Ск 66: СК РФ Статья 66. Осуществление родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка

Содержание

СК РФ Статья 66. Осуществление родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка

1. Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет права на общение с ребенком, участие в его воспитании и решении вопросов получения ребенком образования.

Родитель, с которым проживает ребенок, не должен препятствовать общению ребенка с другим родителем, если такое общение не причиняет вред физическому и психическому здоровью ребенка, его нравственному развитию.

2. Родители вправе заключить в письменной форме соглашение о порядке осуществления родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка.

Если родители не могут прийти к соглашению, спор разрешается судом с участием органа опеки и попечительства по требованию родителей (одного из них). По требованию родителей (одного из них) в порядке, установленном гражданским процессуальным законодательством, суд с обязательным участием органа опеки и попечительства вправе определить порядок осуществления родительских прав на период до вступления в законную силу судебного решения.

(в ред. Федерального закона от 04.05.2011 N 98-ФЗ)

(см. текст в предыдущей редакции)

3. При невыполнении решения суда к виновному родителю применяются меры, предусмотренные законодательством об административных правонарушениях и законодательством об исполнительном производстве. При злостном невыполнении решения суда суд по требованию родителя, проживающего отдельно от ребенка, может вынести решение о передаче ему ребенка исходя из интересов ребенка и с учетом мнения ребенка.(в ред. Федерального закона от 30.12.2015 N 457-ФЗ)

(см. текст в предыдущей редакции)

4. Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право на получение информации о своем ребенке из образовательных организаций, медицинских организаций, организаций социального обслуживания и аналогичных организаций. В предоставлении информации может быть отказано только в случае наличия угрозы для жизни и здоровья ребенка со стороны родителя. Отказ в предоставлении информации может быть оспорен в судебном порядке.

(см. текст в предыдущей редакции)

Открыть полный текст документа

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 66 СК РФ

1. Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет права на общение с ребенком, участие в его воспитании и решение вопросов получения ребенком образования.

Комментарий к Ст. 66 Семейного кодекса РФ

1. Согласно статье 66 СК РФ раздельное проживание родителей не является основанием для отказа в осуществлении родителем, проживающим отдельно от ребенка, прав на общение с ребенком, участие в его воспитании и решении вопросов получения ребенком образования, поскольку указанные права являются одновременно родительскими обязанностями, которые не прекращаются в связи с проживанием одного из родителей отдельно от ребенка.

2. Судебная практика по этой категории споров свидетельствует о том, что довольно часто проживающий с ребенком родитель либо вовсе лишает другого родителя возможности общаться с ребенком, либо безосновательно ограничивает такое общение, выдвигая для общения с ребенком различного рода условия, в том числе неправомерные.

Возникший между родителями спор разрешается судом в интересах ребенка с участием в деле органа опеки и попечительства. В отдельных, наиболее сложных ситуациях суды для разрешения возникшего спора привлекают к участию в деле в качестве специалиста психолога либо при необходимости назначают судебно-психологическую, психолого-педагогическую или даже комплексную медико-психолого-педагогическую экспертизы, приостанавливая производство по делу на период проведения экспертизы.

По требованию родителей (одного из них) в порядке, установленном ч. 6.1 ст. 152 ГПК РФ, суд с обязательным участием органа опеки и попечительства и с обязательным учетом мнения детей вправе определить порядок осуществления родительских прав на период до вступления в законную силу судебного решения.

Судебная практика.

Исходя из права родителя, проживающего отдельно от ребенка, на общение с ним, а также из необходимости защиты прав и интересов несовершеннолетнего при общении с этим родителем, суду с учетом обстоятельств каждого конкретного дела следует определить порядок такого общения (время, место, продолжительность общения и т.п.), изложив его в резолютивной части решения.

При определении порядка общения родителя с ребенком принимаются во внимание возраст ребенка, состояние его здоровья, привязанность к каждому из родителей и другие обстоятельства, способные оказать воздействие на физическое и психическое здоровье ребенка, на его нравственное развитие. В исключительных случаях, когда общение ребенка с отдельно проживающим родителем может нанести вред ребенку, суд, исходя из п. 1 ст. 65 СК РФ, не допускающего осуществление родительских прав в ущерб физическому и психическому здоровью детей и их нравственному развитию, вправе отказать этому родителю в удовлетворении иска об определении порядка его участия в воспитании ребенка, изложив мотивы принятого решения (Постановление Пленума ВС РФ от 27.05.1998 N 10 «О применении судами законодательства при разрешении споров, связанных с воспитанием детей»). См. также: Обзор практики разрешения судами споров, связанных с воспитанием детей, утв. Президиумом ВС РФ 20.07.2011.

Ст. 66 СК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

Комментарий к Ст. 66 СК РФ

1. Нормы комментируемой статьи 66 СК РФ базируются на положениях ст. 9 Конвенции ООН о правах ребенка, согласно которой государства-участники обеспечивают, чтобы ребенок не разлучался со своими родителями вопреки их желанию, за исключением случаев, когда компетентные органы согласно судебному решению, определяют в соответствии с применимым законом и процедурами, что такое разлучение необходимо в интересах ребенка. Данное определение может оказаться необходимым в том или ином конкретном случае, например когда родители жестоко обращаются с ребенком или не заботятся о нем либо когда родители проживают раздельно и необходимо принять решение относительно места проживания ребенка.

Государства-участники уважают право ребенка, который разлучается с одним или обоими родителями, поддерживать на регулярной основе личные отношения и прямые контакты с обоими родителями, за исключением случаев, когда это противоречит интересам ребенка. Если такое разлучение вытекает из какого-либо решения, принятого государством-участником, например при аресте, тюремном заключении, высылке, депортации или смерти (включая смерть, наступившую по любой причине во время нахождения данного лица в ведении государства) одного или обоих родителей или ребенка, государство-участник предоставляет родителям, ребенку или при необходимости другому члену семьи по их просьбе необходимую информацию в отношении местонахождения отсутствующего члена (членов) семьи, когда предоставление этой информации не наносит ущерба благосостоянию ребенка. Государства-участники в дальнейшем обеспечивают, чтобы предоставление такой информации само по себе не приводило к неблагоприятным последствиям для соответствующего лица (лиц).

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

2. Комментируемая статья 66 Семейного кодекса России направлена на защиту прав родителя, проживающего отдельно от ребенка, который имеет те же самые права и обязанности, что и родитель, с которым проживает ребенок.

Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право на:

— общение с ребенком;

— участие в его воспитании;

— решение вопросов получения ребенком образования;

— получение информации о своем ребенке из воспитательных и иных учреждений (за исключением случаев наличия угрозы для жизни и здоровья ребенка со стороны родителей).

3. В соответствии с п. 2 комментируемой статьи родители вправе заключить в письменной форме соглашение о порядке осуществления родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка. Нотариальное удостоверение такого соглашения не является обязательным. В соглашении указываются время, место, продолжительность общения, порядок такого общения, возможность присутствия других лиц и т.п. При этом родители должны учитывать мнение ребенка, его режим, интересы. Законодательством не указан возраст, с которого ребенок вправе самостоятельно решать вопрос о порядке общения с родителями. В том случае, если ребенок не желает такого общения, он не может быть принужден, поскольку для него это право на общение, а не обязанность, которую он должен исполнять.

4. Если родители не могут прийти к соглашению, возникший спор разрешается судом по требованию родителей или одного из них с участием органа опеки и попечительства. Орган опеки и попечительства должен представить свое заключение на основании акта обследования условий жизни ребенка.

Абзац 2 п. 2 комментируемой статьи 66 СК был дополнен Федеральным законом от 4 мая 2011 г. N 98-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации», предусматривающим возможность по требованию родителей (одного из них) в порядке, установленном гражданским процессуальным законодательством, на заседании суда с обязательным участием органа опеки и попечительства определить порядок осуществления родительских прав на период до вступления в законную силу судебного решения. Основанием для подобного дополнения послужила проблема длительного рассмотрения споров о расторжении брака, об определении места жительства ребенка. Гарантии и механизм реализации прав детей на общение с родителями в период разрешения судами указанных дел были установлены в комментируемой статье, а также в ст. 65 ГК РФ, ст. 152 ГПК РФ и ст. 5.35 КоАП.

Пункт 8 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 27 мая 1998 г. N 10 «О применении судами законодательства при разрешении споров, связанных с воспитанием детей» дает следующее разъяснение относительно определения порядка общения с ребенком родителя, проживающего отдельно от ребенка. Исходя из права родителя, проживающего отдельно от ребенка, на общение с ним, а также из необходимости защиты прав и интересов несовершеннолетнего при общении с этим родителем суду с учетом обстоятельств каждого конкретного дела следует определить порядок такого общения (время, место, продолжительность общения и т.п.), изложив его в резолютивной части решения.

В исключительных случаях, когда общение ребенка с отдельно проживающим родителем может нанести вред ребенку, суд исходя из п. 1 ст. 65 СК РФ, не допускающего осуществление родительских прав в ущерб физическому и психическому здоровью детей и их нравственному развитию, вправе отказать этому родителю в удовлетворении иска об определении порядка его участия в воспитании ребенка, изложив мотивы принятого решения.

Аналогично должно рассматриваться и требование об устранении препятствий родителям, не лишенным родительских прав, в воспитании детей, находящихся у других лиц на основании закона или решения.

Определив порядок участия отдельно проживающего родителя в воспитании ребенка, суд предупреждает другого родителя о возможных последствиях невыполнения решения суда (п. 3 ст. 66 СК). В качестве злостного невыполнения решения суда, которое может явиться основанием для удовлетворения требования родителя, проживающего отдельно от ребенка, о передаче ему несовершеннолетнего, может расцениваться невыполнение ответчиком решения суда или создание им препятствий для исполнения такового, несмотря на применение к виновному родителю предусмотренных законом мер.

5. Об ответственности, предусмотренной п. 3 комментируемой статьи, см. комментарий к ст. 67 СК РФ.

6. В п. 4 комментируемой статьи 66 Семейного кодекса говорится о праве родителя, проживающего отдельно от ребенка, на получение информации о ребенке. Это может быть информация о состоянии здоровья, об уровне образования, о нахождении его в чрезвычайной ситуации, об интересах ребенка и др. Соблюдение этого права необходимо обеспечивать в интересах самого ребенка, с тем чтобы родитель, проживающий отдельно от ребенка, мог полноценно заботиться о ребенке, воспитывать, участвовать в его жизни. Так, согласно ст. 31 Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан от 22 июля 1993 г. N 5487-1 каждый гражданин имеет право в доступной для него форме получить имеющуюся информацию о состоянии своего здоровья, включая сведения о результатах обследования, наличии заболевания, его диагнозе и прогнозе, методах лечения, связанном с ними риске, возможных вариантах медицинского вмешательства, их последствиях и результатах проведенного лечения.

Информация о состоянии здоровья гражданина предоставляется ему, а в отношении лиц, не достигших возраста 15 лет, и граждан, признанных в установленном законом порядке недееспособными, — их законным представителям лечащим врачом, заведующим отделением лечебно-профилактического учреждения или другими специалистами, принимающими непосредственное участие в обследовании и лечении. По достижении 15 лет ребенок вправе самостоятельно определять, кто именно имеет право на информацию о состоянии его здоровья.

Информация о факте обращения за медицинской помощью, состоянии здоровья гражданина, диагнозе его заболевания и иные сведения, полученные при его обследовании и лечении, составляющие врачебную тайну, могут быть предоставлены без согласия гражданина в случае оказания помощи несовершеннолетнему в возрасте до 15 лет для информирования его родителей или законных представителей. Лица, которым в установленном законом порядке переданы сведения, составляющие врачебную тайну, наравне с медицинскими и фармацевтическими работниками с учетом причиненного гражданину ущерба несут за разглашение врачебной тайны дисциплинарную, административную или уголовную ответственность в соответствии с законодательством Российской Федерации и республик в составе Федерации, что предусмотрено ст. 61 Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан.

В случае выявления ВИЧ-инфекции у несовершеннолетних в возрасте до 18 лет, а также у лиц, признанных в установленном законом порядке недееспособными, работники медицинских учреждений уведомляют об этом родителей или иных законных представителей указанных лиц в соответствии с п. 2 ст. 13 Федерального закона от 30 марта 1995 г. N 38-ФЗ «О предупреждении распространения в Российской Федерации заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции)».

7. Родитель, проживающий отдельно, имеет право на общение с ребенком согласно п. 2 ст. 55 СК РФ, в том числе и в случаях, когда ребенок находится в экстремальной ситуации (задержание, арест, заключение под стражу, нахождение в лечебном учреждении и др.). Родители имеют право на информацию о ребенке, находящемся в экстремальной ситуации, и право на защиту его прав.

Ст 66 СК РФ с комментариями и изменениями на 2020-2021 год

Наиболее сложная семейная ситуация у ребенка и его родителей, когда они проживают раздельно, причем тяжесть такого положения в основном падает на ребенка.

Право на общение есть и у ребенка, и у родителей. Оно служит удовлетворению жизненных потребностей как несовершеннолетних, так и взрослых членов семьи. Комментируемая статья посвящена праву на общение с ребенком родителя, который живет от него отдельно, поэтому постоянный ежедневный контакт такого родителя со своими детьми невозможен. Ребенок любого возраста должен иметь единый режим воспитания, жить сообразно сложившемуся в его семье укладу, иметь привычную среду обитания. В противном случае может пострадать его воспитание. Общение с ребенком родителя, живущего отдельно от него, предполагает существование постоянного, систематического контакта между ними, а не эпизодических неожиданных встреч. Общение должно приносить пользу ребенку, служить источником его полноценного воспитания.

