Ст 44 тк рф с комментариями 2019: Статья 44 ТК РФ. Изменение и дополнение коллективного договора

Статья 44 ТК РФ. Изменение и дополнение коллективного договора

Актуально на:

31 июля 2021 г.

Трудовой кодекс, N 197-ФЗ | ст. 44 ТК РФ

Изменение и дополнение коллективного договора производятся в порядке, установленном настоящим Кодексом для его заключения, либо в порядке, установленном коллективным договором.

• URL
• HTML
• BB-код
• Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

—

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Скачать документ в формате

Судебная практика по статье 44 ТК РФ:

• Решение Верховного суда: Определение N 5-В08-139, Судебная коллегия по гражданским делам, надзор

  Из материалов дела видно, что коллективный договор на 2005-2007 г.г подписан президентом ОАО «Российские железные дороги» и председателем Российского профессионального союза железнодорожников и транспортных строителей. В соответствии со ст. 44 Трудового Кодекса РФ изменение и дополнение коллективного договора производятся в порядке, установленным Трудовым Кодексом РФ для его заключения, либо в порядке, установленным коллективным договором…

• Решение Верховного суда: Определение N 46-В09-9, Судебная коллегия по гражданским делам, надзор

  При этом следует отметить, что действующее законодательство допускает возможность изменения и дополнения коллективных договоров (статья 44 Трудового кодекса Российской Федерации). В судебном заседании председатель профкома первичной профсоюзной организации ООО «Тольяттикаучук» Китев Н.И. пояснил, что заключенный с предприятием коллективный договор пересматривается ежегодно, в него вносятся поправки…

Изменения документа

• URL
• HTML
• BB-код
• Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

—

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Составить подборку

Анализ текста

Идет загрузка…

комментарии и текст статьи в новой редакции 2019 года

Текст статьи 44 ТК РФ в новой редакции.

Изменение и дополнение коллективного договора производятся в порядке, установленном настоящим Кодексом для его заключения, либо в порядке, установленном коллективным договором .

N 197-ФЗ, ТК РФ действующая редакция.

Комментарий к ст. 44 Трудового Кодекса РФ

Комментарии к статьям ТК помогут разобраться в нюансах трудового права.

§ 1. Новая редакция ст. 44 разрешает вносить изменения и дополнения в коллективный договор не только в порядке, установленном Кодексом для его заключения, но и в порядке, установленном в коллективном договоре.

§ 2. О порядке заключения коллективного договора сказано в ст. 42 ТК, что он определяется сторонами в соответствии с Кодексом и иными федеральными законами. Ссылка в ст. 44 на порядок, установленный Кодексом, ясности не вносит, поскольку прямых норм по этому вопросу Кодекс не содержит.

Сопоставление текстов ст. 44 и 42 ТК приводит к выводу, что порядок изменения и дополнения коллективного договора может определяться его сторонами (как и порядок заключения) либо устанавливаться коллективным договором.

На практике встречаются случаи, когда в коллективный договор вносится запись, предоставляющая право представителям работников и работодателей вносить изменения и дополнения в коллективный договор по договоренности между собой. Подобная практика ущемляет права работников на непосредственное участие в управлении организацией в сфере социально-трудовых отношений и, с нашей точки зрения, не соответствует законодательству.

Следующий комментарий к статье 44 ТК РФ

Если у вас есть вопросы по ст. 44 ТК, вы можете получить консультацию юриста.

Изменения и дополнения коллективного договора в течение срока его действия производятся только по взаимному согласию сторон, достигаемому в результате проведения коллективных переговоров. Порядок проведения таких переговоров аналогичен порядку, установленному для проведения коллективных переговоров по заключению коллективного договора (см. ст. 35, гл. 6 ТК и комментарии к ним). Однако в коллективном договоре может быть установлен иной порядок внесения в него изменений и дополнений.

Статья 263.1 ТК РФ. Дополнительные гарантии женщинам, работающим в сельской местности

Статья 263.1 ТК посвящена описанию дополнительных гарантий для женщин, трудящихся в сельской местности. В отдельном виде она появилась сравнительно недавно: в конце 2019 года.

Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ

Содержание ст. 263.1 ТК

В ней предусмотрены три льготы для трудящихся на селе женщин. Указано, что эта категория сотрудниц имеет право на:

1. Предоставление нанимателем одного дополнительного выходного в месяц. Причём этот выходной не оплачивается и оформляется на основе соответствующей письменной просьбы сотрудницы.
2. Сокращённую длительность рабочей недели – максимум 36 часов. Это возможно, если сокращение рабочей недели не предусмотрено для них общефедеральными законами и нормативными актами. Подчёркнуто, что сокращение времени работы в данной ситуации не влияет на величину зарплаты, которая должна выплачиваться из расчёта полноценной трудовой недели.
3. Увеличение зарплат при выполнении таких работ, где из-за производственной специфики трудовой день разделён на части.

Рассмотренная статья нацелена на смягчение условий работы трудящихся на селе женщин. Она затрагивает данную группу сотрудниц полностью, независимо от семейных обстоятельств и других факторов.

Основные вопросы по ст. 263.1 ТК

Какие ещё группы лиц имеют право на трудовую неделю в 36 часов?

Таких категорий сотрудников довольно много. К тем, для кого установлена именно трудовая неделя в 36 часов, относят:

• отдельные группы работающих в педагогической сфере;
• отдельные категории медиков;
• сотрудников, непосредственно занятых обращением с химическим вооружением.

Более подробно упомянутые категории лиц описаны в следующих документах:

• Постановление Правительства № 101 от 14.02.03.
• Приказ Минобрнауки № 1601 от 22.12.14.
• ФЗ № 136 от 07.11.00.

Также имеются и лица, для которых установлена максимальная длительность рабочей недели в 36 часов, т.е. она может быть и меньше. К ним относятся следующие группы:

• сотрудницы, занятые на работах в северных и приравнённых к ним территориях;
• лица, занятые в производстве с определёнными вредными условиями для трудовой деятельности.

Подобные льготы предусмотрены статьями 320 и 92 ТК. Как можно заметить, сотрудницы, упомянутые в ст. 263.1, относятся именно к этой категории. Получается, что по факту они приравнены к трудящимся на Крайнем Севере и во вредных условиях.

Также имеются и иные отдельные категории, занятые на специализированных работах, для которых длительность трудовой недели ещё меньше. Она составляет 24 часа. Это сотрудники, задействованные в обращении с химическим оружием, и сотрудники лабораторий, в которых занимаются гамма-облучением.

Отдельно выделяются некоторые специалисты в сфере медицины: для них установлена трудовая неделя длительностью в 39 часов.

В ст. 92 ТК предусмотрены и иные категории сотрудников, нуждающихся по объективным условиям в меньшей по длительности трудовой неделе. К ним отнесены несовершеннолетние, инвалиды и т.д.

Отдельно нужно отметить: ст. 92 указывает, что длительность работы конкретного сотрудника устанавливается на базе соответствующих колдоговоров и соглашений. Т.е. индивидуальная нагрузка в определённой отрасли у конкретных специалистов может отличаться, если это предусмотрено в соответствующих документах.

Каковы отличительные особенности данной статьи?

Основной её смысл – нацеленность на оптимизацию условий труда женщин, занятых в сельском хозяйстве. Льготы для этой категории сотрудниц объяснимы различиями в физической нагрузке относительно большинства городских профессий. Следует отметить, что они распространяются на всех сотрудниц, занятых на работах в сельской местности. Следовательно, гарантии по ст. 263.1 не отменяют иных льгот, положенных для женщин с беременностью, занятых воспитанием малолетних детей и иных категорий сотрудниц с особыми семейными обстоятельствами.

Ст. 263.1 ТК РФ

Женщины, работающие в сельской местности, имеют право:
на предоставление по их письменному заявлению одного дополнительного выходного дня в месяц без сохранения заработной платы;
на установление сокращенной продолжительности рабочего времени не более 36 часов в неделю, если меньшая продолжительность рабочей недели не предусмотрена для них федеральными законами, иными нормативными правовыми актами Российской Федерации. При этом заработная плата выплачивается в том же размере, что и при полной рабочей неделе;
на установление оплаты труда в повышенном размере на работах, где по условиям труда рабочий день разделен на части.

Судебная практика по статье 263.1 ТК РФ.
1.
Решение № 2-1183/2020 2-1183/2020~М-613/2020 М-613/2020 от 25 сентября 2020 г. по делу № 2-1183/2020
Березовский районный суд (Красноярский край) — Гражданские и административные
 …относятся к рабочему времени. Нормальная продолжительность рабочего времени не может превышать 40 часов в неделю.
С 23.11.2019 года вступили в силу требования ст.  263.1   ТК РФ, на основании которой женщины, работающие в сельской местности, имеют право: на предоставление по их письменному заявлению одного дополнительного выходного дня в месяц без сохранения …
2.
Решение № 7Р-128/2020 от 17 августа 2020 г. по делу № 7Р-128/2020
Верховный Суд Республики Хакасия (Республика Хакасия) — Административное
 …неотложных мерах по улучшению положения женщин, семьи, охраны материнства и детства на селе» до внесения изменений в Трудовой кодекс РФ в части закрепления в ст.   263.1   Трудового кодекса РФ дополнительных гарантий женщинам, работающим в сельской местности, не подлежало применению, так как не является нормативным актом, которым может быть установлена сокращенная продолжительность рабочего …
3.
Решение № 12-80/2020 от 27 июля 2020 г. по делу № 12-80/2020
Ленинский районный суд г. Омска (Омская область) — Административное
 …было.
В связи с вступлением в силу с ДД.ММ.ГГГГ изменений в Трудовой Кодекс РФ, касающихся дополнительных гарантий женщинам, работающим в сельской местности ( ст.   263.1   ТК РФ), были внесены изменения в действующее Положение об оплате труда, и подписаны дополнительные соглашения к трудовым договорам.
При этом прокуратурой и административным органом оставлены без …
4.
Решение № 2-160/2020 2-160/2020~М-93/2020 М-93/2020 от 27 июля 2020 г. по делу № 2-160/2020
Балезинский районный суд (Удмуртская Республика) — Гражданские и административные
 …нормальная продолжительность рабочего времени (не более 40 часов в неделю).
Согласно дополнительного соглашения  от  Кутявиной О.Н. с  в соответствии со ст.   263.1   ТК РФ устанавливается сокращенная продолжительность рабочего времени 36 часов в неделю, заработная плата выплачивается в том же объеме, что и при 40 часовой рабочей неделе.
Должностная …
5.
Решение № 12-70/2020 от 22 июля 2020 г. по делу № 12-70/2020
Березовский районный суд (Красноярский край) — Административное
 …которой просил указанное выше постановление отменить и производство по делу прекратить, указывая на то, что им не нарушены требования статей 22, 91, 99, 152 и   263.1   ТК РФ, перечисленные в постановлении, а также п. 1.3 постановления Верховного Совета РСФСР от  № и постановления Пленума Верховного суда Российской Федерации от  №, поскольку …
6.
Решение № 2-91/2020 2-91/2020~М-77/2020 М-77/2020 от 22 июля 2020 г. по делу № 2-91/2020
Максатихинский районный суд (Тверская область) — Гражданские и административные
 …что суммированный учет рабочего времени осуществляется в соответствии с графиком работы с учетным периодом 1 год. Переработку по количеству рабочих дней и часов на период 1 месяц и 1 год не выплачивают. Ссылаясь на ст.   263.1   ТК РФ, указывает, что при 36 часовой рабочей неделе они должны ежедневно работать 7 ч. 12 …
7.
Решение № 12-25/2020 от 16 июля 2020 г. по делу № 12-25/2020
Ужурский районный суд (Красноярский край) — Административное
 …и в части установления сокращенной продолжительности рабочего времени для женщин, работающих в сельской местности, до внесения соответствующих изменений в Трудовой Кодекс РФ (до введения ст.  263.1 ,  введена Федеральным законом от 12.11.2019 N 372-ФЭ) противоречило вышеназванным положениям Трудового Кодекса и не подлежало применению. В силу чего, дело было разрешено государственной …
8.
Решение № 30-2-217/2020 от 16 июля 2020 г. по делу № 30-2-217/2020
Ярославский областной суд (Ярославская область) — Административное
 …в период с 23 января 2020 года по 5 марта 2020 года в МУП «Энергоресурс», выявлены нарушения трудового законодательства РФ, а именно: в нарушение абз. 1 ст. 100,   263.1   ТК РФ, Постановления Верховного Совета РСФСР, в Правилах внутреннего трудового распорядка, в трудовых договорах иных локальных актах работодатель не установил режим рабочего времени …
9.
Решение № 2-113/2020 2-113/2020~М-91/2020 М-91/2020 от 16 июля 2020 г. по делу № 2-113/2020
Бирилюсский районный суд (Красноярский край) — Гражданские и административные
 …от 28 января 2005 г. №13-2896, статусом сельского поселения наделено село Суриково, являющееся административным центром, который входит в состав Суриковского сельсовета.
В силу ст.   263.1   ТК РФ, вступившей в силу 23 ноября 2019 г., женщины, работающие в сельской местности имеют право на установление сокращенной продолжительности рабочего времени не более 36 часов …
10.
Решение № 12-115/2020 от 15 июля 2020 г. по делу № 12-115/2020
Сосновский  районный суд (Челябинская область) — Административное
 …компенсации (например трудовой договор № от ДАТА с Пьянковым Э.В. (машинист бульдозера), трудовой договор № от ДАТА с Кадацевым С.М. (электрогазосварщик). В нарушение требований ст.   263.1   Трудового кодекса РФ, п. 1.1 ст. 1 Постановления ВС РСФСР от ДАТА № «О дополнительных гарантиях женщинам, работающим в сельской местности» работники Топильская А.С., Вакурова …

