Протокол об отстранении от управления транспортным средством: КоАП РФ Статья 27.12. Отстранение от управления транспортным средством, освидетельствование на состояние алкогольного опьянения и медицинское освидетельствование на состояние опьянения / КонсультантПлюс

КоАП РФ Статья 27.12. Отстранение от управления транспортным средством, освидетельствование на состояние алкогольного опьянения и медицинское освидетельствование на состояние опьянения / КонсультантПлюс

КоАП РФ Статья 27.12. Отстранение от управления транспортным средством, освидетельствование на состояние алкогольного опьянения и медицинское освидетельствование на состояние опьянения

(в ред. Федерального закона от 24.07.2007 N 210-ФЗ)

1. Лицо, которое управляет транспортным средством соответствующего вида и в отношении которого имеются достаточные основания полагать, что это лицо находится в состоянии опьянения, а также лица, совершившие административные правонарушения, предусмотренные частями 2 и 3 статьи 11.8, частью 1 статьи 11.8.1, частью 1 статьи 12.3, частью 2 статьи 12.5, частями 1 и 2 статьи 12.7 настоящего Кодекса, подлежат отстранению от управления транспортным средством до устранения причины отстранения.

(в ред. Федеральных законов от 24. 07.2007 N 210-ФЗ, от 29.12.2017 N 452-ФЗ)

1.1. Лицо, которое управляет транспортным средством соответствующего вида и в отношении которого имеются достаточные основания полагать, что это лицо находится в состоянии опьянения, либо лицо, в отношении которого вынесено определение о возбуждении дела об административном правонарушении, предусмотренном статьей 12.24 настоящего Кодекса, подлежит освидетельствованию на состояние алкогольного опьянения в соответствии с частью 6 настоящей статьи. При отказе от прохождения освидетельствования на состояние алкогольного опьянения либо несогласии указанного лица с результатами освидетельствования, а равно при наличии достаточных оснований полагать, что лицо находится в состоянии опьянения, и отрицательном результате освидетельствования на состояние алкогольного опьянения указанное лицо подлежит направлению на медицинское освидетельствование на состояние опьянения.

(часть первая.1 введена Федеральным законом от 24.07.2007 N 210-ФЗ, в ред.

Федерального закона от 23.07.2013 N 196-ФЗ)

2. Отстранение от управления транспортным средством соответствующего вида, освидетельствование на состояние алкогольного опьянения, направление на медицинское освидетельствование на состояние опьянения осуществляются должностными лицами, которым предоставлено право государственного надзора и контроля за безопасностью движения и эксплуатации транспортного средства соответствующего вида, а в отношении водителя транспортного средства Вооруженных Сил Российской Федерации, войск национальной гвардии Российской Федерации, спасательных воинских формирований федерального органа исполнительной власти, уполномоченного на решение задач в области гражданской обороны, — также должностными лицами военной автомобильной инспекции в присутствии двух понятых либо с применением видеозаписи.

3. Об отстранении от управления транспортным средством, а также о направлении на медицинское освидетельствование на состояние опьянения составляется соответствующий протокол, копия которого вручается лицу, в отношении которого применена данная мера обеспечения производства по делу об административном правонарушении.

4. В протоколе об отстранении от управления транспортным средством соответствующего вида, а также в протоколе о направлении на медицинское освидетельствование на состояние опьянения указываются дата, время, место, основания отстранения от управления или направления на медицинское освидетельствование, должность, фамилия и инициалы лица, составившего протокол, сведения о транспортном средстве и о лице, в отношении которого применена данная мера обеспечения производства по делу об административном правонарушении.

5. Протокол об отстранении от управления транспортным средством, а также протокол о направлении на медицинское освидетельствование на состояние опьянения подписывается должностным лицом, их составившим, и лицом, в отношении которого применена данная мера обеспечения производства по делу об административном правонарушении.

В случае отказа лица, в отношении которого применена данная мера обеспечения производства по делу об административном правонарушении, от подписания соответствующего протокола в нем делается соответствующая запись.

6. Освидетельствование на состояние алкогольного опьянения и оформление его результатов, направление на медицинское освидетельствование на состояние опьянения осуществляются в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

(часть 6 в ред. Федерального закона от 25.11.2013 N 317-ФЗ)

6.1. Критерии, при наличии которых имеются достаточные основания полагать, что лицо находится в состоянии опьянения и подлежит направлению на медицинское освидетельствование, и порядок проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения устанавливаются федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим функции по выработке и реализации государственной политики и нормативно-правовому регулированию в сфере здравоохранения.

(часть 6.1 в ред. Федерального закона от 21.07.2014 N 227-ФЗ)

7. Акт освидетельствования на состояние алкогольного опьянения или акт медицинского освидетельствования на состояние опьянения прилагается к соответствующему протоколу. Копии акта освидетельствования на состояние алкогольного опьянения и (или) акта медицинского освидетельствования на состояние опьянения вручаются лицу, в отношении которого они были составлены.

(часть седьмая в ред. Федерального закона от 24.07.2007 N 210-ФЗ)

Примечание. Утратило силу. — Федеральный закон от 23.07.2010 N 169-ФЗ.

Открыть полный текст документа

Отстранение от управления транспортным средством

Основания для отстранения от управления транспортным средством

Сроки отстранения

Порядок отстранения от управления

 

 

Отстранение от управления транспортным средством – это мера обеспечения производства по делу, применяемая сотрудником ГИБДД непосредственно после выявления соответствующих оснований, путем запрещения управления транспортным средством данным водителем до устранения причины отстранения.

 

Порядок и основания отстранения от управления транспортным средством предусмотрены статьей 27. 12 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях (КоАП РФ).

 

 

Основания для отстранения от управления транспортного средства

Основания для отстранения от управления транспортного средства перечислены в ч. 1 ст. 27.12 КоАП РФ и не подлежат расширительному толкованию.

 

К таким обстоятельствам относят:

 

1. Имеются достаточные основания полагать, что водитель находится в состоянии опьянения. При  этом установлены четкие критерии, являющие достаточными для того, чтобы заподозрить водителя в управлении автомобилем в состоянии опьянения (алкогольном или наркотическом):

• запах алкоголя изо рта;
• неустойчивость позы и шаткость походки;
• нарушение речи;
• резкое изменение окраски кожных покровов лица.

Лицо, отстраненное от управления в связи с подозрением на опьянение, подлежит освидетельствованию на состояние алкогольного опьянения.

В случае если водитель отказывается от прохождения данного освидетельствования, а также при отрицательном результате освидетельствования и наличии достаточных оснований полагать, что лицо находится в состоянии опьянения, проводится медицинское освидетельствование на состояние опьянения.

 

2. Водитель управляет транспортным средством, не имея при себе регистрационных документов, а в установленных случаях документов, предусмотренных таможенным законодательством Таможенного союза, с отметками таможенных органов, подтверждающими временный ввоз транспортного средства, (ответственность за данное правонарушение предусмотрена ч. 1 ст. 12.3 КоАП РФ). Об ответственности за езду без документов можно прочитать в статье по ссылке.

 

3. Управление транспортным средством с заведомо неисправными тормозной системой (за исключением стояночного тормоза), рулевым управлением или сцепным устройством (в составе поезда) (ответственность за данное правонарушение предусмотрена ч.

2 ст. 12.5 КоАП РФ).

 

4. Управление транспортным средством водителем, не имеющим права управления транспортным средством, то есть лицом, не получившим водительское удостоверение, или с недействительными правами (ответственность за такое правонарушение предусмотрена ч. 1 ст. 12.7 КоАП РФ).

 

5. Управление транспортным средством водителем, лишенным права управления транспортными средствами (наказывается по ч. 2 ст. 12.7 КоАП РФ). О том, за какие нарушения ПДД лишают водительских прав можно посмотреть в таблице по ссылке.

 

Данные обстоятельства инспектор ГИБДД может выявить после остановки транспортного средства. О правилах и основаниях остановки автомобиля инспектором ГИБДД можно прочитать в статье по ссылке.

 

Срок отстранения

 

Законом предусмотрен срок, на который принимается решение об отстранении водителя от управления автомобилем. Такой срок – до устранения причины отстранения.

 

Таким образом, если у водителя отсутствуют необходимые документы на право управления транспортным средством, срок отстранения составит – до момента представления недостающих документов. Также срок отстранения прекратится, если водитель передаст право управления другому лицу, у которого имеются все необходимые для вождения документы.

 

В случаях невозможности устранения на месте причин, по которым принято решение об отстранении, инспектор ГИБДД принимает решение об эвакуации транспортного средства.

 

 

Порядок принятия решения об отстранении от управления

 

Решение об отстранении от управления транспортным средством принимается инспектором ГИБДД, о чем составляется протокол, в котором указываются дата, время, место, основания отстранения от управления, должность, специальное звание, фамилия и инициалы сотрудника, составившего протокол, сведения о транспортном средстве и о лице, в отношении которого применена данная мера обеспечения производства по делу об административном правонарушении.

 

Отстранение лица от управления транспортным средством осуществляется сотрудником ГИБДД непосредственно после выявления соответствующих оснований в присутствии двух понятых путем запрещения управления этим транспортным средством данным водителем до устранения причины отстранения.

 

Образец протокола об отстранении утвержден приказом МВД России от 02.03.2009 N 185 (в действующей редакции).

 

 

Протокол об отстранении от управления транспортным средством подписывается сотрудником ГИБДД, его составившим, и лицом, в отношении которого применена данная мера. В случае отказа лица от подписания протокола в нем делается соответствующая запись. Копия протокола вручается лицу, в отношении которого применена данная мера.

 

Подготовлено «Персональные права.ру»

Отстранение от управления транспортным средством в 2021 году: порядок и процедура

Далеко не каждый водитель имеет право управлять транспортным средством, если инспекторы ГИБДД предположили, что в определенной ситуации ему не стоит этого делать.

Подобные запреты не являются безосновательными, у сотрудников правоохранительных органов может быть несколько причин для проведения такого процесса, как отстранение от управления транспортным средством.

Самое главное, что требуется помнить водителю, решение может быть принято только при наличии двух, не менее понятых. Таким образом можно зафиксировать факт полного отстранения от управления автомобилем.

В подобном случае все должны придерживаться закона и определенных установленных регламентов – водители, нарушившие закон, а также сотрудники ГИБДД.

Основания для отстранения

Что такое отстранение от управления транспортным средством? Это стандартный, обоснованный законом запрет на вождение.

Согласно ст 27 12 КоАП РФ, основанием для полного отстранения водителя от управления его транспортным средство, могут стать следующие цели и основания отстранения:

1. Неисправность используемого транспортного средства – повреждение системы тормозов, выход из строя рулевого механизма.
2. Пребывание водителя в подвыпившем опьяненном состоянии, а также под влиянием наркотических и токсических компонентов.
3. Если за рулем находится заключенный, который сбежал от ответственности и обязан отбывать еще срок назначенного заключения.
4. Требование использовать автомобиль сотрудникам правоохранительных органов в особых служебных целях.
5. Отсутствие у водителя документов на транспорт, а также стандартного водительского удостоверения.
6. Лишение прав.

Самой распространенной причиной по отстранению является предполагаемое определенное количество алкоголя в составе крови человека, который находился за рулем.

В самом начале обследования сотрудники ГИБДД не в состоянии максимально точно определить уровень опьянения человека, который управлял транспортным средством. Несмотря на это, они обязаны его проверить при малейших подозрениях.