Обеспечению права на общение родителя не обязательно должно предшествовать разрешение судом спора о месте жительства ребенка. Проживание ребенка с одним из родителей может быть результатом их договоренности. Если же такой договоренности нет, проживающему отдельно родителю принадлежит право выбора: ставить ли вопрос об общении или просить суд решить, с кем из родителей должен проживать ребенок.

Не менее важной формой осуществления родительских прав лицом, которое не проживает со своим ребенком, является участие в его воспитании. Предполагается использование различных способов положительного воздействия на ребенка. Для этого применяются не только личные контакты (общение), но и телефонная связь, переписка и т.п.

Общение с ребенком относится к числу личных прав одного из родителей, о существовании которого прямо говорит закон. Поэтому нарушение этого права, создание условий, затрудняющих или делающих невозможной его реализацию, есть правонарушение. Причем это нарушение не только прав одного из родителей, но и ребенка. Поэтому СК РФ запрещает родителю, с которым проживает ребенок, препятствовать его общению с другим родителем при условии, если такое общение не причинит вред физическому и психическому здоровью ребенка, его нравственному развитию. В основе противодействия общению не должны лежать сугубо личные, продиктованные эгоистическими соображениями мотивы.

Проблемы осуществления права на общение возникают при прекращении семейных отношений между родителями. Целесообразно именно в этот момент решить все вопросы, связанные с правом на общение. Тогда легче оценить реальную перспективу будущих контактов отдельно проживающего родителя со своими детьми.

Родителям предоставляется право заключать соглашения о порядке осуществления права на общение, где могут быть зафиксированы любые важные для сторон детали: место общения, его частота, продолжительность и т.п. В любом случае это соглашение должно быть свободно от положений, противоречащих интересам ребенка, заключено в простой письменной форме, не подлежащей нотариальному удостоверению.

При необходимости это соглашение может послужить одним из доказательств при рассмотрении судом иска об устранении препятствий к общению.

Нарушение права на общение касается одного из наиболее значимых личных прав гражданина как родителя. Семейный кодекс устанавливает защиту прав отдельно проживающего родителя в судебном порядке. В отличие от КоБС, при наличии спора, связанного с реализацией этого права, любая из заинтересованных сторон может обратиться с иском в суд. Спор разрешается с обязательным участием органов опеки и попечительства, дающим свое заключение по поручению суда, а не по просьбе родителей.

Суд в своем решении подтверждает право на общение и одновременно определяет его форму, сообразуясь с конкретной ситуацией (возрастом ребенка, состоянием его здоровья, привязанностью к каждому из родителей и т.п.). В иске может быть отказано, если того требуют интересы ребенка. Но всякий раз такой отказ нуждается в серьезном обосновании.

Судебный порядок служит более надежной гарантией осуществления права на общение. Поскольку обычно противодействует другой родитель, то к нему применяются меры, обязывающие к исполнению решения суда, — денежный штраф в размере до 200 установленных законом минимальных размеров оплаты труда. Если родитель, обязанный устранить препятствия к общению, по независящим от него причинам сделать этого не может (тяжело болен, выехал в командировку и т.п.), применение к нему мер принудительного характера откладывается.

Сознательное упорное нежелание подчиниться решению суда, уйти от его исполнения любым способом, даже ценой нанесения душевной травмы ребенку, рассматривается как злостное невыполнение решения суда. Это позволяет передать несовершеннолетнего другому родителю для совместного проживания. При рассмотрении такого иска суд обязательно учитывает мнение ребенка, его желание (нежелание) перейти жить к другому родителю. Только противодействия исполнению решения суда по делам подобного рода для лишения родительских прав недостаточно. Если родитель, чьи права нарушаются, стремится только к общению, он вправе обратиться за помощью в орган опеки и попечительства, к педагогу, воспитателю.

Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право на получение интересующей его информации о ребенке из любого учреждения, где находится его ребенок, будь то общеобразовательное учреждение, специальное учебно-воспитательное учреждение для детей и подростков с девиантным поведением или больница, дом инвалидов и т.п.

Информация о ребенке не должна представлять угрозы его жизни и здоровью со стороны родителя, если он, например, страдает тяжелым и опасным для окружающих психическим заболеванием, глубоким слабоумием, после возвращения из мест лишения свободы продолжает вести асоциальный образ жизни и т.п. Родитель, имеющий право на информацию о ребенке, вправе оспорить (обжаловать) в судебном порядке отказ в предоставлении ему этой информации. При этом он освобождается от обязанности доказывать незаконность обжалуемых действий (решений), но должен доказать факт нарушения своих прав, в данном случае родительских.

Статья 66 СК РФ и комментарии к ней

1. Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет права на общение с ребенком, участие в его воспитании и решение вопросов получения ребенком образования. Родитель, с которым проживает ребенок, не должен препятствовать общению ребенка с другим родителем, если такое общение не причиняет вред физическому и психическому здоровью ребенка, его нравственному развитию.

2. Родители вправе заключить в письменной форме соглашение о порядке осуществления родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка.Если родители не могут прийти к соглашению, спор разрешается судом с участием органа опеки и попечительства по требованию родителей (одного из них). По требованию родителей (одного из них) в порядке, установленном гражданским процессуальным законодательством, суд с обязательным участием органа опеки и попечительства вправе определить порядок осуществления родительских прав на период до вступления в законную силу судебного решения.
3. При невыполнении решения суда к виновному родителю применяются меры, предусмотренные законодательством об административных правонарушениях и законодательством об исполнительном производстве. При злостном невыполнении решения суда суд по требованию родителя, проживающего отдельно от ребенка, может вынести решение о передаче ему ребенка исходя из интересов ребенка и с учетом мнения ребенка.(Пункт в редакции, введенной в действие с 10 января 2016 года Федеральным законом от 30 декабря 2015 года N 457-ФЗ.

4. Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право на получение информации о своем ребенке из воспитательных учреждений, медицинских организаций, организаций социального обслуживания и аналогичных организаций. В предоставлении информации может быть отказано только в случае наличия угрозы для жизни и здоровья ребенка со стороны родителя. Отказ в предоставлении информации может быть оспорен в судебном порядке.(Пункт в редакции, введенной в действие с 1 сентября 2008 года Федеральным законом от 24 апреля 2008 года N 49-ФЗ; в редакции, введенной в действие Федеральным законом от 25 ноября 2013 года N 317-ФЗ; в редакции, введенной в действие с 9 декабря 2015 года Федеральным законом от 28 ноября 2015 года N 358-ФЗ.

Комментарий к статье 66 СК РФ

1. В силу различных жизненных обстоятельств родители могут не проживать совместно со своими детьми. В этой связи осуществление такими родителями своих родительских прав представляет для них относительную сложность. Поэтому настоящая статья закрепляет основные положения по осуществлению родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка.

Пункт 1 комментируемой статьи устанавливает, что родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право: а) на общение с ним; б) участие в его воспитании; в) на решение вопросов получения ребенком образования. Данное положение основано на принципе равенства родительских прав и обязанностей (см. комментарий к ст. 61 СК РФ), а также праве ребенка в случае раздельного проживания его родителей на общение с каждым из них (см. комментарий к ст. 55 СК РФ). Поэтому родитель, совместно проживающий с ребенком, обязан допускать его общение с другим родителем. Причем это не право родителя, проживающего с ребенком, а его обязанность, поскольку в противном случае будут ущемляться законные права и интересы как отдельно проживающего родителя, так и самого ребенка. В этой связи п. 1 комментируемой статьи определяет, что родитель, с которым проживает ребенок, не должен препятствовать общению ребенка с другим родителем, за исключением случаев, когда такое общение причиняет вред физическому или психическому здоровью ребенка, его нравственному развитию.

Однако учитывая, что мнение родителя, совместно проживающего с ребенком, о вредном влиянии другого родителя может быть чисто субъективным, на практике споры такого рода разрешаются в судебном порядке на основании п. 2 комментируемой статьи. Так, С. обратился в суд с иском к бывшей жене В. об определении порядка общения с несовершеннолетней дочерью, указав, что брак с ответчицей расторгнут, дочь осталась проживать с матерью, ответчица препятствует его общению с ребенком. Судом первой инстанции было принято решение об обязании В. предоставить возможность С. общаться с дочерью в период с 9.00 до 12.00 часов в воскресенье каждую вторую и четвертую недели месяца, в присутствии В., по определенному адресу, куда она обязана привозить дочь. При оценке доказательств суд первой инстанции не учел то обстоятельство, что после расторжения брака В. с дочерью проживает в селе, в доме родителей, а истец — в городе. В надзорной жалобе В. просила об отмене данного решения. При этом указывается, что решение является неисполнимым, нарушающим ее права и интересы малолетнего ребенка в связи с тем, что ей с трехлетним ребенком крайне затруднительно приезжать в город из деревни, расположенной в 45 километрах от города. Личного транспортного средства она не имеет, вынуждена с ребенком, независимо от погодных условий и времени года, добираться на попутном транспорте, что требует дополнительных материальных затрат, физических сил и может отрицательно повлиять на здоровье ребенка. Верховный суд Республики Татарстан, отменяя решение суда нижестоящей инстанции, пояснил, что указанные обстоятельства, непосредственно касающиеся интересов малолетнего ребенка, при разрешении спора судом учтены не были, суд не проверил, отвечает ли интересам ребенка такой порядок общения истца с дочерью и является ли решение исполнимым. Между тем семейное законодательство предусматривает разрешение подобных споров прежде всего с учетом интересов ребенка <1>.

———————————
<1> Обзор судебной практики Верховного суда Республики Татарстан за третий квартал 2007 г. (по гражданским делам) // СПС ГР.

2. Согласно п. 2 комментируемой статьи, порядок осуществления родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка, может быть определен соглашением между родителями. Такое соглашение именуется соглашением о порядке осуществления родительских прав родителем, проживающим отдельно от ребенка, и заключается между родителями несовершеннолетнего ребенка. Законодатель предусматривает, что данное соглашение может быть заключено в письменной форме, но не уточняет — в простой письменной форме или нотариально удостоверенной. Однако, как показывает практика, с целью защиты прав и законных интересов ребенка и родителя, отдельно проживающего от ребенка, данное соглашение целесообразнее заключать в нотариально удостоверенной форме. Вместе с тем возможны и такие случаи, когда такое соглашение заключается в устной форме. При этом следует помнить, что в силу ст. 162 ГК РФ несоблюдение простой письменной формы влечет недействительность сделки, т.е. недействительность данного соглашения родителей. Содержание соглашения составляют вопросы, касающиеся форм, места, частоты, продолжительности общения ребенка с родителем, проживающим отдельно от него, а также любые вопросы его участия в воспитании ребенка.

В случае недостижения соглашения об осуществлении родительских прав родителя, отдельно проживающего от ребенка, спор между родителями разрешается судом с участием органа опеки и попечительства по требованию заинтересованного родителя. При подготовке дел данной категории к судебному разбирательству судье следует правильно определить обстоятельства, имеющие значение для разрешения возникшего спора и подлежащие доказыванию сторонами, обратив особое внимание на те из них, которые характеризуют личные качества родителей либо иных лиц, воспитывающих ребенка, а также сложившиеся взаимоотношения этих лиц с ребенком. Такие дела назначаются к разбирательству в судебном заседании только после получения от органов опеки и попечительства составленных и утвержденных в установленном порядке актов обследования условий жизни лиц, претендующих на воспитание ребенка (п. 2 Постановления Пленума Верховного Суда РФ N 10). Суд, рассматривая по существу спор по данному вопросу, принимает во внимание различные обстоятельства с учетом соблюдения принципа равенства родительских прав обоих родителей и интересов ребенка. При необходимости судом может быть назначена судебно-психологическая экспертиза, которая может проводиться как в отношении родителей (одного из них), так и по психологическому анализу ситуации (семейного конфликта). Однако следует иметь в виду, что заключение судебно-психологической экспертизы, как и заключение органа опеки и попечительства, является лишь одним из доказательств, которое оценивается судом в совокупности с другими имеющимися в деле доказательствами. Пункт 8 Постановления Пленума Верховного Суда РФ N 10 разъясняет, что, исходя из права родителя, проживающего отдельно от ребенка, на общение с ним, а также из необходимости защиты прав и интересов несовершеннолетнего при общении с этим родителем, суду с учетом обстоятельств каждого конкретного дела следует определить порядок такого общения (время, место, продолжительность общения и т.п.), изложив его в резолютивной части решения.

При определении порядка общения родителя с ребенком принимаются во внимание возраст ребенка, состояние его здоровья, привязанность к каждому из родителей и другие обстоятельства, способные оказать воздействие на физическое и психическое здоровье ребенка, на его нравственное развитие. В исключительных случаях, когда общение ребенка с отдельно проживающим родителем может нанести вред ребенку, суд, исходя из п. 1 ст. 65 СК РФ, не допускающего осуществление родительских прав в ущерб физическому и психическому здоровью детей и их нравственному развитию, вправе отказать этому родителю в удовлетворении иска об определении порядка его участия в воспитании ребенка, изложив мотивы принятого решения. Аналогично должно разрешаться и требование об устранении препятствий родителям, не лишенным родительских прав, в воспитании детей, находящихся у других лиц на основании закона или решения.

3. В соответствии с п. 3 комментируемой статьи суд, определив порядок участия отдельно проживающего родителя в воспитании ребенка, предупреждает другого родителя о возможных последствиях невыполнения решения суда. В качестве злостного невыполнения решения суда, которое может явиться основанием для удовлетворения требования родителя, проживающего отдельно от ребенка, о передаче ему несовершеннолетнего, может расцениваться невыполнение ответчиком решения суда или создание им препятствий для его исполнения, несмотря на применение к виновному родителю предусмотренных законом мер (п. 8 Постановления Пленума Верховного Суда РФ N 10).

