, судам следует иметь в виду, что обязанность доказать наличие обстоятельств, с которыми закон связывает возможность такого перевода, возлагается на работодателя.

Перевод на другую работу в указанных случаях регламентируется федеральным законом, поэтому право работодателя осуществить такой перевод, как и обязанность работника выполнять новую работу, вытекает непосредственно из закона, вне зависимости от того, предусмотрено ли это в качестве условия трудового договора. При этом под работой, не обусловленной трудовым договором, понимается работа, которая может находиться за рамками трудовой функции, обусловленной трудовым договором.

Рассматриваемый перевод относится к категории переводов, осуществляемых по инициативе работодателя (см. п. 6 комментария к ст. 72.1 ТК). Отказ работника от перевода является дисциплинарным проступком, влекущим дисциплинарную ответственность.

Поскольку указанная внедоговорная обязанность чревата возникновением феномена принудительного труда, законодатель обставляет ее реализацию рядом внедоговорных организационно-правовых условий.

Перевод в порядке ст. 72.2 ТК: а) возможен при наличии фактических обстоятельств экстраординарного характера; б) является временным; в) может быть осуществлен только у того же работодателя; г) допускается при сохранении за работником права на труд определенного качества.

3. Перечень случаев экстраординарного характера, являющихся основанием для перевода работника, приводится в ч. ч. 2 и 3 ст. 72.2 ТК. Если работодатель осуществил перевод работника под предлогом производственной необходимости при отсутствии исключительных случаев, свидетельствующих о реальной необходимости такого перевода, он признается незаконным.

Судебная практика исходит из того, что рассматриваемый перевод возможен, если у работодателя отсутствовала возможность иным путем предотвратить или ликвидировать указанные в ст. 72.2 причины. Недостатки в организации труда не могут служить основанием для такого перевода.

4. Перевод в порядке ст. 72.2 ТК допускается на срок не более одного месяца. Поскольку законом ограничивается лишь предельный срок, но не число переводов, такой перевод может иметь место неоднократно, однако всякий раз при наличии соответствующей причины исключительного характера.

Если действие причины, обусловившей рассматриваемый перевод, продолжается более месяца, работнику может быть поручено выполнение работы за пределами обусловленной трудовой функции или места работы (структурного подразделения) при условии получения на это его согласия.

5. В соответствии с действующим Кодексом рассматриваемый перевод допускается исключительно у данного работодателя. При этом не имеет значения то, что обстоятельство, обусловившее такой перевод, может возникнуть у другого хозяйствующего субъекта.

Временный перевод к другому работодателю для устранения указанных обстоятельств возможен только с согласия переводимого работника.

В то же время следует обратить внимание на то, что законодатель никак не ограничивает возможность перевода в связи с обстоятельствами, указанными в комментируемой статье, в подразделение организации работодателя, находящееся в другой местности, в том числе в обособленное структурное подразделение.

6. При переводе в порядке ст. 72.2 ТК работнику не может быть поручена работа, противопоказанная ему по состоянию здоровья.

Поручение переводимому работнику работы более низкой квалификации по сравнению с обусловленной трудовым договором возможно только с письменного согласия работника.

7. Перевод для замещения временно отсутствующего работника является частным случаем временных переводов рассматриваемого вида. В отличие от ранее действовавшего порядка в настоящее время он осуществляется на основании общих правил, установленных для временных переводов ст. 72.2 ТК.

8. Перевод на другую работу в случаях, указанных в ст. 72.2 ТК, оформляется приказом (распоряжением) работодателя, в котором должны быть указаны основание и срок перевода, поручаемая работнику работа и условия оплаты труда (по выполняемой работе, но не ниже среднего заработка по прежней работе).

9. Приказ работодателя о переводе обязателен для работника, и необоснованный отказ от него является дисциплинарным проступком, влекущим дисциплинарную ответственность.

В том случае, когда работник не выходит на работу либо выходит к прежнему рабочему месту, такие его действия должны рассматриваться как прогул. Если же работник выходит на новое рабочее место, отказываясь при этом выполнять соответствующую работу, подобные действия следует трактовать как длящееся дисциплинарное правонарушение, за которое может быть объявлено несколько дисциплинарных взысканий, включая увольнение за неоднократное неисполнение трудовых обязанностей (п. 5 ст. 81 ТК).

Вместе с тем следует учитывать, что в силу абз. 5 ст. 219, ч. 7 ст. 220 ТК работник не может быть подвергнут дисциплинарному взысканию за отказ от выполнения работ в случае возникновения опасности для его жизни и здоровья вследствие нарушения требований охраны труда, за исключением случаев, предусмотренных федеральными законами, до устранения такой опасности либо от выполнения тяжелых работ и работ с вредными и (или) опасными условиями труда, не предусмотренных трудовым договором. Поскольку Кодекс не содержит норм, запрещающих работнику воспользоваться названным правом и тогда, когда выполнение таких работ вызвано переводом по основаниям, указанным в ст. 72.2 Кодекса, отказ работника от временного перевода на другую работу в порядке ст. 72.2 Кодекса по указанным выше причинам является обоснованным (п. 19 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 17 марта 2004 г. N 2).

Комментарии к Трудовому кодексу Российской Федерации

Издательский Дом «Городец», 2007

Источник: СПС Консультант

Работник стал инвалидом – увольнение или перевод на другую работу?

Если сотруднику была установлена инвалидность и ему противопоказана любая трудовая деятельность, работодатель должен расторгнуть с ним трудовой договор на основании п.

5 ч. 1 ст. 83 ТК РФ, в котором сказано, что трудовой договор подлежит прекращению по обстоятельствам, не зависящим от воли сторон, при признании работника полностью неспособным к трудовой деятельности в соответствии с медицинским заключением, выданным в порядке, установленном федеральными законами и иными нормативными правовыми актами РФ. Документом — основанием для увольнения по п. 5 ч. 1 ст. 83 ТК РФ является справка медико-социальной экспертизы.

Кроме того, работодателю необходимо учитывать положения ст. 184 ТК РФ, в которой сказано, что при повреждении здоровья или в случае смерти работника вследствие несчастного случая на производстве либо профессионального заболевания работнику (его семье) возмещаются утраченный им заработок (доход), а также связанные с повреждением здоровья дополнительные расходы на медицинскую, социальную и профессиональную реабилитацию либо соответствующие расходы в связи со смертью работника.

Если сотруднику установлена инвалидность и ему необходим более легкий труд, согласно ч. 3 ст. 73 ТК РФ, если в соответствии с медицинским заключением работник нуждается во временном переводе на другую работу на срок более четырех месяцев или в постоянном переводе, при его отказе от перевода либо отсутствии у работодателя подходящей работы трудовой договор с ним прекращается по п. 8 ч. 1 ст. 77 ТК РФ. В этом пункте указано, что основанием для прекращения трудового договора является, в частности, отказ работника от перевода на другую работу, необходимого ему в соответствии с медицинским заключением, выданным в порядке, предусмотренном федеральными законами и иными нормативными правовыми актами РФ, либо отсутствие у работодателя соответствующей работы (ч. 3 и 4 ст. 73 ТК РФ). При этом увольняемому работнику в таком случае выплачивается выходное пособие в размере двухнедельного среднего заработка (ч. 3 ст. 178 ТК РФ).

При увольнении работника до окончания того рабочего года, в счет которого он уже получил ежегодный оплачиваемый отпуск, за неотработанные дни отпуска выплаты не производятся, если работник увольняется по основаниям, предусмотренным п. 8 ч. 1 ст. 77 или п. 5 ч. 1 ст. 83 ТК РФ (абз. 5 ч. 2 ст. 137 ТК РФ).

Согласно ст. 182 ТК РФ при переводе работника, нуждающегося в соответствии с медицинским заключением, выданным в порядке, установленном федеральными законами и иными нормативными правовыми актами РФ, в предоставлении другой работы, на другую нижеоплачиваемую работу у данного работодателя за ним сохраняется средний заработок по прежней работе:

Статья 72.1. Перевод на другую работу. Перемещение

Перевод работника с временной на постоянную работу

Сотрудники учреждений могут получить статус временных по ряду причин. Одной из них является замещение другого специалиста на должности, если он ушел в административный отпуск, декрет и т.п. Но прежний работник может впоследствии уволиться. В этом случае непременно встанет вопрос, как принятого ранее перевести с временной должности на постоянную работу. Процедура не подразумевает сложную схему действий. Не обязательно составлять заявление с просьбой уволить, а следом за ним — с требованием принять вновь. Однако есть некоторые нюансы, которые стоит учесть. Они связаны с оформлением бумаг.

Перевод с временной должности на постоянную по Трудовому кодексу РФ

Статья 58 ТК РФ предполагает наличие определенных требований. Срочный трудовой договор может потерять силу, если ни сотрудник, ни работодатель ранее не запросили расторжения документа из-за его просроченной даты. При этом специалист как и раньше осуществляет свои функции после того, как срок действия договора истек.

Внимание

После того, как срочный трудовой договор потерял силу, он автоматически переходит в статус заключенного на неопределенное время. Потребуется дополнительное соглашение. В нем будет указано, что договор бессрочен, а работа меняет характер с временной на постоянную.

Необходимые документы

Перечень документов, необходимых для оформления статуса постоянной работы внутри организации:

Заявление от специалиста с просьбой оформить его на постоянную должность. Его следует написать до того, как закончится действие временного договора. Документ оформляется на имя первого лица компании.
Приказ о переводе работника с временной на постоянную работу, оформленный на основании заявления. В нем указываются данные:
-вид и причины переоформления;
-инициалы специалиста;
-прежнее и новое места занятости;
-номер, дата подписания и окончания заключенного прежде трудового документа.

Новый договор. В нем должны быть отражены должность, зарплата, права и обязательства. Составляется в двух экземплярах. Подписывается обеими сторонами, закрепляется печатью предприятия.
Должностная инструкция. Также потребуется отметка в трудовой книге с указанием должности, даты и номера приказа.
Приказ о том, что изменилось штатное расписание и отпускной график работника.

К сведению

Есть альтернативный способ оформления — расторгнуть временный договор. Но в этом случае прерывается стаж. Потребуются новые приказ, карточка, дело. Эта процедура — вынужденная мера. К ней прибегают лишь тогда, когда до истечения временного документа не были подготовлены нужные бумаги для переоформления на постоянную работу.

Все документы требуют подписей обеих сторон и заверяются печатью организации.

Приказ о переводе сотрудника на постоянную работу

Приказ на перевод работника на постоянную работу имеет унифицированную форму № Т-5. Бланк с учетом согласия специалиста, данного в письменной форме, заполняет сотрудник отдела кадров.

Пошаговая инструкция перевода

Специфика процедуры перевода работника на постоянную работу состоит в том, что она может осуществляться и внутри организации и с переходом к другому работодателю. Для внутреннего перевода достаточно приказа и записи в трудовой книжке. Для внешнего потребуется уволиться у одного работодателя и подать заявление о приеме у другого.

Пошаговый инструктаж.

При внешнем переоформлении новый работодатель составляет письменное заявление на ФИО руководителя предыдущего учреждения, где задействован сотрудник. В приглашении указываются инициалы специалиста, его должность, а также дата планируемого поступления в новую организацию. Письму присваивается номер и дата, оно заверяется печатью учреждения и подписывается директором.
Нынешний руководитель составляет письмо будущему начальнику. Далее следует ответ-согласие нового руководителя, заверенное подписью и печатью.
Уведомление о внешнем переводе на постоянную работу составляется минимум за 8 недель до совершения процедуры. Потребуется согласие работника в письменном виде. В нем он должен будет указать, что знаком с текстом уведомления.
Приказ об увольнении-переводе составляется со ссылкой на Статью 77 ТК РФ. Документ заверяется печатью и подписью руководителя. Кроме того, в нем расписывается и сотрудник.
Завершается часть процедуры записью в трудовой об увольнении и переходе в иное учреждение. После этого уволенный получает деньги под расчет и его личная карточка закрывается.
Специалист, получивший книжку, составляет заявление с требованиями принять его на постоянное трудоустройство, с ним заключают договор, не предполагающий испытательного срока. Также формируется приказной документ о приеме на должность посредством перевода из другого учреждения. Оформляется новая личная карточка.
При внутреннем переоформлении специалиста письменно ставят в известность о процедуре перевода работника с временной на постоянную работу за два месяца до начала составления. Сотрудник заверяет согласие подписью с датой или заявлением.
Заключается допсоглашение к договору с учетом изменившихся обязанностей. На основании соглашения создается приказ. Оговаривается должность, инициалы, подразделение перевода, сумма зарплаты.
В трудовой книжке прописываются соответствующие данные.