Среди первичных признаков опьянения можно выделить:

• резкий запах алкоголя;
• нарушение ясности и четкости речи;
• невозможность находиться в положении стоя.

Последствием подобного состояния может стать серьезная автокатастрофа, которая может повлечь за собой достаточно серьезные трагические последствия.

Именно по этой причине любой, даже самый незначительный признак обязательно принимается во внимание сотрудниками ДПС.

Если их подозрения относительно опьянения подтверждаются, человек автоматически отстраняется от управления авто.

Каждый нетрезвый водитель в первую очередь отстраняется от вождения автомобилем, затем составляют официальное освидетельствование, по которому водитель отправляется на процесс стандартного медицинского освидетельствования.

Там уже более точно устанавливают «диагноз», определяют степень опьянения. На основании полученных результатов от медиков становится понятно, нужно ли привлекать человека к ответственности или причина плохого состояния заключается в другом.

Полное отстранение водителя от управления транспортным средством осуществляется строго при наличии свидетелей, которые возьмут на себя ответственность относительно подтверждения законности производимых действий сотрудников ГИБДД.

Есть мнение, что человеку, которого остановили для проверки, совершенно не обязательно покидать свой автомобиль. Современное законодательство позволяет передать ключи от зажигания сотруднику ГИБДД и позволить ему проверить все, что его может не устраивать.

Как показала практика, данным правилом мало, кто пользуется, так как мало у кого появляется желание строить из себя гордую птицу, но контролировать действия сотрудников ДПС.

Многим известны их неправомерные действия, вплоть до особых подставных действий. Именно по этой причине так важно знать, как происходит отстранение.

Процедура отстранения от вождения автомобилем

Сотрудники ГИБДД и иных подобных правоохранительных органов имеют полное право проводить определенные меры относительно водителя, его отстранения от последующего вождения им автомобиля.

Общая последовательность действий построена таким образом, что без присутствия двух понятых не обойтись.

Это свидетели, которые должны присутствовать в процессе составления такого документа, как протокол об отстранении от управления транспортным средством, с обязательным обозначением места, даты и времени задержания управляющего водителя, а также личные данные самого сотрудника и причину отстранения.

По окончании составления документа, протокол требуется подписать сотруднику ДПС и задержанному водителю. Стоит отметить, что водитель имеет право отказаться от подписания документа, тогда на месте подписи будет стоять специальная отметка, подтверждающая отказ.

В качестве дополнительного документа, к оформленному протоколу прикрепляются результат медицинского освидетельствования. Инспекторы ДПС стараются выполнить свою работу как можно быстрее, стремясь покинуть одного нарушителя закона и перейти к иному.

Процедура проверки уровня алкогольного опьянения может затянуть порядок отстранения от управления транспортным средством, так как далеко не всегда в наличии присутствует специальный измерительный прибор.

В этом случае водителя быстро отвозят на ближайший постовой пункт, где присутствует все требуемое оборудование. Отсюда вырастает проблема, связанная с тем, что осмотр осуществляется на посту, а автомобиль остается на месте задержания.

Это неправильная ситуация! Инспектор изначально должен провести процедуру отстранения без освидетельствования, причем сделать это при понятых. Сначала составляется протокол, а потом разрешается покидать место остановки.

Многие специалисты не соблюдают данные требования и правила, опираясь на элементарное отсутствие знаний у стандартных водителей.

Если подобная ситуация произошла, стоит пригласить грамотного опытного правоведа, который через суд докажет ошибочные и неправомерные действия сотрудников ДПС.

В суде обязательно нужно будет отметить, что протокол составлялся на посту, где проходило освидетельствование.

Тем временем автомобиль находился в ином месте, потому водитель может заявить, что просто не пользовался своим транспортным средством, но выступал в качестве пешехода.

Чтобы в суде было проще доказывать право продолжать процессом управления авто, требуется обратить внимание на тот фактор, что авто на время оформления дела отсутствовал в зоне видимости.

А согласно законодательству, если средство передвижения не было на месте, то водителя можно не обвинять ни в чем.

В суде могут разбираться и иные ситуации, связанные, например, с неправильным заполнением протокола. Если сотрудник ДПС указал неточные данные или забыл проставить дату, решение также может быть оспорено.

Особенности составления протокола

Наряду с проведение процедуры отстранения имеет внимание нужно обратить на составление официального протокола аналогичного направления и документа, являющегося направлением на официальное медицинское освидетельствование.

В документе в обязательном порядке указываются следующие данные:

• время задержания;
• место на трассе или на улице населенного пункта;
• основная причина для отстранения и на направление человека в поликлинику на проведение обследования;
• личные данный и должность сотрудника ДПС, который составлял протокол;
• информация о самом транспортном средстве, относительно которого были применимы меры обеспечения по делу о зафиксированном административном нарушении.

Чтобы удостовериться в правильном составлении документа, его всегда можно сверить с образцом, представленном на любом тематическом сайте или форуме.

Это позволит избежать неточностей, способных спровоцировать неправомерные действия со стороны властей.

Права обвиняемого водителя

Если водителя можно на вполне законных основаниях отнести к категории нарушителей, но при этом не был составлен протокол относительно зафиксированного нарушения, к ответственности его привлечь не получится.

Данное правило не относится к ситуации, когда водитель был очевидно пьян и мог стать настоящей угрозой для остальных водителей или пешеходов.

В подобной ситуации нарушившего порядок инспектора просто обвинят в халатности, а разбирательство при этом будет продолжено.

Водители, как только появляется процедура отстранения, могут забыть о присущих им правах. Знать о них нужно, чтобы избежать необоснованных обвинений.

Вот самые основные из них:

• задержанный водитель имеет право потребовать официальное медицинское освидетельствование на предмет содержание спиртного в крови в обычном отделении городской поликлиники;
• если у водителя не оказалось документов на месте задержания, он имеет право потребовать привезти их и даже съездить за ними самостоятельно. Здесь все зависит от времени, которым располагает сотрудник ГИБДД;
• в оформляемом протоколе водитель должен описать полную версию всего произошедшего, а также обозначить свои законные пояснения;
• отстранение от управления транспортным средством без понятых — недопустимо;
• каждый водитель в процессе оформления нарушения имеет право потребовать копии всех составленных материалов или попросить для себя защитника.

Самое главное – нужно понимать, что у водителя, как и у любого гражданина РФ, есть не только обязанности, но и права. Это поможет предотвратить незаконное отстранение от управления авто.

Общее время отстранения

Современным законодательством предусмотрен временной период отстранения водителя от управления его транспортным средством.

Если у человека отсутствуют документы на право управления автомобилем, сроки отстранения будут равны ровно тому времени, когда все недостающие документы будут предоставлены.

Кроме того, срок запрета на вождение прекратится в случае, если водитель право по управлению транспортным средством передаст иному лицу, имеющему все требуемые документы в распоряжении.

Подводя итоги

Отстранение от управления авто – это особая мера обеспечения производства по делу, которая используется сотрудником ГИБДД сразу после определения и выявления разных соответствующих причин и оснований.

Данная мера прямо направлена на категорический запрет управления транспортным средством до тех пор, пока все причины и основания не будут полностью устранены.

Порядок отстранения от вождения средством передвижения предусмотрены современным законодательством 2021 года, в котором регулируются административные нарушения категории КоАП.

Скачать:

 

Подпишись на наш Телеграм-канал https://t.me/pravoauto чтобы быть в курсе новых штрафов и других изменений автомобильного законодательства.

Вас заинтересует:

Процедура оформления освидетельствования пьяных водителей может быть упрощена

Профильный комитет отправил в рассылку законопроект № 682125–6 «О внесении изменений в Кодекс Российской Федерации об административных правонарушениях», разработанный депутатами В. Лысаковым и Р.Ишмухаметовым.

В настоящее время при освидетельствовании водителя транспортного средства на состояние опьянения инспекторами Госавтоинспекции и медицинскими работниками составляется, как правило, не менее 6 процессуальных документов: протокол об отстранении от управления транспортным средством; акт освидетельствования на состояние алкогольного опьянения; протокол направления на медицинское освидетельствование; акт медицинского освидетельствования на состояние опьянения; протокол об административном правонарушении; протокол задержания транспортного средства.

Составление такого количества документов депутаты считают избыточным, поскольку указанные процедуры приводят к значительным потерям времени и конфликтам.

Для упрощения этой процедуры законопроектом предлагается: упразднить составление протокола об отстранении от управления транспортным средством водителя, в отношении которого имеются достаточные основания полагать, что он находится в состоянии опьянения; предусмотреть возможность направления его на медицинское освидетельствование с признаками наркотического опьянения без предварительного освидетельствования на состояние алкогольного опьянения; предусмотреть вместо составления отдельного протокола задержания транспортного средства внесение записи о задержании транспортного средства в документ, которым возбуждается дело (определение о возбуждении дела об административном правонарушении, протокол об административном правонарушении или постановление по делу об административном правонарушении).

Советом Думы определен срок подготовки законопроекта к рассмотрению Госдумой в первом чтении – март 2015 года, срок представления в Комитет Государственной Думы по конституционному законодательству и государственному строительству отзывов и предложений установлен до 19 февраля 2015 года.

Очередной сотрудник консульства США задержан за пьяную езду

Владивосток, ИА Приморье24. Сестаро Майкл Кейт был задержан в августе сотрудниками ГИБДД во Владивостока за управление автомобилем в нетрезвом виде, передает РИА Vladnews.  Сегодня в 1-м участке мирового суда Ленинского района должно быть вынесено решение в отношении Майкла Кейта Сестаро, сотрудника Генерального консульства США, который был задержан 26 августа 2013 года в центре Владивостока, на улице Суханова, за езду в нетрезвом виде за управление автомобилем в нетрезвом виде. Автомобиль «Форд Экспейп» сотрудники ГИБДД города Владивостока с «красными» дипломатическими номерами остановили для проверки документов около 22 часов. Обычная ситуация. Однако от сидевшего за рулем гражданина США Майкла Кейта Сестаро пахло спиртным, поэтому он был отстранен от управления транспортным средством и в отношении него был составлен протокол об административном правонарушении. Автомобиль сотрудника консульства был остановлен в районе Суханова, 8.