В случае неподчинения родителя, с которым проживает ребенок, решению суда о порядке участия другого родителя, проживающего отдельно от ребенка, в его воспитании к нему применяются меры ответственности, предусмотренные законодательством об исполнительном производстве.

4. Исходя из принципа равенства не только обязанностей по воспитанию ребенка, но и родительских прав, п. 4 комментируемой статьи предоставляет родителю, проживающему отдельно от ребенка, право на получение информации о своем ребенке из воспитательных учреждений, лечебных учреждений, учреждений социальной защиты и других аналогичных учреждений. Лица, к которым родитель обратился за получением подобной информации, обязаны ее предоставить. Так, например, согласно п. 7 ст. 15 Закона РФ «Об образовании», в период учебы в образовательном учреждении родителям несовершеннолетних обучающихся воспитанников должна быть обеспечена возможность ознакомления с ходом и содержанием образовательного процесса, а также с оценками успеваемости обучающихся.

Родителем, проживающим отдельно от ребенка, может быть затребована также информация о состоянии здоровья ребенка из учреждений здравоохранения. Так, согласно ст. 31 Основ об охране здоровья, каждый гражданин имеет право в доступной для него форме получить имеющуюся информацию о состоянии своего здоровья, включая сведения о результатах обследования, наличии заболевания, его диагнозе и прогнозе, методах лечения, связанном с ними риске, возможных вариантах медицинского вмешательства, их последствиях и результатах проведенного лечения. Информация о состоянии здоровья гражданина предоставляется ему, а в отношении лиц, не достигших 15 лет, и граждан, признанных в установленном порядке недееспособными, — их законным представителям лечащим врачом, заведующим отделением лечебно-профилактического учреждения или другими специалистами, принимающими непосредственное участие в обследовании и лечении. Несовершеннолетние, больные наркоманией, в возрасте старше 16 лет, иные несовершеннолетние в возрасте старше 15 лет имеют право на самостоятельное добровольное информированное согласие на медицинское вмешательство или на отказ от него (ст. 24 Основ об охране здоровья). Родители, проживающие отдельно от ребенка, имеют право на получение и иной информации о своем ребенке, его нравственном, физическом развитии.

В предоставлении такой информации может быть отказано лишь в одном случае: наличие угрозы для жизни и здоровья ребенка со стороны родителя. Однако и в этом случае отказ в предоставлении информации может быть оспорен родителем в судебном порядке по правилам гражданского процессуального судопроизводства.

Другой комментарий к статье 66 Семейного Кодекса РФ

1. Нормы комментируемой статьи базируются на положениях ст. 9 Конвенции ООН о правах ребенка, согласно которой государства-участники обеспечивают, чтобы ребенок не разлучался со своими родителями вопреки их желанию, за исключением случаев, когда компетентные органы согласно судебному решению, определяют в соответствии с применимым законом и процедурами, что такое разлучение необходимо в интересах ребенка. Данное определение может оказаться необходимым в том или ином конкретном случае, например когда родители жестоко обращаются с ребенком или не заботятся о нем либо когда родители проживают раздельно и необходимо принять решение относительно места проживания ребенка.

2. Комментируемая статья направлена на защиту прав родителя, проживающего отдельно от ребенка, который имеет те же самые права и обязанности, что и родитель, с которым проживает ребенок.

Родитель, проживающий отдельно от ребенка, имеет право на:

— общение с ребенком;

— участие в его воспитании;

— решение вопросов получения ребенком образования;

Абзац 2 п. 2 комментируемой статьи был дополнен Федеральным законом от 4 мая 2011 г. N 98-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации», предусматривающим возможность по требованию родителей (одного из них) в порядке, установленном гражданским процессуальным законодательством, на заседании суда с обязательным участием органа опеки и попечительства определить порядок осуществления родительских прав на период до вступления в законную силу судебного решения. Основанием для подобного дополнения послужила проблема длительного рассмотрения споров о расторжении брака, об определении места жительства ребенка. Гарантии и механизм реализации прав детей на общение с родителями в период разрешения судами указанных дел были установлены в комментируемой статье, а также в ст. 65 ГК РФ, ст. 152 ГПК РФ и ст. 5.35 КоАП.

5. Об ответственности, предусмотренной п. 3 комментируемой статьи, см. комментарий к ст. 67 СК РФ.

6. В п. 4 комментируемой статьи говорится о праве родителя, проживающего отдельно от ребенка, на получение информации о ребенке. Это может быть информация о состоянии здоровья, об уровне образования, о нахождении его в чрезвычайной ситуации, об интересах ребенка и др. Соблюдение этого права необходимо обеспечивать в интересах самого ребенка, с тем чтобы родитель, проживающий отдельно от ребенка, мог полноценно заботиться о ребенке, воспитывать, участвовать в его жизни. Так, согласно ст. 31 Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан от 22 июля 1993 г. N 5487-1 каждый гражданин имеет право в доступной для него форме получить имеющуюся информацию о состоянии своего здоровья, включая сведения о результатах обследования, наличии заболевания, его диагнозе и прогнозе, методах лечения, связанном с ними риске, возможных вариантах медицинского вмешательства, их последствиях и результатах проведенного лечения.

СК проводит проверку из-за вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве

https://ria.ru/20210627/lager-1738780585.html

СК проводит проверку из-за вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве

СК проводит проверку из-за вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве — РИА Новости, 27.06.2021

СК проводит проверку из-за вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве

СК проводит проверку по факту вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве, там заболели 66 детей и восемь сотрудников, сообщается на сайте ведомства по региону. РИА Новости, 27.06.2021

2021-06-27T09:02

2021-06-27T09:06

распространение коронавируса

происшествия

республика тыва

федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (роспотребнадзор)

следственный комитет россии (ск рф)

россия

коронавирус в россии

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn25.img.ria.ru/images/07e5/02/02/1595757200_0:0:3072:1728_1920x0_80_0_0_50e467f73219199317f10cad4ba0516b.jpg

МОСКВА, 27 июн — РИА Новости. СК проводит проверку по факту вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве, там заболели 66 детей и восемь сотрудников, сообщается на сайте ведомства по региону.Ранее сообщалось, что вспышка коронавируса зафиксирована в тувинском детском лагере «Байлак», где заболели 66 детей и восемь сотрудников.»По данному факту следственными органами СК РФ по Республике Тыва организовано проведение процессуальной проверки на наличие признаков преступления, предусмотренного статьей УК РФ «Оказание услуг, не отвечающих требованиям безопасности жизни или здоровья потребителей», — говорится в сообщении.Установлено, что в лагере находились 174 ребенка и 33 работника. ПЦР-методом выявлено активное заболевание у 66 детей, а также у восьми сотрудников лагеря. Проводятся необходимые проверочные мероприятия, направленные на установление соблюдения работниками лагеря антиковидных мер, требований Роспотребнадзора по недопущению распространения COVID-19, а также на предмет фальсификации справок об отсутствии заболевания.Следствием будут установлены причины и условия, способствовавшие возникновению и распространению заболевания в детском лагере. По результатам проверки будет принято процессуальное решение.

https://ria.ru/20210626/paleolit-1738739814.html

https://ria.ru/20210626/koronavirus-1738722091.html

республика тыва

россия

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn23.img.ria.ru/images/07e5/02/02/1595757200_0:0:2732:2048_1920x0_80_0_0_2482c15f0418704d8389caffbbd63a83.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

происшествия, республика тыва, федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (роспотребнадзор), следственный комитет россии (ск рф), россия, коронавирус в россии

09:02 27.06.2021 (обновлено: 09:06 27.06.2021)

СК проводит проверку из-за вспышки COVID-19 в детском лагере в Туве

Мегафон ручной с аккумулятором записью и сиреной CR-66 50W ⋆ Купи рупор

Описание

Мощность максимальная: 50 Watt
Цвет: Серо-синий
Масса: 1,5 кг
Размеры: 350×240 mm

Мегафон ручной CR-66 оптимальная модель для оповещения на открытой местности и закрытых территориях, обладает высокой мощностью – 50 Ватт, дальность оповещения до 2000 метров на открытой местности.

Функции самые необходимые: речевое оповещение с регулировкой громкости и остальными функциями на выносном микрофоне, мощный свисток 1,600Hz-2,400Hz, сирена, запись речевых сообщений и последующее циклическое воспроизведение, питание от перезаряжаемого аккумулятора (идет в комплекте) либо от элементов питания тип С – 8 штук. Возможно питание от 12 Вольт. Наплечный ремень для удобства эксплуатации.

Основные функции:

Речевое оповещение мощность до 50 Ватт
Запись до 20 секунд и воспроизведение сообщений циклическое
Регулировка громкости и включение на выносном микрофоне
Индикация работы
Возможность питания от сети 12 Вольт
Сирена и мощный свисток
Включение с помощью курка на рукоятке мегафона
Два варианта использования в руке, либо на плече

Характеристики:

Мощность до 50 Ватт, дальность озвучивания до 2000 метров.
Питание от аккумулятора либо от 8 батареек C типа
Диаметр рупора 240 мм
Длинна мегафона 350 мм
Вес 1,5 кг

Функциональные возможности



Максимальная дальность озвучивания	до 2000 метров



Встроенный микрофон	возможно крепление на торцевой части мегафона
Включение на панели управления	на тангенте


Входы

Технические характеристики
Диаметр рупора	240 мм
Длина мегафона	350 мм
Материал корпуса	ABS пластик
Мощность максимальная	50 Ватт
Питание	от аккумулятора либо от 8 батареек размерности C
Комплектация

LTE SC66-E 3 + 32 ГБ Интеллектуальный модуль

Имя *

Продукт

Электронная почта *

Телефон *

Должность *

Компания *

Вертикальная отрасль * Послепродажная телематика Управление активамиАвтомобильКоммерческая телематикаВертикальная телематикаДисплей и вывескиEix Доступ (FWA) Ноутбук и ПКОплатаPDA и карманные компьютерыRMAC (приложения для удаленного мониторинга и управления) Безопасность и автоматизацияУмный учет и интеллектуальные сети подразделение * Автомобильный OEM

Подразделение коммерческой телематики * Управление флотом Тяжелые транспортные средства и оборудование

Подразделение дисплеев и вывесок * Digital Signage

Подразделение периферийных вычислений и искусственного интеллекта * RobotV Устройства R, AR и XRAI Устройства Edge и SBC

Подразделение

Emerging Verticals * DroneeMBBS (Multimedia Broadcast Multicast Services) Время (только GNSS)

Подразделение фиксированного беспроводного доступа (FWA) * GatewayCPE и Set-top Box Промышленный маршрутизатор 4G / 5G Repeater 9000 Подразделение ПК и ПК ТранспортУмный городУмная парковкаУмное освещение

Подразделение безопасности и автоматизации * Автоматизация коммерческих зданийДомашняя безопасность и автоматизацияВидеонаблюдение

Подразделение интеллектуального учета и умных сетей * Умная сетьУмный счетчик электроэнергииСчетчик газаСчетчик водыПодсчет

Телемедицина подразделение * Главная MonitoringPatient MonitoringWellbeing Предметы одежды

Торговый подразделение * KiosksVending

Страна / территория * United StatesCanadaChinese MainlandAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntigua И BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia И HerzegowinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBrunei DarussalamBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongoCongo, Демократическая Республика TheCook IslandsCosta RicaCote D ‘ИвуарХорватияКубаКипрЧехияДанияДжибутиДоминикаДоминиканская РеспубликаВосточный ТиморЭквадорЭгипетЭль-СальвадорЭкваториальная ГвинеяЭритреяЭстонияЭфиопияФолклендские острова (Мальвинские острова) Фарерские островаФиджиФинляндияФранцияФранцузская ГвианаФранцузская ПолинезияГерманияГерманияГерманияГермания braltarGreeceGreenlandGrenadaGuadeloupeGuamGuatemalaGuineaGuinea-BissauGuyanaHaitiHeard остров и МакДональда IslandsHoly Престол (Ватикан) HondurasHong Kong, ChinaHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJordanKazakhstanKenyaKiribatiKosovoKuwaitKyrgyzstanLao Народная Демократическая RepublicLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyan арабских JamahiriyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacauMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesia, Федеративные Штаты OfMoldova, Республика OfMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlandsNetherlands AntillesNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorth KoreaNorth MacedoniaNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestinian TerritoryPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairnPolandPortugalPuerto RicoQatarReunionRomaniaRussian FederationRwandaSaint HelenaSaint Киттс И NevisSaint LuciaSaint Пьер и Ми quelonSaint Винсент и GrenadinesSamoaSan MarinoSao Фолиант И PrincipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Джорджия и Южные Сандвичевы IslandsSouth KoreaSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян MayenSwazilandSwedenSwitzerlandSyrian арабских RepublicTaiwan, ChinaTajikistanTanzania, Объединенная Республика OfThailandTogoTokelauTongaTrinidad И TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks И Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited Арабские EmiratesUnited KingdomUnited Внешние Малые IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVenezuelaViet NamVirgin острова, BritishVirgin острова, U.S.Wallis И FutunaWestern SaharaYemenZambiaZimbabwe