Официальный сайт городского поселения «Кожва»

При заключении и направлении на уведомительную регистрацию коллективных договоров, соглашений необходимо соблюдать требования трудового законодательства и иных нормативных правовых актов, регулирующих данные отношения.

Порядок ведения коллективных переговоров и заключения коллективных договоров регулируется Главами 6-7 Трудового кодекса Российской Федерации (далее — ТК РФ).

Коллективный договор, соглашение подписывается полномочными представителями работников и работодателя, указанными в ст. 29 — 33, 37 ТК РФ.

Интересы работодателя при проведении коллективных переговоров, заключении или изменении коллективного договора представляют руководитель организации, работодатель — индивидуальный предприниматель (лично) или уполномоченные ими лица, интересы работников — профсоюзы либо иные представители, избранные работниками (ч. 1 ст. 33, ч. 2 ст. 29 ТК РФ).

Если первичная профсоюзная организация объединяет более половины работников организации, то в силу ч. 3 ст. 37 ТК РФ она вправе по решению своего выборного органа направить работодателю предложение о начале коллективных переговоров от имени всех работников без предварительного создания единого представительного органа.

Две или более профсоюзные организации, объединяющие в совокупности более половины работников, могут создать единый представительный орган, который будет представлять всех работников организации при ведении коллективных переговоров и заключении коллективного договора (ч. 2 ст. 37 ТК РФ).

Если работники не объединены в профсоюзные организации или ни одна из них не объединяет более половины работников, то на общем собрании сотрудников тайным голосованием может быть избран иной представитель или представительный орган из числа работников (ч. 1 ст. 31 ТК РФ).

При проведении коллективных переговоров, заключении или изменении соглашений интересы работодателей представляют соответствующие объединения работодателей, интересы работников соответствующие профсоюзы, их территориальные организации, объединения профессиональных союзов и объединения территориальных организаций профессиональных союзов (ч. 2 ст. 33, ч. 3 ст.29 ТК РФ).

При наличии на соответствующем уровне нескольких профсоюзов (объединений профсоюзов) каждому из них предоставляется право на представительство в составе единого представительного органа для ведения коллективных переговоров, формируемого с учетом количества представляемых ими членов профсоюзов. При отсутствии договоренности о

создании единого представительного органа для ведения коллективных переговоров право на их ведение предоставляется профсоюзу (объединению профсоюзов), объединяющему наибольшее число членов профсоюза (профсоюзов) (ч. 6 ст. 37 ТК РФ).

Коллективный договор, соглашение в течение семи дней со дня подписания направляются работодателем, представителем работодателя (работодателей) на уведомительную регистрацию в соответствующий орган по труду. Согласно постановлению Правительства Республики Коми от 11 декабря 2015 года № 519 «О Министерстве труда, занятости и социальной защиты Республики Коми» государственная услуга по проведению уведомительной регистрации коллективных договоров, соглашений предоставляется Министерством труда, занятости и социальной защиты Республики Коми по адресу: г.Сыктывкар, ул. Интернациональная, 174, тел. 28-60-90.

Административный регламент предоставления государственной услуги по проведению уведомительной регистрации коллективных договоров, соглашений (далее – Административный регламент) утвержден приказом Министерства труда и социальной защиты Республики Коми № 764 от 21 апреля 2015 года и размещен на официальном сайте Министерства во вкладках «Административные регламенты» (раздел «Утвержденные административные регламенты»), «Социальное партнерство, раздел «Коллективные договоры» и находится в свободном доступе по ссылке http://mintrudsoc.rkomi.ru/page/11947/34609/, а также в базе СПС КонсультантПлюс.

С порядком получения государственной услуги можно ознакомиться на портале Государственных услуг Республики Коми www.pgu.rkomi.ru. и на Едином портале государственных услуг www.gosuslugi.ru.

Для получения государственной услуги по проведению уведомительной регистрации соглашений, коллективных договоров пунктом 2.9. Административного регламента предусматривается предоставление следующих документов:

1) заявление о проведении уведомительной регистрации коллективного договора, соглашения по рекомендуемой форме, указанной в приложениях № 2, 3 к Административному регламенту;

2) коллективный договор, соглашение с приложениями, на которые есть ссылки в коллективном договоре, соглашении, подписанные сторонами, в количестве экземпляров по числу подписавших сторон и один экземпляр для Министерства;

3) копия протокола (выписка из протокола) общего собрания (конференции) работников о делегировании полномочий на представление интересов работников организации и подписание коллективного договора, уполномоченному лицу (для организаций, где отсутствует первичная профсоюзная организация, или ни одна из имеющихся первичных профсоюзных организаций не объединяет более половины работников данной организации), в одном экземпляре.

Заявление на проведение уведомительной регистрации коллективного договора, соглашения должно содержать в том числе следующую информацию:

полное наименование организации (индивидуального предпринимателя), ОГРН (ОГРНИП), адрес регистрации (почтовый адрес), Ф.И.О. руководителя организации, Ф.И.О., телефон контактного лица, ОКВЭД, форму собственности, списочную численность работников, членов профсоюза (при наличии), количество организаций, охваченных соглашением (при направлении на уведомительную регистрацию соглашения).

При направлении коллективного договора, соглашения на уведомительную регистрацию необходимо соблюдать установленные требования документооборота и делопроизводства, в частности, коллективный договор, соглашение должен (должно) быть представлен(о) с приложениями, на которые есть ссылки в коллективном договоре, (соглашении) подписанный сторонами, в количестве экземпляров по числу подписавших сторон и один экземпляр для Министерства труда и социальной защиты Республики Коми, содержать титульный лист, содержание, подписи и печати (при наличии) полномочных представителей сторон. Страницы коллективного договора, соглашения должны быть пронумерованы и прошиты.

Вышеуказанные требования Административного регламента и документооборота необходимо соблюдать и при направлении на уведомительную регистрацию изменений и дополнений в соглашения и коллективные договоры.

Изменение и дополнение коллективного договора (соглашения) производятся в порядке, установленном настоящим ТК РФ, либо в порядке, установленном коллективным договором (соглашением) (ст. 44, 49 ТК РФ).

Изменения и дополнения условий коллективного договора (соглашения) оформляются отдельным документом, который также направляется на уведомительную регистрацию в Министерство.

С примерной формой изменений и дополнений в коллективный договор можно ознакомиться на официальном сайте Министерства во вкладке «Социальное партнерство», разделе «Коллективные договоры» по ссылке http://mintrudsoc.rkomi.ru/page/11775/.

В соответствии со статьей 9 ТК РФ коллективные договоры не могут содержать условий, ограничивающих права или снижающих уровень гарантий работников по сравнению с установленным трудовым законодательством и иными нормативными правовыми актами, содержащими нормы трудового права.

Статья 44. Трудового кодекса РФ, действующая редакция на 2021 год с комментариями

Изменение и дополнение коллективного договора производятся в порядке, установленном настоящим Кодексом для его заключения, либо в порядке, установленном коллективным договором.
(в ред. Федерального закона от 30.06.2006 N 90-ФЗ)

Комментарий к статье.

Изменение и дополнение коллективного договора в течение срока его действия производится в порядке, установленном в ст. 42 ТК РФ для его заключения, или по взаимному согласию сторон в порядке, определенном в коллективном договоре. В большей степени оправданно проведение переговоров в порядке, аналогичном установленному для проведения коллективных переговоров по заключению коллективного договора (см. комментарий к ст. 35, гл. 6 ТК РФ).

• Изменение и дополнение коллективного договора может осуществляться либо в процессе проведения коллективных переговоров, т.е. по правилам его заключения (ст. 37 ТК), либо в порядке, установленном самим коллективным договором.
• Выбор одного из двух предлагаемых рассматриваемой нормой вариантов осуществляется представителями сторон. Это может быть сделано при заключении коллективного договора или при обсуждении вопроса о необходимости внесения в него изменений.
• Очевидно, серьезные изменения, касающиеся принципиальных вопросов, таких, как система оплаты и стимулирования труда, социальная программа организации, порядок индексации заработной платы, целесообразно вносить после проведения коллективных переговоров. Незначительные дополнения (изменения) могут быть внесены по согласованию между представителями сторон без коллективных переговоров.
• На практике некоторые социальные партнеры поручают комиссии по ведению коллективных переговоров контролировать выполнение коллективного договора и по мере необходимости вносить в него изменения и дополнения.

Подпишитесь в соц сетях

Публикуем ссылку на статью, как только она выходит. Отдельно даём знать о важных изменениях в законах.

Важно знать!