Перевод работника с постоянной работы на временную

Устройство временного сотрудника происходит со ссылкой на Статью 59 ТК РФ. Согласно ее требованиям составляется срочный договор с работником, подразумевающий определенный срок действия.

Этапы перевода.

Оформляемый составляет заявительное письмо с присвоенным порядковым номером на имя руководящего персонала.
Снимаются копии документов будущего временного работника — паспортные данные, СНИЛС, ИНН, диплом. Возможно, потребуются водительские права и медицинская книжка.
Оформляется приказ о приеме. В строке «условия» прописывается «временно» с обозначением дат. Подписывается обеими сторонами.
Формируется срочный трудовой документ, где прописываются права, обязанности и характер занятости. Если предполагается временное оформление на место основного специалиста, то указываются инициалы основного человека. Прописываются порядок оплаты, часы работы. В определенных случаях срочный договор требует дополнительных соглашений. Обычно речь идет о ситуациях, когда основной персонал продлевает отпуск по разным причинам.
Комплектуется личное дело временного работника, создается личная карточка.

Нюансы

Нюансы переоформления временного специалиста на постоянную работу важны для тех, кто желает свести к минимуму количество ошибок. Нужно знать точные формулировки терминов ТК РФ, а также процесс составления документов, количество требуемых образцов и другую информацию.

Перевод — назначение на определенную должность, требующее согласие от сотрудника.
Соглашение о переоформлении подразумевает основные моменты процедуры, формируется в двух экземплярах, подписывается и сотрудником, и руководителем.
Срок перехода — временной отрезок, в течение которого происходит данная процедура. Оговаривается индивидуально с сотрудником.
Трудовой договор отражает данные о правах, ответственности, размере оклада.

Псевдоуридинилирование кодирующих последовательностей мРНК изменяет трансляцию

Значимость

Посттранскрипционная модификация информационных РНК (мРНК) представляет собой новый рубеж в регуляции генов. Понимание биологических последствий одной из наиболее распространенных модификаций мРНК, псевдоуридина, в клетках осложняется субстехиометрическим наличием модификаций мРНК и трудностью отделения влияния на трансляцию от стабильности мРНК. Здесь мы использовали биохимические и структурные исследования in vitro вместе с клеточными анализами, чтобы продемонстрировать, что псевдоуридин препятствует удлинению трансляции и увеличивает частоту аминокислотных замен.Наша работа поддерживает идею о том, что модификации мРНК могут модулировать трансляционную способность мРНК, и предоставляет доказательства того, что псевдоуридин может изменять отбор тРНК рибосомой. Это исследование представляет собой биохимическую основу для лучшего понимания последствий модификаций в кодирующих областях мРНК.

Abstract

Уже давно установлено, что химические модификации РНК являются ключевыми модуляторами структуры и функции небелковых РНК в клетках. Растет понимание того, что последовательности информационной РНК (мРНК), ответственные за управление синтезом белка, также могут быть модифицированы посттранскрипционно.Ферментативное включение модификаций мРНК имеет множество потенциальных результатов, включая изменение стабильности мРНК, рекрутирование белков и трансляцию. Мы проверили, как одна из наиболее распространенных модификаций, присутствующих в кодирующих областях мРНК, псевдоуридин (), влияет на синтез белка с использованием полностью реконструированной бактериальной системы трансляции и человеческих клеток. Наша работа показывает, что замена одного уридинового нуклеотида на в кодоне мРНК препятствует добавлению аминокислоты и активации EF-Tu GTPase. Кристаллическая структура рибосомы Thermus thermophilus 70S с тРНК ^Phe, связанной с кодоном ΨUU в сайте A, подтверждает эти выводы.Мы также обнаружили, что присутствие может способствовать синтезу нескольких пептидных продуктов на низком уровне из одной последовательности мРНК в восстановленной системе трансляции, а также в клетках человека, и увеличивает скорость реакции близкородственной Val-тРНК ^Val. на кодоне ΨUU. Подавляющее большинство фрагментов в мРНК обнаруживаются в кодирующих областях, и наше исследование предполагает, что одним из последствий столкновения с рибосомами Ψ может быть небольшое изменение как скорости трансляции, так и декодирования мРНК.

Нуклеозиды в информационных РНК (мРНК) можно ферментативно модифицировать посттранскрипционно (1, 2), чтобы расширить химические и топологические свойства этих важных биомолекул.Полнотранскриптомное картирование индивидуальных модификаций выявило наличие модификаций как в нетранслируемых, так и в кодирующих белки областях мРНК (2, 3). Локализация модификаций по всей мРНК предполагает, что модификации потенциально могут изменять продукцию белка с помощью множества механизмов, включая влияние на взаимодействия транслирующего рибосомного комплекса с мРНК, структуру мРНК и стабильность мРНК. Среди модификаций мРНК, идентифицированных на сегодняшний день, наиболее распространены N6-метиладенонин (m ⁶ A) и псевдоуридин () (2, 4).m ⁶ A модификации, по оценкам, происходят в половине мРНК человека, а клетки содержат набор белков, которые, как сообщается, записывают, читают и стирают модификацию (5, 6).

Ψ было сопоставлено с сотнями последовательностей мРНК (7⇓ – 9), а исследования масс-спектрометрии показывают, что отношение Ψ / U в линиях клеток человека сравнимо с таковым для m. ⁶ A / A (∼0,3% для Ψ / U vs. ∼0.5% m ⁶ A / A) (10, 11). Хотя частота на большинстве нанесенных на карту участков не установлена, оценки-частоты, основанные на экспериментах с Ψ-seq, и прямое измерение занятости в дискретном узле (в EEF1A1) показывают, что может быть включена на частотах ( > 50%) сопоставимо с хорошо заселенными участками m ⁶ A (8, 10).Преобладание-фрагментов в мРНК находится в кодирующих областях (> 60%), и хотя было идентифицировано множество псевдоуридинилирующих ферментов, которые включают как в мРНК, так и в некодирующие РНК воспроизводимым, специфическим и индуцируемым образом (7⇓⇓– 10, 12⇓ – 14), белки, которые читают или стирают Ψ, обнаружены не были. Следовательно, рибосома обязательно встречает в клетках, и было высказано предположение, что она может служить ключевым клеточным компонентом для чтения в мРНК (2). Как, или даже если, псевдоуридинилирование мРНК способствует экспрессии генов, пока неясно.Репортерные исследования клеток человека и бактериальных лизатов приводят к противоречивым выводам относительно роли, при этом некоторые исследования предполагают, что присутствие в кодонах мРНК увеличивает продукцию белка (15), а другие сообщают о снижении синтеза белка (16, 17). ). Наиболее четкие доказательства биологической роли в мРНК получены из исследований на паразите Toxoplasma gondii , где Ψ увеличивает стабильность мРНК и способствует дифференцировке паразитов (12, 13). Независимо от того, выявят ли дальнейшие исследования значительную роль в регуляции генов, рибосома точно транслирует-содержащие кодоны в клетках, и важно установить возможные результаты этих событий.

Поскольку может изменять фундаментальные свойства РНК, включая их вторичные структуры и способность к спариванию оснований (18⇓ – 20), было предложено, что одним из последствий может быть содействие включению нескольких аминокислот в одну кодон (2, 8). Действительно,-содержащие стоп-кодоны, как было обнаружено, управляют бессмысленным подавлением терминации трансляции (14, 21), хотя влияние Ψ на стоп-кодоны остается нерешенным вопросом (22). До сих пор не сообщалось о дифференциальном декодировании Ψ-содержащих смысловых кодонов (16, 17).Установление того, может ли Ψ изменить выбор тРНК на рибосоме, является своевременным вопросом, учитывая, что широкий спектр модифицированных нуклеозидов (β, N1-метил-β, 2-тиуридин, 5-метилцитозин) обычно вставляется в синтетические мРНК с высокой скоростью. стехиометрические соотношения для терапевтического применения (15).

Выявление последствий модификации мРНК в клетках затруднено, потому что ферменты, которые включают в мРНК, также катализируют Ψ добавление к некодирующим видам РНК. Кроме того, влияние стабильности мРНК и белка на выход белка может быть трудным для деконволюции из-за воздействия на трансляцию в клетках.Здесь мы непосредственно исследуем механистические эффекты псевдоуридинилирования мРНК на трансляцию, используя энзимологию in vitro, а также рентгеновскую кристаллографию, и поддерживаем наши выводы in vitro с помощью клеточных подходов. Наши результаты демонстрируют, что вставка одного нарушает функцию рибосомы и способствует низкоуровневому синтезу нескольких пептидных продуктов из одной последовательности мРНК в зависимости от контекста. Эти исследования обеспечивают основу для понимания эффектов β-модификации на трансляцию мРНК в клетках.

Результаты

Ψ Снижает константы скорости для удлинения трансляции и активации EF-Tu GTPase.

Мы оценили, влияет ли Ψ на трансляцию, выполнив кинетические анализы с хорошо зарекомендовавшей себя восстановленной системой трансляции Escherichia coli (23, 24). В наших анализах 70 нМ рибосомных комплексов E. coli 70S, содержащих ³⁵ S-меченный формилметионин-тРНК ^fMet в P-сайте и кодон UUU в A-сайте, реагировали с 0.5–5 мкМ Phe-тРНК ^Phe • EF-Tu • GTP (тройной комплекс) при 37 ° C и продукты визуализировали с помощью электрофоретической ТСХ ( SI Приложение , рис. S1). Мы измерили скорость добавления фенилаланина (Phe) к кодонам UUU, ΨUU, UΨU и UUΨ, поскольку константа скорости образования дипептида на кодоне UUU хорошо известна (23), а Ψ регулярно обнаруживается в кодонах UUU в клетках (7, 10). ) (Рис. 1; подробности оценки качества олигонуклеотидов с помощью UHPLC-MS / MS в SI Приложение ). Phe надежно встраивался в немодифицированные мРНК с конечной точкой реакции и константами скорости, аналогичными ранее описанным (23, 25) (рис. 1 и SI Приложение , Таблица S1). ^f Образование дипептида Met-Phe, катализируемое рибосомами на Ψ-содержащих мРНК, также было завершено ( SI Приложение , таблица S1), а k _max для включения Phe при концентрациях Phe-tRNA ^{Phe ниже 5 мкМ.} (15,7 ± 0,9 с ⁻¹) не был затронут (рис. 1, SI, приложение , таблица S1). Однако константа скорости образования дипептида ^f Met-Phe была умеренно снижена в 2 раза в условиях реакции с субнасыщающими концентрациями Phe-тРНК ^Phe (рис.1 C и SI Приложение , Таблица S1). Мы аппроксимировали K _1/2 для включения Phe в UUU и ΨUU и обнаружили, что значение увеличивается в 2 раза на UU. В соответствии с этим, мы обнаружили, что продукция полноразмерного пептида люциферазы в восстановленной системе трансляции in vitro (NEB PURExpress) в 3 раза медленнее на мРНК репортера люциферазы с каждым U, замененным на ( SI Приложение , рис. S2).

Рис. 1.

Ψ изменяет включение аминокислоты в рибосому.( A ) Кодирующие последовательности для Ψ-содержащих конструкций мРНК. ( B и C ) Временные графики, отображающие образование пептида ^f Met-Phe на немодифицированном и модифицированном кодоне UUU [UUU (черные кружки), ΨUU (синие квадраты), UΨU (зеленые ромбы), UUΨ ( красные треугольники)]. Курсы времени собирали в условиях однократного оборота (70–100 нМ 70S рибосомные инициирующие комплексы с либо [ B ], близкими к насыщению [1 мкМ], либо [ C ] высокими [5 мкМ] уровнями Phe-тРНК ^{. Phe}).

