Статья гк 619: ГК РФ Статья 619. Досрочное расторжение договора по требованию арендодателя / КонсультантПлюс

Бессмысленные варианты и варианты со сдвигом рамки

Мы выявили 44 уникальных бессмысленных варианта или варианта со сдвигом рамки, которые изменяют полноразмерный тайтин у 47 субъектов с дилатационной кардиомиопатией (таблица 1 и таблица 6 в дополнительном приложении). В когортах и ​​группах, исследованных с помощью секвенирования нового поколения, доля лиц с этими вариантами была выше среди лиц с дилатационной кардиомиопатией в группах А и В (21 из 92 человек [23%] и 14 из 71 человека [20%]. ] соответственно), чем среди субъектов с гипертрофической кардиомиопатией (2 из 231 [1%], P=2×10 ^-12 ) или контрольных субъектов (2 из 249 [1%], P=3×10 ^{— 13} ).Такие варианты были у 12 из 149 человек (8%) с дилатационной кардиомиопатией в группе С, обследованных с помощью традиционного дидезокси-секвенирования. Мы наблюдали сильную косегрегацию (значение LOD, 9,3) нонсенс-вариантов и вариантов со сдвигом рамки с клиническим статусом среди 60 членов 16 семей, страдающих дилатационной кардиомиопатией (рис. 2, а также таблицы 12 и таблицы 13 в дополнительном приложении), что указывает на вероятность приблизительно 1 в 10 ⁹ , что выделение этих вариантов ТТН произошло случайно.У одного субъекта с дилатационной кардиомиопатией в возрасте 17 лет был один редкий вариант на каждом аллеле TTN : ранее описанная патогенная миссенс-мутация ⁹ и нонсенс-вариант, унаследованный от ее матери (рис. 2 в дополнительном приложении). Во всех других семьях имело место совместное наследование дилатационной кардиомиопатии и одного варианта со сдвигом рамки TTN или нонсенс-варианта. Среди 32 членов семьи старше 40 лет, по которым имелись данные, пенетрантность укороченных мутаций TTN составила более 95%.

Варианты сплайсинга

Мы идентифицировали 17 вариантов TTN у 19 субъектов с дилатационной кардиомиопатией, которые, по прогнозам, изменяют сплайсинг РНК, в том числе 11, которые изменяют абсолютно консервативные нуклеотиды сайта сплайсинга (таблица 1 и таблица 7 в дополнительном приложении). Секвенирование РНК образцов сердечной ткани двух субъектов с вариантами сплайсинга (один взрослый ребенок от кровнородственного брака с гомозиготным вариантом сплайсинга [данные не показаны], другой описан на рис.3 в дополнительном приложении) подтвердил аномальный сплайсинг TTN . Среди субъектов, исследованных с использованием секвенирования нового поколения, мы наблюдали значительное обогащение вариантов сплайсинга у субъектов с дилатационной кардиомиопатией в группе А (с 15 из 92 субъектов [16%] пораженных) и группе В (с 3 из 71 субъекта [16]. 4%] поражены) по сравнению с субъектами с гипертрофической кардиомиопатией (только у 1 из 231 субъекта [<1%] поражены, P = 7 × 10 ^-8 ) и контрольными субъектами (с 5 из 249 субъектов [2%]). ] затронуты, P=9×10 ^-6 ).Мы обнаружили полную косегрегацию вариантов сплайсинга и дилатационную кардиомиопатию (показатель lod, 1,8, что указывает на связь, которая была в 60 раз более вероятной, чем случайная) среди 11 членов трех семей (рис. 2 и таблица 13 в дополнительном приложении).

Варианты номеров копий

Мы оценили количество копий в TTN у субъектов с дилатационной кардиомиопатией в группах A и B путем сравнения распределения прочтений последовательностей среди субъектов (рис. 4 в дополнительном приложении).Традиционное дидезокси-секвенирование, используемое для образцов от субъектов с дилатационной кардиомиопатией в группе С, не позволяло проводить эти анализы. Один вариант числа копий был идентифицирован у субъекта с дилатационной кардиомиопатией. Было предсказано, что эта тандемная вставка размером 28 т.п.н. (охватывающая интроны с 71 по 124) включает 13% внутреннего дублирования части тайтина; его наличие было подтверждено у пробанда и отсутствовало у двух здоровых родственников (рис. 5 в дополнительном приложении). Никаких изменений числа копий TTN не наблюдалось среди субъектов с гипертрофической кардиомиопатией или контрольных субъектов (всего 480).

Последствия

Поскольку TTN бессмысленный вариант, варианты со сдвигом рамки считывания, сплайсингом и числом копий, которые, по прогнозам, существенно изменяют структуру тайтина, значительно чаще встречались среди субъектов с дилатационной кардиомиопатией, чем среди субъектов с гипертрофической кардиомиопатией ( P=3×10 ^-16 ) или в контроле (P=9×10 ^-14 ) и наследовались совместно с дилатационной кардиомиопатией в семьях (комбинированный показатель lod, 11.1), мы пришли к выводу, что эти варианты вызывают дилатационную кардиомиопатию. Шесть мутаций TTN присутствовали у двух субъектов; результаты анализов одной пары субъектов соответствовали общему гаплотипу (данные не показаны).

Чтобы консервативно оценить частоту усеченных мутаций TTN у субъектов с дилатационной кардиомиопатией, мы увеличили нашу популяцию субъектов с дилатационной кардиомиопатией в группе A, добавив 40 субъектов, которые были набраны одновременно с другими субъектами в группе и у которых TTN последовательностей не были проанализированы, поскольку исследования выявили патогенную мутацию в другом гене дилатационной кардиомиопатии. После этого добавления частоты усеченных мутаций TTN среди субъектов с дилатационной кардиомиопатией в группах A и B составили 28% и 24% соответственно (P = 0,74). У субъектов группы С, образцы которых исследовались с использованием другой платформы секвенирования ДНК, было значительно меньше мутаций TTN (9%, P<0,001). Частота мутаций TTN существенно не отличалась между субъектами с дилатационной кардиомиопатией и без нее в семейном анамнезе (P = 0.36) (таблица 3 в дополнительном приложении).

Усеченные мутации TTN , обнаруженные у субъектов с дилатационной кардиомиопатией, были неслучайно распределены в тайтине (рис. 1): они были чрезмерно представлены в области полосы A по сравнению с остатком N2BA (P = 0,0004) или N2B (P = 0,01) и отсутствовали в областях Z-диска и М-полосы (P=0,006 и P=0,001 для сравнения с N2BA и с N2B соответственно). Пространственное распределение 10 вариантов, обнаруженных у субъектов с гипертрофической кардиомиопатией и контрольных субъектов (рис. 1), отличалось от распределения вариантов, обнаруженных у субъектов с дилатационной кардиомиопатией (P = 0.001). Варианты у субъектов с гипертрофической кардиомиопатией и контрольных субъектов были менее обогащены областью A-диапазона тайтина (40% против 84% для мутаций у субъектов с дилатационной кардиомиопатией, P = 0,006) и включали варианты Z-диапазона ( 20% против 0%, р=0,01).

Клинические характеристики

Панель A показывает данные на момент постановки диагноза, а панели B, C и D показывают отсутствие трансплантации сердца, имплантации вспомогательного устройства для левого желудочка (LVAD) и смерти от сердечных причин. Панели A и B показывают данные для 67 субъектов, у которых были мутации, и 228, у которых их не было. На панелях C и D показаны данные для 94 субъектов (из 19 семей), у которых были мутации усечения (рис. 2 в дополнительном приложении; также см. дополнительное приложение для описания влияния пола).Заштрихованные метки обозначают субъекты с подвергнутыми цензуре данными.

Не было выявлено существенных различий между субъектами с усеченными мутациями TTN и без них в отношении возраста на момент постановки диагноза, конечно-диастолических размеров левого желудочка, фракции выброса или частоты трансплантации сердца, имплантации вспомогательного устройства для левого желудочка, и смерть от сердечных причин (таблица 2 и рисунок 2A и 2B).

Разнообразие клинических проявлений дилатационной кардиомиопатии отражалось у субъектов в группах А, В и С.Субъекты в группе А были более склонны к семейному заболеванию, чем субъекты в группе В (P = 6 × 10 ^-13 ) или группе C (P = 0,005). Субъекты в группе B (у которых клинические признаки были установлены во время оценки трансплантации сердца) чаще имели тяжелую дилатационную кардиомиопатию, чем субъекты в группах A и C, со значительно увеличенным конечно-диастолическим диаметром левого желудочка (P = 1 × 10 ^-9). и P=3×10 ^-6 соответственно) и снижение фракции выброса левого желудочка (P=0.03 и P = 0,0001 соответственно) (таблица 2 и рис. 1 в дополнительном приложении).

Частота трансплантации сердца, имплантации вспомогательного устройства для левого желудочка и смерти от сердечных причин среди субъектов и членов их семей с мутациями TTN , по-видимому, не зависит от типа мутации, но зависит от пола субъектов (рис. 2С и 2D). Средний (±SD) возраст на момент этих нежелательных явлений у 94 носителей мутации в 19 семьях составлял 68±5 лет для 33 женщин и 56±3 года для 61 мужчины (P=4×10 ^-5 ). (Инжир.2 в дополнительном приложении).

Образцы из межжелудочковой перегородки сердца у двух субъектов (панель А и панель В, гематоксилин и эозин) показывают ядра миоцитов с аномальными морфологическими характеристиками (стрелки).

Субъекты с укороченными мутациями TTN имели дилатационную кардиомиопатию, которая обычно не сопровождалась поражением проводящей системы или скелетных мышц (таблицы 9, 10 и 11 в дополнительном приложении), хотя явная скелетная миопатия наблюдалась у одного субъекта с гомозиготным Мутация сплайсинга TTN .Гистопатологические характеристики образцов сердца от субъектов с укороченными мутациями TTN были типичны для идиопатической дилатационной кардиомиопатии. В некоторых срезах были обнаружены очаги миоцитов с причудливой звездчатой ​​ядерной морфологией, которые лучше всего видны на поперечном срезе (рис. 3). Электронно-микроскопическое исследование одного образца, полученного при вскрытии, показало неповрежденные саркомерные структуры (рис. 6 в дополнительном приложении).

