П 4 ст 69 нк рф: Статья 69 НК РФ. Требование об уплате налога, сбора, страховых взносов

Содержание

Статья 69 НК РФ. Требование об уплате налога, сбора, страховых взносов

1. Требованием об уплате налога признается извещение налогоплательщика о неуплаченной сумме налога, а также об обязанности уплатить в установленный срок неуплаченную сумму налога.2. Требование об уплате налога направляется налогоплательщику при наличии у него недоимки.

При наличии недоимки по налогу на прибыль организаций по консолидированной группе налогоплательщиков требование об уплате налога направляется ответственному участнику этой группы.

3. Требование об уплате налога направляется налогоплательщику независимо от привлечения его к ответственности за нарушение законодательства о налогах и сборах.4. Требование об уплате налога должно содержать сведения о сумме задолженности по налогу, размере пеней, начисленных на момент направления требования, сроке исполнения требования, а также мерах по взысканию налога и обеспечению исполнения обязанности по уплате налога, которые применяются в случае неисполнения требования налогоплательщиком. Требование об уплате налога, направляемое физическому лицу, должно содержать также сведения о сроке уплаты налога, установленном законодательством о налогах и сборах.

Во всех случаях требование должно содержать подробные данные об основаниях взимания налога, а также ссылку на положения законодательства о налогах и сборах, которые устанавливают обязанность налогоплательщика уплатить налог.

В случае, если размер недоимки, выявленный в результате налоговой проверки, позволяет предполагать факт совершения нарушения законодательства о налогах и сборах, содержащего признаки преступления, в направляемом требовании должно содержаться предупреждение об обязанности налогового органа в случае неуплаты сумм недоимки, пеней и штрафов в полном объеме в установленный срок направить материалы в следственные органы для решения вопроса о возбуждении уголовного дела.

Требование об уплате налога должно быть исполнено в течение восьми дней с даты получения указанного требования, если более продолжительный период времени для уплаты налога не указан в этом требовании.5. Утратил силу. — Федеральный закон от 27.12.2018 N 546-ФЗ.6. Требование об уплате налога может быть передано руководителю организации (ее законному или уполномоченному представителю) или физическому лицу (его законному или уполномоченному представителю) лично под расписку, направлено по почте заказным письмом, передано в электронной форме по телекоммуникационным каналам связи или через личный кабинет налогоплательщика. В случае направления указанного требования по почте заказным письмом оно считается полученным по истечении шести дней с даты направления заказного письма. Форматы и порядок направления налогоплательщику требования об уплате налога в электронной форме по телекоммуникационным каналам связи устанавливаются федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным по контролю и надзору в области налогов и сборов.7. Утратил силу. — Таможенный кодекс РФ от 28.05.2003 N 61-ФЗ.8. Правила, предусмотренные настоящей статьей, применяются также в отношении требований об уплате сборов, страховых взносов, пеней, штрафов, процентов, предусмотренных главой 9 настоящего Кодекса, и распространяются на требования, направляемые плательщикам сборов, плательщикам страховых взносов и налоговым агентам.

КонсультантПлюс: примечание.

10. Указанное в пункте 2.1 статьи 70 настоящего Кодекса требование об уплате страховых взносов может быть обжаловано только в случае нарушения налоговым органом процедуры его направления плательщику страховых взносов.

КонсультантПлюс: примечание.

О выявлении конституционно-правового смысла ст. 70 см. Постановление КС РФ от 24.03.2017 N 9-П.

Налоговое требование извещает плательщика о том, что у него образовалась задолженность. Оно отправляется налоговой службой в виде документа, в котором указан срок погашения налогового долга. Ст 69 НК РФ не отвечает на вопрос о том, будет ли считаться документ действительным, если в нём неверно указано название самого налога. Поэтому законодательство в этом спектре толкуется по разному. Есть две противоположные судебные позиции. Приверженцы первой считают, что налоговое требование должно быть заполнено правильно. Если в нём указано недостоверное наименование налога, то это признаётся нарушением. Налоговое требование, выставленное с нарушением, подлежит отмене. Приверженцы второй позиции считают неверное название налога недостаточным основанием для отмены налогового требования, признавая важным лишь сам факт наличия недоимки перед Налоговой службой. Итак, судьи не едины во мнениях, поэтому свою правоту при возникновении спора сторонам придётся доказывать.

По п 1 ст 69 НК РФ налоговое требование — это извещение, направленное плательщику, в котором говорится о его долге по налогам и необходимости уплатить его в определённый срок. В Налоговом кодексе нигде не указано, что именно в самом требовании об уплате налога должен быть написан адрес плательщика налога. Но при этом ФНС РФ утверждена форма требования об уплате налога, штрафа, пени и процентов, которая содержит графу для указания адреса налогоплательщика — организации или ИП. Сложно поспорить вот с чем: чтобы иметь возможность добровольно и в срок выполнить налоговое требование, плательщику нужно его получить. Поэтому оно должно быть отправлено по нужному адресу. При этом направление по почте — не единственный метод доставки требования. По п 6 ст 69 НК РФ оно может быть передано также и лично под расписку, и в электронной форме. Когда требование отправляется по почте заказным письмом, оно считается полученным адресатом в течение 6 дней после отправки. В самом требовании может быть написан неверный адрес, но, если это не повлияло на его получение плательщиком в срок, то, по мнению некоторых судей, такого основания недостаточно для отмены требования. Факт неверного указания адреса не имеет юридического значения, если требование находится на руках у налогоплательщика, и у него есть время на добровольное его исполнение. Недействительным требование с неверно указанным адресом может быть признано лишь тогда, когда плательщик лишился возможности это требование получить. Работники налоговой службы, должны исполнять свои обязанности, строго соблюдая требования НК РФ и ФЗ о налогах и сборах. По мнению большинства судов, если требования направлены ненадлежащим образом, то и обязанности у плательщика уплатить сумму по этому требованию не возникает. Порядок направления требования утвержден ст 46 и ст 69 НК РФ. Если этот порядок нарушен, то неверным будет и решение о принудительном взыскании, вынесенное налоговым органом. Итак, если адрес плательщика написан в требовании неправильно и это послужило причиной его неполучения в срок, то это налоговое требование может быть признано судом недействительным, также как и все последующие меры по взысканию налога. В случае же, когда несмотря на ошибочный адрес требование дошло в срок до своего получателя, суд может встать на сторону налогового органа, признав документ законным.