  Для россиянина такое нарушение чревато не только крупным штрафом, но и лишением права управления транспортным средством на 1,5 года. Но американец обладает дипломатическим иммунитетом. Поэтому, скорее всего, он отделается легким испугом: права управления транспортным средством его не лишат, просто представители МИДа России должны уведомить МИД США об этом инциденте. Следует напомнить, что пьяная езда другого сотрудника американского консульства – Дагласа Кента, в свое время закончилась инвалидностью для жителя Приморья Александра Кашина. В 1998 году пьяный консул на своей машине врезался в другую машину. После этого 23-летний Александр Кашин, житель Большого Камня, гостивший во Владивостоке, навсегда остался инвалидом, прикованным к коляске. А Даглас Барри Кент (полное имя героя) переехал к другому месту службы, не ответив за содеянное ни уголовной ответственностью, ни рублем – спас его тот самый пресловутый дипломатический иммунитет. На этот раз сотрудникам ГИБДД Владивостока, наверное, удалось предотвратить очередной случай пьяной езды работника Генконсульства США во Владивостоке. Неизвестно еще, куда бы (в кого бы) мог приехать этот гонщик…

Протокол осмотра транспортного средства бланк — О мусоре

Приложение 9 к Письму ГТК РФ от 18 ноября 2002 г. Протокол о досмотре транспортного средства рекомендуемый образец. Бланк протокол осмотра транспортного средства категории меню ДТП, Формы документов Бланки заявлений Протокол осмотра транспортного средства. Бланк схемы к протоколу осмотра места ДТП файл. Боюсь, у них даже бланка протокола досмотра с собой нет. ДТП Протокол осмотра транспортного средства. Акт осмотра транспортного средства ТС образец. Бланки Акт проверки и оценки технического состояния транспортного средства ф. Акт осмотра транспортных средств необходим при прохождении регистрационных мероприятий в МРЭО для того, чтобы не предъявлять само транспортное. Осмотр начат в ч мин. Предлагаемый протокол выполнен на специальном бланке. Технических средств каких именно и. ПРОТОКОЛ осмотра места дорожнотранспортного происшествия. Пример описания в протоколе осмотра дороги и. Акт осмотра транспортного средства документ, который составлен несколькими лицами и подтверждает факт осмотра транспортного средства. Осмотр транспортных средств марка модель номерной знак, цвет, год выпуска. При осмотре транспортного средства, необходимо в протоколе зафиксировать. О досмотре транспортного средства составляется протокол либо делается соответствующая запись в протоколе об. Проведении осмотра транспортного средства и. В области дорожного движения Образец ПРОТОКОЛ ОСМОТРА ТРАНСПОРТНОГО СРЕДСТВА г. Уважаемый посетитель, к сожалению, сайт. В приведенном примере протокола осмотра места ДТП образец, место столкновения транспортных средств. Помогите пожалуйста как должен состовляться протокол осмотра транспортного средства? Формы документов Бланки заявлений. Если же понятые, указанные в бланках протоколов на момент выявления. Протокол осмотра транспорта и проверки его технического состояния. Далее акт следует вложить в отдельную папку с другими такими же бланками и передать на. ПРОТОКОЛ досмотра транспортного средства. ПРОТОКОЛ ОСМОТРА ТРАНСПОРТНОГО СРЕДСТВА г. В протоколе фиксируется время осмотра, при каких погодных условиях он проводился, какое было освещение, какие применялись технические средства и какие. Приложение N 10 к Административному регламенту Министерства внутренних дел. О проведении осмотра транспортного средства и груза. Приложение 2 Бланк извещения о ДТП. Для того, чтобы определить необходимый объем послеаварийных восстановительных работ. Адвокат по ДТП предлагает ознакомиться с бланком осмотра транспортного средства. Полные тексты документов в последней редакции. В приведенном примере протокола осмотра места ДТП место столкновения транспортных средств. Требования к акту осмотра транспортного средства при автоэкспертизе. Удобный поиск законов, кодексов, приказов и других документов. Требование о передаче редакцией главным редактором средства массовой информации документов и материалов. Протокол досмотра транспортного средства. ПРОТОКОЛ осмотра принадлежащих юридическому лицу или индивидуальному предпринимателю помещений, территорий и. Предьявив акт осмотра транспортного средства, полученный в ГИБДД по месту фактического нахождения ТС, его можно предьявить. При покупке автомобиля в автосалоне дилер сам выдаст вам полный набор документов, необходимых для регистрации вашего нового транспортного средства. Протокол осмотра и проверки технического состояния транспортных средств фиксирует выявленные технические неисправности и повреждения автомобиля. Об осмотре транспортного средства наличие. Транспортного средства, в то время как термин осмотр означает. На самом деле понятым нередко предлагается подписать чистый бланк протокола осмотра. Кстати, протоколы осмотра транспортного средства дублируются договор продажи земли экранной утилитой в момент включения модификатора появляется. В протоколе о досмотре транспортного средства указываются дата и место его составления, должность, фамилия. Помогите найти заполненный бланк протокола снятия со стипендии студентов. Форма бланка протокола осмотра места происшествия. Протокол об отстранении от управления транспортным средством ст. Чтобы получить акта осмотра транспортного средства нужно. Скачать Бланк Протокол задержания транспортного средства. Фототаблица к протоколу осмотра места происшествия. Участвующим в осмотре места происшествия лицам также объявлено о применении технических средств фотоаппарата. ДОКУМЕНТАЦИЯ Бланки документации Форма акта осмотра транспортного средства. Законы и кодексы Российской Федерации. Бланк страхового полиса обязательного. Для осмотра транспортного средства на предприятии отдельным. Протокол изъятия должен быть составлен в двух экземплярах, один из которых передается представителю юридического. Эта процедура происходит с участием понятых и прилагается к бланку протокола в виде кассет, дискет, пленок. Обломанных и утерянных частей транспортных средств не обнаружено. К протоколу осмотра прилагаются заверенные. Осмотр принадлежащих юридическому лицу или. Документы, образцы протоколов, образцы постановлений, бланки документов, юридическая литература. Бланк протокола осмотра предметов документов. Установление технического состояния транспортного средства. При заключении договора обязательного страхования страховщик вправе провести осмотр транспортного средства по. Ветеринарные свидетельства являются бланками строгой. Транспортные средства осмотр и проверка технического состояния транспортных средств в отдельном протоколе Осмотр начат вчас. Согласно указанной норме законодательства осмотр транспортного средства производит следователь. На странице представлен образец бланка документа Акт технического освидетельствования крана. Владельцу предоставляется выписка из протокола установленного образца, с которым транспортное средство подается на государственный технический осмотр.К протоколу осмотра прилагаются схема

Образец ПРОТОКОЛ ОСМОТРА ТРАНСПОРТНОГО СРЕДСТВА в ред. Также в целях проведения более качественного и полного осмотра рекомендуется иметь при себе стандартный бланк протокола. Место хранения транспортного средства после осмотра с указанием лица, ответственного за его хранение. Помогите найти заполненную форму протокола осмотра транспортного средства. Паспорт транспортного средства 51 СМ автомашины Тайота Авенсис, черного цвета, 2004 года. К протоколу прилагается [перечень документов и справок. Водитель отвечает, что для досмотра необходимы два понятых и протокол досмотра. Акт осмотра транспортного средства ТС рекомендуемый образец заполнения. Копии протокола осмотра места совершения административного правонарушения вручаются лицам, непосредственно управлявшим транспортными средствами. Я ночью был задержан сотрудниками ГАИ, машина осталась на в. Произвела осмотр транспортного средства Мазда626, седан, 1998. Отказ водителя или граждан, сопровождающих грузы, от проведения осмотра транспортного средства и. Протокол осмотра и выемки почтово. Стоимость прохождения технического осмотра транспортного средства оплачивает F или иное лицо, если так. Однако недобросовестный инспектор после вашего отказа открыть багажник без протокола досмотра может. Если транспорт находится далеко от места регистрации, то акт осмотра транспортного средства можно предъявить в качестве документа, удостоверяющего. ПРОТОКОЛ осмотра места происшествия 20 г. Протокол осмотра транспортного средства составляется на каждый автомобиль и содержит сведения обо всех видимых механических повреждениях. Образец протокол осмотра транспортного средства. В ряде случаев акт осмотра транспортного средства может оказать существенное влияние на ход развития взаимоотношений между сторонами. Кроме того, из протокола допроса генерального директора Вермы Хитеш следует транспортных средств. Протокол допроса свидетеля Квинт.

Application Verification Testing на иммунофлуоресценцию (адгезия и суспензия) | Thermo Fisher Scientific

Компания Thermo Fisher Scientific занимается тестированием свойств и специфичности антител. Чтобы подтвердить это обязательство, каждое антитело Invitrogen, указанное для иммунофлуоресцентного применения, было протестировано с использованием протокола, аналогичного приведенному ниже. Эти тесты помогают подтвердить эффективность наших антител и помогают обеспечить превосходные результаты при использовании в ваших экспериментах.

Типичный протокол иммунофлуоресценции (как для прикрепленных, так и для суспензионных клеток), которому подвергаются антитела Invitrogen, воспроизводится ниже. Этот протокол включает:

Иммунофлуоресценцию для прикрепленных клеток

Иммунофлуоресценцию для суспензионных клеток

Примечание: Некоторые шаги в этом протоколе требуют оптимизации в зависимости от используемого образца и антител.

Протокол иммунофлуоресценции для прикрепленных клеток

Подготовка клеток для прикрепленных клеток

1. Семя 1–1.5 x10 ⁴ клеток на лунку 4-камерного предметного стекла в 500 мл питательной среды. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO ₂ .
2. Через 32–36 часов после посева клеток удалите среду для культивирования клеток и промойте клетки 3 раза, используя 500 мкл 1X PBS.

Фиксация

Параформальдегид в качестве фиксатора

1. Зафиксируйте клетки, используя 400 мкл 4% параформальдегида (pH 7,4) в течение 10 минут при 37 ° C.
2. Удалите раствор параформальдегида и промойте клетки 3 раза 500 мкл 1X PBS.

Метанол в качестве фиксатора

1. Зафиксируйте клетки, используя 400 мкл 100% ледяного метанола в течение 5 минут при –20 ° C.
2. Удалите метанол и трижды промойте клетки 500 мкл 1X PBS.

Повышение проницаемости

1. Добавьте 400 мкл 0,1% Triton X-100 в 1X PBS и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 мин.
2. Удалите Triton-X-100 и трижды промойте клетки 500 мкл 1X PBS.

Блокирование

Добавьте 500 мкл 2% BSA в 1X PBS и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 60 мин. (В качестве альтернативы, клетки можно инкубировать в течение ночи в 2% BSA или 1X PBS перед тем, как перейти к иммуноокрашиванию.)

Иммуноокрашивание

1. Добавьте к клеткам желаемую концентрацию первичных антител, разведенных в 500 мкл 0,1% BSA, и инкубируйте в течение 3 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
2. Удалите раствор первичных антител и трижды промойте клетки 500 мкл 1X PBS.
3. Добавьте желаемую концентрацию меченного флуоресцентным красителем вторичного антитела вместе с совместимым контрастным красителем для цитоскелета (например,g., родамин фаллоидин) и ядро ​​(DAPI) разводят в 500 мкл 0,1% BSA и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
4. Промойте клетки три раза 500 мкл 1X PBS-T.

Примечание: Используйте дополнительные лунки для контроля.

• Контроль № 1 — без антител, только с контрастными красителями.
• Контроль № 2 — только с вторичным антителом, меченным флуоресцентным красителем, без включения первичного антитела для проверки специфичности флуоресцентного окрашивания и во избежание артефактов, связанных с аутофлуоресценцией клеток.

  Примечание: Оптимизируйте концентрацию контрастных красителей, разведения первичных и вторичных антител, а также этапы фиксации, блокирования и промывки для достижения наилучших результатов.

Крепление

1. Высушите на воздухе покровное стекло / предметное стекло и добавьте монтажную среду (содержащую антифатер).
2. При желании закройте покровные стекла и визуализируйте целевой антиген с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол иммунофлуоресценции для суспензионных клеток

Подготовка клеток для суспензионных клеток

1. Центрифугируйте суспензию клеток при 1500 об / мин в течение 5 минут, удалите супернатант.
2. Вымойте клетки 1 мл 1X PBS и получите осадок центрифугированием при 1500 об / мин в течение 5 мин.

Фиксация

Параформальдегид в качестве фиксатора

1. Добавьте 700 мкл 4% параформальдегида (pH 7,4) к осадку клеток, тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут при 37 ° C с последующим центрифугированием при 1500 об / мин в течение 5 минут.
2. Удалите супернатант, добавьте к осадку 800 мкл 1X PBS и тщательно перемешайте. Центрифуга при 1500 об / мин в течение 5 мин.