Теплофизические свойства некоторых ключевых твердых тел: обновление

14.

А. С. Добросавлевич и К. Д. Маглич, High Temp.-High Press 23 :129 (1991).

Google Scholar

19.

LW Shacklette, Phys. Версия В9 :3789 (1974).

Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

29.

C. A. Swenson, Университет штата Айова, личное сообщение (1990 г.).

Анализ вариации количества копий GK Rat выявил новые предполагаемые локусы предрасположенности к диабету 2 типа

Abstract

Были предприняты большие усилия для поиска генов, ответственных за диабет 2 типа (СД2), но в результате у людей было найдено только около 20 генов из-за его сложности и гетерогенности.Крыса GK, спонтанная модель T2D, предлагает нам превосходную возможность поиска большего количества диабетических генов. Используя технологию сравнительной гибридизации генома (aCGH), мы идентифицировали 137 областей неповторяющихся вариаций числа копий (CNV) у крыс GK при использовании нормальных крыс Wistar в качестве контроля. Эти области CNV (CNVR) охватывают примерно 36 Мб нуклеотидов, что составляет около 1% всего генома. Объединив информацию из аннотаций генов и знаний о заболеваниях, мы всесторонне исследовали CNVR для поиска новых генов T2D.В результате мы отдали предпочтение 16 предполагаемым генам, кодирующим белок, и двум генам микроРНК ( rno-mir-30b и rno-mir-30d ) как хорошим кандидатам. Каталог CNVR между крысами GK и Wistar, выявленный в этой работе, служил хранилищем для добычи генов, которые могут играть роль в патогенезе T2D. Более того, наши усилия по использованию методов биоинформатики для определения приоритетности хороших генов-кандидатов предоставили более конкретный набор предполагаемых кандидатов. Эти результаты будут способствовать изучению генетической основы СД2 и, таким образом, прольют свет на его патогенез.

Образец цитирования: Ye Z-Q, Niu S, Yu Y, Yu H, Liu B-H, Li R-X, et al. (2010) Анализ вариации количества копий крыс GK выявил новые предполагаемые локусы предрасположенности к диабету 2 типа. ПЛОС ОДИН 5(11): е14077. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014077

Редактор: Stein Aerts, University of Leuven, Бельгия

Получено: 14 июля 2010 г.; Принято: 31 октября 2010 г.; Опубликовано: 23 ноября 2010 г.

Авторские права: © 2010 Ye et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национальной программы исследований и разработок в области высоких технологий Китая «863» (2009AA022710), Национальной программы фундаментальных исследований «973» (2010CB529206), Национального фонда естественных наук Китая. (30770497, 30800641), Китайский фонд докторантуры (200669), Исследовательская программа Академии наук Китая (KSCX2-YW-R-112), Шанхайский комитет по науке и технологиям (2009B105) и SA-SIBS (Sanofi Aventis — Шанхайский институт биологических наук) Стипендиальная программа.Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Диабет 2 типа (СД2), официально известный как инсулиннезависимый диабет, составляет около 90% из 180 миллионов случаев диабета во всем мире [1]. Это хроническое и сложное заболевание, характеризующееся дефектами секреции инсулина бета-клетками островков поджелудочной железы и действием инсулина в периферических тканях, предположительно обусловлено комбинированным действием множества генетических факторов [2], [3].За последние два десятилетия были предприняты большие усилия, включая традиционное картирование генов-кандидатов и недавние высокопроизводительные полногеномные ассоциативные исследования, чтобы раскрыть генетическую основу СД2, и было обнаружено около 20 генов СД2 человека [3]–[8] и число родственных локусов в геномах человека, мыши и крысы [9], [10]. Однако точный молекулярный патогенез этого гетерогенного заболевания остается плохо изученным, и ожидается, что будет обнаружено больше генов, связанных с СД2.

Крыса Goto-Kakizaki (GK), не страдающая ожирением животная модель T2D, была получена путем повторного инбридинга непереносимых к глюкозе крыс Wistar [11].Во время своего развития крысы GK спонтанно страдают от снижения массы бета-клеток и резистентности к инсулину и, таким образом, предоставляют реальную возможность для поиска восприимчивых локусов, изучения патогенеза и разработки терапевтических стратегий [12], [13]. Несколько анализов локуса количественных признаков (QTL) на этой модели уже идентифицировали ряд геномных локусов, несущих восприимчивые варианты [14]–[16].

В то время как большинство исследований генетической изменчивости, связанных с заболеванием, были сосредоточены на отдельных нуклеотидных последовательностях, крупномасштабные изменения, такие как вариации числа копий (CNV), обычно определяемые как различия в числе копий участков ДНК размером более 1 кб, также были связаны с десятками заболевания человека [17].Среди наиболее известных случаев — ассоциация синдрома Дауна с дополнительной копией хромосомы 21, идентифицированной с помощью технологии кариотипирования [18]. Новые высокопроизводительные подходы, такие как сравнительная гибридизация генома на основе массивов (массив CGH или aCGH), позволили идентифицировать CNV во всем геноме [19]–[21] и обнаружили, что CNV широко распространены вдоль хромосом. Обнаружено, что некоторые из CNV связаны со сложными заболеваниями, включая нейропсихиатрические, аутоиммунные заболевания и т. д. [22]–[25], но связь CNV с СД2 остается в значительной степени неиспользованной, за исключением того, что совсем недавнее исследование подтвердило значение ранее идентифицировали человеческий ген TSPAN8 [26].

В этой работе мы провели полногеномный скрининг CNV между GK (модель T2D) и крысой Wistar (дикий тип) с использованием массива CGH. Был идентифицирован неизбыточный набор областей CNV общей длиной около 36 млн. п.н., включая несколько новых локусов предрасположенности к СД2, включающих 16 генов, кодирующих белок ( Il18r1 , Cyp4a3 , Sult2a1 , Sult2a2 , Sult2a2 , Sult2a2 , , NOS2 , PSTPIP1 , UGT2B , UXS1B1 , RT1-A1 , RT1-A1 , RT1-A3 , RT1-DB1 , RT1-N1 , RT1-N1 , RT1-N3 , RT1 -O и RT1-S2 ) и два гена микроРНК ( rno-mir-30b и rno-mir-30d ).На данный момент это первое исследование СД2 у крыс GK с точки зрения изменения количества копий в масштабе всего генома, и предполагается, что CNV, идентифицированные у крыс GK, проливают свет на генетическую основу и патогенез СД2.

Результаты

Обработка данных массива

Сравнение между крысами GK и Wistar имело три биологических повтора («прямой») с заменой красителя («обратный») для каждого, в результате чего было получено 6 массивов. Данные массива обрабатывали в соответствии с процедурами, описанными в разделе «Материалы и методы».На этапе контроля качества набор данных из небольшой области шестого чипа включает 1278 точек (∼0,5%), в дополнение к 152, 157, 147, 143, 155 и 401 рассеянной точке каждого чипа соответственно ( ∼0,08% в среднем), были отфильтрованы из-за плохого качества. Чтобы обнаружить предвзятость маркировки красителем, мы иерархически сгруппировали все 6 чипов на основе отношений логарифмов (значения M). Оказалось, что все «прямые» чипы были четко отделены от «обратных», что противоречило ожиданию того, что пара замены красителя должна быть сгруппирована вместе (рис. S1A).Используя линейную модель, мы обнаружили, что около 23,7% пятен показали значительное смещение красителя ( p <0,05). После исправления смещения красителя новый результат кластеризации совпал с ожидаемым (рис. S1B). Три пары замены красителя привели к трем наборам значений M, каждый из которых соответствовал одному повтору GK. Затем хромосомы были разделены в соответствии со сглаженными значениями M зондов, расположенных на них, процесс, формально называемый сегментацией. Необработанные интенсивности и обработанные данные были депонированы в Gene Expression Omnibus NCBI [27] и доступны через GEO Series номер доступа GSE21387.

Идентификация CNVR

В соответствии с нашим определением областей CNV (CNVR, см. «Материалы и методы»), мы идентифицировали в среднем около 101 CNVR у каждой крысы GK, охватывающих примерно 26 миллионов пар оснований, , т.е. , около 1% генома крысы (таблица S1). и S2), порядок величины которых был таким же, как и общая длина опубликованных CNVR крыс (22 Мб и 15,5 Мб на двух разных платформах) [21]. Сравнение CNVR, идентифицированных из 3 образцов, показало, что большинство из них (более 70%) были одинаковыми среди людей (таблицы S2 и S3).Затем мы объединили CNVR из всех 3 образцов в окончательный неизбыточный набор, состоящий из 137 CNVR, охватывающих 36,31 Мб (таблица S4 и столбец «Неизбыточные» в таблице S2). Последующие исследования были основаны на этом неизбыточном наборе данных.

Мы нанесли CNVR GK/Wistar вдоль каждой хромосомы (рис. 1) и обнаружили, что они были неравномерно распределены с крайними случаями, когда хромосомы 12 и 18 не содержали CNVR, а хромосомы 7 и 15 содержали больше CNVR, чем случайные (4,5 Мб). и 2.7 МБ идентифицировано против только 1,8 МБ и ожидаемых 1,4 МБ соответственно). Неравномерный характер распределения CNVR был в некоторой степени похож на предыдущий отчет о CNVR крыс [21].

Рис. 1. Хромосомное распределение CNVR GK/Wistar.

Зеленые столбцы слева и красные столбцы справа от хромосомных осей представляют «потерю» и «прирост» CNV соответственно. Хромосома «Un» представляет собой псевдохромосому, состоящую из контигов, которые нельзя с уверенностью сопоставить с конкретной хромосомой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014077.g001

Расследование CNVR

Чтобы выявить генетические вариации, лежащие в основе фенотипических различий между крысами GK и Wistar (, т. е. , диабетические и недиабетические), мы исследовали CNVR, изучив их перекрытие с различными геномными особенностями, такими как гены, кодирующие белок, и микроРНК. Геномные особенности, охватываемые GK/Wistar CNVR, послужили ценным хранилищем для изучения генетических факторов, которые играют роль в патогенезе T2D посредством измененных чисел копий и, следовательно, аномальных уровней экспрессии.Для гена CNV, о котором уже сообщалось, что он связан с T2D, наша работа может помочь выяснить его основные механизмы, , т.е. , эффект дозы гена через изменение числа копий. Что еще более важно, гены CNV, о которых не было известно, что они связаны с СД2, могут содержать новых кандидатов, и предполагалось, что будет многообещающе отделить их от неродственных путем объединения предшествующих биологических знаний с использованием методов биоинформатики.