Ст. 69 НК РФ. Требование об уплате налога, сбора, страховых взносов

2. Требование об уплате налога направляется налогоплательщику при наличии у него недоимки.

3. Требование об уплате налога направляется налогоплательщику независимо от привлечения его к ответственности за нарушение законодательства о налогах и сборах.

4. Требование об уплате налога должно содержать сведения о сумме задолженности по налогу, размере пеней, начисленных на момент направления требования, сроке исполнения требования, а также мерах по взысканию налога и обеспечению исполнения обязанности по уплате налога, которые применяются в случае неисполнения требования налогоплательщиком. Требование об уплате налога, направляемое физическому лицу, должно содержать также сведения о сроке уплаты налога, установленном законодательством о налогах и сборах.

5. Утратил силу. — Федеральный закон от 27.12.2018 N 546-ФЗ.

6. Требование об уплате налога может быть передано руководителю организации (ее законному или уполномоченному представителю) или физическому лицу (его законному или уполномоченному представителю) лично под расписку, направлено по почте заказным письмом, передано в электронной форме по телекоммуникационным каналам связи или через личный кабинет налогоплательщика. В случае направления указанного требования по почте заказным письмом оно считается полученным по истечении шести дней с даты направления заказного письма.

Форматы и порядок направления налогоплательщику требования об уплате налога в электронной форме по телекоммуникационным каналам связи устанавливаются федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным по контролю и надзору в области налогов и сборов.

7. Утратил силу. — Таможенный кодекс РФ от 28.05.2003 N 61-ФЗ.

8. Правила, предусмотренные настоящей статьей, применяются также в отношении требований об уплате сборов, страховых взносов, пеней, штрафов, процентов, предусмотренных главой 9 настоящего Кодекса, и распространяются на требования, направляемые плательщикам сборов, плательщикам страховых взносов и налоговым агентам.

9. Утратил силу с 1 января 2007 года. — Федеральный закон от 27.07.2006 N 137-ФЗ.

См. все связанные документы >>>

Комментируемая статья закрепляет процедуру, согласно которой при наличии у налогоплательщика сумм налогов (сборов), пеней, штрафов, не уплаченных в установленный срок, налоговый орган направляет ему требование.

Неисполнение или ненадлежащее исполнение налогоплательщиком обязанности по уплате налога является основанием для направления налоговым органом налогоплательщику требования об уплате налога, которое является началом процедуры принудительного взыскания в порядке, предусмотренном статьями 46, 47 НК РФ. Направление требования об уплате налога является обязательной стадией, предшествующей принятию решения о взыскании налогов, пеней за счет денежных средств на счетах налогоплательщика. При этом решение о взыскании налога, пени, штрафа за счет денежных средств налогоплательщика (статья 46 НК РФ) не может быть принято ранее истечения срока для добровольного исполнения требования, который согласно пункту 4 статьи 69 НК РФ начинает течь с даты получения требования налогоплательщиком.

Такая позиция подтверждается Постановлением ФАС Московского округа от 23.07.2012 N А40-12689/12-116-24.

Пункт 4 статьи 69 НК РФ регламентирует содержание такого требования.

Однако нарушение данных положений само по себе не может служить основанием для признания недействительным требования налоговой инспекции.

Требование об уплате недоимок, пеней, штрафов может быть признано недействительным, если оно не соответствует фактической обязанности налогоплательщика по их уплате.

На это указано в Постановлении ФАС Московского округа от 12.10.2012 N А40-128628/11-75-511.

В пункте 52 Постановления Пленума ВАС РФ от 30.07.2013 N 57 «О некоторых вопросах, возникающих при применении арбитражными судами части первой Налогового кодекса Российской Федерации» разъяснено, что пунктом 4 статьи 69 НК РФ определен перечень сведений, которые должно содержать требование об уплате налога.

При рассмотрении споров о признании такого требования недействительным по мотиву неуказания в нем каких-либо из перечисленных сведений судам необходимо учитывать следующее.

В основе требования об уплате налога лежит либо решение, принятое по результатам рассмотрения материалов налоговой проверки, либо представленная налогоплательщиком налоговая декларация, либо налоговое уведомление.

Поэтому требование об уплате налога не может быть признано недействительным в связи с отсутствием в нем сведений, указанных в пункте 4 статьи 69 НК РФ, если такие сведения содержатся соответственно в решении, налоговой декларации, налоговом уведомлении и на эти документы имеется ссылка в данном требовании.

С учетом положений пункта 3 статьи 58 НК РФ аналогичный подход применяется и к требованию об уплате авансовых платежей по налогу.

Приказом ФНС России от 16.04.2012 N ММВ-7-8/238@ утверждены формы требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа (для организаций, индивидуальных предпринимателей), а также требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа (для физических лиц, не являющихся индивидуальными предпринимателями).

Если в требовании нет реквизитов решения налогового органа, принятого по результатам налоговой проверки, то это влечет отсутствие в требовании необходимых указаний, позволяющих определить конкретные налоговые обязательства предприятия, противоречит статье 69 НК РФ и нарушает права налогоплательщика.

Данная позиция изложена в Постановлении Десятого арбитражного апелляционного суда от 25.03.2009 N А41-22682/08.

В НК РФ не указано, является ли требование об уплате пени незаконным, если в нем не указан размер недоимки, на которую были начислены пени, а также если в нем не указан срок возникновения недоимки.

Как разъяснено в Постановлении ФАС Московского округа от 25.04.2012 N А40-128939/10-90-730, в соответствии со статьей 69 НК РФ, пунктом 19 Постановления Пленума ВАС РФ от 28.02.2001 N 5 «О некоторых вопросах применения части первой Налогового кодекса Российской Федерации» отсутствие в требовании суммы недоимки, на которую начислены пени, а также других необходимых данных является существенным нарушением прав и интересов налогоплательщика, влекущим отмену требования.

