Статья гпк 321: Статья 321 [ГПК РФ] — последняя редакция

Содержание

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 321 ГПК РФ

1. Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 настоящего Кодекса.

2. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.

Комментарий к Статье 321 Гражданского процессуального кодекса

Комментируемая статья предусматривает порядок и срок подачи апелляционных жалобы, представления.

Согласно ч. 1 комментируемой статьи апелляционная жалоба, представление подаются в суд, принявший решение. В случае если апелляционная жалоба, представление поступили в суд апелляционной инстанции, то данные документы должны быть направлены в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с правилами ст. 325 ГПК РФ. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме.

Судам надлежит учитывать разъяснения, содержащиеся в Постановлении Пленума Верховного Суда РФ от 19 июня 2012 г. N 13 "О применении судами норм гражданского процессуального законодательства, регламентирующих производство в суде апелляционной инстанции", согласно которым апелляционные жалоба, представление на не вступившие в законную силу решения суда первой инстанции в соответствии с ч. 1 ст. 321 ГПК РФ подаются через суд, принявший решение.

Подача апелляционных жалобы, представления непосредственно в суд апелляционной инстанции не является основанием для их возвращения заявителю. Исходя из положений ч. 1 ст. 321 ГПК РФ такие апелляционные жалоба, представление подлежат направлению сопроводительным письмом суда апелляционной инстанции в суд, вынесший решение, для совершения действий, предусмотренных ст. 325 ГПК РФ, о чем сообщается лицу, подавшему апелляционные жалобу, представление (п. 5).

Течение месячного срока на подачу апелляционных жалобы, представления, предусмотренного ч. 2 ст. 321 ГПК РФ, начинается согласно ч. 3 ст. 107 и ст. 199 ГПК РФ со дня, следующего за днем составления мотивированного решения суда (принятия решения суда в окончательной форме), и оканчивается согласно ст. 108 ГПК РФ в соответствующее число следующего месяца.

Если составление мотивированного решения суда отложено на определенный срок, который в силу ст. 199 ГПК РФ не должен превышать пять дней со дня окончания разбирательства дела, судья-председательствующий при объявлении резолютивной части решения суда в силу положений ч. 2 ст. 193 ГПК РФ разъясняет лицам, участвующим в деле, их представителям, когда они могут ознакомиться с мотивированным решением суда, что на основании п. 13 ч. 2 ст. 229 ГПК РФ должно быть отражено в протоколе судебного заседания.

Срок на подачу апелляционных жалобы, представления не считается пропущенным, если они были сданы в организацию почтовой связи до двадцати четырех часов последнего дня срока (ч. 3 ст. 108 ГПК РФ). В этом случае дата подачи апелляционных жалобы, представления определяется по штемпелю на конверте, квитанции о приеме заказной корреспонденции либо иному документу, подтверждающему прием корреспонденции (справка почтового отделения, копия реестра на отправку почтовой корреспонденции и т.п.). Указанные правила применяются и в отношении апелляционных жалобы, представления, поданных непосредственно в суд апелляционной инстанции. <...>

Срок для представления возражений с учетом времени подачи апелляционных жалобы, представления (например, апелляционные жалоба, представление поданы в последний день срока обжалования) может быть определен судом за пределами установленного ч. 2 ст. 321 ГПК РФ месячного срока апелляционного обжалования (п. 15).

При поступлении в суд апелляционной инстанции дела с апелляционными жалобой, представлением, поданными с пропуском установленного ст. 321 ГПК РФ срока и (или) не соответствующими требованиям ч. ч. 1 - 3 и 5 ст. 322 ГПК РФ, суд апелляционной инстанции до принятия апелляционных жалобы, представления к своему производству возвращает их вместе с делом сопроводительным письмом в суд первой инстанции для совершения процессуальных действий, предусмотренных ст. ст. 323, 324, 325 ГПК РФ (п. 18).

Если при рассмотрении дела в суде апелляционной инстанции будет установлено, что апелляционные жалоба, представление поданы с пропуском установленного ст. 321 ГПК РФ срока апелляционного обжалования и не решен вопрос о восстановлении этого срока, суд апелляционной инстанции на основании п. 4 ст. 328 ГПК РФ выносит определение об оставлении апелляционных жалобы, представления без рассмотрения по существу (п. 40) <1>.

--------------------------------
<1> Бюллетень Верховного Суда РФ. 2012. N 9.

Статья 321 ГПК РФ с комментариями

Полный текст ст. 321 ГПК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 321 ГПК РФ.

1. Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 настоящего Кодекса.

2. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.

Комментарий к статье 321 ГПК РФ

1. Необходимость подачи апелляционной жалобы (представления) в суд, вынесший решение, продиктована соображениями удобства и целесообразности: в суде первой инстанции находятся материалы рассмотренного дела, судья, принявший обжалуемое решение, знает его обстоятельства, что облегчает совершение действий, предшествующих апелляционной проверке (см. комментарий к ст. 325 ГПК). Соответственно жалоба (представление), поданная непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежит направлению в суд первой инстанции для совершения им этих действий.

2. Исчисление срока для подачи жалобы (представления) осуществляется в соответствии с общими правилами, установленными гл.9 ГПК. В соответствии с ч.3 ст. 107 ГПК, течение процессуального срока, исчисляемого месяцами, начинается на следующий день после даты или наступления события, которым определено его начало.

Так, срок на обжалование решения, вынесенного в окончательной форме 1 июля, начинает течь со 2 июля, а последним днем срока является 1 августа. Соответственно, жалоба считается поданной с соблюдением срока, если она подана 1 августа до окончания рабочего дня непосредственно в суд, принявший решение, либо сдана на почту до 24 ч. указанного дня. В случае отправки жалобы по почте определяющим будет являться дата отправки, а не дата получения жалобы судом, которому она адресована. Если последний день срока приходится на нерабочий день, днем окончания срока считается следующий за ним рабочий день.

3. По общему правилу жалоба (представление) могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения в окончательной форме, но ГПК устанавливает из него исключения. Например, апелляционная жалоба на решение суда о защите избирательных прав и права на участие в референдуме, вынесенные в период избирательной кампании, кампании референдума, могут быть поданы в течение пяти дней (ч.3 ст. 261 ГПК). Срок на обжалование по общему правилу начинает течь с момента принятия решения суда в окончательной форме. Решение считается принятым в окончательной форме, когда оно изготовлено в виде документа, содержащегося все необходимые части решения: вводную, описательную, мотивировочную и резолютивную. При этом резолютивная часть решения должна быть объявлена в том же судебном заседании, в котором закончилось разбирательство дела, а изготовление мотивировочной части может быть отложено на срок не более чем пять дней со дня окончания разбирательства дела (ч.1 ст. 199 ГПК). Согласно ч.2 ст. 193 ГПК, при объявлении только резолютивной части решения суда председательствующий обязан разъяснить, когда лица, участвующие в деле, и их представители, могут ознакомиться с мотивированным решением суда.

Заочное решение может быть обжаловано в апелляционном порядке в течение месяца по истечении срока подачи ответчиком заявления об отмене этого решения, а в случае подачи такого заявления - в течение месяца со дня вынесения определения суда об отказе в удовлетворении этого заявления. Пропуск срока на обжалование по причинам, признанным судом уважительными, может быть восстановлен (статья 112 ГПК РФ). В качестве уважительных причин, которые могут оправдать пропуск заинтересованным лицом срока на подачу апелляционных жалобы, представления в судебной практике рассматриваются различные обстоятельства, препятствующие своевременному ознакомлению с мотивированным решением суда (непредвиденные события, болезнь, командировка, необоснованный отказ работников суда в ознакомлении с вынесенным решением либо с материалами гражданского дела, и т.п.), несвоевременная высылка лицам, участвующим в деле, но не присутствующим в судебном заседании, копии решения суда в порядке ст. 214 ГПК, задержка рассмотрения замечаний на протокол судебного заседания, а также в случаях, когда несоблюдение судом установленного ст. 199 ГПК срока, на который может быть отложено составление мотивированного решения, привело к невозможности подачи мотивированных жалобы и представления в установленный для этого срок.

_______________
См.: Комментарий к Гражданскому процессуальному кодексу Российской Федерации / под ред. Г.А.Жилина. М., 2011. С. 662; автор комментария к ст. 338 ГПК Н.К.Толчеев.

Консультации и комментарии юристов по ст 321 ГПК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 321 ГПК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Статья 321 ГПК РФ. Действующая редакция ст. с комментариями

(официальная действующая редакция, полный текст статьи 321 ГПК РФ. Комментарии кодекса)


1. Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 настоящего Кодекса.

2. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.


Комментарии статьи 321 ГПК РФ. Порядок и срок подачи апелляционных жалобы, представления

Обжалование решений в апелляционном порядке — процессуальное действие. Согласно ст. 107 ГПК процессуальные действия совершаются в сроки, установленные федеральным законом.

Для подачи апелляционной жалобы, апелляционного представления ст. 321 ГПК установлен месячный срок, начало течения которого исчисляется со дня принятия решения в окончательной форме.

Для обжалования в апелляционном порядке заочного решения законом установлен иной срок. В соответствии с ч. 2 ст. 237 ГПК заочное решение мирового судьи может быть обжаловано в апелляционном порядке по истечении срока подачи ответчиком заявления об отмене этого решения суда.

При выяснении вопроса о соблюдении установленного законом процессуального срока на апелляционное обжалование суду следует руководствоваться как непосредственно ст. 321 ГПК, так и ст. ст. 107, 108 ГПК.

При исчислении срока на апелляционное обжалование следует помнить о том, что течение процессуального срока, исчисляемого месяцами, истекает в соответствующее число последнего месяца срока. В случае, когда последний день процессуального срока приходится на нерабочий день, днем окончания срока считается следующий за ним рабочий день.

Процессуальное действие, для совершения которого установлен процессуальный срок, может быть совершено до 24 часов последнего дня срока. Если апелляционная жалоба сдана на почту или на телеграф до 24 часов последнего дня срока, то срок не считается пропущенным.

В соответствии со ст. 198 ГПК решение суда состоит из вводной, описательной, мотивировочной и резолютивной частей. Под принятием решения в окончательной форме понимается решение суда, состоящее из указанных четырех частей.

Решение суда принимается немедленно после разбирательства дела. Закон допускает отложение составления мотивированного решения суда на срок не более чем пять дней со дня окончания разбирательства дела, но резолютивную часть решения суд должен объявить в том же судебном заседании, в котором закончилось разбирательство дела (см. комментарии к ст. 199 ГПК).

Если судья отложил составление мотивированного решения на определенный в законе срок, то течение срока на апелляционное обжалование этого решения начнется на следующий день после составления мотивированного решения. Если же судья не воспользовался правом на отложение составления мотивированного решения, принял и объявил решение сразу после разбирательства дела, то исчисление срока на его обжалование начинается на следующий день после принятия и объявления решения.

В случае пропуска срока на апелляционное обжалование лицо, подающее апелляционные жалобу, представление, вправе обратиться в суд с просьбой о восстановлении пропущенного срока.

При решении вопроса о восстановлении срока на апелляционное обжалование решения необходимо руководствоваться ст. ст. 109, 112 ГПК. Заявление о восстановлении пропущенного срока на апелляционное обжалование подается в суд первой инстанции и рассматривается в судебном заседании. Лица, участвующие в деле, извещаются о времени и месте судебного заседания, однако их неявка не является препятствием к разрешению поставленного вопроса.

Одновременно с подачей заявления о восстановлении пропущенного срока на апелляционное обжалование необходимо подать апелляционные жалобу, представление.

Суд первой инстанции, рассмотрев заявление о восстановлении пропущенного срока на апелляционное обжалование и признав причины пропуска срока уважительными, своим определением восстанавливает пропущенный срок. При признании причин пропуска срока на апелляционное обжалование неуважительными он отказывает в восстановлении этого срока. В последнем случае апелляционные жалоба, представление возвращаются лицу, которым они были поданы.

На определение о восстановлении или об отказе в восстановлении пропущенного срока на апелляционное обжалование может быть подана частная жалоба.

В случае пропуска срока на апелляционное обжалование и отсутствия со стороны лица, подавшего апелляционные жалобу, представление, ходатайства о восстановлении пропущенного срока апелляционные жалоба, представление не рассматриваются судом и возвращаются лицу, которым они были поданы.

Дополнительный комментарий к статье 321 ГПК РФ

Установленный ч. 1 комментируемой статьи 321 ГПК РФ порядок подачи жалобы, представления на не вступившие в законную силу решения суда первой инстанции предусматривает, что апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение.

При разрешении вопроса о принятии апелляционных жалобы, представления судья должен проверить, соблюдены ли установленные законом условия и порядок возбуждения апелляционного производства, в частности: обладает ли лицо, подавшее жалобу или принесшее представление, правом апелляционного обжалования, принесения представления; не вступило ли решение, на которое подана жалоба или принесено представление, в законную силу; соблюдены ли требования закона, предъявляемые к содержанию апелляционных жалобы, представления; оплачена ли апелляционная жалоба государственной пошлиной в случаях, когда это предусмотрено законом.

Право апелляционного обжалования решения суда принадлежит сторонам и другим лицам, участвующим в деле. Кроме того, согласно новой редакции статьи 320 ГПК РФ апелляционную жалобу вправе подать лица, которые не были привлечены к участию в деле, но вопрос о правах и об обязанностях которых был разрешен судом. Право принесения апелляционного представления принадлежит и прокурору, участвующему в деле.

Согласно ч. 1 комментируемой статьи 321 ГПК РФ подача апелляционных жалоб и представлений непосредственно в суд апелляционной инстанции исключается. Если апелляционные жалоба, представление поступили непосредственно в апелляционную инстанцию, они подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями ст. 325 ГПК РФ.

Если апелляционные жалоба, представление поданы лицами, не имеющими права на их подачу, судья должен вынести определение об отказе в принятии жалобы, представления. На определение судьи об отказе в принятии апелляционных жалобы, представления могут быть поданы частная жалоба и принесено представление прокурора. Подобная позиция была разъяснена Пленумом Верховного Суда РФ для случаев, когда подавались кассационные жалоба, представление лицами, не имеющими на это права. Подобный подход необходимо соблюдать судьям и в отношении апелляционного производства. Необходимо отметить, что данный вопрос прямо в ГПК РФ не регламентирован. 

В гражданском процессуальном законодательстве зарубежных стран предусматривается наступление различных правовых последствий в случае отсутствия предпосылок права на апелляционное обжалование. Так, апелляционная жалоба, поданная лицом, которое не является лицом, участвующим в деле, или его представителем, не принимается и возвращается лицу, ее подавшему. Судья отказывает в принятии кассационной жалобы или кассационного протеста: 1) лицам, не имеющим права на обжалование или опротестование; 2) если судебное постановление не подлежит обжалованию или опротестованию в силу закона; 3) лицам, пропустившим установленный Кодексом срок, если отказано в его восстановлении.

Пункт 2 комментируемой статьи 321 ГПК РФ устанавливает новый срок для обжалования судебных решений, не вступивших в законную силу. Теперь ГПК РФ и АПК РФ предусматривают одинаковый срок для подачи апелляционных жалоб, который равен одному месяцу.

Отметим, что месячный срок для обжалования — это общее правило, иные сроки могут быть установлены в самом ГПК РФ. Иной срок для подачи апелляционной жалобы установлен, например, ст. 232.4 ГПК РФ. 

Срок на апелляционное обжалование начинает течь на следующий день после принятия решения в окончательной форме в соответствии со ст. 199 ГПК РФ. По правилам названной статьи решение суда принимается немедленно после разбирательства дела. Но составление мотивированного решения суда может быть отложено на срок не более чем пять дней со дня окончания разбирательства дела, при этом резолютивную часть решения суд должен объявить в том же судебном заседании, в котором закончилось разбирательство дела.

Таким образом, окончательно решение может быть изготовлено на следующий день после его объявления или через день, а может и на пятый день после судебного заседания. Для участников процесса дата изготовления решения в окончательной форме — вопрос неизвестный, в связи с чем может возникнуть спор о начале течения срока для обжалования судебных решений, не вступивших в законную силу. 

Судебная практика к статье 321 ГПК РФ

Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 19.06.2012 N 13 «О применении судами норм гражданского процессуального законодательства, регламентирующих производство в суде апелляционной инстанции»

5. Апелляционные жалоба, представление на не вступившие в законную силу решения суда первой инстанции в соответствии с частью 1 статьи 321 ГПК РФ подаются через суд, принявший решение.

Подача апелляционных жалобы, представления непосредственно в суд апелляционной инстанции не является основанием для их возвращения заявителю. Исходя из положений части 1 статьи 321 ГПК РФ такие апелляционные жалоба, представление подлежат направлению сопроводительным письмом суда апелляционной инстанции в суд, вынесший решение, для совершения действий, предусмотренных статьей 325 ГПК РФ, о чем сообщается лицу, подавшему апелляционные жалобу, представление.

6. Течение месячного срока на подачу апелляционных жалобы, представления, предусмотренного частью 2 статьи 321 ГПК РФ, начинается согласно части 3 статьи 107 и статье 199 ГПК РФ со дня, следующего за днем составления мотивированного решения суда (принятия решения суда в окончательной форме), и оканчивается согласно статье 108 ГПК РФ в соответствующее число следующего месяца.

Если составление мотивированного решения суда отложено на определенный срок, который в силу статьи 199 ГПК РФ не должен превышать пять дней со дня окончания разбирательства дела, судья-председательствующий при объявлении резолютивной части решения суда в силу положений части 2 статьи 193 ГПК РФ разъясняет лицам, участвующим в деле, их представителям, когда они могут ознакомиться с мотивированным решением суда, что на основании пункта 13 части 2 статьи 229 ГПК РФ должно быть отражено в протоколе судебного заседания.

Срок на подачу апелляционных жалобы, представления не считается пропущенным, если они были сданы в организацию почтовой связи до двадцати четырех часов последнего дня срока (часть 3 статьи 108 ГПК РФ). В этом случае дата подачи апелляционных жалобы, представления определяется по штемпелю на конверте, квитанции о приеме заказной корреспонденции либо иному документу, подтверждающему прием корреспонденции (справка почтового отделения, копия реестра на отправку почтовой корреспонденции и т.п.). Указанные правила применяются и в отношении апелляционных жалобы, представления, поданных непосредственно в суд апелляционной инстанции.

Судам следует учитывать, что ГПК РФ могут быть предусмотрены сокращенные сроки подачи апелляционных жалобы, представления на судебные постановления по отдельным категориям дел. 

8. Заявление о восстановлении срока на подачу апелляционных жалобы, представления рассматривается судом первой инстанции по правилам статьи 112 ГПК РФ в судебном заседании с извещением участвующих в деле лиц, неявка которых не является препятствием к разрешению поставленного перед судом вопроса.

При решении вопроса о восстановлении срока апелляционного обжалования лицам, не привлеченным к участию в деле, о правах и обязанностях которых судом принято решение, судам первой инстанции следует учитывать своевременность обращения таких лиц с заявлением (ходатайством) о восстановлении указанного срока, которая определяется исходя из сроков, установленных статьями 321, 332 ГПК РФ и исчисляемых с момента, когда они узнали или должны были узнать о нарушении их прав и (или) возложении на них обязанностей обжалуемым судебным постановлением.

Пропуск прокурором срока принесения апелляционного представления не лишает лицо, в интересах которого прокурор обращался с заявлением в суд первой инстанции, права самостоятельно обратиться с заявлением (ходатайством) о восстановлении срока подачи апелляционной жалобы.

10. После поступления апелляционных жалобы, представления в суд первой инстанции судье исходя из требований статей 320, 321, 322 ГПК РФ следует проверять, подлежит ли судебное постановление обжалованию в апелляционном порядке; обладает ли лицо, подавшее апелляционную жалобу, и прокурор, принесший апелляционное представление, правом апелляционного обжалования; соблюден ли установленный законом срок апелляционного обжалования; соблюдены ли требования закона, предъявляемые к содержанию апелляционных жалобы, представления; приложена ли доверенность или иной документ, удостоверяющий полномочия представителя, если в деле отсутствуют документы, удостоверяющие полномочия представителя; подписаны ли апелляционные жалоба, представление; соответствует ли число копий апелляционных жалобы, представления и приложенных к ним документов числу лиц, участвующих в деле; оплачена ли апелляционная жалоба государственной пошлиной в случаях, когда это предусмотрено законом.

Определение Верховного Суда РФ от 15.01.2019 N 5-КГ18-289

Обстоятельства: Определением отказано в удовлетворении заявления о восстановлении срока подачи апелляционной жалобы на решение суда по делу о взыскании задолженности по кредитному договору.

Решение: Определение отменено. Дело направлено на новое рассмотрение, поскольку судами не установлено каких-либо фактов и событий, имевших место на момент вынесения решения или после его вынесения, из которых бы следовало, что заявитель знал или должен был знать о принятом судебном решении.

В соответствии с частью 2 статьи 321 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены данным кодексом.

Определение Верховного Суда РФ от 18.12.2018 N 67-КГ18-22

Обстоятельства: Определением отказано в удовлетворении ходатайства о восстановлении пропущенного процессуального срока для подачи апелляционной жалобы, так как заявителем не представлено доказательств наличия уважительных причин пропуска данного срока.

Решение: Определение отменено. Пропущенный процессуальный срок на подачу апелляционной жалобы восстановлен. Дело направлено в суд первой инстанции для выполнения действий, предусмотренных ст. 325 ГПК РФ, поскольку причины пропуска заявителем указанного процессуального срока непосредственно связаны с его личностью и объективно затрудняли его возможность подать апелляционную жалобу в установленный законом срок.

Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом (часть 2 статьи 321 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации).

Определение Верховного Суда РФ от 30.07.2018 N 46-КГ18-27

Обстоятельства: Определением отказано в удовлетворении заявления о восстановлении пропущенного процессуального срока на подачу апелляционной жалобы, так как заявителем не представлено доказательств наличия уважительных причин пропуска указанного срока.

Решение: Определение отменено, заявление удовлетворено. Дело направлено в суд первой инстанции для выполнения действий, предусмотренных ст. 325 ГПК РФ, поскольку вывод об отсутствии доказательств, подтверждающих наличие у заявителя уважительных причин пропуска процессуального срока, судом не мотивирован, установлено, что указанные заявителем обстоятельства затрудняли его возможность подать апелляционную жалобу в установленный законом срок.

Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены Кодексом (часть 2 статьи 321 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации).

Статья 321 ГПК РФ. Порядок и срок подачи апелляционных жалобы, представления

Гражданский процессуальный кодекс Российской Федерации:

Статья 321 ГПК РФ. Порядок и срок подачи апелляционных жалобы, представления

1. Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 настоящего Кодекса.

2. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.


Вернуться к оглавлению документа: Гражданский процессуальный кодекс РФ

Комментарии к статье 321 ГПК РФ, судебная практика применения

В п. п. 14 - 20 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 22.06.2021 N 16 "О применении судами норм гражданского процессуального законодательства, регламентирующих производство в суде апелляционной инстанции" содержатся следующие разъяснения:

Апелляционная жалоба может быть как в суд первой, так и апелляционной инстанции

Апелляционные жалоба, представление на не вступившие в законную силу решения суда первой инстанции в соответствии с частью 1 статьи 321 ГПК РФ подаются через суд, принявший решение.

Подача апелляционных жалобы, представления непосредственно в суд апелляционной инстанции не является основанием для их возвращения заявителю. Исходя из положений части 1 статьи 321 ГПК РФ такие апелляционные жалоба, представление подлежат направлению судом апелляционной инстанции в суд, принявший решение, для совершения действий, предусмотренных статьей 325 ГПК РФ, о чем сообщается лицу, подавшему апелляционные жалобу, представление.

Сроки отложения составления мотивировочной части решения суда

Если в судебном заседании, в котором закончилось разбирательство дела, объявлена только резолютивная часть решения суда, судья-председательствующий в силу части 2 статьи 193 ГПК РФ разъясняет лицам, участвующим в деле, их представителям, когда они могут ознакомиться с мотивированным решением суда, что в соответствии с пунктом 13 части 2 статьи 229 ГПК РФ должно быть отражено в протоколе судебного заседания.

Согласно части 2 статьи 199 ГПК РФ составление мотивированного решения суда может быть отложено на срок не более пяти дней со дня окончания разбирательства дела, за исключением особенностей, установленных для решений по делам упрощенного производства (часть 6 статьи 199, статья 232.4 ГПК РФ), для решений мировых судей (части 3 - 5 статьи 199 ГПК РФ), а также в иных предусмотренных законом случаях.

Исчисление срока на подачу апелляционной жалобы

Течение месячного срока на подачу апелляционных жалобы, представления, предусмотренного частью 2 статьи 321 ГПК РФ, начинается согласно части 3 статьи 107 и статье 199 ГПК РФ со дня, следующего за днем принятия решения, а если в судебном заседании объявлялась только резолютивная часть решения, - со дня, следующего за днем составления мотивированного решения суда, и оканчивается в соответствующее число следующего месяца - число, соответствующее дате составления мотивированного решения.

Например, если мотивированное решение составлено 31 июля, то последним днем подачи апелляционных жалобы, представления является 31 августа (до 24 часов) - число, соответствующее дате составления мотивированного решения.

Если в следующем месяце нет соответствующего числа, срок истекает в последний день этого месяца (например, если мотивированное решение составлено 31 марта, то последним днем срока является 30 апреля), а если последний день срока выпадает на выходной день (суббота или воскресенье) либо на нерабочий праздничный день, днем окончания срока считается следующий за ним первый рабочий день (части 1 и 2 статьи 108 ГПК РФ, статьи 111 и 112 Трудового кодекса РФ).

В случаях, когда срок на апелляционное обжалование исчисляется днями, в него не включаются выходные и нерабочие праздничные дни (часть 3 статьи 107 ГПК РФ, статьи 111 и 112 Трудового кодекса РФ), если иное не установлено ГПК РФ.

Срок на обжалование решений мировых судей, решений вынесенных в порядке упрощенного производства

Срок на обжалование решений мировых судей, который составляет один месяц, а также срок на обжалование решений по делам, рассмотренным в порядке упрощенного производства, который составляет пятнадцать дней, исчисляется со дня, следующего за днем принятия этих решений, а в случае составления мотивированного решения по заявлению лиц, имеющих на это право, - со дня, следующего за днем составления мотивированного решения (часть 3 статьи 107, части 3 - 5 статьи 199, часть 8 статьи 232.4 ГПК РФ).

В каком случае срок не подачу апелляционной жалобы не считается пропущенным

Срок на подачу апелляционных жалобы, представления не считается пропущенным, если они были сданы в организацию почтовой связи до двадцати четырех часов последнего дня срока (часть 3 статьи 108 ГПК РФ). В этом случае дата подачи апелляционных жалобы, представления определяется по штемпелю на конверте, квитанции о приеме заказной корреспонденции либо иному документу, подтверждающему прием корреспонденции (справка почтового отделения, копия реестра на отправку почтовой корреспонденции и т.п.). Указанные правила применяются и в отношении апелляционных жалобы, представления, поданных непосредственно в суд апелляционной инстанции.

В случае подачи апелляционных жалобы, представления в электронном виде посредством заполнения формы, размещенной на официальном сайте соответствующего суда в информационно-телекоммуникационной сети "Интернет", дата подачи жалобы, представления определяется датой и временем их поступления в соответствующую информационную систему.

Заявление о восстановлении пропущенного срока апелляционного обжалования

Лицо, пропустившее срок апелляционного обжалования, вправе обратиться в суд, принявший решение, с заявлением (ходатайством) о восстановлении пропущенного процессуального срока. В заявлении (ходатайстве) должны быть указаны причины пропуска срока на подачу апелляционных жалобы, представления, а также подтверждающие их доказательства.

Ходатайство лица, пропустившего срок апелляционного обжалования, о восстановлении этого срока может содержаться непосредственно в апелляционных жалобе, представлении.

В случае пропуска прокурором срока принесения апелляционного представления лицо, в интересах которого прокурор обращался с заявлением в суд первой инстанции, вправе самостоятельно обратиться в суд с заявлением (ходатайством) о восстановлении срока подачи апелляционной жалобы.

Одновременно с заявлением о восстановлении пропущенного срока в суд первой инстанции в соответствии с требованиями части 3 статьи 112 ГПК РФ должны быть поданы апелляционные жалоба, представление, отвечающие требованиям статьи 322 ГПК РФ.

Если срок на подачу апелляционных жалобы, представления не пропущен и апелляционные жалоба, представление соответствуют требованиям статьи 322 ГПК РФ, то суд первой инстанции выполняет действия, предусмотренные статьей 325 ГПК РФ. Заявление о восстановлении срока в этом случае не рассматривается.

При подаче апелляционных жалобы, представления с заявлением (ходатайством) о восстановлении пропущенного процессуального срока суд первой инстанции сначала рассматривает заявление (ходатайство) о восстановлении срока.

Заявление (ходатайство) о восстановлении срока на подачу апелляционных жалобы, представления рассматривается судом первой инстанции в судебном заседании с извещением участвующих в деле лиц, неявка которых не является препятствием к разрешению поставленного перед судом вопроса (часть 4 статьи 112 ГПК РФ).

Вопросы восстановления процессуального срока в упрощенном производстве (глава 21.1 ГПК РФ) рассматриваются судьей единолично без проведения судебного заседания.

Уважительные причины пропуска срока на апелляционное обжалование

Суд первой инстанции на основании статьи 112 ГПК РФ восстанавливает срок на подачу апелляционных жалобы, представления, если признает причины его пропуска уважительными.

К уважительным причинам могут быть отнесены объективные обстоятельства, препятствующие совершению заявителем соответствующих процессуальных действий (например, чрезвычайные ситуации и происшествия: наводнение, пожары, землетрясение, эпидемия и т.п.).

В отношении граждан к уважительным причинам пропуска срока могут быть отнесены также обстоятельства, связанные с личностью заявителя (тяжелая болезнь, беспомощное состояние и т.п.), семейные обстоятельства (смерть или тяжелое заболевание членов семьи и близких родственников, иные ситуации, требующие личного участия заявителя), а также иные обстоятельства, если они исключали либо существенно затрудняли подачу апелляционной жалобы в установленные законом сроки.

Подробнее об уважительных причинах пропуска срока апелляционного обжалования см. п. 20 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 22.06.2021 N 16, комментарии к статье 112 ГПК РФ.

Статья 321 ГПК РФ и комментарии к ней

1. Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 настоящего Кодекса.

2. Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.

Комментарий к статье 321 Гражданского Процессуального Кодекса РФ

1. Установленный ч. 1 комментируемой статьи порядок подачи жалобы, представления на не вступившие в законную силу решения суда первой инстанции предусматривает, что апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение.

При разрешении вопроса о принятии апелляционных жалобы, представления судья должен проверить, соблюдены ли установленные законом условия и порядок возбуждения апелляционного производства, в частности: обладает ли лицо, подавшее жалобу или принесшее представление, правом апелляционного обжалования, принесения представления; не вступило ли решение, на которое подана жалоба или принесено представление, в законную силу; соблюдены ли требования закона, предъявляемые к содержанию апелляционных жалобы, представления; оплачена ли апелляционная жалоба государственной пошлиной в случаях, когда это предусмотрено законом.

С 1 января 2012 г. действует новая редакция ст. 320 ГПК РФ о праве апелляционного обжалования. Право апелляционного обжалования решения суда принадлежит сторонам и другим лицам, участвующим в деле. Кроме того, согласно новой редакции комментируемой статьи апелляционную жалобу вправе подать лица, которые не были привлечены к участию в деле, но вопрос о правах и об обязанностях которых был разрешен судом. Право принесения апелляционного представления принадлежит и прокурору, участвующему в деле.

Часть 3 ст. 320 ГПК РФ, по сути, закрепляет позицию, определенную в Постановлении Конституционного Суда РФ от 20 февраля 2006 г. N 1-П "По делу о проверке конституционности положения статьи 336 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации в связи с жалобами граждан К.А. Инешина, Н.С. Никонова и открытого акционерного общества "Нижнекамскнефтехим" <1>. Согласно указанной позиции по своему конституционно-правовому смыслу в системе действующего гражданского процессуального законодательства положения ст. 336 ГПК РФ не предполагают в случае отсутствия кассационной жалобы лиц (до 1 января 2012 г. на не вступившее в силу решение суда подавалась кассационная жалоба), участвующих в деле, отказ суда второй инстанции в принятии к рассмотрению поданных в установленный законом срок жалоб лиц, не привлеченных к участию в деле при его рассмотрении в суде первой инстанции, для кассационной проверки наличия такого основания для отмены решения суда первой инстанции, как разрешение вопроса о правах и обязанностях лиц, не привлеченных к участию в деле. Исходя из этого и кассационные жалобы таких лиц должны были приниматься к рассмотрению. Теперь это правило прямо закреплено в ГПК РФ.

--------------------------------
<1> СЗ РФ. 2006. N 10. Ст. 1145.

Согласно ч. 1 комментируемой статьи подача апелляционных жалоб и представлений непосредственно в суд апелляционной инстанции исключается. Если апелляционные жалоба, представление поступили непосредственно в апелляционную инстанцию, они подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями ст. 325 ГПК РФ.

Если апелляционные жалоба, представление поданы лицами, не имеющими права на их подачу, судья должен вынести определение об отказе в принятии жалобы, представления. На определение судьи об отказе в принятии апелляционных жалобы, представления могут быть поданы частная жалоба и принесено представление прокурора. Подобная позиция была разъяснена Пленумом Верховного Суда РФ для случаев, когда подавались кассационные жалоба, представление лицами, не имеющими на это права. Подобный подход необходимо соблюдать судьям и с 1 января 2012 г. в отношении апелляционного производства. Необходимо отметить, что данный вопрос прямо в ГПК РФ не регламентирован. Впрочем, подобного правила не содержал Кодекс и до 1 января 2012 г. В юридической литературе есть предложения о необходимости введения института отказа в принятии жалоб на не вступившие в законную силу судебные решения <1>.

--------------------------------
<1> См., например: Гражданский процесс: Учебник / Под ред. М.К. Треушникова. М., 2003. С. 501.

В гражданском процессуальном законодательстве зарубежных стран предусматривается наступление различных правовых последствий в случае отсутствия предпосылок права на апелляционное обжалование. Так, в соответствии с ч. 3 ст. 416 Гражданского процессуального закона Латвийской Республики апелляционная жалоба, поданная лицом, которое не является лицом, участвующим в деле, или его представителем, не принимается и возвращается лицу, ее подавшему <1>. Согласно ст. 408 ГПК Республики Беларусь судья отказывает в принятии кассационной жалобы или кассационного протеста: 1) лицам, не имеющим права на обжалование или опротестование; 2) если судебное постановление не подлежит обжалованию или опротестованию в силу закона; 3) лицам, пропустившим установленный Кодексом срок, если отказано в его восстановлении <2>.

--------------------------------
<1> Ресурсы Интернета. Институт частного права - Institute for Private Law. Сайт uril.mplik.ru.
<2> Там же.

2. Пункт 2 комментируемой статьи с 1 января 2012 г. устанавливает новый срок для обжалования судебных решений, не вступивших в законную силу. Теперь ГПК РФ и АПК РФ предусматривают одинаковый срок для подачи апелляционных жалоб, который равен одному месяцу.

Отметим, что месячный срок для обжалования - это общее правило, иные сроки могут быть установлены в самом ГПК РФ. Иной срок для подачи апелляционной жалобы установлен, например, п. 3 ст. 261 ГПК РФ. Апелляционная жалоба на решение суда, частная жалоба на определение суда по делу о защите избирательных прав и права на участие в референдуме граждан Российской Федерации, вынесенные в период избирательной кампании, кампании референдума до дня голосования, могут быть поданы в течение пяти дней со дня принятия судом указанных решения, определения.

Срок на апелляционное обжалование начинает течь на следующий день после принятия решения в окончательной форме в соответствии со ст. 199 ГПК РФ. По правилам названной статьи решение суда принимается немедленно после разбирательства дела. Но составление мотивированного решения суда может быть отложено на срок не более чем пять дней со дня окончания разбирательства дела, при этом резолютивную часть решения суд должен объявить в том же судебном заседании, в котором закончилось разбирательство дела.

Таким образом, окончательно решение может быть изготовлено на следующий день после его объявления или через день, а может и на пятый день после судебного заседания. Для участников процесса дата изготовления решения в окончательной форме - вопрос неизвестный, в связи с чем может возникнуть спор о начале течения срока для обжалования судебных решений, не вступивших в законную силу. Особенно этот вопрос был актуален до 1 января 2012 г., поскольку срок обжалования составлял всего лишь 10 дней.

Отметим, что в этой части норма АПК РФ составлена более точно, что исключает какие-либо споры относительно начала течения срока для обжалования судебного решения. Согласно ч. 2 ст. 176 АПК РФ в судебном заседании, в котором закончено рассмотрение дела по существу, может быть объявлена только резолютивная часть принятого решения. В этом случае арбитражный суд объявляет, когда будет изготовлено решение в полном объеме (этот срок не более пяти дней), и разъясняет порядок доведения его до сведения лиц, участвующих в деле.

На практике данное положение снимает все проблемы, связанные с расхождением во времени оглашения резолютивной части решения и вынесения мотивировочного решения. Кроме того, данное правило позволяет вышестоящим инстанциям контролировать соблюдение пятидневного срока изготовления мотивировочной части судебных решений.

Обжалование судебных решений по гражданским делам (ст. 320-321 ГПК РФ)

Обжалование судебных решений по гражданским делам (ст. 320-321 ГПК РФ)

Решения суда первой инстанции, не вступившие в законную силу, могут быть обжалованы в апелляционном порядке в соответствии с правилами, предусмотренными настоящей главой.

Право апелляционного обжалования решения суда принадлежит сторонам и другим лицам, участвующим в деле. Право принесения апелляционного представления принадлежит прокурору, участвующему в деле.

Апелляционную жалобу вправе подать также лица, которые не были привлечены к участию в деле и вопрос о правах и об обязанностях которых был разрешен судом.

Суды, рассматривающие апелляционные жалобы, представления

Апелляционные жалобы, представления рассматриваются:

1) районным судом - на решения мировых судей;

2) верховным судом республики, краевым, областным судом, судом города федерального значения, судом автономной области, судом автономного округа, окружным (флотским) военным судом - на решения районных судов, решения гарнизонных военных судов;

3) апелляционным судом общей юрисдикции - на решения верховных судов республик, краевых, областных судов, судов городов федерального значения, суда автономной области, судов автономных округов, принятые ими по первой инстанции;

4) апелляционным военным судом - на решения окружных (флотских) военных судов, принятые ими по первой инстанции;

5) Апелляционной коллегией Верховного Суда Российской Федерации - на решения Верховного Суда Российской Федерации, принятые по первой инстанции.

Апелляционные жалоба, представление подаются через суд, принявший решение. Апелляционные жалоба, представление, поступившие непосредственно в апелляционную инстанцию, подлежат направлению в суд, вынесший решение, для дальнейших действий в соответствии с требованиями статьи 325 ГПК РФ.

Апелляционные жалоба, представление могут быть поданы в течение месяца со дня принятия решения суда в окончательной форме, если иные сроки не установлены настоящим Кодексом.

Статья 321 ГПК РФ 2016-2021. Порядок и срок подачи апелляционных жалобы, представления . ЮрИнспекция

В апелляционном порядке обжалуется не вступившее в законную силу постановление мирового судьи. В качестве апелляционной инстанции выступает обычный районный суд. Апелляционная инстанция вправе вторично рассмотреть дело по существу. Как это происходит? Право апелляционного обжалования - это право на возбуждение апелляционного производства по проверке законности и обоснованности решения мирового судьи. Таким правом обладают лица, участвующие в деле. Оно возникает со дня вынесения решения мировым судьей в окончательной форме (ст. 321 ГПК РФ) .Апелляционная жалоба может быть подана на решение в целом или в части. Она может быть подана и на заочное решение. А вот судебный приказ такому обжалованию не подлежит. Подать апелляцию вправе истцы, ответчики и третьи лица. Прокурор вправе принести апелляционное представление на решение мирового судьи, если он участвовал в процессе у мирового судьи (ч. 2 ст. 320 ГПК РФ) .Апелляционная жалоба может быть подана в течение 10 дней со дня вынесения решения в окончательной форме. Она подается в районный суд только через мирового судью. В самой жалобе должны быть указаны (ст. 322 ГПК РФ) :- районный суд, которому адресована жалоба;- лицо, подающее жалобу, его процессуальное положение, местожительство или местонахождение;- решение какого мирового судьи обжалуется, дата его вынесения и наименование дела, по которому оно вынесено;- доводы жалобы (в чем состоит неправильность решения, со ссылкой на материалы дела и новые доказательства) ;- просьба заинтересованного лица, которая должна быть сформулирована с учетом полномочий апелляционной инстанции (ст. 328 ГПК РФ) ;- перечень документов, прилагаемых к жалобе. Жалоба подписывается лицом, подающим жалобу, а также представителем.Апелляционная жалоба и приложенные к ней документы должны представляться с копиями по числу участвующих в деле лиц.Если подающий жалобу не освобожден от уплаты госпошлины, то надо ее оплатить. После получения жалобы мировой судья:- направляет участвующим в деле лицам копии жалобы и приложенных к ней документов;- разъясняет им их право представить возражения на жалобу и соответствующие документы.Лица, участвующие в деле, вправе представить мировому судье письменные возражения на апелляционную жалобу с приложением документов, подтверждающих эти возражения, в копиях по числу лиц, участвующих в деле (ч. 2 ст. 325 ГПК РФ) .По истечении срока обжалования мировой судья направляет дело с апелляционной жалобой и поступившими на нее возражениями в районный суд. До истечения срока обжалования дело не может быть направлено. Далее районный судья назначает время и место рассмотрения дела (судебного заседания) , о чем извещает участвующих в деле лиц. В апелляционной инстанции дело рассматривается судьей районного суда единолично. Постановления, вынесенные другими судами по первой инстанции единолично, проверяются кассационной инстанцией коллегиально. Производство по апелляционной жалобе ведется по правилам производства в суде первой инстанции. Судья районного суда:- рассматривает и разрешает повторно дело, по которому вынесено решение мировым судьей;- проверяет законность и обоснованность этого решения. Проверка законности и обоснованности осуществляется как на основании имеющихся в деле материалов и установленных фактов, так и путем установления новых фактов и исследования новых доказательств по делу (ч. 3 ст. 327 ГПК РФ) .Законность и обоснованность решения мирового судьи проверяются апелляционным судом в полном объеме. Заседание апелляционного суда проводится в том же порядке, что и в суде первой инстанции. Что может суд апелляционной инстанции? Согласно статье 328 ГПК РФ апелляционная инстанция в результате рассмотрения жалобы, представления прокурора вправе:- оставить решение мирового судьи без изменения, а жалобу без удовлетворения, если признает, что решение является законным и обоснованным. Разумеется, что суд обязан указать в своем решени

Graphic Packaging (GPK) вышла с квартальной прибылью в размере 0,28 доллара на акцию, что превышает прогноз Zacks Consensus Estimate в 0,27 доллара на акцию. Для сравнения, год назад прибыль компании составляла 0,23 доллара на акцию. Эти цифры скорректированы на единовременные статьи.

Этот квартальный отчет представляет собой неожиданность прибыли в размере 3,70%. Квартал назад ожидалось, что эта упаковочная компания опубликует прибыль в размере 0,22 доллара на акцию, тогда как на самом деле она принесла прибыль в размере 0 долларов.26, что составляет 18,18% сюрпризов.

За последние четыре квартала компания в четыре раза превзошла консенсус-прогноз по прибыли на акцию.

Graphic Packaging, принадлежащая компании Zacks Containers - Paper and Packaging, сообщила о выручке в размере 1,65 миллиарда долларов за квартал, закончившийся в декабре 2020 года, что превысило консенсус-прогноз Zacks на 4,74%. Для сравнения, год назад выручка составила 1,52 миллиарда долларов. Выручка компании за последние четыре квартала превысила консенсус-прогноз в четыре раза.

Устойчивость немедленного движения цены акций, основанная на недавно опубликованных данных и ожиданиях будущих доходов, будет в основном зависеть от комментариев руководства по поводу отчета о прибылях и убытках.

Акции Graphic Packaging с начала года потеряли около 7,6% по сравнению с падением индекса S&P 500 на -1,1%.