Генное и межгенное содержание CNVR

Генные и межгенные области в CNVR GK/Wistar определяли в соответствии с хромосомным расположением крысиных генов, полученным из NCBI Entrez Gene.В совокупности области размером 3,22 Мб были аннотированы Entrez Gene, что составляет всего 8,87% всех CNVR, что намного меньше, чем доля областей генов во всем геноме (21,35%, таблица 1). Казалось, что вариации числа копий будут преимущественно находиться в межгенных областях. Далее мы провели случайное моделирование для проверки статистической значимости (см. «Материалы и методы») и обнаружили, что величина перекрытия между рандомизированными интервалами и генами была значительно больше, чем между реальными CNVR и генами (7.84 Мб ожидаемо случайным образом со стандартным отклонением 1,13 Мб по сравнению с 3,22 Мб фактически, p <1e-10), что подтверждает наш вывод о предпочтении CNVR межгенным областям. Частично это можно объяснить очищающим отбором, который, вероятно, действовал на CNV GK/Wistar в процессе селекционного разведения. Вариации в большинстве областей генов могут с большей вероятностью оказывать вредное воздействие, чем в межгенных областях, и, таким образом, более сильное негативное давление отбора на области генов может привести к более низкой наблюдаемой частоте CNV в областях генов, чем в межгенных областях.

Функциональный анализ генов CNV

Всего было идентифицировано 62 и 72 гена Entrez в CNVR с «приобретением» и «потерей» соответственно (таблицы S4 и S5). Мы проверили, содержат ли эти гены какие-либо из тех, о которых ранее сообщалось, что они связаны с СД2. Был собран список из 425 известных генов, связанных с СД2, из опубликованных источников (см. Материалы и методы) и проведено сравнение с этими 134 генами GK/Wistar CNV, но ничего общего не было обнаружено. Этот результат показал, что потенциальными факторами CNV, лежащими в основе диабетического патогенеза крыс GK, могут быть другие гены, связь которых с T2D не наблюдалась.Это могут быть гены, которые были аннотированы в NCBI Entrez Gene, или даже локусы, которые ранее никогда не идентифицировались. В этой работе мы сосредоточились на добыче кандидатов из известных генов (то есть 134 генов CNV) в соответствии с вышеупомянутой стратегией принятия предварительных знаний.

Сначала мы использовали базу знаний путей KEGG, чтобы идентифицировать потенциальных новых кандидатов, которые, как предполагается, связаны с характеристиками диабета. После сопоставления 134 генов CNV с KEGG мы обнаружили, что с этими генами связан 41 путь (таблица S6).Затем для дальнейшего анализа были отобраны гены CNV, попадающие в пути, связанные с T2D (таблица 2). Поскольку T1D имеет некоторые общие характеристики с T2D, и ранее сообщалось об участии метаболизма серы в диабете [28], [29], гены CNV ( RT1-A1 , RT1-A3 , RT1-Db1 , RT1-N1 , RT1-N1 , RT1-N3 , RT1-O , RT1-S2 , Sult2Al1 , Sult2A1 , Sult2A1 и Sult2A2 ) в путях «Тип I Diabetes Mellitus (04940)» и приоритет отдавался «обмену серы (00920)».Хорошо известно, что метаболизм сахаров или жирных кислот и сигнальные пути PPAR связаны с СД2 [2], и, таким образом, гены CNV ( Uxs1 , Ugt2b и Cyp4a3 ) в путях «метаболизма крахмала и сахарозы» (00500 )», «взаимопревращения пентозы и глюкуроната (00040)», «метаболизм жирных кислот (00071)» и «передача сигналов PPAR (03320)». Мы также обнаружили, что Ugt2b , Cyp4a3 и CNV, связанные с метаболизмом серы ( Sult2a1 , Sult2a2 и Sult2al1 ), перекрываются с T2D QTL Niddm37, эти гены могут обусловливать предрасположенность к T2D.

Мы заметили, что гены GK/Wistar CNV были значительно перепредставлены в путях обонятельной трансдукции (04740), иммунного ответа (05332, 05330, 05320 и 04612) и молекулы клеточной адгезии (04514) (таблица S6). Они напоминали результаты функционального обогащения, о которых ранее сообщалось в генах CNV человека, мыши и крысы, указывая на то, что смещение в сторону этих функциональных категорий может быть общей общей характеристикой генов CNV [19], [21], [30].

Поскольку существуют сложные взаимосвязи между заболеваниями, составляющие «заболевание» [31], заболевания, непосредственно связанные с СД2 («близкие к СД2»), могут помочь понять родство генов GK/Wistar CNV с СД2.Всего было извлечено 1097 генов, близких к СД2, в соответствии с процедурой, описанной в разделе «Материалы и методы». Из-за сложности и гетерогенности диабета мы предположили, что часть этих генов также может в некоторой степени способствовать развитию СД2. Фактически, в списке генов GK/Wistar CNV встречаются пять генов, близких к T2D, включая Pstpip1 , Il18r1 , Sult2a1 , Nos2 и RT1-Db1 (T) Мы также проверили взаимосвязь между ними и крысиными QTL и обнаружили, что они перекрываются с QTL «кровяного давления», «триглицеридов сыворотки», «холестерола сыворотки» или «массы тела».В частности, Pstpip1 , Il18r1 , Sult2a1 перекрывают QTL «инсулинозависимого сахарного диабета (Niddm)».

Существует несколько веб-инструментов для приоритизации генов-кандидатов болезней человека из заданных геномных интервалов [32]. Сравнение между нашими 134 крысиными генами CNV и 103 человеческими генами T2D, приоритетными для Tiffin et al. [33] обнаружил один общий ген, Uxs1 , который также был отсортирован с помощью нашего картирования пути, связанного с T2D.

В совокупности вышеприведенный анализ выявил 16 генов GK/Wistar CNV, предоставив ценную коллекцию наиболее вероятных кандидатов на заболевание, которые должны быть приоритетными для дальнейших экспериментов (таблица S8). Эти гены неравномерно распределены по нескольким разным хромосомам и разным регионам CNV. Среди них все 7 генов RT1 кластеризованы в двух областях хромосомы 20, т.е.Усиление.54 и cnv.gain.53 составляет всего ∼345 Кб в соответствии с таблицей S4), в то время как RT1-N1 , RT1-N3 , RT1-O и RT1-S2 в другом. Однако 3 гена в первом кластере поддерживаются только одним образцом, что снижает нашу уверенность в том, что эти гены могут способствовать предрасположенности к СД2. Три гена Sult2a сгруппированы в области усиления на хромосоме 1 и поддерживаются всеми тремя образцами. Остальные шесть генов распределены по шести различным хромосомам соответственно, причем Uxs1 , Cyp4a3 и Nos2 идентифицированы во всех трех образцах.Эти данные дадут дополнительные подсказки для последующей расстановки приоритетов этих 16 генов.

Ультраконсервативные элементы и микроРНК

Согласно вышеупомянутому анализу, более 90% CNVR были межгенными областями. Хотя межгенные области, а также некодирующие области генов, такие как интроны и UTR, могут не включать столько функциональных признаков, как кодирующие области, недавние исследования показали, что некоторые из некодирующих областей могут играть важную регуляторную роль.Поэтому мы расширили наше внимание за пределы кодирующих областей, чтобы включить ультраконсервативные элементы и микроРНК.

Ультраконсервативные элементы определяются как участки ДНК (длиной более 200 п.н.), которые чрезвычайно консервативны в ортологичных областях геномов человека, крысы и мыши. Было высказано предположение, что они находятся под сильным очищающим отбором и могут играть важную роль в связывании ДНК, процессинге РНК и регуляции транскрипции [34]. Мы сравнили CNVR GK/Wistar и 481 опубликованный ультраконсервативный элемент (126.всего 7 т.п.н., сопоставленных со сборкой генома крысы rn4), но перекрытия обнаружено не было, в то время как ∼1,5 т.п.н. можно было ожидать случайно ( p  = 0,027), что согласуется с выводами, сделанными в других исследованиях [21], [35] . Эти результаты в сочетании с вышеуказанным генным и межгенным содержанием CNVR подтверждают мнение о том, что в качестве глобальной тенденции большинство CNV ГК/Вистар были обнаружены в нефункциональных, а не функциональных областях, вероятно, из-за очищающего отбора во время селекционного разведения. .

Принимая во внимание значительный вклад микроРНК в процессы развития и патогенез заболеваний на посттранскрипционном уровне [36]–[37], мы проверили наличие генов микроРНК в наших GK/Wistar CNVR.Сравнивая геномные положения известных генов крысиных микроРНК с геномами GK/Wistar CNVRs, мы обнаружили, что rno-mir-30b и rno-mir-30d были одновременно покрыты областью «прироста» на хромосоме 7 во всех три образца (таблица S9) в области всего 3,8 Кб. Интересно, что несколько QTL T2D и различные соответствующие QTL, включая QTL массы тела, артериального давления и уровня триглицеридов в сыворотке, также были расположены в этой области, что означает, что изменение количества копий этих генов микроРНК может быть коррелировано с этими количественными признаками (рис. 2).В недавней публикации сообщалось, что измененная экспрессия mir-30d в ответ на глюкозу влияет на экспрессию гена инсулина в мышиной Min6, линии островковых клеток поджелудочной железы [38]. Хотя дальнейшие исследования все еще необходимы, мы получили дополнительные доказательства, подтверждающие участие mir-30b/30d в патогенезе T2D посредством изменения количества копий.

Рис. 2. МикроРНК rno-mir-30b и rno-mir-30d , расположенные в QTL T2D.