В Постановлении от 11.07.2012 N Ф03-2590/2012 ФАС Дальневосточного округа пришел к выводу, что в силу правовых норм, содержащихся в статьях 46 и 75 НК РФ, уплату пеней следует рассматривать как дополнительную обязанность налогоплательщика, помимо обязанности по уплате налога, исполняемую одновременно с обязанностью по уплате налога либо после исполнения последней. Исполнение обязанности по уплате пеней не может рассматриваться в отрыве от исполнения обязанности по уплате налога, поэтому начисление пени без указания недоимки по налогу, срока его уплаты и периода начисления пени нельзя признать соответствующим действительной обязанности налогоплательщика.

В Постановлении ФАС Московского округа от 19.06.2012 N А41-18874/11 суд сделал вывод о том, что требование об уплате налога, сбора, пени, штрафа и решение о взыскании налогов, сборов, пеней, штрафов за счет денежных средств на счетах налогоплательщика (плательщика сборов) организации, индивидуального предпринимателя или налогового агента — организации, индивидуального предпринимателя в банках подлежат признанию недействительными как принятые с нарушением норм налогового законодательства.

В нарушение пункта 4 статьи 69 НК РФ в требовании не приведен расчет пеней с учетом ставки рефинансирования Банка России, действовавшей в период их начисления, что препятствует определению периода возникновения недоимки и проверке размера пени, а также не указаны основания взимания налога, установленные законодательством о налогах и сборах, не известен налоговый период, за который образовалась задолженность, а также срок начисления пени.

В Постановлении от 08.05.2008 N А55-17952/2007 ФАС Поволжского округа пришел к выводу, что без указания даты образования недоимки и суммы такой недоимки, а также документального подтверждения ее образования невозможно проверить расчет пеней, а также соблюдение налоговым органом сроков, установленных НК РФ для взыскания пеней.

ФАС Московского округа в Постановлении от 24.11.2008 N КА-А40/11050-08 установил, что требование вынесено налоговым органом с нарушением положений статьи 69 НК РФ, поскольку не позволяет определить, на какую недоимку начислены пени, по какому сроку платежа, период начисления и ставку пени.

При данных обстоятельствах налогоплательщик лишен возможности проверить обоснованность начисления пени.

Как отметил ФАС Московского округа, указанные выводы согласуются с правовой позицией ВАС РФ, изложенной в Постановлении Пленума от 28.02.2001 N 5 «О некоторых вопросах применения части первой Налогового кодекса Российской Федерации», где указывается, что досудебное урегулирование спора по вопросу взыскания недоимки, пеней состоит в указании налоговым органом в ранее направленном налогоплательщику требовании размера недоимки, даты, с которой начинают начисляться пени, и ставки пеней.

Ссылка налогового органа на то, что данные налоговых деклараций и лицевых счетов налогоплательщика подтверждают правильность исчисления пени, не принята судом, поскольку допустимым доказательством по делу может быть только само требование налогового органа, содержащее все предусмотренные статьей 69 НК РФ сведения.

Спорным на практике является вопрос действительности требования об уплате налога в случае проставления в нем факсимиле вместо подписи.

МНС России в письме от 01.04.2004 N 18-0-09/000042 «Об использовании факсимиле подписи» разъяснило, что использование факсимильного воспроизведения подписи с помощью средств механического или иного копирования, электронно-цифровой подписи либо иного аналога собственноручной подписи не установлено действующим законодательством. Кроме того, факсимиле не допускается использовать на доверенностях, платежных документах, других документах, имеющих финансовые последствия. Таким образом, МНС России запретило использовать факсимиле подписи должностных лиц налоговых органов в основной деятельности.

Как отметил ФАС Северо-Кавказского округа в Постановлении от 07.09.2012 N А63-11860/2011, поскольку требование об уплате налога является ненормативным актом налогового органа и законодательство о налогах и сборах не предусматривает возможности проставления на требовании об уплате налога, сбора, пени, штрафа факсимильной подписи руководителя (заместителя руководителя) налогового органа, требование как неподписанный ненормативный правовой акт налогового органа не порождает правовых последствий его неисполнения. С момента направления требования начинается этап принудительного исполнения обязанности по уплате налога или сбора, поэтому направление требования — это составная часть процедуры принудительного исполнения налогоплательщиком обязанности по уплате налога.

В Постановлении от 14.07.2010 N А58-9855/09 ФАС Восточно-Сибирского округа признал несостоятельным довод налогового органа о том, что факсимиле является точным воспроизведением графического оригинала подписи, в связи с чем приравнивается к подписи лица собственной рукой. Штамп-факсимиле предполагает его использование другими лицами и не может однозначно свидетельствовать о согласии соответствующего должностного лица на его проставление. В материалы дела не представлено требований с выполненными собственноручно подписями руководителя налогового органа (его заместителей).

В письме Минфина России разъяснено, что по общему правилу требование об уплате налога, сбора, пени, штрафа подписывается руководителем (заместителем руководителя) налогового органа собственноручно и скрепляется печатью налогового органа.

В случае направления требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа налогоплательщику в электронном виде по телекоммуникационным каналам связи указанное требование в соответствии с Порядком направления налогоплательщику требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа в электронном виде по телекоммуникационным каналам связи, утвержденным Приказом ФНС России от 09.12.2010 N ММВ-7-8/700@, подписывается электронной цифровой подписью уполномоченного должностного лица налогового органа.

В то же время в Постановлении ФАС Дальневосточного округа от 10.10.2012 N Ф03-4512/2012 указана противоположная позиция.

Как отметил суд, налоговое законодательство не содержит норм, предусматривающих возможность использования штампа-факсимиле или иного аналога воспроизведения подписи руководителя (заместителя руководителя) при подписании ненормативных правовых актов. Однако данные нормы не содержат и прямого запрета.

Кроме того, не может быть признана состоятельной приведенная в качестве правового обоснования запрета использования штампа-факсимиле ссылка судов на письмо МНС России от 01.04.2004 N 18-0-09/000042@ «Об использовании факсимиле подписи», поскольку ненормативный правовой акт, исходя из части 1 статьи 198 АПК РФ, может быть признан недействительным либо оценен как незаконный в случае его несоответствия закону или иному нормативно-правовому акту, к которому данное письмо не относится.

