Увольнение по пп а п. 6 ч. 1 ст. 81 ТК РФ
Подборка наиболее важных документов по запросу Увольнение по пп а п. 6 ч. 1 ст. 81 ТК РФ (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).
Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Увольнение по пп а п. 6 ч. 1 ст. 81 ТК РФ Путеводитель по кадровым вопросам. УвольнениеУвольнение по пп. «а» п. 6 ч. 1 ст. 81 ТК РФ является видом дисциплинарного взыскания (ч. 3 ст. 192 ТК РФ). Применение к работнику взыскания и расторжение трудового договора оформляются соответствующими приказами (ст. ст. 84.1, 193 ТК РФ). Поскольку наложение взыскания в виде увольнения само по себе свидетельствует о расторжении трудового договора, то в данной ситуации следует издать один приказ (Апелляционное определение Верховного Суда РФ от 09.11.2012 N 60-АПГ12-7, Письмо Роструда от 01.06.2011 N 1493-6-1). В противном случае будет нарушена ч. 5 ст. 193 ТК РФ, согласно которой за каждый проступок можно применить только одно дисциплинарное взыскание (Апелляционное определение Верховного Суда РФ от 09.11.2012 N 60-АПГ12-7).Нормативные акты: Увольнение по пп а п. 6 ч. 1 ст. 81 ТК РФ «Трудовой кодекс Российской Федерации» от 30.12.2001 N 197-ФЗСт. 81 Конституции РФ с Комментариями. Последняя редакция с изменениями на 2021 год
1. Президент Российской Федерации избирается сроком на шесть лет гражданами Российской Федерации на основе всеобщего равного и прямого избирательного права при тайном голосовании.
2. Президентом Российской Федерации может быть избран гражданин Российской Федерации не моложе 35 лет, постоянно проживающий в Российской Федерации не менее 25 лет, не имеющий и не имевший ранее гражданства иностранного государства либо вида на жительство или иного документа, подтверждающего право на постоянное проживание гражданина Российской Федерации на территории иностранного государства. Требование к кандидату на должность Президента Российской Федерации об отсутствии у него гражданства иностранного государства не распространяется на граждан Российской Федерации, ранее имевших гражданство государства, которое было принято или часть которого была принята в Российскую Федерацию в соответствии с федеральным конституционным законом, и постоянно проживавших на территории принятого в Российскую Федерацию государства или территории принятой в Российскую Федерацию части государства. Президенту Российской Федерации в порядке, установленном федеральным законом, запрещается открывать и иметь счета (вклады), хранить наличные денежные средства и ценности в иностранных банках, расположенных за пределами территории Российской Федерации.
3. Одно и то же лицо не может занимать должность Президента Российской Федерации более двух сроков.
3.1. Положение части 3 статьи 81 Конституции Российской Федерации, ограничивающее число сроков, в течение которых одно и то же лицо может занимать должность Президента Российской Федерации, применяется к лицу, занимавшему и (или) занимающему должность Президента Российской Федерации, без учета числа сроков, в течение которых оно занимало и (или) занимает эту должность на момент вступления в силу поправки к Конституции Российской Федерации, вносящей соответствующее ограничение, и не исключает для него возможность занимать должность Президента Российской Федерации в течение сроков, допустимых указанным положением.
4. Порядок выборов Президента Российской Федерации определяется федеральным законом.
Комментарий к Ст. 81 КРФ
1. Конституция 1993 г. установила четырехлетний срок полномочий Президента РФ (до ее принятия он составлял пять лет). В Послании Президента РФ Федеральному Собранию от 5 ноября 2008 г. было предложено увеличить срок президентских полномочий до шести лет, а Государственной Думы — до пяти лет. Соответствующая поправка была внесена в Конституцию на основе Закона РФ о поправке к Конституции РФ «Об изменении срока полномочий Президента Российской Федерации и Государственной Думы», проект которого был рассмотрен в соответствии со ст. 136 Конституции и одобрен в ноябре-декабре 2008 г. Государственной Думой, Советом Федерации и законодательными органами субъектов РФ. Предусмотренные поправкой сроки полномочий распространяются на Президента и Государственную Думу, которые будут избраны после вступления данного Закона в силу.
Увеличение срока полномочий обосновывалось прежде всего тем, что оно позволит Президенту и Государственной Думе не только определить направление дальнейшего развития страны и начать осуществление намеченных целей, но и во многом реализовать задуманное в течение одного срока полномочий. Тем самым повышается ответственность главы государства и парламента перед гражданами и обществом в целом за результаты своей деятельности. Установление более продолжительного срока полномочий Президента по сравнению со сроком полномочий Государственной Думы связывалось с необходимостью стабильного, поступательного развития страны и преемственности государственной политики.
Исчисление конституционного срока полномочий Президента ведется со дня вступления его в должность. Начало исполнения полномочий знаменуется принесением торжественной присяги вновь избранным Президентом (см. комментарий к ст. 92 КРФ).
День голосования на выборах нового Президента назначается Советом Федерации. Таким днем является второе воскресенье месяца, в котором проводилось голосование на предыдущих общих выборах Президента. При досрочном прекращении исполнения полномочий Президентом днем голосования является последнее воскресенье перед днем, когда истекают три месяца со дня досрочного прекращения исполнения им своих полномочий (ФЗ «О выборах Президента Российской Федерации», ст. 5//СЗ РФ. 2003. N 2. Ст. 171; 2005. N 30. Ст. 3104; 2006. N 31. Ст. 3427).
Президент избирается гражданами России на основе всеобщего равного и прямого избирательного права при тайном голосовании. Гражданин РФ может избирать и быть избранным на пост Президента России независимо от пола, расы, национальности, языка, происхождения, имущественного и должностного положения, места жительства, отношения к религии, убеждений, принадлежности к общественным объединениям, а также других обстоятельств. Не имеют права избирать и быть избранными граждане, признанные судом недееспособными, или граждане, содержащиеся в местах лишения свободы по приговору суда (ч. 3 ст. 32 Конституции РФ).
Федеральные законы «О выборах Президента Российской Федерации» и «Об основных гарантиях избирательных прав и права на участие в референдуме граждан Российской Федерации» (СЗ РФ. 2002. N 24. Ст. 2253; 2005. N 30. Ст. 3104; 2007. N 1. Ст. 37) содержат ряд норм об иных ограничениях пассивного избирательного права при выборах Президента, в том числе норму о том, что гражданин РФ, имеющий гражданство иностранного государства либо обладающий правом на постоянное проживание на территории иностранного государства, не имеет права быть избранным Президентом РФ; не имеет такого права и гражданин РФ, занимающий должность Президента РФ второй срок подряд; запрещается регистрация в качестве кандидата в Президенты гражданина, в отношении которого вступил в силу приговор суда о лишении его права занимать государственные должности в течение определенного срока, если голосование состоится до истечения этого срока. Закон запрещает избираться на пост Президента гражданину, осужденному к лишению свободы за совершение тяжкого и (или) особо тяжкого преступления, осужденному за совершение преступления экстремистской направленности и имеющему на день голосования на выборах неснятую и непогашенную судимость, а также гражданину, подвергнутому административному наказанию за административное правонарушение, выражающееся в пропаганде нацистской символики.
Участие в выборах Президента является свободным и добровольным. Никто не вправе оказывать воздействие на избирателей с целью принудить их к участию или неучастию в выборах, а также препятствовать свободному волеизъявлению; исключается возможность какого-либо контроля за волеизъявлением гражданина. ФЗ от 26 апреля 2007 г. отменил требование о явке на выборы Президента не менее чем половины избирателей для признания таких выборов состоявшимися (СЗ РФ. 2007. N 18. Ст. 2118).
Право избирать Президента, а также участвовать в выдвижении кандидатов на должность Президента, в предвыборной агитации, наблюдении за проведением выборов и работой избирательных комиссий, включая установление итогов голосования и определение результатов выборов, а также в осуществлении других избирательных действий в порядке, установленном законом, имеют граждане РФ, достигшие на день голосования 18 лет.
Необходимо отметить существенное изменение нормативного регулирования в сфере выдвижения кандидатов в Президенты по сравнению с периодом проведения выборов Президента, состоявшихся 14 марта 2004 г. В тот период право выдвижения кандидатов принадлежало избирателям, избирательным объединениям и избирательным блокам. В соответствии с действующим избирательным законодательством кандидат на должность главы государства может быть выдвинут лишь политической партией и в порядке самовыдвижения при условии поддержки самовыдвижения группой избирателей. Федеральный орган исполнительной власти, уполномоченный на осуществление регистрации политических партий, составляет список политических партий, имеющих законное право принимать участие в выборах Президента, публикует данный список в общероссийских государственных периодических печатных изданиях, размещает его в сети Интернет, а также направляет его в Центральную избирательную комиссию (ст. 6, 29, 34-36 ФЗ «О выборах Президента Российской Федерации»).
Подготовку и проведение выборов Президента осуществляют Центральная избирательная комиссия РФ, другие избирательные комиссии, образуемые в соответствии с законом.
Избранным считается кандидат, который получил более половины голосов избирателей, принявших участие в голосовании; данное число определяется по числу избирательных бюллетеней, обнаруженных в ящиках для голосования.
Официальное опубликование результатов выборов Президента, а также данных о числе голосов избирателей, полученных каждым из зарегистрированных кандидатов, осуществляется Центральной избирательной комиссией в течение трех дней со дня подписания ею протокола о результатах выборов.
2. Конституцией и на ее основе ФЗ «О выборах Президента РФ» установлены дополнительные условия приобретения гражданами пассивного избирательного права — Президентом РФ может быть избран лишь гражданин не моложе 35 лет, постоянно проживающий в России не менее 10 лет. Конституция РСФСР 1978 г. (в ред. Закона от 24 мая 1991 г.) устанавливала также требование о максимальном возрасте для избрания гражданина Президентом. Этот возраст составлял 65 лет. Действующая Конституция эту норму не воспроизводит.
Конституция не выдвигает требования о том, чтобы кандидат в президенты был гражданином Российской Федерации по рождению. Понятие «постоянно проживающий» означает, что, во-первых, кандидат в президенты должен постоянно жить в России не менее указанного срока; во-вторых, этот срок должен быть непрерывным, т.е. отрезки времени менее 10 лет не могут суммироваться. Требование постоянного проживания, разумеется, не исключает командировок и краткосрочных выездов в зарубежные государства.
Гражданин РФ, проживающий или находящийся в период подготовки и проведения выборов Президента за пределами территории России, обладает на выборах равными правами с иными российскими гражданами. Вместе с тем, как об этом уже говорилось, Закон запрещает гражданину РФ, имеющему гражданство иностранного государства либо право на постоянное проживание на территории иностранного государства, избираться на пост Президента РФ.
Все зарегистрированные кандидаты на должность Президента имеют равные права и несут равные обязанности. Со дня регистрации кандидат, находящийся на государственной или муниципальной службе либо работающий в средствах массовой информации, на время участия в выборах освобождается от должностных или служебных обязанностей и не вправе использовать преимущества своего служебного положения. Президент РФ, баллотирующийся на второй срок, вправе продолжать выполнять свои полномочия, при этом соблюдение установленных законом ограничений не должно препятствовать осуществлению президентских полномочий.
ФЗ «О выборах Президента Российской Федерации» предоставляет кандидату в президенты ряд гарантий, в том числе материального характера, обеспечивающих его независимость. Зарегистрированный кандидат не может быть привлечен к уголовной ответственности, арестован или подвергнут в судебном порядке административному наказанию без согласия Генерального прокурора РФ. Кандидат не может быть по инициативе администрации (работодателя) уволен с работы, со службы, отчислен из образовательного учреждения или без его согласия переведен на другую работу, в том числе в другую местность, а также направлен в командировку, призван на военную или альтернативную гражданскую службу и военные сборы.
3. Положение ч. 3 комментируемой статьи 81 КРФ ограничивает продолжительность пребывания федерального Президента на своем посту, устанавливая, что одно и то же лицо не может занимать должность Президента более двух сроков подряд.
В процессе разработки и принятия Конституции возникал вопрос о правопреемстве президентской власти по отношению к сформированной в соответствии с прежней Конституцией и о допустимости признания сроков полномочий Президента, избранного по ранее действовавшей Конституции, в качестве начала срока полномочий Президента по новой Конституции. В общей форме проблема была урегулирована в п. 3 раздела второго «Заключительные и переходные положения» Конституции, предусмотревшем, что Президент, избранный в соответствии с Конституцией (Основным законом) Российской Федерации, со дня вступления в силу действующей Конституции осуществляет установленные ею полномочия до истечения срока, на который он был избран.
Эта норма во взаимосвязи с положением ч. 3 рассматриваемой статьи была предметом рассмотрения Конституционного Суда по запросу Государственной Думы о толковании Конституции. В Определении Суда от 5 ноября 1998 г. N 134-О о прекращении производства по данному делу в связи с отсутствием неопределенности в понимании названных норм указывается, что два срока полномочий подряд, о чем идет речь в ч. 3 анализируемой статьи 81 Конституции РФ, составляют конституционный предел, превышения которого Конституция, включая п. 3 ее раздела второго «Заключительные и переходные положения», не допускает; имеющий переходный характер данный пункт раздела второго Конституции в июне — июле 1996 г. был исчерпан и в дальнейшем регулятором общественных отношений служить не может (п. 4 мотивировочной части//СЗ РФ. 1998. N 46. Ст. 5701).
Положение ч. 3 комментируемой статьи преследует цель конституционного обновления руководства государством и направлено против возможного установления режима авторитаризма. Вместе с тем названная норма не запрещает одному и тому же лицу избираться на пост президента неоднократно, но с перерывом — после пребывания на данном посту два срока подряд. Президент, досрочно прекративший свои полномочия в связи с обстоятельствами, перечисленными в ч. 2 ст. 92 Конституции России, не может быть выдвинут кандидатом на выборах, назначенных в связи с такими обстоятельствами.
4. Законодательство о выборах Президента РФ составляют Конституция, ФЗ от 11 июля 2001 г. «О политических партиях» (СЗ РФ. 2001. N 29. Ст. 2950; 2002. N 12. Ст. 1093; 2005. N 30. Ст. 3104; 2007. N 1. Ст. 37), ФЗ от 12 июня 2002 г. «Об основных гарантиях избирательных прав и права на участие в референдуме граждан Российской Федерации» (СЗ РФ. 2002. N 24. Ст. 2253; 2005. N 30. Ст. 3104; 2007. N 1. Ст. 37), ФЗ от 10 января 2003 г. «О выборах Президента Российской Федерации» (СЗ РФ. 2003. N 2. Ст. 171; 2005. N 30. Ст. 3104; 2006. N 31. Ст. 3427), иные федеральные законы, в том числе о федеральном бюджете, включающие положения о расходах на избирательную кампанию (СЗ РФ. 2006. N 52. Ст. 5504).
Федеральными законами устанавливаются основные принципы проведения избирательной кампании, регулируется организация выборов путем создания системы избирательных комиссий, предусматриваются статус избирателей, порядок их включения в избирательные списки, порядок участия в выборах политических партий, регулируются отношения по выдвижению и регистрации кандидатов на должность Президента, их равный статус, вопросы информирования избирателей и предвыборной агитации, финансирования выборов, устанавливаются порядок голосования и определения результатов выборов, порядок обжалования нарушений избирательных прав и указывается на ответственность за нарушение законодательства о выборах, а также определен порядок вступления в должность Президента.
Проблемные моменты процедуры увольнения работника по подп. «б» П. 6 ст. 81 трудового кодекса Российской Федерации Текст научной статьи по специальности «Право»
УДК 349
ПРОБЛЕМНЫЕ МОМЕНТЫ ПРОЦЕДУРЫ УВОЛЬНЕНИЯ РАБОТНИКА ПО ПОДП. «Б» П. 6 СТ. 81 ТРУДОВОГО КОДЕКСА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
PROBLEMATIC MOMENTS EMPLOYEE DISMISSAL PROCEDURES COP. «B»
OF PARAGRAPH 6 OF ARTICLE 81 OF THE LABOR CODE OF THE RUSSIAN
FEDERATION
Г. Н. ОБУХОВА (G. N. OBUKHOVA)
Исследуется проблема увольнения работника в случае его появления на работе в состоянии алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения. Анализируется процедура прекращения трудового договора по инициативе работодателя по подп. «б» п. 6 ст. 81 ТК РФ.
Ключевые слова: работник; работодатель; процедура; дисциплинарная ответственность; состояние алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения.
This article is devoted to the dismissal of an employee in case of his appearance on the work of alcohol, drugs or other toxic substances. Analysis of the termination of the employment contract by the employer to cop. «b» of paragraph 6 of article 81 of the LC RF.
Key words: employee; employer; procedure; disciplinary liability; the state of alcohol, drugs or other toxic substances.
Действующее трудовое законодательство в настоящее время предусматривает множество оснований расторжения трудового договора по инициативе работодателя; все они закреплены в ст. 81 Трудового кодекса Российской Федерации (далее — ТК РФ) [1]. Одним из таких оснований является предусмотренное подп. «б» п. 6 ст. 81 ТК РФ расторжение трудового договора по инициативе работодателя в случае появления работника на работе в состоянии алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения. На практике достаточно многочисленны судебные иски о восстановлении на работе или изменении записи в трудовой книжке от лиц, уволенных по данному основанию.
ТК РФ относит состояние алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения к однократному грубому нарушению трудовых обязанностей. Следовательно, работодатель должен выяснить, имеется ли в действиях работника вина, т. е. добровольное приведение себя в состояние алкогольного, наркотического или токсического опьянения
(в отличие от приема препаратов, содержащих наркотические вещества, по назначению врача; от алкогольного, наркотического или токсического опьянения, связанного с нарушением технологического процесса; от принятия перечисленных веществ по ошибке). Увольнение по данному основанию не требует согласия профсоюзного органа, за исключением случая увольнения несовершеннолетнего. Тогда согласно ст. 269 ТК РФ необходимо получение согласия соответствующей государственной инспекции труда и комиссии по делам несовершеннолетних о защите их прав.
Работодателю нужно иметь в виду, что за появление в состоянии опьянения можно уволить не каждого работника и не в любое время. К примеру, нельзя уволить за появление в состоянии опьянения беременную женщину. Расторжение трудового договора по инициативе работодателя с беременными женщинами не допускается, за исключением случаев ликвидации организации (ст. 261 ТК РФ). Также увольнение будет неправомерным,
© Обухова Г. Н., 2014
если работник появился в состоянии опьянения на работе в нерабочее время (по окончании рабочего дня, в выходные, праздники, в период нахождения в отпуске) [2].
В Постановлении Пленума Верховного Суда от 17 марта 2004 г. № 2 судам рекомендовано при рассмотрении споров, связанных с расторжением трудового договора по подп. «б» п. 6 ст. 81 ТК РФ, исходить из того, что по данному основанию могут быть уволены работники, находившиеся в состоянии алкогольного опьянения в рабочее время:
— в месте выполнения трудовых обязанностей;
— не на своем рабочем месте, но на территории организации;
— не на своем рабочем месте, но на территории объекта, где по поручению работодателя должны были выполнять трудовую функцию.
В названном постановлении указано, что для увольнения по основанию, предусмотренному подп. «б» п. 6 ст. 81 Трудового кодекса РФ, не имеет значения, отстранялся ли работник от работы в связи с состоянием опьянения. Это, в частности, распространяется на случаи, когда работодатель принял решение об увольнении работника сразу же после обнаружения данного нарушения трудовых обязанностей.
Если же работодатель не готов принять решение об увольнении сразу же после обнаружения данного нарушения и истребования объяснений от работника, то в силу ч. 1 ст. 76 ТК РФ он обязан отстранить работника, появившегося в состоянии опьянения, от работы. В этом случае документы, которыми оформлялось отстранение от работы, могут быть представлены в качестве дополнительных доказательств.
В трудовом законодательстве в качестве основного признака грубого нарушения служебных обязанностей, выразившегося в появлении на работе в состоянии опьянения, называется добровольность приведения себя в состояние алкогольного, наркотического или токсического опьянения. Другим признаком выступает прием алкогольных или иных спиртных напитков, наркотических и психотропных препаратов с целью приведения себя в состояние алкогольного опьянения. Например, работник по назначению врача мо-
жет употреблять препараты, содержащие наркотические вещества (не с целью одурманивания, а для снятия боли). Алкогольное, наркотическое или токсическое опьянение также может быть связано с нарушением технологического процесса там, где используются технические спирты, ароматические, наркотические и другие аналогичные вещества. Перечисленные вещества также могут быть употреблены работником по ошибке.
Совершено, очевидно, что появление в состоянии опьянения должно содержать признаки виновного поведения работника в виде умысла или неосторожности. Случайное же опьянение не образует состава правонарушения и, следовательно, не может повлечь увольнения. Если, например, работник, исполняя трудовую функцию, вынужденно вдыхает токсические вещества (формалин и т. д.), не образуется состава дисциплинарного проступка из-за отсутствуя как вины, так и противоправности.
Некоторые авторы, для того чтобы придать исследуемому составу дисциплинарного проступка завершенный вид и поставить всех работников в одинаковое юридическое положение (независимо от содержания правил внутреннего трудового распорядка, трудовых договоров и т. п.), предлагают прямо в Трудовом кодексе предусмотреть запрещение работникам появляться (оставаться) на работе в состоянии опьянения. Этого можно достичь посредством включения новой ч. 3 в ст. 21 ТК РФ («Основные права и обязанности работников»). Пока же без подобной новеллы в России вполне реальны случаи, когда противоправность поведения работников на достаточной формальной основе не установлена, а юридическая ответственность всё-таки наступает. В правовом государстве такого быть не должно [3].
Другой вопрос заключается в том, что даже если работник появился в состоянии опьянения в рабочее время и виновен в таком поведении, то не совсем ясно, что считать опьянением, какие признаки имеет данное состояние?
Так, под состоянием опьянения в медицине понимается совокупность психических, вегетативных и неврологических расстройств, возникающих в результате острого отравления нейротропными веществами и характе-
ризующихся сменой психического возбуждения торможением с явлениями нарастающего оглушения сознания [4]. Основными признаками алкогольного опьянения принято считать такие, как появление блеска в глазах, дрожание рук, запах алкоголя изо рта, несвязная речь, покраснение лица, замедление пульса, нарушение мимики. Признаками наркотического или токсического опьянения обычно считают бледность, расширенные зрачки, учащенное сердцебиение, излишне громкая речь, неадекватность реакции на внешние раздражители.
Но в то же время многие из перечисленных симптомов свойственны не только опьянению, но и ряду других состояний и наблюдаются при сильном волнении, стрессе, высокой температуре, приёме лекарственных средств и т. п. Сам по себе запах алкоголя не свидетельствует об опьянении, так как с медицинской точки зрения первая стадия опьянения наступает лишь при определенной концентрации алкоголя в крови.
Трудовое законодательство, в частности, предусматривает, что увольнение может быть санкцией только за само состояние опьянения, а не за факт употребления спиртных напитков или других средств, пусть даже и на работе. Судебная практика подтверждает, что в отдельных случаях вывод о состоянии опьянения делается исходя из простого наличия алкоголя, наркотических веществ или иных одурманивающих средств, вызывающих опьянение, в организме человека. Хотя между содержанием алкоголя или иных вызывающих опьянение веществ и состоянием опьянения нет прямой связи, тяжесть опьянения зависит от множества иных факторов. Эти обстоятельства наводят на мысль, что необходимо устанавливать наряду с наличием вызывающих опьянение веществ в организме человека и клинические признаки опьянения во всех случаях выявления состояния опьянения.
Как известно, определенные вещества выводятся из организма человека сутками или даже неделями. Более того, при определении состояния алкогольного или иного опьянения с помощью технических средств измерения работодатели забывают, что эти средства допускают определенную погрешность показаний. Всё это несет опасность
признания находящимся в состоянии опьянения лица, в организме которого обнаружены алкоголь, наркотические средства или одурманивающие вещества, при отсутствии нарушений функционального состояния, что идет вразрез с целями проведения медицинского освидетельствования. Тем самым необходимость установления клинических признаков опьянения влечет за собой потребность в их детальной законодательной регламентации применительно к трудовым правоотношениям.
Кроме того, в соответствии с клинической классификацией алкогольного опьянения, принятой в наркологии ещё много лет назад [5], в зависимости от степени интоксикации, выделяются три степени тяжести алкогольного опьянения — легкая, средняя и тяжелая. Субклиническая форма легкой степени алкогольного опьянения, которая во многих странах не исключает вождение транспортных средств и идентифицируется как «отсутствие влияния на психику и поведение», наблюдается при концентрации алкоголя в крови 0,3-0,7 %о. Из этого следует вывод, что состояние лица, при котором концентрация алкоголя в крови составляет менее
0,3 %о, не рассматривается в наркологии как алкогольное опьянение.