QTL Niddm (инсулиннезависимый сахарный диабет) 14 и 19 охватывают эти 2 микроРНК.Кроме того, в этой области есть много других QTL, таких как «триглицерид сыворотки 14», «холестерин сыворотки 3», «артериальное давление 181/215/216/265/266», «масса тела 9/12/17», и эти признаки, как известно, связаны с диабетом. Этот рисунок был подготовлен с использованием браузера генома UCSC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014077.g002

Для дальнейшего выяснения предполагаемой роли mir-30b/30d мы рассмотрели их предполагаемые цели с помощью MicroCosm [39]. В совокупности для рно-мир-30б и рно-мир-30д было 1868 и 1776 мишеней соответственно.Как и при анализе генов CNV, мы сравнили эти гены-мишени с 425 генами, связанными с T2D. Оказалось, что 39 и 35 мишеней mir-30b и mir-30d встречались в этом списке генов T2D соответственно, и обе были значительно перепредставлены ( p  = 0,000273 и 0,00152, подробные мишени перечислены в таблице 3). подтверждая гипотезу об участии mir-30b и mir-30d в T2D. Среди них PPARG и AKT2 и AKT2 (цели MIR-30B ), HNF1B , HNF4A и LMNA (цели MIR-30D ), являются известными генами, привлеченными в T2D или резистентность к инсулину.Затем мы сопоставили эти мишени микроРНК с путями KEGG и обнаружили, что 5(2), 12(6), 10(4), 14(12), 4(5) и 1(3) мишени mir-30b ( mir-30d ) относились к путям «диабета II типа (04930)», «диабета I типа (04940)», «рака поджелудочной железы (05212)», «сигнализации инсулина (04910)», «сигнализации PPAR (03320)». )» и «диабет зрелого возраста у молодых (04950)» соответственно (табл. 4). Более того, несколько путей метаболизма жирных кислот или сахаров (00010, 00030, 00512, 00051, 00071 и 01030) были обогащены этими предсказанными мишенями со значительно низкими значениями p (таблица S10 и таблица S11).Эти результаты предоставили дополнительные доказательства роли mir-30b/30d в патогенезе диабета.

Обсуждение

В этом исследовании мы определили каталог CNVR между крысами GK и Wistar, используя мозаичный массив CGH. Принимая во внимание гипотезу о том, что фенотипические различия между GK и Wistar (диабетическими и недиабетическими) должны быть в значительной степени связаны с их геномными вариациями, мы провели серию биоинформатических функциональных анализов этих GK/Wistar CNVR, чтобы сузить диапазон. возможности для дальнейшего изучения генов-кандидатов СД2.В общей сложности 16 генов, кодирующих белок, и 2 гена микроРНК были выбраны в качестве приоритетных для дальнейшего анализа (таблица S8 и таблица 3), которые могут в комбинации или по отдельности способствовать патогенезу диабета на основе различного количества копий на геномном уровне.

Мы считаем, что список CNVR GK/Wistar является ценным хранилищем для изучения генетических факторов, которые играют роль в патогенезе T2D посредством измененных номеров копий. В биоинформатическом анализе мы сосредоточились на кодирующих белок генах Entrez и микроРНК с известными геномными местоположениями и обнаружили 134 кодирующих белок гена и 2 микроРНК, вовлеченных в GK / Wistar CNVR.Объединив имеющиеся знания о СД2, мы отдали приоритет 16 генам, кодирующим белок, и 2 микроРНК как хорошим кандидатам для дальнейших экспериментов по проверке их вклада в патогенез СД2 с помощью эффекта дозы. Кроме того, CNVR без аннотаций генов Entrez или микроРНК также могут заслуживать дальнейшего изучения. Мы проверили другие аннотации генов из UCSC «KnownGene», «RefGene», «мРНК», «EST» и «EnsemblGene» и обнаружили различные кодирующие сигналы, выходящие за рамки аннотаций генов Entrez (таблица S12).Это могут быть новые гены, но необходимы дополнительные доказательства.

Среди предпочтительно выбранных генов, кодирующих белок, Il18r1 ранее был идентифицирован как ген-кандидат T2D в когорте афроамериканских семей [40]. Ген Cyp4a3 участвует в метаболизме жирных кислот и передаче сигналов Pparg, нарушения которых тесно связаны с патогенезом СД2 [2], [41]. Как упоминалось в результатах, некоторые серосодержащие соединения используются в терапии диабета, хотя терапевтический механизм еще не ясен.Таким образом, идентификация sult2a1 , sult2a2 и sult2al1 перекликается с полезными эффектами серосодержащих соединений, и дальнейшее изучение может пролить свет на механизм.

Мы проанализировали общедоступный набор данных GSE13271 [42], в настоящее время единственный набор данных дифференциальной экспрессии GK/Wistar в NCBI GEO, и идентифицировали 30 наборов дифференциально экспрессируемых генов (DEG) между крысами GK и Wistar, соответствующими различным тканям, временным точкам и кормлению. условия.При сравнении этих DEG с генами GK/Wistar CNV, идентифицированными в этой работе, мы обнаружили, что некоторые из них проявляют согласованность в определенных тканях (таблица S13), в том числе RT1-N1 в мышцах, Ugt2b в печени, RT1- A3 во всех трех тканях (печень, жир и мышцы). Была также несоответствие между CNV и дифференциальным выражением, в том числе Sult2AL1 , Sult2A1 , Sult2A2 , Sult2A2 , UXS1 , RT1-DB1 , CYP4A3 , PSTPIP1 и IL18R1 в определенных условиях.Вообще говоря, разумно предположить, что устойчивые гены могут быть более вероятно вовлечены в T2D, но мы не можем исключать возможность вовлечения других генов.

Было много сообщений о влиянии микроРНК на диабет, но почти все они были сосредоточены на профилях экспрессии, которые в основном связаны с промежуточным процессом развития заболевания [38], [43]–[46]. Здесь мы впервые нашли доказательства того, что микроРНК могут быть связаны с T2D посредством вариации числа копий.Мы предположили, что измененное количество копий mir-30b и mir-30d у крыс GK может способствовать патогенезу T2D. Это может происходить на стадии инициации заболевания: по сравнению с нормальными крысами Вистар, различное число копий mir-30b и mir-30d в GK может приводить к изменению уровня экспрессии на некоторых специфических стадиях развития и в некоторых специфических тканях. а измененная экспрессия mir-30b и mir-30d может затем привести к дисфункции некоторых специфических мишеней, способствуя развитию СД2.Все эти предрасполагающие факторы могут действовать в сочетании, поскольку они вовлечены в это сложное заболевание. В дополнение к вышеупомянутому исследованию экспрессии mir-30d , было несколько других сообщений о профилировании экспрессии, предполагающих участие семейства mir-30 в диабете или адипогенезе [47]-[49]. Мы повторно проанализировали общедоступный набор данных по экспрессии микроРНК GSE13920, который в настоящее время является единственным профилированием микроРНК у крыс GK и Wistar [43], и обнаружили, что уровни экспрессии mir-30b/30d в мышечных клетках резко различались между нормальными крысами и крысами. Крыса T2D (рисунок S2).Однако изменение экспрессии противоречило обнаруженному здесь направлению изменения числа копий. Мы заметили, что существует ген, кодирующий белок, названный Zfat , который расположен в том же коэффициенте усиления CNVR, что и mir-30b и mir-30d . Изучив набор данных GSE13271, мы обнаружили, что Zfat Активация повышалась в печени, но подавлялась в жировых тканях и мышцах (таблица S13). Понижающая регуляция Zfat в мышцах согласуется с таковой у mir-30b и mir-30d , то есть все они не согласуются с усилением CNV, что предполагает необходимость дальнейших исследований для подтверждения этих результатов. и раскрыть подробные механизмы.

Хотя мы стремились найти специфические для диабета варианты, мы заметили, что CNVR GK/Wistar, идентифицированные в этой работе, имеют довольно много общих характеристик с ранее опубликованными исследованиями CNV [19], [21], [30]. Например, наши CNVR из одного образца ГК составляют около 1% всего генома, неслучайно распределены по хромосомам и обогащены генами, связанными с обонятельной трансдукцией и иммунным ответом (таблица S6), что предполагает возможные общие факторы, участвующие в генезисе. или техническое обслуживание CNV.Предпочтение CNVR GK/Wistar межгенным областям соответствовало нескольким опубликованным сообщениям [19], [50], в то время как некоторые другие заявляли об обратном [21], [51]. Это может быть связано с различением различных предметов исследования или другими причинами, не выявленными в настоящее время.

В этом исследовании мы попытались изучить причины T2D у крыс GK на основе данных CNV. По общему признанию, было еще несколько аспектов, не затронутых здесь. T2D является гетерогенным заболеванием и может быть вызвано множеством факторов, включая генетические вариации (точечные вариации, структурные вариации, такие как инверсия, транслокация, небольшие вставки и CNV) и воздействие окружающей среды.Также сообщается, что эпигенетические факторы могут быть связаны с СД2 у крыс GK [12]. В настоящей работе рассматриваются только CNV, и, таким образом, весьма ожидаемы будущие исследования, касающиеся всех этих точек и проверки кандидатов. Дизайн зонда с более высокой плотностью, гибридизация с большим количеством особей GK и аннотация генома крысы с большей точностью улучшат качество данных CNVR и последующего анализа. Будет еще более многообещающим, если технология секвенирования следующего поколения будет принята для обнаружения CNV, поскольку она может не только более точно определять границы CNV, но также обнаруживать инверсии или транслокации, которые иначе не могут быть обнаружены с помощью массива CGH.Кроме того, секвенирование может идентифицировать новые участки последовательности, которые не представлены в текущей сборке эталонного генома, прокладывая более широкий путь к идентификации генов T2D и других заболеваний.

Материалы и методы

Подготовка проб, гибридизация массивов и извлечение данных

Три самца крыс Goto-Kakizaki и 8 самцов крыс Wistar были получены от SLAC Co., Ltd (Шанхай, Китай). Крыс анестезировали формалином в возрасте 8 недель, брали кровь из перикарда и антикоагулировали.Затем выделяли геномную ДНК с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, p/n 69504). Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике биомедицинских исследований Шанхайского института биологических наук Китайской академии наук (IRB00005813). ДНК от 3 особей крысы GK использовали в качестве тестового образца отдельно, тогда как ДНК, объединенная от 8 крыс Wistar, служила в качестве общего эталона.