Поэтому, для вас работают бесплатные эксперты-консультанты!
Расскажите о вашей проблеме, и мы поможем ее решить! Задайте вопрос прямо сейчас!

Анонимно

Профессионально

Задавайте вопрос
удобным для Вас способом

Ответим на вопрос в соц. сетях

Ответим на вопрос в мессенджерах

Ссылки по теме:

Катетерная абляция фибрилляции предсердий: современное состояние и перспективы на будущее

% PDF-1.4 % 6344 0 объект > эндобдж xref 6344 112 0000000016 00000 н. 0000004541 00000 н. 0000004762 00000 н. 0000004799 00000 н. 0000005874 00000 н. 0000006493 00000 н. 0000007103 00000 н. 0000007284 00000 н. 0000007399 00000 н. 0000007911 00000 п. 0000008009 00000 н. 0000018602 00000 п. 0000019014 00000 п. 0000032677 00000 п. 0000032792 00000 п. 0000032909 00000 н. 0000033024 00000 п. 0000033281 00000 п. 0000033814 00000 п. 0000034039 00000 п. 0000034551 00000 п. 0000034852 00000 п. 0000035167 00000 п. 0000036681 00000 п. 0000038487 00000 п. 0000040405 00000 п. 0000042222 00000 н. 0000044121 00000 п. 0000045951 00000 п. 0000047521 00000 п. 0000049287 00000 п. 0000049401 00000 п. 0000049519 00000 п. 0000049599 00000 п. 0000049698 00000 п. 0000049849 00000 п. 0000049962 00000 н. 0000050194 00000 п. 0000050278 00000 п. 0000050335 00000 п. 0000050401 00000 п. 0000050481 00000 п. 0000050561 00000 п. 0000051502 00000 п. 0000051624 00000 п. 0000051783 00000 п. 0000055073 00000 п. 0000171422 00000 н. 0000186760 00000 н. 0000197717 00000 н. 0000208676 00000 н. 0000211966 00000 н. 0000405687 00000 н. 0000405723 00000 н. 0000405802 00000 н. 0000406149 00000 п. 0000406218 00000 н. 0000406336 00000 п. 0000408897 00000 н. 0000408938 00000 н. 0000409017 00000 н. 0000409415 00000 н. 0000409494 00000 н. 0000409530 00000 н. 0000409609 00000 н. 0000409963 00000 н. 0000410032 00000 н. 0000410150 00000 н. 0000410229 00000 п. 0000410522 00000 н. 0000410856 00000 п. 0000410935 00000 п. 0000411138 00000 н. 0000411216 00000 н. 0000411534 00000 п. 0000411613 00000 н. 0000411649 00000 н. 0000411728 00000 н. 0000412066 00000 н. 0000412135 00000 н. 0000412253 00000 н. 0000412332 00000 н. 0000412613 00000 н. 0000413090 00000 н. 0000413169 00000 н. 0000413205 00000 н. 0000413284 00000 н. 0000413622 00000 н. 0000413691 00000 п. 0000413809 00000 н. 0000413888 00000 н. 0000414162 00000 п. 0000414628 00000 н. 0000414707 00000 н. 0000414743 00000 н. 0000414822 00000 н. 0000415160 00000 н. 0000415229 00000 н. 0000415347 00000 н. 0000415426 00000 п. 0000415702 00000 н. 0000416161 00000 н. 0000416240 00000 н. 0000416445 00000 н. 0000416524 00000 н. 0000416922 00000 н. 0000419107 00000 п. 0000421292 00000 н. 0000472807 00000 н. 0001067799 00000 п. 0000004259 00000 н. 0000002593 00000 н. xlŒNȍt + uv c7e «n LԨ $ hl»!) FC | e -! {= 繗 _

Последовательное лечение LASER ART и CRISPR устраняет ВИЧ-1 в подгруппе инфицированных гуманизированных мышей

Культура клеток реагенты

Буфер для 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) и ципрофлоксацин были приобретены у Sigma-Aldrich, St.Луи, штат Миссури. Приобретены диэтиловый эфир, вода без эндотоксинов, гентамицин, ацетонитрил (ACN), метанол, KH ₂ PO ₄ , бычий сывороточный альбумин (BSA), Triton X-100, вода класса LC-MS и реагент TRIzol. от Fisher Scientific, Сан-Диего, Калифорния. Линия репортерных клеток TZM-bl (AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD) и клетки HEK-293T (Американская коллекция типовых культур (ATCC), Манассас, штат Вирджиния) культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы. с 10% FBS и гентамицином (10 мкг / мл).Клетки Jurkat (Clone E6–1, TIB-152 ™) были приобретены в ATCC и культивированы в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI), содержащей 10% FBS и гентамицин (10 мкг / мл) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ). PBMC выделяли из лейкопаков градиентным центрифугированием на Ficoll-Paque в течение 30 минут при 600 g. PBMC, собранные из лейкоцитарной пленки, стимулировали PHA (5 мкг / мл) в течение 24 часов в RPMI с 10% FBS и гентамицином (10 мкг / мл) с добавлением человеческого рекомбинантного интерлейкина-2 (rIL-2) в концентрации 30 нг / мл ((STEMCELL Technologies, Сиэтл, Вашингтон).Свежие среды меняли каждые 2–3 дня.

Инфекция ВИЧ-1 в культуре клеток

Клетки HEK-293T трансфицировали методом преципитации CaPO ₄ в присутствии хлорохина (50 мкМ) с 30 мкг плазмиды pNL _4–3 -EGFP-P2A-Nef ²² / 2,5 × 10 ⁶ клеток / чашка 100 мм. На следующий день были заменены носители; и через 24 и 48 часов супернатанты собирали, осветляли при 1400 g в течение 10 минут, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и концентрировали ультрацентрифугированием в течение 2 часов с 20% сахарозной подушкой.Осадки вирусов ресуспендировали в основном солевом растворе Хэнка (HBSS) осторожным встряхиванием в течение ночи, разделяли на аликвоты и титровали в клетках Jurkat с помощью FACS для экспрессии GFP. Клетки Jurkat инфицировали спинокуляцией в течение 1,5 ч при 32 ° C в 500 мкл инокулята, содержащего 8 мкг / мл полибрена, затем ресуспендировали и оставляли на 4 ч, затем добавляли 500 мкл ростовой среды. На следующий день клетки промывали 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) и повторно суспендировали в среде для выращивания.

Дизайн гРНК, конструирование плазмиды экспрессии CRISPR-Cas9 и вектора AAV

Биоинформатический дизайн и клонирование гРНК LTR1 и GagD в вектор AAV-CMV-saCas9 были ранее описаны ^19,23 .Вкратце, инструмент разработки гРНК Института Броада (https://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design) использовался для скрининга последовательностей ВИЧ-1 _{NL4-3 или ADA} на предмет возможных Области протоспейсера гРНК, за которыми следует saCas9-специфический PAM: NGGRR (N). Была выбрана пара гРНК, демонстрирующая наилучшую предсказуемую активность на мишени (в геноме ВИЧ-1) и минимальную активность вне мишени (в геноме человека): одна нацелена на промоторную область LTR ВИЧ-1, а другая нацелена на ген gag. Последовательности соответствующих гРНК LTR1 и GagD плюс PAM были дополнительно подвергнуты перекрестной ссылке с базой данных последовательностей ВИЧ Лос-Аламоса, подтверждающей высокие уровни консервативности (> 90%) для последовательностей ВИЧ-1.Затем пара олигонуклеотидов для каждого целевого сайта с выступами 5′-CACC и 3′-AAAC Bsa1 была получена от Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa, Table S1), отожжена, фосфорилирована и лигирована в Bsa I. , дефосфорилированный pX601-AAV-CMV: NLS-saCas9-NLS-3xHA-bGHpA; U6 :: BsaI-sgRNA (подарок от Feng Zhang через Addgene) (61591; Addgene). Для мультиплексного клонирования гРНК кассету каркаса U6-LTR1-gRNA из pX601-CMV-saCas9-LTR1 амплифицировали с использованием праймеров T795 / T796 (таблица S1) и клонировали с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech, Mountain View, CA) в EcoR I и KpnI линеаризовали плазмиду pX601-CMV-saCas9-GagD, что привело к вектору доставки AAV pX601-CMV-saCas9-LTR1-GagD.Наконец, плазмиду с подтвержденной последовательностью отправляли для упаковки в серотип AAV-9 (Vigene Biosciences Inc., Milton Park Abingdon, UK). AAV ₉ был выбран в качестве вектора для доставки CRISPR-Cas9 из-за его высокой эффективности трансдукции во многих тканях, включая центральную нервную систему, как значимых предполагаемых резервуарах для ВИЧ-1. Идея заключалась в том, чтобы обеспечить эффективное проникновение AAV во все предполагаемые ткани-мишени ВИЧ-1, включая мозг.

Инфекция ВИЧ-1 гуманизированных мышей CD34 +

NSG (NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rgt ^m1Wjl / SzJ) мышей были получены из лабораторий Джексона, Бар-Харбор, штат Мэн, и выведены в определенных свободных от патогенов условиях в Медицинском центре Университета Небраски (UNMC) в соответствии с установленными этическими руководящими принципами. вперед Национальным институтом здравоохранения по уходу за лабораторными животными. CD34 + HSC были обогащены из пуповинной крови человека или клеток печени плода с использованием иммуномагнитных шариков (набор для отбора CD34 +; Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA).Чистота клеток CD34 + составила> 90% по данным проточной цитометрии. Клетки трансплантировали новорожденным мышам, облученным в дозе 1 Гр с использованием облучателя RS-2000 × -Ray (Rad Source Technologies, Buford, GA). Клетки трансплантировали путем внутрипеченочной (i.h.) инъекции 50000 клеток / мышь в 20 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью иглы 30-го размера. Эксперименты, показанные на рис. 2–6, проводились на клетках эмбриональной печени человека, выделенных от одного донора. В исследовании, описанном на рис. 7 и 8, HSC из пуповинной крови были получены от двух доноров.Мышей от одного донора использовали для всех мышей с двойным лечением. Гуманизация животных была подтверждена с помощью проточной цитометрии ^31,60 на присутствие CD45- и CD3-положительных иммунных клеток крови, как показано на фиг.4. В возрасте 18 недель 25 мышей NSG-hu были инфицированы внутрибрюшинно (ip ) с ВИЧ-1 _NL4–3 ^32,36 при 10 ⁴ Инфекционная доза культуры ткани ₅₀ (TCID ₅₀ ) / мл и умерщвление в дни 1, 3, 7 и 14; n = 5 в каждый момент времени.Во все оценки испытаний были включены пять неинфицированных контрольных животных. Уровни вирусных копий РНК / мл анализировали с помощью автоматизированной системы COBAS Ampliprep System V2.0 / Taqman-48 (Roche Molecular Diagnostics, Базель, Швейцария) ^30,31 . Для этого анализа 100 мкл мышиной сыворотки разбавляли до 1 мл стерильной фильтрованной нормальной сывороткой человека. Предел обнаружения анализа после разведения составляет 200 копий вирусной РНК / мл. Хотя фаза затмения вирусной инфекции у людей остается изменчивой ⁶¹ , вирусная нагрузка и уровни истощения CD4 + Т-клеток, наблюдаемые у инфицированных нами гуманизированных мышей, на самом деле отражают течение болезни у инфицированного человека-хозяина.Действительно, только после нескольких недель заражения мы действительно наблюдаем значительную потерю клеток ^{12,17,29,37,50} . Эти результаты можно рассматривать как подтверждение модели, включающей временное восстановление CD4 + Т-клеток, наблюдаемое после АРТ, как это наблюдается у людей.