Что будет дальше с упаковкой графики?

Хотя в этом году Graphic Packaging пока что отстает от рынка, у инвесторов возникает вопрос: что дальше с акциями?

На этот ключевой вопрос нет простых ответов, но один надежный показатель, который может помочь инвесторам решить эту проблему, - это прогноз прибыли компании.Сюда входят не только текущие консенсусные ожидания по прибыли на ближайшие кварталы, но и то, как эти ожидания изменились в последнее время.

Эмпирические исследования показывают сильную корреляцию между краткосрочными движениями акций и тенденциями в пересмотре оценок прибыли. Инвесторы могут отслеживать такие изменения самостоятельно или полагаться на проверенный инструмент оценки, такой как Zacks Rank, который имеет впечатляющий послужной список использования возможностей пересмотра оценок прибыли.

История продолжается

В преддверии этого отчета о прибылях и убытках тенденция к пересмотру оценок для Graphic Packaging была неоднозначной.Хотя величина и направление пересмотра оценок могут измениться после только что опубликованного отчета о прибылях и убытках компании, текущий статус переводится в рейтинг Zacks № 3 (удержание) для акций. Таким образом, в ближайшем будущем ожидается, что акции будут расти в соответствии с рыночными тенденциями. Вы можете увидеть полный список сегодняшних акций Zacks # 1 Rank (Strong Buy) здесь.

Будет интересно посмотреть, как оценки на ближайшие кварталы и текущий финансовый год изменятся в ближайшие дни. Текущая консенсусная оценка прибыли на акцию составляет $ 0.31 на 1,64 миллиарда долларов дохода в следующем квартале и 1,25 доллара на 6,66 миллиарда долларов дохода в текущем финансовом году.

Инвесторам следует помнить о том, что перспективы развития отрасли также могут оказать существенное влияние на доходность акций. Что касается отраслевого рейтинга Zacks, тара - бумага и упаковка в настоящее время входит в число лучших 35% из 250 с лишним отраслей Zacks. Наше исследование показывает, что лучшие 50% отраслей, попавших в рейтинг Zacks, превосходят нижние 50% более чем в 2 раза.


Хотите получить последние рекомендации от Zacks Investment Research? Сегодня вы можете скачать 7 лучших акций на следующие 30 дней. Нажмите, чтобы получить этот бесплатный отчет

Graphic Packaging Holding Company (GPK): Бесплатный отчет по анализу запасов

Чтобы прочитать эту статью на Zacks.com, нажмите здесь.

Zacks Investment Research

Важная роль микрофибриллярно-ассоциированного белка 4 в кожном гомеостазе человека и в его фотозащите

, 1 , a, 1 , 1 , 2 , 1 , 3 , 4 , 5 , 1 , 5 и 1

Шинья Касамацу

1 Лаборатории биологических наук, Kao Corporation, Хага, Точиги, 321–3497, Япония

Акира Хачия

1 Лаборатории биологических наук, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

Tsutomu Fujimura

1 Лаборатории биологических наук, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

Penkiriyanok Sri

2 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо 45267, США

Кейчи Хакета

1 Биологические науки ence Laboratories, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

Marty O.Visscher

3 Отделение неонатологии и института кожных наук, Медицинский центр детской больницы Цинциннати, Цинциннати, Огайо, 45229, США

Уильям Дж. Китцмиллер

4 Отделение хирургии, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо, 45267, США

Александр Белло

5 Программа по особым патогенам, Национальная микробиологическая лаборатория, Агентство общественного здравоохранения Канады, Департамент медицинской микробиологии, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 3R2, Канада

Такаши Китахара

1 Лаборатории биологических наук, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

Гэри П.Кобингер

5 Программа специальных патогенов, Национальная лаборатория микробиологии, Агентство общественного здравоохранения Канады, Департамент медицинской микробиологии, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 3R2, Канада

Йошинори Такема

1 Лаборатории биологических наук, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

1 Biological Science Laboratories, Kao Corporation, Haga, Tochigi, 321–3497, Япония

2 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо 45267, США

3 Отделение неонатологии и Института кожных наук, Медицинский центр детской больницы Цинциннати, Цинциннати, Огайо, 45229, США

4 Отделение хирургии, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо, 45267, США

5 Специальная программа по патогенам, Национальная лаборатория микробиологии, Агентство общественного здравоохранения Канады, Департамент медицинских микробов иология, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 3R2, Канада

Получено 5 августа 2011 г .; Принята в печать 8 ноября 2011 г.

Авторские права © 2011, Macmillan Publishers Limited. Все права защищеныЭта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

УФ-В-индуцированное фотоповреждение / фотостарение кожи характеризуется качественным и количественным ухудшением компонентов дермального внеклеточного матрикса (ВКМ), таких как коллаген и эластические волокна. Исчезновение микрофибриллярно-ассоциированного белка 4 (MFAP-4), возможного ограничивающего фактора эластичности кожи, было зарегистрировано в фотостарении дермы, но его функция плохо изучена.Чтобы охарактеризовать его возможный вклад в фотозащиту, экспрессия MFAP-4 была либо усилена, либо ингибирована на мышиной модели фотоповреждения ксенотрансплантата кожи человека и человеческих фибробластах. Кожа с ксенотрансплантатом с повышенной экспрессией MFAP-4 была защищена от УФ-В-индуцированного фотоповреждения / фотостарения, что сопровождалось предотвращением деградации ECM и ухудшением эластичности. Кроме того, заметно увеличенное или уменьшенное развитие микрофибрилл на основе фибриллина-1 наблюдалось, когда фибробласты обрабатывали рекомбинантным MFAP-4 или MFAP-4-специфичной миРНК, соответственно.Анализ иммунопреципитации подтвердил прямое взаимодействие между MFAP-4 и фибриллином-1. Взятые вместе, наши результаты показывают важную роль MFAP-4 в фотозащите и предлагают новые терапевтические возможности для предотвращения кожных патологий.

Кожа, внешний барьер тела, играет важную роль в защите от вредных воздействий окружающей среды, включая УФ-излучение, которое, как было документально подтверждено, связано с учащением случаев фотостарения и фотоканцерогенеза, отчасти из-за заметного разрушения стратосферного озона слой за последние десятилетия 1 , 2 , 3 .Фотоповреждение / фотостарение - это термин, описывающий зависящие от времени изменения, которые происходят в коже, постоянно подвергающейся воздействию солнца, что, по-видимому, является ускорением внутреннего процесса старения, который происходит даже в защищенной от солнца коже 4 . Сообщалось, что фотоповреждение / фотостарение кожи физиологически коррелирует с несколькими изменениями, включая повышенную дезорганизацию эластических волокон и уменьшение коллагенов в дермальном ECM 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , а также повышенный уровень кератинов 6 и 16 и ухудшение кератиновых промежуточных филаментов в эпидермисе 13 , 14 , 15 , 16 .Эластичные волокна, а также коллагеновые волокна являются компонентами дермального внеклеточного матрикса, которые в первую очередь отвечают за фиброзный механизм (ы), контролирующий эластичность кожи 5 , 6 , 17 , 18 . В дополнение к дегенерации эластических волокон в коже хронологического и / или фотостарения, которая, как сообщается, связана с повышенной активностью матриксной металлопротеиназы (ММП) -12 и / или эластазы 19 , 20 , 21 , 22 , накопление дистрофического эластического материала в ретикулярной дерме, называемое солнечным эластозом, также часто наблюдается в фотостарении кожи 23 , 24 , 25 .Что касается частоты солнечного эластоза, было продемонстрировано, что УФ-излучение in vivo, и in vitro, повышает экспрессию гена тропоэластина и содержание белка в фибробластах и ​​кератиноцитах, что приводит к аберрантному накоплению эластичных волокон дермы. и содержание эластина 6 , 9 , 11 , 12 , 26 . Однако механизмы, лежащие в основе изменения эластических волокон в фотостареющей коже, включая их образование, накопление и деградацию, на сегодняшний день полностью не охарактеризованы.

Эластичные волокна, несмотря на их меньшее количество по сравнению с коллагеновыми волокнами, представляют собой более крупные структуры ВКМ, которые контролируют эластические свойства соединительных тканей, которые состоят из двух основных компонентов, микрофибрилл и тропоэластина. Одним из основных структурных компонентов микрофибрилл является фибриллин-1, большой (∼350 кДа) гликопротеин, богатый цистеином, количество которого, как сообщается, значительно снижено в тканях и клетках пациентов с синдромом Марфана, у которых наблюдаются глазные, сердечно-сосудистые заболевания. и аномалии скелета 27 , 28 .Кроме того, документально подтверждено, что мономер фибриллина-1 собирается как линейно, так и латерально с образованием каркаса микрофибрилл 29 с последующей его ассоциацией с различными другими белками, включая латентные TGF-β-связывающие белки (LTBP), фибулины. , гликопротеины, ассоциированные с микрофибриллами, и поверхность раздела микрофибрилл эластина, локализованная в белке-1, с образованием зрелых микрофибрилл 30 . С другой стороны, тропоэластин, белок 60–70 кДа, который имеет лизинсодержащие перекрестно-сшивающие и гидрофобные домены, подвергается процессу хорошо регулируемой самоагрегации, называемой коацервацией, которая индуцируется специфическими взаимодействиями каждого гидрофобного домена под действием оптимизированные условия 31 .Коацервация может быть стимулирована повышением температуры и считается важным предварительным условием для сшивки 32 , 33 , 34 . Было высказано предположение, что тропоэластин связывает микрофибриллы с последующей коацервацией для поперечного сшивания лизилоксидазой (LOX) 29 .

Помимо микрофибрилл и тропоэластина, MFAP-4 считался человеческим гомологом 36 кДа микрофибрил-ассоциированного гликопротеина (MAGP-36) из-за его высокого уровня гомологии последовательности Arg-Gly-Asp (RGD), его фибриногена. -подобный домен с аналогичной молекулярной массой, который первоначально был обнаружен в аорте свиньи и обнаружен в эластичных тканях различных животных 35 , 36 , 37 , 38 , 39 .Иммуногистохимическое исследование показало, что MAGP-36, который локализуется вокруг эластичных волокон в аорте крысы и богат микрофибриллами, связанными с эластином, исчез в фотостарении дермы и может быть обнаружен в скоплении дезинтегрированных эластических волокон в пораженной коже при псевдоксантоме. elasticum, расстройство, связанное с эластином 40 . Этот отчет убедительно свидетельствует о том, что MAGP-36 является белком, связанным с микрофибрилами, хотя мало известно о его роли (ах) в эластичных тканях человека.

В этом исследовании модель ксенотрансплантата кожи человека в комбинации с лентивирусным вектором была использована для оценки роли MFAP-4 в коже человека. Несмотря на то, что было проведено множество исследований фотостарения кожи с использованием моделей на животных и заменителей кожи человека, было высказано предположение, что эти результаты могут вводить в заблуждение из-за различий в нижних структурах, таких как относительно тонкий эпидермальный слой и нарушение барьерной функции между подлинная человеческая кожа и модели и что использование реальной человеческой кожи или ксенотрансплантатов человеческой кожи более подходит для исследования фотостарения кожи.Поэтому модель фотоповреждения / фотостарения человека с ксенотрансплантатом, которая была установлена ​​ранее, была представлена ​​в этом исследовании 16 . Наши результаты впервые демонстрируют, что MFAP-4 играет критическую роль в сборке микрофибрилл на основе фибриллина-1 и связан с образованием эластичных волокон, что приводит к защите от фотоповреждения / фотостарения кожи.

Результаты

Изобилие MFAP-4 значительно снижено как в коже с внешним фотостарением, так и в коже с естественным возрастом

Чтобы охарактеризовать возможную функцию MFAP-4 по защите кожи от фотоповреждения и / или старения, экспрессия MFAP -4 оценивали на модели кожи фотостарения, индуцированной повторным воздействием УФВ, и на изначально стареющей коже.Кожа человека, трансплантированная мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), подвергалась 1-2 минимальной дозе эритемы (MED) UVB-излучения в течение 6 недель (недель), и общие РНК извлекались для анализа экспрессии транскриптов. Для экстракции общей РНК также использовались биопсии кожного пунша из брюшной части плеч здоровых кавказских женщин в возрасте от двадцати до пятидесяти лет. Количественный анализ RT-PCR показал, что экспрессия MFAP-4 была значительно ниже в модели фотостарения кожи, что согласуется с предыдущим отчетом 40 ().Точно так же экспрессия MFAP-4 также была значительно нарушена в изначально стареющей коже (), что указывает на потенциальную роль MFAP-4 в защите от старения кожи. В соответствии с оценкой транскрипта мРНК, иммуногистохимическое сравнение с использованием дермы на вентральных плечах (защищенных от солнца областях) образцов кожи европеоидов ясно продемонстрировало, что локализация белка MFAP-4, обнаруженная на дерме в возрасте от 30 до 60 лет, значительно уменьшилась в возрасте от 60 лет. Интересно, что уровни его белка были обнаружены почти полностью в дерме на тыльных сторонах нижних конечностей (подверженных воздействию солнца участков) у доноров в возрасте 60 лет ().

Экспрессия транскриптов MFAP-4 в фотоповрежденной / фотостаренной и изначально состаренной коже.

Был проведен количественный анализ RT-PCR MFAP-4 в коже человека. (а) Экспрессия MFAP-4 в ксенотрансплантированной коже человека после многократных УФ-В-облучений с 1-2 MED в течение 6 недель была нормализована к экспрессии рибосомного белка, RPLP0 , и относительной величине по сравнению с не- показан облученный контроль. (b) MFAP-4 Экспрессия в пункционной биопсии кожи человека в вентральной области плеча молодых (20 лет) и старых (50 лет) кавказских женщин.Представлены результаты, нормализованные по экспрессии RPLP0 . Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. * р <0,05, ** р <0,01.

Более низкое отложение MFAP4 в фотоповрежденной / фотостарой коже, чем в изначально стареющей коже.

Иммуногистологическое окрашивание кроличьими поликлональными антителами к человеческому MFAP-4 и нормальным кроличьим контрольным IgG проводили на залитых парафином срезах биоптатов кожи. Они были взяты из нижнего плеча доноров от 30 до 60 лет или из заднего нижнего отдела рук доноров в возрасте от 60 до 60 лет.Масштабные линейки = 50 мкм.

Сверхэкспрессия MFAP-4 защищает кожу от хронического УФ-B-индуцированного фотоповреждения

После наблюдения подавления экспрессии MFAP-4 как в фотоповрежденной / фотостарой коже, так и в изначально стареющей коже, лентивирусный вектор сверхэкспрессия MFAP-4 вводили субэпидермально в кожу с ксенотрансплантатом, чтобы исследовать, предотвращает ли кожная сверхэкспрессия MFAP-4 фотоповреждение / фотостарение. Экспрессия MFAP-4 в коже, обработанной лентивирусным вектором, кодирующим MFAP-4 , оставалась более высокой, чем в коже, сверхэкспрессирующей контрольный репортерный ген, с помощью вестерн-блоттинга до и после облучения UVB в течение 4 недель (данные не показаны) .Кроме того, иммуногистохимический анализ с использованием ксенотрансплантата кожи сразу после облучения УФВ в течение 8 недель продемонстрировал даже более высокое содержание белка MFAP-4 в коже, обработанной лентивирусным вектором, кодирующим MFAP-4 , чем в коже, сверхэкспрессирующей контрольный репортерный ген. (), предполагая, что более высокая экспрессия MFAP-4 сохранялась в течение экспериментального периода.

Защита кожи от УФ-В-индуцированного фотоповреждения путем усиления экспрессии MFAP-4 .

(a) Лентивирусные векторы для сверхэкспрессии MFAP-4 или контрольного репортерного гена вводили внутрикожно в кожу человека с ксенотрансплантатом дважды с недельным интервалом, подвергая непрерывному УФ-B-облучению при 1-2 MED в течение 8 недель, как указано. (b) Иммуногистологическое окрашивание кроличьими поликлональными антителами к человеческому MFAP-4 и нормальным кроличьим контрольным IgG проводили на залитых парафином срезах необлученной кожи со сверхэкспрессией контрольного репортерного гена, кожи, трансдуцированной контрольным репортерным геном, с облучением UVB для 8 недель и MFAP-4 -сверхэкспрессированная кожа с повторяющимся облучением UVB в течение 8 недель.Масштабные линейки = 100 мкм. (c) En face репрезентативных изображений кожи с ксенотрансплантатом были получены в 0 (до введения лентивируса), 6 (до облучения UVB), 10, 14 (сразу после завершения непрерывного воздействия UVB) и 20 недель (6 недель). после последнего облучения UVB) с помощью ручного микроскопа. Контрольный образец без УФ-В-облучения с избыточной экспрессией контрольного репортерного гена, длительно облученная УФ-В-излучением кожа с избыточной экспрессией контрольного репортерного гена и кожа с избыточной экспрессией MFAP-4 с повторяющимся воздействием УФ-В показаны на верхняя, средняя и нижняя соответственно.Масштабная линейка = 3 мм. (d) Профиль кожи реплик использовали для оценки шероховатости поверхности с использованием средней арифметической шероховатости (Sa) и средней высоты от пика до впадины (Sz) в указанные моменты времени. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. * р <0,05, ** р <0,01. 1; против значений УФ-облученного контроля с избыточной экспрессией контрольного репортерного гена. 2; по сравнению со значениями необлученного контроля со сверхэкспрессией контрольного репортерного гена. (e) Эластичность кожи оценивали с использованием Cutometer SEM575 в те же временные точки, что и оценки шероховатости поверхности кожи.Ur / Ue представляет собой чистую эластичность без учета ползучести. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. * р <0,05. 1; против значений УФ-облученного контроля с избыточной экспрессией контрольного репортерного гена.

Во время хронического облучения УФВ, на лице репрезентативных изображений кожи с ксенотрансплантатом продемонстрировали, что образование борозды индуцировалось постепенно в коже, трансдуцированной контрольным репортерным геном (). Это согласуется с количественным анализом шероховатости поверхности кожи и эластичности кожи, который демонстрирует значительное увеличение обоих параметров (Sa и Sz) ​​через 10 и 14 недель (после воздействия УФ-В в течение 4 и 8 недель) на коже, подвергнутой повторному воздействию УФ-В, по сравнению к контролю, не облученному УФВ, трансфицированному контрольным репортерным геном ().Кроме того, сниженное значение чистой эластичности (Ur / Ue) также было зарегистрировано через 10 недель (после воздействия УФ-В в течение 4 недель) (). Увеличение шероховатости поверхности кожи сохранялось по крайней мере в течение 6 недель после последнего облучения УФВ. Напротив, было обнаружено, что на коже, чрезмерно экспрессирующей MFAP-4 , вызванная ультрафиолетом B шероховатость поверхности, в соответствии с изображениями en face и параметрами шероховатости поверхности кожи (Sa и Sz), демонстрируют значительно более низкие значения по сравнению с показателями в Кожа, подвергшаяся воздействию УФ-В, сверхэкспрессирует контрольный репортерный ген ().Соответственно, значение Ur / Ue было значительно выше в коже, сверхэкспрессирующей MFAP-4 , чем в коже, подвергшейся воздействию УФ-B, сверхэкспрессирующей контрольный репортерный ген через 10 недель (после воздействия УФ-B в течение 4 недель) (), добавление дополнительных доказательств защитной роли MFAP-4 от УФ-В-индуцированного фотоповреждения / фотостарения.

MFAP-4 необходим для сборки эластичных волокон

Обнаружение защитной роли MFAP-4 привело нас к исследованию воздействия MFAP-4 на формирование эластичных волокон.показывает окрашивание Luna кожи человека, ксенотрансплантата на мышах SCID. Эластичные волокна в коже, трансфицированной контрольным репортерным геном, подвергнутой УФ-В в течение 8 недель, были заметно уменьшены по сравнению с таковыми в не подвергнутой УФ-В коже, сверхэкспрессирующей контрольный репортерный ген. С другой стороны, кожа, обработанная вектором MFAP-4 с избыточной экспрессией , была защищена от повторяющейся деградации эластичных волокон, вызванной воздействием УФ-В. Интересно, что УФ-В индуцировала повышающую регуляцию активности ММР-12, которая, как сообщалось, секретируется дермальными фибробластами для разрушения эластичных волокон 19 , 20 , 21 , 22 , значительно подавлялась в коже. за счет сверхэкспрессии MFAP-4 ().

Эффект сверхэкспрессии MFAP-4 на индуцированное UVB увеличение активности MMP-12.

(a) Окрашивание луны было выполнено для оценки роли MFAP-4 в защите эластичных волокон с использованием залитых парафином срезов необлученной кожи со сверхэкспрессией контрольного репортерного гена, кожи, трансдуцированной контрольным репортерным геном с UVB-облучение в течение 8 недель и MFAP-4 -сверхэкспрессированная кожа с повторяющимся UVB-облучением в течение 8 недель. Масштабные линейки = 100 мкм.(b) Активность MMP-12 в ксенотрансплантатной коже человека, обработанной лентивирусными векторами, кодирующими контрольный репортерный ген с или без облучения UVB в течение 8 недель, и на коже, подвергшейся воздействию UVB с сверхэкспрессией MFAP-4 , оценивали с использованием флуоресцентно меченых MMP- 12 субстрат, как описано в Методах. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. ** р <0,01; по сравнению со значением для кожи, подвергшейся воздействию УФВ-излучения, с избыточной экспрессией контрольного репортерного гена

После анализа in vivo был проведен дальнейший подробный анализ механизмов, лежащих в основе сборки эластичных волокон, стимулированной MFAP-4, с использованием нормальных дермальных фибробластов человека (NHDF).NHDF, обработанные неспецифической siRNA в присутствии или в отсутствие рекомбинантного MFAP-4 человека или NHDF, обработанные siRNA, специфичной для MFAP-4, культивировали в течение 8 дней, чтобы позволить NHDF собрать эластичные волокна. После подтверждения заметного снижения уровней транскрипта MFAP-4 и белка обработкой MFAP-4-специфической миРНК () был проведен иммуногистохимический анализ с антителами против тропоэластина человека и против фибриллина-1 человека. Было обнаружено, что ассоциация тропоэластина и фибриллина-1, которые необходимы для образования эластичных волокон, снижена на клетках с подавленным содержанием белка MFAP-4 по сравнению с клетками, обработанными неспецифической миРНК (), тогда как уровни общего белка Количество фибриллина-1 в супернатанте культивируемых NHDF не изменилось при введении MFAP-4-специфической миРНК ().С другой стороны, увеличение их сборок наблюдалось после обработки человеческим рекомбинантным MFAP-4, что привело к усилению сборки эластичных волокон. Вследствие уменьшения организации эластичных волокон с помощью MFAP-4-специфической миРНК, уровни экспрессии транскрипта MMP-12 и белка стимулировались репрессией экспрессии MFAP-4 (). Чтобы подтвердить роль MFAP-4 в ускорении образования эластичных волокон, NHDF культивировали в течение 8 дней в условиях голодания по нефетальной бычьей сыворотке (FBS) с рекомбинантным человеческим рекомбинантным MFAP-4 или без него.Иммуногистохимическое окрашивание компонентов эластичных волокон продемонстрировало, что совместная локализация тропоэластина и фибриллина-1 в NHDF была близка к пределу обнаружения в контрольных клетках, не обработанных рекомбинантным MFAP-4 человека, тогда как их содержание белка после обработки рекомбинантным MFAP-4 человека было равным. повышенная ().