Метанол в качестве фиксатора

1. Инкубируйте клетки с 700 мкл 100% ледяного метанола в течение 5 минут при –20 ° C с последующим центрифугированием при 1500 об / мин в течение 5 минут.
2. Удалите супернатант и тщательно перемешайте с 800 мкл 1X PBS и центрифугируйте при 1500 об / мин в течение 5 мин.

Проницаемость

1. Добавьте 700 мкл 0,1% Triton X-100 в 1X PBS и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут с последующим осаждением при 1500 об / мин в течение 5 минут.
2. Удалите супернатант и добавьте к осадку 800 мкл 1X PBS, тщательно перемешайте и центрифугируйте при 1500 об / мин в течение 5 мин.

Блокирующий

Добавьте 1 мл 2% BSA в 1X PBS для 3.5 миллионов ячеек. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 60 мин. (В качестве альтернативы, клетки можно инкубировать в течение ночи в 2% BSA или 1X PBS перед тем, как перейти к иммуноокрашиванию. )

Иммуноокрашивание

1. Добавьте к клеткам желаемую концентрацию первичных антител, разведенных в 500 мкл 0,1% BSA, и инкубируйте в течение 3 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
2. Удалите раствор первичных антител и трижды промойте клетки 500 мкл 1X PBS.
3. Добавьте желаемую концентрацию меченного флуоресцентным красителем вторичного антитела вместе с совместимым контрастным красителем для цитоскелета (например,g., родамин фаллоидин) и ядро ​​(DAPI) разводят в 500 мкл 0,1% BSA и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
4. Промойте клетки три раза 500 мкл 1X PBS-T.

Примечание: Используйте дополнительные лунки для контроля.

• Контроль № 1 — без антител, только с контрастными красителями.
• Контроль № 2 — только с вторичным антителом, меченным флуоресцентным красителем, без включения первичного антитела для проверки специфичности флуоресцентного окрашивания и во избежание артефактов, связанных с аутофлуоресценцией клеток.

  Примечание: Оптимизируйте концентрацию контрастных красителей, разведения первичных и вторичных антител, а также этапы фиксации, блокирования и промывки для достижения наилучших результатов.

Крепление

1. Высушите на воздухе покровное стекло / предметное стекло и добавьте монтажную среду (содержащую антифатер).
2. При желании закройте покровные стекла и визуализируйте целевой антиген с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол анализа мазка клеток ICC для суспензионных клеток: Novus Biologicals

1.6 клеток / мл, затем зафиксируйте путем добавления 4% параформальдегида непосредственно в культуральную среду в течение 20 минут при комнатной температуре.

2. Перенесите пипеткой 1 мл суспензии фиксированных клеток в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и вращайте клетки в течение 30 секунд.

3. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл дигидрата. Вращайтесь на максимальной скорости 30 секунд.

4. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 200 мкл дихлорметана.

5. Добавьте 5 мкл клеточной суспензии в покровное стекло, покрытое поли-L-лизином размером 22 мм x 22 мм (~ 3 пятна на предметное стекло), затем смажьте суспензию стороной кончика пипетки.

6. Дайте всей жидкости испариться, поместив покровные стекла на горячую пластину (выберите низкий уровень нагрева!).

7. Проверьте наличие кристаллов соли, поместив покровное стекло под микроскоп. Слегка промойте покровное стекло ди-водой, если присутствуют кристаллы.

8. Поместите покровные стекла в 6-луночные планшеты для тканевых культур оптического качества для немедленного использования или храните при 2-8 градусах Цельсия до 3 месяцев для будущих экспериментов.

Протокол флуоресцентного окрашивания ICC для мазков клеток

1.В зависимости от типа белка проницаемость клеток осуществляется следующим образом:

a. Для обнаружения ядерного или митохондриального белка добавьте 1 мл TBS с 0,5% Triton X-100. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре.
г. Если антитело специфично для обнаружения цитоплазматического или мембранного белка, добавьте 1 мл PBS с 0,5% Tween-20 в течение 10 минут при комнатной температуре.

2. Снимите буфер для повышения проницаемости и добавьте 1 мл PBS плюс 0,1% Tween-20, не позволяя образцу высохнуть. Перед тем, как перейти к этапу блокировки, промойте 3 раза по 5 минут.

3. Чтобы заблокировать неспецифическое связывание антител, инкубируйте в 10% нормальной сыворотке вторичного антитела хозяина в течение 1 часа при комнатной температуре.

4. Добавьте первичные антитела (разведенные в блоке: 10% нормальная сыворотка или подходящая) и инкубируйте в течение ночи при 4 градусах Цельсия.

5. Удалите первичное антитело и замените PBS. Промыть 3 раза по 5 минут в PBS с 0,1% Tween-20.

6. Добавьте вторичные антитела (разведенные в блоке: 10% нормальная сыворотка) в соответствующем разведении в соответствии с рекомендациями производителя. Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре.

7. Удалите антитела и замените PBS, промойте 1 x 5 минут в PBS с 0,1% Tween-20. Для второй промывки добавьте Hoechst 33258 в PBS в соотношении 1:25 000 и инкубируйте в течение 10 минут. Промыть третий раз, добавив фаллоидин в соотношении 1:40, разведенный в PBS с 0,1% Tween Tween-20, в течение 20 минут (всего 3 × 5 минут промывок PBS Tween-20).

8. Осторожно снимите покровные стекла с лунок и промокните их, чтобы удалить лишнюю воду. Нанесите 1 каплю монтажной среды против выцветания на предметное стекло микроскопа на покровное стекло.Установите покровное стекло так, чтобы клетки были обращены к предметному стеклу микроскопа, и закрепите края прозрачным лаком для ногтей.

9. Визуализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа и наборов фильтров, соответствующих используемой этикетке (см. Список ниже). Слайды также можно хранить в ящике для слайдов при температуре <-20 ° C для последующего изучения.

Флуоресцентные красители λabs (нм) λfl (нм)

Atto390 390 479
Atto425 436 484
Atto465 453 508
Atto488 501523
Atto532 532 553
Atto 6279 569 600 59 Atto 6279 627 563 657
Atto637 630 659
Atto655 663 684
Atto680 670 710
Atto700 700 725
DyLight 488 493518
FluoProbes®547H 557572
FluoProbes®647H 653675
FluoProbes®682 6

FluoProbes®752 748772
AMCA 346442
FITC 485 535
Rhodamine 544576
Суспензия одиночных клеток из твердых тканей для проточной цитометрии — Reichard — 2019 — Cytometry Part A

Подготовка единичных клеток является важной частью любого эксперимента по проточной цитометрии твердых тканей. Целью приготовления суспензии отдельных клеток является быстрое выделение клеток из тканей и их окраска или метка для получения методом проточной цитометрии, избегая при этом гибели и агрегации клеток. Эта процедура должна дать клеточную популяцию с высокой жизнеспособностью, минимальным клеточным дебрисом или агрегатами и сохранением антигенов клеточной поверхности для проточного цитометрического иммунофенотипирования, чтобы быть эффективным. 1. Основные шаги при приготовлении одиночной клеточной суспензии включают (i) увеличение площади поверхности начало твердого тканевого материала для максимального увеличения контакта между тканями и пищеварительными ферментами, (ii) переваривание внеклеточного матрикса путем введения этих ферментов в массы и (iii) расщепление межклеточных соединений.Эти шаги необходимо выполнять, обеспечивая при этом максимально возможное сохранение целостности клеток, поскольку суспензия отдельных клеток должна включать минимальное количество ДНК, высвобождаемой умирающими или фрагментированными клетками.

Эта статья посвящена препарату единичных клеток из твердых тканей. Жидкие ткани, содержащие гемопоэтические клетки, такие как кровь или костный мозг, могут быть относительно легко получены с использованием разделения в градиенте плотности или лизиса эритроцитов. Эти методы позволяют отделить лимфоциты или специфические мононуклеарные клетки от цельной крови или других жидких тканей с высоким выходом и чистотой.Однако приготовление суспензии единичных клеток из жидких тканей не является целью данной статьи.

Информация и процедуры, относящиеся к лучшим методам приготовления суспензии отдельных клеток специально для экспериментов с массовой цитометрией, были описаны 2. В этой статье основное внимание будет уделено лучшим методам только для экспериментов с проточной цитометрией.

Состав ткани

Ткани состоят из клеток, встроенных во внеклеточный матрикс, в котором соседние клетки прикреплены друг к другу через межклеточные соединения на клеточной мембране.

Внеклеточный матрикс

В организме все ткани и органы состоят из клеток, окруженных неклеточным компонентом, известным как внеклеточный матрикс. Функция внеклеточного матрикса заключается в обеспечении каркаса и структурной поддержки тканей, а также инициирования биохимических и биомеханических сигналов в каждой конкретной ткани 3. Внеклеточный матрикс состоит из компонентов, принадлежащих к трем основным категориям биологических молекул: коллагены, протеогликаны и гликопротеины 4, 5.

Коллагены — это самый распространенный волокнистый белок во внеклеточном матриксе. В результате коллагены являются основным структурным элементом этой матрицы, обеспечивая прочность на разрыв и регулируя клеточную адгезию. Коллагены также реагируют на биохимические сигналы во внеклеточном матриксе, поддерживая хемотаксис и миграцию, одновременно управляя развитием ткани. 6. Протеогликаны — это биологические молекулы, состоящие из белкового ядра, связанного с цепями гликозаминогликанов. Роли протеогликанов во внеклеточном матриксе включают организацию сборки матрикса, регулирование передачи сигналов цитокинов и факторов роста в тканях и активацию рецепторов клеточной поверхности, чтобы влиять на функцию и развитие клеток и целых органов 7.Обычные типы протеогликанов, обнаруживаемые в тканях, включают декорин, версикан и гиалуронан. Декорин и версикан присутствуют во всех тканях организма. Гиалуронан обнаружен в большинстве тканей, выступая в качестве структурного компонента и сигнальной молекулы, но не имеет ядра белка, что обычно указывает на протеогликаны 8, 7. Многие другие типы протеогликанов присутствуют только в определенных типах тканей по всему организму и поэтому не будут рассматриваться в данной статье. статья. Гликопротеины — это любой белок, состоящий из полипептидной цепи, присоединенной к углеводной группе.Одним из распространенных гликопротеинов, обнаруженных во внеклеточном матриксе, является фибронектин, который играет структурную роль, связываясь с коллагеном, тромбоспондином, интегринами, фибринами и гликозаминогликанами 9. Ламинин также вносит вклад в структуру внеклеточного матрикса, активно модулируя поведение связанных клеток в касательно адгезии, дифференцировки, миграции, стабильности фенотипа и устойчивости к апоптозу 5. Эластин является основным компонентом эластичных волокон во внеклеточном матриксе тканей и вносит основной вклад в эластичность этих волокон 10, 11.Эластин обычно содержится в коже, легких, связках, сухожилиях и тканях сосудов 12. Другие гликопротеины, обычно обнаруживаемые во внеклеточном матриксе, включают фибриноген, фибриллины, фибулины, тенасцины, тромбоспондины и белки олигомерного комплекса хряща 5.