Признавая наличие штампа-факсимиле подписи руководителя на указанных требованиях обстоятельством, не порождающим правовые последствия их неисполнения, нижестоящие суды, по мнению ФАС Дальневосточного округа, не учли, что требование об уплате налога может быть оценено в качестве незаконного и не подлежащего исполнению, если оно не соответствует фактической обязанности налогоплательщика по уплате налога и если нарушения требований, предъявляемых к его содержанию, являются существенными. В свою очередь существенными признаются нарушения, которые исключают возможность установить на основе этого требования основания возникновения налоговой обязанности и ее размер.

Такие обстоятельства судом не установлены.

Следовательно, принимая во внимание фактические обстоятельства рассматриваемого дела, свидетельствующие о наличии у предпринимателя реальной обязанности по уплате указанных в требованиях налоговых платежей, что не оспаривается налогоплательщиком, направление в адрес предпринимателя требований с факсимильным воспроизведением подписи начальника налогового органа, как отметил ФАС Дальневосточного округа, не может быть расценено как существенное нарушение прав и законных интересов заявителя.

Положения статей 52 и 69 НК РФ, устанавливающие презумпцию получения налогового уведомления (требования) его адресатом на шестой день с даты направления, не могут рассматриваться как нарушающие конституционные права налогоплательщиков.

Данный вывод содержится в Определении Конституционного Суда РФ от 27.10.2015 N 2430-О.

Конституционный Суд РФ в указанном Определении также отметил, что факт получения налогового уведомления (требования) по почте заказным письмом на шестой день после направления может быть опровергнут при рассмотрении соответствующего спора в суде, в том числе по иску налогового органа о взыскании недоимки по налогу (Определения от 8 апреля 2010 года N 468-О-О и от 24 марта 2015 года N 735-О).

В пункте 53 Постановления Пленума ВАС РФ от 30.07.2013 N 57 отмечено, что согласно абзацу первому пункта 6 статьи 69 НК РФ в случае направления требования об уплате налога по почте заказным письмом оно считается полученным по истечении шести дней с даты направления заказного письма.

При рассмотрении споров судам необходимо исходить из того, что в силу прямого указания закона соответствующая налоговая процедура признается соблюденной независимо от фактического получения налогоплательщиком (его представителем) требования об уплате налога, направленного заказным письмом.

В пункте 4 письма ФНС России от 09.03.2011 N ЯК-4-8/3612@ указано, что срок исполнения требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа, направленного организациям, индивидуальным предпринимателям в электронном виде по телекоммуникационным каналам связи, должен составлять не менее 20 календарных дней, а физическим лицам, не являющимся индивидуальными предпринимателями, — не менее 30 календарных дней.

В силу пункта 19 Постановления Пленума ВАС РФ от 28.02.2001 N 5 «О некоторых вопросах применения части первой Кодекса» направленное налогоплательщику требование должно содержать данные, позволяющие ему убедиться в обоснованности начисления пеней.

Взыскание недоимки за счет денежных средств или за счет имущества налогоплательщика должно осуществляться только после истечения срока, который был указан в требовании, направленном налогоплательщику. В противном случае налогоплательщик лишается права на добровольное исполнение требования.

Данный вывод обусловлен тем, что направление требования является составной частью процедуры принудительного исполнения обязанности по уплате налога.

Принятие налоговым органом решения о взыскании недоимки за счет имущества налогоплательщика до истечения срока для добровольного исполнения требования об уплате налога является существенным нарушением процедуры принудительного исполнения обязанности по уплате налога, влекущим признание такого решения недействительным.

Данная позиция является устоявшейся в судебной практике (см. Постановления Президиума ВАС РФ от 29.03.2005 N 13592/04, ФАС Поволжского округа от 30.09.2008 N А57-22547/07, от 30.04.2008 N А57-2811/07).

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 69 НК РФ.

2. Требование об уплате налога направляется налогоплательщику при наличии у него недоимки.

5. Утратил силу. — Федеральный закон от 27.12.2018 N 546-ФЗ.

7. Утратил силу с 1 января 2004 г.

9. Утратил силу с 1 января 2007 г.

Комментарий к Ст. 69 Налогового кодекса

Комментарий к Статье 69 НК скоро появится.

Форма требования об уплате налога для организаций и ИП не должна содержать информацию о налоговом периоде | ФНС России

Дата публикации: 17.05.2018 10:45

Верховный Суд Российской Федерации подтвердил, что форма требования об уплате налога для организаций и ИП не должна содержать информацию о налоговом периоде. Суд отказался признать частично недействующим приложение № 2 к приказу ФНС России от 13.02.2017 № ММВ-7-8/179@. В нем содержится форма требования об уплате налога, сбора, страховых взносов, пени, штрафа, процентов (для организаций, индивидуальных предпринимателей).

Гражданин обратился в Верховный Суд РФ с административным исковым заявлением. Он посчитал, что форма требования, предусмотренная указанным приложением, противоречит п. 1 ст. 17, п. 1 ст. 21, п. 2 ст. 22 и п. 1 ст. 69 НК РФ, так как в ней отсутствует информация о налоговом периоде. Заявитель решил, что это нарушает его права и мешает уплатить налог.

ФНС России просила отказать в удовлетворении иска. Она напомнила, что сначала налогоплательщику приходит уведомление, в котором содержится информация о периоде, за который следует уплатить налог. Требование же направляется, если он в указанный срок этого не сделал. Полный перечень сведений, которые должно содержать требование об уплате налога, определен п. 4 ст. 69 НК РФ. Согласно статье, информация о налоговом периоде не входит в число обязательных реквизитов требования. Следовательно, оспариваемое приложение к приказу не противоречит НК РФ.

Верховный Суд отказал гражданину в удовлетворении заявления. Указание налогового периода в форме требования не предусмотрено НК РФ или иными нормативными актами в сфере налогового законодательства. Соответственно, это не может быть основанием для признания приложения № 2 к приказу ФНС России от 13.02.2017 № ММВ-7-8/179@ в оспариваемой части не соответствующим Налоговому кодексу РФ. Суд также учел, что гражданину не направлялось требование по той форме, которую он оспаривает.