Наноформованные антиретровирусные препараты

DTG, 3TC и ABC были щедрыми подарками от ViiV Healthcare, Research Triangle Park, NC. КПА был приобретен у Hangzhou Bingo Chemical Co., Ltd, Ханчжоу, Китай. Антиретровирусные пролекарства и их полимерные оболочки получали, как описано ранее ^12,13,14 .Миристоилированные модификации для DTG, 3TC и ABC были сделаны (называемые MDTG, M3TC и MABC) для усиления включения в наночастицы полоксамера 407 (P407), в то время как RPV был заключен в оболочку только полоксамером 338 (P338) в немодифицированной форме с использованием высокой гомогенизация под давлением с образованием кристаллических наноформулированных лекарств. Размер частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциал определяли динамическим светорассеянием с использованием Malvern Nano-ZS (Malvern, Worcestershire, UK) ⁴⁹ . Конечные концентрации лекарственного средства в суспензиях наноформулировок и растворах для инъекций определяли с помощью HPLC-UV / Vis и UPLC-MS / MS.Объем 40-50 мкл для каждой комбинации наноформ (NMDTG / NRPV и NM3TC / NMABC) вводили внутримышечной (IM) инъекцией в противоположные мышцы бедра мышей.

Антител -человеческий CD3 (№ по каталогу 557943), APC-конъюгированные мышиные антитела к человеческому CD4 (№ по каталогу 555349) и BV421-конъюгированные мышиные антитела к человеческому CD8 (№ по каталогу 562428), PE-конъюгированные мышиные антитела к человеческому CD14 (№ по каталогу 555398). ), и мышиные антитела против CD19 человека (№ по каталогу 555414), конъюгированные с PE-Cy5.Для иммуногистохимического окрашивания мы использовали моноклональные мышиные антитела против человеческого ВИЧ-1p24 (клон Kal-1, M0857, Dako, 1:10), моноклональные мышиные антитела против лейкоцитов человека (HLA-DR; клон CR3 / 43, Dako, 1: 100), а вторичные антитела против EnVision + мыши, конъюгированные с HRP, были приобретены у Dako (Carpinteria, CA). Периферическую кровь собирали из подчелюстной вены в пробирки, покрытые этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), или путем сердечной пункции в конце исследования. Лейкоциты крови тестировали на человеческие маркеры pan-CD45, CD3, CD4, CD8, CD14 и CD19 в виде шестицветных комбинаций с использованием анализатора LSR-II FACS (BD Biosciences).Антитела и контрольные изотипы получали от BD Pharmingen, San Diego, CA, и окрашивание анализировали с помощью FlowJo (BD Immunocytometry Systems, Mountain View, CA). Стратегия стробирования показана на дополнительном рис. 20. Результаты выражали в процентах от общего числа ограниченных лимфоцитов. Процентное содержание CD4- и CD8-положительных клеток было получено из ворот CD3 + человека

Иммуногистохимические исследования (ИГХ)

Селезенку, легкие, печень и лимфатические узлы перфузировали PBS, затем 4% параформальдегидом, а затем фиксировали в течение ночи и обрабатывали для заливки парафином. Из парафиновых блоков вырезали срезы толщиной пять микрон, помещали на предметные стекла и метили мышиными моноклональными антителами (Dako) к HLA-DQ / DP / DR (клон CR3 / 43, 1: 100) и ВИЧ-1p24 (1 : 10). Система Dako EnVision на основе полимера, конъюгированная с HRP, использовалась в качестве вторичного детектирующего реагента и была разработана с использованием 3,3′-диаминобензидина (DAB).Все залитые парафином срезы контрастировали гематоксилином Майера. Делеция первичных антител или использование мышиного IgG служили контролем. Изображения были получены с помощью камеры Nikon DS-Fi1, закрепленной на Nikon Eclipse E800 (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк), с использованием программного обеспечения NIS-Elements F 3.0.

Экстракция нуклеиновых кислот и анализ кПЦР

В исследованиях, представленных на рис. 2-8, общие вирусные нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) были экстрагированы из селезенки, клеток костного мозга, легких, кишечника, печени, почек и мозга с использованием набор Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.Общая клеточная ДНК, полученная из инфицированной ВИЧ-1 клеточной линии ACh3, служила положительным контролем и стандартами, тогда как геномная ДНК человека, полученная от неинфицированных мышей NSG-hu, служила отрицательным контролем. Связанные с клетками РНК и ДНК ВИЧ-1 количественно оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени и капельной цифровой ПЦР (ddPCR). Из-за чрезвычайно низкого количества латентно-инфицированных человеческих клеток у ВИЧ-инфицированных мышей NSG-hu после длительной АРТ для обнаружения общей ДНК ВИЧ-1 потребовалось два раунда амплификации ПЦР. Первый раунд ПЦР проводили на обычном ПЦР-аппарате (T100 Thermal Cycler, Biorad, CA) в 25 мкл реакционной смеси для ПЦР, содержащей 500 нг матрицы и по 50 нг каждого из обоих праймеров, отжигаемых к области gag ВИЧ-1 и реакции Условия следующие: 94 ° C в течение 3 минут, затем 15 циклов 94 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты.Продукт первой ПЦР впоследствии был использован в качестве матрицы во второй полувложенной ПЦР-амплификации в реальном времени, выполненной на машине для ПЦР в реальном времени ABI Step One Plus (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния) с использованием детекторного зонда TaqMan и праймеров. ³⁰ . Два мкл первого продукта ПЦР разбавляли до 50 мкл основной смесью ПЦР, содержащей два праймера по 0,2 мкМ каждый и 0,2 мкМ TaqMan флуоресцентный зонд с двойной меткой. Настройки ПЦР в реальном времени были следующими: 50 ° C в течение 2 минут, затем 95 ° C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты.Размеры ампликона составляют 221 п.н. для первого раунда ПЦР и 83 п.н. для второго раунда (в реальном времени) ПЦР. ДНК, выделенная из клеток ACh3, содержащих одну интегрированную копию ВИЧ-1 на клетку, была использована в качестве стандарта в серийных 10-кратных разведениях с числом копий ВИЧ в диапазоне от 10 ¹ до 10 ⁵ копий ДНК / реакция ^36,37 . Интегрированная ДНК (iDNA) провируса была количественно определена с использованием адаптированного анализа Alu-gag PCR, как описано Agosto et al. ⁶² с модификациями для второго раунда ПЦР, следуя ранее опубликованным методам ⁶³ .Вкратце, образцы подвергали амплификации ПЦР в первом раунде (95 ° C в течение 2 минут; 20 циклов 95 ° C в течение 15 секунд, 50 ° C в течение 15 секунд и 72 ° C в течение 150 секунд) с использованием 100 нМ Alu и 600 нМ. gag обратные праймеры. Пять мкл продукта первого цикла амплифицировали во вложенном протоколе с использованием анализа на ген gag ВИЧ-1 (вторые праймеры и зонд ПЦР), как описано выше. ПЦР в первом раунде включала 3 повтора с использованием только обратного праймера gag (только gag) в качестве фонового неинтегрированного контроля. Уровни интеграции на клетку рассчитывали путем вычитания сигналов только gag из количественного определения Alu-gag.Полувложенная ОТ-ПЦР в реальном времени на РНК ВИЧ-1 выполнялась, как описано ^36,37 . Элюированную клеточную РНК сначала подвергали обработке ДНКазой для удаления ДНК ВИЧ-1, чтобы избежать вмешательства в количественный анализ. Для анализа обратной транскрипции случайные гексамеры использовали в качестве праймеров и SuperScript III (Invitrogen, MA) для синтеза кДНК первой цепи при 42 ° C в течение 60 мин. кДНК использовали для анализа без сплайсинга (usRNA). Два раунда ПЦР были выполнены в тех же условиях ПЦР, что описаны для общей вирусной ДНК.Для анализа usRNA проводили ПЦР в реальном времени в течение 45 циклов и использовали те же праймеры и флуоресцентный зонд, что и для анализа общей вирусной ДНК. Видоспецифичные праймеры и зонды CD45 человека были получены от Thermo-Fisher Scientific (США) (номер по каталогу 433182 для Hs0036534_g1).

Для тестирования вирусной эксцизии замороженные ткани, отправленные в Университет Темпл из Медицинского центра Университета Небраски, гомогенизировали с использованием гомогенизатора Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY) с использованием комбинаций гранул и настроек, специфичных для каждой ткани, в соответствии с протоколами производителя.Буфер T1 из набора NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Duren, Германия) использовали для гомогенизации / начального лизиса с последующим расщеплением протеиназой K в течение ночи. Экстракция геномной ДНК была завершена в соответствии с протоколом производителя. Для стандартных ПЦР (дополнительная таблица 1) 500 нг экстрагированной ДНК подвергали ПЦР с использованием набора Fail Safe PCR и буфера D (Epicenter, Madison, WI) в следующих условиях ПЦР: 94 ° C, 5 мин, 30 циклов (94 ° C). C 30 с, 55 ° C 30 с, 72 ° C 30 с), 72 ° C 7 мин с использованием праймеров 1-го раунда с последующей вложенной ПЦР с использованием разбавленной реакции 1-го раунда ПЦР.Вложенные продукты ПЦР подвергали секвенированию по Сэнгеру напрямую, если только одна популяция ампликонов была обнаружена электрофорезом в агарозном геле. Для обнаружения множества ампликонов для исследования состава иссечения ВИЧ каждую популяцию ампликонов отделяли и очищали с помощью электрофореза в агарозном геле, а затем клонировали в вектор ТА (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Плазмидную ДНК, содержащую вырезанный ампликон ВИЧ, очищали из каждой бактериальной колонии для секвенирования по Сэнгеру (Genewiz, South Plainfield, NJ).ДНК ВИЧ-1 количественно определяли с использованием TaqMan qPCR, специфичного для генов pol и env ВИЧ-1, и клеточного гена бета-глобина в качестве эталона (дополнительная таблица 1). Перед кПЦР геномную ДНК разводили до 10 нг / мкл, а затем отбирали по 5 мкл (50 нг) на реакцию / лунку. Реакционные смеси готовили с использованием ДНК-полимеразы Platinum Taq (Invitrogen) в соответствии с упрощенной процедурой ⁶⁴ . Стандарт был приготовлен из серийных разведений геномной ДНК клеток U1, поскольку он содержит две одиночные копии провируса ВИЧ-1 на диплоидный геном, равное количеству копий гена бета-глобина.Условия КПЦР: 98 ° C 5 мин, 45 циклов (98 ° C 5 мин, 45 циклов (98 ° C 15 с, 60 ° C 30 с с получением данных, 72 ° C 1 мин). a LightCycler96 (Roche, Базель, Швейцария). Для ОТ-ПЦР использовали реагент TRIzol (Ambion, Остин, Техас) для начальной экстракции РНК с последующей очисткой с помощью набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Германия) с расщеплением ДНКазой I в колонка для экстракции. Всего 0,5 мкг РНК использовали для обратной транскрипции M-MLV (Invitrogen). Для скрининга экспрессии гРНК специфический обратный праймер (каркас pX601gRNA / R, дополнительная таблица 1) использовали в реакции RT с последующей стандартной ПЦР с использованием мишени LTR 1 или GagD-смысловые олигонуклеотиды в качестве прямых праймеров (дополнительная таблица 1) и электрофорез в агарозном геле.Для проверки экспрессии мРНК saCas9 смесь олиго-dT праймеров использовали в RT, и кДНК подвергали ПЦР с использованием пар специфичных для saCas9 праймеров и β-актина в качестве эталона (дополнительная таблица 1). Результаты секвенирования по Сэнгеру анализировали с использованием инструмента множественного выравнивания последовательностей Clustal Omega (EMBL-EBI) и программного обеспечения сканера последовательностей 2 (Applied Biosystems).