Клеточная мембрана

Клеточная мембрана представляет собой бислой фосфолипидов, который служит гидрофобным барьером, окружающим клетку, защищая внутреннюю часть клетки и ее органеллы 13.Клеточная мембрана содержит различные мембранные белки, которые жизненно важны для развития и выживания клетки. Рецепторные белки облегчают передачу сигналов через клеточную мембрану, что позволяет клетке реагировать на сигналы из окружающей среды, в то время как каналы и белки-переносчики, встроенные в клеточную мембрану, обеспечивают прохождение определенных ионов внутрь или из клетки с использованием активных и пассивных процессов. 13, 14. Ферментные белки также присутствуют по всей клеточной мембране, катализируя химические реакции внутри клетки и вокруг нее.Выбор и концентрация пищеварительных ферментов жизненно важны при приготовлении суспензии отдельных клеток из твердых тканей для проточной цитометрии, поскольку рецепторы клеточной поверхности или мембранные белки могут быть расщеплены протеолитической активностью ферментов, таких как трипсин 15, что приводит к ложноотрицательным результатам при иммунофенотипировании. эксперименты.

Ячейка – Ячейка Соединения

Межклеточные соединения являются основным структурным и функциональным компонентом тканей, которые необходимо расщепить, чтобы приготовить единственную клеточную суспензию, которая даст полезные данные в эксперименте по проточной цитометрии.Три основные категории межклеточных переходов, которые имеют отношение к приготовлению одиночной клеточной суспензии, это (i) закрывающие соединения, (ii) сообщающиеся соединения и (iii) закрепляющие соединения. Окклюзионные соединения, обычно известные как плотные соединения, поддерживают непрерывное кольцевое уплотнение вблизи верхушки эндотелиальных и эпителиальных клеток 16. Эти соединения выглядят как серия дискретных участков очевидного слияния с клеточными мембранами соседних клеток 17. Плотные соединения присутствуют с вариациями. по структуре и состоят из трансмембранных белков, включая клаудины, белки семейства соединительных молекул адгезии, окклюдин, нектины и молекулы адгезии, селективные к эндотелиальным клеткам 16,18.Функция плотных контактов заключается в формировании барьера, который может контролировать движение воды и растворенных веществ через параклеточное пространство, одновременно поддерживая распределение ионных каналов, насосов и белков-носителей, присутствующих в клеточной мембране 17. Коммуникационные контакты, обычно известные как Щелевые соединения, функционируют, позволяя цитоплазматический обмен метаболитов и ионами между соседними клетками 19. Эти щелевые соединения состоят из белков innexin у беспозвоночных организмов и белков коннексина у позвоночных животных, где шесть белков коннексина объединяются, чтобы сформировать один коннексон 20. Якорные соединения включают адгезионные соединения, десмосомы и гемидесмосомы, которые действуют, опосредуя клеточную адгезию между соседними клетками и передавая внутриклеточные сигналы 18. Якорные соединения состоят из белков кадгерина и образуют структуру, подобную застежке-молнии, которая обеспечивает стабильную адгезию соседних клеток внутри ткани.

Дезагрегация тканей

Рубленые салфетки

После отделения твердых тканей от организма, перед введением пищеварительных ферментов, ткани следует промыть для удаления крови или другого нежелательного материала.Затем ткани следует измельчить и распределить ножницами, скальпелем или лезвием, чтобы увеличить общую площадь поверхности. Это увеличивает контакт между ферментами и поверхностью тканей, что приводит к более эффективному и полному пищеварению, сокращая время, необходимое для пищеварения.

Ферменты

Ткани удерживают клетки вместе, поддерживаемые внеклеточным матриксом и межклеточными соединениями, состоящими из разнообразного набора белков и других биологических молекул, которым требуются специфические ферменты для правильного переваривания и удаления из клеточной суспензии. Пищеварительные ферменты, которые играют важную роль в дезагрегации твердых тканей, приведены в таблице 1. Первая категория ферментов, которые следует учитывать, — это те ферменты, которые разрушают внеклеточный матрикс. Диспаза — это обычно используемая нейтральная протеаза, выделенная из бактерий, с высоким уровнем ферментативной специфичности в отношении коллагена IV и фибронектина 21, 22. Диспаза полезна для отделения колоний клеток и диссоциации кусочков ткани на небольшие скопления клеток, поскольку она работает, чтобы расщеплять связи между клетками и внеклеточным матриксом, не затрагивая межклеточные соединения 23.Однако следует проявлять осторожность при переваривании тканей диспазой, поскольку она способна расщеплять определенные соответствующие поверхностные молекулы или антигены, такие как те, которые связаны с анализом Т-клеток 24, 25. Таким образом, исключение диспазы из буфера для переваривания может быть полезным, если наблюдается потеря эпитопов. Также эффективна при дезагрегации внеклеточного матрикса коллагеназа. Коллагеназа способна разрушать пептидные связи, присутствующие в коллагене, что помогает переваривать внеклеточный матрикс, превращая клетки в суспензию.Важно отметить, что очищенные ферменты коллагеназы более эффективны, чем традиционная коллагеназа, полученная естественным путем из бактерий, поскольку в составе очищенного фермента меньше вариаций, что увеличивает стабильность клеток на протяжении всего процесса пищеварения тканей 26. Последний фермент, который следует учитывать при Переваривание внеклеточного матрикса в твердых тканях осуществляется гиалуронидазой. Гиалуронан, структурный протеогликан внеклеточного матрикса, разлагается ферментами семейства гиалуронидазы, которые продуцируются как в бактериальных, так и в позвоночных организмах.Эти ферменты гиалуронидазы расщепляют β1,4-гликозидную связь, присутствующую в гликозаминогликановой части гиалуронана 27, способствуя перевариванию внеклеточного матрикса.

Таблица 1. Пищеварительные ферменты при дезагрегации твердых тканей

Фермент	Назначение
Dispase	-Разрушает внеклеточный матрикс — Удаляет колонии клеток — Удаляет прикрепления между клетками и внеклеточным матриксом
Коллагеназа	-Разрушает внеклеточный матрикс — Разрывает пептидные связи, присутствующие в коллагене
Гиалуронидаза	-Разрушает внеклеточный матрикс — Разрывает гликозидные связи в гиалуронане
Папаин	-Разлагает белки, образующие плотные соединения между клетками
DNase-I	-Не деградирует-ДНК -Предотвращает агрегацию клеток
Accutase	-Протеолитическая, коллагенолитическая и ДНКазная активность
TrypLE	-Очищает межклеточные соединения — Не изменяет экспрессию антигена, как трипсин.

Следующая группа ферментов, которую следует учитывать при приготовлении суспензии одиночных клеток, включает ферменты, которые разрушают межклеточные соединения.Трипсин — это естественная протеаза, синтезируемая в пищеварительной системе позвоночных организмов. Хотя трипсин полезен для разрушения определенных белков, присутствующих в межклеточных соединениях, он также оказывает очень сильное воздействие на белки клеточной мембраны 1. Кроме того, было показано, что трипсин приводит к индуцированной свободной ДНК агрегации клеток, что указывает на лизис клеток. происходит внутри суспензии 28. Поэтому трипсин традиционно избегают при приготовлении суспензии отдельных клеток из твердых тканей для экспериментов по проточной цитометрии.Папаин — это альтернативная протеаза, полученная из растения папайя. Папаин, как известно, разрушает белки, образующие плотные соединения между клетками 29. Однако, как и трипсин, папаин, как было показано, приводит к индуцированной свободной ДНК агрегации клеток из-за лизиса клеток, который происходит во время ферментативного переваривания 28.

Последний тип фермента, который следует учитывать при приготовлении суспензии единичных клеток, — это дезоксирибонуклеаза (ДНКаза), которая расщепляет фосфодиэфирные связи остова ДНК.Двумя основными типами ДНКазы являются ДНКаза-I и ДНКаза-II, которые обладают немного разными ферментативными функциями. ДНКаза-II не подходит для приготовления суспензии отдельных клеток, поскольку она играет роль в опосредованных поглощением путях деградации ДНК, участвующих в апоптозе 30, 31. ДНКаза-I подходит для переваривания тканей и приготовления суспензии отдельных клеток, поскольку она предотвращает агрегацию клеток за счет разрушения свободной ДНК, высвобождаемой в результате лизиса мертвых клеток во время ферментативного расщепления, не инициируя пути апоптоза.Хлорид кальция (CaCl ₂ ) действует как активатор ферментов ДНКазы-I и поэтому вводится в коктейль для переваривания во время ферментативного переваривания. Ионы кальция (Ca ²⁺ ) прочно связываются с ферментом ДНКазой-I, чтобы стабилизировать его активную конформацию и обеспечить надлежащую деградацию свободной ДНК 32.

Чтобы избежать возможных проблем, вызванных добавлением вышеуказанных ферментов к коктейлю для пищеварения, были разработаны и оптимизированы коммерчески доступные коктейли для пищеварения.Аккутаза — это коммерчески доступная смесь протеазы и коллагеназы, которая имитирует действие трипсина и коллагеназы, но делает это в гораздо более низкой концентрации, чем это необходимо при использовании стандартных ферментов. Аккутаза содержит смесь ферментов с протеолитической, коллагенолитической и ДНКазной активностью и обеспечивает более высокий общий выход клеток и улучшенное общее сохранение антигена по сравнению с использованием коктейля аналогичных ферментов для переваривания тканей 33, 34. TrypLE — еще один коммерчески доступный коктейль ферментов, содержащий очищенные рекомбинантные ферменты, которые имитируют активность трипсина без изменения экспрессии антигенов клеточной поверхности 35. Этот продукт позволяет избежать проблем, возникающих при использовании трипсина при переваривании тканей, и позволяет повысить выживаемость клеток и более эффективное приготовление суспензии отдельных клеток.

Ферментативная и механическая диссоциация

Ферментативная диссоциация осуществляется путем введения коктейля для переваривания в измельченные твердые ткани и инкубации при определенных температурах в зависимости от используемого коктейля ферментов. Ферменты могут зависеть от температуры и, следовательно, работать с максимальной скоростью и эффективностью при заданной температуре, обычно 37 ° C.В зависимости от конкретных ферментов ферментативная диссоциация также может проводиться при 4 ° C или на льду. Эти более низкие температуры, вероятно, замедлят скорость реакции ферментов и увеличат инкубационный период, но могут помочь минимизировать гибель клеток. Сила фермента и концентрация фермента — два наиболее важных фактора, которые следует учитывать при выборе коктейля для пищеварения для приготовления суспензии отдельных клеток для проточной цитометрии. Ферменты с высокой активностью или высокой концентрацией могут поставить под угрозу маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, что может повлиять на доступность этих маркеров и жизнеспособность клеток в дальнейших экспериментах.Следовательно, слабо прилипшие клетки, такие как лимфоциты, должны быть изолированы с использованием короткого периода переваривания мягким или мягким ферментом, чтобы избежать этих проблем. 36. Определение оптимальной силы и концентрации ферментов, используемых при ферментативной диссоциации, является эмпирическим и имеет решающее значение для надлежащего выделения клетки и успешное переваривание тканей.

Механическая диссоциация играет роль в приготовлении суспензии отдельных клеток из твердых тканей на протяжении ферментативной диссоциации.Чтобы способствовать механической диссоциации тканей, посредством которой клетки высвобождаются из внеклеточного матрикса в суспензию, ферментативное расщепление можно проводить на орбитальном шейкере. После ферментативной диссоциации суспензию следует профильтровать, чтобы исключить любые непереваренные кусочки или агрегаты ткани из вновь приготовленной суспензии отдельных клеток.