Хотелось бы поддержать тех авторов, которые говорят о необходимости замены понятия «состояние алкогольного опьянения», используемого при определении объекта освидетельствования. А вместо термина «нетрезвое состояние» наиболее корректным и отражающим характер производимых действий было бы использование термина «наличие алкоголя в организме» [6].
На практике работодателям достаточно трудно установить факт алкогольного опьянения, особенно при его легкой степени. А распознать наркотическое или токсическое опьянение, в определенных случаях вообще невозможно, поскольку в этих состояниях отсутствует запах алкоголя. Поэтому медицинское освидетельствование очень важная составляющая процедуры увольнения по подп. «б» п. 6. ст. 81 ТК РФ. Однако Постановление Пленума ВС РФ от 17 марта 2004 г. № 2 «О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса РФ» говорит о том, что медицинское заключение не явля-
ется обязательным доказательством, и в суде могут быть использованы и другие виды доказательств, которые должны быть соответственно оценены судом.
В случае обнаружения работника в любом состоянии опьянения работодатель может предложить пройти ему медицинское освидетельствование, но вот обязать его совершить данные действия у него полномочий нет. В случае если работник отказывается проходить медицинский осмотр, об этом должна быть сделана соответствующая пометка в составленном акте. Данный акт составляется в связи с появлением на работе в состоянии опьянения. Составляется он в произвольной форме, однако следующие реквизиты должен содержать обязательно: дата и время составления акта; фамилия, имя, отчество, должность сотрудника; признаки, свидетельствующие о нахождении в состоянии опьянения; вид опьянения; время отстранения от работы и время направления на медицинское освидетельствование, а также отказ от прохождения данной процедуры. Подписать данный акт должны руководитель организации (подразделения) и как минимум два свидетеля.
На сегодняшний день Временная инструкция о порядке медицинского освидетельствования для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения (утв. заместителем Министра здравоохранения СССР 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14) является единственным действующим документом, регулирующим вопросы освидетельствования на предмет опьянения лиц, появившихся в таком состоянии на работе [7]. В этом акте устанавливается, что медицинское освидетельствование производится в специализированных кабинетах наркологических диспансеров (отделений) врачами-психиатрами-наркологами или в лечебнопрофилактических учреждениях врачами-психиатрами-наркологами и прошедшими подготовку врачами других специальностей как непосредственно в учреждениях, так и с выездом в специально оборудованных для этой цели автомобилях. Таким образом, можно сделать вывод, что результаты медицинского освидетельствования могут считаться действительными только при условии, что они были получены в ходе медицинского об-
следования, выполненного в соответствии с Инструкцией.
Хотелось бы порекомендовать работодателям заранее заключать договор с организацией, которая имеет право проводить соответствующее освидетельствование, чтобы потом знать, куда в таких случаях направлять работника. И уж тем более предостеречь их от вызовов нарколога по рекламе в газете или вызовов бригад скорой помощи, которым прямо запрещено проводить такие освидетельствования.
Когда работник, выйдя из состоянии опьянения, явится на работу, необходимо потребовать от него написать объяснительную. Объяснения работника — это обязательный элемент наложения должностного взыскания, так как увольнение согласно ст. 192 ТК РФ является дисциплинарным взысканием за совершение дисциплинарного проступка. Кроме того, они будут нелишним доказательством в случае возникновения спора, поскольку в них сам работник вынужден будет признать, что находился в состоянии опьянения.
В случае отказа работника давать объяснения об этом составляется акт, подписываемый комиссионно руководителем и двумя свидетелями отказа.
После установления факта нарушения трудовых обязанностей и учёта тяжести проступка работодатель издает приказ о привлечении виновного работника к дисциплинарной ответственности. Работника в течение трёх дней с момента издания знакомят с приказом об увольнении под роспись и вручают ему копию приказа (в данной ситуации в случае отказа от подписи об этом составляется акт, подписываемый комиссионно руководителем и двумя свидетелями отказа). Поскольку увольнение является мерой дисциплинарного взыскания, то в соответствии со ст. 193 ТК РФ все эти действия должны быть произведены не позднее одного месяца с момента обнаружения проступка.
Работодателю следует обратить внимание на то, что в приказе необходимо описать, в чем именно выразился дисциплинарный проступок (в данном случае в появлении работника на работе в рабочее время в состоянии алкогольного, токсического или наркотического опьянения), указать срок и место его совершения, а также указать вредные по-
следствия в случае их наступления. В обосновании приказа нужно указать все документы, которые имеются у работодателя в качестве доказательств совершенного деяния -это и служебные записки, и докладные, и осмотр нарколога, различные акты с обязательным указанием номеров и дат.
Для суда обстоятельством, имеющим значение для правильного рассмотрения дел об оспаривании дисциплинарного взыскания или о восстановлении на работе и подлежащим доказыванию работодателем, является представление доказательств, свидетельствующих не только о том, что работник совершил дисциплинарный проступок, но и о том, что при наложении взыскания учитывались тяжесть проступка и обстоятельства, при которых он был совершен, а также предшествующее поведение работника, его отношение к труду.
Приведенный анализ российских правил об увольнении работников за появление на работе в состоянии опьянения указывает на согласие (в целом) с идеей об ограничении прав работодателей на такое прекращение трудового договора. Однако предложение о переносе в российское право действующей во многих западных системах трудового права нормы о том, что алкогольное опьянение влечет увольнение работника только при привычном (систематическом, повторном и т. д.) совершении этого правонарушения, тоже очень сомнительно.
Малоприемлемой для России видится и локальная практика отдельных работодателей в Канаде, которые принимают на себя обязательства вместо увольнения соответствующих работников вводить для них особые программы реабилитации. Нельзя согласиться и с А. М. Котовой-Смоленской, полагающей, что рассматриваемое основание для прекращения трудового договора целесообразно преобразовать из общего в применяемое только для определенных категорий работников [8].
В процессе дисциплинарного производства по факту нахождения работника на рабочем месте в состоянии алкогольного, токсического или наркотического опьянения работодатель должен действовать исключительно в соответствии с законодательством. Любое дисциплинарное взыскание может
быть обжаловано работником в государственной инспекции труда или органах по рассмотрению индивидуальных трудовых споров. И работодателю придется доказывать, что он действовал законно, сообразно обстоятельствам и ни в коей мере не нарушил права работника. Чтобы увольнение не было признано незаконным, надо соблюдать порядок увольнения и собирать все возможные доказательства, подтверждающие факт состояния опьянения на рабочем месте, в том числе медицинское заключение, выданное в установленном порядке, записи камер наблюдения, показания свидетелей и сотрудников и др.
Медицинское освидетельствование на состояние опьянения, проводимое третьими лицами по отношению к сторонам трудового договора, с позиции защиты прав человека и интересов работника более надёжно. Однако в условиях рыночных отношений приходится предполагать, что по мере увеличения спроса эта услуга со стороны третьих лиц может стать дорогостоящей, а значит недоступной для части работодателей. Кроме того, усиление в заданном направлении юридических гарантий для работников может сделать отечественные нормы об отстранении от работы неосуществимыми на практике, что, в свою очередь, способно выступить детерминантой многих опасных нарушений. Ведь по данным Открытого института здоровья в среднем один житель нашей страны выпивает более 15 литров чистого спирта за год. Отечественная статистика пока вуалирует количество спиртного, выпитого перед работой или во время её, но несомненно, что и эта цифра значительна [9].
Безусловным прогрессом было бы введение в Российской Федерации ограничений в допустимости доказательств появления работника на работе в состоянии алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения и установление определенных средств доказывания.
К сожалению, нынешняя ситуация показывает, что при прекращении трудового договора в связи с появлением работника на работе в состоянии опьянения преобладает в основном функция кары, абсолютизация которой не является достойной для работодателей в условиях социального государства.
Представляется, что развитие отечественного 4
трудового права в направлении ограничений в расторжении трудового договора по ини- 5
циативе работодателя при появлении работника на работе в состоянии опьянения должно исходить из целесообразности при увязывании наказания с функциями пресечения и предупреждения дисциплинарных правона- 6
рушений.
1. Трудовой кодекс Российской Федерации от 7
30 декабря 2001 г. № 197-ФЗ (ред. от 29 декабря 2012 г.) // Собрание законодательства
РФ. — 2002. — № 1, ч. 1. — Ст. 3.
2. О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации : Постановление Пленума Верховного Суда РФ
от 17 марта 2004 г. № 2 (ред. от 28 сентября 8
2010 г.) // Российская газета. — 2004. — № 72.
3. Бугров Л. Ю. Увольнения работников в случа-
ях появления на работе в состоянии алко- 9
гольного, наркотического или иного токсического опьянения // Известия вузов. Правове-
дение. — 2009. — № 4. — С. 184-195.
См.: Словарь медицинских терминов. — иКЬ: http://www.magalif.ru/?an=slovar (дата обращения: 10.02.2014).
См., напр.: Кононенко В. И., Сосин И. К., Моисеев В. И., Рудяга А. В., Сгонникова Т. Б. Клиническая и лабораторная диагностика алкогольного опьянения : методические рекомендации. — Харьков, 1984.
Зеренин А. Г., Мостовой С. М. Новое в проведении медицинского освидетельствования для выявления состояния опьянения // Вопросы наркологии. — 2010. — № 6. — С. 56. Временная инструкция о порядке медицинского освидетельствования для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения (утв. Минздравом СССР 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14) (с изм. от 27 июля 2010 г.). — Доступ из справ.-правовой системы «КонсультантПлюс».
Котова-Смоленская А. М. Ограничение права работодателя на прекращение трудового отношения. — М., 2003. — С. 85-88.
Бугров Л. Ю. Увольнения работников в случаях появления на работе в состоянии алкогольного, наркотического или иного токсического опьянения // Известия вузов. Правоведение. — 2009. — № 4. — С. 184-195.
последние изменения и поправки, судебная практика
СТ 81 ГПК РФ
1. В случае оспаривания подлинности подписи на документе или ином письменном доказательстве лицом, подпись которого имеется на нем, суд вправе получить образцы почерка для последующего сравнительного исследования. О необходимости получения образцов почерка выносится определение суда.
2. Получение образцов почерка судьей или судом может быть проведено с участием специалиста.
3. О получении образцов почерка составляется протокол, в котором отражаются время, место и условия получения образцов почерка. Протокол подписывается судьей, лицом, у которого были получены образцы почерка, специалистом, если он участвовал в совершении данного процессуального действия.
Комментарий к Статье 81 Гражданского процессуального кодекса
Комментируемая статья предусматривает правила получения образцов почерка для сравнительного исследования документа и подписи на документе.
Согласно ч. 1 комментируемой статьи, в случае оспаривания подлинности подписи на документе или ином письменном доказательстве лицом, подпись которого имеется на нем, суд вправе получить образцы почерка для последующего сравнительного исследования. О необходимости получения образцов почерка выносится определение суда.
В силу ч. 2 комментируемой статьи, получение образцов почерка судьей или судом может быть проведено с участием специалиста.
О получении образцов почерка составляется протокол, в котором отражаются время, место и условия получения образцов почерка. Протокол подписывается судьей, лицом, у которого были получены образцы почерка, специалистом, если он участвовал в совершении данного процессуального действия (ч. 3 комментируемой статьи).
Отказывая в принятии к рассмотрению жалобы гражданина Я.О.С. на нарушение его конституционных прав ст. 81 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации, Конституционный Суд РФ в Определении от 27 октября 2015 г. N 2480-О указал следующее: «Суд в силу части второй статьи 10 ГПК Российской Федерации, сохраняя независимость, объективность и беспристрастность, осуществляет руководство процессом и создает условия для установления фактических обстоятельств при рассмотрении и разрешении гражданских дел, а в случае возникновения в процессе рассмотрения дела вопросов, требующих специальных знаний в областях науки, техники, искусства, ремесла, — назначает экспертизу (часть первая статьи 79 ГПК Российской Федерации), в том числе почерковедческую, для надлежащего проведения которой необходимо получение образцов почерка лица, подлинность подписи которого на документе или ином письменном документе оспаривается, что является необходимым для достижения задачи гражданского судопроизводства по правильному разрешению гражданских дел (статья 2 ГПК Российской Федерации).
При этом результаты почерковедческой экспертизы не имеют для суда заранее установленной силы и оцениваются им по своему внутреннему убеждению, основанному на всестороннем, полном, объективном и непосредственном исследовании всех имеющихся в деле доказательств; результаты такой оценки суд обязан отразить в решении, в котором приводятся мотивы, по которым одни доказательства приняты в качестве средств обоснования выводов суда, другие доказательства отвергнуты судом, а также основания, по которым одним доказательствам отдано предпочтение перед другими (статья 67 ГПК Российской Федерации). Гарантией процессуальных прав лиц, участвующих в деле, выступают установленные Гражданским процессуальным кодексом Российской Федерации процедуры проверки судебных постановлений вышестоящими судами и основания для их отмены или изменения.
Таким образом, сами по себе положения статьи 81 ГПК Российской Федерации не могут расцениваться как нарушающие конституционные права заявителя, перечисленные в жалобе, в указанном им аспекте» <1>.
———————————
<1> Определение Конституционного Суда РФ от 27 октября 2015 г. N 2480-О.
Использование статьи 81 Закона о психической гигиене в качестве эффективного инструмента Medicaid и имущественного планирования: учебник | Enea, Scanlan & Sirignano, LLP
Автор: Энтони Дж. Энеа, эсквайр. *
В 1993 году, во время вступления в силу статьи 81 Закона о психической гигиене, я сомневаюсь, что более чем горстка адвокатов представляла, в какой степени на нее когда-нибудь будут полагаться как на инструмент планирования Medicaid и имущественного положения для недееспособных. .
В значительной степени, в результате изобретательности и дальновидности законодательной власти, адвокатуры и судебных органов, статья 81, которая предусматривает, среди прочего, назначение Опекуна лица и имущества недееспособного лица, была разработана. в высокоэффективный инструмент Medicaid и имущественного планирования.Независимо от того, разрешают ли суды опекуну отказаться от наследства или передать активы в целях содействия планированию Medicaid, статья 81 играет решающую роль в планировании для недееспособных и его или ее иждивенцев. В идеальном мире все наши клиенты выполнили бы доверенность на медицинское обслуживание, достаточно обширную долгосрочную генеральную доверенность и любые другие расширенные директивы, что, возможно, избавило бы от необходимости в опекуну. Однако в очень многих случаях такого планирования не было.
СТАТЬЯ 81.21. ЗАКОНОДАТЕЛЬНОЕ ПРИЗНАНИЕ
ОБЩЕГО ЗАКОНА О ЗАМЕСТИТЕЛЬНОМ РЕШЕНИИ
Чтобы дать читателю представление о законодательной базе статьи 81, ниже приводится краткое изложение ее положений, которые имеют отношение к полномочиям, предоставленным опекуном, для участия в программе Medicaid и имущественном планировании. Статья 81.21 (a) Закона о психической гигиене (далее «MHL») предусматривает, что Суд может уполномочить Опекуна осуществлять полномочия, необходимые и достаточные для управления имуществом и финансовыми делами для поддержки и содержания недееспособного лица и его иждивенцев. на недееспособного человека.Осуществление полномочий должно соответствовать функциональным ограничениям недееспособного лица и его или ее пониманию последствий и потенциального вреда в результате его или ее неспособности управлять имуществом и финансовыми делами. При осуществлении полномочий Опекун должен учитывать пожелания и предпочтения недееспособного человека и наименее ограничительную форму вмешательства.
Формирование полномочий Хранителя таким образом, чтобы обеспечить «наименее ограничительное вмешательство» в права недееспособного человека, является приоритетом судов.В ходе слушания председательствующий судья нередко спрашивает, гарантируют ли запрошенные полномочия, что запрашиваемое вмешательство является наименее ограничительным. Например, если недееспособное лицо в определенной степени способно управлять своими финансами, Суд может потребовать, чтобы недееспособный имел доступ к ограниченной сумме денег, которая может быть израсходована по его или ее усмотрению.
Статья 81.21 (a) MHL также предусматривает, что переводы могут осуществляться в любой форме, которую недееспособное лицо могло бы использовать, если бы у него или нее была необходимая дееспособность, за исключением исполнения нового завещания или Codicil для недееспособный человек.
Статья 81.21 (a) MHL также предусматривает, что полномочия, которые могут быть предоставлены, включают, но не ограничиваются правом:
1. Делайте подарки;
2. Предоставлять поддержку лицам, находящимся на иждивении недееспособного лица, независимо от того, обязано ли недееспособное лицо оказывать такую поддержку;
3. Передавать или высвобождать условные и ожидаемые интересы в собственности, включая права супружеской собственности и любое право на наследство, присущее совместной аренде или аренде в целом;
4.Осуществление или освобождение от полномочий, принадлежащих недееспособному лицу в качестве доверенного лица, личного представителя, опекуна для несовершеннолетних, опекуна или одаряемого полномочиями по назначению;
5. Заключение договоров;
6. Создавать отзывные или безотзывные имущественные трасты на имущество, которые могут выходить за рамки недееспособности или жизни недееспособного лица;
7. Осуществление опциона недееспособного лица на покупку ценных бумаг или иного имущества;
8. Осуществлять права выбора опционов и смены бенефициаров по страховым полисам и полисам аннуитета и сдавать полисы в обмен на их денежную стоимость;
9.Осуществлять любое право на выборную долю в имуществе умершего супруга недееспособного лица;
10. Отказаться или отказаться от каких-либо интересов посредством наследования по завещанию, без завещания или передачи inter vivos в соответствии с параграфом (c) Раздела 2-1.11 Закона штата Нью-Йорк о сословиях, полномочиях и трастах;
11. Разрешить доступ к конфиденциальным записям или раскрыть их; и
12. Подайте заявку на получение государственных и частных пособий.
Как надлежащим образом отмечено в Комментариях Ревизионной комиссии к Разделу 81.21 MHL, вышеупомянутый список полномочий предназначен, чтобы быть «иллюстративным, а не исключительным». Но что еще более важно, Комиссия правильно признала, что Раздел 81.21 дает статутное признание доктрине общего права «замещенного судебного решения», которая признана судами в Нью-Йорке и других юрисдикциях. Пример использования этой доктрины см. В Matter of Florence, 140 Misc.2d 393, 530 NYS2d 986. Проще говоря, Хранитель, используя полномочия для управления собственностью недееспособного человека, включая право передавать активы недееспособного лица другому лицу, может быть уполномочено совершать действия, которые недееспособное лицо могло бы совершить, если бы у него была возможность сделать это.
Как будет показано ниже, суды Нью-Йорка были чрезвычайно восприимчивы к доктрине «замещающего судебного решения», предоставив Опекунам право передавать активы недееспособного лица при различных обстоятельствах. Однако, прежде чем Опекун получит разрешение на передачу активов своего подопечного, существует несколько факторов, обозначенных в Разделе 81.21 (b), которые должны содержаться в Петиции с просьбой о передаче активов и которые должны быть рассмотрены Судом перед тем, как постановление о запрошенном переводе.
ФАКТОРЫ, РАССМОТРЕННЫЕ СУДОМ
Примером информации, которую необходимо раскрыть в петиции в соответствии с положениями §81.21 (b) MHL, является:
(a) Соответствует ли распоряжение какому-либо известному завещательному плану или образцу даров. Очень важно, чтобы истец, запрашивающий передачу активов, сформулировал все документальные доказательства, содержатся ли они в последней воле, отзывном или безотзывном трасте или в любом другом письменном виде, в котором недееспособный ранее выражал намерение передать свое имущество или активы в способ, который соответствует переводам, запрошенным в Петиции;
(b) выразило ли недееспособное лицо какое-либо намерение, несовместимое с предлагаемым распоряжением;
(c) Занималось ли недееспособное лицо какими-либо значительными подарками или набором подарков до своей недееспособности; и
(d) Имеет ли недееспособное лицо достаточные возможности для вынесения предложенного решения, и если да, то его согласие должно быть приложено к петиции.
В соответствии с положениями Раздела 81.21 (d) ЗДП, при определении того, должен ли Суд одобрить предлагаемую передачу, Суд рассмотрит, среди прочего: (a) наличие у недееспособного лица достаточных возможностей для вынесения предлагаемого решения и если да, было ли согласие; (b) будет ли инвалидность недееспособного лица длительной или кратковременной; (c) могут ли потребности недееспособного лица и его или ее иждивенцев или других лиц, зависящих от него в поддержке, быть удовлетворены за счет активов, оставшихся после предлагаемой передачи; (d) являются ли предлагаемые исполнители передачи естественными объектами награды недееспособного лица; (e) принесут ли предлагаемые переводы налоговую экономию, которая пойдет на пользу подопечному или его или ее иждивенцам; (f) соответствует ли передача известному завещательному плану или схеме даров; и (g) любые другие факторы, которые Суд сочтет важными.
ОБСЛУЖИВАНИЕ ОБРАЩЕНИЯ ПО ЗАИНТЕРЕСОВАННЫМ ЛИЦАМ
Раздел 81.21 (a) MHL конкретно определяет, кому должно быть подано ходатайство о предлагаемом переводе:
(i) Лица, имеющие право на уведомление в соответствии с параграфом один подпункта (d) Раздела 81.07 данной Статьи. Например, супруг (а), если есть, родители, если есть, взрослые дети, если есть, и т.д .; и
(ii) если истцу или опекуну известно, что предполагаемое распределение недееспособного лица определено в разделе 103 Закона о процедурах суррогатного суда, если суд не отменит такое уведомление; и
(iii) если оно известно истцу или опекуну, любое лицо, указанное в последнем завещании или аналогичном документе недееспособного лица в качестве бенефициара, на чьи взгляды или интересы может негативно повлиять средство правовой защиты, запрошенное в петиции.
Очень важно, чтобы поверенный внимательно изучил последнюю волю недееспособных лиц и любые другие документы завещательного характера, оформленные, чтобы определить, на кого будет воздействовать предлагаемая передача. Нет ничего необычного в том, что одна группа лиц является заинтересованными сторонами для целей петиции о назначении опекуна, а другая группа лиц является заинтересованными сторонами для целей петиции о передаче активов. Кроме того, не менее важно определить, является ли какое-либо заинтересованное лицо инвалидом, что потребует назначения Guardian ad Litem для защиты его или ее интересов в отношении предлагаемой передачи.Недавно у меня был опыт работы судебным оценщиком в процессе опекунства, когда бенефициар, названный в Последней воле недееспособного, имел пристрастие к алкоголю. При указанных обстоятельствах в петиции должно быть четко указано, что данное лицо как заинтересованное лицо может быть инвалидом, нуждающимся в Guardian ad Litem. Это существенный факт, который впоследствии может стать проблемой, если он останется нераскрытым.
ТРЕБУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ, КОТОРЫЕ БУДУТ ВЫВЕДЕНЫ СУДОМ ДЛЯ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ЖАЛОБЫ
Раздел 81.21 (e) Закона о психической гигиене уточняет, что до удовлетворения ходатайства о передаче активов недееспособного лица суд должен установить «четкие и убедительные доказательства» и зафиксировать следующие выводы (курсив наш):
1. Недееспособное лицо не обладает необходимыми умственными способностями для совершения действия или действий, на которые было запрошено разрешение, и вряд ли сможет восстановить такую дееспособность в течение разумного периода времени или, если недееспособное лицо обладает необходимой способностью, то, что он или она соглашается с предложенным распоряжением;
2.Компетентный, разумный человек в положении недееспособного лица, вероятно, совершит действие или действует при тех же обстоятельствах; и
3. Недееспособное лицо не проявило намерения, несовместимого с совершением действия или действий, одобрение которых было запрошено в какой-то более ранний момент, когда он или она обладали необходимой дееспособностью или, если такое намерение было проявлено, каковы вероятность того, что он или она изменил бы такое намерение при обстоятельствах, существовавших на момент подачи ходатайства.Ясно, что это фактические вопросы, которые потребуют расследования со стороны адвоката истца.
Совершенно очевидно, что включение законодательным органом судебной доктрины «замещенного судебного решения» в раздел 81.21 (e) (2) MHL было обязательным для того, чтобы позволить как старшему практикующему юристу, так и судебным органам проявлять как можно более творческий и прагматичный подход в отношении передача активов для целей Medicaid и имущественного планирования.