Мы использовали геном крысы CGH 244A (Agilent, p/n G4435A) в качестве нашей олиго-платформы aCGH, которая включает около 240 тыс. 60-мерных зондов, расположенных поверх генома крысы со средним расстоянием между зондами, равным 7.9 т.п.н. (4,7 т.п.н. в областях генов). Мечение геномной ДНК и гибридизацию с мозаичными матрицами проводили в соответствии со стандартными протоколами Agilent. Вкратце, 2 мкг геномной ДНК из тестового образца (GK) и 2 мкг из эталона (Wistar) расщепляли с помощью AluI/RsaI и метили случайным праймером, включающим флуоресцентные красители Cy5 (красный) и Cy3 (зеленый). Исследуемый и эталонный образцы были совместно гибридизованы с микрочипом Agilent 244A в камере для гибридизации (Agilent, номер по каталогу G2545A) при 65 градусах Цельсия и 20 об/мин в течение 40 часов.Для каждого образца проводили мечение с заменой красителя и гибридизацию. При «прямой» гибридизации испытуемый и эталонный образцы были окрашены Cy5 и Cy3 соответственно, тогда как при соответствующей «обратной» гибридизации испытуемый и эталонный образцы были окрашены Cy3 и Cy5 соответственно.

После гибридизации и промывки массивы визуализировали с помощью сканера высокого разрешения US80803205 (Agilent, номер по каталогу G2505B). Интенсивность флуоресценции была извлечена с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction и использована для последующих процедур обработки.

Обработка данных

Данные обрабатывались в среде программирования R (2.9.0) и пакетах snapCGH (1.12.0), limma (1.18.0), MANOR (1.16.0) и DNAcopy (1.18.0) из проекта bioconductor ( http://www.bioconductor.org/), и несколько внутренних скриптов были приняты для контроля качества, нормализации и сегментации. Структура обработки данных была в основном основана на snapCGH [52], и были внесены некоторые необходимые модификации, чтобы соответствовать требованиям контроля качества и схемы замены красителя.Весь конвейер, включающий обработку данных и идентификацию CNVR, показан на рисунке 3. Интенсивности сигналов от двух каналов (Cy5 и Cy3) были преобразованы в форму отношений логарифмов (значения M), а затем были введены в MANOR для оценки качества. особенно для настройки потенциального глобального градиента и обнаружения областей чипа с низким качеством [53]. После этого все значения М были нормализованы с помощью «лёссовых» коэффициентов, рассчитанных по значениям М между -1 и 1 («взвешенный лёсс») [54], а значения из «обратных» гибридизаций были умножены на -1, чтобы сделать их сопоставимыми. с теми из «передовых» ( i.е. , значения M для Wistar и GK, преобразованные в значения M для GK и Wistar).

Далее мы разработали линейную модель, используя limma для коррекции смещения красителя, специфичного для пятна [55]. Для каждой характерной точки у нас было 6 M значений, соответствующих 6 массивам. В нашей модели каждое измеренное значение M было записано как: где i принимали значения от 1 до 6, представляя разные массивы. Элемент α использовался для моделирования вклада геномных различий между крысами GK и Wistar, в то время как элемент β предназначался для систематической ошибки красителя.Пункт и представлял собой вклад других факторов, включая разницу между особями GK и случайные ошибки. Во всех гибридизациях ( i  = 1, …, 6) GkWis принимал значение 1. Краситель принимал значение 1 для «прямых» гибридизаций (i = 1, 2, 3) и −1. для «обратных» ( и  = 4, 5, 6), что свидетельствует о разной направленности смещения красителей при «прямой» и «обратной» гибридизациях. Коррекция смещения красителя заключалась в вычитании компонента β·Dye _i из значений M.Минимизируя сумму квадратов e , мы смогли получить оценки α и β в лимме. Дендрограммы, использованные для иллюстрации необходимости коррекции смещения красителя для конкретных точек, были созданы путем иерархической кластеризации с использованием метода минимальной дисперсии Уорда с использованием евклидовых расстояний.

После коррекции смещения красителя 6 массивов были объединены в 3 независимых набора данных, соответствующих 3 образцам ГК. Значения M из повторов зонда также усредняли.Затем была проведена сегментация с использованием пакета DNAcopy, целью которого является фрагментация хромосом на интервалы в соответствии со сглаженными значениями M зондов, расположенных рядом с геномом, , т.е. , статусом количества копий соответствующих областей генома [56].

Идентификация CNVR

В этой работе область CNV (CNVR) была определена на основе сглаженных значений M: трех или более последовательных зондов, все значения M которых были больше 0,5 («усиление») или все меньше -0.5 («потеря») очерчена основная область, которая расширяется дополнительно на 5 Кб с обеих сторон, чтобы определить CNVR. При сравнении двух диплоидов значение M, равное 0,5, предполагает, что один из двух аллелей дублируется (log ₂ (3/2)≈0,58). Вот почему 0,5 было установлено как пороговое значение М. Расширение CNVR на 5 Кб с обеих сторон было связано с тем, что 5 Кб соответствуют половине медианного расстояния между последовательными зондами на платформе Agilent 244A, примерно представляя покрытие зонда с одной стороны.

При объединении CNVR нескольких образцов в неизбыточный набор критерием было то, что область, которая была обнаружена хотя бы 1 образцом, должна была остаться в конечном наборе, а перекрывающиеся области должны быть объединены, аналогично «объединению» в набор операций. Хотя «объединение» 3 образцов неизбежно приводило к более высокому уровню ложноположительных результатов идентификации CNVR, мы по-прежнему предпочитали высокий охват высокой точности. Геномные координаты CNVR относили к сборке UCSC rn4 (на основе RGSC 3.4), а их хромосомное распределение строили с помощью Caryoscope [57].

Расследование CNVR

Анализы также проводились в среде программирования R. Хромосомные местоположения генов NCBI Entrez были получены из пакета org.Rn.eg.db (2.2.11) в Bioconductor. Все координаты геномных особенностей, принятые в этой работе, были отнесены к сборке UCSC rn4 в соответствии с координатами CNVR. Гены CNV идентифицировали по перекрытию геномных интервалов, i.е. , если какой-либо из CNVR GK/Wistar перекрывался, он учитывался. При расчете длины участков генов в CNVR или во всем геноме перекрывающиеся участки генов объединялись в неповторяющиеся интервалы, чтобы избежать дублирования подсчета. .

Случайное моделирование для оценки статистической значимости предпочтения CNVR межгенным областям было разработано следующим образом. То же количество геномных интервалов, что и у CNVR (137 в этом исследовании), было случайным образом выбрано из хромосом крыс, и их длины также были такими же, как у соответствующих CNVR.Суммарная длина перекрытий между ними и областями гена Entrez затем рассчитывалась как статистика. После 1000 циклов этого процесса было получено эмпирическое распределение, представляющее величины перекрытия между областями гена и случайными геномными интервалами. И, таким образом, можно было оценить вероятность того, что длина перекрытия меньше, чем между реальными CNVR и областями гена (3,22 Мб в этом исследовании).

Список генов, связанных с СД2, был составлен на основе статьи, в которой собрано 172 гена, связанного с СД2 человека [10], и базы данных СД2-БД [9], которая содержала 330, 60 и 36 генов человека, мыши и крысы соответственно.Используя NCBI HomoloGene Release 64 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene), мы получили соответствующие крысиные гомологи генов человека и мыши. В общей сложности оказалось, что 425 неперекрывающихся крысиных генов составляют список генов, связанных с СД2.

В дополнение к org.Rn.eg.db (2.2.11) пакеты биопроводников, включая KEGG.db (2.2.11) и GOstats (2.10.0), использовались для получения сопоставления генов с путями и для тестирования значение обогащения путей. Набор генов, близких к T2D, был получен из исследования «болезни» человека [31], где все заболевания были организованы во взаимосвязанную сеть.Мы собрали все заболевания, которые напрямую связаны с СД2 в этой сети, а затем все гены, соответствующие этим заболеваниям, были извлечены как набор генов, близких к СД2. Крысиные гомологи человеческих генов, близких к T2D, также были получены из выпуска 64 NCBI HomoloGene, в результате чего было получено 1097 крысиных генов, близких к T2D. Данные крысиного QTL были получены из источника RGD [58], и их перекрытие с генами CNV было проверено путем ручной навигации в браузере генома UCSC [59]. Набор генов Tiffin T2D человека [33] первоначально был представлен идентификаторами генов Ensembl и был преобразован в идентификаторы генов Entrez с использованием org.Hs.eg.db (2.2.11). Человеческие гомологи крысиных генов CNV также были получены с использованием HomoloGene выпуска 64, что сделало возможным сравнение между CNV генами и набором данных Tiffin.

Расположение ультраконсервативных элементов в геноме крысы (сборка rn4) определяли с помощью BLAT [60]. 481 опубликованный элемент привел к 484 позициям из-за неуникального сопоставления. Моделирование для оценки значимости перекрытия между CNVR и ультраконсервативными элементами проводилось в соответствии с предыдущей процедурой для перекрытия между CNVR и областями гена.

крысиных микроРНК вместе с их геномными координатами на основе сборки rn4 были загружены с сайта miRBase (http://www.mirbase.org/, выпуск 14) [61]. Предсказанные мишени зрелых микроРНК были получены от MicroCosm (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/) на основе алгоритма miRanda [39]. Поскольку rno-mir-30b был обработан в две зрелые формы, rno-miR-30b-3p и rno-miR-30b-5p , их мишени были объединены для дальнейшего анализа; и то же самое было с rno-mir-30d , где мишени rno-miR-30d и rno-miR-30d* были объединены.Цели в MicroCosm, представленные в виде идентификаторов транскриптов Ensembl, были преобразованы в идентификаторы генов Entrez с использованием карт, предоставленных пакетом org.Rn.eg.db. Значимость обогащения мишеней 425 генами, связанными с СД2, рассчитывали в гипергеометрическом распределении, принимая все гены в пакете «org.Rn.eg.db» в качестве фона. Картирование путей и анализ обогащения мишеней проводили так же, как и для генов CNV, с использованием пакета GOstats.