Оценка суспензии отдельных клеток

Оценка суспензии отдельных клеток, полученных из твердых тканей, является важным шагом перед использованием клеток для эксперимента по проточной цитометрии.Три критических параметра для оценки последующей ферментативной и механической диссоциации твердых тканей: (i) жизнеспособность клеток, (ii) отсутствие клеточного дебриса и (iii) отсутствие агрегатов. Жизнеспособность клеток в суспензии отдельных клеток можно легко проверить с помощью анализа исключения жизнеспособности клеток трипанового синего, в котором мертвые клетки поглощают трипановый синий в свою цитоплазму, в то время как живые клетки сохраняют свою избирательно проницаемую мембрану и предотвращают попадание трипанового синего в цитоплазму 37.Затем можно оценить относительное количество живых и мертвых клеток в суспензии отдельных клеток с помощью световой микроскопии. Клеточный дебрис и клеточные агрегаты также можно быстро оценить с помощью световой микроскопии. Обработка суспензии отдельных клеток на проточном цитометре также настоятельно рекомендуется для оценки препарата отдельных клеток. Добавление ядерного красителя позволит отличить интактные клетки от клеточного дебриса, а включение красителя жизнеспособности позволит количественно определить процент мертвых клеток.

Повышение жизнеспособности и удаление клеточного мусора

Исключение клеточного дебриса и мертвых клеток из данных проточной цитометрии — лучший метод для точного и эффективного исследования интересующих типов клеток или антигенов. В ходе переваривания тканей и иммуноокрашивания суспензии отдельных клеток некоторые клетки погибнут в результате естественной гибели клеток, а также травм, вызванных ферментативной и механической диссоциацией. Высокая жизнеспособность клеток должна быть целью переваривания каждой ткани, но также необходимо предпринять шаги, необходимые для исключения из окончательной подготовки клеток тех клеток, которые действительно умирают и образуют дебрис. Одним из методов удаления обломков клеток и мертвых клеток из суспензии отдельных клеток является использование набора для удаления мертвых клеток для «очистки» популяции образцов перед запуском образцов на проточном цитометре. Эти наборы доступны от таких поставщиков, как Miltenyi Biotec Inc. (Оберн, Калифорния) и STEMCELL Technologies Inc. (Кембридж, Массачусетс), и в них используются микрошарики и буферы для специфического связывания для магнитной метки клеточного мусора, мертвых клеток или умирающих клеток, что позволяет отрицательный отбор этих нежелательных популяций посредством магнитной сепарации.

Криоконсервация суспензии одиночных клеток

Эксперименты по проточной цитометрии, включающие функциональные анализы, следует проводить вскоре после приготовления суспензии отдельных клеток или на криоконсервированных живых клетках. Возможные эффекты криоконсервации следует проверить в пилотных экспериментах. Для серийного анализа образцов в более поздний момент времени можно использовать мягкую фиксацию параформальдегидом, чтобы избежать изменения экспрессии или присутствия антигенов во время криоконсервации 1. Однако сама фиксация может влиять на антигенность, изменяя конформацию белка, поэтому распознавание антител также следует оценивать в пилотных экспериментах. Фиксация физически стабилизирует клетки в их текущем состоянии, предотвращая фрагментацию недавно мертвых клеток 38. Умеренная фиксация параформальдегидом также сохраняет свойства светорассеяния, критичные для гетерогенных популяций клеток, и помогает предотвратить слипание клеток вместе или с планшетом или пробиркой, в которых они находятся. окрашенный. Установлено, что фиксация особенно важна для хрупких / гетерогенных популяций, таких как единичные клетки легких 38.Криоконсервируемый живой / мертвый краситель следует нанести на клетки перед фиксацией, чтобы можно было различить эти две популяции во время анализа данных.

Общие подводные камни и соображения

Несколько типичных ошибок и подводных камней могут возникнуть в процессе приготовления суспензии отдельных клеток из твердых тканей для проточной цитометрии из-за неправильных методов. Эти неправильные методы (что нельзя) и соответствующие им передовые методы (Dos) приведены в таблице 2.Сравнительные данные между передовой практикой и неправильными методами с использованием анализа жизнеспособности трипанового синего и панели проточной цитометрии DRAQ5 и пропидия иодида (описанные ниже и в вспомогательном информационном файле S1) обобщены в таблице 3. Файлы исходных данных и рабочие области анализа для эксперимента проточной цитометрии доступны на FlowRepository.org, идентификатор эксперимента: FR-FCM-ZYQP.

Таблица 2. Приготовление суспензии единичных клеток: что и чего нельзя

Шаги протокола	Dos	Нельзя
Рассечение ткани	-Промыть PBS	— Салфетки для заморозки
Фарш	-Используйте скальпель, лезвие или ножницы для увеличения общей площади поверхности	-Используйте гомогенизатор тканей — Вихревые ткани
Ферментативное расщепление	-Определить оптимальную силу и концентрацию ферментов -Определить оптимальную температуру для пищеварения -Включить ДНКазу-I и ЭДТА в коктейль для пищеварения	-Используйте трипсин для оценки белков клеточной поверхности
Инкубация	-Используйте орбитальный шейкер для механической диссоциации	-Избыточный или недостаточный инкубатор пищеварительных ферментов
Фильтрация	-Удалить непереваренные кусочки или агрегаты тканей
Центрифугирование	-Используйте блоки RCF -Центрифуги клеток при RCF 300–900	-Используйте блоки RPM при использовании нескольких центрифуг
Ресуспензия	-Пипетка мягко -Избегайте пузырей	-Вихревые ячейки -Создание пузырей
Оценка	-Проверьте жизнеспособность клеток и оцените клеточную суспензию для определения общего выхода клеток, клеточного дебриса и агрегатов	-Перейти к препарату с низкой жизнеспособностью или высоким уровнем клеточного дебриса и агрегатов
Повышение жизнеспособности / вывоз мусора	-Используйте набор для очистки для удаления мусора и мертвых клеток -Используйте буфер для лизиса эритроцитов, если образец остается красным
Выбор материала	-Используйте полипропиленовые пробирки и планшеты, чтобы избежать адгезии клеток	-Используйте полистирольные трубки и пластины

Таблица 3. Сравнение правильных и неправильных техник

Лечение	Лучшая практика	Замороженные салфетки	Гомогенизатор тканей	Вихревые ячейки	В условиях переваривания	Переваривание
Урожайность	100% ± 0%	54.0% ± 6,0% *	50,0% ± 18% *	98,0% ± 9,2%	98,0% ± 3,5%	90,0% ± 21%
Жизнеспособность: анализ трипанового синего	81,3% ± 17%	33. 6% ± 3,8% *	53,7% ± 13% *	40,3% ± 8,7% *	67,3% ± 4,2%	47,4% ± 11% *
Агрегаты	0,3 ± 0,6	0.0 ± 0	0,0 ± 0	3,0 ± 1,0	50,7 ± 10 *	1,3 ± 1,2
Жизнеспособность: проточная цитометрия	75,1% ± 1,2%	46. 0% ± 1,9% *	60,3% ± 1,0% *	39,6% ± 1,8% *	72,2% ± 1,1%	26,1% ± 0,8% *
Обрывки и фрагменты клеток	6,8% ± 0,9%	7.1% ± 1,0%	1,3% ± 0,1% *	14,0% ± 1,8% *	9,2% ± 0,7% *	19,3% ± 0,6% *

• Использование животных было одобрено местным IACUC. Все эксперименты проводились с использованием мышей того же возраста и пола в левой доле легкого.Среднее значение ± стандартная ошибка трех экспериментов показано для каждого условия. (*) обозначает p <0,05 ( t -тест) по сравнению с Best Practice. Количество агрегатов определяли как количество на 100 нл объема (1 квадрат камеры гемоцитометра на глубине 0,1 мм). Урожай рассчитывается как (количество восстановленных клеток, специфичных для обработки) / (количество восстановленных клеток согласно передовой практике) * 100.

Замораживание рассеченных тканей методами медленного или мгновенного замораживания, как было показано, снижает общее восстановление клеток по сравнению с изоляцией клеток из свежих тканей 39.Это очевидно из сравнительных данных в таблице 3, где легочная ткань, которая хранилась при -80 ° C в течение 72 часов после вскрытия и перед перевариванием, показала снижение выхода клеток и снижение жизнеспособности клеток. Поэтому лучше всего по возможности изолировать и обрабатывать клетки из свежих тканей.

Принудительная механическая диссоциация с использованием гомогенизатора тканей не подходит для приготовления суспензии отдельных клеток, поскольку вместо этого создается бульон из компонентов клеток и тканей и предназначена для выделения белка для других методов анализа 40.Следовательно, клетки не будут оставаться жизнеспособными или неповрежденными при использовании этого метода, и следует избегать использования гомогенизатора тканей. Данные в таблице 3 показывают, что использование гомогенизатора ткани вместо измельчения ткани привело к снижению выхода и жизнеспособности клеток. Уменьшение относительного количества клеточного дебриса и фрагментов является результатом центрифугирования, которое происходило на протяжении всего протокола, во время которого дебрис и фрагменты, созданные гомогенизатором тканей, оставались в суспензии и были аспирированы.

Вихревые клетки — это еще одна форма активного обращения с клетками, которой следует избегать, чтобы сохранить жизнеспособность суспензии отдельных клеток и предотвратить распад клеток. Вихревание клеток привело к снижению жизнеспособности клеток и увеличению клеточного дебриса и агрегатов в экспериментах, представленных в таблице 3. Вместо встряхивания предпочтительнее нежное пипетирование для ресуспендирования клеток или клеточного осадка. Не менее важно избегать пузырьков в суспензии при дозировании.

Центрифугирование — еще одна область, в которой могут быть сделаны ошибки, приводящие к плохим результатам при суспендировании единичных клеток твердой ткани. Как правило, клетки следует центрифугировать при относительной центробежной силе (RCF) от 300 до 900, при этом RCF 900 больше подходит для фиксированных клеток, а более низкие значения силы используются для живых, нефиксированных клеток. Важно отметить, что эти значения представлены в относительной центробежной силе, а не в оборотах в минуту (RPM), поскольку RPM обозначает переменную силу, зависящую от радиуса ротора каждой конкретной центрифуги.Центрифугирование клеток на слишком высокой скорости может привести к компактному осаждению и повреждению клеточной мембраны, тогда как центрифугирование на слишком низкой скорости позволит клеткам оставаться в суспензии и погибнуть при аспирации супернатанта.

Было показано, что время инкубации в коктейле для переваривания играет роль в жизнеспособности и агрегации клеток в экспериментах, приведенных в Таблице 3. При переваривании, когда клетки удаляли из коктейля для переваривания через 20 минут, это приводило к увеличению агрегатов и увеличение клеточного дебриса и фрагментов.Избыточное переваривание, при котором клетки оставались в коктейле для переваривания в течение 5 часов, привело к значительному снижению жизнеспособности клеток, а также к увеличению клеточного дебриса и фрагментов в суспензии. Поэтому очень важно определить правильное время инкубации для конкретных пищеварительных ферментов и тканей, участвующих в каждом эксперименте.

Если возможно, незафиксированные клетки следует окрашивать на льду, чтобы сохранить жизнеспособность и избежать гибели клеток в процессе иммуноокрашивания.На протяжении всего процесса пищеварения все буферы должны содержать ДНКазу-I для разложения свободной ДНК, высвобождаемой лизированными клетками, предотвращая агрегацию клеток. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) представляет собой хелатирующий агент, который изолирует ионы двухвалентных металлов, в том числе те, которые необходимы для опосредованной интегрином клеточной адгезии к внеклеточному матриксу 41. Следовательно, включение ЭДТА в коктейль для переваривания важно для ограничения адгезии естественно адгезионных клеток, таких как эпителиальные клетки. клетки и макрофаги.