State (США) * AlabamaAlaskaArizonaArkansasCaliforniaColoradoConnecticutDelawareDistrict из ColumbiaFloridaGeorgiaHawaiiIdahoIllinoisIndianaIowaKansasKentuckyLouisianaMaineMarylandMassachusettsMichiganMinnesotaMississippiMissouriMontanaNebraskaNevadaNew HampshireNew JerseyNew MexicoNew YorkNorth CarolinaNorth DakotaOhioOklahomaOregonPennsylvaniaRhode IslandSouth CarolinaSouth DakotaTennesseeTexasUtahVermontVirginiaWashingtonWest VirginiaWisconsinWyoming

State (Канада) * AlbertaBritish ColumbiaManitobaNew BrunswickNewfoundland и LabradorNorthwest TerritoriesNova ScotiaNunavutOntarioPrince Эдвард IslandQuebecSaskatchewanYukon

Сообщение *

SC66- Интеллектуальный модуль MW 3 + 32 ГБ | Quectel

Имя *

Продукт

Электронная почта *

Телефон *

Должность *

Компания *

Вертикальная отрасль * Телематика послепродажного обслуживания (Приложения для удаленного мониторинга и управления) Безопасность и автоматизацияSmart Metering и Smart GridTelehealthVending

Подразделение послепродажной телематики * Страхование на основе использования Послепродажная телематика

Подразделение управления активами * Отслеживание активов * Управление парком транспортных средств и оборудования

Подразделение дисплеев и вывесок * Подразделение цифровых вывесок

Подразделение периферийных вычислений и искусственного интеллекта * Устройства RobotVR, AR и XRAI Edge Devices vices и SBC

Подразделение

Emerging Verticals * DroneeMBBS (Multimedia Broadcast Multicast Services) Время (только GNSS)

Подразделение фиксированного беспроводного доступа (FWA)

* GatewayCPE и Set-top Box Промышленный маршрутизатор Повторитель 4G / 5G

Подразделение ноутбуков и ПК Сервер

Платежное подразделение * БанкоматыPOS и кассовый аппарат

Подразделение КПК и портативных устройств * PoCIndustrial PDA

RMAC (Remote Monitoring & Control Applications) подраздел * EMS, возобновляемые источники энергии и хранилища Мониторинг медицинского оборудования Мониторинг на основе условийСельское хозяйство и окружающая средаДомашний транспорт Подразделение безопасности и автоматизации * Автоматизация коммерческих зданийДомашняя безопасность и автоматизацияВидеонаблюдение

Подразделение Smart Metering и Smart Grid * Smart GridSmart Electricity MeterGas MeterWaterSubmetering

Telehealth subdivision * Home MonitoringP atient MonitoringWellbeing Предметы одежды

Торговый подразделение * KiosksVending

Страна / территория * United StatesCanadaChinese MainlandAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntigua И BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia И HerzegowinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBrunei DarussalamBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongoCongo, Демократическая Республика TheCook IslandsCosta RicaCote D’IvoireCroatiaCubaCyprusCzech RepublicDenmarkDjiboutiDominicaDominican РеспубликаВосточный ТиморЭквадорЭгипетЭль-СальвадорЭкваториальная ГвинеяЭритреяЭстонияЭфиопияФолклендские (Мальвинские) острова Фарерские островаФинляндияФранцияФранцияФранцузская ГвианаФранцузская ПолинезияФранцузские Южные территорииГабонГамбияГрузияГерманияГанаГибралтарГрецияГренландия GuadeloupeGuamGuatemalaGuineaGuinea-BissauGuyanaHaitiHeard остров и МакДональда IslandsHoly Престол (Ватикан) HondurasHong Kong, ChinaHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJordanKazakhstanKenyaKiribatiKosovoKuwaitKyrgyzstanLao Народная Демократическая RepublicLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyan арабских JamahiriyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacauMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesia, Федеративные Штаты OfMoldova, Республика OfMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlandsNetherlands AntillesNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorth KoreaNorth MacedoniaNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestinian TerritoryPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairnPolandPortugalPuerto RicoQatarReunionRomaniaRussian FederationRwandaSaint HelenaSaint Киттс И NevisSaint LuciaSaint Пьер и МикелонСент-Винсент и Джи renadinesSamoaSan MarinoSao Фолиант И PrincipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Джорджия и Южные Сандвичевы IslandsSouth KoreaSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян MayenSwazilandSwedenSwitzerlandSyrian арабских RepublicTaiwan, ChinaTajikistanTanzania, Объединенная Республика OfThailandTogoTokelauTongaTrinidad И TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks И Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited Арабские EmiratesUnited KingdomUnited Штаты Незначительные Отдаленные IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVenezuelaViet NamVirgin острова, BritishVirgin острова, U.S.Wallis И FutunaWestern SaharaYemenZambiaZimbabwe

State (Канада) * AlbertaBritish ColumbiaManitobaNew BrunswickNewfoundland и LabradorNorthwest TerritoriesNova ScotiaNunavutOntarioPrince Эдвард IslandQuebecSaskatchewanYukon

Сообщение *

ингибитор

Akt SC66 способствует клеточной чувствительности к цисплатину в химиорезистентных клетках рака яичников за счет ингибирования экспрессии COL11A1

Исследуемая популяция

Всего 230 пациентов с раком яичников с EOC I – IV стадии, согласно данным в исследовании приняли участие представители Международной федерации гинекологии и акушерства, которые прошли комплексную хирургическую операцию или циторедукцию в больнице Национального университета Ченг Кунг в период с 2002 по 2010 год.Обзор медицинских карт и слайдов патологии этих пациентов был источником информации о клинических характеристиках, патологических диагнозах и исходах. Пациенты наблюдались после лечения, дата последней полученной записи — 31 января 2015 г. И ОВ, и ВБП рассчитывались на основе даты диагноза, а PFI определялся с использованием даты последнего контакта. Пациенты с EOC с PFI ≤ 6 месяцев были отнесены к категории «резистентных» к химиотерапии на основе платины, а пациенты с PFI> 6 месяцев были отнесены к категории «чувствительных» к химиотерапии на основе платины.Исследование было одобрено наблюдательным советом больницы Национального университета Ченг Кунг (A-ER-105-017), и эксперименты проводились с понимания и письменного согласия каждого пациента. Методики обучения в соответствии со стандартами, установленными Хельсинкской декларацией.

Оценка уровней p-Akt с помощью иммуногистохимии

Срезы ткани рака яичника получали, как описано ранее ²¹. Фиксированные в формалине залитые парафином срезы ткани депарафинизировали и окрашивали на белок p-Akt с использованием стандартной автоматической системы окрашивания слайдов ИГХ (автоокрашивание BenchMark XT; Ventana Medical Systems, Тусон, Аризона, США) после извлечения эпитопа с помощью микроволнового излучения.Первичное антитело против p-Akt (Ser473) (4060S) было приобретено в Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) и применено в разведении 1: 100. Отрицательные контроли обрабатывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Ткани карциномы легких человека с высокой экспрессией p-Akt использовали в качестве положительного контроля. Исследователь, оценивающий эксперименты IHC (C.-C.C., гинекологический патолог), не знал данных о клинических исходах пациентов. Интенсивность окрашивания классифицировалась как отрицательная (степень 0), слабая (степень 1), умеренная (степень 2) или сильная (степень 3).Степень 0–2 интенсивности окрашивания была обозначена как низкая экспрессия, тогда как степень 3 считалась высокой экспрессией (дополнительный рис. 6).

Клетки и среда

Клеточные линии рака яичников человека A2780 и A2780CP70 были получены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Клеточная линия HAC-2 была получена из Японской коллекции исследовательского банка клеток биоресурсов (Осака, Япония). Клеточные линии OVCAR-3, OVCAR-4 и OVCAR-8 были приобретены через программу репозитория опухолей DTP Национального института рака (Фредерик, Мэриленд, США).Клеточная линия ES-2 была приобретена в Центре сбора и исследования биоресурсов Института исследований и развития пищевой промышленности (Синьчжу, Тайвань). Цисплатин-резистентные штаммы ES-2 (ES-2 / CP) были разработаны в нашей лаборатории, как описано ранее ⁴⁸. Бессмертные поверхностные эпителиальные клетки яичников (HOSE 6-3 и HOSE 11-12) были любезно предоставлены доктором Джорджем Цао (кафедра анатомии Университета Гонконга). Клеточные линии A2780, A2780CP70, OVCAR-3, OVCAR-4 и OVCA-8 выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).Клетки HAC-2 выращивали в минимальной необходимой среде с добавлением 15% FBS. Клетки ES-2 и ES-2 / CP выращивали в среде Mycos 5A с добавлением 10% FBS. Клетки HOSE 6-3 и HOSE 11-12 выращивали в среде MCDB105 / M199 1: 1 с добавлением 15% FBS. Все клетки выращивали при 37 ° C в атмосфере 5% углекислого газа. Клетки культивировали и хранили в соответствии с инструкциями поставщика и использовали между 5-м и 20-м пассажами. После размораживания клеточные линии обычно проверяли на аутентификацию примерно каждые 6 месяцев, причем последний раз клетки тестировались в марте 2018 г. путем мониторинга морфологии клеток и анализа кривой роста. , проверка видов с помощью изоэнзимологии и кариотипирования, проверка идентичности с использованием короткого тандемного анализа повторного профилирования и проверки контаминации.

Нокдаун и трансфекция COL11A1

siРНК, направленные против человеческого COL11A1 (COL11A1 shRNA, sc-72956-SH, пулы трех целевых миРНК 19-25 нуклеотидов) и не нацеливающая отрицательная контрольная плазмида shRNA (sc-108060- SH) были приобретены в Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Даллас, Техас, США). Для создания стабильных клонов плазмиды для нокдауна COL11A1 трансфицировали в клетки A2780CP70 с использованием реагента для трансфекции липофектамина (Invitrogen). Через 24 часа после трансфекции стабильные трансфектанты отбирали в G418 (Sigma) в концентрации 800 мкг / мл.После этого селекционную среду заменяли каждые 3 дня. После 2 недель отбора в G418 клоны устойчивых клеток выделяли и позволяли пролиферировать в среде, содержащей G418 в концентрации 800 мкг / мл.

Сверхэкспрессия и трансфекция COL11A1

кДНК COL11A1 (BC117697 GE Healthcare) клонировали в вектор pCMV6-AC-GFP (PS100010 OriGene). Плазмиды трансфицировали в клетки рака яичников с использованием реагента для трансфекции ДНК HyFect ^TM (Leadgene Biomedical, Тайвань) в соответствии с протоколом производителя.Для создания стабильных клонов плазмиды экспрессии COL11A1 трансфецировали в клетки A2780 и через 24 часа отбирали стабильные трансфектанты в G418 (Sigma) в концентрации 400 мкг / мл. После этого селекционную среду заменяли каждые 3 дня. После 2 недель отбора в G418 клоны устойчивых клеток были выделены и позволили пролиферировать в среде, содержащей G418 в концентрации 400 мкг / мл.

Вестерн-блоттинг-анализ

Белки экстрагировали и равные количества разделяли с помощью 8–15% -ного электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), как описано ранее ²¹.

Антитела и реагенты

Антитела, специфичные к Akt (9272 для вестерн-блоттинга), фосфо-Akt (ser473, 9271), фосфо-p70S6K (9205), P70S6K (9202), фосфо-4EBP1 (9451) (9452), 4EBP , каспаза 3 (9664), мышиный IgG (7076) и кроличий IgG (7074) были получены от Cell Signaling Technology. Антитело против Akt1 для иммуногистохимии (IHC; A11027) было приобретено у ABclonal (Woburn, MA, USA). Антитело против Ki-67 (61-0078) было приобретено в Genemed (Южный Сан-Франциско, Калифорния, США).Антитело против COL11A1 (sc-68853 для IHC), анти-TWIST1 (sc-15393), анти-Mcl-1 (sc-12756), анти-NF-YA (sc-10779), анти-c / EBPβ sc. -150 козьих антител против кроличьего IgG-HRP (sc-2005), козьих антител против кроличьего IgG-HRP (sc-2054) и антител против β-актина (sc-47778) были приобретены в Santa Cruz Biotechnology. Антитело против COL11A1 (GTX55142 для вестерн-блоттинга) было получено от GeneTex (Ирвин, Калифорния, США). Антитело против MMP3 (ab38912) было получено от Abcam (Кембридж, Великобритания). Ингибитор Akt SC66 был приобретен у Cayman Chemicals (Анн-Арбор, Мичиган, США).Цисплатин (Fresenius Kabi Oncology, Ltd) и паклитаксел (Corden Pharma Latina S.P.A.) были предоставлены онкологическим центром больницы Национального университета Ченг Кунг.

Расчет IC

₅₀ и анализ CI

Цисплатин (10 мМ) и паклитаксел (10 мМ) растворяли в дистиллированной воде, тогда как исходные растворы SC66 (10 мМ) готовили в диметилсульфоксиде и хранили при -20 ° C. . При проведении эксперимента питательную среду использовали для разведения лекарственного средства. Клетки подвергали воздействию различных концентраций цисплатина (0–32 мкМ), паклитаксела (0–64 мкМ) или SC66 (0–22 мкМ) в течение 48 часов.Цитотоксические эффекты этих обработок in vitro определяли с помощью анализа МТТ (при 570 нм), и жизнеспособность клеток выражали как процент жизнеспособности контрольных клеток (% от контроля). Значения IC ₅₀ определяли по кривой зависимости зависимости от процента ингибирования роста по сравнению с тестируемыми концентрациями. Для комбинированного лечения клетки обрабатывали совместно 2 мкМ SC66 и различными концентрациями цисплатина (0–32 мкМ) или паклитаксела (0–64 мкМ) в течение 48 часов. Анализ ДИ — это наиболее распространенный метод, используемый для оценки характера взаимодействия лекарственных средств в комбинированной химиотерапии, и он дает полезную количественную информацию ²⁶.CI — это числовое значение, рассчитываемое по следующей формуле: CI = C _{A, X} / IC _{X, A} + C _{B, X} / IC _{X, B}. C _{A, X} и C _{B, X} представляют концентрации лекарственного средства A и лекарственного средства B при использовании в комбинации для достижения х% эффекта лекарственного средства. IC _{X, A} и IC _{X, B} представляют концентрации, необходимые для индивидуальной монотерапии для достижения такого же эффекта x%. CI <1 указывает на синергию, CI = 1 демонстрирует аддитивный эффект, а CI> 1 представляет антагонизм ⁴⁹.