КС не стал разбираться, какой день считать днем выявления налоговой недоимки

Все три эксперта «АГ» поддержали выводы Конституционного Суда. По мнению одного из них, попытка заявителя пересмотреть невыгодный ему судебный акт арбитражного суда в КС РФ изначально не имела шансов на успех. Другой эксперт полагает, что Суд поддержал ранее сформированную практику о том, что выявить недоимку инспекторы могут только в рамках контрольных мероприятий. Третий отметил, что КС, по сути, подтвердил правильность позиции кассационной инстанции и Верховного Суда по делу заявителя.

Конституционный Суд РФ вынес Определение № 2165-О от 18 июля по жалобе организации на ряд положений НК РФ относительно сроков взыскания налогов.

Ранее ЗАО «Трест СевЗапСпецСтройМонтаж» успешно оспорило в первой и второй судебных инстанциях решение налогового органа, касающегося, в том числе, доначисления НДФЛ. Тогда суды пришли к выводу о пропуске налоговым органом предельного срока взыскания соответствующей недоимки, подлежащего исчислению с учетом дня выявления недоимки. Так, днем выявления недоимки они признали дату представления налогоплательщиком в налоговый орган справок по форме 2-НДФЛ.

Впоследствии кассация отменила вышеуказанные судебные акты в этой части. Третья инстанция сочла, что нижестоящие суды неверно определили день выявления недоимки. Как подчеркнула кассация, недоимка была выявлена лишь по результатам проведения выездной налоговой проверки.

В своей жалобе в высшую судебную инстанцию налогоплательщик подверг сомнению конституционность нескольких положений НК РФ:

п. 3 ст. 46, определяющего сроки принятия решения о взыскании налога и обращения в суд с заявлением о взыскании налога;
п. 4 ст. 69, устанавливающего сведения, содержащиеся в требовании об уплате налога;
п. 1, 2 и 4 ст. 70, которые устанавливают сроки направления налогоплательщику (налоговому агенту) требования об уплате налога.

Кроме того, заявитель оспаривал конституционность п. 2 ч. 1 ст. 287 АПК РФ. Согласно этой норме кассационная арбитражная инстанция вправе отменить или изменить решения суда первой инстанции или апелляции полностью или частично и самостоятельно принять новый судебный акт, если нижестоящие суды установили все имеющие значение для дела фактические обстоятельства, но неправильно применили нормы права.

По мнению заявителя, оспариваемые им законоположения неконституционны, поскольку они допускают исчисление срока взыскания налога только со дня вступления в силу решения налогового органа по результатам выездной налоговой проверки, а также допускают принятие кассацией необоснованного решения, исходя исключительно из его усмотрения по делу.

Изучив материалы жалобы, Конституционный Суд РФ отказался принимать ее к рассмотрению. Как пояснил КС, спорные положения предусматривают конкретные сроки, которыми налоговый орган связан при принятии решения о взыскании налога с налогоплательщика (налогового агента). Так, ст. 70 НК РФ прямо устанавливает, что требование об уплате налога должно быть направлено налоговым органом не позднее 3 месяцев со дня выявления недоимки, и не связывает этот день лишь с датами проведения выездной налоговой проверки или датой принятия решения по ее результатам.

Относительно спорной нормы АПК РФ Суд отметил, что установленный ею порядок кассационного производства в арбитражных судах предусматривает возможность исправления третьей инстанцией ошибок нижестоящих судов. Он соответствует принципу процессуальной экономии и требованию эффективности судопроизводства, служит гарантией справедливого судебного разбирательства в разумный срок. Следовательно, оспариваемые заявителем нормы не нарушают его конституционные права.

Старший партнер, руководитель группы практик юридической фирмы INTELLECT Роман Речкин согласился с выводами Конституционного Суда РФ. «Позиция КС РФ в данном случае закономерна, поскольку претензии заявителя по существу связаны не с нормами закона и соответствием их Конституции РФ, а с его несогласием с тем, как арбитражные суды оценили определенные обстоятельства. Вопрос о том, что считать днем выявления недоимки (дату представления налогоплательщиком в налоговый орган справок по форме 2-НДФЛ либо дату вынесения решения по результатам проведения выездной налоговой проверки), – это, безусловно, не вопрос Конституционного Суда РФ. Еще меньшую перспективу в КС РФ имеет претензия ЗАО “Трест СевЗапСпецСтройМонтаж” к суду кассационной инстанции, который отменил судебные акты нижестоящих судов и вынес новый судебный акт. Ограничить полномочия кассационного суда на вынесение нового судебного акта по делу только потому, что этот новый судебный акт не нравится заявителю, конечно, недопустимо», – отметил он.

По словам эксперта, даже если заявитель не согласен с позицией кассационного суда по конкретному делу, он вправе оспорить судебные акты только в судебную коллегию ВС РФ. «Попытка заявителя в данном случае, используя КС РФ, пересмотреть невыгодный ему судебный акт арбитражного суда изначально шансов на успех не имела», – заключил Роман Речкин.

Руководитель налоговой практики юридической фирмы Five Stones Consulting, адвокат Екатерина Болдинова отметила, что в комментируемом определении КС РФ поддержал ранее сформированную практику о том, что выявить недоимку инспекторы могут только в рамках контрольных мероприятий. «Она отражается в соответствующих решениях, принимаемых по результатам проверок. Дата таких решений – это и есть дата выявления недоимки. Иные правила установлены для недоимки в виде излишне возмещенной ранее суммы налога, признаваемой таковой. В этой связи совершенно логичен вывод Суда о том, что ст. 70 НК РФ прямо устанавливает, что требование об уплате налога должно быть направлено налоговым органом не позднее 3 месяцев со дня выявления недоимки. И этот день не привязан лишь к датам проведения выездной налоговой проверки или дате принятия решения по ее результатам», – пояснила эксперт.