MFAP-4 необходим для сборки эластичных волокон.

NHDF трансфицировали siRNA для неспецифических последовательностей (контроль) или MFAP-4 дважды в течение культивирования в течение 8 дней.Контрольные клетки, трансфицированные siRNA, обрабатывали 10 нМ рекомбинантного MFAP-4 человека или без него во время культивирования. (a) Количественный анализ RT-PCR выполняли с использованием MFAP-4 -специфических анализов экспрессии гена человека Taq после обратной транскрипции общих РНК из культивированных NHDF. Экспрессия мРНК целевого гена была нормализована относительно экспрессии мРНК GAPDH и представлена ​​относительно. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. *** р <0,001. (b) Вестерн-блоттинг с антителами, специфичными к MFAP-4 или фибриллину-1, был проведен для подтверждения влияния сайленсинга MFAP-4 на их содержание белка с использованием супернатантов культивированных NHDF.(c) Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с помощью антитела против тропоэластина человека (зеленый) и антитела против фибриллина-1 человека (красный). Ядерное окрашивание (DAPI) и объединенные изображения также показаны на диаграмме. Масштабные линейки = 50 мкм. (d) Количественный анализ RT-PCR экспрессии мРНК MMP-12 в культивируемых NHDF проводили, как описано в легенде. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. *** p <0,001, ** p <0,01. (e) Вестерн-блоттинг с антителом против ММР-12 человека проводили для супернатантов культивированных NHDF.Полученные полосы активной формы MMP-12 были проанализированы с помощью денситометра, и значения на графике представлены относительно. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. * р <0,05. (f) NHDF культивировали в течение 8 дней с 20 нМ рекомбинантного MFAP-4 человека или без него во время культивирования в среде без FBS. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано в легенде о. Масштабные линейки = 50 мкм.

Кроме того, чтобы выяснить, какие клеточные компоненты взаимодействуют прямо или косвенно с MFAP-4, концентрированные супернатанты из NHDF были иммунопреципитированы антителом против MFAP-4 с последующим вестерн-блоттингом с антителами против фибриллина-1 или тропоэластина.Соответствующие сигналы были обнаружены с использованием антитела, специфичного для фибриллина-1 (), тогда как сигнал не наблюдался, когда использовалось антитело против тропоэластина (данные не показаны). Кроме того, совместная локализация MFAP-4 с фибриллином-1 была подтверждена в NHDF, трансфицированных неспецифической siRNA, с помощью иммуноцитохимического анализа (2). Интересно, что снижение сигнала фибриллина-1 наблюдалось в NHDF, трансфицированных MFAP-4-специфической миРНК, синхронизированной с истощением MFAP-4, что позволяет предположить, что MFAP-4 отвечает за прямое взаимодействие с фибриллином-1 для стимулирования сборка микрофибриллы.

MFAP-4 напрямую взаимодействует с фибриллином-1 с образованием микрофибрилл.

(a) Концентрированные супернатанты от NHDF, культивированных в течение 8 дней, подвергали иммунопреципитации с помощью антитела против MFAP-4 или нормального кроличьего IgG. Иммунопреципитанты анализировали вестерн-блоттингом с антителом против фибриллина-1. (b) NHDF трансфицировали siRNA для неспецифических последовательностей (контроль) или MFAP-4 дважды в течение культивирования в течение 8 дней с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием антителом против MFAP-4 человека (зеленый) и фибриллином человека. -1 антитело (красное).Также показаны ядерное окрашивание (DAPI) и объединенные изображения. Масштабные линейки = 50 мкм.

Сверхэкспрессия MFAP-4 предотвращает вызванную УФ-В излучением деградацию коллагена, а также ухудшение эластина

Учитывая, что экспрессия про-ММР-1 индуцируется пептидами эластина в фибробластах кожи 41 , 42 , открытие Роль MFAP-4 в стимулировании сборки эластичных волокон побудила нас также исследовать его влияние на метаболизм коллагена I. Иммуногистохимический анализ с антителом против человеческого коллагена I показал, что локализация коллагена I наблюдалась по всей дерме в контроле. Кожа, трансфицированная репортерным геном, без воздействия УФ-В, но заметно разложилась после воздействия УФ-В в течение 8 недель ().Напротив, депонированный коллаген I в коже, обработанной лентивирусным вектором, кодирующим MFAP-4, был защищен от разрушения, вызванного УФ-В. В соответствии с этими иммуногистохимическими анализами, вестерн-блоттинг-анализ также показал, что содержание коллагена I в коже, сверхэкспрессирующей MFAP-4 , было выше, чем в коже, сверхэкспрессирующей контрольный репортерный ген, до и после повторного облучения UVB в течение 4 недель (). Впоследствии дальнейшее подтверждение влияния дефицита MFAP-4 на экспрессию MMP-1 было исследовано с использованием NHDF.NHDF, обработанные неспецифической миРНК в присутствии или в отсутствие рекомбинантного человеческого MFAP-4, или NHDF, обработанные siRNA, специфичной для MFAP-4, культивировали в течение 8 дней. Экспрессия транскриптов MMP-1 была значительно увеличена в NHDF с нарушенной экспрессией MFAP-4 (). Соответственно, секреция активного MMP-1 также стимулировалась, когда экспрессия MFAP-4 подавлялась ().

Сверхэкспрессия MFAP-4 предотвращает УФ-В-индуцированное разрушение коллагена I.

(a) Иммуногистохимический анализ кроличьего антитела против человеческого коллагена I или неспецифического контрольного кроличьего IgG проводили с использованием парафиновых срезов из Кожа с ксенотрансплантатом, обработанная лентивирусным вектором, кодирующим контрольный репортерный ген, с или без непрерывного облучения UVB в течение 8 недель и с использованием ксенотрансплантата кожи, сверхэкспрессирующей MFAP-4 с воздействием UVB в течение 8 недель.Масштабные линейки = 100 мкм. (b) Вестерн-блоттинг с использованием антитела против человеческого коллагена I или антитела против β-актина человека для оценки уровней белка коллагена I в ксенотрансплантатной коже, обработанной лентивирусными векторами, кодирующими контрольный репортерный ген или MFAP-4 до и после воздействия УФВ в течение 4 недель. (c) NHDF трансфицировали siRNA для неспецифических последовательностей (контроль) или MFAP-4 дважды в течение культивирования в течение 8 дней. Контрольные клетки, трансфицированные siRNA, обрабатывали 10 нМ рекомбинантного MFAP-4 человека или без него во время культивирования.Количественный анализ RT-PCR экспрессии мРНК MMP-1 в культивируемых NHDF проводили, как описано в легенде. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. *** р <0,001. (d) Вестерн-блоттинг с использованием антитела против ММР-1 человека проводили для супернатантов культивированных NHDF, обработанных, как описано в. Полученные полосы активной формы MMP-1 были проанализированы с помощью денситометра, и значения на графике представлены относительно. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение.** р <0,01, * р <0,05.

Обсуждение

Эластичность, обеспечиваемая образованием эластичных волокон, необходима для поддержания гибкости и растяжимости тканей для многих органов, таких как крупные артерии, легкие и кожа 30 . Хотя микрофибриллы фибриллина-1 и белок тропоэластина представляют собой большинство компонентов эластичных волокон, было плохо изучено, как микрофибриллы строятся после сборки фибриллина-1 и как микрофибриллы и тропоэластин взаимодействуют во время организации эластичных волокон.Недавно было показано, что дезинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами-подобным белку-6 напрямую связывается с фибриллином-1, способствуя образованию микрофибрилл фибриллина-1 43 . Другое недавнее исследование показало, что белок фибулин-4 незаменим для связывания LOX с тропоэластином, чтобы облегчить перекрестное связывание 44 . Эти отчеты имеют большое значение для понимания механизмов, лежащих в основе построения эластичных волокон, в то время как еще предстоит определить, сколько других молекул участвует в эластогенезе, чтобы полностью понять процесс образования эластичных волокон.Например, сообщалось, что MAGP-36, гомолог MFAP-4, обнаруженный вокруг эластичных волокон у различных животных, исчез в фотостарении дермы, но накапливался в разрушенных эластичных волокнах в пораженной коже эластической псевдоксантомы, расстройстве, связанном с эластином 40 . Эти результаты побудили нас изучить функцию MFAP-4 в коже человека с использованием модели in vivo фотоповрежденной / фотостаренной кожи с ксенотрансплантатом кожи человека на мышах SCID в сочетании с лентивирусным вектором для сверхэкспрессии MFAP-4, а также in vitro NHDF в сочетании с технологией siRNA.

Одной из наиболее значительных проблем, которые необходимо было решить в этом исследовании, было рассмотрение того, как MFAP-4 участвует в формировании эластичных волокон. Ранее было продемонстрировано, что фибулин-4 и -5 отвечают за рекрутирование тропоэластинов и его сшивающих ферментов на микрофибриллы для ускорения сборки эластичных волокон в сотрудничестве с LTBP-2, который связывается с гепарином и протеогликанами сульфата гепарина 45 , 46 , 47 , 48 , 49 .Вдобавок, количество фибулина-5 также было зарегистрировано как снижение как в фотостарении, так и в изначально стареющей дерме, предполагая, что он играет роль в поддержании эластичности кожи 50 . Учитывая, что фибулины играют роль в сборке и сшивании мономеров тропоэластина, разумно предположить, что MFAP-4 способствует развитию микрофибрилл, а не связыванию LOX с тропоэластином, которое в основном регулируется фибулинами. Мы ясно продемонстрировали, что MFAP-4 взаимодействует с фибриллином-1, продукция которого, как сообщается, также снижается в фотостарой коже 51 , а не с тропоэластином для организации микрофибрилл, что делает возможным участие тропоэластина, поперечно сшитого с LOX для формирование функциональных зрелых эластических волокон, существенно необходимых для гомеостаза кожи.Основываясь на наших выводах, мы предлагаем модель вклада MFAP-4 в развитие эластичных волокон (). Благодаря присутствию MFAP-4 фибриллин-1 может быть собран с образованием микрофибрилл с последующим поперечным сшиванием тропоэластинов, связанных с LOX, с микрофибриллами, как подтверждается предыдущим исследованием 44 . Помимо его роли в развитии микрофибрилл, еще одна важная роль MFAP-4 в подавлении активности MMP-12 проиллюстрирована как в наших анализах in vivo, и in vitro, .Параллельно с предыдущими исследованиями, показывающими, что пептиды, полученные из эластина, индуцируют экспрессию различных видов ММП (включая ММР-12) в нескольких типах клеток 52 , 53 и что одного УФ-излучения достаточно для избирательного разрушения многих эластичных волокон ассоциированные белки 54 , считается, что усиление MFAP-4 отвечает за подавление активности MMP-12, а также за стимулирование образования микрофибрилл, которые необходимы для организации функциональных эластичных волокон, что приводит к наблюдаемой фотозащите .

Схематическое изображение роли MFAP-4 в формировании эластичных волокон.

(a) Секретируемый MFAP-4 и фибриллин-1 взаимодействуют напрямую, в результате чего в нормальных условиях происходит сборка микрофибрилл. Тропоэластины, собранные с LOX, рекрутируемым фибулином-4, впоследствии перекрестно сшиваются с микрофибриллами для образования полных зрелых эластичных волокон. (b) В отсутствие MFAP-4 фибриллин-1 не может собираться или созревать для образования микрофибрилл. Тропоэластины никогда не сшиваются из-за нарушения образования микрофибрилл.

Также представляет интерес исследовать влияние образования эластичных волокон, опосредованного MFAP-4, на другой основной тип возрастных снижающихся компонентов, коллагены, поскольку сообщалось, что MAGP-36 также связывается с коллагеном I 39 . Наши данные показывают, что сверхэкспрессия MFAP-4 защищает от вызванного УФ-В-излучением разрушения коллагена I, которое связано с ингибированием фотоповреждения / фотостарения в ксенотрансплантатной коже человека in vivo. Кроме того, количество MMP-1, которое является одной из коллагеназ, экспрессируемых дермальными фибробластами 55 , было значительно повышено в NHDF с нокдауном MFAP-4 как на уровне транскрипта, так и на уровне белка.Соответственно, повышение MMP-1 в дермальных фибробластах также наблюдается, когда клетки подвергаются воздействию разрушенных коллагенов в культурах органов кожи человека 56 . Эти данные привели нас к гипотезе о том, что MFAP-4 играет еще одну роль в стабилизации коллагена I. Учитывая, что экспрессия про-MMP-1 стимулируется пептидами эластина в фибробластах кожи 41 , 42 , разумно предлагают другую роль MFAP-4 в поддержании коллагенов, что также важно для гомеостаза кожи.В дополнение к защите коллагена I за счет повышенной экспрессии MFAP-4, в нашей модели фотоповреждения ксенотрансплантата кожи человека также было обнаружено препятствие вызванному УФВ ухудшению коллагена IV (данные не показаны).

В заключение, наши данные впервые показывают, что уровни белка MFAP-4 снижаются как в внешней фотостаренной коже, так и во внутренней стареющей коже, и что усиление экспрессии MFAP-4 защищает кожу от фотоповреждений, вызванных УФ-В. / фотостарение, характеризующееся разрушением волокон эластина и коллагена, что приводит к ухудшению эластичности кожи.Что еще более важно, MFAP-4 играет важную роль не только в развитии микрофибрилл путем прямого взаимодействия с фибриллином-1, но также в поддержании белков ECM, включая коллаген I, с помощью пока нераскрытого механизма (механизмов). Эти результаты дают новое понимание фундаментального понимания механизмов, лежащих в основе образования микрофибрилл, приводящих к гомеостазу кожи, а также создают основу для разработки эффективной стратегии лечения заболеваний кожи, вызванных УФ-излучением.

Методы

Кожа человека

Кожа живота на всю толщину у здоровой 41-летней кавказской женщины с кожей II типа, подвергшейся абдоминопластике, и кожа груди у здоровой 46-летней кавказской женщины с кожей II типа, подвергшейся уменьшению груди (University Pointe, Cincinnati, OH, USA), были использованы для ксенотрансплантатов кожи.Три-четыре пункционных биопсии кожи вентральной части плеча или дорсальной части предплечья от здоровых кавказских женщин с кожей типа II в возрасте двадцати, тридцати, пятидесяти и шестидесяти лет (Stephens and Associates, Carrollton, TX, USA) также использовались для исследования. исследование экспрессии транскрипта мРНК или локализации белка. Сбор образцов был одобрен институциональным наблюдательным советом медицинского центра детской больницы Цинциннати или этическим наблюдательным советом IntegReview (Остин, Техас), и до процедуры было получено информированное согласие добровольцев.

Прививка животных

Шестьдесят самок мышей ICR-SCID в возрасте от 4 до 6 недель (Taconic Farms, Germantown, NY) обрабатывались в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных в детской больнице Цинциннати, которые одобрили эксперименты и были на протяжении всего эксперимента содержали в условиях, свободных от патогенов. Кожи брюшной полости и груди на всю толщину были ксенотрансплантированы мышам SCID под анестезией и поддерживались с использованием изофлуорана / кислорода (2% / 0,7 л) на протяжении всей операции, как описано ранее 16 .Вкратце, после того, как спинная кожа каждой мыши была разрезана для получения раневого ложа диаметром приблизительно от 2,0 до 3,0 см, человеческую кожу на всю толщину зашили на месте с помощью прецизионной моноволокна с обратным разрезом PS-3, 6-0. Сенсоркаин наносили на края ложа трансплантата для обезболивания.

Воздействие UVB

Хроническое воздействие UVB кожи человека, ксенотрансплантированного мышам SCID, начиналось примерно через 10 недель после трансплантации, когда заживление было завершено, как описано ранее 1 .Вкратце, использовался блок из двух ламп UVB (лампы 340044-1; UVB, Upland, CA) с фильтром, дающим пик излучения около 302 нм, и выход энергии измерялся с помощью измерителя УФ-излучения UV-340 MSR7000 ( Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Тайбэй, Тайвань). Режим прогрессивного УФ-В облучения использовался, начиная с 40 мДж / см 2 (1 минимальная доза эритемы; MED) и увеличивался на 10 мДж / см 2 в неделю до 3 недели. Доза облучения составляла 60 мДж / см 2 затем оставался постоянным в течение оставшегося периода воздействия.Привитую кожу человека облучали 5 раз в неделю в течение 6 или 8 недель с получением общих доз УФ-В приблизительно 1,65 или 2,2 Дж / см 2 , соответственно. Перед или после каждого воздействия УФ-В подвергалось 30-секундное механическое растяжение, чтобы стимулировать физиологическое движение кожи человека.

Дизайн лентивирусного вектора

MFAP-4 полной длины получали из библиотеки кДНК кожи (Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием следующих наборов праймеров.

MFAP-4-5 ′: ATA-TAT-CTA-GAG-CCA-CCA-TGA-AGG-CAC-TCC-TGG-CC

MFAP-4-3 ′: TAT-AAG-GCC-TTG-GCC -CGG-CGG-ATT-TTC-AT

Амплифицированный продукт ПЦР обрабатывали ферментом Кленова перед разрезанием XbaI, а затем клонировали в виде полутупленного фрагмента в pBlueScript по сайтам XbaI / SmaI.После выделения плазмидной ДНК MFAP-4 в pBlueScript был выпущен с использованием StuI и XbaI, а затем был клонирован в DeltaUX3M-9. Наконец, хелперная упаковочная конструкция pCMVR8.2, вектор-переносчик DeltaUX3M-9-MFAP-4 и плазмида, кодирующая гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSV-G), были использованы для тройной трансфекции, как описано в другом месте 57 . Векторы переноса DeltaUX3M-9-eGFP и DeltaUX3M-9-β-галактозидаза также получали для векторов, экспрессирующих репортерный ген, и их титры исследовали, как описано ранее 58 .

Сверхэкспрессия

MFAP-4 в ксенотрансплантированной коже человека

После сертификации вирусных запасов на отсутствие RCL примерно 25 мкл VSV-G псевдотипированного лентивирусного вектора, кодирующего MFAP-4 или репортерных генов (1,5 × 10 9 TU / ml) вводили внутрикожно в полностью зажившую кожу человека, ксенотрансплантированную мышам SCID, дважды с недельным интервалом, как описано в другом месте 59 .

Профилометрические измерения кожи

Реплики ксенотрансплантатов кожи получали с использованием агента-реплики SILFLO (Flexico Developments, Potters Bar, UK) в указанных точках, как описано в другом месте 16 .Вкратце, копии кожи, сжатые с использованием GC exafine (GC Corporation, Tokyo, Japan), были проанализированы с использованием трехмерного оптического измерения каждой копии с использованием PRIMOS Compact (GF Messtechnik GmbH, Берлин, Германия), как сообщалось ранее 16 . После измерения муаровые полосы были удалены, и прямоугольная область (от 4 до 5 мм × 7 до 9 мм) была выбрана в центральной части каждой реплики при анализе плоскости. Для оценки степени фотоповреждения использовались два двумерных параметра Sa и Sz.Sa представляет собой среднее абсолютных значений площади гор и долин, отражающих морщины, на определенную площадь, а Sz представляет собой среднее арифметическое от максимальной высоты пика до впадины значений шероховатости 5 последовательных участков отбора проб по отфильтрованному профилю.

Оценка эластичности

Эластичность кожи анализировали с помощью Cutometer SEM575 (Courage & Khazaka Electronic, Кельн, Германия), как было ранее задокументировано 60 . Вкратце, центр каждого ксенотрансплантата кожи использовали для 5-секундных прикладных нагрузок 200 гПа с последующим 2-секундным периодом релаксации.Два параметра, Ue (непосредственная деформация) и Ur (немедленное преломление), использовались как индикаторы степени эластичности. Ur / Ue = чистая эластичность без учета ползучести.

Анализ активности MMP-12

Всю кожу солюбилизировали для измерения активности MMP-12, используя SensoLyte TM 520 MMP-12 Fluorimetric Assay Kit (AnaSpec Corporate, San Jose, CA).

Клеточная культура

NHDF (Kurabo Corporation, Осака, Япония) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Invitrogen), содержащей 5% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO 2 .

трансфекция siRNA

NHDF, посеянные на покровном стекле в планшете для культивирования клеток, трансфицировали с использованием siRNA (неспецифическая последовательность для контроля или специфическая последовательность для MFAP-4) и реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) дважды в течение 96 часов. интервал согласно инструкции производителя. Супернатанты и клетки собирали для вестерн-блоттинга и иммуноцитохимического анализа и количественного анализа RT-PCR в реальном времени, соответственно, через 72 часа после второй трансфекции.

Иммуноцитохимический анализ

NHDF, фиксированные в ледяном метаноле и впоследствии обработанные для неспецифического блокирования иммунореактивности, инкубировали с разведенными кроличьими антителами против тропоэластина человека (Elastin Products Company, Оуэнсвилл, Миссури), кроличьими антителами против человеческого MFAP- 4 или мышиное антитело против фибриллина-1 человека (Millipore, Billerica, MA), а затем с разбавленным меченным Alexa Fluo 488 антителом против IgG кролика или меченным Alexa Fluo 546 антителом против IgG мыши.Клетки, прикрепленные к покровному стеклу, помещали на предметное стекло с использованием антифадного реагента ProLong Gold с DAPI (Invitrogen), и иммунореактивность наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMR (Leica Microsystems GmbH, Ветцлар, Германия).

Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени

Используя количественную ОТ-ПЦР в реальном времени, нормализованную относительно экспрессии рибосомного белка большого P0 ( RPLP0 ) или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH ), транскрипт экспрессии MFAP-4 , MMP-12 или MMP-1 был определен в ксенотрансплантатной коже человека через 24 часа после повторяющегося воздействия УФ-В в течение 6 недель и в биопсированных образцах кожи из вентральной части верхних конечностей молодых (20 лет) и старых (50) доноров, собранных в RNAlater (Qiage, Валенсия, Калифорния).Суммарные РНК из каждого образца кожи и из NHDF, трансфицированных миРНК, получали с использованием микрокомплекта RNeasy (Qiagen). кДНК синтезировали обратной транскрипцией общей РНК с использованием олиго dT и обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони. Количественные RT-ПЦР в реальном времени с анализами экспрессии гена Taq Man (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) проводили с использованием системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7300 или 7500 (Applied Biosystems).

Иммунопреципитация

Супернатанты культивированных NHDF концентрировали с использованием мембраны с отсечкой 3 кДа (Millipore) с последующей инкубацией с антителом против человеческого MFAP-4 (AdipoGen, Инчхон, Корея) или нормальным кроличьим IgG.Затем к смеси добавляли гранулы протеин G-сефарозы (GE Healthcare, Waukesha, WI) и инкубировали перед сбором гранул центрифугированием. Иммунопреципитированные белки суспендировали в 1X буфере для образцов SDS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) для анализа вестерн-блоттингом.

Вестерн-блоттинг.

Образцы кожи с ксенотрансплантатом лизировали в буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), содержащем 1 мМ фениметилсульфонилфторид (Sigma, St. Louis, MO).Двадцать мкг каждого тканевого экстракта или 12 мкл каждой культуральной среды из NHDF разделяли на 7,5% или 12% гелях SDS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Образцы переносили на PVDF-мембраны (Bio-Rad Laboratories) и инкубировали с антителами, специфичными к человеческому MFAP-4 (AdipoGen, Инчхон, Корея), человеческому коллагену I (United States Biological, Swampscott, MA), человеческому MMP-1 (AbD Serotec, Oxford, UK), человеческий MMP-12 (Millipore), человеческий фибриллин-1 (Elastin Products Company) или человеческий β-актин (Sigma).Последующую визуализацию распознавания антител проводили с помощью Enhanced Chemiluminescence Plus (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуногистохимия

Ксенотрансплантаты человеческих кож и человеческие кожи, полученные из перфорированной биопсии, у субъектов в возрасте от тридцати до шестидесяти лет фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали парафином. Иммунореактивность MFAP-4 и коллагена I оценивали с использованием античеловеческого MFAP-4 (Abcam, Кембридж, Великобритания) и античеловеческого коллагена I (United States Biological), соответственно, как описано в другом месте 16 .Нормальный кроличий IgG использовали в качестве отрицательного контроля. Иммунореактивность MFAP-4 и коллагена I визуализировали с использованием системы каталитической амплификации сигнала без биотина CSAII (DAKO) с аминоэтилкарбазолом.

Окрашивание Luna

Срезы ксенотрансплантата кожи человека толщиной 5 мкм окрашивали с использованием обычного окрашивания Luna для визуализации тонких эластичных волокон.

Статистика

Уровень значимости различий между группами анализировали с помощью критерия Стьюдента t .Различия в средних или необработанных значениях между группами считались значимыми при p <0,05.

Вклад авторов

Автор (ы) сделали следующие заявления о своем вкладе: Задумал и спроектировал эксперименты: SK, AH. Проведены эксперименты: SK, AH, PS, KH. Проанализированы данные: AH. Созданы вирусные векторы: AB, GPK. Написал статью: СК, АХ, ГПК. Руководил исследованиями: TF, MOV, WJK, TK, YT.

Благодарности

Мы благодарим доктора Х.Джун Янг (Key Clone Technologies) за технический опыт в модификации плазмид и критическое обсуждение дизайна векторов и г-жу Меган Кемски за ее помощь в поддержании ксенотрансплантатов кожи человека на мышей SCID.

Список литературы

  • Крутцен П. Дж. Ультрафиолет нарастает. Nature 356, 104–105 (1992). [Google Scholar]
  • Slaper H., Velders G. J. M., Daniel J. S., De, .Gruijl F. R. и Van, der, Leun J. C. Оценки разрушения озонового слоя и заболеваемости раком кожи для изучения достижений Венской конвенции.Nature 384, 256–258 (1996). [PubMed] [Google Scholar]
  • Scharffetter-Kochanek K. et al. . Активные формы кислорода, индуцированные УФ-излучением, при фотоканцерогенезе и фотостарении. Биол. Chem. 378, 1247–1257 (1997). [PubMed] [Google Scholar]
  • Накагава Х. Процессы старения кожи. J. Японское общество косметической науки 24, 120–123 (2000). [Google Scholar]
  • Браверман И. М., Фонферко Е. Исследования старения кожи: 1. Сеть эластичных волокон. J. Invest. Дерматол.78. С. 434–443 (1982). [PubMed] [Google Scholar]
  • Уитто Дж. Биохимия соединительной ткани стареющей дермы. Возрастные изменения коллагена и эластина. Дерматол. Clin. 4, 433–446 (1986). [PubMed] [Google Scholar]
  • Schwartz E. Изменения соединительной ткани в коже бесшерстных мышей, облученных ультрафиолетом. J. Invest. Дерматол. 91, 158–161 (1988). [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжэн П. и Клигман Л. Х. Ультраструктурные изменения безволосой кожи мышей, вызванные УФ-излучением: сравнение с повреждением, вызванным УФ-В.J. Invest. Дерматол. 100, 194–199 (1993). [PubMed] [Google Scholar]
  • Бернштейн Э. Ф. et al. . Повышенная экспрессия генов эластина и фибриллина в коже с хроническими фотоповреждениями. J. Invest. Dermato.l 103, 182–186 (1994). [PubMed] [Google Scholar]
  • Шварц Э., Файнберг Э., Лебволь М., Мариани Т. Дж. И Бойд С. Д. Ультрафиолетовое излучение увеличивает накопление тропоэластина за счет посттранскрипционного механизма в дермальных фибробластах. J. Invest. Дерматол. 105, 65–69 (1995).[PubMed] [Google Scholar]
  • Бернштейн Э. Ф. и Уитто Дж. Влияние фотоповреждения на внеклеточный матрикс дермы. Clin. Дерматол. 14. С. 143–151 (1996). [PubMed] [Google Scholar]
  • Старчер Б., Пирс Р. и Хинек А. УФ-В-излучение стимулирует отложение новых эластичных волокон модифицированными эпителиальными клетками, окружающими волосяные фолликулы и сальные железы у мышей. J. Invest. Дерматол. 112, 450–455 (1999). [PubMed] [Google Scholar]
  • Kambayashi H. et al. .Эпидермальные изменения, вызванные хроническим облучением низкими дозами УФ-излучения, вызывают образование морщин у лысых мышей. J. Dermatol. Sci. 27, S19 – S25 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Камбаяси Х., Одаке Ю., Такада К., Фунасака Ю. и Итихаши М. Вовлечение изменений кератина рогового слоя в образование морщин при хроническом ультрафиолетовом облучении у бесшерстных мышей. Exp. Дерматол. 12. С. 22–27 (2003). [PubMed] [Google Scholar]
  • Sano T. et al. . Образование морщин, вызванное переходом кератиновых промежуточных волокон после многократного воздействия ультрафиолета B.Arch. Дерматол. Res. 296. С. 359–365 (2005). [PubMed] [Google Scholar]
  • Hachiya A. et al. . Механистические эффекты длительного ультрафиолетового облучения B вызывают эпидермальные и дермальные изменения в ксенотрансплантатах кожи человека. Являюсь. J. Pathol. 174, 401–413 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Оклунд Х., Маншо Дж. И Вийдик А. Роль эластина в механических свойствах кожи. J. Biomech. 21, 213–218 (1988). [PubMed] [Google Scholar]
  • Имаяма С.& Браверман И. М. Гипотетическое объяснение старения кожи. Хронологическое изменение трехмерного расположения коллагеновых и эластических волокон в соединительной ткани. Являюсь. J. Pathol. 134, 1019–1025 (1989). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Лабат-Роберт Дж., Фуртанье А., Бойер-Лафаргур Б. и Роберт Л. Возрастное увеличение активности протеазы эластазного типа в коже мышей. Эффект УФ-излучения. J. Photochem. Photobiol. В. 57, 113–118 (2000). [PubMed] [Google Scholar]
  • Цукахара К. et al. . Селективное ингибирование эластазы фибробластов кожи вызывает зависящее от концентрации предотвращение образования морщин, индуцированного ультрафиолетом B. J. Invest. Дерматол. 117, 671–677 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Tsuji N., Moriwaki S., Suzuki Y., Takema Y. & Imokawa G. Роль эластаз, секретируемых фибробластами, в образовании морщин: влияние через избирательное ингибирование активности эластазы. Photochem. Photobiol. 74, 283–290 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Chung J.H. et al. . Ультрафиолетовая модуляция металлоэластазы макрофагов человека в коже человека in vivo. J. Invest. Дерматол. 119, 507–512 (2002). [PubMed] [Google Scholar]
  • Мера С. Л., Ловелл К. Р., Джонс Р. и Дэвис Дж. Д. Эластичные волокна в нормальной и поврежденной солнцем коже: иммуногистохимическое исследование. Br. J. Dermatol. 117, 21–27 (1987). [PubMed] [Google Scholar]
  • Монтанья В., Кирхнер С. и Карлайл К. Гистология поврежденной солнцем кожи человека. Варенье. Акад. Дерматол. 21. С. 907–918 (1989).[PubMed] [Google Scholar]
  • Уоррен Р. и др. . Возраст, солнечный свет и кожа лица: гистологическое и количественное исследование. Варенье. Акад. Дерматол. 25, 751–760 (1991). [PubMed] [Google Scholar]
  • Seo J. Y. et al. . Ультрафиолетовое излучение увеличивает экспрессию мРНК тропоэластина в эпидермисе кожи человека in vivo. J. Invest. Дерматол. 116, 915–919 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Сакаи Л. Ю., Кин Д. Р. и Энгвалл Э. Фибриллин, новый гликопротеин массой 350 кДа, является компонентом внеклеточных микрофибрилл.J. Cell Biol. 103, 2499–2509 (1986). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Холлистер Д. В., Годфри М., Сакаи Л. Ю. и Пайериц Р. Э. Иммуногистологические аномалии системы микрофибриллярных волокон при синдроме Марфана. N. Engl. J. Med. 323, 152–159 (1990). [PubMed] [Google Scholar]
  • Килти К. М., Шерратт М. Дж. И Шаттлворт К. А. Эластичные волокна. J. Cell Sci. 115, 2817–2828 (2002). [PubMed] [Google Scholar]
  • Wagenseil J. E. & Mecham R. P.Новое понимание сборки эластичных волокон. Врожденные дефекты Res. С. 81, 229–240 (2007). [PubMed] [Google Scholar]
  • Грей В. Р., Сандберг Л. Б. и Фостер Дж. А. Молекулярная модель структуры и функции эластина. Nature 246, 461–466 (1973). [PubMed] [Google Scholar]
  • Нараянан А. С., Пейдж Р. С., Кузан Ф. и Купер С. Г. Сшивание эластина in vitro. Исследования факторов, влияющих на образование десмозинов за счет действия лизилоксидазы на тропоэластин. Biochem. J. 173, 857–862 (1978).[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Беллингем К. М., Вудхаус К. А., Робсон П., Ротштейн С. Дж. И Кили Ф. В. Характеристики самоагрегации рекомбинантно экспрессируемых полипептидов эластина человека. Биохим. Биофиз. Acta. 1550, 6–19 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Тункул П., Дженсен С. А., Максвелл А. Л. и Вайс А. С. Гидрофобные домены тропоэластина человека взаимодействуют контекстно-зависимым образом. J. Biol. Chem. 276, 44575–44580 (2001). [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжао З. et al. . Ген гликопротеина, ассоциированного с микрофибриллами человека, обычно удаляется у пациентов с синдромом Смита-Магениса. Гм. Мол. Genet. 4, 589–597 (1995). [PubMed] [Google Scholar]
  • Kobayashi R. et al. . Выделение и характеристика нового гликопротеина, ассоциированного с микрофибриллами, размером 36 кДа из аорты свиньи. J. Biol. Chem. 264, 17437–17444 (1989). [PubMed] [Google Scholar]
  • Кобаяши Р., Мизутани А. и Хидака Х. Выделение и характеристика гликопротеина, связанного с микрофибриллами 36 кДа, с помощью недавно синтезированной аффинной хроматографии с изохинолинсульфонамидом.Biochem. Биофиз. Res. Commun. 198. С. 1262–1266 (1994). [PubMed] [Google Scholar]
  • Toyoshima T. et al. . Ультраструктурное распределение гликопротеина, ассоциированного с микрофибриллами 36 кДа (MAGP-36), в тканях человека и крупного рогатого скота. J. Histochem. Cytochem. 47, 1049–1056 (1999). [PubMed] [Google Scholar]
  • Тоошима Т., Ниси Н., Кусама Х., Кобаяши Р. и Итано Т. 36-кДа-ассоциированный с микрофибриллами гликопротеин (MAGP-36) - это эластин-связывающий белок, повышенный в аорте цыпленка. во время развития и роста.Exp. Клетка. Res. 307, 224–230 (2005). [PubMed] [Google Scholar]
  • Hirano E. et al. . Экспрессия гликопротеина, ассоциированного с микрофибриллами, размером 36 кДа (MAGP-36) в кератиноцитах человека и его локализация в коже. J. Dermatol. Sci. 28. С. 60–67 (2002). [PubMed] [Google Scholar]
  • Brassart B. et al. . Конформационная зависимость активации коллагеназы (матриксной металлопротеиназы-1) под действием эластиновых пептидов в культивируемых фибробластах. J. Biol. Chem. 276. С. 5222–5227 (2001).[PubMed] [Google Scholar]
  • Duca L. et al. . Комплекс рецептора эластина передает сигналы за счет каталитической активности своей субъединицы Neu-1. J. Biol. Chem. 282, 12484–12491 (2007). [PubMed] [Google Scholar]
  • Tsutsui K. et al. . ADAMTSL-6 - это новый белок внеклеточного матрикса, который связывается с фибриллином-1 и способствует образованию фибрилл фибриллина-1. J. Biol. Chem. 285. С. 4870–4882 (2010). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Хоригучи М. et al. . Фибулин-4 осуществляет правильный эластогенез за счет взаимодействия с поперечно сшивающим ферментом лизилоксидазой. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 106, 19029–19034 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Nakamura T. et al. . Фибулин-5 / DANCE необходим для эластогенеза in vivo. Nature 415, 171–175 (2002). [PubMed] [Google Scholar]
  • Hirai M. et al. . Скрытый TGF-бета-связывающий белок 2 связывается с DANCE / фибулин-5 и регулирует сборку эластичных волокон.EMBO J. 26, 3283–3295 (2007). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Katsuta Y. et al. . Фибулин-5 ускоряет сборку эластичных волокон в фибробластах кожи человека. Exp. Дерматол. 17, 837–842 (2008). [PubMed] [Google Scholar]
  • Чоудхури Р. и др. ., Дифференциальная регуляция образования эластических волокон фибулином-4 и -5. J. Biol. Chem. 284. С. 24553–24567 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Парси М. К., Адамс Дж. Р., Уайтлок Дж.& Гибсон М. А. LTBP-2 имеет несколько сайтов связывания гепарина / гепарансульфата. Matrix Biol. 29. С. 393–401 (2010). [PubMed] [Google Scholar]
  • Kadoya K. et al. ., Отложение фибулина-5 в коже человека: уменьшение с возрастом и воздействием ультрафиолета B и увеличение солнечного эластоза. Br. J. Dermatol. 153, 607–612 (2005). [PubMed] [Google Scholar]
  • Уотсон Р. Э. и др. ., Микрофибриллы, богатые фибриллином, уменьшаются в фотостарении кожи. Распространение на стыке дермы и эпидермиса.J. Invest. Дерматол. 112, 782–787 (1999). [PubMed] [Google Scholar]
  • Coquerel B. et al. . Пептиды, производные эластина: матрикины, критически важные для агрессивности клеток глиобластомы в трехмерной системе. Glia 57, 1716–1726 (2009). [PubMed] [Google Scholar]
  • Парк Дж. Б., Конг К. Г., Зуль К. Х., Чанг Э. Д. и Рью К. Д. Повышенная экспрессия матриксных металлопротеиназ, связанная с деградацией эластина и фиброзом желтой связки у пациентов со стенозом поясничного отдела позвоночника.Clin. Ортоп. Surg. 1. С. 81–89 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Sherratt M. J. et al. ., Низкие дозы ультрафиолетового излучения избирательно разрушают богатые хромофором компоненты внеклеточного матрикса. J. Pathol. 222, 32–40 (2010). [PubMed] [Google Scholar]
  • Moon SE, Dame MK, Remick DR, Elder JT & Varani J. Индукция матричной металлопротеиназы-1 (MMP-1) во время эпидермальной инвазии стромы в культуре органов кожи человека: стимуляция кератиноцитами производство фибробластов ММП-1.Br. J. Рак. 85, 1600–1605 (2001). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Fisher G. J. et al. . Фрагментация коллагена способствует окислительному стрессу и повышает уровень матричной металлопротеиназы-1 в фибробластах стареющей кожи человека. Являюсь. J. Pathol. 174. С. 101–114 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Watson DJ, Kobinger GP, Passini MA, Wilson JM & Wolfe JH Шаблоны целевой трансдукции в мозге мыши лентивирусными векторами, псевдотипированными VSV, Ebola, Mokola, LCMV или MuLV белки оболочки.Мол. Ther. 5. С. 528–537 (2002). [PubMed] [Google Scholar]
  • Croyle M. A. et al. . Пегилирование лентивирусного вектора, псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита G, предотвращает инактивацию в сыворотке. J. Virol. 78, 912–921 (2004). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Hachiya A. et al. . Перенос генов в коже человека с помощью различных псевдотипированных векторов на основе ВИЧ. Gene Ther. 14. С. 648–656 (2007). [PubMed] [Google Scholar]
  • Takema Y., Yorimoto Y., Kawai M.И Имокава Г. Возрастные изменения эластичных свойств и толщины кожи лица человека. Br. J. Dermatol. 131, 641–648 (1994). [PubMed] [Google Scholar]

Противовирусный эффект витамина А на норовирусную инфекцию посредством модуляции микробиома кишечника

  • 1

    Ахмед С.М., Лопман, Б.А. и Леви, К. Систематический обзор и метаанализ глобального сезонность норовируса. PloS one 8 , e75922, DOI: 10.1371 / journal.pone.0075922 (2013).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 2

    Hall, A. J. et al. Эпидемиология вспышек норовируса пищевого происхождения, США, 2001–2008 гг. Emerg Infect Dis 18 , 1566–1573, DOI: 10.3201 / eid1810.120833 (2012).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 3

    Long KZ1 et al.Добавки витамина А по-разному влияют на норовирусные инфекции и клинические симптомы у мексиканских детей. Журнал инфекционных болезней 196 , 978–985, DOI: 10.1086 / 521195 (2007).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 4

    Long, K. Z. et al. Витамин А изменяет хемокиновые и цитокиновые реакции кишечника на норовирусную инфекцию у мексиканских детей. J Nutr 141 , 957–963, DOI: 10.3945 / jn.110.132134 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 5

    Холл, Дж. А., Грейнджер, Дж. Р., Спенсер, С. П. и Белкайд, Ю. Роль ретиноевой кислоты в толерантности и иммунитете. Иммунитет 35 , 13–22, DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.07.002 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 6

    Такеучи, О.& Акира, С. Врожденный иммунитет к вирусной инфекции. Immunol Rev 227 , 75–86, DOI: 10.1111 / j.1600-065X.2008.00737.x (2009).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 7

    Thornton, K. A., Mora-Plazas, M., Marin, C. & Villamor, E. Дефицит витамина A связан с желудочно-кишечными и респираторными заболеваниями у детей школьного возраста. J Nutr 144 , 496–503, DOI: 10.3945 / jn.113.185876 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 8

    Камада, Н., Сео, С. У., Чен, Г. Ю. и Нуньес, Г. Роль микробиоты кишечника в иммунитете и воспалительных заболеваниях. Природные обзоры. Иммунология 13 , 321–335, DOI: 10,1038 / nri3430 (2013).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 9

    Чу, Г.И Мазманян, С. К. Врожденное иммунное распознавание микробиоты способствует симбиозу между хозяином и микробом. Nat Immunol 14 , 668–675, DOI: 10,1038 / ni.2635 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 10

    Ракофф-Нахум, С., Паглино, Дж., Эслами-Варзане, Ф., Эдберг, С. и Меджитов, Р. Распознавание комменсальной микрофлоры толл-подобными рецепторами необходимо для гомеостаза кишечника. Ячейка 118 , 229–241, DOI: 10.1016 / j.cell.2004.07.002 (2004).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 11

    Виджай-Кумар, М. и др. Метаболический синдром и измененная микробиота кишечника у мышей, лишенных Toll-подобного рецептора 5. Science 328 , 228–231, DOI: 10.1126 / science.1179721 (2010).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 12

    Backhed, F.Ответы хозяев на микробиом человека. Nutr Ред. 70 Приложение 1, S14–17, DOI: 10.1111 / j.1753-4887.2012.00496.x (2012).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 13

    Wen, L. et al. Врожденный иммунитет и микробиота кишечника в развитии диабета 1 типа. Nature 455 , 1109–1113, DOI: 10.1038 / nature07336 (2008).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 14

    Ли, Х.И Ко, Г. Влияние метформина на улучшение метаболизма и микробиоту кишечника. Прикладная и экологическая микробиология 80 , 5935–5943, DOI: 10.1128 / AEM.01357-14 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 15

    Шин Н. Р. и др. Увеличение численности Akkermansia spp. Популяция, индуцированная лечением метформином, улучшает гомеостаз глюкозы у мышей с ожирением, вызванным диетой. Кишечник , DOI: 10.1136 / gutjnl-2012-303839 (2013).