Суперсерия GSE13271 содержит три набора данных экспрессии: GSE13268 (жировая ткань), GSE13269 (мышцы) и GSE13270 (печень), все из которых профилировали экспрессию генов у крыс GK и Wistar при нормальной диете и диете с высоким содержанием жиров и в 5 временных точках. , что приводит к 30 условиям.Для генов с более чем одним набором зондов мы сохранили тот, который чаще всего ассоциировался с самым высоким уровнем экспрессии. Если оставалось еще более одного набора зондов, интенсивности оставшихся наборов зондов усреднялись, чтобы представить уровень экспрессии этого гена. Затем мы выполнили тест t для идентификации дифференциально экспрессируемых генов между образцами GK и Wistar и рассчитали логарифм по основанию 2 кратных изменений для уровней экспрессии. Коррекция FDR с использованием метода BH [62] была принята для корректировки необработанных p -значений нескольких проверок гипотез и 0.2 был выбран в качестве порога, что означает, что более 80% идентифицированных генов действительно дифференциально экспрессируются. Что касается набора данных экспрессии микроРНК GSE13920, мы просто посмотрели на среднюю интенсивность сигнала после удаления среднего фонового шума для каждого зонда mir-30b и mir-30d .

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Эффект коррекции смещения красителя. Образцы были сгруппированы в соответствии с соответствующими значениями M до (A) и после (B) исправления систематических ошибок, вызванных смещением красителя, соответственно.GK1′, GK2′ и GK4′ представляют собой соответствующие «обратные» гибридизации для GK1, GK2 и GK4 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014077.s001

(0,08 МБ TIF)

Рисунок S2.

Уровни экспрессии mir-30b/30d в мышцах крыс GK и Wistar. Данные были загружены из GEO (GSE13920), и два образца GK и 2 образца Wistar были гибридизованы на 4 одноканальных микроматрицах соответственно. Уровень экспрессии был представлен средней интенсивностью сигнала переднего плана после вычитания средней интенсивности фонового сигнала.Каждый зонд дублируется 3 раза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014077.s002

(0,22 МБ TIF)

Благодарности

Мы благодарим доктора Tingqing Guo из Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек США (NIDDK) за полезные обсуждения. Мы также благодарим доктора Штейна Аэртса и двух анонимных рецензентов за их комментарии и предложения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: HSX RZ YXL JRW YYL.Проведены эксперименты: YY RXL. Проанализированы данные: ZQY SN HY BHL YYL. Написал статью: ZQY YYL.

Каталожные номера

1. 1. ВОЗ (2008 г.) Информационный бюллетень ВОЗ по диабету № 312.
2. 2. Stumvoll M, Goldstein BJ, van Haeften TW (2005)Диабет 2 типа: принципы патогенеза и терапии. Ланцет 365: 1333–1346.
3. 3. Прокопенко И., Маккарти М.И., Линдгрен С.М. (2008)Диабет 2 типа: новые гены, новое понимание. Тенденции Жене 24: 613–621.
4. 4. Frayling TM (2007) Полногеномные ассоциативные исследования дают новое представление об этиологии диабета 2 типа. Нат Рев Генет 8: 657–662.
5. 5. McCarthy MI, Zeggini E (2009)Общегеномные ассоциативные исследования диабета 2 типа. Карр Диаб, представитель 9: 164–171.
6. 6. Zeggini E, Weedon MN, Lindgren CM, Frayling TM, Elliott KS, et al. (2007) Репликация сигналов полногеномной ассоциации в образцах Великобритании выявляет локусы риска для диабета 2 типа.Наука 316: 1336–1341.
7. 7. Саксена Р., Войт Б.Ф., Лысенко В., Бертт Н.П., де Баккер П.И. и соавт. (2007) Анализ ассоциации всего генома идентифицирует локусы для диабета 2 типа и уровней триглицеридов. Наука 316: 1331–1336.
8. 8. Скотт Л.Дж., Молке К.Л., Бонникасл Л.Л., Виллер С.Дж., Ли И. и др. (2007) Полногеномное исследование ассоциации диабета 2 типа у финнов выявило множественные варианты восприимчивости. Наука 316: 1341–1345.
9. 9. Агравал С., Димитрова Н., Натан П., Удаякумар К., Лакшми С.С. и др.(2008) T2D-Db: интегрированная платформа для изучения молекулярной основы диабета 2 типа. BMC Genomics 9: 320.
10. 10. Хэнкок А.М., Витонски Д.Б., Гордон А.С., Эшель Г., Притчард Дж.К. и соавт. (2008) Адаптация к климату в генах-кандидатах для общих нарушений обмена веществ. PLoS Genet 4: e32.
11. 11. Гото Ю., Какидзаки М., Масаки Н. (1975)Спонтанный диабет, вызванный селективным размножением нормальных крыс Вистар. Proc Jpn Acad 51: 80–85.
12. 12. Порта Б., Лакраз Г., Кергоат М., Хомо-Деларш Ф., Жируа М.Х. и др.(2009) Бета-клетка GK крысы: прототип больной бета-клетки человека при диабете 2 типа? Mol Cell Endocrinol 297: 73–85.
13. 13. Movassat J, Calderari S, Fernandez E, Martin MA, Escriva F, et al. (2007) Диабет 2 типа — вопрос недостаточного неогенеза бета-клеток? Подсказки из крысиной модели GK. Diabetes Obes Metab 9: Suppl 2187–195.
14. 14. Gauguier D, Froguel P, Parent V, Bernard C, Bihoreau MT, et al. (1996) Хромосомное картирование генетических локусов, связанных с инсулиннезависимым диабетом у крыс GK.Нат Жене 12: 38–43.
15. 15. Галли Дж., Ли Л.С., Глейзер А., Остенсон К.Г., Цзяо Х. и др. (1996)Генетический анализ инсулиннезависимого сахарного диабета у крыс GK. Нат Жене 12: 31–37.
16. 16. Granhall C, Park HB, Fakhrai-Rad H, Luthman H (2006)Количественный анализ локусов с высоким разрешением показывает множественные локусы предрасположенности к диабету, сопоставленные с интервалами <800 т.п.н. в видоконсервативном Niddm1i крысы GK. Генетика 174: 1565–1572.
17. 17.Уэйн Л.В., Армор Дж.А., Тобин М.Д. (2009)Изменение числа копий генома, здоровье человека и болезни. Ланцет 374: 340–350.
18. 18. Мегарбейн А., Равель А., Мирчер С., Стурц Ф., Граттау Ю. и др. (2009) 50-летие открытия трисомии 21: прошлое, настоящее и будущее исследований и лечения синдрома Дауна. Жене Мед 11: 611–616.
19. 19. Редон Р., Исикава С., Фитч К.Р., Феук Л., Перри Г.Х. и другие. (2006) Глобальная вариация числа копий в геноме человека.Природа 444: 444–454.
20. 20. Иган К.М., Шридхар С., Виглер М., Холл И.М. (2007)Рекуррентное изменение числа копий ДНК у лабораторной мыши. Нат Жене 39: 1384–1389.
21. 21. Гурьев В., Саар К., Адамович Т., Верхел М., ван Хиш С.А. и др. (2008)Распределение и функциональное влияние изменения количества копий ДНК у крыс. Нат Жене 40: 538–545.
22. 22. Cook EH Jr, Scherer SW (2008)Вариации числа копий, связанные с нейропсихиатрическими состояниями.Природа 455: 919–923.
23. 23. Морроу Э.М., Ю С.И., Флавелл С.В., Ким Т.К., Лин И и др. (2008) Идентификация локусов и генов аутизма путем отслеживания недавних общих предков. Наука 321: 218–223.
24. 24. Schaschl H, Aitman TJ, Vyse TJ (2009)Изменение количества копий в геноме человека и его влияние на аутоиммунитет. Clin Exp Immunol 156: 12–16.
25. 25. Маккэрролл С.А., Альтшулер Д.М. (2007)Количество копий и исследования ассоциации заболеваний человека.Нат Жене 39: S37–42.
26. 26. WTCCC (2010) Полногеномное исследование ассоциации CNV в 16 000 случаев восьми распространенных заболеваний и 3 000 общих контролей. Природа 464: 713–720.
27. 27. Барретт Т., Троуп Д.Б., Уилхайт С.Е., Леду П., Руднев Д. и др. (2009) NCBI GEO: архив высокопроизводительных функциональных геномных данных. Рез. нуклеиновых кислот 37: D885–890.
28. 28. Stocker R (2009)Молекулярные механизмы, лежащие в основе антиатеросклеротического и антидиабетического действия пробукола, сукцинобукола и других аналогов пробукола.Curr Opin Lipidol 20: 227–235.
29. 29. Ким С.Дж., Рамеш С., Гупта Х., Ли В. (2007)Взаимодействие таурина и диабета: от участия к защите. Агенты J Biol Regul Homeost 21: 63–77.
30. 30. Graubert TA, Cahan P, Edwin D, Selzer RR, Richmond TA, et al. (2007) Карта высокого разрешения вариаций числа копий сегментной ДНК в геноме мыши. PLoS Genet 3: e3.
31. 31. Li Y, Agarwal P (2009) Взгляд на болезни человека и взаимосвязь между болезнями на основе путей.ПЛОС Один 4: e4346.
32. 32. Teber ET, Liu JY, Ballouz S, Fatkin D, Wouters MA (2009)Сравнение автоматизированных систем предсказания генов-кандидатов с использованием генов, вовлеченных в диабет 2 типа, с помощью полногеномных ассоциативных исследований. BMC Bioinformatics 10: Приложение 1S69.
33. 33. Tiffin N, Adie E, Turner F, Brunner HG, van Driel MA, et al. (2006) Вычислительная идентификация генов болезней: набор методов отдает приоритет генам-кандидатам диабета 2 типа и ожирения.Нуклеиновые кислоты Рез. 34: 3067–3081.
34. 34. Беджерано Г., Фазан М., Макунин И., Стивен С., Кент В.Дж. и др. (2004) Ультраконсервативные элементы в геноме человека. Наука 304: 1321–1325.
35. 35. Derti A, Roth FP, Church GM, Wu CT (2006) Ультраконсервативные элементы млекопитающих сильно истощены среди сегментных дупликаций и вариантов числа копий. Нат Жене 38: 1216–1220.
36. 36. He L, Hannon GJ (2004)МикроРНК: малые РНК, играющие большую роль в регуляции генов.Нат Рев Генет 5: 522–531.
37. 37. Croce CM (2009)Причины и последствия дисрегуляции микроРНК при раке. Нат Рев Генет 10: 704–714.
38. 38. Tang X, Muniappan L, Tang G, Ozcan S (2009) Идентификация регулируемых глюкозой микроРНК из {бета} клеток поджелудочной железы выявляет роль miR-30d в транскрипции инсулина. РНК 15: 287–293.
39. 39. Энрайт А.Дж., Джон Б., Галл У., Тушл Т., Сандер С. и др. (2003)МикроРНК-мишени у дрозофилы.Геном Биол 5: R1.
40. 40. Эльбейн С.К., Дас С.К., Холлман Д.М., Ханис С.Л., Хасстедт С.Дж. (2009)Геномное сцепление и картирование примесей диабета 2 типа в афроамериканских семьях из исследовательской когорты Американской диабетической ассоциации GENNID (Генетика NIDDM). Диабет 58: 268–274.
41. 41. Kroetz DL, Yook P, Costet P, Bianchi P, Pineau T (1998)Рецептор, активируемый пролифератором пероксисом альфа, контролирует печеночный адаптивный ответ индукции CYP4A на голодание и диабет.J Biol Chem 273: 31581–31589.
42. 42. Алмон Р.Р., Дюбуа Д.К., Лай В., Сюэ Б., Ни Дж. и др. (2009) Анализ экспрессии генов роли печени в возникновении и развитии диабета у крыс Goto-Kakizaki. Дж. Эндокринол 200: 331–346.
43. 43. Хуанг Б., Цинь В., Чжао Б., Ши Ю., Яо С. и др. (2009)Профилирование экспрессии микроРНК в модели крыс с диабетом GK. Acta Biochim Biophys Sin (Шанхай) 41: 472–477.
44. 44. Ван С. Х., Цянь Р. З., Чжан В., Чен С. Ф., Джин Х. М. и др.(2009)Экспрессия микроРНК-320 в эндотелиальных клетках микрососудов миокарда и ее связь с инсулиноподобным фактором роста-1 у крыс с диабетом 2 типа. Clin Exp Pharmacol Physiol 36: 181–188.
45. 45. Ловис П., Роггли Э., Лейбатт Д.Р., Гаттеско С., Ян Дж.И. и другие. (2008) Изменения в экспрессии микроРНК способствуют индуцированной жирными кислотами дисфункции бета-клеток поджелудочной железы. Диабет 57: 2728–2736.
46. 46. Lu H, Buchan RJ, Cook SA (2010) МикроРНК-223 регулирует экспрессию Glut4 и метаболизм глюкозы в кардиомиоцитах.Cardiovasc Res 86: 410–420.
47. 47. Клотинг Н., Бертольд С., Ковач П., Шон М.Р., Фассхауэр М. и соавт. (2009)Экспрессия микроРНК в сальниковой и подкожной жировой ткани человека. ПЛОС ОДИН 4: e4699.
48. 48. Herrera BM, Lockstone HE, Taylor JM, Wills QF, Kaisaki PJ, et al. (2009) МикроРНК-125a сверхэкспрессируется в тканях-мишенях инсулина в модели спонтанного диабета 2 типа у крыс. BMC Med Genomics 2: 54.
49. 49. Ортега Ф.Дж., Морено-Наваррете Дж.М., Пардо Г., Сабатер М., Хуммель М. и др.(2010) Профиль экспрессии микроРНК в подкожной жировой клетчатке человека и во время дифференцировки адипоцитов. PLoS One 5: e9022.
50. 50. Допман Э.Б., Хартл Д.Л. (2007)Портрет полиморфизма числа копий у Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 19920–19925.
51. 51. Купер Г.М., Никерсон Д.А., Эйхлер Э.Е. (2007)Мутационное и селективное воздействие на варианты числа копий в геноме человека. Нат Жене 39: S22–29.
52. 52. Смит М.Л., Мариони Дж., Хардкасл Т.Дж., Торн Н.П. (2006) snapCGH: Руководство пользователя по сегментации, нормализации и обработке данных aCGH.Биопроводник.
53. 53. Neuvial P, Hupe P, Brito I, Liva S, Manie E и др. (2006) Пространственная нормализация данных массива CGH. BMC Биоинформатика 7: 264.
54. 54. Smyth GK, Speed ​​T (2003) Нормализация данных микрочипов кДНК. Методы 31: 265–273.
55. 55. Смит Г.К. (2004)Линейные модели и эмпирические байесовские методы для оценки дифференциальной экспрессии в экспериментах с микрочипами. Stat Appl Genet Mol Biol 3: Статья3.
56. 56.Олшен А.Б., Венкатраман Э.С., Лусито Р., Виглер М. (2004)Круговая бинарная сегментация для анализа данных о количестве копий ДНК на основе массива. Биостатистика 5: 557–572.
57. 57. Awad IA, Rees CA, Hernandez-Boussard T, Ball CA, Sherlock G (2004) Caryoscope: Java-приложение с открытым исходным кодом для просмотра данных микрочипов в геномном контексте. BMC Биоинформатика 5: 151.
58. 58. Двинелл М.Р., Уорти Э.А., Шимояма М., Бакир-Гунгор Б., Депонс Дж. и др. (2009) База данных генома крысы 2009: вариации, онтологии и пути.Рез. нуклеиновых кислот 37: D744–749.
59. 59. Rhead B, Karolchik D, Kuhn RM, Hinrichs AS, Zweig AS, et al. (2010) База данных UCSC Genome Browser: обновление 2010 г. Nucleic Acids Res 38: D613–619.
60. 60. Kent WJ (2002) BLAT – инструмент выравнивания, подобный BLAST. Геном Res 12: 656–664.
61. 61. Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ (2008) miRBase: инструменты для геномики микроРНК. Рез. нуклеиновых кислот 36: D154–158.
62. 62.Benjamini Y, Hochberg Y (1995) Контроль частоты ложных открытий: практичный и мощный подход к множественному тестированию. Журнал Королевского статистического общества, серия B 289–300.