Пониженные наблюдаемые константы скорости включения аминокислот в псевдоуридинилированные кодоны при суб- и близких к насыщению концентрациях Phe-тРНК ^Phe могут отражать изменения констант скорости для одной или нескольких из нескольких предшествующих кинетических стадий (23) ( SI Приложение , рис. S3). Чтобы получить более полное представление о том, на какие стадии влияет, мы измерили константы скорости гидролиза GTP с помощью EF-Tu после связывания тройного комплекса aa-tRNA • EF-Tu • GTP с сайтом A. В этих анализах 1,8 мкМ ³ H- ^f Met-меченные комплексы смешивали со 100 нМ α- ³² P-GTP-меченого тройного комплекса. Наблюдаемая константа скорости гидролиза GTP на немодифицированном кодоне UUU ( k _GTP = 78 ± 10 с ^-1) соответствовала ранее опубликованным значениям (23), в то время как константа скорости была меньше на кодоне ΨUU ( k _GTP = 42 ± 6 с ⁻¹) (Рис.2 A и B , SI Приложение , Таблица S1).

Рис. 2.

Ψ изменяет гидролиз GTP во время связывания тройного комплекса с рибосомой. ( A ) Временные графики, отображающие образование GDP при смешивании 1,6 мкМ ³ H-fMet-меченных комплексов со 100 нМ γ- ³² P-GTP-меченого тройного комплекса, образованного с Phe-tRNA ^Phe и безнуклеотидный EF-Tu. Одноэкспоненциальные кривые были подогнаны к данным, собранным в 3 независимых экспериментах. ( B ) Наблюдаемые константы скорости для данных, соответствующих A . Планки погрешностей — это SE подобранного значения k _obs. ( C и D ) 2Fo-Fc карты Фурье электронной разности (синяя сетка) для связанного с рибосомами сайта A (зеленый) и сайта P (темно-синий), взаимодействующих с немодифицированными ( C ) или Ψ-содержащая мРНК ( D ). В C и карта, и модель взяты из записи PDB 4Y4P. Направление обзора для обеих панелей указано на вставке справа вверху в C .Уточненные модели мРНК (пурпурный) и тРНК (зеленый) отображаются с соответствующими электронными плотностями, очерченными на 1,2σ. Увеличенные изображения CCA-концов тРНК A-сайта показаны нижними правыми вставками на каждой из панелей. Электронная плотность, соответствующая CCA-концу тРНК, взаимодействующей с-содержащей мРНК, намного слабее по сравнению с CCA-концом тРНК, взаимодействующей с немодифицированной мРНК, в то время как электронная плотность, соответствующая телам A-сайта тРНК сопоставимы между двумя комплексами.

тРНК

^Phe 3’CCA не упорядочена в кристаллической структуре комплекса бактериальных рибосом 70S с UU.

Чтобы исследовать, изменяет ли присутствие в кодоне мРНК взаимодействия тРНК с рибосомой во время элонгации трансляции, мы решили кристаллическую структуру рибосомы T. thermophilus 70S в комплексе с UU-содержащей мРНК, тРНК P-сайта _i ^Met и тРНК A-сайта ^Phe (на кодоне ΨUU A-сайта) с разрешением 2,95 Å (рис.2 C и D , SI Приложение , Таблица S2, PDB 6OU1). Мы сравнили эту структуру с нашей ранее опубликованной структурой того же самого 70S рибосомного комплекса, содержащего тРНК ^Phe из того же препарата в рибосомном сайте A, распознающем немодифицированный кодон Phe. В нашей структуре, содержащей ΨUU, мы наблюдали сильную электронную плотность, соответствующую телу и стебле-петле антикодона тРНК ^Phe A-сайта, взаимодействующей с кодоном мРНК ( SI Приложение , рис. S4), аналогичные предыдущим структурам, содержащим немодифицированные мРНК (26). Значение RMSD 0,612, рассчитанное для всего тела тРНК A-сайта (остатки 1–73), указывает на то, что она остается в своем нормальном положении.

Наблюдаемая электронная плотность, соответствующая CCA-концу тРНК в рибосомном сайте A, сильна и хорошо определена в большинстве ранее опубликованных структур (26). Как и ожидалось, это относится к полностью адаптированному CCA-концу тРНК ^Phe, взаимодействующему с немодифицированной мРНК (рис.2 С ). Однако, когда присутствует-содержащая мРНК, мы не наблюдали электронной плотности для оснований CCA-конца той же тРНК ^Phe A-сайта, хотя остальная часть тела тРНК была видна (рис. 2 D ). Даже после уточнения наших рентгеновских данных по сравнению с моделью 70S рибосомы, содержащей полноразмерную тРНК ^Phe в сайте A, плотность оснований CCA-конца не наблюдалась в ( 2Fo-Fc ). карта электронной плотности (рис. 2 D , врезка ).Эти данные указывают на гибкость CCA-конца тРНК A-сайта, взаимодействующего с кодоном ΨUU. Как следствие, CCA-конец этой тРНК неспособен образовывать канонические взаимодействия в сайте A пептидилтрансферазного центра (PTC) на большой субъединице рибосомы, которая обычно включает образование пары оснований Уотсона-Крика между C75 нуклеотид тРНК A-сайта и G2553 23S рРНК. Поскольку основным отличием комплекса 70S, кристаллизованного в этом исследовании, является замена уридина на в каноническом кодоне Phe, отсутствие CCA-конца в электронной плотности, вероятно, объясняется изменениями в декодировании кодона, которые происходят в противоположный конец молекулы тРНК в декодирующем центре и, по-видимому, распространяется до ПТК (рис.2 C и D ). Смещение CCA-конца тРНК A-сайта наблюдалось во многих структурах рибосомы, связанной с антибиотиками [например, Мадумицин II (27) или гигромицин A (28)]. В этих связанных с антибиотиком рибосомных структурах наблюдаемые конформационные изменения в CCA-конце являются результатом стерического вмешательства между CCA-концом и лекарством, что препятствует правильному позиционированию акцепторного стержня тРНК в 70S рибосомной PTC.

Ψ Способствует замене аминокислот в восстановленном

E.coli Система перевода.

Ψ может изменять взаимодействия пар оснований между антикодонами тРНК и мРНК. Это повысило вероятность того, что может с некоторой частотой заставлять рибосому принимать аминоацил-тРНК (аа-тРНК), которая не может быть родственной по U-содержащему кодону. Чтобы проверить эту возможность, мы подготовили пулы общей аа-тРНК, заряжая всего тРНК E. coli с использованием экстракта S100. Затем мы представили 70S рибосомные комплексы с разбавленной смесью аа-тРНК, связанных с EF-Tu, вместо чистой Phe-тРНК ^Phe.Если отбор а-тРНК не изменен, мы должны почти всегда видеть образование дипептида ^f Met-Phe. Как и ожидалось, 97% дипептидов, образованных на кодонах UUU, были продуктом ^f Met-Phe (фиг. 3 и SI, приложение , фиг. S5). Напротив, мРНК, содержащие UU или UUΨ, управляли синтезом множества продуктов (рис. 3) с разумной эффективностью; почти половина всех пептидов, продуцируемых на мРНК ΨUU, были альтернативными продуктами Met-Phe, отличными от ^f (фиг. 3 B и SI, приложение , S5 A ).Степень, в которой Ψ способствует замене аминокислот, по-видимому, зависит от контекста — мы обнаружили различные уровни аминокислотной замены в рибосомных комплексах, запрограммированных модифицированным стоп-кодоном (AA) в сайте A (рис. 3 C ). Важно отметить, что эти эксперименты проводились в условиях, имитирующих голодание и приводящих к снижению точности перевода. Мы не ожидаем, что близкие к родственным тРНК будут столь же эффективно конкурировать с заметными концентрациями родственных аа-тРНК.

Фиг.3.

Ψ способствует включению альтернативных аминокислот рибосомой в предельных концентрациях аа-тРНК. ( A ) Электрофоретическая ТСХ, отображающая продукты трансляции смеси мРНК, содержащих один рандомизированный кодон (NNN), и немодифицированных и содержащих сообщений UUU в присутствии тРНК (ноль), тРНК Phe-тРНК ^Phe ( phe TC) и общая aa-тРНК (общая TC). Трансляция пула мРНК NNN со случайными кодонами в сайте A демонстрирует присутствие нескольких видов аа-тРНК ^аа в препарате тотальной тРНК. ( B ) Процент аминокислотных замещенных дипептидов относительно правильного продукта fMet-Phe на немодифицированных и модифицированных кодонах UUU (например,%, не образующий ожидаемый пептид MF). ( C ) Процент рибосом, которые реагируют с 2 мкМ Lys-тРНК ^Lys тройным комплексом на стоп-кодонах UAA и ΨAA с образованием пептида MK через 10 мин. Почти родственная Lys-тРНК ^Lys реагирует с образованием вдвое большего количества пептида на ΨAA, чем на UAA. Все данные, отображаемые на графиках, отражают средние значения и SE по крайней мере 3 экспериментов.

Чтобы определить, какие аминокислоты включены в-содержащие кодоны UUU, мы провели реакции трансляции с общей тРНК, заряженной по одной либо валином (Val), изолейцином (Ile), лейцином (Leu) или серином (Ser ) (Рис.4 и SI Приложение , S5). Эти аминокислоты были выбраны для исследования на основе миграции замещенных аминокислотами пептидов в экспериментах с электрофоретической ТСХ (фиг. 3 A ) и их антикодонов тРНК. Val и Leu были включены в кодоны UU и UUΨ, Ile был включен только в UU, а Ser не был включен выше фона (рис.4 B и SI Приложение , S5 B ). Наши данные согласуются с известными возможными взаимодействиями пары оснований (29⇓ – 31) и дополнительно предполагают, что пара оснований Ψ: U может удовлетворять требованиям для декодирования в первой позиции ( SI Приложение , Таблица S3) . Это удивительная степень гибкости для сайта декодирования, который, как правило, строго контролирует взаимодействие кодон-антикодон.

Рис. 4.

Аминокислоты из близкородственных и непознанных тРНК включены в Ψ-содержащие кодоны.( A ) Электрофоретическая ТСХ, отображающая продукты трансляции NNN и-содержащих сообщений в присутствии общей аа-тРНК (общей), общей тРНК, аминоацилированной валином (val TC), общей тРНК, аминоацилированной изолейцином (ile TC), и общая аа-тРНК, аминоацилированная лейцином (leu TC). ( B ) Процент продуктов MV / ML / MI, образованных на UUU и-содержащих кодонах, относительно NNN. Представленные на графике значения представляют собой среднее значение 4 экспериментов, а полосы ошибок отражают стандартную погрешность. ( C ) Сводка аминокислотных замен, наблюдаемых с помощью масс-спектрометрии в люциферазном пептиде, включенном в-содержащие мРНК, транслируемые в клетках 293H.

Чтобы количественно определить, снижает ли способность рибосом E. coli различать родственные и близкие / непознанные аа-тРНК, мы провели кинетические анализы с почти родственной Val-тРНК ^Val. В присутствии EF- Ц и смесь регенерации энергии (32).Мы наблюдали всплеск, за которым следует длинная линейная фаза ( SI Приложение , рис. S7). И всплеск, и константа скорости были в 2 раза больше на ΨUU (рис. 5 A и SI, приложение , S7). Эти различия могут отражать изменения на любом этапе до переноса пептидила, включая перенос пептидила, но — с учетом наших экспериментальных условий ([Mg (II)] _{свободный} = 10 мМ) — скорее всего, сообщают об относительных скоростях аккомодации и отторжения Val-тРНК. ^Val на UUU и ΨUU, аналогично тому, что ранее наблюдалось для включения Leu-тРНК ^Leu в кодон UUU (33).Эти данные согласуются с двукратным увеличением, которое мы наблюдаем во включении Val на ΨUU, прореагировавшем с Val-тРНК ^Val, заряженной из смеси тотальной тРНК (фиг. 4 B ).

Рис. 5.

Ψ изменяет способ считывания кодонов. ( A ) k _app значения для ^f Met-Val и образование на кодонах UUU и ΨUU в присутствии 10 нМ EF-Tu и 10 мкМ Val-тРНК ^Val. ( B ) Положение кодонов и пептидил-тРНК в очищенных комплексах удлинения рибосом перед добавлением анализа для наблюдения за несоответствием Р-сайтов RF2 и RF2 / RF3.( C ) Константы скорости преждевременного гидролиза ^f Met-Lys из fMet-Lys-тРНК ^lys, связанного с UAA или ΨAA в P-сайте, катализируемого RF2 (белый) и RF2 / RF3 (серый). ( D и E ) ^f Высвобождение Met на стоп-кодонах UAA (квадраты), ΨAA (кружки), катализируемое 500 нМ RF1 ( D ) или RF2 ( E ).