Прежде чем обсуждать некоторые примеры прецедентного права, иллюстрирующие Medicaid и имущественное планирование, которое было разрешено в соответствии с разделом 81.21 MHL, я обращаю ваше внимание на раздел 81.16 (b) MHL и раздел 81.22 MHL, которые уполномочивают Суд направлять или ратифицировать любую сделку для установления защитных механизмов, включая траст (отзывный или безотзывный), который может даже продлить за пределами жизни недееспособного человека. Эти разделы часто игнорируются положениями статьи 81, на которые поверенный может обратить внимание, когда сталкивается с проблемами Medicaid или имущественного планирования недееспособного лица.
СООТВЕТСТВУЮЩЕЕ ДЕЛО ОТНОСИТЕЛЬНО ЗАПРОСОВ О ПЕРЕДАЧЕ АКТИВОВ ОПЕКУНАМИ согласно статье 81
Начиная с 1994 года, начала формироваться готовность судебной власти широко толковать статью 81.Следующие ниже случаи иллюстрируют масштабы и широту признания судебной властью доктрины «замененного судебного решения».
A. Matter of Klapper, N.Y.L.J. 9 августа 1994 г., стр. 26, кол. 1, (Sup. Ct. Kings City). Сын / опекун жительницы дома престарелых (его мать) обратился за разрешением передать большую часть имущества матери (приблизительно 340 000 долларов США) своей семье. Суд постановил, что использование такого планирования Medicaid допустимо с юридической точки зрения и что перевод для целей планирования Medicaid не будет нарушением государственной политики.Вынося свое решение, суд установил, что мать имела «обширную историю» постоянного оказания финансовой поддержки своему сыну и его семье. Суд отметил, что годовые расходы семьи сына составляли примерно 62 400 долларов США, однако годовой доход семьи сына составлял примерно 43 000 долларов США, что составляет дефицит в 19 000 долларов США в год или 1500 долларов США в месяц.
Суд установил, что нет никаких сомнений в том, что использование такого планирования Medicaid компетентными лицами допустимо с юридической точки зрения и что надлежащее планирование приносит пользу их владениям.Суд постановил, что переводы для целей планирования Medicaid не нарушают государственной политики. Скорее всего, цель статьи 81 — разрешить такую передачу. Суд считает, что основная политика, лежащая в основе статьи 81, заключается в том, чтобы помочь недееспособному лицу компенсировать его или ее ограничения и предоставить наименее ограничительную альтернативу. Для реализации этой политики недееспособному лицу должно быть разрешено иметь те же возможности, что и для передачи собственности, которые аналогичным образом доступны для компетентных лиц.
B. Дело Купера (Дэниэлс), 162 Misc.2d 840, 618 N.Y.S.2d 499, 1994 (Suffolk City). Сестра / опекун недееспособного лица добивалась разрешения (а) отказаться от доли своего подопечного в имуществе его покойной жены, (б) передать активы с банковского счета двум детям подопечного в возрасте 20 и 23 лет и (в) передать недвижимость подопечной ее 20-летнему ребенку. Суд постановил, что «компетентный, разумный человек… предпочел бы, чтобы его имущество перешло к его ребенку, а не служило для оплаты счетов по программе Medicaid и по уходу в доме престарелых, если есть выбор».Суд также установил, что отказ некомпетентному лицу через ее опекуна в тех же правах на планирование Medicaid, которые доступны любому компетентному лицу в штате Нью-Йорк, приведет к результату, прямо противоречащему выраженному намерению «статьи 81. ”
Суд удовлетворил запрошенный отказ и передачу активов, при этом потребовав удержания достаточных средств в рамках опекунства для оплаты ухода в доме престарелых в течение штрафного периода Medicaid.Суд также разрешил передачу недвижимости 20-летнему ребенку на основании статьи 366 (5) (d) (3) (I) (B) Закона о социальных услугах, которая разрешает передачу дома ребенку в возрасте до 2 лет. 21, не влияя отрицательно на право на участие в программе Medicaid.
C. Matter of Parnes, N.Y.L.J. 2 ноября 1994 г., стр. 32, кол. 2 (Sup. Ct., Kings City). Заявитель запросила разрешение на перевод 150 000 долларов в виде ликвидных активов недееспособной жительницы дома престарелых ее мужу, у которого были ликвидные активы на общую сумму 345 000 долларов, а также на передачу доли недееспособного лица в совместном доме (110 000 долларов).Суд постановил, что перевод поможет мужу в покрытии его собственных домашних и медицинских расходов, а также в предоставлении его недееспособному супругу услуг и предметов, не покрываемых программой Medicaid. Суд удовлетворил ходатайство даже при отсутствии каких-либо доказательств того, что Опека когда-либо способствовала поддержке ее мужа, а также при отсутствии каких-либо доказательств того, что она делала подарки. Суд также отметил, что отказ мужа от супруга не является нарушением государственной политики.
D. Дело ДаРонко, 167 Разное.2d 140, 638 NYS 2d 275 (1995) Консерватор / жена недееспособного супруга стремилась преобразовать опекунство в опекунство и разрешить передачу всего недееспособного супруга ей самой, а затем осуществить «супружеский отказ», когда подача заявки на Медикейд. Суд удовлетворил ходатайство о преобразовании опекунства в опеку и санкционировал запрошенные переводы. Суд постановил, что стоимость ухода в палате в доме престарелых превышает ежемесячный доход палаты и в конечном итоге приведет к истощению всего его состояния менее чем за семь лет.Суд также постановил, что «растрата» имущества недееспособного лица в конечном итоге оставит его жену / опекуна и несовершеннолетнего сына без средств к существованию. Суд также отметил, что, поскольку предлагаемые переводы будут осуществляться супругу, налоги на дарение будут исключены, и не будет начислен штрафной период Medicaid из-за того, что супруга / опекун ссылается на свои права на отказ супруга в соответствии с разделом 366 (3) Закона о социальных услугах. ) (а).
E. Matter of Baird, 167 Misc. 2d 526.634 N.Y.S., 2d 971, (1995).Предлагаемый опекун стремился отказаться от части интереса недееспособного человека к имуществу умершего друга для целей планирования Medicaid. Суд постановил, что Департамент социальных услуг штата Нью-Йорк не являлся необходимой стороной в разбирательстве по статье 81. Суд сослался на MHL ‘81 .07 (d) (1) (viii) как указание на то, что местный департамент социальных услуг, а не государственный департамент социальных услуг, является стороной, имеющей право на уведомление о судебном разбирательстве.
Суд постановил, что Опекун в соответствии со статьей 81 имеет право отказаться от части интереса недееспособного лица в имуществе умершего друга, чтобы предоставить средства для оплаты расходов на дом престарелых в течение «штрафного периода» Medicaid, при этом разрешая оставшиеся средства передать ее детям и не использовать на расходы дома престарелых.Суд выразил мнение, что компетентное разумное лицо сделает отказ и что лицо, участвующее в разбирательстве по статье 81, должно иметь те же возможности, что и компетентное лицо, имеющее активы. Опять же, явная ссылка на доктрину «замещающего суждения».
F. Matter of Shah, 95 NY 2d 148, 711 NYS2d 824 (8.06.2000) Апелляционный суд подтвердил решение Апелляционного отделения 2-го департамента, которое уполномочило опекуна / супругу передать ей все активы ее недееспособного супруга с целью позволить ей затем осуществить отказ от супруга и дать своему супругу право на Медикейд, а также чтобы иметь возможность отказаться от использования этих активов для поддержки своего супруга.
G. Дело Кристин Бэнкс, Sup. Кт. Нью-Йорк, 14.06.2000 — Нью-Йорк (27.06.2000). Суд разрешил опекуну недееспособной жительницы дома престарелых, у которой был большой накопленный долг, передать половину из 164 000 долларов США ее запоздало обнаруженных активов в объединенный траст в соответствии с Законом о социальных услугах ‘366.2 (b) (2) ( iii) (B).
‘366.2 Закона о социальных услугах разрешает создание объединенного траста для недееспособного лица, который финансируется за счет половины его активов.Другая половина расходуется, и тогда человек имеет право на участие в программе Medicaid.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По мере того, как поколение бэби-бумеров, членом которого я являюсь, достигает совершеннолетия и начинает сталкиваться со всеми медицинскими и физическими проблемами, связанными со старением, я уверен, что использование статьи 81 и ее прецедентного права будет возрастать с увеличением частота. Продолжающийся творческий подход к закону старшего поколения в сочетании с готовностью судебных органов широко интерпретировать статью 81, а доктрина «замещающего судебного решения» поможет гарантировать, что права недееспособных никоим образом не ущемляются.
Я уверен, что обязательство коллегии адвокатов защищать права недееспособного человека будет и дальше обеспечивать жизнеспособность статьи 81 как эффективного инструмента Medicaid и имущественного планирования.
Выбросы летучих органических веществ от дистилляции и пиролиза растительности
13 января 2006 г.
13 января 2006 г.
Дж.П. Гринберг, Х. Фридли, А. Б. Гюнтер, Д. Хэнсон, П. Харли и Т. Карл J. P. Greenberg et al. Дж. П. Гринберг, Х. Фридли, А. Б. Гюнтер, Д. Хэнсон, П. Харли и Т. Карл- Национальный центр атмосферных исследований, Боулдер, Колорадо, 80307-3000, США
- Национальный центр атмосферных исследований, Боулдер, Колорадо, 80307-3000, США
Листовая и древесная ткань растений ( Pinus ponderosa , Eucalyptus saligna , Quercus gambelli , Saccharum officinarum и Oriza sativa ) были нагреты от 30 до 300 ° C и были идентифицированы летучие органические соединения (ЛОС). и количественно.Основные выбросы ЛОС были в основном насыщенными кислородом и включали уксусную кислоту, фурилальдегид, ацетол, пиразин, терпены, 2,3-бутадион, фенол и метанол, а также меньшие выбросы фурана, ацетона, ацетальдегида, ацетонитрила и бензальдегида. Общие выбросы ЛОС от дистилляции и пиролиза составляли порядка 10 гС / кгС сухого веса растительности, что составляет целых 33% и 44% измеренных выбросов CO 2 (гС (ЛОС) / гС (CO 2 )). в тех же экспериментах в атмосфере воздуха и азота соответственно.
Выбросы идентичны и по количеству, чем выбросы от тлеющего горения древесной ткани, и отличаются по своему характеру от выбросов при горении пламенем. Выбросы ЛОС в результате перегонки бассейнов и эндотермического пиролиза в условиях низкой турбулентности могут создавать легковоспламеняющиеся концентрации возле листьев и могут способствовать распространению лесных пожаров. Выбросы ЛОС от производства древесного угля также связаны с дистилляцией и пиролизом; выбросы высокореактивных летучих органических соединений при производстве столь же велики, как и выбросы окиси углерода.
Закон о правах человека Канады
Краткое название
Примечание на полях: Краткое название
1 Этот Закон может именоваться как Закон о правах человека Канады .
Цель Закона
Примечание на полях: Цель
2 Цель этого Закона состоит в том, чтобы расширить действие законов в Канаде, чтобы в рамках вопросов, относящихся к законодательной власти Парламента, действовать в соответствии с принципом, согласно которому все лица должны иметь возможность наравне с другими людьми зарабатывать себе жизнь, которую они могут и хотят иметь, и чтобы их потребности были удовлетворены в соответствии с их обязанностями и обязательствами как членов общества, без каких-либо препятствий или препятствий со стороны дискриминационная практика по признаку расы, национального или этнического происхождения, цвета кожи, религии, возраста, пола, сексуальной ориентации, гендерной идентичности или выражения, семейного положения, семейного положения, генетических характеристик, инвалидности или осуждения за преступление, за которое было дано помилование, или в отношении которого было приказано приостановить запись.
- Р.С., 1985, с. Н-6, с. 2
- 1996, г. 14, с. 1
- 1998, г. 9, с. 9
- 2012, г. 1, с. 137 (E)
- 2017, с. 3, сс. 9, 11, с. 13, с. 1
ЧАСТЬ I Запрещенная дискриминация
Общее
Примечание на полях: Запрещенные основания дискриминации
3 (1) Для всех целей настоящего Закона запрещенными основаниями дискриминации являются раса, национальное или этническое происхождение, цвет кожи, религия, возраст, пол, сексуальная ориентация, гендерная идентичность или самовыражение, семейное положение, семейное положение, генетические характеристики, инвалидность и осуждение за правонарушение, за которое было помиловано или в отношении которого было принято решение о приостановлении записи.
Примечание на полях: То же
(2) Если основанием для дискриминации является беременность или рождение ребенка, считается, что дискриминация имеет место по признаку пола.
Примечание на полях: То же
(3) Если основанием для дискриминации является отказ в просьбе пройти генетический тест или раскрыть или разрешить разглашение результатов генетического теста, дискриминация будет считаться быть на основании генетических характеристик.
- р.С., 1985, с. Н-6, с. 3
- 1996, г. 14, с. 2
- 2012, г. 1, с. 138 (E)
- 2017, с. 3, сс. 10, 11, с. 13, с. 2
Маргинальное примечание: множественные основания для дискриминации
3,1 Для большей определенности дискриминационная практика включает практику, основанную на одном или нескольких запрещенных основаниях дискриминации или в результате сочетания запрещенных оснований.
Маргинальное примечание: Приказы о дискриминационной практике
4 Дискриминационная практика, как описано в разделах 5–14.1, может быть предметом жалобы в соответствии с Частью III, и любое лицо, уличенное в причастности или участии в дискриминационной практике, может быть подвергнуто судебному приказу, как это предусмотрено в разделе 53.
- R.S., 1985, c. Н-6, с. 4
- 1998, г. 9, с. 11
- 2013, г. 37, с. 1
Дискриминационная практика
Пограничное примечание: отказ в предоставлении товара, услуги, объекта или жилья
5 Это дискриминационная практика при предоставлении товаров, услуг, помещений или жилья, обычно доступных для широкой публики
(a ) Для отказа или отказа в доступе к любому такому товару, услуге, объекту или жилью любому лицу, или
(b) для проведения неблагоприятной дифференциации по отношению к любому человеку,
на запрещенном основании дискриминации .
Маргинальное примечание: отказ в предоставлении коммерческих помещений или жилых помещений
6 Это дискриминационная практика при предоставлении коммерческих помещений или жилых помещений
(a) отказ в предоставлении таких помещений или жилых помещений любому лицу, или
(б) для проведения неблагоприятной дифференциации по отношению к любому человеку,
по запрещенному признаку дискриминации.
Маргинальное примечание: занятость
7 Это дискриминационная практика, прямо или косвенно,
(a) отказ в приеме на работу или продолжение приема на работу любого лица, или
(b) в ходе трудоустройство, чтобы дифференцировать неблагоприятное положение по отношению к работнику,
на запрещенном основании дискриминации.
- 1976-77, г. 33, с. 7
- 1980-81-82-83, г. 143, с. 3 (Ф)
Маргинальное примечание: Заявления о приеме на работу, объявления
8 Это дискриминационная практика
(a) использование или распространение любой формы заявления о приеме на работу, или
(b) в связи с трудоустройством или перспективой трудоустройство, публикация любой рекламы или письменный или устный запрос
, который выражает или подразумевает какие-либо ограничения, спецификации или предпочтения, основанные на запрещенном основании дискриминации.
Маргинальное примечание: Организации сотрудников
9 (1) Это дискриминационная практика для организации сотрудников по запрещенному признаку дискриминации
(а) исключение лица из полноправного членства в организации;
(б) исключить или приостановить членство в организации; или
(c) ограничивать, разделять, классифицировать или иным образом действовать в отношении лица таким образом, чтобы лишить человека возможностей трудоустройства, или ограничить возможности трудоустройства, или иным образом отрицательно повлиять на статус человека, если физическое лицо является членом организации или если какие-либо обязательства организации в соответствии с коллективным договором относятся к физическому лицу.
(2) [признана недействительной, 2011, c. 24, с. 165]
(3) [признана недействительной, 1998, c. 9, с. 12]
- Р.С., 1985, с. Н-6, с. 9
- 1998, г. 9, с. 12
- 2011, г. 24, с. 165
Маргинальное примечание: дискриминационная политика или практика
10 Это дискриминационная практика для работодателя, организации сотрудников или организации работодателей
(a), чтобы установить или проводить политику или практику, или
(b ) Для заключения соглашения, касающегося приема на работу, направления, приема на работу, продвижения по службе, обучения, ученичества, перевода или любых других вопросов, связанных с трудоустройством или будущей занятостью,
, которое лишает или имеет тенденцию лишать человека или группу лиц любой работы возможности по запрещенному признаку дискриминации.
- Р.С., 1985, с. Н-6, с. 10
- 1998, г. 9, с. 13 (E)
Маргинальное примечание: Равная заработная плата
11 (1) Установление или поддержание различий в заработной плате между работниками мужского и женского пола, работающими в одном учреждении и выполняющими работу равной ценности, является дискриминационной практикой.
Примечание на полях: Оценка стоимости работы
(2) При оценке стоимости работы, выполненной сотрудниками, работающими в одном и том же учреждении, критерий, который должен применяться, представляет собой совокупность навыков, усилий и ответственности, требуемых в выполнение работы и условия, в которых она выполняется.
Маргинальное примечание: отдельные предприятия
(3) Отдельные предприятия, созданные или поддерживаемые работодателем исключительно или в основном с целью установления или поддержания разницы в заработной плате между работниками мужского и женского пола, считаются для целей данного раздела быть тем же заведением.
Маржинальное примечание: разная заработная плата на основе установленных разумных факторов
(4) Несмотря на положения пункта (1), не является дискриминационной практикой выплачивать разную заработную плату сотрудникам-мужчинам и женщинам, если разница основана на факторе, установленном руководящие принципы, выпущенные Канадской комиссией по правам человека в соответствии с подразделом 27 (2), чтобы быть разумным фактором, оправдывающим различие.
Примечание на полях: То же
(5) Для большей уверенности пол не является разумным фактором, оправдывающим разницу в заработной плате.
Примечание на полях: без снижения заработной платы
(6) Работодатель не должен снижать заработную плату с целью устранения дискриминационной практики, описанной в этом разделе.
Определение заработной платы
(7) Для целей данного раздела заработная плата означает любую форму вознаграждения, выплачиваемого за работу, выполняемую физическим лицом, и включает
(а) заработную плату, комиссионные, отпуск выплату, увольнение заработной платы и премий;
(б) разумная стоимость питания, аренды, жилья и проживания;
(в) натуральные платежи;
(d) взносы работодателя в пенсионные фонды или планы, планы долгосрочной нетрудоспособности и все формы планов медицинского страхования; и
(e) любое другое преимущество, полученное прямо или косвенно от работодателя физического лица.
ОБНОВЛЕНИЕ Сводки 8-й Бундеслиги | Reuters
, 14 августа (OPTA) - Итоги Бундеслиги в субботу (время начала - центральноевропейское время)
Вольфсбург (1) 1
Голы: У. Вегхорст 22
Неудачный пенальти: В. Вегхорст 5
Используемые запасные: Marmoush 70 (Steffen), Guilavogui 81 (Schlager),
Герхардт 81 (Филипп), Мехмеди 87 (Руссильон)
Бохум (0) 0
Красная карточка: Теще 4
Желтая карточка: Лейч 29, Рекшбекай 88
Использованные запасные: Пантович 46 (Асано), Бокхорн 78 (Гамбоа),
Ганвула 89 (Лампропулос)
8536 зрителей
Судья: Фрэнк Вилленборг
................................................... ..............
Юнион Берлин (1) 1
Голы: Т. Авони 7
Используемые запасные: Voglsammer 63 (Awoniyi), Öztunali 64
(Ingvartsen), Teuchert 73 (Kruse), Behrens 81 (Haraguchi),
Райерсон 82 (Триммель)
Байер Леверкузен (1) 1
Голы: М. Диаби 12
Желтая карточка: Диаби 28
Использованные запасные: Paulinho 76 (Amiri), Pohjanpalo 89 (Schick),
Baumgartlinger 89 (Palacios)
Посещаемость: 11000
Судья: Тобиас Райхель
................................................... ..............
Штутгарт (2) 5
Голы: В. Эндо 30, П. Клемент 36, М. Кемпф 55, Х. Ал
Ghaddioui 61, M. Kempf 76
Используемые запасные: Klement 9 (Каразор), Sankoh 65 (Al Ghaddioui),
Дидави 65 (Климович), Томми 69 (Санко)
Гройтер Фюрт (0) 1
Голы: Дж. Левелинг 90 + 3
Желтая карточка: Сегуин 53
Использованные запасные: Sarpei 58 (Seufert), Abiama 59 (Nielsen), Fein 70
(Зеленый), Левеллинг 85 (Хргота)
Посещаемость: 18 109
Судья: Феликс Цвайер
................................................... ..............
Аугсбург (0) 0
Желтая карточка: Гувелеув 89
Использованные запасные: Maier 59 (Morávek), Caligiuri 64 (Hahn),
Грегорич 64 (Дженсен), Саренрен Бази 81 (Варгас),
Педерсен 82 (Яго)
Хоффенхайм (1) 4
Голы: Я. Бруун Ларсен 37, С. Адамян 78, Г. Руттер 87, С.
Руди 90 + 5
Желтая карточка: Раум 20, Руди 62
Использованные запасные: Джон 52 (Раум), Адамян 59 (Бруун Ларсен),
Гачинович 59 (Даббур), Самассеку 73 (Акпогума), Руттер 74
(Баумгартнер)
9124 зрителя.
Судья: Брыч Феликс
................................................... ..............
Арминия Билефельд (0) 0
Желтая карточка: Приетль 16, Лаурсен 30, Клос 89
Используемые запасные части: Hack 67 (Okugawa), De Medina 77 (Laursen), фургон.
дер Хорн 77 (Нильссон), Крюгер 77 (Ласме), Серра 90 (Клос)
Фрайбург (0) 0
Желтая карточка: Кейтель 34, Гульде 37, Хёфлер 75, Демирович 93
Использованные запасные: Heintz 62 (Gulde), Santamaría 70 (Keitel), Sallai
70 (Чон Ву-Ён), Демирович 85 (Грифо), Хаберер 85
(Хёлер)
13 750 зрителей.
Судья: Свен Яблонски
................................................... ..............
Боруссия Дортмунд (3) 5
Голы: М. Реус 23, Т. Азард 32, Э. Хааланд 34, Г. Рейна
58, E. Haaland 70
Используемые запасные: Malen 73 (Hazard), Delaney 73 (Bellingham),
Пападопулос 78 (Витсель), Тиггес 87 (Рейна), Мукоко 87
(Реус)
Айнтрахт Франкфурт (1) 2
Голы: Ф. Пасслак 27ог, Ж. Хауге 86
Используемые запасные: Lenz 46 (Ilsanker), Lindstrøm 46 (Barkok), Hauge
46 (Камада), Хрустич 69 (Хасебе), Аче 86 (Костич)
Посещаемость: 25000
Судья: Тобиас Стилер
................................................... ..............
Воскресенье, 15 августа - матчи (CET / GMT)
Майнц 05 - РБ Лейпциг (1530/1330)
Кёльн - Герта (1730/1530)
Frontiers | Защитный антиген P1 gp41 оболочки ВИЧ-1 действует как адъювант слизистой оболочки, стимулирующий врожденный иммунитет
Введение
Хотя большинство патогенов человека инициируют инфекцию на участках слизистой оболочки, пока создано лишь несколько лицензированных вакцин для слизистой оболочки (1). Интраназальная иммунизация, индуцирующая антиген-специфический иммунитет как в слизистой оболочке, так и в системных компартментах, и применяемая атравматичным образом после измельчения в порошок, в настоящее время считается идеальной стратегией для предотвращения проникновения патогенов в слизистую оболочку (2–4).Следует отметить, что ранние побочные эффекты, связанные с назальной иммунизацией, включая паралич лицевого нерва, больше не вызывают беспокойства, поскольку они связаны со специфическим адъювантом на основе АДФ-рибозилирующего токсина, используемым в этих исследованиях, а не с путем назальной иммунизации (4–2). 6). Иммунизация слизистой оболочки сильно разделена на уникальные пути, связывающие индуктивный и эффекторный сайты (2, 3). В частности, назальная вакцинация вызывает ответные реакции антиген-специфических антител в половых путях (7) и, следовательно, может быть полезной для предотвращения передачи патогенов, передаваемых половым путем.Тем не менее, были предприняты очень ограниченные усилия, чтобы понять механизмы, с помощью которых назальные вакцины и специальные адъюванты активируют местный назальный врожденный и адаптивный иммунитет в качестве первого шага к созданию эффективной вакцинации.