Анализ связывания аннексина V на апоптоз

После воздействия на клетки цисплатина и паклитаксела, каждый по отдельности или в комбинации с SC66, измеряли апоптоз с помощью набора для определения апоптоза FITC Annexin V (BD Pharmingen, Bedford, MA, USA) в соответствии с протоколу производителя. Собранные клеточные суспензии инкубировали с аннексином V в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте, а затем анализировали проточной цитометрией.

Анализ образования колоний

Клетки (300 на лунку) культивировали в 6-луночных планшетах в полной среде в течение ночи.После инкубации культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей SC66, цисплатин или паклитаксел, в течение 48 часов. Обработанные клетки культивировали в свежей среде с добавлением 10% FBS в течение еще 14 дней для клеточных линий A2780, A2780CP70, A2780 / V и A2780 / COL11A1 и 21 день для клеточных линий ES-2 и ES-2 / CP. По окончании культивирования клетки окрашивали 0,01% кристаллическим фиолетовым в течение 1 ч при комнатной температуре. Цифры исследований образования колоний показаны на дополнительном рисунке 7.

Количественная ПЦР с обратной транскриптазой

Общая РНК (5 мкг) использовалась в качестве матрицы в реакциях синтеза кДНК со случайными праймерами с использованием обратной транскриптазы Superscript III (Applied Biosystems) .Полученные кДНК использовали (в разведении 1:20) для определения уровня экспрессии эндогенной мРНК COL11A1 с помощью количественной ПЦР (кПЦР). Точная количественная оценка была достигнута с использованием стандартных кривых, построенных путем серийного разбавления известного количества РНК из реакции транскрипции in vitro и выполнения TaqMan qPCR с разведением вместе с образцами клеток. Количественный анализ экспрессии мРНК проводили с помощью системы ПЦР в реальном времени StepOne ^TM (ABI). Праймеры и зонды TaqMan, использованные для анализа, были разработаны с использованием программного обеспечения производителя Primer Express.Использовали следующие праймеры: COL11A1 (HS01097664) и GAPDH (HS99999905). Контрольные реакции без обратной транскрипции (без ОТ) проводили с использованием 100 нг общей РНК из каждого отдельного образца в качестве матрицы, чтобы гарантировать, что амплификация не была вызвана загрязнением ДНК. В контроле без RT сигнал обнаружен не был. Экспрессию мРНК целевого гена оценивали с помощью ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени. Контрольный ген GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля качества РНК. Все количественные анализы были выполнены в двух экземплярах, чтобы оценить согласованность результатов.Относительные уровни экспрессии целевого гена, нормированные на экспрессию GAPDH , были рассчитаны как Δ C _t = C _t (целевой) — C _t (GAPDH). Затем было рассчитано отношение количества копий мРНК целевого гена к количеству копий GAPDH как 2 ^-Ct × K (K = 10 ⁶, константа).

Конструирование плазмиды и сайт-направленный мутагенез

COL11A1 ПЦР-продукт клонировали в сайты KpnI и XhoI вектора pGL4.Полученная конструкция была подтверждена секвенированием ДНК. COL11A1 Делеционные конструкции промотора COL11A1-541 / + 1, COL11A1-541 / -203 и COL11A1-202 / + 1 были аналогичным образом получены с использованием конструкции COL11A1-541 / + 1 в качестве матрицы, как описано ранее ²².

Анализы репортера люциферазы

Анализы люциферазы проводили через 48 часов после трансфекции с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega). Нормализованная активность люциферазы представлена как отношение активности люциферазы к активности β-галактозидазы, как описано ранее ²².

ChIP-анализы

Комплексы нативный белок-ДНК были сшиты обработкой 1% формальдегидом в течение 15 минут, и ChIP-анализы были выполнены, как описано ранее ²². Вкратце, равные количества изолированного хроматина подвергали иммунопреципитации моноклональными антителами против NF-YA, против c / EBPβ и IgG.

Анализ инвазии Transwell®

Инвазию исследовали в камерах для культивирования клеток Transwell с использованием поликарбонатных мембран с размером пор 8 мкм (Costar, Cambridge, MA).Мембраны Transwell, покрытые крысиным коллагеном I, помещали в качестве барьера (60 мкг / Transwell) на верхнюю сторону. Клетки (5 × 10 ⁴) помещали в верхнюю камеру. Нижняя камера содержала 0,6 мл среды, содержащей фибронектин в качестве хемоаттрактанта. Клеткам давали возможность проникнуть в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂. Немигрированные клетки в верхней камере удаляли ватным тампоном, фильтры фиксировали в 95% этаноле и окрашивали 0,005% кристаллическим фиолетовым в течение 1 часа.Общее количество клеток, которые мигрировали на нижнюю поверхность, подсчитывали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus, Lake Success, NY). Для каждого образца исследовали десять смежных полей, чтобы получить репрезентативное количество клеток, которые проникли через мембрану. Каждое условие было проанализировано в трех экземплярах. Данные представлены как кратное изменение количества клеток в каждой группе по сравнению с контрольной группой A2780 / V. Значение P сравнивали между SC66 и контролем в разных ячейках.

Анализ зимографии казеина

Для измерения активности MMP3 кондиционированную среду из обработанных клеток концентрировали ~ 20-кратно с использованием центробежных концентраторов Centricon-10 (Millipore, Billerica, MA, USA).Образцы количественно оценивали с помощью анализа Брэдфорда, и равные количества белка смешивали с буфером для образцов Лэммли без восстанавливающих агентов, инкубировали в течение 15 мин при 37 ° C и разделяли на готовых градиентных гелях SDS-полиакриламидных пластин, содержащих 1 мг / мл казеина (Sigma). После электрофореза гели помещали в 2,5% Triton X-100 на 30 мин, затем инкубировали при 37 ° C в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,4, содержащем 5 мМ CaCl ₂, в течение 18 часов. Полосы MMP3 визуализировали окрашиванием кумасси синим, и уровень активности MMP3 определяли количественно, как описано ранее ²¹.

Модель ксенотрансплантата на животных

Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Национальном университете Ченг Кунг. Самкам мышей NOD-SCID в возрасте 6 недель (Центр животных Национального университета Ченг) подкожно имплантировали в задний бок 1 × 10 ⁶ клеток A2780 / COL11A1 (100 мкл). Размеры опухоли измеряли два-три раза в неделю, и объемы рассчитывали как длина (мм) × ширина (мм) × высота (мм) × 0,52. Исследования на животных, включающие измерение объема опухоли, обычно проводились с одним контролем на каждого объекта эксперимента.Размер выборки для экспериментальной и контрольной групп должен быть достаточным, чтобы отвергнуть нулевую гипотезу о том, что средние по совокупности экспериментальной и контрольной групп были равны со степенью 0,8 и ошибкой I типа 0,01. Мы оценили количество животных, используя PS: Power and Sample Size Calculation, версия 3.1.2, Уильям Д. Дюпон и Уолтон Д. Пламмер-младший (Университет Вандербильта, Нашвилл, Теннесси, США). Мы подсчитали, что количество мышей, необходимое для оценки объема опухоли, должно составлять не менее трех для каждой из контрольной и экспериментальной групп.Как только опухоли достигли 20 мм ³, мышей случайным образом распределили в одну из девяти групп ( n = 4 / группа). Животные в каждой группе получали 200 мкл физиологического раствора, цисплатина, паклитаксела или SC66 путем внутрибрюшинной инъекции. Частота лечения была один раз в день для SC66 и один раз в 3 дня для цисплатина и паклитаксела. Рост опухоли, визуализацию опухоли и массу тела определяли, как описано ранее ⁵⁰. Через 30 дней мышей умерщвляли, используя ингаляцию CO ₂, и вырезали опухолевые ткани ксенотрансплантата.Опухоли удаляли, взвешивали, фиксировали в 10% формалине, заливали парафином и делали срезы (4 мкм) для гистопатологии и IHC. Парафиновые срезы опухолей окрашивали гематоксилином и эозином. Исследователь (C.-C.C., гинекологический патолог) отвечал за интерпретацию степени поражения раком каждого органа. Применяли первичные антитела против p-Akt, против Akt, против COL11A1, против Ki-67 и против каспазы 3. Отрицательные контроли обрабатывали PBS. Интенсивно экспрессирующая p-Akt-положительная карцинома легких человека, Akt-положительные нормальные ткани почек, COL11A1-положительные нормальные гепатоциты, Ki-67-положительные нормальные миндалины и нормальные миндалины, положительные по каспазе 3, использовали в качестве положительных контролей.Интенсивность окрашивания оценивали как отрицательное, слабое, умеренное и сильное окрашивание (степень 0, 1, 2 и 3 соответственно).

Статистика

Данные были проанализированы с использованием статистического пакета для программного обеспечения социальных наук, версия 17.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Интервальные переменные показаны как среднее ± SEM; различия между группами анализировали с помощью критерия Манна – Уитни U . Частотные распределения между категориальными переменными сравнивались с использованием теста Пирсона χ ² и точного метода Фишера.Выживаемость оценивалась с использованием метода Каплана – Мейера, а результаты сравнивались путем выполнения лог-ранговых тестов. P -значения <0,05 (двусторонние) считались показывающими статистическую значимость.

Mister Freedom Californian Lot 64 Jean — SC66 Denim

Модель Lot 64 от Mister Freedom вдохновлена деталями синих джинсов 1950-х годов, но перенесена в 1960-е с дополнительным сужением штанины и немного меньшим подъемом. Этот релиз вырезан из их «SC66», хрустящей, слегка волосатой, 13.Джинсовая ткань 75 унций с розовой кромкой.

Mister Freedom — внимание к деталям присутствует во всех них, как и в каждой другой паре. Карманные сумки изготовлены из тканой клетчатой ткани NOS. Карман для монет имеет небольшую потайную кромку. Для их сшивания используется двенадцать видов 100% хлопковых ниток.

Несанфорированный, поэтому сжимается при первой стирке и растягивается до нужного размера при износе. Холодная стирка, рекомендуется сушить в подвешенном состоянии.

100% хлопок
Джинсовая ткань Selvedge, фрезерованная в Японии
Сумки с карманами из плетеной ткани в клетку NOS
Оригинальные серебристые «оксидированные» металлические пуговицы на талии / ширинке из литого металла MF®.
Медная заклепка без маркировки для усиления проема кармана.
Карман для монет со скрытой кромкой
Планка с отверстием для пуговиц по селвиджу
Стирать в холодной воде, сушить в подвешенном состоянии
Несанфорированный
Сделано в США

Посмотрите, как мы измеряем — нажмите здесь.

Вашего размера нет в наличии? Нажмите на свой размер, чтобы подписаться на оповещение о наличии товара.

Все размеры указаны в дюймах.

Модель

Gen носит размер 32
Характеристики размеров Gen:
6 футов 1 дюйм и 180 фунтов
грудь 41 дюйм и талия 31 дюйм

30	30.5 «	12 «	14 «	10,5 «	9 «	8,5 дюйма	33,25 дюйма
31	32 ‘	12,25 дюйма	14,25 дюйма	11,25 дюйма	9 ‘	8,5 дюйма	33,25 дюйма
32	32,5 «	12,75 дюйма	15 «	11,5 «	9,5 «	8,5 дюйма	35,5 «
33	34 «	12.75 «	15,75 дюйма	11,5 «	9,5 «	8,75 дюйма	35,5 «
34	34,5 ‘	12,75 ‘	16 «	12 «	9,75 дюйма	9 «	35,5 «
36	36,5 «	13,25 дюйма	16,5 «	12,75 дюйма	10 «	9,25 дюйма	37 «

Наши магазины в Окленде и Санта-Фе открыты для самовывоза.Ознакомьтесь с нашей информацией о пикапе у обочины.

Из-за задержек обслуживания USPS мы доставляем большинство заказов в США через UPS Ground до дальнейшего уведомления. Если вы предпочитаете, чтобы ваш заказ был отправлен через USPS, свяжитесь с нами, и мы сделаем все возможное, чтобы удовлетворить ваши потребности.

США Заказы

СИЗ и банданы стоимостью менее 100 долларов США — 3 доллара США через почту первого класса USPS
Самовывоз на обочине: бесплатно
Заказы на сумму более 100 долларов США — Бесплатная доставка через UPS Ground
Заказы на сумму менее 100 долларов США — 8 долларов США доставка через UPS Ground
Ускоренная доставка (1-2 рабочих дня) через UPS — $ 35

Международные заказы

Доставка в Канаду — Заказы до 500 долларов США
Первый класс USPS (10-15 рабочих дней) — 15 долларов США
Приоритетная почта USPS (5-10 рабочих дней) — 30 долларов США
DHL Express (2-3 рабочих дня) — 40 долларов США

Доставка в Канаду — заказы на сумму более 500 долларов США
DHL Express (1-3 рабочих дня) — 40 долларов США

Доставка в остальные страны
DHL Express (2-4 рабочих дня) — 50 долларов США

Мы хотим, чтобы вам было удобно делать покупки в Интернете, не касаясь продукта.Перед покупкой сверьтесь с таблицами размеров, которые мы предоставляем, с вашими любимыми предметами одежды.