Ψ Повышает уровень аминокислотной замены в эмбриональных клетках почек человека.

Затем мы исследовали влияние на аминокислотную замену во время трансляции в эукариотических клетках.МРНК люциферазы транскрибировали in vitro с помощью уридина или β и трансфицировали в клетки 293H ( SI, приложение , фиг. S8). Белок люциферазы полной длины очищали ( SI, приложение , рис. S9) и анализировали масс-спектрометрией с акцентом на специфический пептид люциферазы с благоприятными ионизационными характеристиками. Аминокислотные замены в этом пептиде, которые составили ∼1%, наблюдались только в пептидах, генерируемых из-содержащих мРНК (рис. 4 C и SI, приложение , рис.S10 и таблицы S4 и S5). Мы также расширили наш анализ на весь набор данных по люциферазе. Белок люциферазы, транслируемый с-содержащих мРНК, обладал значительно более высокой скоростью аминокислотных замен (всего ~ 1,5%, интегрированной по всем-содержащим кодонам) по сравнению с белком, синтезированным из уридин-содержащих мРНК (замены в сумме <0,05% наблюдались только на два кодона Val) ( SI, приложение , таблица S6). События неправильного кодирования, которые мы наблюдали в наших образцах, содержащих немодифицированный уридин (замены Val), вероятно, являются относительно распространенными заменами, поскольку они также были замечены более сложными подходами масс-спектрометрии, исследующими немодифицированные последовательности EF-Tu (34).Эти наблюдения согласуются с ожидаемыми уровнями аминокислотных замен, которые мы могли бы оценить из наших кинетических исследований in vitro с родственным Phe-тРНК ^Phe и почти родственным Val-тРНК ^Val, которые предполагают, что в условиях, когда все тРНК являются одинаково хорошо заряженный и доступный, ожидаемый общий уровень аминокислотной замены в кодонах ΨUU должен составлять ~ 1% ( SI, приложение , рис. S7).

мРНК: несовпадение тРНК на ΨAA в сайте P, не обнаруженное

E.coli Рибосома.

Наши данные показывают, что рибосома может по-разному взаимодействовать с близкими / непознанными aa-тРНК, когда Ψ присутствует в кодонах A-сайта. Чтобы оценить, влияет ли Ψ также на то, как рибосома воспринимает взаимодействия мРНК: тРНК в P-сайте, мы исследовали, обнаруживает ли рибосома несовпадения мРНК: тРНК на-содержащих кодонах P-сайта. На немодифицированных кодонах рибосомы E. coli воспринимают несовпадения в Р-сайтах, а факторы высвобождения 2 и 3 (RF2 / 3) катализируют гидролиз усеченных пептидов, содержащих замещенные аминокислоты, из смыслового (непрерывного) кодона для обеспечения точности трансляции (рис.5 В ) (35). Мы проверили, отслеживаются ли несовпадения, включающие псевдоуридинилированный кодон, аналогичным образом путем взаимодействия комплексов инициации рибосом, содержащих UAA или AA в сайте A, с тройными комплексами, содержащими Lys-тРНК ^Lys, в присутствии фактора элонгации G (EF-G). Это привело к образованию смеси несовпадающих рибосомных комплексов, содержащих либо ^f Met-Lys-тРНК ^Lys, либо ^f Met-Lys-Lys-тРНК ^Lys в сайте P (рис. 5 и SI, приложение , рис. .S11 A и B ). Затем мы добавили RF2 или RF2 / RF3 и измерили константы скорости высвобождения пептидов Met-Lys-Lys (MK) ^f (MK) и ^f Met-Lys-Lys (MKK) из этих мРНК. Если обнаружено несоответствие, мы ожидаем, что RF2 / RF3 будет катализировать преждевременное высвобождение пептида намного быстрее, чем один только RF2 (35). На немодифицированной мРНК мы наблюдали, что пептиды MK и MKK высвобождаются RF / RF3 со скоростью, сравнимой со скоростями, о которых ранее сообщалось для других несовпадающих комплексов (рис.5 и SI, приложение , рис.S11 C и D ) (35). Напротив, когда AA находится в сайте P, пептид MK не высвобождается (фиг. 5 C и SI, приложение , фиг. S11 E ). Однако, когда AA транслоцируется в сайт E, высвобождение пептида MKK катализируется RF2 / RF3; это означает, что несоответствие между тРНК ^Lys и кодоном GUU в P-сайте отслеживается на Ψ-содержащем транскрипте (фиг. S11 F ). Наши данные демонстрируют, что несовпадения мРНК: тРНК на кодонах AA P-сайта не распознаются, что позволяет предположить, что Ψ может изменять способ взаимодействия рибосомы с близкими / непознанными аа-тРНК в P-сайте.

Фактору высвобождения 1 (RF1) класса I незначительно препятствует присутствие.

Сообщалось, что присутствие в стоп-кодонах способствует бессмысленному подавлению, включая Ser или Thr вместо прекращения трансляции кодонов UAA, как в клетках бактерий, так и в клетках дрожжей (14, 21). Вычислительные исследования предсказывают, что это связано с изменениями активности фактора высвобождения на псевдоуридинилированных стоп-кодонах (36). Чтобы оценить, влияет ли на способность факторов высвобождения класса I катализировать гидролиз пептида из пептидил-тРНК, мы измерили константы скорости высвобождения пептида на мРНК, кодирующей метионин, за которой следует универсальный стоп-кодон (UAA / AA) (рис.5 D и E ). При насыщающих концентрациях RF1 или RF2 высвобождение пептида на кодоне UAA происходило с константами скорости ( k _{макс, высвобождение}) между 0,06–0,24 с ^–1 при 22 ° C, что согласуется с ранее опубликованными значениями (35, 37) (Рис. 5 D и E и SI Приложение , Таблица S7). Высвобождение пептида на кодоне ΨAA было лишь незначительно нарушено: k _{макс, высвобождение} для RF1 было уменьшено в ~ 3 раза, но k _{макс, высвобождение} для RF2 и K _1/2 для обоих RF1 и RF2 остались без изменений (рис.5 D и E и SI Приложение , рис. S12 и таблица S7). Наши результаты в основном согласуются с предыдущим исследованием с использованием RF1 и варианта RF2 A246T (38), в котором не было обнаружено различий в константах скорости высвобождения пептида на стоп-кодонах дикого типа и β-содержащих стоп-кодонах (22). Умеренное влияние на активность RF1, по-видимому, специфично для, поскольку мы находим, что m ⁶ A препятствует RF2‒, но не RF1‒, опосредованному высвобождению пептида ( SI, приложение , фиг. S13 и S14).Вместе это небольшое уменьшение константы скорости для катализированного высвобождения RF1, наша неспособность включить Ser на AA в отсутствие факторов высвобождения ( SI Приложение , рис. S15) и наша неспособность обнаружить расширенные продукты из полностью AA замещенный репортер люциферазы в системе трансляции NEB PURExpress in vitro, предполагают, что Ψ вряд ли значительно подавит терминацию трансляции в нормальных клеточных условиях.

Обсуждение

Неспособность нейтрализовать ферменты, которые включают в мРНК, не влияя при этом на модификацию некодирующей РНК, в сочетании с отсутствием известных белков-ридеров или стирателей, затрудняет исследование биологических последствий модификаций мРНК.Мы подошли к этой задаче, используя полностью восстановленный анализ трансляции in vitro и спросив, как псевдоуридинилирование мРНК влияет на функцию одного возможного ридера, рибосомы. Наши исследования показывают, что присутствие в кодонах незначительно изменяет то, как рибосома взаимодействует как с родственными, так и с неконференционными / близкими к аа-тРНК. Мы наблюдали, что β-содержащие кодоны нарушают трансляцию родственных кодонов и способствуют синтезу различных пептидных продуктов из одной мРНК чаще, чем из немодифицированных мРНК, как в реконструированной бактериальной системе трансляции, так и в клетках человека.

Рассмотрение наших кинетических и структурных данных в отношении установленной механистической парадигмы для связывания aa-тРНК с сайтом A ( SI Приложение , Fig. S3) (23) дает некоторое представление о механистических эффектах Ψ. Мы наблюдали снижение констант скорости добавления аминокислот ( k _obs) и GTP-гидролиза, катализируемого EF-Tu ( k _GTP) на Ψ-содержащих кодонах, что согласуется с нашим выводом о том, что-замещенные кодоны снизить общую скорость производства полноразмерного белка.Изменения в зависимости от k _obs, k _GTP и Mg (II) в наших наблюдениях ( SI Приложение , рис. S16) напоминают те, которые наблюдались для близкородственных тРНК (33), хотя и более тонко, предполагая, что распознавание псевдоуридинилированных кодонов существует где-то в спектре между родственными и почти родственными комплексами. Наши структурные данные предоставляют дополнительные доказательства того, что рибосома по-разному взаимодействует с тРНК, связанными с-содержащими кодонами. Мы обнаружили, что 3′-CCA тРНК A-сайта становится неупорядоченным, что позволяет предположить, что нетрадиционное декодирование кодона ΨUU A-сайта в центре декодирования в малой субъединице рибосомы приводит к дальнодействующим изменениям в акцепторном стволе A -сайтовая тРНК, расположенная в PTC на большой субъединице рибосомы.Взятые в целом, наши кинетические и структурные результаты показывают, что незначительно влияет на несколько этапов кинетического пути трансляции, оказывая общий наблюдаемый эффект на добавление аминокислот.

Наши кинетические и масс-спектрометрические данные показывают, что, хотя аминокислотная замена увеличивается в присутствии, эти события относительно редки в нестрессированных клетках (<1,5%). Более того, многие аминокислотные замены, вероятно, будут нейтральными, поэтому не следует ожидать, что включение в мРНК приведет к образованию значительных количеств нефункционального белка в нормальных клеточных условиях.Тем не менее, могут быть некоторые условия или контексты последовательностей, в которых-опосредованная замена аминокислот происходит более устойчиво. Наше наблюдение, что изменяет декодирование рибосомой в клетках, отличается от предыдущих исследований на основе репортеров, в которых не наблюдались аминокислотные замены в одном определенном положении в полноразмерном репортерном пептиде ErmCL или в полностью-замещенном репортере GFP (16 , 17). Есть несколько возможных объяснений этого несоответствия. Во-первых, наши масс-спектрометрические анализы смогли обнаружить множественные события аминокислотных замен in vivo, которые происходили с частотами (0.1–0,4%; SI Приложение , таблицы S5 и S6) ниже, чем заявленный предел обнаружения для исследования GFP (~ 1%). Во-вторых, влияние на декодирование может сильно зависеть от локальной последовательности и структуры мРНК (39). Это было бы неудивительно, учитывая, что наши исследования показывают, что степень включения альтернативной аминокислоты зависит как от идентичности кодона, так и от положения нуклеотида в кодоне (рис. 3). Такая зависимость от контекста ранее наблюдалась для инозина; как декодируется инозин, так и частота аминокислотных замен (0. 5–25%) широко варьируются в зависимости от контекста последовательности (40). В-третьих, клеточные стрессы изменяют доступный пул аа-тРНК и распределение модификаций мРНК (7, 41). Степень аминокислотной замены должна быть очень чувствительной к относительным уровням аа-тРНК, поэтому различные клеточные условия, вероятно, будут влиять на степень аминокислотной замены. Наконец, возможно, что возможность наблюдения альтернативного декодирования в различных мРНК может быть совершенно различной на основании идентичности мРНК и посттрансляционной судьбы замещенного аминокислотой пептида.