Вегетарианская и веганская диеты и риски тотальных и локальных переломов: результаты проспективного исследования EPIC-Oxford | BMC Medicine

Резюме результатов

В целом, веганы в этом исследовании имели более высокий риск тотальных переломов и переломов некоторых локализаций (бедренной кости, ноги, позвонка), чем мясоеды.Самые сильные ассоциации наблюдались для переломов шейки бедра, риск которых был выше у любителей рыбы, вегетарианцев и веганов. Эти различия в риске могут быть частично объяснены более низким средним ИМТ и более низким средним потреблением кальция и белка у лиц, не употребляющих мясо. Однако, поскольку различия остались, особенно у веганов, после учета этих факторов могут оказаться важными и другие неучтенные факторы.

Сравнение с предыдущими исследованиями

В нескольких предыдущих исследованиях изучалась связь вегетарианской диеты с риском переломов.В предыдущем анализе EPIC-Oxford переломов, о которых сообщали сами пациенты, с коротким последующим наблюдением, у веганов, но не у рыбоядных или вегетарианцев, риск общих переломов был на 30% (HR 1,30; 1,02, 1,66) выше, но в отличие от Согласно текущим результатам, связь полностью ослабла, когда она была ограничена участниками, которые сообщили о потреблении не менее 525 мг кальция в день [16]. Это очевидное несоответствие можно объяснить несколькими различиями между текущим и предыдущим анализом; в то время как текущий анализ включал около 4000 госпитализированных случаев в течение более чем 17 лет среднего наблюдения около 55 000 участников, предыдущее исследование включало менее 2000 случаев переломов, о которых сообщали сами, в течение 5 лет наблюдения около 35 000 участников.Учитывая разницу в методах подтверждения случая, текущий анализ менее подвержен ошибкам в отчетах и ​​не подвержен выборочному отсеву. Также возможно, что было недостаточно мощности для обнаружения различий после стратификации по статусу потребления кальция в предыдущем анализе, в котором также не изучались локальные переломы.

Единственными другими исследованиями, в которых сообщалось о рисках переломов в зависимости от диеты, было одно небольшое проспективное исследование во Вьетнаме с участием 210 женщин (105 веганов), в котором не было обнаружено существенной разницы в частоте переломов (всего 10 случаев) между веганами и всеядными в течение 2 лет. [17] и одно проспективное исследование в Индии, в котором сообщалось о более высокой общей частоте стрессовых переломов (всего 604 случая) среди 2131 вегетарианца, чем среди 6439 новобранцев-невегетарианцев [18].Отдельно предыдущие результаты Адвентистского исследования здоровья 2, в котором большая часть вегетарианцев, показали, что участники, которые ели мясо более трех раз в неделю, имели более низкий риск переломов бедра (ОР 0,60; 0,41, 0,87), чем участники, которые ели мясо. менее одного раза в неделю [32], в то время как комбинированный анализ женщин в пери- и постменопаузе из Adventist Health Study 1 и 2 показал, что у участников, которые ели мясо более четырех раз в неделю, был более низкий риск переломов запястья (ОР 0,44; 0,23, 0). .84), чем у участников, которые никогда не ели мяса [33], но эти результаты нельзя использовать для вывода о рисках у любителей рыбы, вегетарианцев или веганов как отдельных диетических групп.

Интерпретация результатов и последствия

Более высокий наблюдаемый риск переломов у лиц, не употребляющих мясо, обычно был выше до корректировки ИМТ, что позволяет предположить, что различия в риске, вероятно, были частично обусловлены различиями в ИМТ. Вегетарианцы и веганы, как правило, имеют более низкий ИМТ, чем мясоеды [2, 8], и в предыдущих исследованиях сообщалось об обратной связи между ИМТ и некоторыми переломами, особенно переломами шейки бедра, возможно, по причинам, включая амортизацию ударной силы во время падения, повышенный уровень эстрогена. производство с повышенным ожирением или более крепкие кости из-за увеличения нагрузки [14, 34].Однако положительная связь между ИМТ и риском перелома наблюдалась для некоторых других мест, включая переломы лодыжки, возможно, в результате более высоких крутящих моментов от скручивания лодыжки у людей с более высоким ИМТ [14]. В нашем исследовании не наблюдалось существенных различий в рисках переломов лодыжек в зависимости от диеты, но точечные оценки прямо согласовывались с более низким риском у всех, кто не ел мясо, до корректировки ИМТ, и результаты могут отражать противовес между защитным эффектом от более низкого ИМТ, но более высокого риска из-за более низкого потребления питательных веществ, связанных со здоровьем костей, у тех, кто не ест мясо.