Выбор материала также играет роль в ограничении адгезии.Полипропиленовые пробирки или планшеты наиболее подходят для приготовления суспензии отдельных клеток из-за пониженного сродства между клетками и поверхностью полипропилена, что снижает вероятность прилипания клеток к трубке или планшету и их потери из суспензии 42. Полистирол предназначен для стимулирования клеточной адгезии и распространения, которых следует избегать в экспериментах по проточной цитометрии 43.

Проверка жизнеспособности клеток и оценка суспензии отдельных клеток на общий выход клеток и отсутствие клеточного дебриса и агрегатов очень важны перед попыткой сбора и анализа данных проточной цитометрии. Простой протокол с использованием окрашивания ядер (DRAQ5) и окрашивания жизнеспособности клеток (иодид пропидия) для этой цели доступен во вспомогательном информационном файле S1. Если суспензии клеток загрязнены избытком эритроцитов, следует использовать буфер для лизиса эритроцитов, чтобы удалить этот контаминант и убедиться, что в суспензии присутствуют только интересующие типы клеток для иммуноокрашивания и получения данных проточной цитометрией. Если используется, эту обработку следует применять ко всем образцам в эксперименте, чтобы процедура подготовки клеток была единообразной.Протокол создания буфера для лизиса эритроцитов, пригодного для этой цели, доступен во вспомогательном информационном файле S2.

Каждый эксперимент по проточной цитометрии фокусируется на конкретных типах клеток и интересующих антигенах в зависимости от целей исследования. Однако всегда следует принимать во внимание некоторые общие соображения, поскольку сама процедура диссоциации может влиять на изучаемые клетки и пути. Пользователи должны быть осторожны и подтвердить, что их протокол переваривания не влияет на экспрессию эпитопа для конкретных маркеров, изучаемых в их панели, поскольку некоторые ферменты могут изменять экспрессию некоторых маркеров, имеющих отношение к фенотипическому анализу 24.Для экспериментов, включающих обнаружение внутриклеточных цитокинов, рекомендуются ингибиторы транспорта белков для блокирования секреции цитокинов 44. Также было показано, что диссоциация ткани влияет на экспрессию РНК отчасти из-за повышающей регуляции микроРНК, которая играет роль в ограничении клеточной активности, когда клетка становится изолированной. из окружающей ткани 45. Это подавление РНК следует исследовать до оценки экспрессии РНК с помощью проточной цитометрии. Также могут быть включены ингибиторы РНКазы, чтобы избежать деградации представляющих интерес транскриптов РНК.Исследования фосфо-потока предназначены для измерения состояния фосфорилирования внутриклеточных белков путем изучения путей передачи сигналов киназ 46. Ингибиторы фосфатазы должны быть включены в коктейль ферментов для этих исследований, чтобы сохранить сигналы фосфорилирования и гарантировать точные результаты. Наконец, поврежденные клетки могут высвобождать протеазы, способные расщеплять интересующие эпитопы. Ингибиторы протеазы могут уменьшить потерю эпитопа при добавлении в коктейль для пищеварения.

Благодарности

Авторы благодарят Дэйва Шумика из Клинического центра медицинского искусства и фотографии Кливленда за его иллюстрацию к Рисунку 1, Джона Петерсона, доктора философии Исследовательского института Лернера Imaging Core за его помощь в создании изображений с помощью световой микроскопии для Рисунка 1, Джозеф Героу, Йена Кореки и Эрика Шульца из Центра проточной цитометрии Лернера за их помощь в контроле качества инструментов, а также Марио Алемагно, Мэтью Фримела, Николаса Ваннера и Келли Вайс за их отличную техническую помощь.

Критические шаги и устранение неисправностей при приготовлении суспензии единичных клеток из твердой ткани. Микроскопические изображения окрашены красителем живой / мертвой жизнеспособности (трипановый синий). Протокол окрашивания фигур проточной цитометрии доступен в вспомогательном информационном файле S1.

Навигация по каналам протокола отстранения от занятий в школе

Горячие новости в прессе: «Новый закон штата значительно сократил количество отстраненных от занятий учащихся…» [1] Это в значительной степени связано с принятием Государственного закона №08-160, «Закон о школьной учебной среде», который изменил обстоятельства, при которых школы в соответствии с законодательством штата могли отстранять своих учеников, вместо этого отдавая предпочтение отстранению от занятий в школе. [2] Таким образом, в течение 2010-2011 учебного года, «когда закон вступил в силу… количество случаев отстранения от занятий вне школы снизилось по всему штату на 19 процентов, или 9 835 инцидентов» [3]

.

Хотя «некоторые инциденты по-прежнему требуют приостановки», [директор школы Уотербери Кэтлин Уэллетт объяснила, что] она реализовала несколько инициатив, чтобы гарантировать, что учеников не отправят домой за незначительные нарушения, такие как нарушение дресс-кода, разговоры со своими учителями или пропуск занятий . «Мы пытаемся связаться с ними и вмешаться до того, как это дойдет до этого уровня».

Законодательный орган Коннектикута перечислил обстоятельства, при которых учащийся может быть отстранен от занятий: если он находится на территории школы или на мероприятии, спонсируемом школой, поведение нарушает установленную публичную политику школьного совета, серьезно нарушает учебный процесс или подвергает опасности людей или имущество. . [4] Если поведение имело место за пределами школы, школьный совет может принять решение об отстранении от занятий только при соблюдении обоих первых двух обстоятельств.

Предположим, ваш ребенок совершил преступление на территории школы, и школа рассматривает вопрос о приостановке. Что он должен учитывать? В соответствии с законодательством Коннектикута, чтобы определить, серьезно ли нарушит образовательный процесс такое поведение, ваш местный школьный совет должен учитывать, по крайней мере, следующее, хотя они не ограничиваются этими четырьмя факторами:

1. Произошел ли инцидент в непосредственной близости от школы
2. Были ли замешаны другие ученики школы, или была ли причастность к бандам
3. Было ли поведение связано с насилием, угрозой насилия или незаконным применением оружия… и были ли нанесены телесные повреждения
4. Было ли поведение связано с употреблением алкоголя

Как родитель, важно понимать, что вашего ребенка нельзя автоматически отстранить от занятий без неофициального административного слушания. Это связано с тем, что в деле Goss v. Lopez Верховный суд США объяснил важность соблюдения надлежащей правовой процедуры сценарием приостановки:

Среди прочего, государство обязано признать законное право учащегося на государственное образование в качестве имущественного интереса, который защищен Положением о надлежащей правовой процедуре и который не может быть лишен за ненадлежащее поведение без соблюдения минимальных процедур, требуемых [ Надлежащая правовая процедура] Статья. [5]

Таким образом, за исключением чрезвычайных обстоятельств, учащиеся, которым грозит отстранение (таким образом, временно теряют свою имущественную заинтересованность) «должны получить какой-то вид уведомления и предоставить какой-то вид слушания» [6], чтобы они знали, почему они отстранены и дали возможность рассказать свою точку зрения.Слушание — лучшее место для ученика, чтобы убедить школьную администрацию в том, что отстранение от занятий вне школы не является оправданным по какому-либо заданному количеству причин, таких как поведение, не квалифицируемое как запрещенное, отсутствие дисциплинарного прошлого, [7] или отстранение от занятий в школе в качестве жизнеспособной и разумной альтернативы.

Автор Линдси Э. Рабер, эсквайр.

Сложности, связанные с отстранением от занятий в школе и вне школы, могут быть трудными для понимания и потенциально могут привести к лишению учащегося защищенных прав.Таким образом, если вашему ребенку грозит отстранение от занятий, вам обязательно нужно знать все эти права и проконсультироваться с опытным практикующим школьным юристом. Если у вас есть какие-либо вопросы относительно школьной дисциплины или других вопросов, связанных с законодательством об образовании, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к адвокату Джозефу С. Майя, эсквайр. С ним можно связаться по адресу Maya Murphy, P.C., 266 Post Road East, Westport, Connecticut (расположенный в округе Фэрфилд), по телефону (203) 221-3100 или по электронной почте [email protected].

---

[1] «Показатели отчислений из школ снижаются, но ученики из числа меньшинств по-прежнему преобладают», — Жаклин Рабе Томас.2 октября 2012 г .: http://www.ctmirror.org/story/17615/school-suspension-rates-plummet-minority-students-still-overformed

[2] Общие законы Коннектикута, § 10-223c (g).

[4] Общий статут Коннектикута, § 10-223c (a)

[5] Госс против Лопеса , 419 U.S. 565, 574 (1975).

[7] Общий статут Коннектикута, § 10-223c (e)

Джейсон Спецца из Торонто Мэйпл Лифс внесен в протокол COVID-19 после того, как дисквалификация сокращена до четырех игр

Комиссар НХЛ Гэри Беттман сократил дисквалификацию центрового Торонто Мэйпл Лифс Джейсона Спецца с шести до четырех за удар головой защитнику Виннипег Джетс Нилу Пионк в декабре.5.

Спецца был дисквалифицирован на шесть игр Департаментом безопасности игроков, который назвал хит «безрассудным» и сослался на травму Пионка. Спецца пропустил четыре игры и имел право сыграть в субботу на «Ванкувер Кэнакс», но с тех пор попал в протокол НХЛ по COVID-19 вместе с нападающим Уэйном Симмондсом.

Поскольку дисквалификация длилась более пяти игр, NHLPA и Spezza имели право подать апелляцию к Беттману, а затем к нейтральному арбитру, если это необходимо.Апелляционное слушание с Беттманом состоялось во вторник.

NHLPA утверждала, что Спецца не нарушил Правило 50 в отношении колен, потому что Пионк присел на льду, пытаясь переместить шайбу своей перчаткой во время столкновения. Он также утверждал, что дисквалификация была чрезмерной — не только в отношении других случаев дисквалификации за колено, но и в отношении игрока, который провел 1203 игры в регулярном сезоне без дисквалификации, штрафа или даже предупреждения НХЛ по причинам на льду.

По первому аргументу Беттман сказал, что очевидны доказательства того, что Спецца нарушил правило НХЛ о коленях, сказав, что «контакт с г.Голова Пионка не была случайной, и ее можно было избежать ».

Но Беттман сказал, что сокращение дисквалификации было« основано в первую очередь на неоспоримом факте », что у Спеццы был« замечательный рекорд чистой игры за 19 сезонов ». История дополнительной дисциплины игрока является фактором, определяющим продолжительность дисквалификации.

В то время как нападающий Джеймс Нил был дисквалифицирован в пяти играх за удар головой нападающего «Бостон Брюинз» Брэда Маршана в 2013 году, Беттман отметил, что это было сочтено преднамеренным. Действия Спеццы были сочтены «безрассудными», а не в качестве возмездия за удар Пионка по защитнику Расмусу Сандину ранее в той игре 5 декабря.

Еще одним фактором снижения бана на шесть игр было здоровье Пионка. Беттман отметил, что серьезность травмы не была ясна Департаменту безопасности игроков на момент принятия решения, за исключением того, что он знал, что это, как сообщается, сотрясение мозга.

«К счастью, травма г-на Пионка была менее серьезной, чем могла бы быть в противном случае. Впоследствии он был допущен к участию в игре 1 декабря.14, и он пропустил только три игры, две из которых были бы пропущены в любом случае из-за его собственной дисквалификации », — сказал Беттман, имея в виду дисквалификацию на две игры, которую Пионк получил за то, что ударил Сандина коленом.

В целом, Беттман сказал о поведении Спеццы. был «серьезным, но изолированным отклонением» от его обычного стиля игры.