Мы наблюдали, что-содержащие кодоны умеренно влияют на способность рибосомы включать Phe, в соответствии с нашими исследованиями ( SI Приложение , рис. S2) и другими, демонстрирующими, что общая продукция белка снижается за счет репортеров мРНК, содержащих либо одно- (<2-кратно) (16, 17), либо полностью -замещенные кодоны (3-кратно) в полностью восстановленной системе трансляции E. coli и клетках человека (17). Мы предполагаем, что влияние на скорость трансляции кодона может зависеть от контекста последовательности кодона; мы видели, что включение в различные последовательности мРНК, кодирующие идентичные пептиды люциферазы, может иметь очень разные результаты экспрессии белка в клетках 293H ( SI Приложение , рис.S17). В целом, наши результаты сходны с тем, что было сообщено для декодирования m ⁶ A и 2 ‘O-метил содержащих кодонов (32, 42), предполагая, что модификации мРНК могут в целом изменять связывание и аккомодацию aa-тРНК. Учитывая склонность рибосомы реагировать с близкими и нераспознанными аа-тРНК во время трансляции-содержащих мРНК (рис.3 и 4), эти небольшие дефекты скорости могут стать важными для отбора родственных аа-тРНК в условиях клеточного стресса. или голодание.Мы предполагаем, что клеткам может быть выгодно поддерживать небольшой резервуар разнообразия белков для эволюции и адаптации к стрессам окружающей среды (43, 44). Действительно, было показано, что повышенные уровни аминокислотных замен повышают приспособленность клеток при окислительном и температурном стрессе, а также при переходе от стационарных условий к условиям роста клеток (45–47). Идея о том, что уровни аминокислотных замен могут варьироваться в зависимости от клеточных условий, подтверждается недавним исследованием, демонстрирующим, что частота аминокислотных замен в клетках E.coli EF-Tu варьируется на 2 порядка в зависимости от уровня экспрессии белка (34). В конечном счете, для понимания того, как одна модификация связана со стабильностью мРНК и синтезом белка в клетке, потребуется полный набор современных научных инструментов, включая ансамблевую и одномолекулярную биохимию, глубокое секвенирование и клеточную биологию.

Материалы и методы

Рибосомы 70S с жесткой парой были очищены от E. coli MRE600. Немодифицированные мРНК получали транскрипцией T7 ДНК-олигонуклеотидов.мРНК, содержащие модифицированные нуклеотиды, были синтезированы и очищены ВЭЖХ с помощью Dharmacon, и их качество оценивалось с помощью УВЭЖХ-МС / МС ( SI Приложение , рис. S18). РНК для переноса E. coli были приобретены либо у MP Biomedical, Sigma, либо у тРНК Probes. Все эксперименты по трансляции проводили в буфере 1 × 219-Трис (50 мМ Трис pH 7,5, 70 мМ NH ₄ Cl, 30 мМ KCl, 7 мМ MgCl ₂, 5 мМ β-ME), как описано ранее (25, 35). Инициирующие комплексы очищали ультрацентрифугированием.Подробные процедуры и условия реакции для всех экспериментов приведены в Приложении SI .

Доступность данных.

Координаты и структурные факторы были депонированы в банке данных белков RCSB.

Благодарности

Эта работа финансировалась стартовыми фондами Мичиганского университета (для KSK), Rackham Merit Fellowship (для MKF), наградами Национальных институтов здравоохранения R35 GM128836 (для KSK), T32 GM008597 (для MKF), Фонды стартапов Университета Иллинойса (Ю.S.P.) и New England Biolabs (NEB) Inc. (M.Z.W. и B.R. — сотрудники New England Biolabs, Inc.). Структурные работы основаны на исследованиях, проводимых Северо-восточной группой коллективного доступа, которые финансируются Национальным институтом общих медицинских наук Национальными институтами здравоохранения [P30-GM124165 до NE-CAT]. Детектор Pilatus 6M на канале 24ID-C финансируется NIH-ORIP HEI [S10-RR029205 — NE-CAT]. Детектор Eiger 16M на канале 24ID-E финансируется грантом NIH-ORIP HEI [S10-OD021527 to NE-CAT].В этом исследовании использовались ресурсы Advanced Photon Source, Управления науки Министерства энергетики США (DOE), используемого для Управления науки DOE Аргоннской национальной лабораторией по контракту № DE-AC02-06Ch21357. Мы благодарим сотрудников NE-CAT каналов 24ID-C и 24ID-E за помощь в сборе данных и замораживании кристаллов. Мы также благодарим доктора Рэйчел Грин за предоставление плазмид фактора трансляции, доктора Роберта Кеннеди за использование его ВЭЖХ и масс-спектрометра, а также Скотта Шаффера и Маркоса Кутмоса за их комментарии к рукописи.

Сноски

Вклад авторов: D.E.E., M.K.F., Z.B., M.Z.W., M.L.D., Y.S.P., B.R. и K.S.K. спланированное исследование; D.E.E., M.K.F., Z.B., M.Z.W., M.L.D., M.D.-B., J.D.J. и B.R. проведенное исследование; J.D.J. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; D. E.E., M.K.F., Z.B., M.Z.W., M.L.D., Y.S.P., B.R. и K.S.K. проанализированные данные; и D.E.E., M.K.F., Z.B., M.Z.W., Y.S.P., B.R. и K.S.K. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
Размещение данных: Координаты и структурные факторы были депонированы в банке данных белков RCSB с кодом доступа 6OU1 для рибосомы Thermus thermophilus 70S в комплексе с ΨUU-мРНК, тРНК A-, P- и E-сайта.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1821754116/-/DCSupplemental.

Границы | tmRNA-опосредованная транс-трансляция как основная система спасения рибосом в бактериальной клетке

Введение

Перевод часто останавливается в различных ситуациях в камере, иногда запрограммированно, а иногда неожиданно.Например, трансляция мРНК, лишенной стоп-кодона (нон-стоп-кодон), не прекращается эффективно, потому что фактор высвобождения пептида не функционирует. Таким образом, в ячейке должна быть система, способная справиться с такими чрезвычайными ситуациями. Однако до середины 1990-х этому вопросу уделялось мало внимания, и поэтому открытие тмРНК стало большим сюрпризом. Первоначально были выяснены тРНК-подобная структура и функция тмРНК. Обе концевые области тмРНК могут образовывать вторичную структуру, напоминающую верхнюю половину структуры тРНК, напоминающей клеверный лист (Komine et al., 1994; Ushida et al., 1994), который включает несколько консенсусных последовательностей, специфичных для тРНК, и модификаций оснований (Рисунок 1A; Felden et al., 1997, 1998). Как и у тРНК, 3′-конец тмРНК может быть аминоацилирован аминокислотой (аланином) аминоацил-тРНК-синтетазой (аланил-тРНК-синтетазой; Komine et al., 1994; Ushida et al., 1994). Другие тРНК-подобные функции, такие как 5′-процессинг РНКазой P (Komine et al., 1994), связывание с EF-Tu (Rudinger-Thirion et al., 1999; Barends et al., 2000, 2001; Hanawa-Suetsugu и другие., 2001) и взаимодействие с 70S рибосомой (Ushida et al. , 1994; Komine et al., 1996; Tadaki et al., 1996). Хотя она примерно в пять раз больше, чем тРНК, тмРНК не имеет явного антикодона, что затрудняет выяснение того, участвует ли тмРНК в трансляции и каким образом. Несколько лет спустя было обнаружено, что тмРНК выполняет функции не только как тРНК, но и как мРНК: короткий пептид кодируется средней частью тмРНК (Tu et al., 1995), которая окружена четырьмя структурами псевдоузлов (рис. 1A; Nameki et al., 1999б, в). Любопытно, что эти две функции взаимодействуют, а не являются независимыми, для получения химерного полипептида из двух мРНК, усеченного на С-конце полипептида, кодируемого мРНК, сливающей короткий пептид, кодируемый тмРНК, с остатком аланина неизвестного происхождения между ними (Keiler et al. al., 1996; Muto et al., 1996; Himeno et al., 1997). Эта акробатическая трансляция, включающая ко-трансляционную замену мРНК, дает единый полипептид из двух мРНК, и поэтому она была названа трансляцией транс и -трансляцией (рисунок 2; Muto et al. , 1998). Эта система обеспечивает стоп-кодон, позволяющий завершить трансляцию нон-стоп мРНК и, следовательно, рециклинг рибосомы. Кроме того, трансляция транс- рассматривается как система контроля качества, которая предотвращает накопление нефункциональных полипептидов, полученных из усеченных мРНК, в качестве метки-пептида, состоящего из первого остатка аланина и короткого пептида, кодируемого тмРНК. , особенно последовательность последних четырех гидрофобных аминокислот (ALAA), служит мишенью для клеточных АТФ-зависимых протеаз (Gottesman et al., 1998; Герман и др., 1998; Флинн и др., 2001; Choy et al., 2007).

РИСУНОК 1. Вторичные и третичные структуры тмРНК. (A) Вторичная структура тмРНК. (Слева) показана наиболее типичная вторичная структура тмРНК с TLD и областью, кодирующей тег, обозначенными коричневым и красным цветом соответственно. (Справа) Вторичная структура двухкомпонентной тмРНК. 5’-кодирующий фрагмент и фрагмент-акцептор 3’-аминокислоты обозначены зеленым и фиолетовым цветом соответственно. (B) Тетичная структура тмРНК или ее фрагмента в комплексе с SmpB. (Слева) Кристаллическая структура комплекса фрагмента TLD, лишенного 3’CCA-конца тмРНК T. thermophilus (5 ’25 остатков и 3′ 34 остатка, соединенных петлей UUCG) и глобулярного домена (N- терминал 123 из 144 остатков) SmpB (PDB ID: 2CZJ; Bessho et al., 2007). TLD (коричневый) и SmpB (темно-синий) имитируют верхнюю и нижнюю половины L-образной структуры тРНК соответственно. (Справа) Крио-ЭМ структура тмРНК · SmpB в T.thermophilus комплекс посттранслоцированного состояния трансляции (PDB ID: 3YIR; Weis et al., 2010b) показан с TLD, областью, кодирующей тег, и SmpB, обозначенными коричневым, красным и темно-синим цветом, соответственно. . N-концевой глобулярный домен SmpB, имитирующий нижнюю половину L-образной структуры тРНК, находится в тесном контакте с вышележащей областью последовательности, кодирующей метку.

РИСУНОК 2. Схематическое изображение трансляции trans . Когда транслируемая рибосома останавливается из-за усечения мРНК, она восстанавливается с помощью трансляции транс , которая производит химерный белок, состоящий из усеченного на С-конце полипептида (серые кружки), кодируемого 3′-усеченной мРНК, сливающей тмРНК- кодируемый короткий пептид (синие кружки) с остатком аланина (красный кружок), происходящий от аминоацилированного аланина на 3′-конце тмРНК между ними. Trans -трансляция способствует деградации как укороченных мРНК, так и аберрантных полипептидов из укороченных мРНК.

Trans -трансляция требует тмРНК-связывающего белка, называемого SmpB, в дополнение к каноническим факторам элонгации (Karzai et al., 1999). SmpB состоит из глобулярного домена и неструктурированного C-концевого хвоста (Dong et al., 2002; Someya et al., 2003). Он связывается с тРНК-подобным доменом (TLD) тмРНК для предотвращения деградации тмРНК и усиления аминоацилирования тмРНК (Barends et al., 2001; Hanawa-Suetsugu et al. , 2002; Shimizu and Ueda, 2002; Nameki et al. , 2005). SmpB также играет решающую роль в рибосомном процессе трансляции транс .

Система трансляции транс- повсеместно присутствует в бактериальных клетках и присутствует в органеллах некоторых эукариот, но не в цитоплазме эукариот или архебактерий. Накапливаются данные, указывающие на то, что бактериальная клетка оснащена дополнительными системами, позволяющими справиться с остановкой трансляции. Здесь мы рассматриваем текущее понимание молекулярного механизма и клеточных функций тмРНК-опосредованной трансляции trans , а также других систем спасения рибосом.