P1 представляет собой консервативный пептид из 35 аминокислот, покрывающий проксимальную внешнюю область мембраны (MPER) субъединицы оболочки gp41 ВИЧ-1 (8, 9). MPER является основной мишенью для широко нейтрализующих антител и, таким образом, очевидно, очень интересной мишенью для вакцины против ВИЧ-1.Кроме того, P1 опосредует трансцитоз слизистой оболочки ВИЧ-1, основной путь проникновения ВИЧ-1 в слизистую оболочку, путем взаимодействия с галактозилцерамидом (GalCer), рецептором слизистой оболочки ВИЧ-1 (9-11). Соответственно, мы недавно оценили защитную эффективность вакцины gp41-субъединица-виросома на участках слизистой оболочки у нечеловеческих приматов (8). Эта вакцина, в которой P1 использовался в качестве антигена, связанного с виросомами, носителя вакцины без адъюванта, применялась дважды внутримышечно с последующими двумя интраназальными введениями.В модели приматов полная защита после многократных вагинальных провокаций вирусом иммунодефицита обезьян-человека (SHIV) коррелировала с P1 / gp41-специфическими цервиковагинальными антителами, с IgA, блокирующими трансцитоз, и IgG, опосредующими антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Напротив, у защищенных животных сывороточные IgG полностью лишены противовирусной активности. Кроме того, в ходе клинических испытаний фазы I мы обнаружили, что вакцинация P1-виросомой индуцировала P1-специфические антитела слизистой оболочки с противовирусной активностью (12).Эти результаты подчеркнули критическую роль антител слизистых оболочек как первой линии защиты от проникновения вируса.
Тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) представляет собой IL-7-подобный цитокин, который рассматривается как главный регулятор воспалительных реакций Т-хелпера 2 (Th3) путем прайминга дендритных клеток (ДК), особенно слизистых (13, 14). Мы и другие недавно сообщили, что TSLP секретируется эпителиальными клетками во время передачи ВИЧ-1 через слизистую оболочку после взаимодействия вирусной оболочки с эпителиальными клетками (15, 16).В свою очередь, TSLP химиотерапевтически привлекает DC слизистой оболочки к компартменту слизистой оболочки (16), предполагая, что TSLP может модулировать иммунный ответ слизистой оболочки после вакцинации слизистой оболочки. Соответственно, в исследовании с использованием gp140 оболочки ВИЧ-1 в качестве антигена TSLP действует как сильный адъювант слизистой оболочки на мышиной модели (17). TSLP вызывал сильный гуморальный ответ как в сыворотке, так и на генитальном уровне после интраназальной иммунизации, сравнимый с адъювантным эффектом холерного токсина (CT), испытанного параллельно. Кроме того, новое исследование показало, что полностью транс-ретиноевая кислота (RA) проявляет адъювантную активность за счет продукции TSLP (18).Кроме того, недавнее исследование показало, что TSLP и TSLP-рецептор (TSLP-R) были активированы в DC слизистой оболочки мышей, иммунизированных через нос пневмококковым поверхностным белком A плюс CT (19), а у мышей с нокаутом TSLP-R специфический IgA ответ заметно снижен. Это указывает на то, что TSLP и его рецептор вносят основной вклад в адъювантный эффект CT на слизистых оболочках и что передача сигналов TSLP-TSLP-R имеет решающее значение для выявления IgA.
В настоящем исследовании мы исследовали, может ли P1, помимо того, что он является антигеном, действовать как адъювант, сначала исследуя его способность стимулировать эпителиальную продукцию TSLP.Затем мы оценили дополнительные иммуномодулирующие эффекты P1 на моделях слизистой оболочки носа человека, включая продукцию цитокинов и хемокинов, внутриклеточные сигнальные пути, активацию DC слизистой оболочки, пролиферацию Т-клеток и антиген-специфические B-клеточные ответы против модельного антигена in vitro. В целом, мы сообщаем об иммунологических механизмах, лежащих в основе P1-вакцины, и о потенциале P1 в качестве адъюванта слизистой оболочки носа.
Материалы и методы
Пептиды
Пептид P1 (аминокислотные остатки 650–685) получают из субъединицы оболочки gp41 ВИЧ-1.Клады Р1 B (SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK) происходит из изолята клады B HXB2; Кладу А Р1 (SQIQQKKNEQDLLALD KWANLWNWFDISNWLWYIR) из изолята клады А 99UGA07072 и кладу С Р1 (SQTQQEKNEQELLALDSWKNLWNWFSITNWLWYIK) из изолята клады С50 Bw296. P1W представляет собой вариант P1 клады B с мутацией W666G и P1–5W со всеми пятью W, мутированными в G. Последовательность скремблирующего пептида включает тот же набор аминокислот, что и в кладе B P1, но организованный случайным образом (9). Пептиды были синтезированы с чистотой> 95% компанией Biopeptide Co., Inc (Сан-Диего, Калифорния) или United BioSystems (Вирджиния, США).
Клетки
Назальные клетки RPMI 2650 (выделенные из носовой перегородки человека, плоскоклеточный рак, АТСС) выращивали в MEM α (Minimum Essential Medium α , Thermo Fisher) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). , Eurobio, Courtaboeuf, Франция) и 1% пенициллин / стрептомицин.
Первичные эпителиальные клетки носа человека (HNEC, приобретенные у PromoCell, Гейдельберг, Германия) выделяли из носовой перегородки или аденоидов здоровых доноров.Были получены клетки от двух независимых доноров. HNEC культивировали в базальной среде эпителиальных клеток дыхательных путей (PromoCell) и дополняли SupplementMix для роста эпителиальных клеток дыхательных путей (PromoCell), и использовали только клетки из пассажей 2-6.
ДК, происходящие из моноцитов (ДК), были получены из первичных моноцитов человека, полученных из РВМС (чистота> 98%), как описано (11, 20). Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) были отделены от крови здоровых доноров (EFS, Париж, Франция), и моноциты были очищены от PBMC путем отрицательной селекции в соответствии с инструкциями производителя (StemCell Technologies, Франция).DC были получены путем инкубации моноцитов в течение 7 дней в полной среде, содержащей GM-CSF (100 нг / мл) и IL-4 (10 нг / мл).
Аутологичные CD4 + Т-клетки были очищены от PMBC путем отрицательной селекции в соответствии с инструкциями производителя (StemCell Technologies, Франция) (чистота> 95%).
Количественная ОТ-ПЦР для TSLP
Экспрессия короткой и длинной формы TSLP количественно определялась, как описано (21, 22). Вкратце, тотальную РНК экстрагировали с использованием Trizol. Пятьсот нанограмм РНК обрабатывали ферментом ezDNase (Thermo Fisher) для удаления геномной ДНК и обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора SuperScript IV VILO Master Mix в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher).Количественную ПЦР выполняли с использованием указанных праймеров (21) и PowerUp SYBR Green Master Mix в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher). Реакции проводили в трех повторах с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH) в качестве внутреннего контроля. Амплификацию, сбор данных и анализ проводили с использованием программного обеспечения LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany). Уровни мРНК TSLP были нормализованы к уровням GAPDH с использованием метода ΔCt (23) и представлены как 2 — ΔCt значений.
MicroRNA Microarray Analysis
Конфлюэнтные HNEC в 12-луночных планшетах стимулировали средой или P1 (кладка B, 125 мкМ) в течение 6 часов при 37 ° C. Тотальную РНК экстрагировали с помощью Trizol. Перед анализом активацию РНК lfTSLP подтверждали с помощью кПЦР, как описано выше, и оценивали качество РНК с помощью биоанализатора Agilent 2100 в соответствии с инструкциями производителя (Agilent Technologies). Три необработанных и обработанных парных образца из трех независимых экспериментов были проанализированы с помощью GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix, Thermo Fisher), содержащие зонды для 2578 зрелых микроРНК человека и 2025 преждевременных микроРНК (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/miRNA_4-0_and_4-1_datasheet.pdf). Потенциальные мишени для микроРНК анализировали с помощью программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Qiagen).
MiR-4485 Количественное определение и нокдаун
Количественное определение и нокдаун микроРНК проводили, как описано ранее, с некоторыми модификациями (16). Вкратце, тотальную РНК очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR Purification Kit (Qiagen), уровень экспрессии miR-4485 количественно определяли с помощью анализа малых РНК TaqMan (Thermo Fisher).Реакции проводили в трех повторностях, и U6 использовали в качестве эндогенного контроля. Чтобы подавить miR-4485, 70% конфлюэнтных клеток HNEC трансфицировали ингибитором анти-miR-4485 (67 нМ, Qiagen) или ложным ингибитором (отрицательный контроль ингибитора miSCRIPT, 67 нМ, Qiagen) с использованием липофектамина RNAiMAX (Invitrogen) в качестве описан производителем. Через 36 часов после трансфекции экспрессия miR-4485 при количественной оценке, как описано выше, была снижена на 50-60% в клетках, трансфицированных анти-miR-4485, по сравнению с контролем против miR (n = 3 независимых эксперимента).
Ингибиторы передачи сигналов
Конфлюэнтные клетки HNEC в 24-луночном планшете предварительно инкубировали с ингибиторами в течение 1 ч при 37 ° C перед обработкой P1. Ингибиторы, а именно дексаметазон (Dex), NF- κ B и ингибитор MAPK (используемый в концентрации 100 нМ), и циклоспорин A (CsA), ингибитор кальциневрина (используемый в концентрации 1,5 мкМ), были от Invivogen и использовались в рекомендованных производителем концентрациях. . ENMD-1068 (антагонист PAR-2, Enzo Life Science) использовали в концентрации 50 мкг / мл, как описано (24, 25).
Измерение кальция
70–80% конфлюэнтные клетки RPMI 2650 или HNEC в 24-луночных планшетах загружали 2 мМ Fura-2 / AM (Molecular Probes) в базальной среде без сыворотки / факторов роста в течение 1 часа при 37 ° C. .Клетки дважды промывали физиологическим раствором млекопитающих (26) и измерения проводили в полной среде, снабженной HEPES (10 мМ) и CaCl 2 (2 мМ), как описано (26). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Observer Z1, Zeiss, Германия) и анализировали с помощью программного обеспечения MetaMorph (27). Содержание кальция измеряли каждые 5 с с помощью видеофлуоресцентной визуализации. Результаты были выражены как отношение флуоресценции от 340 нм к 380 нм и нормализованы к исходному уровню, , то есть отношение в нулевой момент времени было установлено как 1.
Цитокины и количественное определение хемокинов
TSLP, IL-25 / IL-17E, IL-33, IFN-γ , IL-10, IL-12 / 23p40, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, MMP-9, IL-8 / CXCL8, MIP-3 α / CCL2, MCP-1 / CCL20, MDC / CCL22, TARC / CCL17, APRIL и BAFF измеряли в супернатантах культур. из указанных экспериментов с пользовательскими мультиплексными анализами Luminex (Bio-techne) в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, указанный TSLP измеряли в супернатантах культур с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с пределом обнаружения 8 пг / мл (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя.
Совместное культивирование DC – EC и активация DC
Были разработаны три системы культивирования DC. Полученные из моноцитов ДК (5 × 10 5 клеток) инкубировали в течение 24 часов только в среде и рассматривали как немлизистые ДК (ДК) или совместно культивировали с монослоем назальных эпителиальных клеток (линия клеток RPMI-2650) в 24-луночном слое. планшет (системы DC – EC или eduDC в течение 24 ч при 37 ° C. В свою очередь, DC либо дополнительно культивировали с EC во время стимуляции P1 (DC – ECs), либо отделяли от EC и переносили в новый планшет (eduDC) для дальнейшего P1 лечение.Затем к каждой из культур DC, DC-EC или eduDCs добавляли P1 (кладу B, 125 мкМ) или среду на 16 часов. ДК собирали для окрашивания поверхности конъюгированными с аллофикоцианином (APC) анти-CD86, R-фикоэритрином (PE) -конъюгированными анти-CD83, APC-конъюгированными анти-TSLPR, PE-конъюгированными анти-IL-7R α антителами (все от Bio-Techne). Конкретное мечение определяли количественно с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитометра Guava EasyCyte и описанного программного обеспечения InCyte (Merck) (28). Супернатанты культур собирали и замораживали при -80 ° C для последующего анализа цитокинов и хемокинов.
Совместные культуры клеток DC-T
DC и конфлюэнтные EC культивировали совместно в течение ночи, как описано выше, и DC-EC или eduDC дополнительно инкубировали с P1 (кладка B, 125 мкМ) или средой в течение 24 часов. Затем DC отделяли и инкубировали с аутологичными CD4 + Т-клетками, предварительно меченными CFSE (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя, в соотношении 1: 5 (DC / T). Через 5 дней культивирования пролиферацию CD4 + Т-клеток анализировали проточной цитометрией, как описано (29, 30), с использованием фитогемагглютинина (ФГА) (5 мкг / мл) в качестве положительного контроля.
Анализ иммунизации in vitroАнализ иммунизации in vitro проводили, как описано (31), с изменениями. Вкратце, 1 × 10 6 CD8-истощенных PBMC (Human CD8 Depletion Cocktail, StemCell Technologies, Франция) совместно культивировали в течение 24 часов с клетками RPMI 2650 (1 × 10 5 ), предварительно засеянными в 48 —. планшеты с лунками на 48 ч. Затем добавляли только овальбумин (OVA, EndoFit Ovalbumin, 10 мкг / мл, Invivogen), OVA вместе с P1 (5 мкМ, 25 мкМ, 125 мкМ), OVA вместе с мутантом P1 (P1mut, 125 мкМ) или среду. в среде RPMI 1640 с добавлением заменимых аминокислот (раствор NEAA, Thermo Fisher), IL-4 (10 нг / мл), IL-2 (10 UI / мл) и 2-меркаптоэтанол (20 мкМ) в течение 7 дней.
Для обнаружения OVA-специфических B-клеток в указанные моменты времени поверхность PMBC окрашивали овальбумином, конъюгированным с флуоресцеином (OVA-FITC, 20 мкг / мл, Thermo), PE-конъюгированными мышиными антителами против CD20 человека (BD Biosciences, Калифорния, США), APC-конъюгированные козьи антитела против человеческого IgA или ослиные против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch, PA, USA), как указано производителем. Специфическое мечение было количественно определено проточной цитометрией с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte (Merck-Millipore) и проанализировано с помощью специального программного обеспечения InCyte, используя следующую стратегию: CD20 + B-клетки были сначала заблокированы, и клетки были дважды положительными по OVA-FITC + и APC-конъюгированным Анти-IgA или анти-IgG определяли как OVA-IgA или IgG-специфические B-клетки, соответственно.
Статистический анализ
Данные представлены как среднее ± SEM по крайней мере трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была проанализирована с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.
Результаты
P1 индуцирует секрецию TSLP в эпителиальных клетках носа путем взаимодействия с галактозилцерамидом
Сначала мы исследуем, индуцирует ли P1 секрецию TSLP в назальном эпителии. Поэтому мы культивировали эпителиальные клетки носа человека (RPMI 2650) с кладой P1 B в течение 2–24 ч при 37 ° C и анализировали супернатанты культуры на секрецию TSLP.По сравнению со средой и пептидами scramble, используемыми в качестве отрицательного контроля, P1 повышает секрецию TSLP в зависимости от дозы от 2 до 4 часов (рис. 1A). При 125 мкМ, когда P1 принимает состояние тримерной олигомеризации (9), P1 индуцирует значительно более высокую секрецию TSLP, чем в мономерном состоянии (при 5 мкМ и 25 мкМ). Секреция TSLP происходит быстро в течение нескольких часов после стимуляции, достигая плато от 4 до 24 часов.
Рисунок 1 P1 индуцирует экспрессию TSLP в эпителиальных клетках носа. (A) Конфлюэнтные клетки RPMI 2650 культивировали с пептидом P1 (5 мкМ, 25 мкМ, 125 мкМ) или скрембл-пептидом (125 мкМ) в течение 2 или 4 часов. Секрецию TSLP в супернатантах культур количественно оценивали с помощью ELISA. Данные представлены в виде графиков в виде ящиков и усов. (B) Носовые клетки RPMI культивировали с пептидами P1, полученными из клады ВИЧ-1 (A – C) , или мутантным пептидом P1–5W в возрастающих концентрациях в течение 4 часов. Вставка: ключевые аминокислоты P1 (661–670), соответствующие широко нейтрализующим эпитопам 2F5 и 4E10 IgG со специфическими для клады мутациями, выровнены. (C) назальные клетки RPMI предварительно инкубировали с антителом против галактозилцерамида (GalCer) в течение 30 минут при 37 ° C перед стимуляцией каждым пептидом P1. (D) Первичные клетки HNEC культивировали с пептидом P1 (5 мкМ, 25 мкМ, 125 мкМ) с предварительной инкубацией против GalCer или без нее или пептидом P1W (125 мкМ). (E) Относительная экспрессия мРНК короткой (sf) и длинной формы (lf) TSLP в носовых клетках RPMI (слева) и клетках HNEC (справа). Клетки стимулировали (P1) или без (WO P1) P1 в течение 4 часов при 37 ° C.Данные в (B – D) представлены как среднее ± SEM (n = 3–8 независимых экспериментов. Парный t-критерий Стьюдента * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,001).
Хотя последовательность P1 относительно консервативна, в отличие от сильно мутировавших участков gp120 оболочки ВИЧ-1, последовательность P1 варьируется между кладой A ВИЧ-1, распространенной в Западной Африке, и кладой B, преобладающей в Европе и США, и клада C, преобладающая в Африке и Китае (рис. 1B).Следовательно, мы затем проанализировали, ограничивается ли секреция TSLP P1, происходящим из клады B, или она также будет стимулироваться P1, полученным из вирусов клады A и C (Рисунок 1B). Секреция TSLP, индуцированная кладой A, по сравнению с кладой B P1, снижается на 20% (41,8 ± 2,6 пг / мл для клады A, 52,3 ± 3,4 пг / мл для клады B P1 при 125 мкМ, p <0,05, n = 5), тогда как P1 клады C не индуцировали секрецию TSLP. P1 клады C отличается от P1 клады B и A мотивом ELDKW, мы ранее показали, что она является детерминантой в связывании P1 клады B с галактозилцерамидом (GalCer), эпителиальным рецептором ВИЧ-1 (9, 10).Таким образом, мы предположили, что взаимодействие P1 клады B и A с GalCer инициировало секрецию TSLP. Соответственно, клада B P1, мутировавшая в W666G (P1W), которая не может взаимодействовать с GalCer (9), полностью теряет способность индуцировать секрецию TSLP. Кроме того, когда взаимодействие между P1 и GalCer было заблокировано преинкубацией с антителом против GalCer, продукция TSLP полностью блокируется, подтверждая, что секреция TSLP инициируется взаимодействием P1 с GalCer (рис. 1C). Важно отметить, что стимуляция P1 также побуждает первичные эпителиальные клетки носа человека (HNEC) секретировать TSLP GalCer-зависимым образом (рис. 1D).
Длинная форма TSLP активируется после стимуляции P1
Два варианта транскрипта TSLP, а именно короткая (sfTSLP) и длинная (lfTSLP) формы, были недавно идентифицированы (32). Было высказано предположение, что экспрессия sfTSLP является конститутивной и гомеостатической, тогда как lfTSLP приводит к провоспалительным ответам (32). Таким образом, мы исследовали, какая форма (формы) TSLP активируется при стимуляции P1 эпителиальных клеток носа. При анализе на уровне транскрипции в назальных клетках RPMI и первичных HNEC экспрессия sfTSLP и lfTSLP различается на коэффициент> 10 2 .После стимуляции P1 как назальных клеток RPMI, так и первичных HNEC, уровень транскрипта sfTSLP остается неизменным (рис. 1E). Напротив, при стимуляции P1 уровень транскрипции lfTSLP как в назальных клетках RPMI, так и в HNEC увеличивался в 1,9 (p = 0,02, n = 5) и 5,9 раза (p = 0,004, n = 6), соответственно, по сравнению с нестимулированными клетками. . В целом эти результаты указывают на то, что P1 избирательно регулирует lfTSLP на уровне транскрипции.
Индуцированная P1 экспрессия lfTSLP регулируется miR-4485, кальциневрином и PAR-2
Затем мы исследовали внутриклеточные механизмы, приводящие к экспрессии TSLP после взаимодействия P1 с GalCer.Мы сконцентрировались на первичных HNEC, поскольку их повышение уровня транскрипции lfTSLP после стимуляции P1 выше по сравнению с таковым в назальных клетках RPMI (рис. 1E).
Ранее мы показали, что некодирующая микроРНК miR-375 контролирует экспрессию TSLP в первичных кератиноцитах крайней плоти человека (16), как и в линиях клеток кишечника человека (33). При тестировании на первичных HNEC мы обнаружили, что секреция TSLP, индуцированная описанным выше P1, не сопровождается изменением экспрессии miR-375. Таким образом, мы дополнительно исследовали профили микроРНК при стимуляции назального эпителиального HNEC с помощью P1 после обработки или в отсутствие P1 в течение 6 часов, сравнительно с помощью анализа массива микроРНК.В результате 39 микроРНК по-разному экспрессируются с изменением кратности от 1,3 до 9,15 при p <0,05, включая 23 гена с повышенной и 16 пониженной регуляции (рис. 2А, таблица 1).
Рисунок 2 Регулируемая микроРНК P1-индуцированная экспрессия TSLP и соответствующие пути передачи сигналов в эпителиальных клетках носа. (A) Тепловая карта, показывающая 39 дифференциально экспрессируемых miRNA в стимулированных P1 (P1) клетках HNEC по сравнению с контрольными нестимулированными клетками (NS). Только дифференциально экспрессируемые микроРНК со значением p <0.05 из парного t-критерия Стьюдента, а также предельное значение кратности изменения> 1,3. n = 3 независимых эксперимента с HNEC от двух разных доноров. (B) Антагонист PAR-2 ENMD-1068 (ENMD) и ингибитор кальциневрина циклоспорин A (CsA) снижают экспрессию индуцированной P1 miR-4485, как измерено с помощью qPCR. (C) Нокдаун miR-4485 в HNEC посредством трансфекции siRNA ингибировал P1-индуцированную экспрессию TSLP, измеренную с помощью qPCR, примерно на 50%. (D) Шесть основных целевых путей, предсказанных анализом пути изобретательности, отсортированные по их значениям p .Представленное соотношение определяется как количество дифференцированных miRNA, обнаруженных в клетках, обработанных P1, по сравнению с общим количеством miRNA, вовлеченных в каждый из путей. (E) P1-индуцированная экспрессия TSLP, измеренная с помощью кПЦР, значительно снижается в присутствии CsA, ингибитора NFAT и ENMD, антагониста PAR-2, но не дексаметазона (Dex), ингибитора NF. -κB и MAPK. м: средний. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM n ≥ 3 независимых экспериментов парный t-критерий Стьюдента * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001).
Таблица 1 МикроРНК, индуцированные (слева) или репрессированные (справа) в HNEC, обработанных P1.
Примечательно, что в анализе массива микроРНК наиболее активным геном при стимуляции P1 является miR-4485-3p с n> девятикратным увеличением (Таблица 1). Мы подтвердили эту повышающую регуляцию с помощью кПЦР, что привело к увеличению экспрессии miR-4485-3p в 2,6 ± 0,8 раза (n = 4) после стимуляции P1 (рис. 2B). MiR-4485-3p — это относительно недавно описанная микроРНК, которая плохо охарактеризована на экспериментальном уровне.Единственное описанное действие miR-4485-3p — регулирование митохондриальных функций, что предполагает его роль в подавлении опухоли (34). Таким образом, мы сначала оценили, контролирует ли эта микроРНК экспрессию TSLP. Следовательно, первичные HNEC трансфицировали специфической миРНК для подавления экспрессии miR-4485-3p перед стимуляцией P1. В результате, подавление miR-4485-3p на 50-60% снижает, в свою очередь, индуцированную P1 экспрессию TSLP на 48 ± 10% (p <0,01, n = 4) по сравнению с клетками, трансфицированными ложным ингибитором (рис. 2C). ).
Биоинформатические анализы были проведены для дальнейшего выяснения механизмов, с помощью которых P1 модулирует все идентифицированные микроРНК и последующие внутриклеточные пути передачи сигналов. Гены, на которые предположительно будут нацелены идентифицированные микроРНК, участвуют в нескольких сигнальных путях, пять основных из которых включают передачу сигналов, связанных с рецептором, сопряженным с G-белком (GPCR) — , передачу сигналов ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT), передачу сигналов Rho GDP, эфрин передача сигналов рецептора и передача сигналов тромбина (рисунок 2D).