  • 16

    Everard, A. et al. Взаимодействие между Akkermansia muciniphila и кишечным эпителием контролирует ожирение, вызванное диетой. Proc Natl Acad Sci USA 110 , 9066–9071, DOI: 10.1073 / pnas.1219451110 (2013).

    ADS Статья PubMed Google Scholar

  • 17

    Caricilli, A. M. et al. Микробиота кишечника является ключевым модулятором инсулинорезистентности у мышей с нокаутом TLR 2. Биология PLoS 9 , e1001212, DOI: 10.1371 / journal.pbio.1001212 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 18

    О, J. Z. et al. TLR5-опосредованное зондирование кишечной микробиоты необходимо для антител к вакцинации против сезонного гриппа. Иммунитет 41 , 478–492, DOI: 10.1016 / j.immuni.2014.08.009 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 19

    Маккартни, С.A. et al. Распознавание MDA-5 мышиного норовируса. PLoS Pathog 4 , e1000108, DOI: 10.1371 / journal.ppat.1000108 (2008).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 20

    Broquet, A.H., Hirata, Y., McAllister, C.S. & Kagnoff, M.F. RIG-I / MDA5 / MAVS необходимы для передачи сигнала защитного IFN-ответа в кишечном эпителии, инфицированном ротавирусом. Журнал иммунологии 186 , 1618–1626, DOI: 10.4049 / jimmunol.1002862 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Nunez, V. et al. Альфа-рецептор ретиноида X контролирует врожденные воспалительные реакции за счет повышения экспрессии хемокинов. Proc Natl Acad Sci USA 107 , 10626–10631, DOI: 10.1073 / pnas.05107 (2010).

    ADS Статья PubMed Google Scholar

  • 22

    Синдху, К.N. et al. Иммунный ответ и кишечная проницаемость у детей с острым гастроэнтеритом, леченных Lactobacillus rhamnosus GG: рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование. Clin Infect Dis 58 , 1107–1115, DOI: 10.1093 / cid / ciu065 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 23

    Kikuchi, Y. et al. Пероральное введение штамма AYA Lactobacillus plantarum усиливает секрецию IgA и обеспечивает защиту выживания от заражения вирусом гриппа у мышей. PloS one 9 , e86416, DOI: 10.1371 / journal.pone.0086416 (2014).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 24

    Цай, Ю. Т., Ченг, П. С. и Пан, Т. М. Иммуномодулирующие эффекты молочнокислых бактерий для улучшения иммунных функций и преимуществ. Appl Microbiol Biotechnol 96 , 853–862, DOI: 10.1007 / s00253-012-4407-3 (2012).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 25

    Сандерс, М.E. Влияние пробиотиков на колонизирующую микробиоту кишечника. J Clin Gastroenterol 45 Suppl, S115–119, DOI: 10.1097 / MCG.0b013e318227414a (2011).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 26

    Суэйн, М. Р., Анандхарадж, М., Рэй, Р. К. и Парвин Рани, Р. Ферментированные фрукты и овощи из Азии: потенциальный источник пробиотиков. Международные исследования в области биотехнологии 2014 , 250424, DOI: 10.1155/2014/250424 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 27

    де Врезе, М. и Шрезенмейр, Дж. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии 111 , 1–66, DOI: 10.1007 / 10_2008_097 (2008).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 28

    Хайзер, Х.Дж. И Тернбо, П. Дж. Разработка метагеномного взгляда на метаболизм ксенобиотиков. Фармакологическое исследование: официальный журнал Итальянского фармакологического общества 69 , 21–31, DOI: 10.1016 / j.phrs.2012.07.009 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 29

    Tomosada, Y. et al. Штаммы Lactobacillus rhamnosus, вводимые через нос, по-разному модулируют респираторный противовирусный иммунный ответ и индуцируют защиту от респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. BMC иммунология 14 , 40, DOI: 10.1186 / 1471-2172-14-40 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 30

    Miettinen, M. et al. Непатогенные Lactobacillus rhamnosus активируют инфламмасомы и противовирусные реакции в макрофагах человека. Кишечные микробы 3 , 510–522, DOI: 10,4161 / gmic.21736 (2012).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 31

    Ницца, Т.J. et al. Интерферон-лямбда излечивает хроническую норовирусную инфекцию мышей при отсутствии адаптивного иммунитета. Наука 347 , 269–273, DOI: 10.1126 / science.1258100 (2015).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed Google Scholar

  • 32

    Карта, М. Р. и др. ЛПС модулирует индуцированную риновирусом секрецию хемокинов в моноцитах и ​​макрофагах. Американский журнал респираторных клеток и молекулярной биологии 51 , 125–134, DOI: 10.1165 / rcmb.2013-0404OC (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 33

    Simard, S., Maurais, E., Gilbert, C. & Tremblay, M. J. LPS снижает репликацию ВИЧ-1 в первичных макрофагах человека частично за счет эндогенной продукции интерферонов типа I. Клиническая иммунология 127 , 198–205, DOI: 10.1016 / j.clim.2008.01.007 (2008).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 34

    Адам, М.Нельсон и др. Норовирусная инфекция мышей не вызывает серьезных нарушений кишечной микробиоты мышей. Микробиом 1 , DOI: 10.1186 / 2049-2618-1-7 (2013).

  • 35

    Nelson, A. M. et al. Нарушение микробиоты кишечника человека в результате норовирусной инфекции. PloS one 7 , e48224, DOI: 10.1371 / journal.pone.0048224 (2012).

    CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 36

    Thackray, L.B. et al. Мышиные норовирусы, входящие в одну геногруппу, демонстрируют биологическое разнообразие, несмотря на ограниченное расхождение последовательностей. Журнал вирусологии 81 , 10460–10473, DOI: 10.1128 / JVI.00783-07 (2007).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 37

    Вобус, К. Э., Текрей, Л. Б. и Вирджин, Х. У. т. Норовирус мышей: модельная система для изучения биологии и патогенеза норовирусов. Журнал вирусологии 80 , 5104–5112, DOI: 10.1128 / JVI.02346-05 (2006).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 38

    Hirneisen, K. A. & Kniel, K. E. Сравнение суррогатов человеческого норовируса: мышиный норовирус и вирус Тулейна. J Food Prot 76 , 139–143, DOI: 10.4315 / 0362-028X.JFP-12-216 (2013).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 39

    Уорд, Дж.M. et al. Патология иммунодефицитных мышей с естественно встречающейся норовирусной инфекцией мышей. Toxicol Pathol 34 , 708–715, DOI: 10.1080 / 01

    0600

    6 (2006).

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 40

    Чанг, К. О., Сосновцев, С. В., Беллиот, Г., Кинг, А. Д. и Грин, К. Ю. Стабильная экспрессия репликона РНК норвалькского вируса в клеточной линии гепатомы человека. Вирусология 353 , 463–473, DOI: S0042-6822 (06) 00396-5 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 41

    Kageyama, T. et al. Широкореактивный и высокочувствительный анализ на норволк-подобные вирусы, основанный на количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. J Clin Microbiol 41 , 1548–1557, DOI: 10.1128 / JCM.41.4.1548–1557.2003 (2003).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 42

    Парк, ул., Cho, Y.H, Jee, Y. & Ko, G. Иммуномагнитная сепарация в сочетании с ПЦР-анализами обратной транскриптазы в реальном времени для обнаружения норовируса в зараженной пище. Appl Environ Microbiol 74 , 4226–4230, DOI: AEM.00013-08 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 43

    Ли, Дж., Зох, К. и Ко, Г. Инактивация и УФ-дезинфекция мышиного норовируса с помощью TiO2 в различных условиях окружающей среды. Прикладная и экологическая микробиология 74 , 2111–2117, DOI: 10.1128 / AEM.02442-07 (2008).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 44

    Gilbert, J. A. et al. Отчет о встрече: семинар по терабазной метагеномике и видение проекта микробиома Земли. Stand Genomic Sci 3 , 243–248, DOI: 10.4056 / sigs.1433550 (2010).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 45

    Капорасо, Дж.G. et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Nat Methods 7 , 335–336, DOI: 10.1038 / nmeth.f.303 (2010).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 46

    Segata, N. et al. Открытие и объяснение метагеномных биомаркеров. Биология генома 12 , R60, DOI: 10.1186 / gb-2011-12-6-r60 (2011).

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 47

    Лангиль, М.G. et al. Прогнозирующее функциональное профилирование микробных сообществ с использованием последовательностей маркерного гена 16S рРНК. Nat Biotechnol 31 , 814–821, DOI: 10.1038 / nbt.2676 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Ранняя высокоактивная антиретровирусная терапия острой ВИЧ-1-инфекции сохраняет иммунную функцию CD8 + и CD4 + Т-лимфоцитов

    Реферат

    Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) рекомендуется для лечения первичной инфекции ВИЧ-1 без четкого понимания ее иммунологических эффектов.Здесь мы демонстрируем, что раннее использование ВААРТ во время первичной инфекции сохраняет ВИЧ-специфические CD8 + Т-клетки физически и функционально, в то время как помощь ВИЧ-специфических Т-клеток сохраняется. Мы также показываем, что даже временное введение ВААРТ при сероконверсии может сохранить ВИЧ-специфический иммунитет. Напротив, отсроченное начало ВААРТ связано с прогрессирующей потерей ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов CD8 + и отсутствием помощи ВИЧ-специфических Т-клеток. Эти результаты означают, что ВИЧ-специфическая Т-помощь повреждена во время первичной инфекции ВИЧ-1.Раннее медикаментозное лечение, которое сохраняет этот иммунитет, также сохраняет ВИЧ-специфические CD8 + Т-клетки. Эти результаты имеют значение для понимания раннего патогенеза ВИЧ-1-инфекции и позволяют предположить, что острую ВИЧ-инфекцию следует лечить агрессивно и как можно раньше.

    Признаки первичной инфекции ВИЧ-1 включают острый вирусный синдром, характеризующийся лихорадкой, сыпью и лимфаденопатией в сочетании с высокими уровнями репликации вируса и распространения вируса в лимфоидные ткани (1, 2).Вирус-специфичные ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) CD8 + впервые обнаруживаются в это время и, как считается, опосредуют снижение начальной виремии (1–4). Поскольку исход инфекции ВИЧ-1 зависит от этих ранних событий (5–7), при острой инфекции ВИЧ-1 рекомендована высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) (8). Это терапевтическое вмешательство может ограничить распространение вируса, сводя к минимуму вредное воздействие на клеточную иммунную функцию и архитектуру вторичных лимфоидных органов.Однако влияние ВААРТ на взаимодействие между ответами Т-лимфоцитов и ВИЧ-1 вскоре после заражения вирусом остается неопределенным. Некоторая предварительная поддержка раннего использования ВААРТ основана на данных трех пациентов, получавших комбинированную антиретровирусную терапию при сероконверсии. Вирусная нагрузка была подавлена ​​до неопределяемого уровня, и это коррелировало с измеряемой функцией ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов-помощников (9). Появляется все больше доказательств того, что ВИЧ-специфические CTL могут играть решающую роль в борьбе с виремией (10–12).Начало ВААРТ при установленной инфекции связано со снижением ВИЧ-специфических CTL (13–17). Это может отражать отсутствие ВИЧ-специфической Т-помощи для поддержания Т-клеточных ответов CD8 + (18).

    Мы выдвинули гипотезу, что использование ВААРТ при острой ВИЧ-1-инфекции как средство сохранения ВИЧ-специфических ответов Т-клеток CD4 + может также сохранять ответы Т-клеток CD8 + на вирус. Это было протестировано на группе из восьми пациентов с острой симптоматической первичной инфекцией ВИЧ-1.Был проведен подробный продольный анализ ВИЧ-специфического иммунитета Т-лимфоцитов CD8 + и CD4 + . Идентификация ранних доминантных CTL-ответов, направленных против одного и того же HLA-B8-ограниченного эпитопа в составе белка Nef ВИЧ-1 (FLKEKGGL), у шести из восьми пациентов предоставила необычную возможность изучить влияние ВААРТ на ответы с идентичной специфичностью.

    Материалы и методы

    Изучаемая популяция.

    Пациенты (SC2, SC9, SC10, SC11, SC12, SC15, SC18 и SC19) с острой симптоматической инфекцией ВИЧ-1 были набраны из больницы Челси и Вестминстера (Лондон).Все были мужчинами-гомосексуалистами европеоидной расы в возрасте 25–37 лет с хорошо задокументированным недавним контактом с ВИЧ-1 в результате незащищенных половых контактов с высоким риском, за которым следовало типичное сероконверсионное заболевание, которое включало лихорадку, сыпь и лимфаденопатию (Таблица 1). Дополнительные клинические признаки включали менингизм в SC2, запор в SC10, парастезию и кандидоз полости рта в SC11, анорексию в SC12 и миалгию и артралгию в SC15. Сообщаемое пациентом начало сероконверсионной болезни определялось как начало симптомов.Первичная инфекция определялась как присутствие РНК ВИЧ-1 или антигена p24 во время острого симптоматического заболевания в отсутствие антител к ВИЧ или типичный вирусный синдром после отрицательного теста на антитела к ВИЧ-1 6 мес или менее ранее. Получено соответствующее этическое одобрение.

    Таблица 1

    Характеристика пациента

    HLA Typing.

    Генотип HLA класса I и II каждого пациента определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных для последовательности (19).

    Определение вирусной нагрузки.

    Вирусную нагрузку количественно определяли из криоконсервированной плазмы с использованием набора для обратной транскрипции ампликора – ПЦР (Roche Diagnostics).

    Оценка функциональных ВИЧ-специфических CD8

    + и CD4 + Т-клеточных ответов.

    Лейкоциты периферической крови (PBL) отделяли от гепаринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла / гипака. Массовые культуры получали добавлением аутологичных лимфоцитов, активированных фитогемагглютинином (ФГА), к PBL (20).Цитолитическую активность определяли с помощью стандартных анализов высвобождения хрома (20, 21). Синтетические пептиды (таблица 2, эталонный штамм ВИЧ IIIB) использовали в концентрации 2 мкМ в анализах IFN-γ с ферментным иммунным спотом (ELISPOT) для определения CD8 + ответов Т-клеток непосредственно ex vivo , как описано ранее (22 ). PHA всегда включали в качестве положительного контроля. Рекомбинантные белки, производные от ВИЧ-1 [gp120, p24, p66 при 10 мкг / мл; Национальный институт биологических стандартов и контроля (NIBSC), Potters Bar, U.K.], два синтетических пептида Tat (Tat 32–72 и Tat 49–85 при 5 мкг / мл; NIBSC) и перекрывающиеся объединенные пептиды, охватывающие белок Nef ВИЧ-1 (5 мкг / мл; NIBSC), были использованы для определения ВИЧ. -специфические CD4 + Т-клеточные ответы в PBL, лишенных CD8 + Т-клеток с анти-CD8-конъюгированными Dynabeads (Dynal, Мерсисайд, Великобритания) с помощью анализа IFN-γ ELISPOT с добавлением 0,5 мкг mAb против CD28 (Becton Дикинсон) и анализами пролиферации (22, 23). ВИЧ-неродственные антигены стрептокиназа / стрептодорназа (200 единиц / мл) и ФГА использовали в качестве положительного контроля.Результаты анализов пролиферации выражаются в виде индекса стимуляции (SI), который определяется как отношение включения [ 3 H] тимидина с антигеном / включение [ 3 H] тимидина без антигена. Все анализы были выполнены в двух экземплярах.

    Тетрамерные комплексы.

    Пептид, конъюгированный с фикоэритрином / тетрамерные комплексы HLA-B8, использовали для физического отслеживания антиген-специфических ответов, как описано ранее (24).

    Окрашивание клеток и анализ FACS.

    Клетки окрашивали тетрамером при 37 ° C в течение 30 минут, промывали PBS и 0,1% азидом натрия, а затем окрашивали триколором против CD8 человека (Калтаг, Южный Сан-Франциско, Калифорния) при 4 ° C в течение 20 минут. снова промывали, а затем фиксировали 1% формальдегидом в PBS. Окрашенные клетки анализировали с использованием аппарата Becton Dickinson FACScan с программным обеспечением cellquest.

    Секвенирование провирусной ДНК.

    Геномную ДНК экстрагировали непосредственно из некультивированных РВМС с использованием набора для выделения ДНК Purgene (Gentra Systems).Полноразмерный Nef амплифицировали с помощью вложенной ПЦР, как описано ранее (21). p24 (аминокислоты 558–965) амплифицировали аналогичным образом с использованием праймеров 5'-AGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGT-3 '/ 5'-ACTCCCTGACATGCTGTCATCAT-3' для первичной реакции (отжиг при 53 ° C) и 5'-ATGCTAAACACACAGTGGG'GG '-CAACAAGGTTTCTGTCATCCAATTTTTTAC-3' для вторичной реакции (отжиг при 55 ° C). Продукты были клонированы с помощью системы Т-вектор (Invitrogen) и секвенированы путем секвенирования терминатора красителя с использованием праймера M13F на ДНК-секвенаторе ABI 377 (Perkin – Elmer Applied Biosystems).

    Результаты

    Отсроченное начало ВААРТ.

    Мы исследовали влияние отсроченного начала ВААРТ (более 6 месяцев после сероконверсии) на широту специфичности и на функцию ВИЧ-специфических CD8 + Т-клеток в течение 1–4 лет после появления симптомов. Несколько исследований показали, что начало ВААРТ во время хронической ВИЧ-инфекции приводит к снижению числа ВИЧ-специфических CD8 + Т-клеток (14, 15) и функции (16, 17).Мы подтверждаем эти результаты, наблюдая снижение количества окрашиваемых тетрамерами ВИЧ-специфических популяций Т-лимфоцитов CD8 + и снижение функционального ответа, измеренного с помощью IFN-γ ELISPOT. Кроме того, мы обнаружили, что пациенты, которые начали ВААРТ более чем через 6 месяцев после сероконверсии, не имели детектируемых ВИЧ-1-специфических ответов Т-лимфоцитов CD4 + .

    SC2.

    Этот пациент сначала отказался от ВААРТ и не лечился в течение 21 месяца после сероконверсии.Доминирующий ответ CTL на 22 DFOSx был направлен против HLA B8-ограниченного эпитопа FLK (21) (фиг. 1 A ).

    Рисунок 1

    CTL-активность SC2, SC10 и SC12 вскоре после заражения. Анализы высвобождения хрома выполняли с массовым культивированием PBL SC2 при 22 DFOSx ( A ), SC10 при 36 DFOSx ( B ) и SC12 при 30 DFOSx ( C ). Клетки-мишени, экспрессирующие HLA B8 (B-LCL), были помечены указанными HLA B8-связывающими пептидами, и культивированные в массе PBL использовали при соотношении эффектора к мишени 60: 1 в B и, как указано в A и C .Самопроизвольное высвобождение было ниже 20%.

    На 382 DFOSx и 760 DFOSx ответы на HLA-B8-ограниченные эпитопы GEI, GPK и FLK были обнаружены с помощью IFN-γ ELISPOT. Однако при 1059 DFOSx эти ответы были значительно уменьшены (рис. 2 A ). При 1340 DFOSx были обнаружены сильные GEI- и GPK-специфические, но не FLK-специфичные, ответы Т-клеток CD8 + . Восстановление GEI- и GPK-специфических Т-клеточных ответов, вероятно, отражает стимуляцию аутологичным вирусом в течение периода без лечения (780–1,340 DFOSx).Анализ последовательностей эпитопов GEI и FLK на 1083 DFOSx показал, что большинство последовательностей GEI (7/9 клонов) кодируют индексный пептидный эпитоп GEIYKRWII, тогда как большинство последовательностей FLK (8/10 клонов) кодируют ускользающий вариант CTL. FLKENGGL, как описано ранее (21).

    Рисунок 2

    Иммунный ответ во время и после ВИЧ-инфекции. Размороженные, некультивируемые PBL SC2 ( A ), SC9 ( B ), SC19 ( C ), SC10 ( D ), SC12 ( E ), SC15 ( F ), SC11 ( G ) и SC18 ( H ).Для вирусной нагрузки (●) точки данных на исходном уровне были ниже предела обнаружения анализа (<400 копий на мл). PBL окрашивали тетрамерами, специфичными для HLA B8-рестриктированного эпитопа FLK (□). Показаны средние значения, выраженные в процентах от общего количества CD8 + Т-клеток. Начало и продолжительность ВААРТ обозначена черной полосой в верхней части верхней панели. Анализ IFN-γ-ELISPOT показан на нижних панелях, а время анализа указано стрелками, указывающими на временную ось (ось x ).Специфическое высвобождение IFN-γ указывало на количество пятен, индуцированных пептидной стимуляцией (пептиды указаны на оси x панелей ELISPOT), деленное на количество пятен, наблюдаемых без стимуляции антигеном. У каждого пациента было использовано 9-20 пептидов для скрининга CD8 + Т-клеточных ответов в каждом образце, но показаны только те пептиды, которые стимулировали ответ в какой-то момент исследования. Последовательно отрицательные ответы не наносятся.

    Тетрамер-положительные FLK-специфические CD8 + Т-лимфоцитов снижались до начала ВААРТ, несмотря на стойкую виремию около 10 6 копий на мл плазмы (рис.2 А ). Это снижение антиген-специфических CTL совпало с появлением вариантов FLK-эпитопа, которые не распознавались аутологичными CTL (21).

    Оценка ВИЧ-специфических CD4 + Т-клеточных ответов от CD8-истощенных PBL при 1340 DFOSx не выявила значимого ответа ELISPOT IFN-γ на какой-либо из протестированных антигенов (фиг. 3 A ). Кроме того, не было пролиферативных ответов CD4 + Т-клеток при 543 DFOSx (не показано).

    Рисунок 3

    ВИЧ-специфический CD4 + Т-клеточная реакция.CD8-обедненные PBL SC2 ( A ), SC19 ( B ), SC10 ( C ), SC12 ( D ), SC18 ( E ) и SC11 ( F ) стимулировались с помощью указанные антигены, производные от ВИЧ, и специфическая секреция IFN-γ показаны как количество пятен, индуцированных стимуляцией антигеном (антигены указаны на оси x панелей ELISPOT), деленное на количество пятен, наблюдаемых без стимуляции пептидом. Значения в скобках указывают месяцы после появления симптомов, когда были взяты образцы клеток и проведен анализ.