Молекулярный механизм

Trans — перевод

Схема процесса трансляции trans выглядит следующим образом (Рисунок 3): первоначально тмРНК в комплексе с SmpB аминоацилируется с аланином аланил-тРНК синтетазой. Ala-тмРНК входит в A-сайт остановившейся рибосомы на усеченной мРНК, чтобы получить растущий полипептид из пептидил-тРНК в P-сайте. Затем пептидил-Ala-тмРНК перемещается в Р-сайт, который заменяет матрицу усеченной мРНК на кодирующую метку область на тмРНК.Это может разумно объяснить отсутствие происхождения остатка аланина, соединяющего усеченный полипептид, кодируемый мРНК, с кодируемым тмРНК tag-пептидом: он происходит от остатка аланина, аминоацилированного в тмРНК. Эта модель была предложена на основе результатов исследования in vivo , показывающего, что усеченные полипептиды, сливающие тмРНК-кодирующий таг-пептид на его С-концах, накапливаются в клетке при экспрессии усеченной мРНК (Keiler et al., 1996), и модель была подтверждена результатами исследования in vitro , показывающего, что tag-пептид синтезируется с использованием экстракта клеток Escherichia coli в зависимости от добавления поли (U) и от способности тмРНК к аминоацилированию ( Muto et al., 1996; Himeno et al., 1997). Однако возник ряд вопросов. Как тмРНК находит остановившуюся рибосому? Как тмРНК попадает в А-сайт рибосомы без антикодона? Каким образом кодирующая метка область тмРНК заменяет усеченную мРНК? Как определяется точка возобновления на тмРНК? SmpB стал ключевой молекулой для решения этих вопросов.

РИСУНОК 3. Текущая модель trans -перевод. Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu · GTP входит в свободный A-сайт застопорившейся рибосомы, чтобы запустить трансляцию trans -трансляции.Гидролиз GTP с помощью EF-Tu может вызывать изменение конформации застопорившегося комплекса, позволяя C-концевому хвосту SmpB взаимодействовать с путем мРНК с расширенной структурой. После переноса пептидила пептидил-Ala-tmRNA · SmpB перемещается с A-сайта на P-сайт с помощью EF-G, чтобы вытеснить укороченную мРНК из рибосомы. При этом удлиненный С-концевой хвост как-то складывается. Затем кодон возобновления тмРНК устанавливается в области декодирования. SmpB и область кодирования тегов показаны красным и синим цветом соответственно.

Помимо канонических факторов трансляции и tmRNA, SmpB является минимальным требованием для трансляции in vitro транс- (Shimizu and Ueda, 2002; Takada et al., 2007; Kurita et al., 2012). Считается, что SmpB продолжает связываться с тмРНК на протяжении всего процесса трансляции транс- (Иванова и др. , 2007). В кристаллической структуре комплекса SmpB и модельного фрагмента РНК, соответствующего TLD тмРНК, глобулярный домен SmpB связывается с TLD, так что он компенсирует отсутствие нижней половины структуры L-формы в тмРНК (рис. 1B). ; Gutmann et al., 2003; Бесшо и др., 2007). Таким образом, TLD в комплексе с глобулярным доменом SmpB структурно имитирует целую молекулу тРНК. Исследование направленного исследования гидроксильных радикалов выявило два сайта связывания SmpB в рибосоме E. coli , один в A-сайте, а другой в P-сайте, оба из которых могут быть наложены на нижнюю половину молекул тРНК. в транслирующей рибосоме (Kurita et al., 2007). Дополнительная мимикрия верхней половины тРНК с помощью TLD может завершить две полные трансляции мимики тРНК в A-сайте и P-сайте, так что их аминоацильные концы ориентированы к центру пептидилтрансферазы.Характер расщепления 16S рРНК гидроксильными радикалами от остатков С-концевого хвоста позволяет предположить наличие двух сайтов связывания С-концевого хвоста SmpB с двумя различными способами конформации в рибосоме в дополнение к неструктурированной конформации в растворе: протяженный конформация от A-сайта до нисходящего туннеля вдоль пути мРНК в виде α-спиральной структуры и свернутой конформации вокруг пути мРНК в P-сайте (Kurita et al. , 2007, 2010).

На основе этих свойств SmpB процесс трансляции trans может быть описан более подробно (Рисунок 3).Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu · GTP входит в свободный A-сайт застопорившейся рибосомы. Гидролиз GTP индуцирует конформационное изменение застопорившегося комплекса с высвобождением EF-Tu.GDP, делая возможным размещение Ala-TLD · SmpB в A-сайте. Во время этого процесса C-концевой хвост SmpB взаимодействует с путем мРНК, идущим к каналу входа мРНК. Впоследствии Ala-TLD в A-сайте получает растущую полипептидную цепь из пептидил-тРНК в P-сайте, и полученный пептидил-Ala-TLD · SmpB перемещается с A-сайта на P-сайт.Во время этого процесса С-концевой хвост SmpB диссоциирует от входного канала мРНК и связывается вокруг сайта кодон-антикодонного взаимодействия в Р-сайте с изменением его конформации от протяженной структуры к складчатой, что, в свою очередь, способствует высвобождение мРНК из рибосомы. Конформационное изменение C-концевого хвоста, сопровождающееся транслокацией, делает A-сайт свободным, что позволяет ввести кодон возобновления тмРНК в область декодирования. Эта модель была подтверждена результатами структурных исследований нескольких промежуточных продуктов трансляции транс и .Крио-ЭМ-исследования выявили три типа промежуточных продуктов в предварительно адаптированных, адаптированных и перемещенных состояниях (Kaur et al., 2006; Cheng et al., 2010; Fu et al., 2010; Weis et al., 2010a, б). Во всех из них SmpB и TLD занимают соответственно нижнюю и верхнюю половины сайтов связывания тРНК. Хотя С-концевой хвост SmpB не был идентифицирован на этих картах из-за низкого разрешения, его взаимодействие с путём мРНК было ясно показано в кристаллической структуре комплекса состояния преаккомодации трансляции транс-, содержащего кирромицин ( Neubauer et al., 2012).

Эта модель может объяснить, почему трансляция транс преимущественно происходит на рибосоме, остановленной на мРНК с более коротким 3′-удлинением, что было проиллюстрировано in vitro (Иванова и др., 2004; Асано и др., 2005) : С-концевой хвост SmpB конкурирует с 3′-удлинением мРНК за канал входа мРНК. Исследование химического следа показало, что SmpB взаимодействует с A1492, A1493 и G530 в 16S рРНК, которые образуют область декодирования (Nonin-Lecomte et al., 2009). Однако эти нуклеотиды могут быть изменены без потери как пептидил-трансферазы, так и гидролитической активности GTP при трансляции транс , что указывает на гораздо более низкую значимость этих декодирующих нуклеотидов для трансляции транс (Miller et al., 2011). В кристаллической структуре комплекса Thermus thermophilus пре-аккомодации -трансляции G530 складывается с остатком (Y127) вокруг начала С-концевого хвоста SmpB (Neubauer et al., 2012). Недавно Миллер и Бускирк (2014) обнаружили, что соответствующий остаток в E. coli SmpB (h236) играет решающую роль в гидролизе GTP, что привело к предположению, что укладка этого остатка с G530 запускает гидролиз GTP.

EF-G способствует высвобождению укороченной мРНК из застопорившейся рибосомы после переноса пептидила на Ala-tmRNA, что позволяет предположить наличие канонической транслокационной стадии в процессе транслокации trans -трансляции (Иванова и др. , 2005).Во время этого события SmpB должен пройти через барьер между A-сайтом и P-сайтом, а тмРНК должна войти внутрь канала входа мРНК, чтобы установить кодон возобновления в области декодирования. Соответственно, на крио-ЭМ карте транслокационного промежуточного комплекса, содержащего EF-G и фузидиевую кислоту, оба моста B1a, которые служат барьером между A-сайтом и P-сайтом, и защелка, которая обычно закрывается взаимодействием между головой (спираль 34) и телом (область G530), чтобы сформировать туннель мРНК, открыты (Ramrath et al., 2012). Точное позиционирование кодона возобновления в области декодирования требует наличия последовательности непосредственно перед кодоном возобновления в положениях от –6 до +1 (Williams et al., 1999; Lee et al., 2001), и эта последовательность распознается глобулярным кодоном. домен SmpB (Konno et al., 2007), предполагая, что SmpB соединяет два отдельных домена tmRNA в P-сайте, чтобы определить кодон возобновления для трансляции тегов, предположительно сразу после транслокации. Это согласуется с крио-ЭМ картами комплексов перемещенного состояния транс-трансляции (Рисунок 1B; Fu et al., 2010; Weis et al., 2010b). Другое исследование подтвердило важность C-концевого хвоста SmpB и его взаимодействия со стартовым кодоном GCA на тмРНК для определения начальной точки трансляции тег-пептид (Camenares et al., 2013). Взятые вместе, результаты предполагают, что взаимодействие между тмРНК и SmpB более важно для определения точки возобновления, чем взаимодействие между тмРНК и рибосомой. Следует отметить, что некоторые виды аминогликозидов, которые связывают область декодирования, смещают точку возобновления трансляции тегов (Takahashi et al., 2003; Конно и др., 2004).

Хотя сообщалось о нескольких примерах потенциальной молекулярной мимикрии тРНК фактором трансляции, SmpB является единственной молекулой, которая, как предполагалось, имитирует динамическое поведение тРНК во всех классических и гибридных состояниях, A / T, A / A, A / P, P / P и P / E в транслирующей рибосоме. Считается, что рибосомный белок S1, который был идентифицирован как тмРНК-связывающий белок (Wower et al., 2000), не участвует в ранней стадии трансляции trans , по крайней мере, до первой транслокации (Qi et al. ., 2007; Такада и др., 2007).

Требование расщепления мРНК для

Trans -Translation

Поскольку последовательность тега служит сигналом деградации, продукты трансляции trans вряд ли обнаруживаются в клетке или ее экстракте, хотя они накапливаются и, таким образом, обнаруживаются при конструировании последовательности тмРНК, кодирующей тег. С момента публикации результатов более раннего исследования in vivo с использованием искусственная мРНК (Keiler et al., 1996). Нон-стоп мРНК может быть произведена неожиданно или запрограммированным образом, и аналогичная ситуация может также возникнуть, когда нормальный кодон терминации считывается в присутствии несмысловой супрессорной тРНК (Ueda et al., 2002) или неправильное кодирование препарата (Abo et al. , 2002). Протеомный анализ выявил эндогенные продукты трансляции транс из различных бактериальных источников, что указывает на то, что трансляция транс преимущественно происходит в определенных сайтах конкретных мРНК (Roche and Sauer, 2001; Collier et al., 2002; Fujihara et al., 2002; Hong et al., 2007; Барендс и др., 2010). Следовательно, несколько ситуаций, которые способствуют трансляции транс- в середине мРНК, были сосредоточены на: приостановке трансляции из-за редкого кодона (Roche and Sauer, 1999), неэффективного терминирующего кодона (Roche and Sauer, 2001; Hayes et al. ., 2002a; Sunohara et al., 2002), а запрограммированная задерживающая последовательность (Collier et al., 2004) индуцирует трансляцию транс-. Однако вопрос о том, действительно ли происходит трансляция trans в середине мРНК без расщепления, остается спорным.Было обнаружено, что бактериальный токсин RelE расщепляет мРНК специфически в A-сайте застопорившейся рибосомы (Pedersen et al. , 2003). RelE обычно инактивируется антитоксином, RelB, и активируется за счет деградации RelB протеазой Lon при аминокислотном голодании. Тем не менее, открытие эндорибонуклеазы, специфичной для A-сайта, подтвердило идею о том, что расщепление мРНК является предпосылкой для трансляции транс и . Торможение рибосом вызывает расщепление мРНК в A-сайте даже в клетке, лишенной RelE или некоторых других эндорибонуклеаз (Hayes and Sauer, 2003; Sunohara et al., 2004а, б; Li et al., 2008), что указывает на участие еще не идентифицированной рибонуклеазы или самой рибосомы в расщеплении мРНК. Также сообщалось, что 3′-5′-экзорибонуклеазная активность РНКазы II является важной предпосылкой для A-сайт-специфичного расщепления мРНК (Garza-Sánchez et al., 2009). Помимо RelE, у E. coli было идентифицировано несколько видов рибосомозависимых эндорибонуклеаз, каждая из которых имеет специфический антитоксин (Feng et al., 2013).

Исследования in vitro ясно показали, что трансляция транс может происходить в середине мРНК, хотя эффективность трансляции транс резко снижается с увеличением длины 3′-удлинения от остановленного положения (Иванова и другие. , 2004; Асано и др., 2005). Это согласуется с результатами структурных исследований, показывающих, что С-концевой хвост SmpB занимает путь мРНК на ранней стадии трансляции транс , так что он конкурирует с 3′-удлинением мРНК (Kurita et al., 2010; Neubauer et al., 2012).