Ведущий юрист АБ «Юрлов и Партнеры» Никита Болтинский отметил, что КС подтвердил сложившуюся судебную практику о том, что недоимка по НДФЛ у налогового агента может быть выявлена налоговой инспекцией только по результатам выездной налоговой проверки, а не после получения справки 2-НДФЛ. «Действующим законодательством предусмотрено два основных сценария направления налогоплательщику требования об уплате налога. Согласно первому налогоплательщик подал налоговую декларацию, но не уплатил сумму налога, указанную в декларации. В таком случае требование направляется не позднее 3 месяцев со дня, следующего за последним днем уплаты налога, либо не позднее 3 месяцев со дня, следующего за днем представления налоговой декларации, если она подана с нарушением установленных сроков (п. 1 ст. 70 НК РФ). По второму сценарию налоговая инспекция доначислила налогоплательщику суммы налогов, ранее не указанные им в налоговой декларации. Тогда требование направляется в течение 20 дней с даты вступления в силу решения по налоговой проверке (п. 2 ст. 70 НК РФ)», – пояснил эксперт.

Он добавил, что своим определением Конституционный Суд подтвердил правильность позиции арбитражного суда Северо-Западного округа и Верховного Суда по делу ЗАО «Трест СевЗапСпецСтройМонтаж». «Она сводится к следующему. Справка по форме 2-НДФЛ не является декларацией или расчетом для целей осуществления налогового контроля. Такая справка не может являться предметом камеральной проверки. Поэтому правильность исчисления и уплаты НДФЛ могла быть проверена налоговой инспекцией только по результатам выездной налоговой проверки. Следовательно, в целях определения срока направления налогоплательщику требования об уплате налога п. 1 ст. 70 НК РФ не может быть применен, а надлежит применить п. 2 ст. 70 НК РФ», – пояснил Никита Болтинский.

Может ли ошибочное указание срока исполнения выставленного налогоплательщику требования об уплате налога менее минимального восьмидневного срока, предусмотренно

Может ли ошибочное указание срока исполнения выставленного налогоплательщику требования об уплате налога менее минимального восьмидневного срока, предусмотренного абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ, послужить основанием для признания данного требования недействительным?

Вопрос: Может ли ошибочное указание срока исполнения выставленного налогоплательщику требования об уплате налога менее минимального восьмидневного срока, предусмотренного абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ, послужить основанием для признания данного требования недействительным?

Ответ: В судебной практике на сегодняшний день не сложился единый подход по рассматриваемому вопросу. Преимущественно арбитражные суды придерживаются мнения, что требование об уплате налога не подлежит признанию недействительным только лишь по основанию неверного указания срока его исполнения — менее минимального восьмидневного срока, установленного абз. 4 п. 4 ст. 69 Налогового кодекса РФ, при том что у налогоплательщика имелась реальная возможность его исполнить в добровольном порядке. Однако не исключена иная позиция судей по данному вопросу.