ddPCR для обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1

ddPCR выполняли на основе технологии капель водно-масляной эмульсии с использованием реагентов ddPCR ™ Supermix for Probes в системе ПЦР QX200 ™ Droplet Digital ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules , Калифорния).Для количественного определения ДНК ВИЧ-1 элюированную клеточную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР ^36,37,63 с использованием наборов Taqman, нацеленных на LTR ВИЧ-1, гены gag и pol, и в качестве эталонного бета-актина мыши или человека (дополнительная таблица 1). Всего 100–200 нг ДНК из каждой ткани использовали в качестве матрицы для амплификаций ddPCR с теми же условиями термоциклирования, которые использовались для детекции q-PCR в реальном времени. Сбор и анализ данных проводились с использованием устройства для считывания капель QX200 и программного обеспечения QuantaSoft ™, поставляемого с прибором.Геномную ДНК, экстрагированную из 50 000 клеток, включая клетки человека и мыши, использовали в качестве матрицы для каждого анализа ddPCR. Уменьшение Gag представляет собой удаление между 5’LTR и Gag или от 5’LTR до 3’LTR, в то время как уменьшение Pol представляет собой удаление между Gag и 3’LTR или 5’LTR до 3’LTR. Однако один LTR всегда будет обнаруживаться во всех трех условиях. Таким образом, мы использовали отношение Gag или Pol к LTR для оценки эффективности удаления. Например, у мыши M4349 (рис. 6e) отношения Gag / LTR и Pol / LTR равны 19.7% (15 клеток с обнаруживаемым gag из 76 клеток с обнаруживаемым LTR) и 19,5%, соответственно, в геномной ДНК, экстрагированной из селезенки обработанных мышей. Таким образом, эффективность удаления 5’LTR в Gag и Gag в 3’LTR была оценена примерно в 80% для обоих (100% -19,7% или 100% -19,5%). В селезенке той же мыши эффективность трансдукции AAV9 была рассчитана на уровне 1,03 копий вектора AAV на клетку в общей популяции, включая трансплантаты человека и мышиные клетки-хозяева (фиг. 6g). В другой мыши M4346 (файл исходных данных для рис.6e), мы продемонстрировали, что иссечение произошло в основном в Gag до 3’LTR, потому что соотношение Pol / LTR составляет 38,4%, а Gag / LTR — 89,5%. Таким образом, эффективность удаления оценивается в 61,6% в 5’LTR к Gag и 10,5% в Gag к 3’LTR. Тем не менее, наличие 2 LTR в неразрезанной провирусной ДНК ВИЧ не рассматривалось, чтобы упростить оценку.

RNAscope

Вирусная РНК была обнаружена в виде отдельных коричневых точек или кластеров точек в парафиновых срезах ткани селезенки и лимфатических узлов толщиной 5 мкм с использованием антисмыслового зонда V-HIV1-Clade-B (каталожный номер 416111), нацеленного на 854–8291 п.н. ВИЧ-1 _NL4–3 ⁶⁵ .Человеческую пептидилпролилизомеразу B (PPIB) использовали в качестве положительного контроля для анализируемой ткани селезенки (изображения получали при 40-кратном увеличении). Все реагенты поставляются компанией Advanced Cellular Diagnostics, Ньюарк, Калифорния.

Выделение вируса

PBMC, полученных из лейкопаков от серонегативных доноров ВИЧ-1,2, стимулировали PHA и IL-2 и совместно культивировали с клетками костного мозга или селезенки человека, выделенными из 3 групп мышей CD34 + HSC-NSG, которые включали ВИЧ-1 инфицированных, инфицированных и получавших LASER ART, и мышей, получавших LASER ART и AAV ₉ -CRISPR-Cas9.PBMC использовали в анализах после 3-дневной обработки, поддерживаемой в 10% RPMI с 30 ед. / Мл IL-2, затем культивировали совместно с человеческим костным мозгом или клетками селезенки в концентрациях (1: 5) ^66,67,68 . Клетки собирали через восемь дней на ДНК (A) и РНК (B) ВИЧ-1, используя полувложенный анализ кПЦР в реальном времени, и жидкости супернатанта анализировали на активность обратной транскриптазы в течение периода до 14 дней. Данные выражены в виде общего количества копий ДНК (А) или РНК (В) ВИЧ-1/10 ⁶ CD45 + клеток человека. Одно из двух животных, получавших двойное лечение, было протестировано и подтверждено вирусной стерилизацией.Спасение от вирусов наблюдалось и в других испытанных группах животных.

Адоптивные переносы

Спленоциты и клетки костного мозга (8–10 × 10 ⁶ ) были собраны во время умерщвления от мышей NSG-hu, которые были ВИЧ-1 _ADA , инфицированные LASER ART и AAV _{и без них. 9} -CRISPR-Cas9. Клетки адоптивно переносили необработанным 18-недельным мышам CD34 + HSC-NSG. Подсчет клеток и тесты на жизнеспособность определялись как по трипановому синему, так и по окрашиванию живых / мертвых клеток на автоматическом счетчике клеток TC-20 (Bio-Rad).Клетки вводили мышам внутрибрюшинно и наблюдали в течение дополнительных 4 недель. Эти эксперименты были выполнены для перекрестной проверки искоренения вирусной инфекции, которая могла возникнуть из латентных резервуаров и не была обнаружена ни с помощью количественной ПЦР, ни РНКскопа, ни ддПЦР. Вирусную нагрузку измеряли в образцах крови адоптивно перенесенных мышей, используя автоматизированную систему COBAS Ampliprep System V2.0 / Taqman-48, и параллельно записывали профили иммунных клеток (CD4 и CD8 + Т-клетки с помощью проточной цитометрии). Остаточный вирус из всех тканей гуманизированных мышей исследовали с помощью анализов qPCR и ddPCR.Вирус не был обнаружен в плазме или тканях двух усыновленных животных (мыши M3319 и M3336).

Анализы вне мишени

Клетки TZM-bl высевали в 6-луночные планшеты из расчета 1 × 10 ⁵ клеток / лунку и котрансфицировали с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) с 1 мкг контроля pX601-AAV-CMV: NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA; U6 :: Bsa1-sgRNA (Addgene catalogue # 61591) или 1 мкг плазмиды pX601-LTR1-GagD (20) вместе с 0,2 мкг pKLV-U6gRNA (Bbs1) -PGKpuro каталог № 50946) для получения маркера селекции пуромицина.На следующий день клетки переносили в чашки диаметром 100 мм и культивировали в присутствии пуромицина (Sigma) в концентрации 1 мкг / мл. Через две недели выжившие клоны выделяли с помощью цилиндров для клонирования (Corning, Corning, NY, USA). Геномную ДНК получали из каждого клона отдельной клетки и ПЦР, специфичные для LTR, с последующей очисткой в ​​геле; Было выполнено клонирование ТА и секвенирование по Сэнгеру. Клоны, показывающие наличие индуцированных CRISPR-Cas9 на мишени мутаций InDel в целевом сайте LTR 1 в интегрированной последовательности LTR ВИЧ-1 ( n = 6), вместе с двумя контрольными клонами были отобраны для дальнейшего in vitro анализа вне мишени.Список потенциальных сайтов-мишеней OFF в геноме человека для ВИЧ-1-мишени LTR 1 и GagD был создан с использованием инструмента разработки Benchling CRISPR (https://benchling.com/, дополнительная таблица 2). Всего было выбрано три потенциальных ВЫКЛЮЧЕННЫХ целевых сайта (наивысший результат плюс два верхних специфичных для гена потенциальных вне целевых сайтов, см. Дополнительную таблицу 2, выделенную желтым цветом) для скрининга на основе ПЦР в выбранных клонах отдельных клеток. Потенциальные области мишеней OFF были амплифицированы с помощью ПЦР, клонированы в вектор TA и выполнено секвенирование по Сэнгеру (3–6 последовательностей / клон одной клетки / одна мишень OFF) (дополнительная таблица 3).

Анализ генетической изменчивости среди трех обработок был выполнен с помощью секвенирования следующего поколения (с помощью средства Novogen NGS) и инструментов биоинформатики для четырех образцов животных, одного животного из LASER ART, одного животного из CRISPR-Cas9- и двух не- рикошетные животные из групп LASER ART / CRISPR-Cas9. Основная цель заключалась в обнаружении возможных сайтов, нецелевых для CRISPR-Cas9. Помимо этого, для этих четырех животных были проанализированы некоторые генетические вариации, такие как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), вставки-делеции (InDels), структурные варианты (SV) и варианты числа копий (CNV); и результаты представлены в дополнительных таблицах 4–5.После этапа тщательного контроля качества полученные короткие считывания с парными концами были сопоставлены с эталонным геномом человека (Human_G1K_V37) с использованием алгоритма выравнивателя Берроуза-Уиллера (BWA). Для животных M4356 (CRISPR-Cas9), M4348 и M4349 (LASER ART + CRISPR-Cas9) и M3539 (LASER ART) 8 покрытий составили 92,01%, 91,97%, 92,01% и 91,92%, в то время как Глубина секвенирования составляла 36,08, 63,11, 45,22 и 15,41 соответственно.