Протеомные исследования показали, что трансляция транс- предпочтительно происходит в кодоне пролина, непосредственно предшествующем стоп-кодону (Hayes et al., 2002a, b). Asp-Pro, Glu-Pro, Pro-Pro, Ile-Pro и Val-Pro являются подходящими C-концевыми дипептидами для трансляции trans , что указывает на дополнительную важность предпоследнего остатка.Фактически, Asp-Pro и Pro-Pro необычно недостаточно представлены на С-конце в большинстве бактериальных белков. Из-за структурной нерегулярности пролина, имеющего вторичный амин вместо первичного, пептидил-Pro-тРНК ^Pro в A-сайте будет мешать доступу фактора высвобождения пептида (Janssen and Hayes, 2009), а не этому. комплекса Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu · GTP. Соответственно, ограниченные количества аминоацил-тРНК или фактора высвобождения индуцируют трансляцию транс , что указывает на конкуренцию трансляции транс с аминоацил-тРНК и фактором высвобождения за смысловые и несмысловые кодоны, соответственно, в остановившейся рибосоме (Иванова и др. al., 2004; Асано и др., 2005; Ли и др., 2007). Последовательные остатки пролина также влияют на перенос пептидила во время процесса элонгации, вызывая остановку трансляции, которая может быть устранена с помощью EF-P (Doerfel et al., 2013; Ude et al., 2013).

Эти in vivo и in vitro исследования вместе уладили противоречие, показанное выше: в некоторых ситуациях трансляция может останавливаться даже в середине мРНК, и такая застопорившаяся рибосома может быть потенциальной мишенью для трансляции trans , хотя это по существу будет происходить только после расщепления мРНК вокруг A-сайта с помощью RelE или другой еще не идентифицированной рибонуклеазы с помощью 3’– 5′-экзорибонуклеазы РНКазы II.

Транс -Трансляция как системы контроля качества белка и мРНК

Как описано выше, наиболее важная роль трансляции trans заключается в том, чтобы способствовать рециклированию застопорившихся рибосом в клетке. Считается, что трансляция Trans выполняет дополнительные функции в качестве систем контроля качества белка и мРНК.

Большинство продуктов трансляции trans будут нефункциональными, и, следовательно, их накопление может быть вредным для клетки.Чтобы избежать этой ситуации, tag-пептид и, в свою очередь, продукты трансляции trans быстро разлагаются в клетке цитоплазматическими АТФ-зависимыми протеазами (протеазы AAA ⁺), включая ClpXP, ClpAP, Lon и FtsH, а также периплазматическая протеаза Tsp (Prc; фиг. 4). ClpX или ClpA распознают C-концевую последовательность ALAA тега-пептида, чтобы разворачивать продукты трансляции trans АТФ-зависимым образом для деградации ее партнерской пептидазой ClpP (Gottesman et al. , 1998). Тег-пептид специфически связывается с белком SspB, повышая его сродство к ClpX, и, следовательно, считается, что ClpXP играет доминирующую роль в деградации продуктов трансляции транс-, по крайней мере, в β- и γ-протеобактериях (Flynn et al. al., 2001) и, возможно, у α-протеобактерий (Lessner et al., 2007). Lon участвует в деградации продуктов трансляции транс- в стрессовых условиях (Choy et al., 2007). FtsH прикрепляется к цитоплазматической стороне внутренней мембраны для разложения связанных с мембраной продуктов трансляции — (Herman et al., 1998). С-концевая последовательность ALAA tag-пептида, необходимая для ClpXP и ClpAP, является высококонсервативной среди бактерий, за исключением Mycoplasma , у которой tag-пептид заканчивается AFA вместо ALAA. Это может быть решено отсутствием ClpXP, ClpAP и Tsp в Mycoplasma (Gur and Sauer, 2008; Ge and Karzai, 2009).

РИСУНОК 4. Пути спасения рибосом вместе с путями сворачивания и деградации в клетке E. coli . Пути сворачивания и разложения показаны синим и красным соответственно.

В то время как трансляция транс и индуцируется расщеплением мРНК в остановившейся рибосоме, как описано выше, трансляция транс также способствует дальнейшей деградации безостановочной мРНК (Yamamoto et al., 2003). Trans -трансляция д. Обнажать 3′-конец нон-стоп мРНК, секвестрированной остановившейся рибосомой, облегчая доступ 3’– 5′-экзорибонуклеазы для деградации нон-стоп мРНК. Это должно быть большим преимуществом для клетки, учитывая, что остановка рибосомы будет повторяться до тех пор, пока безостановочная мРНК не будет деградировать, даже если остановившаяся рибосома на 3′-конце полисомы будет спасена с помощью трансляции транс и .РНКаза R является вероятным кандидатом на роль такой экзорибонуклеазы (Oussenko et al., 2005; Mehta et al., 2006; Richards et al., 2006; Ge et al., 2011). E. coli РНКаза R образует комплекс с тмРНК и SmpB (Karzai and Sauer, 2001) посредством прямого взаимодействия с SmpB (Liang and Deutscher, 2010). Он индуцируется в стрессовых условиях у E. coli (Chen and Deutscher, 2005) и участвует в регулируемой клеточным циклом деградации тмРНК у Caulobacter crescentus (Hong et al., 2005). E. coli РНКаза R ацетилируется в экспоненциальной фазе, что приводит к экспоненциальной фазо-специфической деградации за счет более прочного связывания с тмРНК · SmpB (Liang et al., 2011).

Физиологическое значение

Trans -Translation

Очевидная универсальность системы трансляции транс среди бактерий предполагает некоторое биологическое значение этой системы. Действительно, он необходим для некоторых бактерий, включая Neisseria gonorrhoeae (Huang et al., 2000), Mycoplasma genitalium (Hutchison et al., 1999), Haemophilus influenzae (Akerley et al., 2002), Helicobacter pylori (Thibonnier et al., 2008) и Shigella flexneri ( et al., 2013a), а его истощение вызывает широкий спектр расстройств. Поскольку ее отсутствие вызывает авирулентность некоторых инфекционных бактерий, система трансляции trans была сосредоточена как эффективная мишень для антибиотиков (Shi et al. , 2011; Ramadoss et al., 2013б).

Многие из этих дефектных фенотипов вызваны дефектом реакции трансляции trans , а не деградацией продуктов трансляции trans (Keiler, 2008). Это говорит о том, что рециклинг рибосом важнее для клетки, чем предотвращение накопления нефункциональных белков. При недостатке аминокислот поступление аминокислот из продуктов трансляции транс- должно стать важным для синтеза нового белка (Pedersen et al., 2003; Ли и др., 2008).

Транс-трансляция часто используется для регуляции экспрессии генов. В E. coli опосредованная тмРНК трансляция нацелена на мРНК для LacI, репрессора лактозного оперона, для ускорения его деградации при истощении глюкозы, что приводит к дерепрессии оперона lac (Abo et al., 2000). В Bacillus subtilis , трансляция транс- происходит вокруг последовательности реагирующего на катаболизм элемента ( cre ), сайта связывания репрессорного белка, контролирующего белок А катаболита (CcpA), в кодирующей области нескольких мРНК, включая мРНК TreP для трегалозофосфорилаза (Fujihara et al. , 2002). Связывание CcpA с последовательностью cre д. Индуцировать транскрипционный барьер для продукции укороченной мРНК (Ujiie et al., 2009). В C. crescentus клеточный цикл (Keiler and Shapiro, 2003a) и инициация репликации ДНК (Keiler and Shapiro, 2003b; Hong et al., 2007) контролируются трансляцией trans -трансляции.

Накапливаются доказательства повышенной важности тмРНК в стрессовых условиях, таких как высокая или низкая температура (Oh and Apirion, 1991; Muto et al., 2000; Shin and Price, 2007), недостаток питательных веществ (Oh and Apirion, 1991; Okan et al., 2006; Abe et al., 2008), обработка этанолом (Muto et al., 2000), обработка кадмием (Muto et al., 2000) и воздействие кислоты (Thibonnier et al., 2008). Стрессы могут увеличивать частоту аберрантной трансляции в клетках, что может быть устранено трансляцией транс . Соответственно, общее количество продуктов трансляции транс- увеличивается в стрессовых условиях (Fujihara et al. , 2002). Возможно, в ответ на повышенную потребность в системе трансляции trans , внутриклеточный уровень тмРНК или SmpB увеличивается с увеличением стресса у некоторых бактерий (Muto et al., 2000; Palecková et al., 2007; Rezzonico et al., 2007).

Система трансляции trans иногда регулирует другие системы реакции на стресс, возможно, посредством экспрессии глобального регулятора. Например, истощение тмРНК вызывает реакцию теплового шока у E. coli (Munavar et al., 2005). Уровень экспрессии сигма-фактора RpoS (сигма S), который контролирует экспрессию ряда генов, участвующих в общем стрессовом ответе, положительно контролируется трансляцией trans в E.coli (Ранкет и Готтесман, 2007). Также предполагается участие трансляции во внеклеточном пути стресс-ответа посредством др. Сигма-фактора, RpoE (сигма E) (Ono et al., 2009). Другие связанные со стрессом белки, включая молекулярный шаперон DnaK, регулируются трансляцией транс- у стрептомицетов (Barends et al. , 2010). Интересно, что экспрессия ArfA, альтернативной системы спасения рибосом (описанной в следующем подразделе), регулируется трансляцией транс (Chadani et al., 2011а; Garza-Sánchez et al., 2011).

Эволюционные аспекты

Trans — Перевод

Хотя это не является важным для жизнеспособности большинства бактерий, тмРНК присутствует повсеместно в бактериальном царстве и в некоторых пластидах или митохондриях некоторых протистов. ТРНК-подобная вторичная структура TLD, а также несколько консенсусных последовательностей, специфичных для тРНК, являются высококонсервативными, за исключением деформированной структуры D-плеча, которая имеет обширное взаимодействие с SmpB. Кроме того, положение третьей пары оснований акцепторного стержня аминокислоты полностью законсервировано как G-U, которое служит мощным детерминантом идентичности для распознавания аланил-тРНК синтетазой (AlaRS).Аланин не может быть абсолютной предпосылкой для трансляции trans , поскольку аминокислота аминоацилирована в тмРНК, как показано Nameki et al. (1999a). Однако AlaRS может быть наиболее предпочтительной аминоацил-тРНК синтетазой для тмРНК, учитывая уникальный способ распознавания AlaRS, который в значительной степени зависит от акцепторной ножки, а не от антикодона. Подобная тРНК структура также будет иметь значение для распознавания EF-Tu и РНКазой P, а также для связывания с рибосомами. В отличие от высокой степени сохранности TLD, в области, богатой псевдоузлами, есть вариации (Nameki et al., 1999b; Уильямс, 2002). Пластидная тмРНК имеет меньше структур псевдоузлов или не имеет их (Gueneau de Novoa and Williams, 2004). Действительно, по крайней мере, последние три из четырех псевдоузлов тмРНК E. coli необязательны для трансляции in vitro (Nameki et al., 2000), хотя они участвуют в правильном сворачивании и процессинге тмРНК (Wower et al., 2004). TLD и богатая псевдоузлами область связаны длинной вырожденной спиралью, которая выступает из TLD в направлении, соответствующем направлению длинного вариабельного плеча тРНК класса II (рисунок 1B; Bessho et al. , 2007). Это направление должно сохраняться в рамках ограничений тРНК-подобного динамического поведения тмРНК в ограниченном пространстве рибосомы, хотя последовательность соединительной спирали менее консервативна.

В некоторых линиях α-протеобактерий, β-протеобактерий, цианобактерий и митохондрий низших эукариот тмРНК разделена на две части, 5′-кодирующая часть обычно включает только два псевдоязыка (PK1 и PK2) с областью, кодирующей тег. между ними и акцепторной частью 3′-аминокислоты, и две части соединяются вместе путем спаривания оснований с образованием тРНК-подобной структуры, аналогичной структуре цельной тмРНК (рисунок 1A; Keiler et al., 2000; Уильямс, 2002; Шаркади и Уильямс, 2004 г.). Ген двухкомпонентной тмРНК циклически пермутирован (Keiler et al., 2000; Williams, 2002; Mao et al., 2009), и пермутированный предшественник может быть преобразован в зрелую двухкомпонентную тмРНК, вероятно, с помощью РНКазы. P и tRNase Z. Сходная стратегия процессинга была обнаружена в гене циркулярно пермутированной тРНК у некоторых примитивных эукариот или архебактерий (Soma et al. , 2007). Было показано, что состоящая из двух частей тмРНК в C. crescentus , принадлежащая α-протеобактериям, действительно функционирует при трансляции trans (Keiler et al., 2000). Цельная или двухкомпонентная тмРНК присутствует в митохондриальном геноме некоторых групп протистов (jakobids; Jacob et al., 2004). У них отсутствует последовательность, кодирующая метку, а также псевдоузлы, что противоречит их способности к бактериальному типу трансляции транс .