«Дисквалификации на четыре игры достаточно, чтобы гарантировать, что такое поведение не будет повторяться», — сказал Беттман. дисквалификации, выданные Департаментом безопасности игроков или отделом хоккейных операций.В 2012 году он сократил количество заключительных 12 игр из 25-ти игр дисквалификации Раффи Торреса до восьми. В 2014 году он уменьшил запрет на Даниэля Карсилло за то, что дважды появлялся в плей-офф, чтобы толкнуть лайнсмена локтем: с 10 до шести.

Антонио Браун и Майк Эдвардс отстранены по протоколу COVID-19

ТАМПА, штат Флорида — В четверг НФЛ объявила, что приемные Антонио Брауна и Майк Эдвардс на флангах Tampa Bay Buccaneers были приостановлены на три игры за нарушение протоколов COVID-19 NFL-NFLPA. .

Третий игрок, свободный агент Джон Франклин, III, также был дисквалифицирован на три игры за нарушение протокола.

По данным лиги, Ассоциация игроков НФЛ провела совместную с лигой проверку утверждений о том, что игроки исказили свой статус вакцинации в соответствии с протоколами лиги COVID-19. Обзор подтвердил обвинения, согласно заявлению лиги.

В совместном заявлении лиги и NFLPA говорится: «Здоровье и безопасность игроков и персонала — наш главный приоритет. Протоколы были разработаны совместно с нашими экспертами, чтобы обеспечить максимальную безопасность тренировок и игр в футбол во время продолжающейся пандемии. NFL-NFLPA совместно усиливают свою приверженность и дополнительно подчеркивают важность строгого соблюдения протоколов для защиты благополучия всех, кто связан с NFL ».

Браун был ключевым игроком Bucs, когда он был на поле , но он боролся с травмами в последние недели.Эдвардс уже третий год является сильным защитником с Bucs с 25 отбором мяча, 1 форсированным фамблом и 3 перехватами за сезон.

Дисквалификации за нарушение протокола были назначены всего через несколько недель после того, как кандидат MVP лиги, квотербек Green Bay Packers Аарон Роджерс был оштрафован за то, что он был иммунизирован, но так и не получил вакцину от COVID-19. Роджерс пропустил время в протоколе COVID-19 после положительного результата теста на болезнь, но его не отстранили.

Лига заявила, что Браун, Эдвардс и Франклин приняли свои дисквалификации, которые начинаются немедленно. В следующий раз Браун и Эдвардс смогут сыграть в конце декабря.

Bucs опубликовали в Твиттере сообщение о приостановке.

ОБНОВЛЕНИЕ:
Согласно заявлению, полученному Яном Рапопортом из NFL.com от адвоката Антонио Брауна, Шона Берстина, Браун вакцинирован и будет использовать свободное время для реабилитации своей травмы лодыжки.

Подсчет клеток с помощью гемоцитометра

Протокол для получения количества жизнеспособных клеток из суспензии клеток с использованием гемоцитометра (6:51 мин).

Чтобы узнать о других видеопротоколах, посетите нашу библиотеку протоколов здесь.

Распечатать этот протокол

---


Подготовка гемоцитометра
1. При использовании стеклянного гемоцитометра и покровного стекла очистите его спиртом перед использованием. Смочите покровное стекло водой и прикрепите к гемоцитометру. Наличие колец рефракции Ньютона под покровным стеклом указывает на надлежащую адгезию.
2. При использовании одноразового гемоцитометра (например, INCYTO DHC-N01) просто извлеките его из упаковки перед использованием.

Приготовление клеточной суспензии

Асептический метод предотвращает загрязнение культур клеток и реагентов микроорганизмами.Посмотрите наш видео-протокол по асептической технике, в котором показано, как стерилизовать рабочие зоны и использовать соответствующие методы стерильного обращения, средства индивидуальной защиты и соблюдение правил гигиены.

1. Осторожно покрутите колбу, чтобы клетки распределились равномерно.
2. Прежде чем клетки успеют осесть, возьмите 0,5 мл клеточной суспензии с помощью стерильной пипетки на 5 мл и поместите в пробирку Эппендорфа.
3. Возьмите 100 мкл клеток в новую пробирку Эппендорфа и добавьте 400 мкл 0,4% трипанового синего (конечная концентрация 0.32%). Осторожно перемешайте.

Таблица 1. Объем DPBS и трипсин-EDTA, необходимый для трипсинизации адгезивных клеток.

T-flash (см 2 )	DPBS (мл)	Трипсин-EDTA (мл)	Среда, содержащая FBS, необходимая для нейтрализации трипсина
25	2	6
80	3	3	9
175	5	5	15


L Подсчетное отверстие 9007 9007 -обрабатывают клеточную суспензию и наносят на гемоцитометр.При использовании стеклянного гемоцитометра очень осторожно заполните обе камеры под покровным стеклом, чтобы суспензия клеток могла вытягиваться за счет капиллярного действия. При использовании одноразового гемоцитометра внесите пипетку суспензию клеток в лунку счетной камеры, позволяя капиллярам втягивать ее внутрь.
1. С помощью микроскопа сфокусируйтесь на линиях сетки гемоцитометра с 10-кратным увеличением.
2. Используя ручной счетчик, подсчитайте живые, неокрашенные клетки (живые клетки не поглощают трипановый синий) в одном наборе из 16 квадратов (рис. 1).При подсчете используйте систему, при которой клетки считаются только тогда, когда они расположены внутри квадрата или на правой или нижней граничной линии. Следуя тем же рекомендациям, мертвые клетки, окрашенные трипановым синим, также могут быть подсчитаны для оценки жизнеспособности, если это необходимо.
3. Переместите гемоцитометр к следующему набору из 16 угловых квадратов и продолжайте подсчет, пока не будут подсчитаны все 4 набора из 16 углов.

Жизнеспособность

Чтобы вычислить количество жизнеспособных клеток / мл:

1. Возьмите среднее количество клеток из каждого из наборов из 16 угловых квадратов.
2. Умножить на 10,000 (10 ⁴ ).
3. Умножьте на 5, чтобы внести поправку на разбавление 1: 5 от добавки трипанового синего.

Конечным значением является количество жизнеспособных клеток / мл в исходной клеточной суспензии.

Пример:

• Если количество ячеек для каждого из 16 квадратов было 50, 40, 45, 52, среднее количество ячеек было бы:
• (50 + 40 + 45 +52) ÷ 4 = 46,75
• 46,75 x 10 000 (10 ⁴ ) = 467 500
• 467 500 x 5 = 2337 500 живых клеток / мл в исходной клеточной суспензии

Для расчета жизнеспособности:

Если количество живых и мертвых клеток было зарегистрировано для каждого набора из 16 угловых квадратов можно рассчитать оценку жизнеспособности.

1. Сложите количество живых и мертвых клеток, чтобы получить общее количество клеток.
2. Разделите количество живых клеток на общее количество клеток, чтобы рассчитать процент жизнеспособности.

Рис. 1. Линии сетки гемоцитометра.
Схема гемоцитометра, показывающая один из наборов из 16 квадратов, которые следует использовать для подсчета.

Стенограмма вебинара

Подсчет клеток позволяет точно определять количество клеток и, следовательно, согласованность между экспериментами. В этом видео будет описана процедура подсчета как суспензионных, так и адгезионных клеток с помощью гемоцитометра.

Перед началом работы тщательно опрыскайте внутреннюю часть защитного шкафа с ламинарным потоком дезинфицирующим средством и протрите тканью. Выбрасывайте использованные салфетки в соответствующий контейнер для мусора. Затем обрызгайте внутреннюю часть вытяжки 70% этанолом и протрите тканью. Теперь вытяжка чистая и готова к использованию. Извлеките среду для культивирования клеток и трипсин из холодильника и поместите в увлажненный инкубатор с углекислым газом при температуре 37 ° C, чтобы он нагрелся.Тем временем посмотрите на клетки, которые нужно подсчитать, с помощью микроскопа, чтобы проверить наличие каких-либо визуальных признаков бактериального и грибкового загрязнения. Перед помещением в защитный шкаф с ламинарным потоком опрыскайте бутыли и пипетки с 70% этанолом.

Для суспензии клеток осторожно встряхните колбу, чтобы клетки хорошо перемешались. Прежде чем они успеют осесть, возьмите 0,5-миллилитровый образец клеточной суспензии и внесите пипеткой в ​​стерильную пробирку Эппендорфа. Для адгезионных клеток удалите существующие среды, промойте PBS комнатной температуры и добавьте трипсин EDTA, чтобы отделить клетки.В таблице 1 указаны требуемые объемы PBS и трипсина. Инкубируйте клетки в течение двух-пяти минут в увлажненном инкубаторе с углекислым газом при 37 ° C. Время инкубации необходимо будет оптимизировать в соответствии с типом клеток. Когда все клетки отделены, нейтрализуйте трипсин EDTA теплой средой для выращивания, содержащей сыворотку, подходящей для клеток и культуры. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о требуемых объемах.

Ресуспендируйте клетки, осторожно пипетируя суспензию клеток вверх и вниз три раза и перенося их в 50-миллилитровую пробирку.Центрифуга клеточной суспензии в течение пяти минут при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Удалите супернатант с помощью стерильной серологической пипетки и повторно суспендируйте клеточный осадок в сыворотке с температурой 37 ° C, содержащей питательную среду, до исходного объема исходной культуры. С помощью стерильной пипетки объемом пять миллилитров возьмите 0,5-миллилитровую пробу клеточной суспензии и перенесите в стерильную пробирку Эппендорфа.

Чтобы начать подсчет, подготовьте одноразовый гемоцитометр. С помощью пипетки P2000 Gilson Pipette возьмите 100 микролитров суспензии и добавьте 400 микролитров трипанового синего, примечание, 0.08% и хорошо перемешайте. Возьмите 100 микролитров суспензии клеток трипанового синего и осторожно внесите пипеткой каплю суспензии в лунку счетной камеры, позволяя капиллярному действию втягивать образец. Будьте осторожны, чтобы не переполнить счетную камеру. Просмотрите область подсчета под 10-кратным увеличением с помощью инвертированного микроскопа. С помощью микроскопа сфокусируйтесь на одной из сеток четыре на четыре на гемоцитометре и подсчитайте клетки, отрицательные по трипановому синему. Эти жизнеспособны.Также обратите внимание на то, сколько клеток было положительным по трипановому синему. Эти клетки мертвы, и это число может быть использовано позже для расчета процента жизнеспособности культуры, если это необходимо.

При подсчете используйте систему, при которой клетки подсчитываются только тогда, когда они находятся в пределах квадрата, либо на правой, либо на нижней граничной линии. Запишите количество клеток, подсчитанных в этом наборе из 16 квадратов, и перемещайте гемоцитометр, пока не будут подсчитаны все четыре набора из 16 квадратов на гемоцитометре и их значения не будут записаны.Чтобы рассчитать концентрацию клеток, возьмите среднее количество жизнеспособных клеток в четырех наборах по 16 квадратов и умножьте на 10 000, чтобы получить количество клеток на миллилитр. Затем умножьте это на пять, чтобы внести поправку на разведение один к пяти от добавления трипанового синего. Это окончательное значение представляет собой количество жизнеспособных клеток на миллилитр в исходной клеточной суспензии.

Например, если количество жизнеспособных клеток составляет 200 000 клеток на миллилитр в объеме 20 миллилитров, и вы хотите, чтобы в новую колбу помещалось 10 000 клеток, то вам необходимо перенести один миллилитр суспензии клеток в новую колбу.