    SC9.

    Этот пациент не получал лечения 400 DFOSx. Когда была начата ВААРТ, виремия исчезла с помощью 499 DFOSx. Однако, поскольку лечение было остановлено на 800 DFOSx, виремия снова появилась на 839 DFOSx. Доминирующий ответ CTL на 107 DFOSx был направлен против HLA B8-ограниченного эпитопа FLK (фиг. 2 B ). На этапе 421 DFOSx, CD8 + Т-клеточные ответы против FLK и HLA-A2-ограниченного эпитопа ILK наблюдались, а при 560 DFOSx были обнаружены ответы на пептиды FLK, ILK и GEI.Однако при 713 DFOSx эти ответы были значительно снижены до почти неопределяемых уровней (рис. 2 B ). При 1006 и 1146 DFOSx - когда виремия вновь появилась из-за плохой приверженности к терапии - снова были обнаружены GEI-, FLK- и ILK-специфические CD8 + Т-клеточные ответы. Анализ последовательности эпитопов GEI и FLK на 877 DFOSx не выявил изменений в эпитопе GEI (10/10 клонов), и все последовательности эпитопа FLK (10/10 клонов) кодировали индексную последовательность FLKEKGGL (не показано).

    Нет CD4 + Пролиферативные ответы Т-клеток не были обнаружены при 499 и 713 DFOSx (не показано).

    SC19.

    Пациент начал ВААРТ в 197 DFOSx. При 60 DFOSx, значительный ответ IFN-γ ELISPOT наблюдался против нескольких эпитопов (ACQ, AVD, FNC и GEI), но не наблюдался FLK-специфический ответ, что согласуется с отсутствием окрашивания тетрамера для FLK-специфичного CD8 + Т-клеток в это время (рис.2 С ). Позже, при 125 и 195 DFOSx, паттерн реактивности эпитопа сохранялся и увеличивался по величине. Кроме того, была обнаружена чувствительность к FLK, которая коррелировала с положительным окрашиванием тетрамером FLK (фиг. 2 C ). Однако после начала ВААРТ ответы на все эпитопы были снижены по сравнению с уровнями до лечения; в частности, упразднена отзывчивость ФЛК. Это соответствовало отсутствию окрашивания тетрамерами FLK-специфичных CD8 + Т-клеток. Секвенирование на 307 DFOSx показало, что все проанализированные последовательности GEI (10/10 клонов) кодировали индексный пептидный эпитоп GEIYKRWII, и в эпитопе FLK (7/7 клонов) не наблюдали вариации последовательности (не показано).

    Не было обнаружено ВИЧ-специфических CD4 + Т-клеточных ответов в CD8-истощенных PBL при 363 DFOSx (фиг. 3 B ).

    Раннее начало ВААРТ.

    Мы сравнили широту и специфичность функциональных ВИЧ-специфических Т-клеточных ответов у пациентов, у которых начало ВААРТ было отложено, с теми, кто начал лечение во время сероконверсии. Мы обнаружили, что ВИЧ-специфические Т-клеточные ответы CD8 + и CD4 + сохранялись, несмотря на отсутствие детектируемого антигена у пациентов, которые начали ВААРТ при сероконверсии.Кроме того, мы обнаружили доказательства того, что короткий курс ВААРТ в течение 1–4 недель во время первичной инфекции может привести к устойчивым ВИЧ-специфическим Т-клеточным ответам CD4 + и CD8 + .

    Устойчивая терапия. SC10.

    Этот пациент получил ВААРТ от 49 DFOSx. Доминирующий цитолитический ответ в острой фазе инфекции был направлен против HLA-B8-ограниченного эпитопа FLK (рис. 1 B ). В течение всего периода лечения FLK-индуцированная секреция IFN-γ наблюдалась в прямых анализах ex vivo ELISPOT (фиг.2 Д ). HLA-B8-рестриктированный эпитоп p24 Gag GEI индуцировал детектируемую секрецию IFN-γ при 853 DFOSx. Характер реакции на пептиды оставался удивительно постоянным в течение 1100 дней наблюдения. Анализ последовательности при 1088 DFOSx не выявил вариаций последовательности в эпитопе FLK (9/9 клонов; не показано).

    После начала ВААРТ было обнаружено временное повышение FLK-специфических тетрамер-положительных CD8 + Т-лимфоцитов, за которым последовало снижение вирусной нагрузки до неопределяемого уровня.Однако, несмотря на длительное подавление вирусной нагрузки, тетрамер-положительные Т-клетки CD8 + , специфичные к эпитопу FLK, постоянно выявлялись на уровнях 0,2–0,3% Т-клеток CD8 + (рис. 2 D ).

    Периодическое повторное появление виремии у пациента было связано, по крайней мере, в одном случае с непродолжительным периодом несоблюдения режима лечения.

    Оценка ВИЧ-специфической реакции Т-клеток CD4 + из CD8-истощенных PBL при 1088 DFOSx выявила сильный ответ на рекомбинантный антиген p24 и менее выраженные ответы на рекомбинантный антиген gp120 и перекрывающиеся объединенные пептиды Nef (рис.3 С ).

    SC12.

    Этот пациент получил ВААРТ от 30 DFOSx. Иммунодоминантный цитолитический ответ во время острой инфекции был направлен против эпитопа HLA B8 FLK (фиг. 1 C ). Это коррелировало с анализом IFN-γ ELISPOT, где наблюдали доминирующий ответ на эпитоп FLK и менее выраженный ответ на эпитоп GEI (фиг. 2 E ). Ответ FLK сохранялся на протяжении 800 дней ВААРТ (рис.2 E ).

    SC12 прекратил терапию на 832 DFOSx, что привело к повторному появлению виремии. Одновременно наблюдалось повышение чувствительности CTL и Т-клеток CD8 + , окрашиваемых FLK, с 0,1% до прекращения ВААРТ до 1,5% после этого. Интересно, что не только FLK-чувствительные Т-клетки CD8 + были усилены рецидивом вируса, но и другие ответы, неявные во время периода лечения и специфичные для HLA B8-ограниченных эпитопов GGK и GEI, стали обнаруживаемыми.В 874 DFOSx SC12 продолжил ВААРТ. Это привело к контролю виремии и падению количества Т-клеток CD8 + , окрашиваемых FLK, до 0,6% от числа Т-клеток CD8 + . Анализ последовательности эпитопов GEI и FLK при 1050 DFOSx показал, что все последовательности GEI (10/10 клонов) кодируют индексный пептидный эпитоп GEIYKRWII и, аналогично, все последовательности FLK (9/9 клонов) кодируют индексную последовательность FLKEKGGL (не показано) .

    Оценка ВИЧ-специфической CD4 + реактивности Т-клеток из CD8-истощенных PBL при 1019 DFOSx выявила сильный ответ на рекомбинантный антиген p24 и на рекомбинантный антиген p66 (рис.3 Д ). Кроме того, пролиферативные ответы на рекомбинантный антиген p24 (SI 6,2) и рекомбинантный антиген p66 (SI 3,4) наблюдались при 656 DFOSx (не показано).

    SC15.

    Пациент получил ВААРТ при сероконверсии. Анализ IFN-γ ELISPOT показал, что доминирующий ответ был направлен против HLA B35-ограниченных эпитопов PPI и VPL (фиг.2 F ), и оба ответа сохранялись в течение 300 дней ВААРТ (фиг.2 Ф ).

    CD4 + пролиферативный ответ Т-клеток против рекомбинантного антигена p66 (SI 3) наблюдали при 129 DFOSx (не показано).

    Ограниченный курс терапии. SC11.

    Этот пациент получил ВААРТ от 32 DFOSx. Анализ IFN-γ ELISPOT показал, что доминирующий ответ был направлен против GEI и FLK (фиг. 2 G ). SC11 оставался на ВААРТ в течение 40 дней, а затем прекратил лечение до 640 DFOSx.После 40 дней лечения виремия снизилась в 100 раз. Повторное начало лечения 640 DFOSx привело к исчезновению виремии на 757 DFOSx. На 32, 757, 836 и 1082 DFOSx, GEI- и FLK-специфические CD8 + Т-клеточные ответы наблюдались (фиг. 2 G ). FLK-специфическая чувствительность коррелировала с FLK-положительной тетрамерно-окрашиваемой популяцией Т-клеток CD8 + 0,4%, 1,1%, 0,9% и 0,5% при 32, 757, 836 и 1082 DFOSx.

    Анализ ВИЧ-специфических CD4 + Т-клеточных ответов от CD8-истощенных PBL при 1082 DFOSx выявил сильные ответы на рекомбинантный антиген gp120 и p66, а также на пептид Tat 32–72 (рис.3 Ф ). Кроме того, сильный пролиферативный ответ Т-клеток CD4 + на рекомбинантный p66 был измерен при 48 DFOSx (SI 12,5; не показано).

    SC18.

    Этот пациент получил ВААРТ от 12 DFOSx. Анализ IFN-γ ELISPOT показал, что доминирующий ответ был направлен против HLA A11-ограниченных эпитопов ACQ, QVP и AVD (фиг. 2 H ).

    SC18 оставался на ВААРТ в течение 20 дней. Этот период лечения привел к снижению виремии более чем в 100 раз и 174 DFOSx до неопределяемых уровней.Однако виремия вновь появилась на 285 DFOSx. При 8 DFOSx не наблюдалось значительного ответа Т-лимфоцитов CD8 + . На 285 DFOSx был обнаружен значительный ответ против QVP и AVD, а на 599 DFOSx наблюдался сильный ACQ- и QVP-специфический ответ.

    На 599 DFOSx были обнаружены сильные ответы Т-клеток CD4 + на рекомбинантные антигены p24, gp120 и p66 (фиг. 3 E ). Кроме того, пролиферативный ответ против рекомбинантного антигена p24 (SI 6.6) был измерен при 285 DFOSx (не показан).

    Обсуждение

    Иммунологические последствия терапевтического вмешательства при первичной инфекции ВИЧ-1 в значительной степени неизвестны. Имеются убедительные доказательства того, что ранняя активность CTL во время естественного течения инфекции является ключевым фактором в контроле начальной виремии (4, 21, 25, 26). Раннее взаимодействие между репликацией вируса и активностью CTL влияет на равновесную вирусную уставку, которая, в свою очередь, позволяет прогнозировать последующую скорость прогрессирования заболевания (5–7, 27).Таким образом, вмешательство на ранних стадиях инфекции может существенно повлиять на клинический исход ВИЧ-инфекции.

    Мы проанализировали индукцию и поддержание ВИЧ-специфических ответов Т-лимфоцитов CD8 + у пациентов во время острой инфекции ВИЧ-1, а затем проследили эволюцию этих ответов в течение до 3 лет и сравнили влияние раннего и отсроченного лечения. на ВИЧ-специфические Т-клеточные ответы. Начало ВААРТ при сероконверсии было связано с сохранением ВИЧ-специфических CTL, определенных методами окрашивания тетрамерами и функциональными анализами, несмотря на значительное снижение вирусной нагрузки.Это было связано с мощными ВИЧ-специфическими Т-клеточными ответами CD4 + , направленными против множества антигенов. Интересно, что у двух пациентов, несмотря на прекращение раннего лечения через 2 и 4 недели, мы по-прежнему наблюдали доказательства положительного влияния на поддержание ВИЧ-специфических Т-клеточных ответов. Это наблюдение обнадеживает, поскольку длительное лечение ВААРТ является дорогостоящим, токсичным и обычно связано с прерывистым соблюдением режима лечения.

    Напротив, чувствительность CTL снижалась у пациентов, у которых начало ВААРТ было отложено (6–18 мес. После сероконверсии).Это коррелировало с отсутствием помощи ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов. Эти результаты сопоставимы с результатами других исследований (14–17, 28), в которых сообщалось о снижении количества ВИЧ-специфических CTL после назначения ВААРТ у хронически инфицированных пациентов. Анализ последовательности эпитопов CTL подтвердил, что снижение чувствительности CTL у пациентов, получавших позднее лечение, не было результатом выбора вариантов эпитопа, которые все еще могут появляться во время ВААРТ (29, 30). В настоящем исследовании снижение реактивности Т-клеток было очевидным только во время эффективного лечения, т.е.е., при отсутствии виремии. Когда двое из трех поздно пролеченных пациентов прекратили терапию и снова появилась виремия, у них восстановились ВИЧ-специфические ответы ЦТЛ, но не ВИЧ-специфические ответы Т-клеток CD4 + .

    Хотя другие факторы могут объяснять различный иммунологический эффект раннего и позднего начала лечения, наши результаты показывают, что сохранение ВИЧ-специфической Т-помощи играет важную роль. При хронических вирусных инфекциях мышей функциональные Т-хелперные клетки CD4 + необходимы для поддержания устойчивых ответов CTL (31–35).Кроме того, функциональная Т-помощь может быть важна для поддержания Т-клеточных ответов CD8 + памяти после разрешения острой вирусной инфекции (36). Экстраполяция этих результатов на инфекцию ВИЧ-1 позволяет предположить, что устойчивая реакция CTL в отсутствие детектируемого антигена будет зависеть от функциональной ВИЧ-специфической Т-помощи. Доказательства того, что эти особенности, в свою очередь, связаны с благоприятным клиническим исходом, основаны на исследованиях долгосрочных непрогрессоров (LTNP), которые имеют как устойчивую активность CTL (11, 37), так и ВИЧ-специфическую Т-помощь (9, 38).Более того, недавний отчет продемонстрировал корреляцию между ВИЧ-p24-специфическими пролиферативными CD4 + Т-клеточными ответами и Gag-специфическими предшественниками CTL (18).

    Таким образом, эти результаты позволяют предположить, что поддержание устойчивого функционального ответа CTL зависит от функциональной помощи Т-лимфоцитов у пациентов с ВИЧ, которые получают эффективную антиретровирусную терапию. Функциональная помощь ВИЧ-специфических Т-клеток и ответы Т-лимфоцитов CD8 + сохраняются у пациентов, проходящих лечение при сероконверсии, но не у пациентов, которые начинают лечение позже, спустя много времени после разрешения сероконверсии.Эти результаты имеют важное значение для понимания раннего патогенеза ВИЧ-инфекции и для разработки терапевтических протоколов, направленных на ограничение повреждения иммунной системы во время первичной инфекции ВИЧ-1.

    Благодарности

    Мы благодарим Тимоти А. Япа за помощь в секвенировании, а также Анеле Уотерс и пациентов за их сотрудничество в этом исследовании. D.A.P., J.A.W., A.K.S. и R.E.P. поддерживаются Wellcome Trust, U.K. A.O. член Европейской организации молекулярной биологии; А.Д.К. является научным сотрудником Нила Гамильтона Фэрли.

    Сноски

    • ↵ * A.O., D.A.P. и P.J.E. внес равный вклад в эту работу.

    • ↵¶ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку. Эл. Почта: rodney.phillips {at} ndm.ox.ac.uk.

    Сокращения

    CTL,
    цитотоксический Т-лимфоцит;
    ВААРТ,
    высокоактивная антиретровирусная терапия;
    PBL,
    лейкоцит периферической крови;
    PHA,
    фитогемагглютинин;
    ELISPOT,
    иммуноферментный спот;
    SI,
    индекс стимуляции;
    DFOSx,
    дня после появления симптомов
    • Получено 4 ноября 1999 г.
    • Принято 20 декабря 1999 г.
    • Copyright © 2000, Национальная академия наук

    Окислительная полимеризация N-фенилантраниловой кислоты в гетерофазной системе

    Open Journal of Polymer Chemistry
    Vol.3 No. 3 (2013), Идентификатор статьи: 35307,7 стр. DOI: 10.4236 / ojpchem.2013.33012

    Окислительная полимеризация N-фенилантраниловой кислоты в гетерофазной системе

    Света Жирослановна Озкан * Петровна, Игорь Сергеевич Галипаше Ермегева Николаевна Бондаренко

    РАН, А.Институт нефтехимического синтеза им. В. Топчиева, Москва, Россия

    E-mail: * [email protected]

    Copyright © 2013 Света Жирослановна Озкан и др. Это статья в открытом доступе, распространяемая под лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

    Поступила 01.04.2013 г .; редакция 30 апреля 2013 г .; принята к печати 8 мая 2013 г.

    Ключевые слова: Окислительная полимеризация; Поли-N-фенилантраниловая кислота; Химическая структура

    РЕФЕРАТ

    Полимеры N-фенилантраниловой кислоты получены окислительной полимеризацией в гетерофазной системе в присутствии хлороформа.Изучено влияние условий синтеза на химическую структуру полимеров. Было обнаружено, что рост полимерной цепи происходит за счет соединения C-C во 2- и 4-положения фенильных колец по отношению к азоту. Изучена термическая стабильность поли-N-фенилантраниловой кислоты.

    1. Введение

    Развитие современных технологий требует новых материалов. Электроактивные полимеры привлекают большое внимание исследователей благодаря комплексу полезных свойств [1-5]. Полианилин, полученный окислительной полимеризацией анилина в водных растворах кислот, в настоящее время является наиболее часто используемым электроактивным полимером [6,7].Разработка новых электроактивных полимеров сдерживается ограниченной растворимостью новых мономеров в водных растворах кислот. В последние годы были разработаны методы межфазной окислительной полимеризации мономеров, не растворимых в водных растворах кислот. В случае межфазной полимеризации реагенты (мономер и окислитель) диспергированы в двух несмешивающихся фазах: мономер находится в органической среде, а окислитель находится в водной среде; рост полимера происходит на границе раздела [3,4,8-11].Варьирование органических растворителей позволяет вовлекать в окислительную полимеризацию мономеры, не растворимые в водных растворах кислот. Выделение окислителя в отдельную фазу дает возможность изменять тип и концентрацию мономера без разрушения нестабильных продуктов окисления. Поскольку процесс окисления происходит на границе раздела, нет необходимости в постепенном дозировании реагентов, что типично для синтеза полианилина.

    Серьезной проблемой электроактивных полимеров является их ограниченная растворимость в органических растворителях.Известно, что введение карбоксильных групп в ароматическое кольцо полианилина делает его растворимым в водных щелочных растворах. Гомополимеризация антраниловой кислоты изучалась в [12-14]. Реакцию проводили с персульфатами аммония и натрия как в присутствии серной кислоты, так и без нее. Выход полимера не превышал 6-8%, а его электропроводность не превышала 10 -8 См / см. Полученный полимер растворяется в водных растворах NH , 4, OH и NaOH.

    Сополимеризация антраниловой кислоты и анилина приводит к увеличению выхода до 40% - 50%. Доля связей с карбоксильной группой достигает 60%. Однако рост количества антраниловой кислоты в реакционной смеси вызывает уменьшение ММ сополимера с M w = 1,3 × 10 5 до 8,4 × 10 4 . Растворимость улучшается по мере увеличения количества звеньев антраниловой кислоты в сополимере. При этом наблюдается значительное снижение электропроводности с 4.5 × 10 –5 для эквимолярного отношения к 1 × 10 –8 См / см для 0,75-кратного избытка звеньев антраниловой кислоты [12,13]. Сополимер электроактивен в отличие от полиантраниловой кислоты [13].

    Антраниловая кислота также способна сополимеризоваться с дифениламином. Содержание звеньев антраниловой кислоты в сополимере увеличивается с увеличением его концентрации в исходной реакционной смеси [15,16].

    Исследование окислительной полимеризации дифениламин-2-карбоновой кислоты в 5 M H 2 SO 4 и в растворе гидроксида аммония показало, что химическая структура полимера зависит от pH реакционной среды.Было обнаружено, что рост полимерной цепи происходит через C-C - соединение в пара-положение фенильных колец по отношению к азоту при химической окислительной полимеризации дифениламин-2-карбоновой кислоты в растворе серной кислоты [5]. С другой стороны, если дифениламин-2-карбоновая кислота полимеризуется в растворе гидроксида аммония, рост полимерной цепи происходит через C-C - соединение во 2- и 4-положения фенильных колец по отношению к азоту [17]. ММ полимеров составляет M w = 1.9 × 10 4 . Полученные полимеры растворимы в водных щелочных растворах аналогично полианилину, в котором карбоксильные группы введены в ароматическое кольцо [12,13,15,16].

    В данной статье впервые представлены экспериментальные результаты окислительной полимеризации N-фенилантраниловой кислоты в гетерофазной системе в присутствии органического растворителя (хлороформа). Изучено влияние условий синтеза на химическую структуру, морфологию и физико-химические свойства полимеров.

    2. Экспериментальная

    2.1. Материалы

    N-фенилантраниловая кислота (аналитической чистоты), серная кислота (реактивной чистоты), аммиак (реактивной чистоты), хлороформ (реактивной чистоты), ДМФ (Acros Organics) и метиловый спирт («JT Baker ”) Использовались в том виде, в котором они были получены. Персульфат аммония (ЧДА) очищали перекристаллизацией. Водные растворы реагентов готовили на дистиллированной воде.

    2.2. Метод синтеза поли-N-фенилантраниловой кислоты

    Окислительную полимеризацию N-фенилантраниловой кислоты проводили путем растворения необходимого количества мономера в хлороформе и растворения окислителя (персульфата аммония) и NH 4 OH в дистиллированной воде.Соотношение объемов водной и органической фаз составляло 1: 1. Растворы органической и водной фаз смешивали сразу, без постепенного дозирования реагентов. Интенсивный процесс перемешивания осуществляли с помощью электрической мешалки с верхним приводом RW 16 Basic фирмы «IKA Werke» в узкой цилиндрической круглой двугорлой колбе (для повышения эффективности перемешивания) при 0˚C. Смесь осаждали десятикратным избытком 2% раствора H 2 SO 4 . Полученный продукт отфильтровывали и многократно промывали дистиллированной водой для удаления остатков реагентов.По данным элементного анализа в полимере после осаждения его в 2% -ном растворе H 2 SO 4 имеется остаточное количество сульфат-ионов. В связи с тем, что полученный полимер растворяется в NH 4 OH, невозможно провести его нейтрализацию. Низкомолекулярные олигомеры и остатки сульфат-ионов удаляли экстракцией метанолом в аппарате Сокслета в течение 1 дня или диализом в дистиллированной воде в течение 20 дней. Затем продукт сушили в вакууме до постоянного веса.