Подтверждая этот прогностический анализ, определяющий пути NFAT, GPCR и тромбина (PAR) (35) в качестве основных, индуцируемых стимуляцией P1, было описано, что в кератиноцитах продукция TSLP регулируется зависимыми от Ca 2+ Сама передача сигналов NFAT запускается активацией рецептора 2, активируемого протеазой GPCR (PAR-2) (36). Таким образом, мы затем оценили экспериментально, снижают ли ингибиторы, специфичные для этих путей, также индуцированную P1 экспрессию TSLP в первичных HNEC.Следовательно, HNEC предварительно обрабатывали ингибитором кальциневрина циклоспорином A (CsA) или антагонистом PAR-2 ENMD-1068 перед стимуляцией P1. Соответственно, экспрессия TSLP снизилась на 67 ± 4% ( p <0,001, n = 3) после предварительной обработки CsA и на 46 ± 14% ( p <0,05, n = 3) после предварительной обработки ENMD-1068. лечение (рис. 2E). Более того, ингибиторы CsA и ENMD-1068 также блокируют повышающую регуляцию miR-4485-3p (рис. 2B). Напротив, блокирование NF- κ B и MAPK дексаметазоном (Dex) не влияло на экспрессию TSLP (рис. 2E).Эти результаты предоставляют прямые и косвенные доказательства того, что передача сигналов, опосредованная miR-4485-3p, кальциневрин и PAR-2 —, тесно коррелирует с индуцированной P1 экспрессией TSLP.
Чтобы еще раз подтвердить, что P1 активирует кальциневрин, мы исследовали, индуцирует ли P1 потоки кальция в назальных эпителиальных клетках, которые обычно вызывают активацию кальциневрина (37). Соответственно, используя технологию визуализации флуоресцентного красителя Fura-2 / AM, мы наблюдали как в назальных клетках RPMI, так и в первичных клетках HNEC, что обработка P1 вызывает немедленный внеклеточный приток кальция в зависимости от концентрации (125 мкМ против 25 мкМ P1, n = 3) (рисунки 3А, Б).Напротив, обработка контрольными пептидами (мутант P1–5W и P1 клады C, оба в концентрации 125 мкМ) не приводит к значительному повышению уровня кальция.
Фиг. 3 P1 индуцирует приток кальция и секрецию цитокинов / хемокинов в эпителиальных клетках носа. (A, B) Потоки кальция в ответ на стимуляцию P1 . (A) Типичные изображения нагруженных Fura-2 / AM эпителиальных клеток, обработанных средой (имитация), P1 (5 мкМ, 25 мкМ, 125 мкМ), P1 клады C (P1-C, 125 мкМ) и мутировавшего P1 (P1–5W, 125 мкМ). (B) Кальций измеряли каждые 5 с с помощью видеофлуоресцентного изображения и отображали как отношение сигналов возбуждения 340 и 380 нм. Репрезентативный след из n = 3 независимых экспериментов потоков кальция в эпителиальных клетках, нагруженных Fura-2 / AM (левый RPMI, правые клетки HNEC), обработанных P1 и другими указанными пептидами. (C) Высвобождение цитокинов и хемокинов из эпителиальных клеток носа при стимуляции P1. P1 вызывает секрецию MMP-9, CCL20, CCL2, IL-10 в эпителиальных клетках носа.Клетки инкубировали со средой P1 (кладка B, 125 мкМ) или контрольным пептидом: scramble P1, P1–5W или P1 clade C, 125 мкМ (ctrl P) в течение 24 часов. Секреции MMP-9, CCL20, CCL2, IL-10 измеряли с помощью множественного анализа Luminex. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (A, B) . Данные представлены в виде диаграмм в виде прямоугольников и усов из n = 5 независимых экспериментов; парный t-критерий Стьюдента * p <0,05, *** p <0,001.
Вместе эти данные показали, что в эпителиальных клетках носа экспрессия TSLP, стимулированная P1, регулируется miR-4485 через Са 2+ -зависимый сигнальный путь NFAT посредством взаимодействия с рецептором PAR-2.
P1 дополнительно стимулирует эпителиальную секрецию MMP-9, CCL20, CCL2 и IL-10
Затем мы исследовали, может ли P1, помимо TSLP, стимулировать эпителиальную секрецию дополнительных иммунных факторов, склонных к привлечению антигенпрезентирующих клеток (APC). . Таким образом, назальные клетки RPMI инкубировали с P1 (125 мкМ) и через 24 часа среду для культивирования клеток анализировали на интерлейкин (IL) -25 / IL-17E, IL-33, IFN-, γ , IL-10, IL-12 / 23p40, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, матриксная металлопротеиназа 9 ((MMP-9), IL-8 / CXCL8, MIP-3 α / CCL2 , MCP-1 / CCL20, MDC / CCL22, TARC / CCL17, APRIL и BAFF по технологии Luminex.В результате P1 селективно индуцировал секрецию MMP-9, CCL20, CCL2 и IL-10 (рис. 3C). Кроме того, как наблюдали для P1-индуцированной секреции TSLP, P1W и P1 клады C были неспособны стимулировать значительную продукцию MMP-9, CCL-20 CCL2 или IL-10. Вместе с TSLP (16) этот набор иммунных факторов может способствовать рекрутированию APC на поверхность слизистой оболочки для инициации иммунного ответа, поскольку CCL20 и CCL2 хемо привлекают макрофаги и незрелые DC, а MMP-9 разрушает внеклеточный матрикс и способствует развитию миграция иммунных клеток в эпителий или из эпителия.Treg-клетки обладают функцией индуцирования IgA и требуют RA, TGF-b1, IL-10 и TSLP из эпителиальных клеток кишечника и DC. Итак, мы предположили, что IL-10, высвобождаемый либо из EC, либо из DC, может способствовать переключению класса IgA (Gutzeit, Magri, et al., 2014).
P1 активирует дендритные клетки человека в слизистой оболочке носа Модель
APC связывают врожденную и адаптивную иммунные системы и определяют поляризацию иммунных ответов. Таким образом, APC являются ключевой мишенью при разработке вакцин и адъювантов (38).DC являются наиболее распространенными APC в слизистой оболочке дыхательных путей (39), мы дополнительно исследовали ответы DC слизистой оболочки на P1.
Было высказано предположение, что ДК слизистой оболочки обладают уникальными функциями из-за местного микроокружения, особенно на уровне слизистой оболочки (40). В частности, ДК слизистой оболочки модулируют свои функции, взаимодействуя с эпителиальными клетками (ЭК), включая , посредством эпителиальной секреции TSLP (33, 41). Таким образом, мы создали упрощенную модель DC слизистой оболочки путем совместного культивирования DC и носовых EC (клеточная линия RPMI-2650), имитируя тем самым среду слизистой оболочки носа, как показано на рисунке 4A.DC сначала были «обучены» 24-часовой совместной культурой с EC. Впоследствии эти «образованные» ДК либо поддерживались в культуре с ЭК и назывались DC-EC, либо отделялись от эпителия и назывались eduDC. В качестве альтернативы, DC, культивированные только на среде, представляли собой DC «не слизистые».
Рисунок 4 P1 индуцирует созревание дендритных клеток (ДК) слизистой оболочки. (A) Экспериментальные модели активации DC слизистой оболочки с помощью P1. Экспериментальная модель, оценивающая (а) ДК слизистой оболочки, генерируемые непрерывным контактом между эпителием (ЭК) и ДК (ДК – ЭК): ДК, совместно культивируемые с монослоем ЭК (клеточная линия RPMI-2650) в течение 24 часов, обрабатывались P1 или средой. на дополнительные 16 ч; (b) ДК слизистой оболочки, образованные первичным образованием ЭК после ограниченного по времени контакта между ЭК и ДК (eduDC): после совместного культивирования с ЭК в течение 24 часов, как указано выше, ДК отделяли от ЭК и затем обрабатывали P1 или средой. на дополнительные 16 ч.(c) неслизистые DC (DC): DC культивировали отдельно со средой в течение 24 часов до стимуляции P1 или средой в течение 16 часов. (B – E) P1 активирует DC, регулируя экспрессию поверхностных маркеров. Экспрессия CD83 (B) , CD86 (C) , TSLPR (D) , IL-7Ra (E) на ДК, полученных после культивирования в трех моделях, описанных в (A) и количественно оцененных проточная цитометрия со стимуляцией P1 (синие столбцы) или без (WO) (серые столбцы). Экспрессия CD86 показана как средняя интенсивность флуоресценции (MFI).Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (n> 3 независимых эксперимента; парный t-критерий Стьюдента * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).
Каждый тип DC стимулировали P1 в течение ночи, а экспрессию маркеров созревания оценивали с помощью проточной цитометрии. По сравнению с необработанными клетками, обработанные P1 DC слизистой оболочки, DC-EC или eduDCs, демонстрируют значительную повышающую регуляцию костимулирующих молекул CD83 (Рисунок 4B) и CD86 (Рисунок 4C). Напротив, P1 не влияет на «неслизистые» DC.Удивительно, но P1 также значительно усилил экспрессию рецептора TSLP, причем обе цепи TSLP-R (фиг. 4D) и IL-7R α (фиг. 4E) активируются на DC во всех трех моделях.
Профили секреции цитокинов и хемокинов также были сравнительно изучены на этих моделях. По сравнению с неслизистыми DC, P1 вызывает значительное увеличение секреции IL-6, IL-8, IL-10, CCL20, CCL22 и MMP-9 в моделях eduDC и DC-EC, а также секреции TSLP, хотя скромнее.Напротив, секреция IFN- γ остается неизменной при стимуляции P1 или незначительно снижается в DC-EC (фиг. 5A). Кроме того, некоторые цитокины, такие как IL-25, IL-33, IL-4, IL-5, остаются необнаруживаемыми независимо от модели, тогда как другие, такие как IL-12, IL-13, CCL2, CCL17, TNF-α , APRIL и BAFF секретируются одинаково во всех трех моделях.
Рис. 5 Стимуляция Р1 ДК слизистой оболочки приводит к пролиферации CD4 + Т-клеток. (A) Производство цитокинов и хемокинов в моделях DC, обработанных P1.IL-6, IL-10, IFNg, TSLP, IL-8, CCL-20, CCL-22 и MMP9 определяли количественно с помощью мультиплексного анализа Luminex. Синяя звездочка (*) указывает на значительные различия ( p значения <0,05, t-критерий Стьюдента) в каждой модели между обработками P1 (синие столбцы) и имитацией (серые столбцы), тогда как черная звездочка (*) сравнивает P1 — обработанных клеток в разных моделях. Данные представлены в виде графиков в виде прямоугольников из n> 3 независимых экспериментов, p значений <0,05, парный t-критерий Стьюдента). (B) ДК слизистой оболочки, обработанные P1, стимулируют пролиферацию CD4 + Т-клеток. Пролиферацию CD4 + Т-клеток определяли с помощью проточной цитометрии в соответствии с внутриклеточной концентрацией CFSE. Данные представлены в виде пролиферирующих CD4 + Т-клеток в% от общего количества CD4 + Т-клеток. Фитогемагглютинин (ФГА) использовали в качестве положительного контроля. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n> 3 независимых эксперимента; парный t-критерий Стьюдента * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001).
Активированные ДК, как известно, стимулируют пролиферацию Т-клеток, чтобы инициировать адаптивный иммунный ответ, как in vivo, , так и in vitro (15, 29, 30). Таким образом, мы дополнительно оценили, могут ли Р1-активируемые ДК слизистой оболочки способствовать пролиферации Т-клеток. В результате eduDC, примированные P1, индуцировали пролиферацию аутологичных CD4 + T-клеток, тогда как обработка контрольными пептидами (мутант P1W и P1 клады C) или стимуляция P1 только на CD4 + T-клетки не имела никакого эффекта (фиг. 5B). Сходные результаты наблюдались с DC-EC, что согласуется с аналогичными профилями цитокинов между DC-EC и eduDC, как описано выше.
В целом, эти результаты показывают, что P1 специфически активирует DC слизистых оболочек, что приводит к секреции цитокинов и хемокинов Th3, а также к пролиферации CD4 + Т-клеток.
P1 действует как адъювант для стимуляции антиген-специфических гуморальных ответов
In vitroНаконец, учитывая, что P1 вызывает различные иммуномодулирующие эффекты в клетках слизистой оболочки, участвующих в вакцинации в области носа, как описано выше, мы исследовали, способен ли P1 действовать как адъювант. Используя модель иммунизации in vitro человеческими PBMC, оценивали способность P1 запускать гуморальный иммунный ответ против хорошо охарактеризованного антигена, а именно овальбумина (OVA).
Тесты иммунизации in vitro использовались для получения специфических моноклональных антител с использованием определенного антигена, дополненного адъювантом (42). Здесь мы создаем модель иммунизации слизистой оболочки, адаптированную из (29, 31, 43) и использующую DC слизистой оболочки на основе наших результатов, представленных выше. OVA были выбраны в качестве модельного антигена. Следовательно, человеческие PBMC с истощенным CD8 (n = 5 независимых доноров) культивировали совместно с клетками RPMI 2650 в течение одного дня для образования DC, и перед добавлением либо среды, OVA, OVA плюс мутант P1 (P1mut, 125 мкМ) или OVA. плюс P1 (5 мкМ, 25 мкМ, 125 мкМ) еще семь дней.OVA-специфические B-клетки были количественно определены с помощью проточной цитометрии с использованием FITC-конъюгированных OVA и анти-CD20-PE для доступа к OVA-специфическим B-клеткам. Изотип Ig поверхностного B-клеточного рецептора (BCR) был затем охарактеризован APC-конъюгированным антителом против человеческого IgA или против человеческого IgG. Как показано на фиг. 6, только OVA, как и среда, не смог индуцировать специфичные для OVA B-клетки, тогда как в присутствии P1 были обнаружены OVA-специфические B-клетки. При концентрации 5 мкМ и 25 мкМ, при которой P1 остается в мономерном состоянии, индукция OVA-специфических B-клеток очень ограничена, тогда как при 125 мкМ P1 значительно усиливает распознавание OVA B-клетками из-за поверхностной экспрессии OVA- специфические изотипы IgA и IgG.Аналогичные результаты были получены, когда В-клетки окрашивали анти-CD19-PE. Важно отметить, что в отсутствие назальных эпителиальных клеток во время иммунизации in vitro , P1 не способен индуцировать OVA-специфические B-клетки. В супернатантах культур на 7-й день секреция OVA-специфических антител не могла быть обнаружена с помощью ELISA, скорее всего, из-за того, что бласты не были сформированы в этот ранний момент иммунизации и в соответствии с обнаружением OVA-специфических IgA и IgG в Поверхность В-клеток до дифференцировки бластов.Следовательно, P1, по-видимому, действует как адъювант, способствуя экспрессии антиген-специфического BCR на B-клетках, которым могут потребоваться дополнительные сигналы для превращения в плазматические клетки.
Фиг. 6 Иммунизация in vitro овальбумином с адъювантом пептидом P1. CD8-истощенные PBMC совместно культивировали с монослоем назальных клеток RPMI в течение 24 часов перед добавлением OVA в качестве антигена с адъювантом P1 в трех концентрациях или в присутствии мутантного P1 (P1mut) в отсутствие антигена или адъюванта, как отрицательные контроли.CD20 + B-клетки, экспрессирующие OVA-специфические IgA или IgG, были количественно определены с помощью проточной цитометрии с использованием анти-CD20-PE, FITC-конъюгированного OVA и APC —, конъюгированного против человеческого IgA или против человеческого IgG. Данные представлены в виде графиков в виде ящиков и усов для n = 5 независимых доноров; парный t-критерий Стьюдента * p <0,05, ** p <0,01.
Обсуждение
В отличие от интенсивно используемых бактериальных адъювантов, полезные иммунные свойства вирусных компонентов в основном игнорируются.Хотя обычно считается, что вирусы запускают PRR (рецепторы распознавания образов) своим генетическим материалом, белки вирусной оболочки также, как сообщается, инициируют локальное воспаление через взаимодействие с TLR-2 и TLR-4 (44–47). Эти мотивы имеют решающее значение для передачи вируса, но также могут использоваться для улучшения восприятия вакцины и ее эффективности.
Здесь мы впервые сообщили об адъювантной активности вирусного мембранного белка и исследовали соответствующие иммунологические механизмы.Таким образом, мы охарактеризовали иммуномодулирующие свойства P1, консервативного пептида из гликопротеина gp41 ВИЧ-1, который, как мы ранее показали, является мощным вакцинным антигеном, обеспечивающим полную защиту от ВИЧ-инфекции слизистых оболочек после интраназальной иммунизации (8) и определено его стимулирующая активность в человеческих эпителиальных клетках носа и дендритных клетках, двух основных мишенях назальной вакцинации.
Назальные эпителиальные клетки являются первыми клетками, с которыми сталкивается вакцина, применяемая назально, и признано, что они влияют на инициирование, регуляцию и поддержание врожденных и адаптивных иммунных ответов слизистой оболочки через факторов эпителиального происхождения, таких как TSLP (33, 41) .Показанная здесь P1-индуцированная секреция TSLP назальными эпителиальными клетками может, таким образом, составлять начальную адъювантную активность, достигаемую P1, используемым в составе назальной вакцины. TSLP предлагает несколько преимуществ для стимуляции местного иммунитета и индукции продукции специфических антител — двух основных целей вакцинации слизистых оболочек (18). В частности, TSLP влияет на поляризацию иммунных ответов Th3, способствует переключению классов IgA и опосредует образование и поддержание Т-клеток памяти (48).Следовательно, введение TSLP в состав вакцины, наносимой на слизистую оболочку, сильно стимулирует ответ IgA (19), а TSLP продемонстрировал адъювантную активность в недавнем исследовании вакцины против ВИЧ-1 с интраназальным введением на мышиной модели (17). Недавние исследования, проведенные нами и другими, показали, что TSLP секретируется на начальных этапах проникновения ВИЧ-1 в слизистую оболочку половых органов после gp120-зависимой активации пути TLR-4 посредством передачи сигналов NF- κ B (15, 16). Основываясь на значительной эффективности нашей вакцины на основе субъединицы gp41, содержащей виросому, носитель вакцины без адъюванта, связанный с субъединицами gp41, используемый в качестве антигена, и вводимый назально, мы решили исследовать, может ли наш вакцинный антиген, субъединица P1 gp41, также стимулируют TSLP и, таким образом, действуют как адъювант слизистой оболочки.
Однако назальные эпителиальные клетки отличаются от генитальных и, следовательно, по-разному реагируют на патогены, с которыми они связаны. Следовательно, назальные эпителиальные клетки не могут быть активированы LPS через TLR-4 (49). Соответственно, наше исследование показало, что P1 стимулирует продукцию TSLP в назальных эпителиальных клетках, взаимодействуя скорее с GalCer, рецептором слизистой оболочки ВИЧ, экспрессируемым на эпителиальных клетках и дендритных клетках (9-11).
Мы дополнительно изучили механизм, стимулируемый взаимодействием P1 с GalCer, чтобы идентифицировать клеточный регулятор экспрессии TSLP в назальном эпителии.Поскольку секреция TSLP различными стимулами регулируется miRNA (16, 33), мы сначала изучили транскриптом микроРНК, селективно индуцируемый в эпителиальных клетках носа при стимуляции P1. Мы определили miR-4485 как основную miRNA, которая дифференциально увеличивается в носовых клетках при стимуляции P1. Соответственно, блокирование miR-4485 отменяет индуцированную P1 секрецию TSLP. Дальнейший систематический анализ, основанный на прогнозировании, основанный на мишенях идентифицированных miRNAs, вычислил, что путь NFAT, связанный с PAR-2, был модулирован.PAR-2 играет ключевую роль в высвобождении TSLP, особенно кальциевого пути PAR-2 / ORAI1 / NFAT, который, как сообщается, регулирует продукцию TSLP в кератиноцитах (36). Здесь мы экспериментально установили способность P1 стимулировать кальциевый путь PAR-2 / ORAI1 / NFAT в эпителиальных клетках носа. Следовательно, индуцированная P1 секреция TSLP блокируется PAR-2 и специфическими ингибиторами кальциневрина, а P1 индуцирует внутриклеточный приток кальция. Кроме того, в дополнение к TSLP, P1 стимулирует специфическую секрецию CCL20, CCL2, IL-10 и MMP-9 в эпителиальных клетках носа.В соответствии с этими результатами, секреция MMP-9 запускается активацией PAR-2 (50).
Наши результаты показывают, что P1 может индуцировать продукцию TSLP при взаимодействии с назальным эпителием, вероятно, также во время назальной вакцинации. Однако путь, индуцируемый gp41-субъединицей P1, полностью отличается от пути, вызываемого gp120 в спайке оболочки ВИЧ-1 во время передачи ВИЧ-1 половым путем в генитальных участках (15, 16). Что касается его роли в процессе назальной вакцинации, TSLP, продуцируемый на индуктивном участке, может отпечатывать иммунные клетки слизистой оболочки, такие как DC, так что эти клетки приобретают врожденную память (51), прежде чем циркулировать к эффекторному участку на слизистой оболочке гениталий, так как предложено (3).Следовательно, во время самого первого контакта с ВИЧ-1 на слизистой оболочке гениталий — также в эффекторном сайте вакцины — эти импринтированные иммунные клетки могут получить от оболочки ВИЧ-1 сигнал для индукции TSLP и, в свою очередь, быстро мобилизовать индуцированные вакциной клетки памяти для предотвращения инфекция.
На нелимфоидной области поверхности слизистой оболочки подслизистые ДК действуют как дозорные для мониторинга «сигналов опасности», таких как цитокины и хемокины, индуцируемые антиген-стимулированными эпителиальными клетками. После активации эти DC могут проникать в плотные соединения эпителия через трансэпителиальные дендриты и захватывать антигены, как это характерно для носового эпителия (30, 52).DC обычно считаются основной целью TSLP (53). В предыдущем исследовании с использованием TSLP в качестве адъюванта назального нанесения на поверхность носового эпителия было достаточно для активации подслизистых DC, что позволяет предположить, что сигнал, индуцированный TSLP, способен преодолевать эпителиальный барьер (17). Следовательно, мы далее исследовали модулирующий эффект P1 на DC слизистой оболочки, используя модель совместного культивирования ECs и DCs в носу, чтобы имитировать среду слизистой оболочки носа и межклеточные контакты.
Наши данные показывают, что P1 стимулирует экспрессию костимулирующих факторов CD83 и CD86 на ДК слизистой оболочки, а также рецептора TSLP.Учитывая, что TSLP регулирует поляризацию Th3, мы исследовали профиль цитокинов и хемокинов, стимулируемый P1 в DC слизистой оболочки. Наши данные показали, что в ДК слизистой оболочки P1 индуцировал IL-6, IL-10 и снижал IFN- γ , что соответствовало противовоспалительному ответу Th3 и усиливало переключение классов IgA. IL-8, CCL20 и CCL22 также продуцируются и, в свою очередь, могут вызывать рекрутирование иммунных клеток для инициации адаптивного иммунного ответа (макрофагов, лимфоцитов, моноцитов) на строму слизистой оболочки.Последним фактором, секретируемым при стимуляции P1, является ММР-9, который облегчает миграцию иммунных клеток за счет разрушения внеклеточного матрикса. Кроме того, Р1-модулированные ДК слизистой оболочки приводят к пролиферации аутологичных CD4 + Т-клеток. Таким образом, наши результаты показывают, что P1 активирует DC слизистой оболочки для высвобождения устойчивых цитокинов Th3 и хемокинов и, следовательно, может способствовать гуморальному ответу слизистой оболочки.
TSLP, продуцируемый EC, как ожидается, будет опосредовать перекрестные помехи с DC, ведущие к Th3 поляризации иммунного ответа.Однако мы неожиданно обнаружили, что ЭК являются не единственным источником TSLP в наших моделях слизистой оболочки. ДК слизистой оболочки, полученные в наших двух моделях, а именно DC – EC и eduDC, аналогично реагируют на стимуляцию P1. В частности, P1 индуцирует аналогичный уровень секреции TSLP и увеличивает экспрессию рецептора TSLP, двух элементов, которые могут вместе образовывать аутокринную петлю TSLP, в свою очередь, усиливая сигнал, индуцированный TSLP. Эта аутокринная петля фактически согласуется с клиническими исследованиями, в которых сообщается, что секреция TSLP и экспрессия рецептора TSLP усиливаются одновременно при активации EC (54, 55).Такая аутокринная петля TSLP в DCs д. Поддерживать источник TSLP и помогать поддерживать перекрестные помехи между DC и эпителием. Соответственно, мы обнаружили, что «образование», вызванное взаимодействием с ЭК и его специфическим микроокружением, обеспечивает уникальные функциональные особенности ДК слизистой оболочки при стимуляции Р1, характеризующиеся другим иммунным профилем по сравнению с ДК крови. Это согласуется с предыдущими сообщениями, показывающими, что иммунологические последствия после стимуляции адъювантом в первую очередь зависят от среды, в которой применяется адъювант (41, 56).Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять механизмы, участвующие в эпителиальном «образовании» и в путях активации DC, индуцированных P1.