Возврат товаров с полной ценой осуществляется в течение 14 дней с момента доставки (по результатам проверки курьером).
Комиссия за возврат в размере 25 долларов США применяется ко всем заказам на сумму более 500 долларов США, возвращенных для возмещения. Плата за возврат не применяется к возврату в кредит магазина или обмену.
Товары, проданные на распродаже или со скидкой, подлежат окончательной распродаже, возврату и обмену не подлежат.
Товары должны быть в исходном состоянии со всеми прикрепленными бирками.
Вещи, которые были постираны, подшиты, переделаны, излишне изношены, подожжены или затронуты частной инвестиционной компанией, возврату не подлежат.
Вы несете все расходы по доставке и обмену.
Мы обработаем все возвраты в течение 3 рабочих дней с момента получения
Наша команда подтвердит получение и примет меры по вашему возврату.
Если у вас есть вопросы в любое время, вы можете связаться с нами по адресу [email protected], использовать нашу контактную форму или позвонить нам по телефону 510-373-9696.

4550 Highway 66, Loris, SC, 29569

Не упустите эту невероятную возможность! Этот красивый семейный дом ВСЕГО КИРПИЧА с 4 спальнями и 1,5 ванными комнатами расположен на участке БОЛЕЕ 1 ПОЛУАКРА, БЕЗ ТСЖ, и имеет светлую и просторную планировку! В загородной кухне есть прекрасная деревянная мебель, много места и барная стойка! Комфортабельная гостиная с большим количеством естественного света и блестящими полами, а также в этом замечательном доме есть вторая семейная комната! Очаровательный главный люкс может похвастаться большим шкафом и просторной ванной комнатой! Вы будете наслаждаться прекрасной погодой в вашем собственном частном оазисе, идеально подходящем для гриля и семейных встреч! Забронируйте показ сегодня!

Характеристики объекта

Спальни

Спальни: 3
Описание главной спальни: Потолочный вентилятор, уровень 1-го этажа

Ванные комнаты

Всего ванных комнат: 1/1
Полных ванных комнат: 1
1/2 Ванных комнат : 1
Описание главной ванной: Туалетный столик

Элементы интерьера

Ветрозащитный конвейер
Детектор дыма
Соединение с сушилкой и сушилкой
Напольное покрытие: плитка, ковровое покрытие, ламинат

Кухня и столовая

Кухня и столовая : Плита, барная стойка, вытяжка

Официальная столовая Описание: №

Другие комнаты

Спальни на 1 этаже, ванны на 2 этаже, прачечная / коммунальные услуги
Описание гостиной: Потолочный вентилятор

Отопление и охлаждение

Отопление: центральное отопление, оконно-настенный блок, электрическое

Внешний вид и много функций res

Информация о земле

Размер участка Акров: 0.56
Размер участка Источник: Public Record
Размер участка Квадратные футы: 24394

Гараж и парковка

Описание гаража: Навес для автомобиля

Ассоциация домовладельцев

Ассоциация: Нет
Плата за ассоциацию: Нет HOA
Расчетный общий ежемесячный взнос ассоциации: 0

Информация о школе

Начальная школа: Начальная школа Дейзи
Средняя школа: Средняя школа Лорис
Средняя школа: Средняя школа Лориса

Другая информация о собственности

Источник Статус объявления: АКТИВНЫЙ
Округ: Хорри
Тип недвижимости источника: Отдельный
Район: 07A От Лориса до района Лонгс — Юг o
Район источника: Не в пределах подразделения
Номер участка: 21312010004
Подразделение: Не в пределах Подраздел
Название исходной системы: C2C

Building and Con Struction

Год постройки: 1967
Строительные материалы: Кирпичный дом
Жилая площадь Источник: Общественные записи
Возраст объекта: 54
Уровни или истории: Одноуровневые
Стиль дома: Ранчо
Общая площадь Кв. 1232
Год постройки Подробная информация: Вторичка

Коммунальные услуги

Электричество
Кабельное телевидение
Телефон

Домашние характеристики

Другое оборудование: Электрооборудование

Узнайте больше об этой собственности.Связаться с агентом

【SC】スリムコーナ９０ ° |因幡電工

コード No.	型番	A	B	С	標準価格
60874004311	SC-66-G	66	62	97	¥ 910
60874004312	SC-66-I	66	62	97	¥ 910
60874004313	SC-66-B	66	62	97	¥ 910
60874004314	СК-66-К	66	62	97	¥ 910
60874004315	SC-66-W	66	62	97	¥ 910
60874004321	SC-77-G	81	67	100	¥ 1 050
60874004322	SC-77-I	81	67	100	¥ 1 050
60874004323	SC-77-B	81	67	100	¥ 1 050
60874004324	СК-77-К	81	67	100	¥ 1 050
60874004325	SC-77-W	81	67	100	¥ 1 050
60874004331	SC-100-G	106	75	117	¥ 1 980
60874004332	SC-100-I	106	75	117	¥ 1 980
60874004333	SC-100-B	106	75	117	¥ 1 980
60874004334	СК-100-К	106	75	117	¥ 1 980
60874004335	SC-100-W	106	75	117	¥ 1 980
60874004341	SC-140-G	145	84	126	¥ 2,640
60874004342	SC-140-I	145	84	126	¥ 2,640
60874004343	SC-140-B	145	84	126	¥ 2,640
60874004344	СК-140-К	145	84	126	¥ 2,640
60874004345	SC-140-W	145	84	126	¥ 2,640

受注生産… 受注生産生産終了… 生産終了在庫限り… 在庫限り

（）内は、アイボリー以外の梱包数

границ | Ингибитор AKT SC66 ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз в глиобластоме человека посредством подавления пути AKT / β-катенина

Введение

GBM является наиболее распространенной злокачественной и смертельной первичной опухолью в центральной нервной системе (ЦНС) взрослых, на которую приходится приблизительно 50% всех глиом (Cheng et al., 2019). Стандартная стратегия ГБМ включает хирургическую резекцию, лучевую терапию и адъювантную химиотерапию темозоломидом (TMZ). TMZ считался наиболее эффективным препаратом для лечения глиобластомы. Предыдущие исследования показали, что лечение TMZ может увеличить среднюю выживаемость с 12,1 до 14,6 месяцев и 2-летнюю выживаемость с 10% до 26,5% по сравнению с одной послеоперационной лучевой терапией у пациентов с ГБМ (Grossman et al., 2009; Li et al., 2018) . К сожалению, по крайней мере 50% пациентов с ГБМ не реагируют на TMZ и склонны к приобретению резистентности после лечения TMZ, что ограничивает эффективность TMZ (Lee, 2016; Wu et al., 2018). Следовательно, необходимо срочно разработать новые лекарства и изучить новые терапевтические стратегии для улучшения прогноза пациентов с ГБМ.

Сообщается, что сигнальный путь фосфатидилинозитол-3-киназы PI3K / AKT является одним из наиболее часто активируемых при большинстве раковых заболеваний человека. AKT считается центральным белком сигнального пути PI3K / AKT, регулирующим активность более 100 субстратов ниже по течению (Karar and Maity, 2011; Mundi et al., 2016; Lien et al., 2017). AKT представляет собой серин / треониновую протеинкиназу, которая играет решающую роль в злокачественной трансформации клеток после активации путем фосфорилирования.Активация AKT считается отличительной чертой многих видов рака у человека, которая способствует развитию рака, способствуя пролиферации клеток, подавляя апоптоз и увеличивая частоту онкогенных мутаций (Robey and Hay, 2009; Wu et al., 2019). Успешное ингибирование AKT может иметь значительный противоопухолевый эффект, поэтому нацеливание на AKT является важной областью онкологической терапии.

SC66 представляет собой новый аллостерический ингибитор AKT, который, как сообщается, способствует убиквитинизации и инактивации AKT, предотвращая связывание домена гомологии плекстрина (PH) с PIP3 (Jo et al., 2011). Другое исследование показало, что SC66 способствует гибели клеток рака шейки матки, нарушая передачу сигналов mTOR и поглощение глюкозы (Rader, 2016). SC66 в сочетании с цисплатином продемонстрировал более эффективное подавление роста опухоли на модели ксенотрансплантата мышей с раком яичников (Wu et al., 2019). Кроме того, SC66 подавлял пролиферацию клеток рака толстой кишки и индуцировал апоптоз (Liu et al., 2019). Эти исследования показали, что SC66 может быть потенциальным противоопухолевым препаратом. Однако неясно, может ли SC66 проявлять противоопухолевую активность в клетках GBM.

В этой работе мы исследовали противоопухолевую активность SC66 в клетках GBM in vitro и in vivo и доказали, что SC66 эффективно подавляет пролиферацию клеток, EMT-опосредованную миграцию и инвазию клеток. Он также останавливал клеточный цикл в фазе G0 / G1 и индуцировал апоптоз клеток. Кроме того, SC66 продемонстрировал потенциальное снижение роста опухоли в модели GBM на голых мышах. Таким образом, SC66 может быть новым препаратом для подавления прогрессирования ГБМ.

Методы

Лекарства и антитела

Ингибитор AKT SC66 был приобретен у MedChemExpress [HY-19832, чистота (99.32%), Китай] и растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), который был получен от Servicebio (G5051, Ухань, Китай). Ингибитор GS3K-β IM-12 был получен от Selleck (S7566, чистота (99,01%), США). Антитела включали следующие: анти-фосфо-AKT [# 4060, Cell Signaling Technology (CST), США], анти-AKT (# 4691, CST), анти-фосфо-GSK-3β (# 9323, CST), анти-AKT (# 4691, CST), анти-фосфо-GSK-3β (# 9323, CST), анти-AKT. -GSK-3β (# 12456, CST), анти-фосфо-β-катенин (# 9561, CST), анти-расщепленная каспаза3 (ab32042, Abcam, Великобритания), анти-β-катенин (ab32572, Abcam), анти-β-катенин (ab32572, Abcam), -GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, Ухань, Китай), анти-Snai1 (13099-1-AP, Proteintech), анти-BAX (50599-2-Ig, Proteintech), анти-Bcl-2 (127891- AP, Proteintech), антициклин D1 (60186-1-Ig, Proteintech), анти-каспаза3 (19677-1-AP, Proteintech), анти-MMP2 (10373-2-AP, Proteintech), анти-виментин (sc -6260 Санта-Круз Биотехнология, США).Более подробная информация об антителах представлена в дополнительном файле 1.

Клеточная культура

Клеточные линии глиобластомы человека (U87 и U251) были приобретены из Коллекции типовых культур банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все клетки культивировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO2, используя среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco, США).

Анализ жизнеспособности клеток

Способность SC66 проявлять антипролиферативную активность измеряли с помощью набора для подсчета клеток-8 (CCK-8) в соответствии с протоколом поставщика (Додзиндо, Пекин, Китай).Клетки U87 и U251 высаживали в 96-луночный планшет (5000 клеток / лунку) и обрабатывали 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкмоль / л SC66 в течение 24 часов. Затем добавляли 10 ед. CCK8 на лунку и затем инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Величину OD измеряли с помощью ридера для микропланшетов при 450 нм. Было проведено три независимых анализа.

Анализ образования колоний

Примерное количество 500 клеток на лунку высаживали в 6-луночный планшет и культивировали с 2 мл DMEM, содержащей 10% FBS. Затем клетки обрабатывали 0, 6, 10 и 15 мкмоль / л. SC66 в течение двух-трех недель до тех пор, пока не будет значительного образования одноклеточных колоний.Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым. Подсчет колоний подсчитывали с помощью программного обеспечения Image J.

Анализ синтеза EdU-ДНК

Приблизительно 5 × 10 ³ клеток высевали в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл DMEM, и обрабатывали 0, 6, 10, 15 мкмоль / л SC66 в течение 24 часов до следующего дня. Рост клеток изучали с помощью набора Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro (RiboBio, Гуанчжоу, Китай). Клетки культивировали в среде с добавкой 50 мкл EdU в течение 2 часов и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут.Затем добавляли 100 мкл реакционной смеси 1X Apollo ^® и инкубировали в течение 30 минут, а затем контрастировали 1X Hoechst 33342 в темноте в течение 30 минут. Флуоресцентные изображения Hoechst 33342 и EdU визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus BX51, Япония).

Анализ заживления ран

Клетки высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в течение определенного времени до достижения 70% слияния. Стерильный наконечник пипетки использовался для царапания линейной раны. PBS использовали для смывания плавающих клеток три раза и добавляли бессывороточную DMEM для дальнейшего культивирования, а затем подвергали воздействию SC66 в различных концентрациях (0 и 6 мкмоль / л) в течение 24 часов.Изображения были получены через 0, 24 и 48 часов и сняты под микроскопом (Olympus BX51, Япония). Программное обеспечение ImageJ использовалось для анализа процента заживления ран.