SmpB вместе с тмРНК повсеместно присутствует в бактериях. Пластидная тмРНК кодируется пластидным геномом, а пластидная SmpB кодируется ядерным геномом и импортируется из цитоплазмы (Jacob et al., 2005). До сих пор не было сообщений о митохондриальном SmpB. И тмРНК, и SmpB должны были потребоваться при рождении трансляции транс-. Ген тмРНК мог быть образован в результате встраивания чего-либо в ген тРНК ^Ala. Напротив, никто не может предвидеть происхождение SmpB из-за отсутствия его гомолога.

Разнообразие систем спасения застопорившихся переводов

Как описано выше, трансляция trans нацелена на различные виды приостановки трансляции из-за редкого кодона, неэффективного кодона терминации или запрограммированной задерживающей последовательности, но после расщепления мРНК.У бактериальной клетки есть альтернативные механизмы для спасения застопорившейся рибосомы (рис. 4; Himeno, 2010).

Пептидил-тРНК гидролаза (Pth) обладает активностью по гидролизу связи между тРНК и растущим полипептидом пептидил-тРНК после того, как он отпадет от рибосомы. Падение усиливается только за счет RRF, RRF вместе с RF3 (Heurgué-Hamard et al., 1998; Gong et al., 2007) или RRF, IF3 и EF-G (Singh et al., 2008). Первоначально предполагалось, что выпадение происходит в более ранних циклах удлинения.Это кажется разумным, учитывая, что более длинная растущая полипептидная цепь может предотвратить высвобождение пептидил-тРНК из пептидного канала транслирующей рибосомы. Однако было показано, что спад эффективно происходит на 3′-конце нон-стоп мРНК в отсутствие тмРНК (Kuroha et al., 2009). Сверхэкспрессия тмРНК подавляет термочувствительный фенотип Pth (Singh and Varshney, 2004), предполагая, что Pth способствует не только гидролизу выпавшей пептидил-тРНК, но также и спасению застопорившейся рибосомы, или предполагая, что трансляция транс может заменитель спонтанного или стимулирующего фактор спада и последующего гидролиза пептидил-тРНК с помощью Pth.

Недавно было обнаружено, что два белка, ArfA (YhdL) и YaeJ (ArfB), способствуют восстановлению застопорившейся рибосомы. Одиночный нокаут либо E. coli, ArfA, либо тмРНК жизнеспособен, тогда как двойной нокаут является летальным, что объясняет, почему тмРНК не важна для многих бактерий (Chadani et al., 2010). Активность ArfA по спасению рибосом первоначально была продемонстрирована с использованием неочищенного экстракта E. coli (Chadani et al., 2010). Однако один только ArfA не обладает активностью по гидролизу пептидил-тРНК в P-сайте, возможно, из-за отсутствия типичного каталитического мотива GGQ, и для этого требуется помощь RF-2 (Chadani et al. , 2012; Симидзу, 2012). RF-2 обычно действует как кодон-зависимый фактор высвобождения UAA или UGA, в то время как он служит как независимый от стоп-кодонов фактор высвобождения в присутствии ArfA. Интересно, что трансляция белка ArfA останавливается около 3′-конца его мРНК из-за расщепления РНКазой III, и, следовательно, ArfA обычно расщепляется через систему трансляции trans , и только когда клеточная активность трансляции trans становится уменьшенным, является усеченным на С-конце, но активный ArfA синтезируется посредством спонтанного падения или ArfA-опосредованного высвобождения растущего полипептида (Garza-Sánchez et al., 2011; Chadani et al., 2011a). Таким образом, ArfA-опосредованная система спасения рибосом считается резервной системой для трансляции транс . YaeJ также спасает рибосомы, застрявшие на 3′-конце нон-стоп мРНК in vitro, (Handa et al., 2011) и in vivo, (Chadani et al., 2011b). Двойной нокаут E. coli, ArfA и тмРНК является летальным, как описано выше, тогда как сверхэкспрессия YaeJ делает его жизнеспособным (Chadani et al. , 2011a). В отличие от ArfA, YaeJ сам по себе обладает активностью по гидролизу пептидил-тРНК в P-сайте застопорившейся рибосомы, как и ожидалось, исходя из последовательности и структуры, сходной с таковыми из каталитического домена фактора высвобождения бактериального класса I, имеющего мотив GGQ.YaeJ, вероятно, будет действовать как фактор высвобождения стоп-кодон-независимой пептидной цепи, поскольку в нем отсутствует домен распознавания стоп-кодонов, и вместо этого он заменен С-концевым расширением, богатым основными остатками, которое может быть неструктурированным в растворе (Handa et al. ., 2010). В кристаллической структуре E. coli YaeJ в комплексе с остановившейся рибосомой из T. thermophilus C-концевое удлинение YaeJ, как и SmpB, связывается вдоль пути мРНК застопорившейся рибосомы, идущей вниз по течению. мРНК-туннель с α-спиральной структурой (Gagnon et al., 2012). ArfA, как и Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu (GTP), не способствует длинному 3′-удлинению мРНК из области декодирования при входе в остановившуюся рибосому, тогда как YaeJ менее чувствителен (Shimizu, 2012). Таким образом, бактериальные клетки снабжены множеством систем, чтобы справиться с остановленной трансляцией, и поэтому они часто остаются жизнеспособными, даже когда они теряют систему трансляции транс . Судя по фенотипам клеток с истощенным фактором, система трансляции транс должна быть первичной системой спасения рибосом.

Есть несколько сообщений о стресс-специфических системах спасения рибосом. Было показано, что белок теплового шока HSP15 связывается с диссоциированной субъединицей 50S с растущим белком (Korber et al., 2000). При воздействии высокой температуры часть транслирующихся рибосом может преждевременно диссоциировать на субъединицы, хотя пептидил-тРНК остается связанной с диссоциированной субъединицей 50S, если только формирующийся пептид не является коротким. В этой 50S-субъединице HSP15 фиксирует пептидил-тРНК в P-сайте, чтобы сделать A-сайт свободным, предположительно для входа фактора высвобождения пептида (Jiang et al., 2009). Высокая внутриклеточная концентрация ионов магния или низкая температура вызывают остановку трансляции после дефектной транслокации. Он также способствует высвобождению GTPase, EF4 (LepA), которая обычно хранится в клеточной мембране, в цитоплазму, чтобы спасти остановку трансляции за счет обратной транслокации (Pech et al., 2011).

Трансляция часто запрограммированным образом останавливается на определенном сайте мРНК. Как и в случае экспрессии ArfA, описанной выше (Chadani et al., 2011a; Garza-Sánchez et al., 2011), остановка трансляции иногда используется для подавления экспрессии гена с помощью трансляции транс и . С другой стороны, застопорившаяся рибосома часто препятствует доступу средств спасения, чтобы сохранить остановку трансляции для регуляции экспрессии генов. Оперон триптофаназы E. coli ( tna ) индуцируется триптофаном посредством остановки трансляции лидерного пептида (TnaC) путем ингибирования гидролиза пептидил-тРНК ^Pro с помощью RF2 (Yanofsky, 2007). Эта застопорившаяся рибосома не восстанавливается трансляцией trans в присутствии триптофана, хотя она медленно восстанавливается RRF и RF3, что приводит к падению (Gong et al. , 2007). Рибосома также останавливается на внутреннем пролиновом кодоне мРНК E. coli secM , которая активирует трансляцию нижестоящей последовательности, кодирующей SecA, предположительно за счет разрушения вторичной структуры, которая секвестрирует сайт связывания рибосомы (Muto et al. ., 2006). Эта остановка трансляции вызвана неэффективным переносом пептидилом Pro-тРНК ^Pro в A-сайте на растущую пептидил-тРНК в P-сайте, что ингибирует проникновение Ala-тмРНК в A-сайт и A- сайт-специфическое расщепление мРНК (Garza-Sánchez et al., 2006). Трансляция мРНК B. subtilis yidC регулируется посредством остановки трансляции во множестве сайтов на вышестоящей мРНК mifM (Chiba et al., 2009; Chiba and Ito, 2012). Пуромицин менее реагирует на этот арест трансляции, что позволяет предположить, что механизмы спасения рибосом, включая Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu (GTP), также менее доступны для A-сайта этой остановившейся рибосомы. Последовательные кодоны пролина вызывают остановку трансляции из-за неэффективного переноса пептидила между пептидил- (Pro) n-тРНК в P-сайте и Pro-тРНК в A-сайте (Doerfel et al. , 2013; Удэ и др., 2013). В этом случае A-сайт занят Pro-tRNA ^Pro, и, в свою очередь, Ala-tmRNA · SmpB · EF-Tu (GTP), ArfA или YaeJ не сможет получить доступ к этой остановившейся рибосоме. Вместо этого центр пептидилтрансферазы модулируется связыванием EF-P с областью между P-сайтом и E-сайтом, чтобы возобновить перенос пептидила (Blaha et al., 2009). Блокирующие последовательности Pro – Pro – Pro и Gly – Pro – Pro, которые могут быть восстановлены с помощью EF-P, часто обнаруживаются в бактериальных генах, и они могут быть запрограммированы для регуляции экспрессии генов.

Pth необходим для бактерий и широко распространен среди других доменов. В то время как система трансляции транс- универсально существует у бактерий, YaeJ распространяется среди грамотрицательных бактерий, а ArfA имеет более ограниченное распространение среди энтеробактерий. EF-P консервативен среди бактерий, а его гомолог (a / eIF5A) повсеместно присутствует у архей и эукариот. EF4 универсально консервативен среди бактерий. Ни тмРНК, ни SmpB не присутствуют в цитоплазме эукариот, где комплекс Dom34p (Pelota) и GTP-связывающего белка Hbs1 способствует диссоциации субъединицы застопорившейся рибосомы и падению пептидил-тРНК (Shoemaker et al., 2010) совместно с АТФазой, ABCE1 (Pisareva et al., 2011). Комплекс Dom34p · Hbs1 структурно подобен комплексу eRF1 · eRF3 или комплексу аминоацил-тРНК · EF-Tu (Chen et al., 2010), хотя мотив GGQ отсутствует в Dom34, и предполагается, что гидролиз пептидил-тРНК вызывает катализироваться Pth после падения. В митохондриях два белковых фактора, частично похожие на фактор высвобождения бактериального класса I, ICT1 (гомолог YaeJ) и C12orf65, оба лишены домена распознавания стоп-кодона, но сохраняют каталитический мотив GGQ, участвуют в спасении рибосом (Handa et al., 2010; Richter et al., 2010; Когуре и др., 2012, 2014). ICT1 (YaeJ), но не C12orf65, имеет вставку α-спирали в домен GGQ, и, таким образом, ICT1 менее похож на фактор высвобождения класса I. C12orf65 был обнаружен у очень ограниченного числа бактерий. В совокупности было обнаружено, что различные виды гомологов фактора высвобождения, YaeJ, ICT1, C12orf65, ArfA / RF2, Dom34p (Pelota) и Hbs1, участвуют в спасении рибосом. Система трансляции trans уникальна тем, что в ней используется малая РНК и что она предотвращает накопление нефункциональных белков усеченной мРНК в клетке.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарны всем, кто принимал участие в работе. Эта работа была поддержана грантом на научные исследования от Министерства образования, науки, спорта и культуры Японии для Хьюта Химено, грантами на научные исследования (B) и (C) от Японского общества. за содействие науке Акире Муто и субсидии для молодых ученых от Японского общества содействия науке Дайсуке Курите.

Список литературы

Abe, T., Sakaki, K., Fujihara, A., Ujiie, H., Ushida, C., Himeno, H., et al. (2008). tmRNA-зависимая трансляция trans необходима для споруляции в Bacillus subtilis . Мол. Microbiol. 69, 1491–1498. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2008.06381.x