Обоснование: В силу п. 1 ст. 45 НК РФ неисполнение или ненадлежащее исполнение обязанности по уплате налога является основанием для направления налоговым органом налогоплательщику требования об уплате налога.
В соответствии с п. 1 ст. 69 НК РФ требованием об уплате налога признается извещение налогоплательщика о неуплаченной сумме налога, а также об обязанности уплатить в установленный срок неуплаченную сумму налога.
Пунктом 4 ст. 69 НК РФ предусмотрено, что требование об уплате налога должно содержать сведения о сумме задолженности по налогу, размере пеней, начисленных на момент направления требования, сроке исполнения требования, а также мерах по взысканию налога и обеспечению исполнения обязанности по уплате налога, которые применяются в случае неисполнения требования налогоплательщиком. Во всех случаях требование должно содержать подробные данные об основаниях взимания налога, а также ссылку на положения законодательства о налогах и сборах, которые устанавливают обязанность налогоплательщика уплатить налог.
Форма требования об уплате налога, сбора, пени, штрафа, процентов (для организаций, индивидуальных предпринимателей) (Приложение N 2 к Приказу ФНС России от 03.10.2012 N ММВ-7-8/662@) предусматривает указание срока его исполнения.
В соответствии с абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ требование об уплате налога должно быть исполнено в течение восьми дней с даты получения указанного требования, если более продолжительный период времени для уплаты налога не указан в этом требовании. Исходя из нормы ст. 6.1 НК РФ указанный срок исчисляется в рабочих днях.
Согласно п. 6 ст. 69 НК РФ требование об уплате налога может быть передано руководителю организации (ее законному или уполномоченному представителю) или физическому лицу (его законному или уполномоченному представителю) лично под расписку, направлено по почте заказным письмом или передано в электронной форме по телекоммуникационным каналам связи. В случае направления указанного требования по почте заказным письмом оно считается полученным по истечении шести дней (рабочих дней, поскольку не указано иное исходя из разъяснений ст. 6.1 НК РФ) с даты направления заказного письма.
Таким образом, срок на добровольное исполнение требования об уплате налога не может быть менее 8-дневного срока, предусмотренного абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ. В ином случае срок для добровольного исполнения признается равным восьми дням.
В свою очередь, срок на добровольное исполнение требования влияет на сроки последующего принудительного взыскания недоимки (п. 3 ст. 46, абз. 3 п. 1 ст. 47 НК РФ).
Согласно п. 13 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 11.08.2004 N 79 «Обзор практики разрешения споров, связанных с применением законодательства об обязательном пенсионном страховании» несоответствие требования об уплате налога форме и содержанию, установленным ст. 69 НК РФ, не является безусловным основанием для признания его судом недействительным.
Требование об уплате налога может быть признано недействительным в том случае, если оно не соответствует действительной обязанности налогоплательщика по уплате налога либо составлено с существенными нарушениями.
Следовательно, формальное нарушение требований ст. 69 НК РФ само по себе не влечет признание требования недействительным, содержащиеся в нем сведения должны соответствовать фактически неисполненной обязанности налогоплательщика по уплате налога и пени.
В судебной практике на сегодняшний день не сложился единый подход по рассматриваемому вопросу. В основном арбитражные суды приходят к выводу, что требование об уплате налога не подлежит признанию недействительным только лишь по основанию неверного указания срока его исполнения (менее минимального восьмидневного срока, установленного абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ).
Так, в Постановлении ФАС Западно-Сибирского округа от 27.09.2010 по делу N А75-706/2010 судьи пришли к выводу, что, поскольку п. 4 ст. 69 НК РФ установлен минимальный срок исполнения требования об уплате налога, ошибки, допущенные налоговым органом при указании даты исполнения требования, сами по себе не являются безусловным основанием для признания его недействительным. Поскольку требования отражают действительные налоговые обязательства налогоплательщика перед бюджетом и доказательств обратного налогоплательщиком не представлено, суд пришел к выводу об отсутствии при выставлении требований существенных нарушений, свидетельствующих об их недействительности.
Третий арбитражный апелляционный суд в Постановлении от 23.11.2009 по делу N А33-10707/2009 отклонил довод налогоплательщика о нарушении его прав в связи с установлением налоговым органом в оспариваемом требовании срока на его добровольное исполнение меньше минимального предела, предусмотренного п. 4 ст. 69 НК РФ. Суд отметил, что НК РФ не устанавливает правовых последствий установления в требовании срока на его исполнение менее предела, предусмотренного п. 4 ст. 69 НК РФ. Кроме того, налогоплательщиком не опровергнуто, что спорная сумма недоимки на момент рассмотрения дела не погашена. При данных обстоятельствах установление налоговым органом в оспариваемом требовании меньшего срока на его исполнение, чем предусмотрено законом, не нарушает прав и законных интересов налогоплательщика.
В Постановлении Седьмого арбитражного апелляционного суда от 09.06.2014 по делу N А27-9321/13 судьи отклонили ссылку налогоплательщика на то, что инспекцией в нарушение абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ нарушена процедура взыскания налоговых платежей, выразившаяся в предоставлении налогоплательщику для добровольного исполнения требования вместо положенных восьми всего семи рабочих дней. Суд исходил из того, что отраженная в оспариваемом требовании задолженность по налогам и пеням соответствует фактической обязанности общества по уплате данной задолженности. Налогоплательщиком не представлено доказательств нарушения его прав и законных интересов ограничением срока для добровольного исполнения требования в семь дней, поскольку инспекцией решение о взыскании налога, сбора, пени, штрафов и процентов за счет денежных средств на счетах налогоплательщика в банках, а также электронных денежных средств принято только через девять дней.
Двадцатый арбитражный апелляционный суд в Постановлении от 23.11.2009 N 20АП-4675/2009 по делу N А54-3608/2009С20 пришел к выводу, что существенных нарушений положений ст. 69 НК РФ при выставлении обществу требования инспекцией не допущено. То обстоятельство, что налоговым органом в оспариваемом требовании установлен срок для добровольного его исполнения, который не соответствует требованиям п. 4 ст. 69 НК РФ, в частности сокращен на семь календарных дней, само по себе не может являться основанием для признания указанного требования недействительным, поскольку с момента получения данного требования у общества имелась реальная возможность его исполнить в указанный в нем срок. При том что в силу ст. 45 НК РФ общество должно было исполнить обязанность по уплате налога в законодательно установленный срок самостоятельно. При этом инспекцией не принимались предусмотренные ст. ст. 46, 47 НК РФ меры по бесспорному взысканию данной недоимки. Таким образом, сокращение срока на добровольное исполнение требования не привело к ущемлению прав общества и не влечет за собой признание оспариваемого требования недействительным.
Вместе с тем в арбитражной практике встречается и противоположное мнение. Например, в Постановлении Семнадцатого арбитражного апелляционного суда от 20.01.2011 N 17АП-11345/2010-АК по делу N А60-17968/2010 судьи признали незаконным исчисление налоговым органом срока для добровольного исполнения обязанности по уплате налогов с момента выставления требования, а не с момента получения данного требования налогоплательщиком, что противоречит абз. 4 п. 4 ст. 69 НК РФ. Ссылка инспекции на то, что налогоплательщик не планировал производить уплату в добровольном порядке до разрешения спора, в связи с чем сокращение сроков на добровольное исполнение требования не повлияло на возможность налогоплательщика самостоятельно уплатить задолженность, была отклонена судом как не имеющая правового значения для рассмотрения спора.
Судьи приходят к выводу о существенном нарушении прав и законных интересов налогоплательщика, а также требований ст. 69 НК РФ в том случае, если спорное требование было направлено налоговым органом в адрес налогоплательщика после истечения срока для его добровольного исполнения, а также в случае, если неверное указание срока исполнения выставленного налогоплательщику требования повлекло нарушение сроков принятия решений о принудительном взыскании задолженности за счет денежных средств и за счет имущества налогоплательщика, а также взыскания задолженности в судебном порядке.
ФАС Северо-Кавказского округа в Постановлении от 26.04.2010 по делу N А53-14876/2009-С5-37 пришел к выводу, что, направив в адрес общества требование об уплате налога после истечения срока на добровольное исполнение, налоговый орган заведомо лишил общество возможности исполнить обязанность по уплате налога и пени в определенный в требовании срок. При этом решение о взыскании налога за счет денежных средств банка было налоговым органом вынесено до направления обществу требования об уплате налога, как и списание в бесспорном порядке денежных средств на основании выставленных налоговым органом инкассовых поручений. Данные обстоятельства суд оценил как свидетельствующие о несоблюдении налоговым органом процедуры принудительного взыскания сумм налога и пеней, установленной НК РФ. Результатом указанного нарушения положений НК РФ явилось списание с расчетного счета общества спорной суммы налога и пеней вне процедуры, установленной НК РФ, что свидетельствует о нарушении имущественных прав общества.
Аналогичные выводы сделаны также в Постановлениях Шестнадцатого арбитражного апелляционного суда от 25.01.2011 N 16АП-372/09(3) по делу N А20-2255/2008, Семнадцатого арбитражного апелляционного суда от 08.04.2009 N 17АП-1890/2009-АК по делу N А60-33331/2008.