Transwell Assay

Анализ инвазии и миграции измеряли с помощью камеры Transwell (Corning, США). Для анализа инвазии поликарбонатные фильтры Transwell, покрытые Matrigel (R&D, США) для образования непрерывной мембраны, в ряд из 8×10 ³ клеток, обработанных 0, 6, 10 или 15 мкМ SC66 в течение 24 часов, высевали в верхние камеры.Одновременно 200 мкл бессывороточной среды DMEM добавляли в верхние камеры, а 600 мкл добавки DMEM с 10% FBS добавляли в нижнюю камеру. Камеры Transwell помещали в инкубатор (37 ° C, 5% CO ₂) на 24 часа и фиксировали в 4% параформальдегиде на 30 минут. Неинвазивные клетки в верхних камерах перемещали с помощью ватных тампонов, а клетки в нижней камере окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым в течение 15 мин. Сушили на воздухе и результаты подсчитывали под инвертированным микроскопом (Olympus BX51, Япония).

Cell Cycle Assay

Клетки собирали с 0,25 трипсином после обработки 0, 6, 10 или 15 SC66 в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали в 70% холодном этаноле при -20 ° C в течение 12 часов. Затем фиксированные клетки промывали трижды PBS и инкубировали с PBS, содержащим РНКазу, в течение 30 мин. В конце концов, клетки окрашивались йодидом пропидия (PI) в темноте в течение 15 мин. Результаты клеточного цикла измеряли с помощью проточного цитометра FACS Calibur (BD Biosciences, США), а данные количественно оценивали с помощью ModFit LT 5.0 программное обеспечение.

Анализ апоптоза

Набор аннексина V-PE / 7-ADD (Becton Dickinson, США) использовали для измерения апоптоза клеток глиомы. Клетки высевали в 6-луночный планшет и обрабатывали 0,6,10 или 15 мкМ SC66 в течение 24 часов. В соответствии с инструкциями производителя фиксированные клетки суспендировали в 1 мл 1X связывающего буфера и окрашивали аннексином V-PE / 7-ADD в течение 10 минут в темноте. Для каждого эксперимента анализировали 2 × 10 ⁵ клеток на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences, США).Ранний апоптоз и поздний апоптоз суммировали и рассчитывали общую скорость апоптоза.

Вестерн-блот-анализ

Клетки, обработанные 0, 6, 10 или 15 мкМ SC66 в течение 24 часов, а затем лизированные в буфере RIPA (Beyotime, Китай) на льду в течение примерно 30 минут. Лизат клеток центрифугировали при 1,2х10 ⁵ об / мин в течение 15 мин при 4 ° C и количественно определяли концентрацию белка методом BCA (Beyotime, Китай). Лизат смешивали с загрузочным буфером и нагревали при 100 ° C в течение 10 мин.Белок загружали в 10% или 12% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (Millipore, Germeny). Затем мембрану PVDF блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 ч, и мембраны подвергали иммуноблоттингу с первичными антителами к фосфо-AKT, фосфо-GSK-3β, фосфо-β-катенину, AKT, GSK-3β, β-катенину, GAPDH, BAX, Bcl-2, расщепленная каспаза3, casapse3, snai1, MMP2, виментин и циклин D1 с соответствующей концентрацией разведения в течение ночи при 4 ° C. Затем мембраны инкубировали со вторичными антителами (Antgene, Chian, 1: 10 000) в темноте в течение 1 часа.Мембраны визуализировали с помощью Odyssey (LI-COR biosciences, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Стерилизованные предметные стекла помещали в 6-луночный планшет и высевали приблизительно 3 × 10 ⁴ клеток на лунку. После 12 часов обработки sc66 их фиксировали в 4% параформальдегиде в течение получаса и пропитывали 0,5% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем блокировали 1% альбумином Bovine V (Service bio, China) для 30 мин при комнатной температуре. Клетки инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C.На следующий день клетки промывали, а затем инкубировали со вторичным антителом (Antgene, Китай) в течение 1 ч в темноте. Затем ядра клеток контрастировали диамидинофенилиндолом (DAPI) (Antgene, Китай) в темноте в течение 5 мин. Изображения были получены под полностью автоматическим микроскопом (Olympus BX63; Япония).

Иммуногистохимическое окрашивание

Опухолевые ткани из моделей голых мышей фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином. Срезы депарафинизировали, гидратировали и восстанавливали антигеном 10 мМ цитрата натрия (pH 6.0). После удаления эндогенной пероксидазы с помощью 3% H ₂ O ₂ образцы блокировали альбумином Bovine V (Service bio, China) в течение 30 мин. Образцы инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C в соответствии с рекомендованной производителем концентрацией. Реакции визуализировали с помощью набора для визуализации 3,3′-диаминобензидина (Servicebio, Китай) и окрашивали гематоксилином для визуализации ядер в течение 1 мин. Изображения получали под микроскопом (Olympus BX51, Япония).

Люциферазные анализы

Клетки высевали в 6-луночные планшеты и обрабатывали 0 или 6 мкМ SC66 в течение 24 часов.Клетки собирали после котрансфекции репортерной плазмидой люциферазы TCF / LEF1 и репортерной плазмидой люциферазы pGMLR-TK (Yeasen Biotech Co, Китай) в течение 48 часов. Активность люциферазы Renilla и светлячка оценивали с помощью набора Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Yeasen Biotech Co, Китай) в соответствии с протоколом поставщика

Эксперименты на животных

Все голые мыши были приобретены у Shulaibao (Ухань, Китай) Biotechnology Co., Ltd. Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Народной больницы Уханьского университета.Клетки U87 на стадии логарифмического роста ресуспендировали в PBS в концентрации 5 × 10 6 клеток / 100 мкл и затем вводили подкожно в подмышки 5-недельным голым мышам Balb / c. Когда объем опухоли достигал примерно 100 мм ³, мышей случайным образом делили на две группы (n = 8) и вводили внутрибрюшинно SC66 (25 мг / кг) каждые 3 дня 6 раз подряд. Тем временем контрольной группе внутрибрюшинно вводили такой же объем ДМСО. Кроме того, каждые 3 дня мы измеряли объем опухоли.Объем опухоли рассчитывали по формуле V = L × W ² × 1/2 (V — объем; L — длина; W — ширина). Через два дня после последней лекарственной обработки мышей умерщвляли и удаляли опухоль. Половину каждой опухоли фиксировали 4% параформальдегидом и залитыми парафином срезами, другую половину экстрагировали для вестерн-блоттинга.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0. Все экспериментальные результаты были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).Для анализа различий между двумя группами использовался t-критерий Стьюдента. Односторонний тест ANOVA использовался для сравнения между тремя или более группами, и, если дисперсионный анализ был значимым, тестирование различий между группами с помощью теста множественных сравнений Тьюки . Значение p менее 0,05 считалось статистической значимостью.

Результаты

SC66 подавляет пролиферацию клеток GBM человека

SC66 представляет собой аллостерический ингибитор, который проявляет двойную ингибирующую функцию в отношении активности AKT.Его химическая формула показана на рисунке 1А. Чтобы исследовать антипролиферативную активность SC66 против клеток GBM, жизнеспособность клеток U87 и U251 определяли с помощью CCK-8. Результаты показали, что SC66 ингибирует пролиферацию клеток U87 и U251 дозозависимым образом. Значения IC50 SC66 в клетках U87 и U251 составляли 10 мкмоль / л и 12 мкмоль / л соответственно (Фигуры 1B, C). Кроме того, результаты анализа образования колоний также показали, что все меньшие и меньшие колонии образовывались по мере того, как обрабатываемые концентрации SC66 увеличивались в обеих клеточных линиях GBM (0, 6, 10 и 15 мкмоль / л) (рис. 1D).Кроме того, результаты анализа синтеза EdU-ДНК показали, что SC66 вызывает заметное снижение процента EdU-положительных клеток в клетках U87 и U251 (рис. 1E). Эти результаты показали, что SC66 ингибирует пролиферацию клеток GBM дозозависимым образом.

Фиг.1 SC66 ингибировал пролиферацию клеток GBM in vitro . (A) Молекулярная структура SC66. (B, C) Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа CCK8 после обработки SCC66 в различных концентрациях (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкмоль / л). (D) SC66 ингибировал образование колоний клеток U87 и U251, и результаты были проанализированы статистически. (E) Анализ EDU показал, что SC66 ингибирует синтез ДНК в клетках U251 и U87. По крайней мере, для трех независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

SC66 ингибирует EMT клеток GBM

Мы окрашивали цитоскелет фаллоидином, обработка SC66, очевидно, изменила морфологию клеток U87 и U251, а также был поврежден цитоскелет (рис. 2F).Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) — это биологический процесс, который позволяет эпителиальным клеткам приобретать мезенхимальные фенотипы. Во время этого процесса эпителиальные клетки претерпевают морфологические и биохимические изменения, чтобы реорганизовать свой цитоскелет (Colella et al., 2019).

Фиг. 2 SC66 подавлял метастатические биологические функции клеток GBM in vitro . (A, B) Было продемонстрировано заживление ран, что SC66 подавляет миграцию клеток U87 и U251. (C, D) Анализ Тансвелла показал, что SC66 ингибирует инвазию клеток U87 и U251. (E) Экспрессия MMP2, виментина и Snai1 после обработки SC66. (G, H) Типичные флуоресцентные изображения виментина и Snai1 в клетках U87 и U251. (F) Клетки окрашивали на F-актин фаллоидином. Провести минимум 3 независимых эксперимента. ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

Кроме того, было подтверждено, что ЭМП играет важную роль в содействии прогрессированию опухоли и метастазированию при различных формах рака (Han et al., 2017). Таким образом, мы предположили, что SC66 может ингибировать процессы EMT. Чтобы дополнительно проверить нашу гипотезу, были проведены анализы заживления ран и Transwell для оценки ингибирующего эффекта SC66 на миграцию и инвазию клеток GBM. Как показано на фиг. 2A, по сравнению с группой, получавшей SC66, необработанная группа продемонстрировала быстрое увеличение расстояния разрыва. Процент заживления ран значительно выше в группе, не получавшей лечения, через 48 часов (Рисунок 2B). Результат показал, что SC66 препятствовал миграции клеток GBM по сравнению с контрольными клетками, свободными от SC66.Аналогичным образом, анализы Transwell показали дозозависимое снижение инвазии клеток GBM, обработанных SC66 (Фигуры 2C, D). Между тем, вестерн-блоттинг показал, что экспрессия связанного с инвазией белка матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), snail1 и виментина снижалась после обработки SC66 (рисунок 2E; дополнительный файл 2: рисунки S1A, B). Одновременно с этим иммунофлуоресцентные анализы продемонстрировали, что экспрессия виментина и Snai1 снижалась в клетках U87 и U251 после обработки SC66 (Фигуры 2G, H).Эти изменения в виментине и улитке показали, что мезенхимно-эпителиальный переход (MET) произошел в клетках U87 и U251 после обработки SC66, что является обратным процессом EMT. Все результаты in vitro предполагают, что SC66 может значительно блокировать EMT U87 и U25.

SC66 останавливает клеточный цикл в фазе G0 / G1 в клетках GBM

Одной из причин бесконечной пролиферации опухолевых клеток является нарушение регуляции клеточного цикла. Мы предположили, что SC66 ингибирует пролиферацию клеток GBM, блокируя клеточный цикл.В нашем исследовании анализ проточной цитометрии использовался, чтобы проверить, влияет ли SC66 на распределение клеточного цикла. Результаты показали, что обработка SC66 приводит к накоплению клеточного цикла в фазе G0 / G1 (Рисунки 3A – D). Чтобы объяснить основной механизм остановки G0 / G1, индуцированной SC66, мы исследовали экспрессию ключевых регуляторных белков клеточного цикла с помощью вестерн-блоттинга, экспрессия циклина D1 снижалась с увеличением лечебной дозы SC66 (рисунки 3E, F. ; Дополнительный файл 2: Рисунок S1C).

Рисунок 3 SC66 останавливает клеточный цикл в фазе G0 / G1 в клетках U87 и U251. (A – D) Клетки, накопленные в фазе G0 / G1 после обработки SC66 в течение 24 часов, измеряли с помощью проточной цитометрии, а результаты анализировали статистически. (E, F) Экспрессия белка клеточного цикла количественно определена с помощью вестерн-блоттинга. По крайней мере, для трех независимых экспериментов. н.с., не имеет значения; ** P <0,01, *** P <0,001.

SC66 индуцирует апоптоз клеток в клетках U87 и U251

Мы дополнительно исследовали влияние SC66 на апоптоз клеток.Результаты анализа проточной цитометрии продемонстрировали, что дозозависимый характер увеличивался в клетках апоптоза U87 и U251 после обработки SC66 в течение 24 часов (Фигуры 4A, B). Дальнейший анализ методом вестерн-болта показал, что уровни экспрессии Bax и расщепленной каспазы3 были значительно снижены, а экспрессия Bcl2 заметно увеличилась (фиг. 4C; дополнительный файл 2: фиг. S1D, E). Мы оценили апоптоз клеток, выполнив тесты окрашивания TUNEL, и результаты показали, что доля TUNEL-положительных клеток была выше после обработки SC66 (рисунки 4D, E).Кроме того, анализы иммунофлуоресцентного окрашивания также продемонстрировали, что уровень экспрессии Bcl 2 был снижен, а уровень расщепленной каспазы 3 увеличился (Фигуры 4F, G). Эти результаты предполагают, что SC66 индуцировал апоптоз клеток в клетках U87 и U251.