Эффективность удаления и иерархическая кластеризация

Эффективность удаления для каждого животного, ткани и сегмента гена ВИЧ-1 рассчитывалась как отношение количества продукта ПЦР, подтвержденного секвенированием, ко всем членам в каждой группе с обозначенными экспериментальными условиями ( я.е. лечения, клетки и ткани, показанные на фиг. 3, 4, 5, 6 и дополнительный рис. 4). Определяется таким образом, что эффективность удаления можно рассматривать как частотные вероятности, то есть отношение частоты появления интересующего события к общему количеству экспериментальных повторов. Такая интерпретация эффективности удаления дает пользователю прогностическую ценность, так как ее можно использовать для установки предварительного ожидания в отношении вероятности успеха каждого лечения (LASER ART, CRISPR-Cas9 и LASER ART плюс CRISPR-Cas9) при удалении желаемого сегментов гена ВИЧ-1 в исследуемых тканях и в дальнейшем связать это с вероятностью излечения.Иерархическая кластеризация проводилась для значений эффективности событий усечения при различных обработках и для разных животных, тканей и сегментов гена ВИЧ-1. После того, как эффективности вырезания были рассчитаны при различных комбинациях экспериментальных условий, была использована схема иерархической кластеризации для группирования значений эффективности в многоуровневое кластерное дерево, представленное дендрограммой. Эта тепловая карта с иерархической кластеризацией может предложить возможность прогнозирования элиминации вируса.Биоинформатический анализ данных о последовательности генома человека выявил участки генома человека, которые могут служить нецелевыми для гРНК, предназначенных для редактирования ДНК ВИЧ-1. Соответствующие значения эффективности были перечислены в таблице тепловой карты, чтобы кластеры можно было визуально обнаружить. С этой целью были рассмотрены три комбинации: i) вероятности удаления различных сегментов ВИЧ-1 в 6 различных тканях животных, подвергшихся антиретровирусной терапии, редактированию, опосредованному CRISPR-Cas9, и комбинированному лечению; ii) вероятности удаления разных сегментов у разных животных при трех обработках; и iii) вероятности наблюдения по крайней мере одной положительной полосы для каждой указанной ткани у всех животных.Кластеры дополнительных инжиров. 10–16 также включают дополнительные условия излечения и данные количественной ПЦР, чтобы определить, какие животные испытали полное выздоровление и самую высокую степень эрадикации вирусного генома.

Одобрение исследования

Все экспериментальные протоколы с использованием лабораторных животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Медицинского центра Университета Небраски (UNMC), обеспечивающим этический уход и использование лабораторных животных в экспериментальных исследованиях. Клетки крови человека были выделены с помощью лейкафереза ​​от доноров, серонегативных по ВИЧ-1/2 и гепатиту, и считались освобожденными от утверждения Советом по институциональному надзору (IRB) UNMC.Человеческие CD34 + гемопоэтические стволовые клетки были выделены из печени плода и пуповинной крови человека и не подлежат утверждению UNMC IRB.

Статистика

Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, CA) и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Эксперименты проводились с использованием минимум трех биологически различных повторов. Размеры выборки не были основаны на анализе мощности, поскольку эффективность элиминации ВИЧ-1 не была известна и не могла быть спрогнозирована.Для сравнения двух групп использовался тест Стьюдента t (двусторонний). Уровни лекарственного средства в тканях, активность ОТ ВИЧ-1, окрашивание антигена ВИЧ-1p24, популяции Т-клеток, вирусная РНК и ДНК, а также вирусная нагрузка были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Для исследований с множественными временными точками были выполнены двухфакторный факторный дисперсионный анализ и апостериорные тесты Бонферрони для множественных сравнений. Крайние выбросы, превышающие 99% доверительный интервал среднего и в 3 раза превышающие SEM, были исключены.Значимые различия были определены при P < 0,05.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Исследования графена и их результаты: состояние и перспективы

Основные моменты

•

Новые достижения в фундаментальных свойствах графена и их производных.

•

Обзор исследований графена с точки зрения производства графена, физических свойств и приложений в реальном времени.

•

Инженерное применение наноматериалов на основе графена в различных устройствах и их важность.

•

Будущие задачи в области зависящей от времени совместимости и взаимодействия графена и его производных в условиях in vivo и in vitro.

Abstract

Среди различных 2D-материалов графен получил широкое внимание исследователей в последние 2-3 десятилетия из-за его захватывающих свойств.Открытие графена дало огромный импульс и новое измерение исследованиям материалов и нанотехнологиям. Многопрофильные характеристики графена находят широкое применение от здравоохранения до авиакосмической промышленности. Современные исследования графена были направлены на изучение новых производных графена и их использования для изготовления продуктов и устройств. Еще один инновационный подход — улучшение свойств графена за счет функционализации или модификации поверхности. Однако, как и другие 2D-материалы, исследования графена также нуждаются в исправлениях и улучшении в свете последних научных результатов.В этой статье мы пересмотрели результаты недавних исследований графена и материалов на его основе для приложений в различных областях. Для удобства читателя и для поддержания ясности сначала обсуждаются некоторые фундаментальные аспекты графена, а затем систематически изучаются недавние обзоры исследований графена. В целом, в этой обзорной статье дается краткое описание графена с точки зрения его фундаментальных свойств, передовых исследований и приложений.

Ключевые слова

Графен

2D материалы

Оксид графена

Инженерное применение графена

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Авторы.Издательские услуги Elsevier B.V. от имени Вьетнамского национального университета в Ханое.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

32-разрядный микроконтроллер AURIX ™ TriCore ™ — Infineon Technologies

Ревматоидный артрит (РА): основы практики, предпосылки, патофизиология

Уровень техники

Повышенный окислительный стресс как из митохондриальных, так и из цитозольных источников способствует развитию и прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и является целью терапевтических вмешательств. Многочисленные усилия, предпринятые за последние десятилетия для разработки инструментов, позволяющих контролировать уровень окислительного стресса у пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, основаны на необходимости сбора информации о состоянии болезни.Однако до сих пор эта цель не была достигнута удовлетворительным образом. Среди прочего, выделение циркулирующих лейкоцитов для измерения уровня их оксидантов представляет собой действенную неинвазивную задачу, которая была протестирована в нескольких патологических контекстах, включая гипертонию, атеросклероз и его клинические проявления, а также сердечную недостаточность. Поскольку лейкоциты циркулируют в кровотоке, ожидается, что они могут достаточно точно отражать как системный, так и сердечно-сосудистый окислительный стресс и предоставлять полезную информацию о патологическом состоянии.Результаты исследований, обсуждаемых в данной обзорной статье, являются многообещающими. Они подчеркивают важность измерения уровня окислительного стресса в циркулирующих мононуклеарных клетках при различных сердечно-сосудистых заболеваниях с постоянной корреляцией между степенью окислительного стресса и тяжестью сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений. Важно отметить, что они также указывают на двойную роль лейкоцитов, как маркера болезненного состояния, так и непосредственного фактора прогрессирования заболевания. Наконец, они показывают, что уровень окислительного стресса лейкоцитов отражает влияние терапевтических вмешательств.Вероятно, что выделение лейкоцитов и измерение окислительного стресса, после того как они будут адекватно разработаны, могут представлять собой подходящий инструмент как для исследовательских, так и для клинических целей для мониторинга роли окислительного стресса в развитии и прогрессировании ССЗ, а также их воздействия. терапий.

1. Введение

Окислительный стресс является продуктом нескольких внутриклеточных источников, таких как митохондриальная электронная транспортная цепь (ETC), никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (НАДФН), синтаза оксида азота и ксантиноксидаза [1–4].Несколько антиоксидантных механизмов также существуют в митохондриальном компартменте (разобщающие белки, тиоредоксины, глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза) и в цитозоле, которые способны противодействовать чрезмерному накоплению активных форм кислорода (АФК) [5, 6]. Известно, что физиологические концентрации АФК оказывают благотворное влияние. С другой стороны, повышенный окислительный стресс в результате дисбаланса между производством и клиренсом ROS представляет собой важный механизм, ответственный за повреждение и гибель клеток [7, 8].Фактически, белки, липиды и нуклеиновые кислоты являются основной мишенью избытка АФК. Более того, повышенный уровень воспалительных маркеров соответствует уровню окислительного стресса с последующим состоянием хронического развивающегося патологического воспаления. На уровне органов повышенное накопление АФК и воспаление вовлечены в сердечно-сосудистые функциональные и структурные повреждения, лежащие в основе всех основных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [9].

Исходя из ключевой роли, которую АФК играют в сердечно-сосудистой системе и во всех основных сердечно-сосудистых заболеваниях, было бы важно контролировать их уровень у людей как в диагностических, так и в терапевтических целях, поскольку изменения уровня окислительного стресса параллельны прогрессированию патологического состояния. а также реакция на лечение.В этом отношении основным ограничением, очевидно, является ограниченная доступность образцов ткани как из сердца, так и из кровеносных сосудов, так что использование циркулирующих маркеров, способных отображать состояние сердечно-сосудистой системы, могло бы преодолеть проблему. Примечательно, что несколько исследований, проведенных за последние 15 лет, определили, что изоляция циркулирующих лейкоцитов является подходящим методом для представления системных сердечно-сосудистых стрессовых состояний с минимально инвазивным вмешательством. Поскольку лейкоциты циркулируют в кровотоке, они могут довольно точно отражать как системный, так и сердечно-сосудистый метаболический статус [10].

Вероятно, что этот метод, после того как он будет надлежащим образом разработан, может стать подходящим инструментом как для исследовательских, так и для клинических целей для изучения роли нескольких механизмов, связанных с окислительным стрессом, в развитии и прогрессировании ССЗ.

Настоящая обзорная статья направлена ​​на обсуждение актуальности исследований циркулирующих лейкоцитов при всех основных ССЗ, от артериальной гипертензии до ишемической болезни сердца и до последней стадии сердечной недостаточности (Таблица 1). Мы также подчеркиваем роль лейкоцитов как сторонних наблюдателей и участников в контексте сердечно-сосудистых заболеваний.

2. Клеточные источники АФК и антиоксидантов

Митохондрии представляют собой основной источник продукции АФК внутри клеток [4]. АФК производятся физиологически как побочные продукты митохондриального комплекса I и комплекса III. Это происходит при прямом переносе электрона, тогда как кислород частично восстанавливается с образованием супероксида аниона (O ₂ ^— ) [4]. Обратный перенос электронов через комплексы электронно-транспортных цепей — еще один механизм, способствующий продукции митохондриальных АФК [4].Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) оксидазы (NOX) также представляют собой важный источник АФК в сердечно-сосудистой системе [11, 12]. Все члены NOX (NOX1, NOX2, NOX4 и NOX5) генерируют O ₂ ^— , используя NADPH в качестве донора электронов. Тогда O ₂ ^— можно превратить в перекись водорода (H ₂ O ₂ ) [11, 12]. NOX активируются различными стимулами, такими как цитокины, фактор роста и ангиотензин II. АФК, производные от NOX, действуют как сигнальные молекулы, регулируя различные клеточные механизмы, особенно в сердечно-сосудистой системе [11, 12].Другими важными клеточными источниками АФК и активных форм азота являются источники ксантиноксидазы и разобщения синтазы оксида азота (NO) [13, 14].

Различные антиоксидантные механизмы способны противодействовать чрезмерному накоплению ROS. Они экспрессируются как в митохондриальном компартменте (разобщающие белки, тиоредоксины, глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза), так и в цитозоле [5, 6]. Супероксиддисмутазы (СОД) представляют собой важную защиту от окислительного стресса.СОД катализируют дисмутацию O ₂ ^— в H ₂ O ₂ [15]. SOD2 — это изоформа, экспрессируемая в митохондриях, тогда как SOD1 и SOD3 экспрессируются в цитоплазме и во внеклеточном компартменте соответственно [15]. Мутации SOD связаны с различными заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания [15]. Каталаза, еще один фермент, способный снижать окислительный стресс, экспрессируется в пероксисомах, и он предназначен для превращения H ₂ O ₂ в воду и молекулярный кислород (O ₂ ) [16].Примечательно, что сверхэкспрессия каталазы снижает атеросклероз у мышей, лишенных аполипопротеина E [17].