В нашем стратифицированном анализе имеются ограниченные данные о неоднородности риска переломов по категориям ИМТ. Хотя статистически значимо более высокий риск тотальных переломов и переломов бедра наблюдался только у веганов с более низким ИМТ (< 22,5 кг/м ² ), наша интерпретация ограничена небольшим количеством случаев в каждой страте в этих анализах, особенно из-за сильной корреляции между диетической группой и ИМТ, что приводит к очень небольшому количеству веганов с более высоким ИМТ и, наоборот, сравнительно небольшому количеству мясоедов с низким ИМТ.В дополнение к ИМТ в предыдущих исследованиях сообщалось, что мышечная сила является важным фактором риска, защищающим от риска падения и последующего перелома у пожилых людей [35]. Предыдущее исследование, проведенное в Великобритании, выявило более низкую мышечную массу и силу хвата у вегетарианцев и веганов по сравнению с мясоедами [2]; поэтому необходимо дополнительно изучить возможное влияние мышечной силы и риска падения в дополнение к здоровью костей на риск переломов у вегетарианцев и веганов. Переломы в некоторых местах, особенно в области тазобедренного сустава, также могут быть в большей степени связаны с остеопорозом, чем переломы в некоторых других местах, которые с большей вероятностью могут быть результатом сильных ударов при несчастных случаях [36, 37].В этом исследовании мы не смогли дифференцировать фраг- ментальные и травматические переломы, так как отсутствовали данные о причинах переломов.

В этом и предыдущих исследованиях веганы потребляли значительно меньше кальция, чем другие диетические группы, поскольку они не потребляли молочные продукты, являющиеся основным источником диетического кальция [4, 5], в то время как вегетарианцы и веганы в среднем потребляли меньше белка [6, 7]. В организме человека 99% кальция находится в костях и зубах в виде гидроксиапатита, который в случае дефицита кальция резорбируется для поддержания метаболического баланса кальция, и, таким образом, остеопороз может возникнуть, если кальций не восстанавливается [38]. ,39,40].В недавнем метаанализе сообщалось, что увеличение потребления кальция из пищевых источников или пищевых добавок приводило к небольшому увеличению МПК [9], но данные о риске переломов были менее последовательными. Предыдущие анализы в EPIC-Oxford выявили более высокий риск переломов у женщин, но не у мужчин, при потреблении кальция ниже 525 мг/день по сравнению с более чем 1200 мг/день [41]. Недавний метаанализ как рандомизированных, так и проспективных исследований показал, что не было доказательств связи между потреблением кальция с пищей и риском переломов, но возможна слабая защитная связь между приемом добавок кальция и некоторыми переломами [10].Однако совсем недавно отдельный метаанализ показал защитный эффект от переломов комбинированных добавок витамина D и кальция, но не только добавок витамина D [11].

Что касается белка, некоторые более ранние исследования показали, что чрезмерное потребление белка приведет к увеличению метаболической кислотной нагрузки, которая впоследствии будет компенсироваться резорбцией кости и кальциурией, и, таким образом, к ухудшению здоровья костей [12, 42]. Однако более поздние экспериментальные данные показали, что высокое потребление белка также увеличивает всасывание кальция в кишечнике [43] и стимулирует выработку инсулиноподобного фактора роста (IGF)-I [44], что, в свою очередь, связано с улучшением здоровья костей [44]. 45, 46].В двух метаанализах, включавших разные исследования, сообщалось о возможном защитном эффекте повышенного потребления белка на МПК поясничного отдела позвоночника [13, 47]; в нескольких эпидемиологических исследованиях сообщалось об обратной связи между потреблением белка и риском переломов [48,49,50], хотя недавний метаанализ не обнаружил значимой связи между потреблением белка и остеопорозными переломами [51].

Более высокий риск переломов, особенно у веганов, оставался значительным после корректировки содержания кальция и белка в рационе, что позволяет предположить, что эти факторы могут лишь частично объяснять различия в рисках переломов в зависимости от диеты, и другие факторы также могут вносить свой вклад.Однако оценка потребления этих нутриентов с помощью опросников имеет существенную ошибку, и мы смогли учесть только различия в содержании кальция в рационе, но не различия в использовании добавок кальция, поскольку данные о последнем отсутствовали. Подробный анализ связи определенных пищевых продуктов, таких как мясо или молочные продукты, с риском переломов выходит за рамки настоящего исследования, но его следует изучить в дальнейших исследованиях. Будущие исследования также должны быть сосредоточены на возможном влиянии других питательных веществ или биологических маркеров на риск переломов, например, циркулирующего витамина D, витамина B ₁₂ или IGF-I, которые могут варьироваться в зависимости от степени потребления пищи животного происхождения [52,53]. ,54].Следует также дополнительно изучить значение включения привычных пищевых привычек в дополнение к установленным параметрам для прогнозирования риска переломов в клинических условиях.

Сильные стороны и ограничения

Сильные стороны этого исследования заключались в том, что оно включало большое количество людей, не употребляющих мясо, с длительным наблюдением и изучало как тотальные, так и локализованные переломы после учета ряда искажающих факторов. Мы обновили группу диеты и соответствующие вмешивающиеся факторы, где это возможно, чтобы учесть изменения за период наблюдения.Было мало доказательств обратной причинно-следственной связи, поскольку результаты были схожими после исключения первых 5 лет наблюдения. Данные об исходах были установлены на основе больничных записей, что уменьшило количество неверных сообщений и выборочную потерю для последующего наблюдения, хотя возможным ограничением этого подхода было то, что менее серьезные переломы, не требующие госпитализации, не были бы зафиксированы.

Из других ограничений, хотя мы исключили известные случаи переломов до исходного уровня на основании больничных записей, это может не быть полным исключением, так как вопросы о предыдущем диагнозе переломов (до самых ранних доступных больничных данных) или остеопорозе не задавались при исходный уровень, а данные об использовании препаратов против остеопороза отсутствовали.Повторные измерения диеты не были доступны для всех участников, и точная дата изменения диеты во время последующего наблюдения также не была зафиксирована, но, учитывая хорошее согласие диетической группы у участников, которые проводили повторные измерения, и тот факт, что диета изменение может повлиять на риск перелома только через некоторое время, мы не ожидаем существенной неправильной классификации. Как и во всех обсервационных исследованиях, могут присутствовать остаточные искажения как диетических, так и недиетических факторов; например, роль кальция могла быть недооценена из-за ошибки измерения.Поскольку в исследование входят преимущественно белые европейцы, возможность обобщения на другие популяции или этнические группы может быть ограничена, что может быть важно, учитывая ранее наблюдаемые различия в МПК [2, 55] и риске переломов [56] в зависимости от этнической принадлежности. Мы также наблюдали лишь небольшое количество случаев во многих анализах подгрупп, и поэтому, вероятно, у нас не было достаточной мощности, чтобы надежно оценить, может ли быть какая-либо гетерогенность по этим подгруппам, включая возраст, пол, менопаузальный статус или ИМТ; поэтому необходимы дополнительные данные для подтверждения или опровержения возможных различий.В частности, поскольку когорта EPIC-Oxford состоит преимущественно из женщин (77%), дальнейшая работа должна проводиться в когортах с большей долей мужчин, чтобы изучить гетерогенность по полу и получить надежные оценки по полу.

Дейтон | Публикации

Биомаркеры РНК крови при продромальном синдроме PARK4 и расстройстве поведения во время сна с быстрыми движениями глаз показывают роль потери комплексина 1 в риске развития болезни Паркинсона | Модели и механизмы заболеваний

После ночного голодания у людей были взяты образцы цельной крови из семейства PARK4 (после информированного письменного согласия и с одобрения Комиссии по этике Университета Богазичи в Стамбуле) в пробирки PAXgene (Qiagen) и ЭДТА.Также после ночного голодания образцы цельной крови были собраны в пробирки PAXgene у когорты RBD, состоящей из 46 больных и 19 здоровых родственников (лица с нарколепсией были исключены), после письменного информированного согласия и с одобрения Комиссии по этике Марбургского университета. Образцы от пострадавших и контрольных людей обрабатывали параллельно, и после 2-часовой инкубации пробирок PAXgene при комнатной температуре их хранили при -80 °C до экстракции РНК после дополнительной инкубации в течение ночи при комнатной температуре с использованием соответствующего набора PAXgene. .Выделенную РНК очищали с помощью ДНКазы-I степени амплификации (Invitrogen) и преобразовывали в кДНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen). Качество и количество кДНК определяли с помощью спектрофотометрии и показателей целостности РНК (Agilent Bioanalyzer). Количественный ОТ-ПЦР проводили с анализах TaqMan (Applied Biosystems) Hs01018439_s1 ( GPRIN3 ), Hs00201182_m1 ( MMRN1 ), Hs00411197_m1 ( LRRK2 ), Hs01084510_m1 ( GIGYF2 ), Hs00223032_m1 ( ATP13A ), Hs01026447_m1 ( ATXN3 ), Hs00697109_m1 ( DJ-1 ), Hs00260868_m1 ( PINK1 ), Hs00832556_sH ( ST13 ), Hs01038318_m1 ( PARK2 ), Hs00201825_m1 ( FBX07 ), Hs00188233_m1 ( UCHL1 ), Hs00164683_m1 ( GBA ), Hs00234883_m1 ( HtrA2 ), Hs00185926_m1 ( PLA2G6 ), Hs00608185_m1 ( НОЖДБ ), Hs00705917_s1 ( YWHAG ), Hs01103386_m1 ( SNCA ), HS00793604_m1 ( YWHAB ), HS00356749_g1 ( YWHAE ), HS00362510_M1 ( CPLX1 ), HS00277212_M1 ( GZMH ), HS00959010_M1 ( SPP1 ), HS00272126_M1 ( PLTP ), HS00230853_M1 ( HNF4A ) и HS0 07_g1 ( ПТВР1 ).После исследования различных загрузки (например, GAPDH , ACTN , RPL13A , TBP , TBP , SDH и YWHA2 ) против SNCA выражение в цельной крови, HS999999910_M1 ( TBP ) наблюдалось показывают наименьшую дисперсию и поэтому были включены в качестве домашнего контроля для каждого теста экспрессии. Всего в каждой реакции использовали 25 нг кДНК. Условия ПЦР: 2 мин при 50°C, 10 мин при 95°C, 40 циклов по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C.Изменения экспрессии генов анализировали по методу 2 ^-ΔΔCt (Livak, Schmittgen, 2001).