    2.3. Измерения

    MM полимеров N-фенилантраниловой кислоты измеряли с помощью ГПХ с использованием «Water’s 150˚C», оснащенного динамиками PLgel 5 мкм MIXED-C, с использованием N-метилпирролидона в качестве элюента при Т = 60 ° C. Скорость потока элюента - 1 мл / мин. Объем вводимой пробы - 150 мл. Калибровка проводилась по полистиролу. Использовался RI-детектор. Точность определения ММ ~ 5%.

    ИК-спектры образцов поли-N-фенилантраниловой кислоты записаны на ИК-Фурье спектрофотометре «IFS 66 v» в диапазоне 4000–400 см –1 .Образцы готовили в виде таблеток KBr.

    Электронные спектры поглощения образцов поли-N-фенилантраниловой кислоты в ДМФА регистрировали на спектрофотометре UV-1700 «Shimadzu» в диапазоне 190 - 1100 нм.

    13 Спектры ЯМР C поли-N-фенилантраниловой кислоты записаны на спектрометре Bruker MSL-300 в растворах дейтерированного ДМСО.

    Анализ проб поли-N-фенилантраниловой кислоты методом РФЭС проводили на двухкамерном приборе XSAM-800 «Kratos Analytical Ltd».В качестве возбуждающего излучения использовалась характеристическая полоса MgK a (hn = 1253,6 эВ).

    Рентгеновские исследования проводились при комнатной температуре на рентгеновском дифрактометре фирмы «Ригаку» с фокусировкой по Брэггу-Брентано на CrK α -излучение в непрерывном режиме.

    Морфологию порошка поли-N-фенилантраниловой кислоты исследовали методом растровой электронной микроскопии на электронном микроскопе JSVU3 фирмы JEOE (Япония). Электропроводящий углеродный слой предварительно наносили на поверхность образца термовакуумным напылением графита.

    ПЭМ-изображения были получены с помощью Phillips EM-301 (ускоряющее напряжение 60 - 80 кВ).

    БЭТ-анализ площади поверхности поли-N-фенилантраниловой кислоты был проведен на Micromeritics ASAP 2020 методом капиллярной конденсации азота при 77 К в области относительного давления (P / P о ) от 0,01 до 0,99. Поправочный коэффициент площади поверхности составляет ± 1. Дегазация образца проводилась при 120 ° С в течение 2 часов.

    Термический анализ выполнен на ТГА / ДСК1 «Mettler Toledo» при динамическом нагреве в интервале температур 30–800 ° С на воздухе и в токе азота.Масса навески 100 мг, скорость нагрева 10 ° С / мин, скорость потока азота 10 мл / мин. Прокаленный оксид алюминия использовали в качестве эталона. Образцы анализировали в тигле Al 2 O 3 .

    ДСК анализ проводили с использованием калориметра DSC 823 и «Mettler Toledo». Скорость нагрева образцов составляла 10 ° С / мин в атмосфере аргона (скорость его подачи 70 мл / мин). Обработка результатов экспериментов производилась с помощью сервисной программы STARe.Точность измерения температуры ± 0,3 К, энтальпии ± 1 Дж / г.

    3. Результаты и обсуждение

    3.1. Синтез поли-N-фенилантраниловой кислоты

    Изучено влияние концентрации мономера, окислителя, NH 4 OH, температуры и времени синтеза на выход и молекулярно-массовые характеристики поли-N-фенилантраниловой кислоты. Анализ полученных данных показал, что высокий выход и максимальный ММ могут быть получены при следующих условиях синтеза: [мономер] = 0.1 - 0,2 моль / л; [окислитель] = 0,2 - 0,5 моль / л; [NH 4 OH] = 0,5 - 1,0 моль / л; Т = 0˚С - 15˚С; t = 3-6 часов. Максимальный выход полимера составил 72% - 79%. По данным ГПХ, молекулярная масса полимера достигла M w = 2,6 × 10 4 , степень полимеризации более 120, индекс полидисперсности 2,2.

    Полимер N-фенилантраниловой кислоты представляет собой черный порошок, полностью растворимый в водных растворах NH 4 OH и NaOH, N-метилпирролидон, ДМФА, ДМСО, частично в ТГФ, диоксане, ацетоне.Согласно рентгеновскому анализу и ПЭМ поли-N-фенилантраниловая кислота представляет собой аморфный полимер (рисунки 1 и 2).

    3.2. Химическая структура поли-N-фенилантраниловой кислоты

    Строение полимеров N-фенилантраниловой кислоты изучали методами FTIR, ЯМР-спектроскопии и XPS.

    На рис. 3 показано сравнение ИК-спектров мономера (а) и полученного полимера (б). В ИК-спектре поли-N-фенилантраниловой кислоты наблюдаются интенсивные полосы при 1590 и 1510 см. –1 , которые относятся к валентным колебаниям связей n С в ароматических кольцах.Расщепление этих полос указывает на различный тип замещения ароматических колец. Полосы при 1683 и 1227 см –1 относятся к колебаниям групп COOH. В мономере эти полосы наблюдаются при 1658 и 1259 см –1 . Полоса поглощения при 1309 см –1 относится к валентным колебаниям связей n С -N [5,17].

    Наличие полос монозамещенных фенильных колец (неплоские деформационные колебания связей d С = 746, 697 см –1 ) обусловлено концевыми группами [5,17].

    Уширение и сдвиг до 750 см –1 полосы при 746 см –1 и наличие широкой полосы при 830 см –1 в ИК-спектре поли-N-фенилантраниловой кислоты относятся к наличию 1,2-дизамещенных и 1,2,4-трехзамещенных ароматических колец в структуре полимера. Он показывает, что рост полимерной цепи происходит через С-С - соединение в положениях 2 и 4 фенильных колец по отношению к ni-

    Рис. 1. Спектр рентгеновской дифракции поли-N-фенилантраниловой кислоты.

    (а) (б)

    Рис. 2. ПЭМ-изображение (а) и дифракция (б) поли-N-фенилантраниловой кислоты.

    троген, как это имеет место при полимеризации N-фенилантраниловой кислоты в растворе гидроксида аммония [17].

    В ИК-спектре мономера появляется полоса валентных колебаний связей n С = О карбоксильной группы при 1658 см –1 . Это означает, что он сильно смещен в длинноволновую область по сравнению с нормальным положением этих полос (1730–1710 см –1 ) [5].Такой сдвиг полосы n С = О вместе с появлением ряда слабых полос в диапазоне 2490 - 2640 см –1 свидетельствует о том, что при нахождении мономера в твердой фазе происходит димеризация по карбоксильной группе. с образованием димерной структуры:

    .

    В этом случае полоса поглощения валентных колебаний связей n N -H становится видимой вблизи 3337 см –1 , где обычно расположены полосы неассоциированных аминогрупп.В ИК-спектре полимера n С = О полоса смещается в более коротковолновую область до 1683 см –1 , а полоса связи NH сильно уширяется и смещается в длинноволновую область (3239 см, –1 ) и расширяется. полосы от димера карбоксильной группы в диапазоне 2490 - 2640 см –1 практически исчезают. Вышеупомянутые изменения являются спектральными особенностями того, что димеры карбоксила

    (а) (б)

    Рис. 3. (а) FTIR-спектры мономера и (б) поли-Nфенилантраниловой кислоты.[Мономер] = 0,1, [окислитель] = 0,2, [NH 4 OH] = 0,5 моль / л, T = 0 ° C, время синтеза 3 ч.

    группы разрушаются при полимеризации. Группы COOH связаны с группой N – H основной полимерной цепи. Карбоксильные группы по всей полимерной цепи образуют внутримолекулярные водородные связи с аминогруппами, что подтверждается появлением полосы около 3288 см -1 в ИК-спектре и полосы l max = 550 нм в электронном спектре поглощения. полимера (рисунок 4).Эта полоса отсутствует в электронном спектре поглощения мономера.

    Анализ результатов спектральных исследований позволяет представить химическую структуру поли-N-фенилантраниловой кислоты, полученной окислительной полимеризацией в присутствии хлороформа, следующим образом:

    Рисунок 4. Электронные спектры поглощения мономера ( 1) и поли-N-фенилантраниловой кислоты в ДМФА (2). [Мономер] = 0,1, [окислитель] = 0,2, [NH 4 OH] = 0,5 моль / л, T = 0 ° C, время синтеза 3 ч.

    Изучено влияние концентрации окислителя на структуру поли-N-фенилантраниловой кислоты. Установлено, что с увеличением соотношения [окислитель]: [мономер] в ряду 1,25, 2,0, 5,0 интенсивность полос монозамещенных фенильных колец уменьшается d С = 746, 697 см –1 (интенсивность полос измеряли по базовой линии). Это означает, что степень полимеризации увеличивается. Данные ГПХ подтверждают, что степень полимеризации увеличивается с ростом концентрации окислителя в реакционной среде.

    Важной особенностью структуры поли-N-фенилантраниловой кислоты является отсутствие хинодииминовых звеньев, что подтверждается данными XPS, ЯМР и электронной спектроскопии. В структуре полимера есть только фениленаминовые звенья. В спектре N 1 s поли-N-фенилантраниловой кислоты нет полосы около 399,0 эВ, что соответствует энергии связи C = N. Наблюдаемая полоса около 400,5 эВ относится к энергии связи С-N [5, 18-21].

    Электронные спектры подтверждают эти наблюдения.Было показано, что отсутствует полоса поглощения в длинноволновом диапазоне, происходящая от окисленной хиноидной формы, даже в случаях избытка стехиометрического мольного соотношения окислитель: мономер. Например, для полианилина эта полоса находится в области l max = 620 нм, для полифенотиазина - в области l max = 640 нм [10]. Отсутствие хинодииминовых звеньев в структуре полидифениамин-2-карбоновой кислоты подтверждается также данными ЯМР 13 С.В спектре ЯМР 13 С полимера отсутствует сигнал, соответствующий атомам углерода из групп С = N с химическим сдвигом d С = 148 м.д. [10].

    3.3. Морфология

    При интенсивном перемешивании системы образуется дисперсионная реакционная среда. Непрерывная фаза представляет собой водный щелочной раствор с окислителем, а дисперсионная фаза состоит из капель раствора мономера в хлороформе. Существенное отличие рассматриваемого процесса от межфазного заключается в том, что на границе раздела происходит только инициирование полимеризации.Поскольку мономер растворяется не только в хлороформе, но и в водном щелочном растворе, рост полимерной цепи происходит в водной среде с постепенным переходом мономера из органической фазы в водную. В результате на месте капель хлороформа образуются полости, что подтверждается данными СЭМ (рис. 5). Полимер, синтезированный при полимеризации N-фенилантраниловой кислоты в растворе NH 4 OH, имеет пластинчатую морфологию. Площадь поверхности оценивалась с помощью теста площади поверхности БЭТ.Оно равнялось 44 м 2 / г. Объем пор: 0,113 см 3 / г, средний размер пор: 10 нм. Общая пористость невелика и составляет 9%.

    (а) (б)

    Рис. 5. СЭМ-изображения поли-N-фенилантраниловой кислоты, полученные полимеризацией в присутствии хлороформа (а) и в растворе NH 4 OH (б).

    3.4. Термическая стабильность поли-N-фенилантраниловой кислоты

    Термическая стабильность поли-N-фенилантраниловой кислоты изучалась методами ТГА и ДСК.На рис. 6 показана температурная зависимость потери массы поли-Nфенилантраниловой кислоты, нагретой до 800 ° C в токе азота и на воздухе. Кривые похудания имеют ступенчатую форму. Потеря веса при низких температурах (~ 90 ° C) в поли-N-фенилантраниловой кислоте вызвана удалением влаги [22-25]. Это также подтверждают данные ДСК (рисунок 7). Потеря веса при 168˚C связана с удалением COOH-групп [5,14]. Кривые ДСК поли-N-фенилантраниловой кислоты в этом диапазоне температур показывают экзотермический пик, указывающий на разложение [26-28].Этот пик отсутствует после повторного нагрева. Поли-Nфенилантраниловая кислота теряет половину своего веса на воздухе при 520 ° C. В инертной атмосфере наблюдается потеря веса 50% при 660 ° C. При 800 ° C остаток составляет 31%.

    4. Выводы

    Химическая окислительная полимеризация N-фенилан-

    Рис. 6. Потеря веса поли-N-фенилантраниловой кислоты при нагревании до 800 ° C со скоростью 10 ° C / мин в потоке азота ( 1) и в воздухе (2). [Мономер] = 0,1, [окислитель] = 0,2, [NH 4 OH] = 0.5 моль / л, T = 0˚C, время синтеза 3 ч.

    Рис. 7. Термограмма ДСК поли-N-фенилантраниловой кислоты при нагревании в токе азота до 200 ° C со скоростью 10 ° C / мин.

    Траниловая кислота в гетерофазной системе была проведена впервые и была получена поликислота. В его структуре карбоксильные группы образуют внутримолекулярные водородные связи с группами N-H по всей полимерной цепи. ИК-спектроскопия показала, что рост полимерной цепи происходит через C-C - соединение в положениях 2 и 4 фенильных колец по отношению к азоту.Показано, что, несмотря на избыток окислителя, в структуре поли-N-фенилантраниловой кислоты присутствуют только фениленаминовые звенья.

    Гетероциклические полимеры N-фенилантраниловой кислоты аморфны и обладают высокой термической стабильностью. Было обнаружено, что для поли-N-фенилантраниловой кислоты потеря веса 50% наблюдается при 660 ° C в инертной атмосфере и 520 ° C на воздухе. В потоке азота при 800 ° C остаток составляет 31%.

    5. Благодарности

    Авторы выражают признательность за финансовую поддержку Российскому фонду фундаментальных исследований, проект 11-03-00560а.Авторы выражают благодарность Т.Н. Прудской (ОАО «Институт пластмасс им. Г.С. Петрова», Россия) за определение молекулярно-массовых характеристик, Н.А. Жиляевой (Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН) за определение площади поверхности полимеров и Г.А. Шандрюка. (Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН) за проведение термического анализа полимеров.

    СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

    1. А. Малинаускас, «Химическое осаждение проводящих полимеров», Polymer, Vol.42, No. 9, 2001, pp. 3957-3972. doi: 10.1016 / S0032-3861 (00) 00800-4
    2. A. G. MacDiarmid, «Синтетические металлы: новая роль органических полимеров», Synthetic Metals, Vol. 125, No. 1, 2002, pp. 11-22. DOI: 10.1016 / S0379-6779 (01) 00508-2
    3. Ж. Озкан, Г. П. Карпачева, А. В. Орлов и М. А. Дзюбина, «Термическая стабильность дифениламина, синтезированного окислительной полимеризацией дифениламина», Journal of Polymer Science B, Vol. 49, № 1-2, 2007, стр. 36-41.
    4. С.Ж. Озкан, Г.П. Карпачева, Г.Н. Бондаренко, «Полимеры феноксазина: синтез, структура» // Российский химический вестник. 60, No. 8, 2011, pp. 1651-1656. DOI: 10.1007 / s11172-011-0247-z
    5. S. Ж. Озкан, Г. Н. Бондаренко и Г. П. Карпачева, «Окислительная полимеризация дифениламин-2-карбоновой кислоты: синтез, структура и свойства полимеров», Journal of Polymer Science B, Vol. 52, No. 5, 2010, pp. 263-269.
    6. П. Н. Адамс и А. П. Монкман, «Характеристика высокомолекулярного полианилина, синтезированного при -40 ˚C с использованием 0.Мольное отношение персульфатного окислителя к анилину 25: 1 ”, Synthetic Metals, Vol. 87, No. 2, 1997, pp. 165-169. Doi: 10.1016 / S0379-6779 (97) 03818-6
    7. J. Stejskal, A. Riede, D. Hlavata, J. Prokees, M. Helmstedt and P Холлер, "Влияние температуры полимеризации на молекулярный вес, кристалличность и электропроводность полианилина", Synthetic Metals, Vol. 96, No. 1, 1998, pp. 55-61. DOI: 10.1016 / S0379-6779 (98) 00064-2
    8. А.В. Орлов, С.Ж. Озкан, Г.Н.Бондаренко и Г.П. Карпачева, «Окислительная полимеризация дифениламина: синтез и структура полимеров», Journal of Polymer Science B, Vol. 48, No. 1-2, 2006, pp. 5-10.
    9. А.В. Орлов, С.Ж. Озкан, Г. П. Карпачева, «Окислительная полимеризация дифениламина: исследование механизма», Journal of Polymer Science B, Vol. 48, No. 1-2, 2006, pp. 11-17.
    10. С. Ж. Озкан, Г. Н. Бондаренко, А. В. Орлов и Г. П. Карпачева, «Межфазная окислительная полимеризация фенотиазина», Journal of Polymer Science B, Vol.51, № 5–6, 2009 г., стр. 149–156.
    11. Ю. М. Королев, С. Ж. Озкан, “Синтез и рентгеноструктурное исследование полифенотиазина”, Докл. 429, No. 1, 2009, pp. 223-226. doi: 10.1134 / S00125016025
    12. HSO Chan, SC Ng, WS Sim, KL Tan и BTG Tan, «Получение и определение характеристик электропроводящих сополимеров анилина и антраниловой кислоты: доказательства самодопирования с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии». , Vol.25, No. 22, 1992, pp. 6029-6034. doi: 10.1021 / ma00048a026
    13. М. Т. Нгуен и А. Ф. Диас, «Водорастворимые сополимеры поли (анилин-о-о-антраниловая кислота)», Macromolecules, Vol. 28, No. 9, 1995, pp. 3411-3415. doi: 10.1021 / ma00113a047
    14. К. Огура, Х. Шииги, М. Накаяма и А. Огава, «Термические свойства поли (антраниловой кислоты) (PANA) и чувствительных к влажности композитов, полученных из термообработанного PANA и поли (винилового спирта)» , ”Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, Vol.37, No. 23, 1999, pp. 4458-4465. doi: 10.1002 / (SICI) 1099-0518 (199

      ) 37: 233.0.CO; 2-R
    15. MS Wu, TC Wen и A. Gopalan, «In situ УФ-видимые спектроэлектрохимические исследования сополимеризации дифениламина с антраниловой кислотой. // Химия и физика материалов. 74, No. 1, 2002, pp. 58-65. doi: 10.1016 / S0254-0584 (01) 00406-0
    16. М. С. Ву, Т. К. Вен и А. Гопалан, «Электрохимическая сополимеризация дифениламина и антраниловой кислоты с различными коэффициентами подачи», Журнал Электрохимического общества, Vol.148, № 5, 2001, стр. D65-D73. DOI: 10.1149 / 1.1366625
    17. S. Ж. Озкан, И. С. Еремеев, Г. П. Карпачева, Т. Н. Прудкова, Е. В. Веселова, Г. Н. Бондаренко и Г. А. Шандрюк, «Полимеры дифэиламин-2-карбоновой кислоты: синтез, структура и свойства», Journal of Polymer Science B, Vol. 55, No. 3-4, 2013, pp. 107-115.
    18. С. Ж. Озкан, «Кандидатская диссертация по химии», 2006.
    19. А. П. Дементьев, А. де Грааф, М. К. М. ван де Санден, К. И. Маслаков, А. В.Наумкин, А.А. Серов, «Справочные данные рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии для идентификации фазы C 3 N 4 в углеродно-азотных пленках», Алмаз и родственные материалы, Vol. 9, No. 11, 2000, pp. 1904–1907. DOI: 10.1016 / S0925-9635 (00) 00345-9
    20. К. Л. Тан, Б. Т. Г. Тан, Э. Т. Канг и К. Г. Неох, «Исследования химической структуры полианилина с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии», Physical Review B, Vol. 39, No. 11, 1989, pp. 8070-8073. DOI: 10.1103 / PhysRevB.39.8070
    21. С. В. Хуанг, К. Г. Неох, Э. Т. Кан, Х. С. Хан и К. Л. Тан, «Палладийсодержащие микрочастицы полианилина и полипиррола», Journal of Materials Chemistry, Vol. 8, No. 8, 1998, pp. 1743-1748. doi: 10.1039 / a802245c
    22. Дж. Юэ, А. Дж. Эпштейн, З. Чжун, П. К. Галлахер и А. Г. МакДиармид, «Термостабилиты полианилинов», Synthetic Metals, Vol. 41, No. 1-2, 1991, pp. 765-768. DOI: 10.1016 / 0379-6779 (91)

      -I

    23. В. Г. Кулькарни, Л. Д. Кэмпбелл и В.Р. Мэтью, "Термическая стабильность полианилина", Синтетические металлы, Vol. 30, No. 3, 1989, pp. 321-325. DOI: 10.1016 / 0379-6779 (89)
    24. -1
    25. А. Бойл, Дж. Ф. Пено, Э. Дженис и К. Рикель, «Влияние нагрева на полианилиновые порошки, изученное методами дифракции синхротронного излучения в реальном времени, масс-спектрометрии и Термический анализ », Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics, Vol. 30, No. 1, 1992, pp. 265-274. DOI: 10.1002 / polb.1992.0

      306
    26. К. Амано, Х. Исикава, А.Кобаяси, М. Сато и Э. Хасегава, «Термическая стабильность химически синтезированного полианилина», Synthetic Metals, Vol. 62, No. 3, 1994, pp. 229-232. DOI: 10.1016 / 0379-6779 (94) -0
    27. Л. Динг, X. Ван и Р. В. Грегори, «Термические свойства химически синтезированного порошка полианилина (EB)», Synthetic Metals, Vol. 104, No. 2, 1999, pp. 73-78. DOI: 10.1016 / S0379-6779 (99) 00035-1
    28. X.-H. Ван, Ю.-Х. Гэн, Л.-Х. Ван, Х.-Б. Цзин и Ф.-С. Ван, «Температурное поведение допированного полианилина», Synthetic Metals, Vol.69, № 1-3, 1995, стр. 265-266. DOI: 10.1016 / 0379-6779 (94) 02443-3
    29. T.-Ch. Вэнь, Ж.-Б. Чен и А. Гопалан, «Синтез и характеристика поли (дифениламина), допированного растворимой сульфоновой кислотой и метансульфоновой кислотой», Материалы Letters, Vol. 57, No. 2, 2002, pp. 280-290.

    ПРИМЕЧАНИЯ

    * Автор, ответственный за переписку.

    Перейти к основному содержанию Поиск