В качестве последнего шага в характеристике функции адъюванта P1 мы показали, что P1 индуцирует антиген-специфические IgG и IgA на поверхности B-клеток в иммунизации in vitro . В предыдущих исследованиях сообщалось, что при использовании PBMC, обедненных иммуносупрессивными клетками, антиген-специфический иммунный ответ может быть вызван сенсибилизацией антигеном в присутствии цитокинов и адъювантов (29, 31, 42, 43).Поэтому мы использовали этот метод in vitro для оценки способности P1 действовать как адъювант и усиливать антиген-специфический гуморальный ответ с использованием OVA в качестве модельного антигена. Наши результаты ясно показали, что P1, когда он находится в олигомерном состоянии, увеличивает количество OVA-специфических B-клеток, либо способствуя презентации антигена и / или взаимодействию T-B. Были обнаружены как OVA-специфические поверхностные IgA, так и IgG В-клеток, в то время как секреция специфических антител не определялась на 5/7 день, что позволяет предположить, что в этой модели in vitro происходит переключение классов, но В-клетки не развиваются в плазмобласты.Специфическая секреция антител в такой системе иммунизации in vitro потребует дополнительных стимуляций такими агентами, как CD40L и другие цитокины, или повторной сенсибилизации антигеном. Тем не менее, адъювантная функция P1 должна быть подтверждена in vivo при интраназальной иммунизации антигенами с адъювантом P1.
В целом, наши результаты показывают, что в дополнение к его защитным свойствам вакцинного антигена, способствующим полной защите от повторной инфекции SHIV слизистой оболочки (8, 12) и индукции в фазе I клинических испытаний на P1-специфическом IgA слизистой оболочки человека с in vitro ВИЧ блокирует трансцитоз (8, 12), P1 действует как адъювант, как мы сейчас продемонстрировали здесь.Мы показываем, что адъювантная активность P1 проявляется в двухэтапном режиме во время назальной вакцинации. На первом этапе P1 инициирует самые первые иммунные ответы на поверхности носового эпителия, продуцируя TSLP, молекулу, которая считается сильным адъювантом, вместе с CCL20, CCL2, MMP-9 и IL-10, детерминантой цитокинов в иммунном ответе слизистой оболочки. . Этот процесс инициируется взаимодействием P1 с галактозилцерамидом, эпителиальным рецептором ВИЧ-1 (9-11), активирует приток кальция и пути PAR-2 и кальциневрина и регулируется микроРНК miR-4485.На втором этапе P1 модулирует DC слизистой оболочки, индуцируя экспрессию маркеров созревания, способствуя высвобождению хемокинов, которые могут рекрутировать адаптивные иммунные клетки и секрецию цитокинов, которые могут поляризовать адаптивный иммунитет на предпочтительный образ Th3 и IgA. В результате Р1-модулированные ДК способствуют пролиферации CD4 + Т-клеток и усиливают антиген-В-специфические ответы, как показано на фиг. 7.
иммунные ответы на слизистой оболочке носа.Шаг 1: P1 активирует клетки назального эпителия для производства TSLP, взаимодействуя с GalCer, активируя, в свою очередь, miR-4485, приток кальция, PAR-2 и кальциневрин, а также секрецию CCL20, CCL2, MMP-9 и IL. -10. Эти цитокины и хемокины инициируют самые первые шаги иммунного ответа и опосредуют перекрестные помехи между ЭК и иммунными клетками, такими как ДК. Шаг 2: P1 взаимодействует с DC слизистой оболочки, тем самым усиливая экспрессию костимулирующих маркеров и рецептора TSLP в аутокринной петле и способствуя созреванию DC.В результате активированные Р1 — ДК слизистой оболочки инициируют адаптивный иммунный ответ, вызывая высвобождение хемокинов, которые, в свою очередь, могут привлекать адаптивные иммунные клетки и секрецию цитокинов. Следовательно, адаптивный иммунитет поляризован в предпочтительный ответ Th3 и IgA. Этап 3. Наконец, Р1-стимулированные ДК способствуют пролиферации CD4 + Т-клеток и усиливают антиген-специфические В-клеточные ответы.
В целом, настоящее исследование показывает, что P1 представляет собой многофункциональный белок с сильным вакцинным потенциалом, а именно как иммуноген в полностью защитной вакцине-кандидате от ВИЧ-1 (8, 12), но также как многообещающий адъювант, который может сочетаться с другие вакцины для слизистых оболочек.
Заявление о доступности данных
Данные были загружены в NCBI — GSE157449. Другие необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.
Вклад авторов
LX, DT и MB разработали эксперименты. LX, DT и MB проводили и анализировали эксперименты. Рукопись написали LX и MB. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.
Финансирование
Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hepatites (AO2015-2-17046). Фонд для медицинских исследований (грант: «Equipe FRM» EQU2017830).
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Авторы хотят поблагодарить Клотильду Рамандриапиту, Институт Кочина, за полезное обсуждение измерений кальция и Томаса Гильберта с платформы IMAGIC в Институте Кочина за эксперименты по измерению кальция и их анализ.Это исследование было поддержано грантами от Национального агентства исследований в области Сида и гепатит Виралес (ANRS) (AO2015-2-17046) и от Фонда для медицинских исследований (грант: Equipe FRM) для MB. LX был поддержан Советом по стипендиям Китая.
Ссылки
2. Фуджкуяма Ю., Токухара Д., Катаока К., Гилберт Р.С., МакГи Дж. Р., Юки Ю. и др. Новые стратегии разработки вакцин для индукции иммунитета слизистых оболочек. Expert Rev Vaccines (2012) 11 (3): 367–79.doi: 10.1586 / erv.11.196
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
3. Brandtzaeg P. Потенциал лимфоидной ткани, связанной с носоглоткой, для реакции на вакцину в дыхательных путях. Am J Respir Crit Care Med (2011) 183 (12): 1595–604. doi: 10.1164 / rccm.201011-1783OC
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
4. Заман М., Чандруду С., Тот И. Стратегии интраназальной доставки вакцин. Drug Delivery Transl Res (2013) 3 (1): 100–9.doi: 10.1007 / s13346-012-0085-z
CrossRef Полный текст | Google Scholar
7. Йоханссон Э.Л., Вассен Л., Холмгрен Дж., Джертборн М., Рудин А. Назальные и вагинальные вакцинации по-разному влияют на ответы антител во влагалищном и цервикальном секретах у людей. Infect Immun (2001) 69 (12): 7481–6. doi: 10.1128 / iai.69.12.7481-7486.2001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
8. Бомсель М., Тюдор Д., Дрилле А.С., Альфсен А., Ганор Ю., Роджер М.Г. и др.Иммунизация виросомами субъединицы gp41 ВИЧ-1 индуцирует антитела слизистых оболочек, защищающих нечеловеческих приматов от заражения вагинальным вирусом SHIV. Иммунитет (2011) 34 (2): 269–80. doi: 10.1016 / j.immuni.2011.01.015
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
9. Альфсен А., Бомсель М. Остатки 650-685 оболочки gp41 ВИЧ-1, экспонированные на нативном вирусе, действуют как лектин, связывающий галактозилцерамид эпителиальных клеток. J Biol Chem (2002) 277 (28): 25649-59. DOI: 10.1074 / JBC.M200554200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
10. Бомсель М. Трансцитоз инфекционного вируса иммунодефицита человека через плотный барьер линии эпителиальных клеток человека. Nat Med (1997) 342-7 (1): 42–7. doi: 10.1038 / nm0197-42
CrossRef Полный текст | Google Scholar
11. Magérus-Chatinet A, Yu H, Garcia S, Ducloux E, Terris B, Bomsel M. Галактозилцерамид, экспрессируемый на дендритных клетках, может опосредовать перенос ВИЧ-1 от дендритных клеток, полученных из моноцитов, в аутологичные Т-клетки. Вирусология (2007) 362 (1): 67–74. doi: 10.1016 / j.virol.2006.11.035
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
12. Леру-Роэлс Г., Маес С., Клемент Ф., ван Энгеленбург Ф., ван ден Доббельстин М., Адлер М. и др. Рандомизированная фаза I: безопасность, иммуногенность и противовирусная активность слизистых оболочек у молодых здоровых женщин, вакцинированных пептидом Gp41 P1 ВИЧ-1 на виросомах. PLoS One (2013) 8 (2): e55438. doi: 10.1371 / journal.pone.0055438
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
14.Ито Т., Лю И-Дж., Арима К. Клеточные и молекулярные механизмы функции TSLP при аллергических заболеваниях человека — TSLP программирует «код Th3» в дендритных клетках. Allergol Int (2012) 61 (1): 35–43. doi: 10.2332 / аллерголинт.11-RAI-0376
PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar
15. Фонтенот Д., Хе Х, Ханабучи С., Нехете П. Н., Чжан М., Чанг М. и др. Продукция TSLP эпителиальными клетками, подвергшимися воздействию вируса иммунодефицита, запускает DC-опосредованную инфекцию слизистой оболочки CD4 + T-клеток. Proc Natl Acad Sci USA (2009) 106 (39): 16776–81. doi: 10.1073 / pnas.07106
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
16. Zhou Z, Xu L, Sennepin A, Federici C, Ganor Y, Tudor D, et al. Вирусный синапс ВИЧ-1 дает сигнал кератиноцитам крайней плоти человека секретировать стромальный лимфопоэтин тимуса, способствующий проникновению в крайнюю плоть ВИЧ-1. Mucosal Immunol (2018) 11 (1): 158–71. DOI: 10,1038 / mi.2017.23
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
17.Ван Рой Г.А., Ариас М.А., Трегонинг Дж.С., Роу Дж., Шатток Р.Дж. Тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) действует как мощный адъювант слизистой оболочки при вакцинации мышей против gp140 ВИЧ-1. Eur J Immunol (2012) 42 (2): 353–63. doi: 10.1002 / eji.201141787
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
18. Хатаяма Т., Сегава Р., Мидзуно Н., Эгути С., Акамацу Х., Фукуда М. и др. Полностью транс-ретиноевая кислота усиливает продукцию антител, индуцируя экспрессию белка стромального лимфопоэтина тимуса. J Immunol (2018) 200 (8): 2670–6. doi: 10.4049 / jimmunol.1701276
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
19. Джу С., Фукуяма Й., Пак Э.Дж., Юки Й., Курашима Й., Оучида Р. и др. Критическая роль TSLP-чувствительных дендритных клеток слизистой оболочки в индукции назального антиген-специфического ответа IgA. Mucosal Immunol (2017) 10 (4): 901–11. DOI: 10.1038 / mi.2016.103
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
20.Sallusto F, Lanzavecchia A. Эффективная презентация растворимого антигена культивируемыми дендритными клетками человека поддерживается фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов / макрофагов, плюс интерлейкин 4 и подавляется фактором некроза опухоли альфа. J Exp Med (1994) 179 (4): 1109–18. doi: 10.1084 / jem.179.4.1109
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
21. Дун Х, Ху Й, Лю Л., Цзоу М., Хуанг С., Луо Л. и др. Определенная роль коротких и длинных изоформ стромального лимфопоэтина тимуса в разрушении эпителиального барьера дыхательных путей, вызванном астматическим клещом домашней пыли. Sci Rep (2016) 6: 39559. doi: 10.1038 / srep39559
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
22. Bjerkan L, Schreurs O, Engen SA, Jahnsen FL, Baekkevold ES, Blix IJ, et al. Короткая форма TSLP конститутивно транслируется в кератиноцитах человека и имеет характеристики антимикробного пептида. Mucosal Immunol (2015) 8 (1): 49–56. doi: 10,1038 / mi.2014.41
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
24.Выгрецка М., Дахал Б.К., Косанович Д., Петерсен Ф., Таборски Б., фон Герлах С. и др. Тучные клетки и фибробласты работают вместе, чтобы усугубить фиброз легких: роль трансмембранного SCF и пути передачи сигналов PAR-2 / PKC-alpha / Raf-1 / p44 / 42. Am J Pathol (2013) 182 (6): 2094–108. doi: 10.1016 / j.ajpath.2013.02.013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
25. Келсо Э. Б., Локхарт Дж. С., Хембро Т., Даннинг Л., Плевин Р., Холленберг М. Д. и др. Терапевтические перспективы антагонизма рецептора-2, активируемого протеиназой, при воспалении суставов. J Pharmacol Exp Ther (2006) 316 (3): 1017–24. doi: 10.1124 / jpet.105.093807
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
26. Конче С., Булла Дж., Траутманн А., Рандриамампита С. Адгезия Т-клеток запускает индуцированные рецептором антигена кальциевые ответы посредством кратковременного повышения уровня аденозин-3 ’, 5’-циклического монофосфата. Иммунитет (2009) 30 (1): 33–43. doi: 10.1016 / j.immuni.2008.10.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
27.Гишар V, Бонилья Н., Дюран А., Одемар-Верже А., Гильбер Т., Мартин Б. и др. Опосредованное кальцием формирование фенотипа и функции наивных CD4 Т-клеток. Элиф (2017) 6: 1–26. doi: 10.7554 / eLife.27215
CrossRef Полный текст | Google Scholar
28. Duchemin M, Khamassi M, Xu L, Tudor D, Bomsel M. IgA, нацеленное на оболочку вируса иммунодефицита человека-1 gp41 запускает антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, перекрестную кладку и взаимодействует с gp41-специфическим IgG для увеличения лизиса клеток . Front Immunol (2018) 9 (244): 1–30. doi: 10.3389 / fimmu.2018.00244
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
29. Yeh CY, Yeh TH, Jung CJ, Chen PL, Lien HT, Chia JS. Активированные эпителиальные клетки носа человека модулируют специфический антительный ответ против бактериальных или вирусных антигенов. PloS One (2013) 8 (2): e55472. doi: 10.1371 / journal.pone.0055472
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
30. Цинь Т, Инь И, Ван Х, Лю Х, Лин Дж, Ю Q и др.Целые инактивированные вирусы птичьего гриппа H9N2 индуцируют дендритные клетки подслизистой оболочки носа для отбора проб вирусов просвета через трансэпителиальные дендриты и запускают последующее созревание ДК. Vaccine (2015) 33 (11): 1382–92. doi: 10.1016 / j.vaccine.2015.01.022
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
31. Юнг Ю.С., Мацумото С.Е., Ямасита М., Томимацу К., Теруя К., Катакура Ю. и др. Propionibacterium acnes действует как адъювант при иммунизации in vitro мононуклеарных клеток периферической крови человека. Biosci Biotechnol Biochem (2007) 71 (8): 1963–9. doi: 10.1271 / bbb.70159
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
32. Цилингири К., Форнаса Дж., Ресциньо М. Тимический стромальный лимфопоэтин: коротко. Cell Mol Gastroenterol Hepatol (2017) 3 (2): 174–82. doi: 10.1016 / j.jcmgh.2017.01.005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
33. Biton M, Levin A, Slyper M, Alkalay I, Horwitz E, Mor H, et al.Эпителиальные микроРНК регулируют иммунитет слизистой оболочки кишечника посредством взаимодействия эпителия с Т-клетками. Nat Immunol (2011) 12 (3): 239–46. doi: 10.1038 / ni.1994
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
34. Шрипада Л., Сингх К., Липатова А.В., Сингх А., Праджапати П., Томар Д. и др. hsa-miR-4485 регулирует функции митохондрий и подавляет онкогенность клеток рака груди. J Mol Med (Berl) (2017) 95 (6): 641–51. doi: 10.1007 / s00109-017-1517-5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
36.Wilson SR, The L, Batia LM, Beattie K, Katibah GE, McClain SP и др. Цитокин атопического дерматита TSLP, полученный из эпителиальных клеток, активирует нейроны, вызывая зуд. Cell (2013) 155 (2): 285–95. doi: 10.1016 / j.cell.2013.08.057
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
39. Шон-Хеград М.А., Оливер Дж., Макменамин П.Г., Холт П.Г. Исследования плотности, распределения и поверхностного фенотипа дендритных клеток (DC), несущих антиген главного комплекса гистосовместимости класса II, в проводящих дыхательных путях. J Exp Med (1991) 173 (6): 1345–56. doi: 10.1084 / jem.173.6.1345
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
41. Rimoldi M, Chieppa M, Salucci V, Avogadri F, Sonzogni A, Sampietro GM, et al. Кишечный иммунный гомеостаз регулируется перекрестным взаимодействием эпителиальных клеток и дендритных клеток. Nat Immunol (2005) 6 (5): 507–14. doi: 10.1038 / ni1192
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
42. Borrebaeck CA, Danielsson L, Moller SA.Человеческие моноклональные антитела, полученные из обработанных метиловым эфиром L-лейцина и иммунизированных in vitro лимфоцитов периферической крови. Biochem Biophys Res Commun (1987) 148 (3): 941-6. doi: 10.1016 / S0006-291X (87) 80223-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
43. Wijkhuisen A, Savatier A, Cordeiro N, Leonetti M. Производство антиген-специфических человеческих IgG путем иммунизации in vitro. BMC Biotechnol (2016) 16:22. doi: 10.1186 / s12896-016-0253-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
44.Курт-Джонс Е.А., Попова Л., Квинн Л., Хейнс Л.М., Джонс Л.П., Трипп Р.А. и др. Рецепторы распознавания образов TLR4 и CD14 опосредуют ответ на респираторно-синцитиальный вирус. Nat Immunol (2000) 1 (5): 398-401. doi: 10.1038 / 80833
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
45. Назли А., Кафка Дж. К., Феррейра В. Х., Анипинди В., Мюллер К., Осборн Б. Дж. И др. Gp120 ВИЧ-1 индуцирует TLR2- и TLR4-опосредованную активацию врожденного иммунитета в эпителии женских половых органов человека. J Immunol (2013) 191 (8): 4246–58.doi: 10.4049 / jimmunol.1301482
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
46. Джордж Дж. А., Ким С. Б., Чой Дж. Й., Патил А. М., Хоссейн ФМА, Уянгаа Э. и др. Зависимая от пути TLR2 / MyD88 регуляция дендритных клеток вирусом денге способствует антителозависимому усилению через Th3-смещенный иммунитет. Oncotarget (2017) 8 (62): 106050–70. doi: 10.18632 / oncotarget.22525
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
48. Ван Цюй, Ду Дж, Чжу Дж, Ян Х, Чжоу Б.Передача сигналов тимического стромального лимфопоэтина в CD4 (+) Т-клетках необходима для Th3-памяти. J Allergy Clin Immunol (2015) 135 (3): 781–91.e3. doi: 10.1016 / j.jaci.2014.09.015
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
49. Камекура Р., Кодзима Т., Коидзуми Дж., Огасавара Н., Куросе М., Го М. и др. Тимический стромальный лимфопоэтин усиливает барьерную функцию плотных соединений эпителиальных клеток носа человека. Cell Tissue Res (2009) 338 (2): 283–93. doi: 10.1007 / s00441-009-0855-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
50.Vliagoftis H, Schwingshackl A, Milne CD, Duszyk M, Hollenberg MD, Wallace JL, et al. Активированное протеиназой рецептор-2-опосредованное высвобождение матриксной металлопротеиназы-9 из эпителиальных клеток дыхательных путей. J Allergy Clin Immunol (2000) 106 (3): 537–45. DOI: 10.1067 / mai.2000.109058
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
52. Такано К., Кодзима Т., Го М., Мурата М., Ичимия С., Хими Т. и др. HLA-DR- и CD11c-положительные дендритные клетки проникают за пределы хорошо развитых эпителиальных плотных контактов в слизистую оболочку носа человека при аллергическом рините. J. Histochem Cytochem (2005) 53 (5): 611–9. doi: 10.1369 / jhc.4A6539.2005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
54. Meng H, Li H, Ohe R, Naing YA, Yang S, Kabasawa T. и др. Тимический стромальный лимфопоэтин в фолликулярных дендритных клетках миндалин коррелирует с повышенным титром сывороточного иммуноглобулина А, способствуя переключению класса иммуноглобулина А миндалин при нефропатии иммуноглобулина А. Перевод Рез. (2016) 176: 1–17. DOI: 10.1016 / j.trsl.2016.04.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
55. Smelter D, Thompson M, Meuchel L, Townsend E, Ryu A, Pabelick C, et al. Тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) и гладкие мышцы дыхательных путей. FASEB J (2009) 23 (1_приложение): 622.6–6. doi: 10.1096 / fasebj.23.1_supplement.622.6
CrossRef Полный текст | Google Scholar
56. Anjuere F, George-Chandy A, Audant F, Rousseau D, Holmgren J, Czerkinsky C. Чрескожная иммунизация адъювантом субъединицы холерного токсина B подавляет ответы антител IgE посредством селективной индукции иммунных ответов Th2. J Immunol (2003) 170 (3): 1586–92. doi: 10.4049 / jimmunol.170.3.1586
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тяжелый острый респираторный синдром Коронавирус 2 от пациента с коронавирусной болезнью, США — Том 26, номер 6 — июнь 2020 — Журнал Emerging Infectious Diseases
Новый коронавирус, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2 (SARS-CoV-2 ), был идентифицирован как источник вспышки пневмонии в Ухане, Китай, в конце 2019 года ( 1 , 2 ).Было обнаружено, что вирус является членом семейства β-коронавирусов того же вида, что и SARS-CoV и связанные с SARS CoV летучих мышей ( 3 , 4 ). Характер распространения указывает на то, что SARS-CoV-2 может передаваться от человека к человеку и может быть более передаваемым, чем SARS-CoV ( 5 — 7 ). Спайковый белок коронавирусов опосредует связывание вируса и проникновение в клетки. Первоначальная характеристика спайка SARS-CoV-2 указывает на то, что он связывает тот же рецептор, что и ангиотензинпревращающий фермент SARS-CoV, который экспрессируется как в верхних, так и в нижних дыхательных путях человека ( 8 ).
Беспрецедентная скорость распространения этой вспышки представляет острую потребность в эталонных реагентах. Сообщество общественного здравоохранения требует, чтобы вирусные лизаты служили диагностическими справочными материалами, а исследовательскому сообществу нужны вирусные изоляты для тестирования противовирусных соединений, разработки новых вакцин и проведения фундаментальных исследований. В этой статье мы описываем изоляцию SARS-CoV-2 от пациента, который болел коронавирусом (COVID-19) в США, и описываем его геномную последовательность и характеристики репликации.Мы сделали изолят вируса доступным для общественного здравоохранения, поместив его в 2 репозитория вирусных реагентов.
Сбор образцов
Выделение вируса из образцов пациентов не было признано исследованием на людях Национальным центром иммунизации и респираторных заболеваний, Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (определение исследования № 0900f3eb81ab4b6e). Клинические образцы от пациента, который заразился COVID-19 во время поездки в Китай и который был идентифицирован в Вашингтоне, США, были собраны, как описано ( 1 ).Образцы мазков из носоглотки (NP) и ротоглотки (OP) собирали на 3-й день после появления симптомов, помещали в 2-3 мл вирусной транспортной среды, использовали для молекулярной диагностики и замораживали. Подтвержденные ПЦР-положительные образцы были разделены на аликвоты и повторно заморожены до начала выделения вируса.
Культура клеток, предельное разведение и выделение вирусов
Мы использовали клетки Vero CCL-81 для выделения и первоначального пассажа. Мы культивировали клетки Vero E6, Vero CCL-81, HUH 7.0, 293T, A549 и EFKB3 в минимально необходимой среде Дульбекко (DMEM) с добавлением термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (5% или 10%) и антибиотиков / антимикотиков (GIBCO, https: // www.thermofisher.com). Для выделения вируса мы использовали образцы мазков NP и OP. Для выделения, предельного разведения и пассажа 1 вируса мы пипетировали 50 мкл бессывороточной среды DMEM в колонки 2–12 96-луночного планшета для культивирования тканей, затем пипеткой вносили 100 мкл клинических образцов в колонку 1 и последовательно разбавляли 2. -сложите по пластине. Затем мы трипсинизировали и ресуспендировали клетки Vero в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 × пенициллин / стрептомицин, 2 × антибиотики / антимикотики и 2 × амфотерицин B в концентрации 2.5 × 10 5 клеток / мл. Мы добавили 100 мкл клеточной суспензии непосредственно к разведениям клинических образцов и осторожно перемешали пипеткой. Затем мы выращивали инокулированные культуры во влажном инкубаторе при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 и ежедневно наблюдали цитопатические эффекты (CPE). Мы использовали стандартные анализы бляшек на SARS-CoV-2, основанные на протоколах SARS-CoV и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) ( 9 , 10 ).