3. Выделение PBMC и определение уровня окислительного стресса

Процедура выделения PBMC человека основана на широко оптимизированных протоколах разделения клеток с помощью градиентного центрифугирования. В этом методе используется принцип дифференциальной миграции клеток в среде с определенным градиентом плотности [18]. Обычно образцы венозной крови, взятые в пробирки для сбора, содержащие ЭДТА, центрифугируют в присутствии полисахарозной среды (фиколл).После центрифугирования слой PBMC, отделенный от плазмы, собирают, и клетки делают доступными для дальнейшей обработки, такой как создание первичных культур (например, для разработки конкретных экспериментальных моделей) или криоконсервация для длительного хранения.

Для оценки внутриклеточного окислительного стресса PBMC инкубируют с хемилюминесцентными, биолюминесцентными или флуоресцентными окислительно-восстановительными зондами, обнаруживающими цитоплазматические (например, 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетат или реагент для окислительного стресса CellROX) или митохондриальные реактивные вещества (митохондриальные реактивы). индикатор супероксида или HE, гидроэтидин) [19, 20].Сигналы окисленных флуоресцентных зондов можно оценить как в клеточных лизатах, так и в целых клетках с помощью количественной флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Эта процедура предлагает некоторые технические преимущества по сравнению со сложными процессами подготовки образцов, необходимыми для методов обнаружения карбонилов белка [21] или изопростанов в образцах плазмы [22].

Кроме того, в экспериментальных условиях, где доступны первичные культуры PBMC, количественное определение метаболитов реактивных видов, поглотителей ROS и антиоксидантных ферментов можно проводить с помощью хромогенных и ферментативных анализов надосадочных жидкостей культур.Более того, анализ экспрессии генов PMBC позволяет оценить антиоксидантные системы и другие молекулы, участвующие в модуляции внутриклеточного окислительного стресса, такие как гены OXPHOS [23-25]. Наконец, количественная оценка структуры и функции митохондрий дает дополнительную информацию, когда окислительный стресс имеет митохондриальный генез [25–27].

4. Гипертония

Патофизиология гипертонии — сложный и многофакторный процесс. Свою роль играют аномалии симпатической нервной системы, системы ренин-ангиотензин-альдостерон, передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белком, а также воспалительных и иммунных механизмов [28].Следует отметить, что эти процессы приводят к избыточному окислительному стрессу из-за увеличения выработки АФК, снижения уровня NO и снижения антиоксидантной способности сердечно-сосудистой системы. Примечательно, что патофизиологическая роль, которую избыток АФК играет в воспалении, гипертрофии, фиброзе, пролиферации, миграции и ангиогенезе, приобретает ключевое значение для процесса ремоделирования сердечно-сосудистой системы и, в конечном итоге, развития повреждения органов-мишеней при гипертонии.

Доказательства того, что окислительный стресс способствует развитию гипертонии, получены из старых исследований [29–31].Однако было проведено лишь несколько исследований с целью определения уровня АФК у пациентов с гипертонической болезнью и их взаимодействия с ключевыми параметрами гипертонической болезни. Интересно, что в когорте из 529 пациентов с гипертонией уровень окислительного стресса полиморфноядерных лейкоцитов (PMN) значительно коррелировал со средним уровнем артериального давления (АД), а также с уровнем гемоглобина A (1c). В той же когорте была обнаружена значимая корреляция между уровнем С-реактивного белка и окислительным стрессом мононуклеарных клеток (MNC) [32].Кроме того, у субъектов из этой когорты, страдающих как гипертензией, так и диабетом, наблюдался повышенный окислительный стресс PMN и MNC. Эти результаты, документально подтверждая тесную взаимосвязь между гипертонией и диабетом с окислительным стрессом и воспалением, позволили разработать и предложить измерение окислительного стресса в циркулирующих лейкоцитах в качестве надежного инструмента для выявления сосудистого повреждения, связанного с гипертензией.

В качестве логического продолжения те же авторы исследовали, может ли повышенный уровень оксидативного стресса быть обнаружен в циркулирующих лейкоцитах крайнего диппера и гипертоников утреннего скачка АД [33].Как и ожидалось, образование АФК МНК было значительно увеличено у обоих типов пациентов с гипертонией. Кроме того, сочетание экстремального типа АД и утреннего всплеска АД привело к еще более высокому уровню образования АФК. Эти данные показывают, что более высокое образование АФК из лейкоцитов при экстремальных типах АД и утреннем всплеске АД является маркером предрасположенности к ранним утренним сердечно-сосудистым событиям (ССЭ). Нельзя исключить, что более высокий уровень АФК также играет патогенетическую роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний у этих типов пациентов с гипертонией.Эта гипотеза подкрепляется наблюдением, что образование АФК МНК связано не только с уровнем ночного АД, но и с другими сердечно-сосудистыми факторами риска, такими как масса левого желудочка, утолщение интима-медиа сонной артерии (IMT) и норадреналин [34].

Полезность измерения активности окислителей лейкоцитов может показать важность не только для оценки окислительного стресса при гипертонии, но и для мониторинга эффекта гипотензивных препаратов. В связи с этим было показано, что использование бенидипина снижает окислительный стресс в PMN у пациентов с гипертонией, по крайней мере, частично за счет снижения уровня АД [35], и что блокаторы рецепторов ангиотензина II типа 1 (AT1R) способны нормализовать АД. и для уменьшения окислительного стресса, производимого лейкоцитами, что позволяет предположить, что последние играют активную роль в патогенезе гипертонии, вызывая окислительный стресс.Фактически, в этих исследованиях лейкоциты были предложены в качестве мишени для антигипертензивных препаратов [36–38].

5. Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца

Сигналы, регулирующие клеточную пролиферацию, формирование неоинтимы и утолщение сосудистой стенки, лежат в основе клеточной и молекулярной основы развития атеросклеротических бляшек. Этот процесс имеет как системный окислительный стресс, так и воспалительные компоненты, включая эндотелиальную дисфункцию, пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток сосудов, циркулирующие иммунные клетки и моноциты / макрофаги [39, 40].Было показано, что последние участвуют в развитии и прогрессировании ишемической болезни сердца (ИБС) [41]. Более того, было продемонстрировано, что нейтрофилы играют ключевую роль в прогрессировании ИБС и нестабильности бляшек через образование миелопероксидазы (МПО) [42]. Фактически, дефицит МПО уменьшал воспаление, окислительный стресс и образование бляшек у мышей с дефицитом аполипопротеина Е, получавших диету с высоким содержанием холестерина [42]. PMN тесно связаны с другими клетками, участвующими в воспалительных реакциях на сосудистом уровне, и они регулируются лимфоцитами и макрофагами.Кроме того, нарушение функции митохондрий может вызвать дополнительный окислительный стресс. Фактически, повреждение митохондриальной ДНК моноцитов и снижение активности комплексов I и IV были идентифицированы на мышиных моделях атеросклероза [43].

Использование лейкоцитов периферической крови может представлять собой действенный инструмент для определения окислительного стресса у пациентов, страдающих атеросклерозом и особенно ИБС. В поддержку этой концепции в исследовании Leu et al. продемонстрировали, что базальная генерация O ₂ ^— с помощью MNCs способна прогнозировать сердечно-сосудистые заболевания у пациентов с сердечным синдромом X независимо от других факторов риска.Это наблюдение предполагает потенциальную роль измерения окислительного стресса, вызываемого МНК, как для мониторинга прогрессирования ИБС, так и для стратификации риска у пациентов с синдромом X [44]. Однако этот метод не показал практической ценности в клинике, чтобы можно было определять другие параметры окислительного стресса в циркулирующих лейкоцитах.

5.1. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом

Несколько исследований показали, что обнаружение в PBMC экспрессии генов, участвующих в атеросклеротическом процессе, полезно с точки зрения прогнозирования и мониторинга атеросклеротических сосудистых поражений.На модели кролика с гиперхолестеринемией наблюдалась значимая взаимосвязь между аортой и экспрессией мРНК CD36 PBMC [45]. Последний является рецептором, который способствует захвату oxLDL артериальной стенкой [46–48]. Он экспрессируется внутри бляшечных макрофагов и опосредует фагоцитоз oxLDL, приводя к образованию пенистых клеток [47]. Что еще более важно, была обнаружена значимая корреляция между экспрессией мРНК CD36 PBMC и более высоким уровнем холестерина у людей [45, 49], что указывает на то, что уровень мРНК CD36 в PBMC может быть использован в качестве биомаркера для диагностики атеросклеротического бремени.

Постоянно сообщалось, что экспрессия p66Shc, митохондриального белка, вызывающего гипергликемическое повреждение клеток, была выше в МКПК пациентов с диабетом, у которых недавно развилась макроангиопатия [50]. На экспериментальном уровне было показано, что делеция p66Shc предотвращает диабетические осложнения [51]. Таким образом, этот маркер можно предложить для прогнозирования возникновения сосудистых осложнений при диабете.

Профилирование экспрессии генов в лейкоцитах крови было предложено в качестве подходящего подхода для выявления субъектов с риском ИБС, хотя и с некоторыми несоответствиями между различными исследованиями [24].Фактически, до сих пор нет определенной информации о генах, действительно предрасполагающих к развитию ИБС.

Помимо оценки риска ИБС, определение экспрессии генов в циркулирующих лейкоцитах может помочь выявить изменения в ответ на изменения физиологического состояния. Таким образом, мы могли охарактеризовать конкретное патологическое состояние. В частности, мы можем отслеживать наличие и прогрессирование ИБС, а также эффекты терапевтических вмешательств [24]. До сих пор было проведено очень мало исследований с определением уровня экспрессии генов, связанных с окислительным стрессом, в МКПК пациентов с ИБС.В исследовании, проведенном в итальянской группе пациентов, страдающих острым коронарным синдромом (ОКС), МКПК использовались для проверки экспрессии гена субъединицы митохондриального комплекса I (Ndufc2) и для оценки уровня окислительного стресса, зависящего от митохондриальной дисфункции. Фактически, экспрессия NDUFC2 была значительно нарушена, наряду со значительным снижением экспрессии нескольких антиоксидантных генов и повышенным уровнем АФК, тогда как в PBMC пациентов, страдающих стабильной стенокардией, не наблюдалось соответствующих изменений [25].Это исследование подтвердило роль повышенного окислительного стресса митохондрий в патогенезе ОКС, продемонстрировав наличие митохондриальной дисфункции и ультраструктурных повреждений наряду с соответствующим снижением уровня АТФ в МКПК пациентов с ОКС. Примечательно, что дефицит митохондриального комплекса I, обусловленный супрессией NDUFC2, ответственен на сосудистом уровне за усиление воспаления, апоптоза и некроза, нарушение целостности эндотелия и ангиогенеза, а также за высвобождение маркеров нестабильности бляшек [25].Насколько нам известно, это один из лучших примеров, подтверждающих полезность циркулирующих PBMC в качестве маркера митохондриального окислительного стресса, который отражает состояние сосудистого стресса и способен отличить состояние ACS от состояния стабильной хронической стенокардии. Интересно, что, по-видимому, PBMC несут и, возможно, усиливают в кровотоке механизм митохондриальной дисфункции, который непосредственно участвует в патогенезе ACS. Фактически, их можно рассматривать не только как сторонних наблюдателей, но и как действующих лиц сцены.С этой точки зрения можно даже идентифицировать PBMC как мишень для лечения CAD.