Фигура 4 SC66 индуцировал апоптоз клеток GBM in vitro . (A, B) Апоптоз клеток заметно усилился после обработки SC66 в течение 24 часов, измеренной с помощью проточной цитометрии, и результаты были проанализированы статистически. (C) Экспрессия белка, связанного с апоптозом клеток, количественно определена с помощью вестерн-блоттинга. (D, E). Гибель клеток U251 и U87 определяли окрашиванием TUNEL. (F, G) Типичные флуоресцентные изображения Bcl-2 и расщепленной каспазы 3 в клетках U87 и U251. По крайней мере, для трех независимых экспериментов. н.с., не имеет значения; * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

SC66 ингибирует сигнальные пути AKT / β-катенина в клетках U87 и U251

SC66 — новый низкомолекулярный аллостерический ингибитор. Чтобы дополнительно подтвердить, оказывает ли SC66 противоопухолевый эффект путем воздействия на сигнальный путь AKT, родственные белки пути AKT были проверены с помощью вестерн-блоттинга, включая AKT, GSK3-β, β-катенин и их соответствующие фосфорилированные формы.Результаты продемонстрировали, что p-AKT, p-GSK-3β и β-катенин заметно снижались дозозависимым образом, а p-β-катенин заметно накапливался. Однако общая экспрессия AKT и GSK3-β не претерпела значительных изменений (рисунок 5A; дополнительный файл 2: рисунки S1F, I). Кроме того, иммунофлуоресцентный анализ показал, что уровень ядерного переноса β-катенина значительно снизился после обработки SC66 по сравнению с контрольной группой (фигура 5B). Отчеты о люциферазе TCF / LEF показали, что активность люциферазы TCF / LEF в клетках U87 и U251 была значительно снижена после обработки SC66 (фиг. 5C).Результаты могут продемонстрировать, что SC66 ингибирует сигнальные пути AKT / β-катенина в клетках U87 и U251.

Фиг. 5 SC66 ингибирует сигнальные пути AKT / β-катенина в клетках U87 и U251. (A) Вестерн-блоттинг экспрессии основного белка сигнальных путей после обработки SC66. (B) Типичные флуоресцентные изображения β-катенина в клетках U87 и U251. Уровень ядерного переноса β-катенина значительно снизился после обработки SC66 по сравнению с контрольной группой. (C) Относительная активность люциферазы TCF / LEF показана как процент относительных световых единиц люциферазы светлячка к люциферазе Renilla. По крайней мере, для трех независимых экспериментов. * Р <0,05.

Повышение активности β-катенина спасает Пролиферацию и метастазирование клеток GBM, опосредованную ингибированием SC66

Для дальнейшего подтверждения, что SC66 оказывает противоопухолевый эффект через пути передачи сигналов AKT / β-катенина. IM12, который является ингибитором GSK-3β, который, как было подтверждено, усиливает каноническую передачу сигналов Wan / β-катенина (Schmöle et al., 2010). IM-12 добавляли к клеткам через 24 часа обработки SC66. Анализы CCK 8 показали, что IM12 спасает способность к пролиферации клеток, ингибируемую SC66, и анализ образования колоний также подтвердил те же результаты (Фигуры 6A – C). В дополнение к этому, анализы Transwell показали, что функция миграции и инвазии, ингибируемая SC66, была частично отменена после того, как IM12 повысил передачу сигналов Wan / β-катенин в клетках U87 и U251 (Фигуры 6D, E). Эти результаты показали, что SC66 опосредует активацию передачи сигналов β-катенина для ингибирования злокачественного новообразования GBM.

Рис. 6 Повышение активности β-катенина спасало опосредованную ингибированием SC66 пролиферацию и метастазирование клеток GBM. (A – C) IM12 использовали для усиления сигнальных путей β-катенина. Анализы образования CCK 8 и клонов были выполнены для исследования пролиферации в клетках U87 и U251. (D, E) Анализ Transwell выполняли для обнаружения миграции и инвазии в клетки GBM. По крайней мере, для трех независимых экспериментов. н.с., не имеет значения; * P <0,05, ** P <0.01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

Подавление роста опухоли SC66 в моделях голых мышей

Для оценки противоопухолевой способности SC66 in vivo мы создали модель опухоли ксенотрансплантата U87 у голых мышей. Результаты продемонстрировали, что SC66 заметно подавлял рост опухоли, поскольку вес и объем опухоли были заметно меньше в группе, получавшей SC66, чем в контрольной группе (Фигуры 7A-C). Кроме того, результаты вестерн-блоттинга показали, что экспрессия белков β-катенина, P-AKT, P-GSK-3β, циклина D1, виментина и Bcl-2 в опухоли ксенотрансплантата была явно снижена в группе лечения SC66 (фигура 7D; дополнительный файл 2: Рисунок S1J).Более того, иммуногистохимическое окрашивание показало, что экспрессия P-AKT, P-GSK-3β, β-катенина, Snai1, виментина и Bcl-2 была значительно снижена, в то время как экспрессия BAX и P-β-катенина заметно увеличилась ( Рисунок 7E). Иммунофлуоресцентный анализ также продемонстрировал, что экспрессия P-AKT и β-катенина была заметно снижена в группе обработки SC66 (дополнительный файл 3: фигура S2).

Фиг. 7 SC66 подавлял рост опухоли в моделях «голых» мышей. (A) Изображение опухолей ксенотрансплантата, образованных на моделях «голых» мышей. (B, C) Рассчитывали вес и объем опухоли. (D) Вестерн-блоттинг экспрессии основного белка в контрольной группе и группе, обработанной SC66. (E) Типичные изображения ИГХ окрашивания P-AKT, P-GSK-3β, β-катенина, P-β-катенина, Snai1, MMP2, Bax, Bcl-2 и расщепленной каспазы 3. * P <0,05, *** P <0,001.

Обсуждение

Глиомы являются наиболее распространенными злокачественными опухолями головного мозга у взрослых, и, по оценкам, ежегодная заболеваемость в США составляет 6.6 на 100 000 человек. Около половины вновь диагностированных глиом классифицируются как глиобластома (GBM), которая является наиболее агрессивным подтипом с наихудшим прогнозом среди всех глиом (Reifenberger et al., 2017). Варианты лечения ограничены, включая хирургическое вмешательство и лечение с помощью лучевой терапии и химиотерапии TMZ. Благодаря преимуществам химиотерапии TMZ, выживаемость пациентов с ГБМ увеличивается примерно на 2,5 месяца (Wang et al., 2016). Тем не менее, среднее время выживания пациентов с ГБМ составляет менее 16 месяцев даже при оптимальном лечении (Joseph et al., 2015)., Для улучшения прогноза потребовались более эффективные препараты.

Предыдущие исследования показали, что активация AKT может стимулировать пролиферацию клеток и влиять на регуляцию клеточного цикла через несколько нижестоящих мишеней. AKT-зависимое фосфорилирование целевых белков, таких как GSK3, может способствовать пролиферации клеток, регулируя стабильность и синтез белков, участвующих в входе в клеточный цикл. GSK3-опосредованное фосфорилирование cyclin D и cyclin E, которые играют значительную роль в трансформации перехода G1 в фазу -S клеточного цикла (Manning and Cantley, 2007).В этом исследовании мы продемонстрировали, что SC66 заметно ингибирует пролиферацию клеток GBM дозозависимым образом. Между тем, супрессия SC66 роста опухоли также была подтверждена на моделях «голых» мышей. Тем не менее, анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что обработка SC66 в значительной степени индуцировала остановку клеточного цикла в фазе G0 / G1 в клетках U87 и U251. Результаты вестерн-блоттинга доказали, что белок, связанный с клеточным циклом, циклин D1 подавлялся после обработки SC66. Основываясь на этих результатах, SC66 может останавливать клеточный цикл в фазе G0 / G1, оказывая противоопухолевое действие.

EMT — это биопроцесс, при котором клетки теряют свои эпителиальные характеристики и приобретают характеристики фенотипов мезенхимальных клеток. В этом процессе свойство миграции и инвазии клеток значительно усиливается. EMT превращает невинные опухоли в инвазивные метастатические опухоли и играет жизненно важную роль в регулировании прогрессирования опухоли и метастазирования (Liu et al., 2017; Sun et al., 2018). В этой работе мы указали, что экспрессия родственного ЕМТ белка snail и виментина снижалась после обработки SC66.Обработка SC66 явно повредила архитектуру цитоскелета. Более того, мы подтвердили, что способность клеток GBM к миграции и инвазии заметно снижалась после обработки SC66. Эти данные показывают, что SC66 подавляет опосредованную EMT миграцию и инвазию в клетки GBM.

Апоптоз клеток — это основной механизм, который поддерживает гомеостаз между пролиферацией и гибелью клеток, а также считается механизмом защиты от туморогенеза (Valdes-Rives et al., 2017; Zhang et al., 2018). Апоптоз опосредован внешним путем, индуцированным рецептором смерти, и внутренним путем, опосредованным митохондриями, и оба пути в конечном итоге активируют каспазу-3 для осуществления апоптоза. Кроме того, члены антиапоптотических и проапоптотических семейств, такие как Bcl-2 и BAX, оказывали значительное влияние на активацию каспаз в митохондриально-опосредованном пути (Valdes-Rives et al., 2017). Следовательно, это основное направление, которое может усилить апоптоз клеток GBM для разработки эффективных терапевтических препаратов.Предыдущее исследование продемонстрировало, что SC66 может значительно индуцировать апоптоз, сопровождаясь инактивацией AKT. Экспрессия Bcl-XL резко снижалась, когда раковые клетки толстой кишки обрабатывали SC66 (Liu et al., 2019). В соответствии с этими результатами мы обнаружили, что обработка SC66 индуцировала апоптоз клеток U87 и U251 дозозависимым образом, обнаруживаемым с помощью проточной цитометрии.

Обработка клеток GBM SC66 индуцировала экспрессию расщепленной каспазы 3 и увеличивала экспрессию BAX.Одновременно снижалась экспрессия белка Bcl-2, что показало, что апоптотические эффекты SC66 могут быть связаны с митохондриальным путем.

Мы дополнительно исследовали влияние SC66 на путь, посредством которого SC66 регулирует пролиферацию, ЕМТ и апоптоз клеток глиомы. SC66 ингибировал пролиферацию клеток рака толстой кишки через AKT / GSK-3β / Bax оси in vivo и in vitro (Liu et al., 2019). Между тем, SC66 индуцировал изменения в организации цитоскелета и продукции ROS, в результате чего уровень фосфорилированного AKT был заметно снижен, и продемонстрировал, что SC66 заметно ингибирует рост опухоли через путь AKT / mTOR / β-катенин в гепатоцеллюлярной карциноме (Cusimano et al., 2015).

GSK-3β инактивировался фосфорилированием по сайту Ser9 после активации сигнального пути Wnt, что приводило к накоплению β-катенина в цитоплазме. Цитоплазматический β-катенин впоследствии переходит в ядро и связывается с TCF / LEF, что приводит к транскрипционной экспрессии генов-мишеней, таких как CyclinD1, c-Myc и т. Д. (Ding et al., 2019). После обработки SC66 экспрессия P-GSK-3β и β-катенина снижалась, а экспрессия P-β-катенина повышалась. Анализ IF показал, что уровень ядерной транслокации β-катенина значительно снижается в группе, получавшей SC66.Между тем, отчетный анализ люциферазы TCF / LEF показал, что активность TCF / LEF заметно подавлялась. Более того, повышение активности β-catenin с помощью IM12 спасает опосредованную ингибированием SC66 пролиферацию и метастазирование клеток GBM. Эти результаты показали, что SC66 может подавлять развитие клеток GBM путем подавления пути AKT / β.

В заключение мы подтвердили, что SC66 проявляет заметную противоопухолевую эффективность в клетках GBM in vivo, и in vitro, , посредством дерегуляции пути AKT / β-катенина.Мы также продемонстрировали, что SC66 ингибирует ЕМТ-опосредованную миграцию и инвазию клеток. Наши результаты могут способствовать его потенциальному применению для действительного лечения ГБМ.

Заявление о доступности данных

Исходные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы; дальнейшие запросы можно направить автору-корреспонденту.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных в больнице Жэньминь Уханьского университета.

Вклад авторов

LG и JL провели эксперименты по клеточной биологии, вестерн-блоттинг, анализ проточной цитометрии, иммунофлуоресценцию, иммуногистохимию, подготовку рукописей и проанализировали статистические данные. PX, GD и BL участвовали в анализе проточной цитометрии. FY, YT, QS и YX участвовали в вестерн-блоттинге. В иммунофлуоресценции участвовали HZ, YQ, HJ, KY, RG и MH. QC участвовал в подготовке рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81572489 и 81372683). Эта рукопись была выпущена в качестве препринта в Research Square (Gao et al., 2020).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2020.01102/full#supplementary-material

Сокращения

ЦНС, центральная нервная система; EMT, эпителиально-мезенхимальный переход; ГБМ, глиобластома; TMZ, Темозоломид.

Ссылки

Cheng, Y. P., Li, S., Chuang, W. L., Li, C.H., Chen, G.J., Chang, C.C., et al. (2019). Блокада передачи сигналов STAT3 способствует противораковому эффекту 5-ацетилокси-6,7,8,4’-тетра-метоксифлавона, производного тангеретина, на мультиформные клетки глиобластомы человека. Внутр. J. Mol. Sci. 20 (13), 3366. doi: 10.3390 / ijms20133366

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Колелла, Б., Фаенца, Ф., Ди Бартоломео, С. (2019). Регуляция EMT с помощью аутофагии: новая перспектива в биологии глиобластомы. Cancers (Базель) 11 (3), 312. doi: 10.3390 / Cancers11030312

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кузимано А., Пулейо Р., Д’Алессандро Н., Лориа Г. Р., МакКубри Дж. А., Монтальто Г. и др. (2015). Цитотоксическая активность нового низкомолекулярного ингибитора AKT SC66 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Oncotarget 6 (3), 1707–1722. doi: 10.18632 / oncotarget.2738