Когда наблюдались CPE, мы соскребали клеточные монослои тыльной стороной кончика пипетки.Мы использовали 50 мкл вирусного лизата для экстракции общей нуклеиновой кислоты для подтверждающего тестирования и секвенирования. Мы также использовали 50 мкл вирусного лизата для инокуляции лунки 90% конфлюэнтного 24-луночного планшета.
Секвенирование всего генома
Мы разработали 37 пар вложенных ПЦР, охватывающих весь геном, на основе эталонной последовательности коронавируса (номер доступа в GenBank NC045512). Мы экстрагировали нуклеиновую кислоту из изолятов и амплифицировали с помощью 37 отдельных вложенных ПЦР. Мы использовали положительные ампликоны ПЦР индивидуально для последующего секвенирования по Сэнгеру, а также объединили их для подготовки библиотеки с помощью набора для секвенирования лигирования (Oxford Nanopore Technologies, https: // nanoporetech.com), впоследствии для секвенирования Oxford Nanopore MinION. Мы сгенерировали согласованные последовательности нанопор с помощью Minimap версии 2.17 (https://github.com) и Samtools версии 1.9 (http://www.htslib.org). Мы сгенерировали консенсусные последовательности путем секвенирования по Сэнгеру в обоих направлениях с помощью Sequencher версии 5.4.6 (https://www.genecodes.com) и дополнительно подтвердили их с помощью консенсусных последовательностей, сгенерированных в результате секвенирования нанопор.
Для секвенирования исходного пассажа 4 мы подготовили библиотеки для секвенирования с использованием набора Next Ultra II RNA Prep Kit (New England Biolabs, https: // www.neb.com) согласно протоколу производителя. Вкратце, мы фрагментировали ≈70–100 нг РНК в течение 15 мин с последующим синтезом кДНК, репарацией концов и лигированием адаптера. После 6 раундов ПЦР мы проанализировали библиотеки с помощью Agilent Bioanalyzer (https://www.agilent.com) и количественно оценили их с помощью количественной ПЦР. Мы объединили образцы и секвенировали образцы, используя протокол с парным концом на 75 оснований на приборе Illumina (Illumina, Inc., https://www.illumina.com) MiniSeq и с помощью набора High-Output Kit, а затем обработали считанные данные с помощью Trimmomatic версия 0.36 ( 11 ), чтобы удалить некачественные базовые вызовы и любые последовательности адаптеров. Мы использовали программу сборки de novo ABySS ( 12 ) для сборки считываний в контиги с использованием нескольких различных наборов считываний и значений kmer в диапазоне от 20 до 40. Мы сравнили контиги> 400 оснований с данными Национального центра биотехнологической информации (Bethesda). , MD, США) сбор нуклеотидов с помощью BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Почти полноразмерный вирусный контиг, полученный в каждом образце, на 100% идентичен штамму 2019-nCoV / USA-WA1 / 2020 (номер доступа в GenBank.MN985325.1). Все остальные контиги картированы либо на рРНК клетки-хозяина, либо на митохондрии. Мы сопоставили обрезанные чтения с эталонной последовательностью с помощью BWA версии 0.7.17 ( 13 ) и визуализировали эти чтения с помощью Integrated Genomics Viewer ( 14 ), чтобы подтвердить идентичность со штаммом USA-WA1 / 2020.
Электронная микроскопия
Мы соскребали инфицированные клетки Vero из колбы, осаждали низкоскоростным центрифугированием, промывали 0,1 моль / л фосфатным буфером, снова осаждали и фиксировали в течение 2 ч в 2.5% забуференный глутаральдегид. Затем мы закрепили образцы 1% тетроксидом осмия, блочно окрашивали 4% уранилацетатом, дегидратировали и заливали эпоксидной смолой. Мы вырезали ультратонкие срезы, окрашивали их 4% уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали их с помощью электронного микроскопа Thermo Fisher / FEI Tecnai Spirit (https://www.fei.com).
Анализ белков и вестерн-блоттинг
Мы собирали клеточные лизаты с использованием буфера для электрофореза для образцов додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля Laemmli (Bio-Rad, https: // www.bio-rad.com), содержащий 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанол. Мы удалили клеточные лизаты из лаборатории уровня биобезопасности 3, кипятили их и поместили в полиакриламидный гель. Мы подвергали лизаты электрофорезу в додецилсульфат-полиакриламидном геле натрия с последующим переносом на поливинилидендифторидную поливинилиденфторидную мембрану. Затем мы заблокировали мембрану в 5% обезжиренном сухом молоке, растворенном в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% твин-20 (TBS-T), в течение 1 ч, после чего следовала короткая промывка TBS-T.Мы инкубировали мембрану в течение ночи с первичным антителом, либо кроличьей поликлональной сывороткой против спайкового белка SARS-CoV (# 40150-T52; Sino Biological, https://www.sinobiological.com), либо антителом к β-актину (# 4970; Cell Signaling. Technology, https://www.cellsignal.com) или пользовательскую кроличью поликлональную сыворотку против нуклеокапсида SARS-CoV. Затем мы промывали мембрану 3 раза TBS-T и наносили вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, на 1 час. Впоследствии мы промыли мембрану 3 раза TBS-T, инкубировали с субстратом Clarity Western ECL (# 1705060S; Bio-Rad) и визуализировали с помощью многоцелевой системы визуализации.
Получение нуклеокапсидных антител против SARS-CoV
Мы использовали плазмиду pBM302 ( 15 ) для экспрессии нуклеокапсидного белка SARS-CoV с С-концевой меткой His6 до высоких уровней в телец включения Escherichia coli , и рекомбинантный белок был очищен от телец включения с помощью с использованием никель-аффинной колоночной хроматографии в денатурирующих условиях. Мы использовали ступенчатый диализ против трис / фосфатного буфера для повторной укладки рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV с уменьшением концентрации мочевины для ренатурации белка.Затем мы иммунизировали кроликов ренатурированным полноразмерным нуклеокапсидным белком SARS-CoV для создания аффинно очищенных кроличьих поликлональных антител к нуклеокапсидному белку SARS-CoV.
Рисунок 1
Рис. 1. Цитопатический эффект, вызванный коронавирусом 2 тяжелого острого респираторного синдрома у пациента с коронавирусной болезнью, США, 2020 г. A – C) Фазово-контрастная микроскопия монослоев клеток Vero через 3 дня после инокуляции: A) Мок, …
22 января 2020 года в штате Вашингтон был выявлен пациент с подтвержденным COVID-19.CPE не наблюдали в ложно инфицированных клетках (рис. 1, панель A). Значения порога цикла (C t ) составляли 18–20 для образцов NP и 21–22 для образцов OP ( 1 ). Положительные клинические образцы были разделены на аликвоты и повторно заморожены в культуру клеток 22 января 2020 г. Мы наблюдали за ЦПЭ через 2 дня после инокуляции и собирали вирусный лизат на 3 день после инокуляции (рис. 1, панели B, C). Мы использовали 50 мкл вирусных лизатов пассажа 1 для экстракции нуклеиновых кислот, чтобы подтвердить присутствие SARS-CoV-2 с помощью молекулярного диагностического анализа CDC ( 1 ).Значения C t для 3 экстрактов нуклеиновых кислот составили 16,0-17,1 для части 1 нуклеокапсида, 15,9-17,1 для части 2 нуклеокапсида и 16,2-17,3 для части 3 нуклеокапсида, что подтверждает выделение SARS-CoV-2 (C t <40 считается положительным результатом). Мы также протестировали экстракты еще 33 различных респираторных патогенов с помощью Fast Track 33 Assay. Других патогенов не обнаружено. Идентичность была дополнительно подтверждена электронной микроскопией тонких срезов (рис. 1, панель D).Мы наблюдали морфологию и морфогенез, характерные для коронавирусов.
Мы использовали изоляты из первого пассажа OP и образец NP для полногеномного секвенирования. Геномы из образца NP (номер доступа в GenBank MT020880) и образца OP (номер доступа в GenBank MT020881) показали 100% идентичность друг с другом. Изоляты также показали 100% идентичность с соответствующим клиническим образцом (номер доступа в GenBank MN985325).
После второго пассажа мы не культивировали отдельно образцы OP и NP.Мы пассировали вирусный изолят еще 2 раза в клетках Vero CCL-81 и титровали, определяя 50% инфекционную дозу для культуры ткани (TCID 50 ). Титры составляли 8,65 × 10 6 TCID 50 / мл для третьего пассажа и 7,65 × 10 6 TCID 50 / мл для четвертого пассажа.
Мы пассировали этот вирус в отсутствие трипсина. Последовательность шипового белка SARS-CoV-2 имеет вставку RRAR на интерфейсе S1-S2, которая может быть расщеплена фурином ( 16 ).Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа имеют высокоосновные сайты расщепления фурином на границе раздела гемагглютинин-белок HA1-HA2, что обеспечивает внутриклеточное созревание вирионов и более эффективную репликацию вируса ( 17 ). Вставка RRAR в SARS-CoV-2 может выполнять аналогичную функцию.
Рисунок 2
Рис. 2. Распространение вируса и количественное определение коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома от пациента с коронавирусной болезнью, США, 2020 г. A) Были определены два запаса вируса пассажа 4 (черный и серый кружки)…
Впоследствии мы создали запас SARS-CoV-2 для четвертого пассажа на клетках VeroE6, другой линии клеток почек плодов макаки-резус. Мы секвенировали вирусную РНК из запаса 4 пассажа SARS-CoV-2 и подтвердили, что она не содержит нуклеотидных мутаций по сравнению с исходной эталонной последовательностью (номер доступа в GenBank MN985325). Было обнаружено, что SARS-CoV хорошо растет на клетках VeroE6, а MERS-CoV — на клетках Vero CCL81 ( 18 , 19 ). Чтобы провести анализ бляшек и определить предпочтительный тип клеток Vero для количественной оценки, мы титровали наш запас пассажа 4 на клетках VeroE6 и VeroCCL81.После заражения серией разведений SARS-CoV-2 реплицировался в обоих типах клеток Vero; однако вирусные титры были немного выше в клетках VeroE6, чем в клетках Vero CCL81 (рис. 2, панель A). Кроме того, бляшки были более отчетливыми и видимыми на клетках Vero E6 (рис. 2, панель B). Уже через 2 дня после инокуляции клетки VeroE6 продуцировали отчетливые бляшки, видимые при окрашивании нейтральным красным. Напротив, клетки Vero CCL81 продуцировали менее прозрачные бляшки, и их легче всего количественно оценить путем окрашивания нейтральным красным через 3 дня после инокуляции.На отдельных монослоях бляшек инфицирование SARS-CoV-2 клеток Vero E6 продуцировало CPE с участками клиренса клеток (рис. 2, панель C). Напротив, клетки Vero CCL81 имели области мертвых клеток, которые сливались с образованием бляшек, но клетки не очищались. Вместе эти результаты предполагают, что клетки VeroE6 могут быть лучшим выбором для амплификации и количественной оценки, но оба типа клеток Vero поддерживают амплификацию и репликацию SARS-CoV-2.
Рисунок 3
Рис. 3. Клеточные линии пациента с коронавирусной болезнью, США, 2020 г., восприимчивые к коронавирусу SARS 2 (SARS-CoV-2).Клеточные линии были инфицированы с высокой множественностью инфекции (> 5), отмыты после адсорбции и …
Поскольку исследования были начаты для изучения и реагирования на SARS-CoV-2, необходима информация о клеточных линиях и типах, восприимчивых к инфекции. Поэтому мы исследовали способность SARS-CoV-2 инфицировать и реплицироваться в нескольких общих линиях клеток приматов и человека, включая клетки аденокарциномы человека (A549), клетки печени человека (HUH7.0) и клетки эмбриональной почки человека (HEK- 293T), в дополнение к клеткам Vero E6 и Vero CCL81.Мы также исследовали доступную линию клеток почек большой коричневой летучей мыши (EFK3B) на репликационную способность SARS-CoV-2. Каждую клеточную линию инокулировали при высокой множественности инфекции и исследовали через 24 часа после инфицирования (фиг. 3, панель A). СРЕ не наблюдали ни в одной из клеточных линий, за исключением клеток Vero, которые выросли до> 10 7 БОЕ через 24 часа после заражения. Напротив, клетки HUH7.0 и 293T показали лишь умеренную вирусную репликацию, а клетки A549 были несовместимы с инфекцией SARS-CoV-2. Эти результаты согласуются с предыдущими данными о чувствительности к SARS-CoV и предполагают, что другие распространенные системы культивирования, включая клетки MDCK, HeLa, HEP-2, MRC-5 и яйца с эмбрионами, вряд ли будут поддерживать репликацию SARS-CoV-2 ( 20 — 22 ).Кроме того, SARS-CoV-2 не реплицировался в клетках EFK3B летучих мышей, которые чувствительны к MERS-CoV. В совокупности результаты показывают, что SARS-CoV-2 поддерживает профиль, аналогичный SARS-CoV с точки зрения чувствительных клеточных линий.
Установив устойчивую инфекцию SARS-CoV-2 в нескольких типах клеток, мы затем оценили перекрестную реактивность антител SARS-CoV против SARS-CoV-2. Клеточные лизаты из инфицированных клеточных линий зондировали на анализ белка; мы обнаружили, что поликлональная сыворотка против белка шипа SARS-CoV и белков нуклеокапсида распознает SARS-CoV-2 (рис. 3, панели B, C).Белок нуклеокапсида, который является высококонсервативным в семействе группы 2B, сохраняет> 90% идентичности аминокислот между SARS-CoV и SARS-CoV-2. В соответствии с результатами репликации (Рисунок 3, панель A), SARS-CoV-2 показал устойчивый белок нуклеокапсида в обоих типах клеток Vero, меньшее количество белка в клетках HUH7.0 и 293T и минимальное количество белка в клетках A549 и EFK3B (Рисунок 3, панель B). Антитело к спайковому белку SARS-CoV также распознало спайковый белок SARS-CoV-2, что указывает на перекрестную реактивность (рис. 3, панель C).В соответствии с SARS CoV, наблюдались несколько расщепленных и нерасщепленных форм шипового белка SARS-CoV-2. Характер расщепления положительного контроля спайка SARS из клеток Calu3, линии респираторных клеток, незначительно варьируется и может указывать на различия между протеолитическим расщеплением белков спайков между двумя вирусами из-за предсказанной вставки сайта расщепления фурином в SARS-CoV- 2 ( 16 ). Однако различия в типах клеток и условиях усложняют эту интерпретацию и указывают на необходимость дальнейших исследований в эквивалентных системах.В целом, данные об экспрессии белка с нуклеокапсида SARS-CoV и антител к спайковому белку повторяют результаты репликации и показывают, что реагенты SARS-CoV могут быть использованы для характеристики инфекции SARS-CoV-2.
Рисунок 4
Рисунок 4. Многоступенчатая кривая роста коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома от пациента с коронавирусной болезнью, США, 2020 г. Клетки Vero CCL81 (черный) и HUH7.0 (зеленый) были инфицированы с множественностью …
Наконец, мы оценили кинетику репликации SARS-CoV-2 на многоступенчатой кривой роста.Вкратце, мы инфицировали клетки Vero CCL-81 и HUH7.0 SARS-CoV-2 при низкой множественности инфицирования (0,1) и оценивали репликацию вируса каждые 6 часов в течение 72 часов после инокуляции с отдельными сборами в ассоциированных с клетками и отсеки супернатанта (рис. 4). Подобно SARS-CoV, SARS-CoV-2 быстро реплицировался в клетках Vero после начальной фазы затмения, достигая 10 5 TCID 50 / мл через 24 часа после заражения и достигая пика> 10 6 TCID 50 / мл. Мы наблюдали аналогичные титры в ассоциированных с клетками и надосадочных компартментах, что указывало на эффективный выход.Несмотря на пиковые вирусные титры через 48 часов после инокуляции, основной CPE не наблюдался до 60 часов после инокуляции и достиг пика через 72 часа после инокуляции, что указывает на то, что инфицированные монослои должны быть собраны до того, как будет наблюдаться пик CPE. Репликация в клетках HUH7.0 также быстро увеличивалась после начальной фазы затмения, но выходила на плато через 24 часа после инокуляции во внутриклеточном компартменте при 2 × 10 3 TCID 50 / мл и снижалась через 66 часов после инокуляции. Вирус не обнаруживался в супернатанте инфицированных клеток HUH7 до 36 часов после инокуляции и демонстрировал более низкие титры во все моменты времени (фиг. 4).Основной CPE никогда не наблюдался в клетках HUH7.0. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами для SARS-CoV и MERS-CoV, которые предполагали аналогичную динамику репликации между зоонозными штаммами CoV ( 23 , 24 ).
Риски и безопасность потребления полифенолов | Американский журнал клинического питания
РЕФЕРАТ
В этой статье дается обзор потенциальных опасностей употребления полифенолов, о которых сообщалось в ходе круглого стола на 1-й Международной конференции по полифенолам и здоровью, состоявшейся в Виши, Франция, в ноябре 2003 года.Неблагоприятные эффекты полифенолов оценивались в основном в экспериментальных исследованиях. Известно, например, что некоторые полифенолы могут обладать канцерогенными / генотоксическими эффектами или могут мешать биосинтезу гормонов щитовидной железы. Изофлавоны представляют особый интерес из-за их эстрогенной активности, для которой наблюдались как положительные, так и вредные эффекты. Кроме того, потребление полифенолов подавляет абсорбцию негемового железа и может привести к истощению запасов железа в группах населения с предельными запасами железа.Наконец, полифенолы могут взаимодействовать с некоторыми фармацевтическими агентами и усиливать их биологические эффекты. Важно учитывать дозы, при которых проявляются эти эффекты, по отношению к концентрациям, которые естественным образом возникают в организме человека. Поэтому будущие исследования, оценивающие полезные или неблагоприятные эффекты, должны включать соответствующие формы и дозы полифенолов, и до разработки обогащенных пищевых продуктов или добавок с фармакологическими дозами следует провести оценку безопасности применяемых доз.
ВВЕДЕНИЕ
За последние несколько десятилетий накопление данных показало потенциальные положительные эффекты полифенолов (1,2). Иногда это приводило к переоценке современных знаний об их влиянии, игнорируя тот факт, что некоторые продукты, богатые полифенолами, ранее считались несъедобными (например, соя). Эти исследования стимулировали дополнительные исследования, сфокусированные на влиянии на здоровье продуктов, богатых полифенолами, определенных фенольных соединений или добавок с комбинацией нескольких типов полифенолов.Когда станут доступны обширные таблицы состава пищевых продуктов для полифенолов, можно будет проводить тщательные эпидемиологические исследования, потенциально подтверждающие обнадеживающие результаты в основном экспериментальных данных, представленных на сегодняшний день. Можно даже запланировать маломасштабные исследования вмешательства на людях для проверки воздействия на суррогатные конечные точки заболевания. Однако прежде чем мы перейдем к этой стадии, мы должны изучить потенциальные неблагоприятные эффекты полифенолов. Принимая во внимание неутешительные результаты интервенционных испытаний с добавлением β-каротина (3), мы должны учитывать тот факт, что полифенолы в определенных группах населения могут иметь эффекты, противоположные желаемым.Другими словами, нельзя предполагать безопасность повышенного водозабора.
ВПУСКНОЙ
В рекомендациях компаний, продающих различные пищевые добавки, богатые полифенолами, некоторые рекомендуют потребление изофлавонов 50 мг / сут или экстрактов виноградных косточек 100–300 мг / сут, богатых проантоцианидинами. Эти уровни потребления близки к уровням потребления соевых продуктов в Японии или винограда или вина в некоторых европейских странах (4,5). Тем не менее, некоторые производители пищевых добавок рекомендуют дозы намного выше, чем те, которые в настоящее время связаны с диетой.Таблетки или капсулы, содержащие 300 мг кверцетина, 1 г цитрусовых флавоноидов или 20 мг ресвератрола, с рекомендуемым приемом 1-6 таблеток или капсул в день, обычно можно найти в Интернете. Это приведет к увеличению потребления примерно в 100 раз по сравнению с обычным потреблением в западной диете.
Кроме того, некоторые из этих добавок могут казаться безопасными при выделении из пищевых растений, но метод экстракции, используемый для производства добавок, может влиять на природу проглатываемых соединений и, таким образом, на безопасность продукта.Это произошло с водно-спиртовым экстрактом чайных почек, продаваемым в качестве добавки для похудения, которая была снята с рынка из-за тяжелых случаев токсического поражения печени (6).
ОЦЕНКА РИСКА И ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ
Это подводит нас непосредственно к проблеме оценки рисков и оценки безопасности. Опасность, риск и безопасность — это разные вопросы, каждый из которых следует учитывать (, таблица 1, ). Тщательная оценка риска для полифенолов сложна не только потому, что существует так много различных соединений, но и потому, что в настоящее время доступны не все необходимые инструменты.Хотя опасности могут быть идентифицированы и охарактеризованы, оценка воздействия (т.е. известное / предполагаемое потребление) не может быть произведена из-за отсутствия данных о составе пищевых продуктов. Оценка воздействия посредством измерения биомаркеров также оказалась сложной, поскольку может существовать метаболическая специфичность среди популяций и отдельных лиц, а методы простого измерения таких биомаркеров и соответствующие данные о достоверности в основном отсутствуют. Поэтому чрезвычайно сложно узнать, безопасны ли предлагаемые поступления или каковы вероятные риски при этих поступлениях.Наблюдалось несколько нежелательных эффектов различных фенольных соединений, которые описаны здесь в качестве примера идентификации опасности (, таблица 2, ). Они также обсуждались во время круглого стола на 1-й Международной конференции по полифенолам и здоровью, но список эффектов не является исчерпывающим.
ТАБЛИЦА 1Термины, используемые при оценке риска и безопасности
| Термин | Определение |
| Опасность | Возможность вызвать побочные эффекты |
| Риск | Вероятность возникновения указанных побочных эффектов доза / уровень |
| Безопасность | Практическая уверенность в том, что не будет наблюдаться никаких побочных эффектов |
| Срок | Определение |
| Опасность | Опасность | Возможные побочные эффектыВероятность возникновения побочных эффектов при определенной дозе / уровне |
| Безопасность | Практическая уверенность в том, что побочных эффектов не будет |
Термины, используемые при оценке риска и безопасности
| Термин | Определение |
| Опасность | Способность вызывать побочные эффекты |
| Риск | Вероятность того, что побочные эффекты возникнут при определенной дозе / уровне |
| Неблагоприятные | |
| Неблагоприятные Безопасность 913 эффекты будут наблюдаться |
| Срок | Определение |
| Опасность | Возможность вызвать побочные эффекты |
| Уровень риска | Побочные эффекты 913 Вероятность появления побочных эффектов 913 |
| Безопасность | Практическая уверенность в отсутствии побочных эффектов |
Опасности, связанные с полифенолами
| Опасность |
| Канцерогенность / генотоксичность |
| Тиреоидная токсичность 131316 |
| Токсичность 131316 |
| 913 913 913 913 913 913 913 913 Взаимодействие с эстрогенами 913 913 913 913 913 913 Взаимодействие с эстрогенами |
| Опасность | |||
| Фармацевтическая канцерогенность / генотоксичность | |||
| Тиреоидная токсичность | |||
| Эстрогенная активность изофлавонов 141319 | |||
| Эстрогенная активность изофлавонов 9134 913 913 913 913 Взаимодействие с изофлавонами | 913 913 913 916
| Опасность |
| Канцерогенность / генотоксичность |
| Токсичность для щитовидной железы |
| Estro генная активность изофлавонов |
| Антипитательные эффекты |
| Взаимодействие с фармацевтическими препаратами |
| Опасность | |||
| 913 916 913 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 Генотоксичность | |||
| Эффекты против питания | |||
| Взаимодействие с фармацевтическими препаратами |
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОПАСНОСТИ ДЛЯ ПОЛИФЕНОЛОВ
Большинство исследований полифенолов было направлено на определение защитного действия полифенолов против болезней или токсичных лекарств, и относительно небольшое число исследователей изучали их возможную токсичность.Не наблюдалось острой токсичности после перорального введения экстракта проантоцианидина виноградных косточек в дозе 0,5 или 2 г / кг массы тела крысам или мышам (7) или после введения пуникалагина (эллагитаннин, присутствующий в гранатовом соке) в дозе 60 г / кг корма для крыс (8). Однако хроническая нефропатия наблюдалась у крыс, когда к их рациону добавлялись высокие дозы кверцетина (2% или 4%) (9). В этом исследовании не наблюдалось никакого влияния на продолжительность жизни, тогда как добавление кверцетина (0,1%) в рацион мышей значительно сократило продолжительность их жизни (10).