5.2. Оценка длины теломер в PBMC

Дополнительный параметр, который был исследован на лейкоцитах, — это длина их теломер. Длина теломер лейкоцитов (LTL) рассматривается как маркер биологического старения [52–55]. В частности, окислительный стресс играет важную роль в процессе потери теломерной ДНК [52–55]. В исследовании, проведенном с участием китайских пациентов, страдающих преждевременной ИБС, было обнаружено, что LTL короче, и это явление было связано со сниженной антиоксидантной способностью и увеличением продукции ROS [56].

Интересное исследование поддерживает использование циркулирующих лейкоцитов для оценки LTL как маркера ИБС. В частности, была обнаружена связь между LTL и терапией статинами у пациентов с ИБС: у тех, кто получал лечение статинами, LTL был дольше, чем у пациентов без [57].

5.3. Протеомный подход

Очевидно, что изменения в некоторых белках, участвующих в реакции на окислительный стресс при ишемии сердца, сопровождают повреждение сердца. В частности, поскольку метаболизм митохондрий сильно вовлечен, ожидаются изменения белков ETC, особенно белков комплекса I [58].

Их обнаружение с помощью протеомного подхода в PBMC может помочь в обнаружении и мониторинге окислительного стресса, связанного с ИБС, для мониторинга самого состояния болезни и реакции на лечение. Однако использование протеомики PBMC все еще находится на очень ранней стадии. Первые доказательства белковых изменений в PBMC появляются только в отношении человеческого инсульта [59].

Необходимы дальнейшие исследования с использованием этого подхода в CAD.

6. Инсульт

Патогенез инсульта, общей сложной сердечно-сосудистой особенности, является результатом нескольких сопутствующих факторов, включая гипертонию, генетику и образ жизни.Также в случае инсульта общие механизмы связаны с воспалением сосудов, пролиферацией, ангиогенезом, апоптозом и дисфункцией. Экспериментальные данные подчеркивают ключевую роль повышенного окислительного стресса в развитии инсульта [60, 61].

У людей мы ранее продемонстрировали, что вариант гена rs11237379 / NDUFC2, связанный со снижением активности митохондриального комплекса I и повышенным окислительным стрессом, является фактором риска ювенильного ишемического инсульта [60]. Затем мы показали, что циркулирующие лейкоциты здоровых людей, несущих этот вариант гена, имеют измененную функцию митохондрий и соответствующие структурные повреждения с повышенным митохондриальным окислительным стрессом в ответ на стрессовые стимулы [26].Это интересное свидетельство подчеркивает потенциальную роль циркулирующих лейкоцитов как маркера окислительного стресса и повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний у генетически предрасположенных людей.

В очень немногих исследованиях использовалось использование PBMC для выявления окислительного стресса в клиническом контексте цереброваскулярных заболеваний. В исследовании Aizawa et al. Было обнаружено, что внутриклеточный уровень АФК PMN выше у пациентов с ишемической атакой головного мозга по сравнению с контрольной группой [62]. Примечательно, что лечение поглотителем свободных радикалов (эдаравон) снижает уровень PMN ROS, а также продукцию O ₂ ^— у этих пациентов.Таким образом, это исследование показало важность циркулирующих мононуклеарных клеток для мониторинга инсульта и ответа на подходящую терапию [62].

7. Сердечная недостаточность

Сердечная недостаточность (СН) — это обычное клиническое состояние, которое представляет собой заключительную стадию нескольких сердечных заболеваний и основных патофизиологических механизмов. Среди всего прочего, СН характеризуется избыточным окислительным стрессом из-за соответствующего митохондриального компонента и хроническим воспалением. Окислительный стресс миокарда ухудшает сердечную функцию, способствуя повреждению и смерти клеток.

PBMC часто использовались для выявления митохондриальной респираторной дисфункции при HF, с доказательствами значительной корреляции с сердечными нарушениями и клиническими проявлениями, которые уже выявляются на ранней стадии заболевания [63]. Фактически, высокие уровни ROS и O ₂ ^— присутствуют в крови пациентов с сердечной недостаточностью. Функциональные изменения антиоксидантных ферментов выявляются параллельно в поврежденном миокарде [64]. Кроме того, в PBMC пациентов с сердечной недостаточностью обнаруживаются избыточные двухцепочечные разрывы ДНК и более высокий уровень белков репарации ДНК [65].Кроме того, способность нейтрофилов O ₂ ^—-генерировать вносит вклад в другие вредные фенотипы HF, такие как эндотелиальная дисфункция. Последний не изменился после кратковременной и длительной терапии витамином С [66].

Следует отметить, что в результате спонтанной реакции O ₂ ^— и NO образуется мощный окислитель пероксинитрит. Нитрование белка является следствием продукции пероксинитрита и, как было обнаружено, выше в МКПК пациентов с сердечной недостаточностью. Кроме того, окислительно-нитрационный стресс приводит к активации нескольких ферментов, включая матриксные металлопротеиназы и поли (АДФ-рибоза) полимеразу-1 (PARP).Последний, будучи сверхактивированным, потребляет НАД + и АТФ, что приводит к апоптозу и гибели клеток [67].

Недавнее исследование нашей группы показало, что PBMC пациентов с хронической сердечной недостаточностью производят избыточные АФК, снижают функциональные характеристики митохондрий и имеют ультраструктурные повреждения, такие как нарушение внутренней митохондриальной мембраны (IMM) и низкий IMM / внешний MM ( OMM) значение индекса [27]. Эти явления сопровождались нарушением активации антиоксидантных генов и снижением митофагического потока с последующей неадекватной митохондриальной динамикой.Функциональные и структурные изменения, наблюдаемые у этих пациентов, вероятно, ответственны за дальнейшее нарушение ETC, разобщение митохондрий и продукцию O ₂ ^— .

Сиртуин 1 (SIRT1) является фактором, вовлеченным в механизм выживания клеток, ишемическое повреждение сердца и патофизиологию сердечно-сосудистых заболеваний [68]. Экспрессия SIRT1 в PBMC была значительно снижена, особенно при декомпенсированной HF, и это было существенно связано с повышенным уровнем окислителя и снижением антиоксидантной способности [69].

Таким образом, все исследования подтверждают концепцию, что дисфункциональные циркулирующие PBMC могут действовать как усилитель окислительного стресса и повреждения клеток / тканей, в конечном итоге способствуя прогрессированию состояния HF [70]. Как следствие, неудивительно, что уровень АФК в PBMC позволяет прогнозировать повторную госпитализацию при хронической сердечной недостаточности [71]. Более того, как указано выше для гипертонии и ИБС, PBMC могут стать мишенью также для лечения сердечной недостаточности.

Воздействие терапии, используемой у пациентов с сердечной недостаточностью, оценивалось на клеточном уровне и в циркулирующих лейкоцитах.Пациенты с декомпенсированной хронической сердечной недостаточностью и выраженным системным воспалением и повышенной продукцией свободных радикалов кислорода улучшили свое функциональное состояние и снизили показатели воспаления и окислительного стресса после кратковременной инотропной поддержки. В частности, краткосрочная инотропная поддержка милриноном и добутамином улучшила клинический статус, согласно классификации NYHA и тестом с 6-минутной ходьбой, и значительно снизила уровни маркеров воспалительного и окислительного стресса в плазме через 30 дней.

Поскольку окислительный стресс усиливается при СН из-за отсутствия легочного клиренса циркулирующих лейкоцитов и тромбоцитов, нагруженных АФК, удаление АФК в легких и перенос активных окислительно-восстановительных молекул в митохондрии могут быть предложены в качестве мишеней для хронической терапии СН [70].

Исследование Kong et al. оценили митохондриальные изменения лейкоцитов, вызванные шунтированием, и обнаружили, что они являются частью системных иммунных нарушений, связанных с кардиохирургическим вмешательством [72]. Также оценивалось влияние имплантации вспомогательного устройства левого желудочка на окислительный стресс циркулирующих лейкоцитов.Интересно, что после имплантации вспомогательного устройства для левого желудочка (LVAD) в лейкоцитах крови наблюдалась повышенная продукция ROS, что указывает на стойкий окислительный стресс у этих пациентов [73]. Поскольку производство ROS и повреждение ДНК связаны с высоким напряжением сдвига, наиболее правдоподобным объяснением вышеупомянутого явления является то, что непрерывный поток LVAD создает высокие напряжения сдвига, что способствует избыточному производству ROS из циркулирующих PBMC и повреждению ДНК лимфоцитами.Гарантия на использование менее травматичных устройств, позволяющих обойти эту проблему.

8. Выводы

Большое количество доказательств подчеркивает важность мониторинга окислительного стресса при ССЗ с целью получения большей информации о состоянии болезни и реакции на лечение. Это наблюдение подразумевает, что релевантная прогностическая информация для пациентов может быть получена параллельно. В настоящее время в клинической практике не существует определенного инструмента. В частности, хотя некоторые маркеры окислительного стресса, оценивающие окисление фосфолипидов и компонентов белка ЛПНП, предсказывают повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний, ни один из них еще не вошел в клиническую практику [9].Фактически, клинические испытания, включая перекрестные, ретроспективные и проспективные исследования, дали противоречивые результаты [74], в основном из-за методологических проблем.

Выбор исследования окислительно-восстановительного состояния PBMC при сердечно-сосудистых заболеваниях основан на доказательствах того, что эти клетки играют ключевую роль в модуляции атерогенеза, управляя воспалительными и иммунными ответами [75]. Лимфоциты и моноциты тесно взаимодействуют с внутренними клетками сосудов атеромы. В этом контексте цитокины и метаболиты реактивных видов являются сигналами, которые опосредуют взаимоотношения между различными типами клеток.Они также модулируют многие ключевые процессы, такие как индукция эндотелиальной дисфункции, запуск коагуляции и фибринолиза, образование и накопление пенистых клеток, миграцию и перепрограммирование гладкомышечных клеток сосудов и активацию путей восстановления, приводящих к фиброзу тканей [76 –78].

Кроме того, окислительно-восстановительное состояние PBMC близко отражает состояние системного оксидативного стресса сердечно-сосудистой системы и, следовательно, наличие и прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний. Вероятно, что измененное окислительно-восстановительное состояние дисфункциональных циркулирующих лейкоцитов может действовать как усилитель окислительного стресса на тканевом уровне, ухудшая развитие болезни [63, 70, 79].

Основываясь на данных, собранных за последние несколько лет и обобщенных в этой статье (Таблица 1, Рисунок 1), вполне вероятно, что использование циркулирующих лейкоцитов может стать важным клиническим инструментом. Они также могут помочь лучше понять механизмы, участвующие в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, чтобы подкрепить текущие данные и определить преимущества, если таковые имеются, PBMC по сравнению с маркерами, обнаруживающими окислительный стресс в плазме.