Некоторые полифенолы могут оказывать канцерогенное или генотоксическое действие в высоких дозах или концентрациях (11–13). Например, кофейная кислота, когда она присутствует в рационе на уровне 2%, вызвала опухоли желудка и почек у крыс и мышей (14). Линейная экстраполяция этих данных указывает на значительный риск при нормальном питании. Кроме того, постулируется, что катехолестрогены опосредуют индукцию почечных опухолей эстрадиолом. Кверцетин ингибирует O -метилирование катехолестрогенов и увеличивает концентрацию 2- и 4-гидроксиэстродиола в почках на 60-80%.Это может привести к усилению окислительно-восстановительного цикла катехолестрогенов и индуцированному эстрадиолом туморогенезу (15,16). Возможно, что наблюдаемые in vitro генотоксические эффекты могут быть связаны с используемыми высокими концентрациями, при которых полифенолы могут стать прооксидантами (17). Образование аддуктов глутатионилкверцетина было показано в богатых тирозиназой клетках меланомы B16F-10 и в богатой миелопероксидазой клеточной линии HL-60 человека, что является важным доказательством прооксидантного метаболизма кверцетина в клеточных моделях in vitro (H. van der Вуд, личное сообщение на 1-й Международной конференции по полифенолам и здоровью, 2003 г.) (18).Это также предполагает, что ткани, богатые окислительными ферментами, могут быть особенно уязвимы к прооксидантной токсичности кверцетина. Наконец, было обнаружено, что катехины зеленого чая (1% или 0,1% от рациона) усиливают развитие опухоли в толстой кишке самцов крыс F344, и, хотя кверцетин может снижать пролиферацию раковых клеток в высоких дозах, было обнаружено, что он стимулирует пролиферацию клеток. в низких дозах (1–5 мкмоль / л) (19,20).
Как и синтетические антиоксиданты, некоторые флавоноиды могут ингибировать пероксидазу щитовидной железы и влиять на биосинтез тироидных гормонов (свободнорадикальное йодирование) (21,22).Когда крысам вводили витексин, С-гликозилфлавон, который содержится в большом количестве в просе, он увеличивал массу щитовидной железы и снижал уровни гормонов щитовидной железы в плазме (23). Считается, что это одна из причин эндемического зоба в Западной Африке, где просо является основным продуктом питания. Кроме того, снижение активности тироидпероксидазы наблюдалось у крыс, получавших диету с добавлением генистеина (24,25). Эти эффекты генистеина на функцию щитовидной железы более выражены в случаях дефицита йода. Это вызывает особую озабоченность у младенцев, подвергшихся воздействию особенно высоких доз изофлавонов при кормлении соей (26).Однако среди взрослых 2 клинических исследования не показали значительного воздействия на гормоны щитовидной железы после употребления изофлавон-содержащих соевых белков в течение 3-6 месяцев (27,28).
Изофлавоны — это семейство полифенолов, которые отличаются своей эстрогеноподобной активностью. Именно из-за этой активности они могут иметь как положительные, так и побочные эффекты (29,30). Общие уровни изофлавонов в плазме обычно составляют от 0,05 до 5 мкмоль / л даже в азиатских популяциях, которые представляют потребителей больших количеств продуктов, богатых изофлавонами, таких как соя.Потребление изофлавонов при западной диете оценивается в 0,2–5 мг / сутки, тогда как при традиционной азиатской диете доставляется 20–120 мг изофлавонов в сутки (31,32). Эти уровни потребления были признаны безопасными при всестороннем обзоре, хотя недостаточно данных, чтобы сделать выводы о влиянии на рак или неврологические заболевания (33). Высокое потребление было связано со снижением фертильности у животных и с эффектами антилютеинизирующего гормона у женщин в пременопаузе (34–37). Кроме того, были высказаны опасения относительно полового созревания младенцев, получающих очень высокие уровни изофлавонов в детских смесях на основе сои (38,39).Это особенно важно для мальчиков, у которых обычно наблюдается секреция лютеинизирующего гормона от рождения до 6 мес. (40). Поэтому важно отметить, что благотворное влияние изофлавонов на развитие рака за счет ингибирования определенных ферментов наблюдалось на уровнях, которые все намного выше (некоторые более чем в 20 раз выше), чем те, которые обычно наблюдаются в плазме крови человека (41–43). ). На этих уровнях изофлавоны могут оказывать антиандрогенное действие, влиять на мужскую и женскую фертильность и половое развитие в утробе матери и после рождения, а также вызывать атрофию яичек (44–47).
Потребление полифенолов может также иметь антипитательный эффект. Ингибирование абсорбции негемового железа, связанное с одновременным употреблением чая, хорошо известно; высокое потребление полифенолов может увеличить риск истощения запасов железа в популяциях людей с маргинальным статусом железа (48). В этом отношении важен тот факт, что основные источники полифенолов, такие как кофе, чай и вино, которые регулярно употребляются во время еды, не содержат витамина С, который является усилителем всасывания негемового железа (49).Кроме того, проантоцианидины (конденсированные танины) и эллагитаннины считаются антипитательными соединениями, особенно в питании животных, поскольку они способны взаимодействовать с белками и ингибировать несколько ферментов. Они влияли на рост и усвояемость крыс при добавлении в рацион в высокой дозе (10 г / кг рациона), но не в более низкой дозе (50). Потребление фава-бобов, богатых проантоцианидином, египетскими мальчиками снизило чистую утилизацию протеина, которая была восстановлена после шелушения (51).Следует отметить, что эти конкретные эффекты вряд ли возникнут при использовании обычных западных диет, которые характеризуются гораздо меньшим потреблением танинов (52).
Наконец, полифенолы могут влиять на биодоступность и фармакокинетику лекарств. Некоторые препараты, такие как бензодиазепины и терфенадин, демонстрируют до 3-кратное увеличение биодоступности с грейпфрутовым соком (богатым нарингенином) из-за ингибирования CYP3A4 (53–55). Эти эффекты, которые могут быть частично приписаны псораленам, а также нарингенину, клинически значимы в случае циклоспорина из-за узкого терапевтического диапазона (например, при использовании после трансплантации органов).
Большинство из этих эффектов было показано в исследованиях in vitro или на животных, и не было доказано, что эти эффекты также встречаются у людей. Поступления из привычного рациона обычно ниже, чем дозы, используемые в этих исследованиях, и пищевая матрица также может влиять на эффекты полифенолов, что может объяснить, почему эпидемиологические исследования, проводимые наблюдениями, на сегодняшний день не показали, например, каких-либо канцерогенных эффектов полифенолов (56 ) (хотя это, вероятно, также связано с отсутствием точной оценки воздействия и остаточным искажением).Однако мы должны серьезно относиться к результатам экспериментальных исследований, так же серьезно, как мы относимся к положительным эффектам. Таким образом, известные канцерогенные и разрушающие эндокринную систему эффекты некоторых полифенолов у животных делают испытания на людях высоких доз этих полифенолов неэтичными.
ВЫВОДЫ
Из вышеупомянутых выводов ясно, что при оценке экспериментальных исследований мы должны внимательно смотреть на используемые дозы. В 17 веке Парацельс сказал: «Все вещества являются ядами, и нет ничего, что не было бы ядом.Это доза, которая отличает яд от лекарства ». Доза, оказывающая положительный эффект на культуры клеток, может быть ядовита при применении в условиях человека. В качестве альтернативы, доза, используемая в экспериментальном исследовании, может никогда не встретиться на людях, потому что потребление никогда не достигает того же уровня, из-за очень низкой биодоступности или из-за того, что соответствующая доза никогда не достигает целевого участка. Форма фенольного соединения также важна, поскольку фенольные соединения присутствуют в пище в основном в виде конъюгированных соединений, а вещества, присутствующие в плазме и тканях, в основном являются конъюгатами млекопитающих, за исключением некоторых изофлавонов и флавонолов.Все эти аспекты должны быть приняты во внимание при планировании будущих экспериментальных исследований в области полифенолов; необходимо попытаться более тщательно смоделировать ситуацию с людьми, независимо от того, нацелены ли исследования на оценку положительных или отрицательных эффектов.
Наконец, необходимо отметить, что уровни воздействия зависят от способа представления полифенолов. Риск употребления высоких доз полифенолов из продуктов, богатых природными полифенолами, невелик, но мы должны принимать во внимание отрицательные эффекты других ингредиентов в этих продуктах, таких как жиры, повышающие холестерин в кофе, алкоголь в вине и жир в шоколаде. .Пища может быть обогащена полифенолами, но мы должны быть уверены, что они потребляются целевыми группами населения, для которых они предназначены, а не группами населения, потенциально подверженными риску, такими как дети и беременные женщины. Могут быть разработаны диетические добавки, содержащие высокие (т.е. фармакологические) дозы полифенолов. Тогда потребление полифенолов может легко достичь очень высокого уровня; в таких случаях может потребоваться токсикологическое тестирование для подтверждения безопасных уровней приема. В этом отношении недавний отчет об оценке безопасности растительных препаратов и растительных препаратов для использования в пищевых продуктах и пищевых добавках вполне может относиться к области полифенолов (57).Тип оценки безопасности будет зависеть от природы полифенолсодержащего продукта (пищевой продукт, пищевой экстракт или чистое соединение) и от предполагаемого использования, которое может привести к значительному увеличению воздействия.
Перед тем, как проводить испытания с участием человека для оценки воздействия полифенолов на хронические заболевания с использованием обогащенных пищевых продуктов или добавок (с питательными или фармакологическими дозами полифенолов), следует провести оценку безопасности применяемой дозы, чтобы предотвратить неэтичные исследования от проводимых.Однако, прежде чем мы дойдем до этой стадии, нам необходимо накопить значительный объем данных, полученных в результате эпидемиологических исследований in vitro, животных и наблюдательных эпидемиологических исследований только с соответствующими формами и дозами, чтобы приписать потенциальный положительный эффект общему или конкретному потреблению полифенолов.
Мы благодарим аудиторию за их вопросы и вклад во время круглого стола на 1-й Международной конференции по полифенолам и здоровью, состоявшейся в Виши, Франция, ноябрь 2003 г.
ССЫЛКИ
1.Tapiero
H
,Tew
KD
,Ba
GN
,Mathe
G
.Полифенолы: играют ли они роль в профилактике патологий человека?
Biomed Pharmacother
2002
;56
:200
—7
.2.Omenn
GS
,Goodman
GE
,Thornquist
MD
и др.Влияние комбинации β-каротина и витамина А на рак легких и сердечно-сосудистые заболевания
.N Engl J Med
1996
;334
:1150
—5
.3.Исследовательская группа по профилактике рака с альфа-токоферолом, бета-каротином
.Влияние витамина Е и β-каротина на заболеваемость раком легких и другими видами рака у курящих мужчин
.N Engl J Med
1994
;330
:1029
—35
.4.Scalbert
A
,Williamson
G
.Диетическое потребление и биодоступность полифенолов
.J Nutr
2000
;130
:2073S
—85S
.5.Манах
C
,Scalbert
A
,Morand
C
,Rémésy
C
,Jimenez
L
.Полифенолы: источники пищи и биодоступность
.Am J Clin Nutr
2004
;79
:727
—47
.6.Французское агентство безопасности продукции Санте.Suspension de l’autorisation de mise sur le marché de la spécialité Pharmaceutique Exolise (gallate d’épigallocatéchol). (Приостановление разрешения на выпуск на рынок фармацевтического препарата Exolise (эпигаллокатехол галлат).) Интернет: http://agmed.sante.gouv.fr/htm/10/filcoprs/030401.htm (по состоянию на 4 февраля 2004 г.) (На французском).
7.Ray
S
,Bagchi
D
,Lim
PM
и др.Острая и долгосрочная оценка безопасности нового экстракта проантоцианидина виноградных косточек IH636
.Res Commun Mol Pathol Pharmacol
2001
;109
:165
—97
,8.Cerda
B
,Ceron
JJ
,Tomas-Barberan
FA
,Espin
JC
.Повторное пероральное введение высоких доз гранатового эллагитаннина пуникалагина крысам в течение 37 дней не является токсичным
.J Agric Food Chem
2003
;51
:3493
—501
.9.Dunnick
JK
,Hailey
JR
.Исследования токсичности и канцерогенности кверцетина, природного компонента пищевых продуктов
.Fundam Appl Toxicol
1992
;19
:423
—31
.10.Джонс
E
,Hughes
RE
.Кверцетин, флавоноиды и продолжительность жизни мышей
.Exp Gerontol
1982
;17
:213
—7
.11.Hirose
M
,Takesada
Y
,Tanaka
H
,Tamano
S
,Kato
T
,Shirai
9.Канцерогенность антиоксидантов BHA, кофейной кислоты, сезамола, 4-метоксифенола и катехола в низких дозах, отдельно или в комбинации, и модуляция их эффектов в модели среднесрочного мультиорганного канцерогенеза у крыс
.Канцерогенез
1998
;19
:207
—12
.12.Snyder
RD
,Gillies
PJ
.Оценка кластогенных, интеркаляционных свойств ДНК и взаимодействия с топоизомеразой II биофлавоноидов в клетках V79 китайского хомяка
.Environ Mol Mutagen
2002
;40
:266
—76
. 13.Catterall
F
,Souquet
JM
,Cheynier
V
и др.Дифференциальная модуляция генотоксичности пищевых канцерогенов природными мономерными и димерными полифенолами
.Environ Mol Mutagen
2000
;35
:86
—98
. 14.Hagiwara
A
,Hirose
M
,Takahashi
S
,Ogawa
K
,Shirai
T
Ito
Канцерогенность кофеиновой кислоты для лесов и почек у крыс F344 и мышей C57BL / 6N × C3H / HeN F 1 мышей
.Cancer Res
1991
;51
:5655
—60
.15.Zhu
BT
,Liehr
JG
.Ингибирование катехол O -метилтрансфераза, катализируемое O -метилирование 2- и 4-гидроксиэстрадиола кверцетином: возможная роль в индуцированном эстрадиолом туморогенезе
.J Biol Chem
1996
;271
:1357
—63
. 16.Zhu
BT
,Liehr
JG
.Кверцетин увеличивает выраженность эстрадиол-индуцированного туморогенеза в почках хомяка
.Toxicol Appl Pharmacol
1994
;125
:149
—58
. 17.Sakihama
Y
,Cohen
MF
,Grace
SC
,Yamasaki
H
.Растительная фенольная антиоксидантная и прооксидантная активность: окислительное повреждение растений, вызванное фенолами, опосредованное металлами
.Токсикология
2002
;177
:67
—80
.18.Awad
HM
,Boersma
MG
,Boeren
S
и др.Идентификация O -хинон / хинонметидных метаболитов кверцетина в клеточной системе in vitro
.FEBS Lett
2002
;520
:30
—4
,19.Hirose
M
,Hoshiya
T
,Mizoguchi
Y
,Nakamura
A
,Akagi
K
,Shirai.
Катехины зеленого чая усиливают развитие опухоли в толстой кишке без воздействия на легкие или щитовидную железу после предварительной обработки 1,2-диметилгидразином или 2,2-дигидрокси-ди- n -пропилнитрозамином у самцов крыс F344
.Cancer Lett
2001
;168
:23
—9
.20.van der Woude
H
,Gliszczynska-Swiglo
A
,Struijs
K
,Smeets
A
,Alink
000 GM
Двухфазная модуляция пролиферации клеток кверцетином в концентрациях, физиологически значимых для человека
.Cancer Lett
2003
;200
:41
—7
. 21.Феррейра
AC
,Лиссабон
PC
,Oliviera
KJ
,Lima
LP
,Barros
IA
,DP Carvalho
Ингибирование активности дейодиназы тироидного типа 1 флавоноидами
.Food Chem Toxicol
2002
;40
:913
—7
. 22.Doerge
DR
,Sheehan
DM
.Гойтрогенная и эстрогенная активность изофлавонов сои
.Environ Health Perspect
110
(доп.3
):349
—53
,2002
. 23.Doerge
DR
,Chang
HC
.Инактивация пероксидазы щитовидной железы изофлавонами сои, in vitro и in vivo
.J Chromatogr B Анал Technol Biomed Life Sci
2002
;777
:269
—79
. 24.Чанг
HC
,Doerge
DR
.Диетический генистеин инактивирует пероксидазу щитовидной железы крыс in vivo без явного гипотиреоидного эффекта
.Toxicol Appl Pharmacol
2000
;168
:244
—52
. 25.Форт
P
,Moses
N
,Fasano
M
,Goldberg
T
,Lifshitz
F
.Кормление грудью и соевыми смесями в раннем детстве и распространенность аутоиммунных заболеваний щитовидной железы у детей
.J Am Coll Nutr
1990
;9
:164
—7
. 26.Манро
IC
,Харвуд
M
,Hlywka
JJ
и др.Изофлавоны сои: обзор безопасности
.Nutr Ред.
2003
;61
:1
—33
.27.Duncan
AM
,Underhill
KEW
,Xu
X
,LaValleur
J
,Phipps
WR
,.Умеренные гормональные эффекты изофлавонов сои у женщин в постменопаузе
.J Clin Endocrinol Metab
1999
;84
:3479
—84
. 28.Persky
VW
,Turyk
ME
,Wang
L
и др.Влияние соевого белка на эндогенные гормоны у женщин в постменопаузе
.Am J Clin Nutr
2002
;75
:145
—53
,29.Осоки
AL
,Питомник
EJ
.Фитоэстрогены: обзор современного состояния исследований
.Phytother Res
2003
;17
:845
—69
.30.Сетчелл
KDR
,Кэссиди
A
.Пищевые изофлавоны: биологические эффекты и значение для здоровья человека
.J Nutr
1999
;129
:758S
—67S
.31.ван Эрп-Баарт
MA
,Brants
HAM
,Kiely
M
, et al.Потребление изофлавонов в четырех разных европейских странах: подход VENUS
.Br J Nutr
2003
;89
(доп. 1
):815
—21
.32.Нагата
C
,Takatsuka
N
,Shimizu
H
.Потребление сои и рыбьего жира и смертность в японском сообществе
.Am J Epidemiol
2002
;156
:824
—31
. 33.Vallet
J
,Rouanet
J-M
,Besançon
P
.Танины из диетических косточек винограда: влияние на пищевой баланс и на некоторые ферментативные активности вдоль оси крипта-ворсинка тонкого кишечника крысы
.Энн Нутр Метаб
1994
;38
:75
—84
. 34.Hughes
CL
.Фитохимическая имитация репродуктивных гормонов и модуляция фертильности травоядных фитоэстрогенами
.Environ Health Perspect
1988
;78
:171
—4
.35.Bennetau-Pelissero
C
,Breton
BB
,Bennetau
B
, et al.Влияние рациона, обогащенного генистеином, на эндокринный процесс гаметогенеза и эффективность воспроизводства радужной форели Oncorhynchus mykiss
.Gen Comp Endocrinol
2001
;121
:173
—87
.36.Setchell
KDR
,Gosselin
SJ
,Welsh
MB
, et al.Диетические эстрогены: вероятная причина бесплодия и заболеваний печени у гепардов в неволе
.Gen Comp Endocrinol
1987
;93
:225
—33
.37.Кэссиди
A
,Bingham
S
,Сетчелл
KDR
.Биологические эффекты диеты, содержащей соевый белок, богатый изофлавонами, на менструальный цикл женщин в пременопаузе
.Am J Clin Nutr
1994
;60
:333
—40
0,38.Сетчелл
KDR
,Zimmer-Nechemias
L
,Cai
J
,Heubi
JE
.Воздействие на младенцев фитоэстрогенов из детских смесей на основе сои
.Ланцет
1997
;350
:23
—7
.39.Mendez
MA
,Anthony
MS
,Arab
L
.Смеси на основе сои и рост и развитие младенцев: обзор
.J Nutr
2002
;132
:2127
—30
.40.Шарп
RM
,Франк
S
.Окружающая среда, образ жизни и бесплодие: проблема поколений
.Nat Cell Biol
2002
;4
(доп.):S33
—40
.41.Le Bail
JC
,Laroche
T
,Marre-Fournier
F
,Habrioux
G
.Ингибирование ароматазы и 17β-гидроксистероиддегидрогеназы флавоноидами
.Cancer Lett
1998
;133
:101
—6
.42.Fotsis
T
,Pepper
M
,Montesano
R
и др.Фитоэстрогены и ингибирование ангиогенеза
.Clin Endocrinol Metab Байера
1998
;12
:649
—66
. 43.Evans
BA
,Griffiths
K
,Morton
MS
.Ингибирование 5α-редуктазы в фибробластах кожи половых органов и ткани предстательной железы диетическими лигнанами и изофлавоноидами
.J Endocrinol
1995
;147
:295
—302
. 44.Nagao
T
,Yoshimura
S
,Saito
Y
,Nakagomi
M
,Usumi
K
,Ono
Эффекты репродуктивной функции самцов и самок крыс при неонатальном воздействии генистеина
.Reprod Toxicol
2001
;15
:399
—411
.45.Wisniewski
AB
,Klein
SL
,Lakshmanan
Y
,Gearhart
JP
.Воздействие генистеина во время беременности и кормления грудью демаскулинизирует репродуктивную систему у крыс
.Дж Урол
2003
;169
:1582
—6
. 46.Леви
JR
,Faber
KA
,Ayyash
L
,Hughes
CL
.Влияние пренатального воздействия генистеина фитоэстрогена на половую дифференциацию у крыс
.Proc Soc Exp Biol Med
1995
;208
:60
—6
. 47.Delclos
KB
,Bucci
TJ
,Lomax
LG
и др.Эффекты воздействия генистеина с пищей во время развития на самцов и самок крыс CD (Sprague-Dawley)
.Reprod Toxicol
2001
;15
:647
—63
.48.Temme
EHM
,van Hoydonck
PG
.Потребление чая и состояние железа
.евро J Clin Nutr
2002
;56
:379
—86
.49.Zijp
IM
,Korver
O
,Tijburg
LBM
.Влияние чая и других диетических факторов на усвоение железа
.Crit Rev Food Sci Nutr
2000
;40
:371
—98
.50.Santos-Buelga
C
,Scalbert
A
.Проантоцианидины и таниноподобные соединения: природа, возникновение, потребление с пищей и влияние на питание и здоровье
.J Sci Food Agric
2000
;80
:1094
—117
. 51.Хуссейн
L
,Аббас
H
.Исследования баланса азота среди мальчиков, получавших комбинации бобов бобы и пшеницы, различающиеся по содержанию полифенолов
.Nutr Rep Int
1985
;31
:67
—81
,52.Arts
ICW
,Hollman
PCH
.Полифенолы и риск заболеваний в эпидемиологических исследованиях
.Am J Clin Nutr
2005
;81
(доп.):317S
—25S
. 53.Veronese
ML
,Gillen
LP
,Burke
JP
и др.Зависимое от воздействия ингибирование кишечного и печеночного CYP3A4 in vivo грейпфрутовым соком
.J Clin Pharmacol
2003
;43
:831
—9
. 54.Lilja
JJ
,Kivisto
KT
,Backman
JT
,Neuvonen
PJ
.Влияние дозы грейпфрутового сока на взаимодействие грейпфрутового сока и триазолама: повторное употребление продлевает период полувыведения триазолама
.евро J Clin Pharmacol
2000
;56
:411
—5
.55.Ameer
B
,Weintraub
RA
.Лекарственные взаимодействия с грейпфрутовым соком
.Clin Pharmacokinet
1997
;33
:103
—21
. 56.Hertog
MGL
,Hollman
PCH
,Katan
MB
,Kromhout
D
.Потребление потенциально антиканцерогенных флавоноидов и их детерминант у взрослых в Нидерландах
.Nutr Cancer
1993
;20
:21
—9
. 57.Schilter
B
,Andersson
C
,Anton
R
и др.