М.И.Дедусова
ООО «Юридическая компания
«Налоговая помощь»
24.05.2015

Обжалование решения налоговой службы

Вручение акта налоговой проверки налогоплательщику	В течение 5 дней с даты акта налоговой проверки (п. 5 ст. 100 НК РФ). Под указанной датой понимается дата подписания акта лицами, проводившими эту проверку (п.п. 1 п. 3 ст. 100 НК РФ). Акт вручается лицу, в отношении которого проводилась проверка, или его представителю под расписку или передается иным способом, свидетельствующим о дате его получения.
Представление налогоплательщиком возражений по акту проверки.	В течение 15 рабочих дней со дня получения акта (п. 6 ст. 100 НК РФ).
Рассмотрение руководителем (заместителем руководителя) налогового органа материалов налоговой проверки и вынесение решения по ним	В течение 10 дней со дня истечения срока для представления возражений с возможностью продления не более чем на один месяц (п. 1 ст. 101 НК РФ).
Вынесение руководителем (заместителем руководителя) налогового органа решения о проведении дополнительных мероприятий налогового контроля (истребование документов, допрос свидетеля, проведение экспертизы)	Дополнительные мероприятия могут проводиться в течение срока не более одного месяца (п. 6 ст. 101 НК РФ).
Вручение налогоплательщику решения о привлечении к ответственности (об отказе в привлечении к ответственности) за совершение налогового правонарушения	В течение 5 дней со дня вынесения (п. 9 ст. 101 НК РФ).
Вступление Решения в силу	В течение 10 дней со дня вручения Решения налогоплательщику. В случае подачи апелляционной жалобы – со дня утверждения Решения вышестоящим налоговым органом (п. 9 ст. 101 НК РФ).
Решение о принятии обеспечительных мер: — запрет на отчуждение имущества, — приостановление операций по счетам в банке	После вынесения Решения. Действует до дня исполнения Решения либо до дня его отмены вышестоящим органом или судом (п. 10 ст. 101 НК РФ).
Апелляционная жалоба на не вступившее в силу Решение в вышестоящий налоговый орган	В течение 10 дней со дня вручения Решения налогоплательщику (пп.1,2 ст. 101.2, п. 2 ст. 139 НК РФ).
Жалоба в вышестоящий налоговый орган на вступившее в силу Решение, которое не было обжаловано в апелляционном порядке	В течение одного года с момента вынесения Решения (п. 3 ст. 101.2, п. 2 ст. 139 НК РФ).
Принятие вышестоящим налоговым органом решения по жалобе	В течение одного месяца со дня ее получения. Возможно продление срока для получения документов у нижестоящих налоговых органов, но не более чем на 15 дней (п. 3 ст. 140 НК РФ).
Сообщение о принятом по жалобе решении	В течение 3 дней с момента принятия (п. 3 ст. 140 НК РФ).
Обжалование Решения в суд (только после обжалования этого Решения в вышестоящем налоговом органе)	В течение трех месяцев со дня, когда лицу стало известно о вступлении Решения в силу (п. 5 ст. 101.2 НК РФ, п. 4 ст. 198 АПК РФ).
Принятие судом решения по делу об оспаривании Решения налогового органа	В срок, не превышающий трех месяцев со дня поступления заявления в суд. Возможно продление на срок до 6 месяцев в связи с особой сложностью дела (п. 1 ст. 200 АПК РФ).
Исполнение Решения налогового органа	Со дня вступления в силу. Может быть приостановлено при обжаловании решения по ходатайству (п. 4 ст. 101.2, п. 1 ст. 101.3 НК РФ).
Выставление требования об уплате налога, пеней, штрафа	В течение 10 дней с момента вступления в силу решения (ст. 69, п. 2 ст. 70, п. 3 ст. 101.3 НК РФ).
Исполнение требования	В течение 10 календарных дней с момента получения требования, если иное не указано в требовании (п. 4 ст. 69 НК РФ).
Решение о взыскании налога, пени, штрафа	Принимается после истечения срока исполнения требования, но не позднее двух месяцев (п. 3 ст. 46 НК РФ).
Инкассовое поручение в банк налогоплательщика	В течение одного месяца со дня принятия решения о взыскании (п. 4 ст. 46 НК РФ).
Решение о приостановлении операций по счетам в банке	Не ранее внесения решения о взыскании налога (п. 2 ст. 76 НК РФ).
Иск налогового органа в суд о взыскании налога	В течение 6 месяцев по истечении срока исполнения требования об уплате налога (п. 3 ст. 46 НК РФ).

Измерение активности NK в цельной крови путем активации CD69 после совместной инкубации с K562, сравнение с анализами цитотоксичности NK и анализом дегрануляции CD107a

330 Вероятно, аномальная экспрессия клональных маркеров NK выявляет дисбаланс субпопуляции NK

331 . Таким же образом, повышенная цитотоксичность NK

332 демонстрирует сдвиг в сторону цитотоксических подмножеств NK и

333 снижения других биологических функций соответственно. Мы предполагаем

334, что функциональный дисбаланс подмножеств NK может быть охарактеризован

335 как вариант повышенной цитотоксичности NK и который связан

336 с репродуктивной недостаточностью.

337 Индукция CD69 на NK после контакта с клетками-мишенями

338 (North et al., 2007) или бактериальным компонентом (Athié-Morales et al.

339 al., 2008) сообщалось ранее. Также было хорошо показано, что повышающая регуляция CD69

340 коррелирует с цитотоксичностью NK и продукцией IFN-γ

341 (Giavedoni et al., 2000; Korbel et al., 2005). В этом исследовании

342 мы показали, что экспрессия CD69 на NK-клетках после

343 стимуляции с избытком мишеней отображает подмножество из

344 всей популяции NK, способной к специфическому ответу.Размер этой функциональной подгруппы

345 определяет реальную цитотоксическую

346 активность NK-клеток периферической крови.

347 5.Q11 Не процитированная ссылка

348 von Zons et al., 1997

349 Ссылки

350 Aktas, E., Kucuksezer, UC, Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G., 2009 Зависимость

351 между экспрессией CD107a и цитотоксической активностью. Клетка. Иммунол. 254

352 (2), 149–154.

353 Athié-Morales, V., O’Connor, G.М., Гардинер, К.М., 2008. Активация NK-клеток человека

354 с помощью молекулярного паттерна, ассоциированного с бактериальным патогеном,

355 мурамилдипептида. J. Immunol. 180 (6), 4082–4089.

356 Bachy, M., Bonnin-Rivalland, A., Tilliet, V., Trannoy, E., 1999. Betagalactosi-

357 dase release как альтернатива высвобождению хрома в цитотоксических T-клетках

358 тестов. J. Immunol. Методы 230 (1–2), 37–46.

359 Бломберг, К., Ульфстедт, А.С., 1993. Флуоресцентные хелаты европия в качестве мишени

360 маркеров клеток при оценке цитотоксичности естественных клеток-киллеров.J.

361 Immunol. Методы 160, 27–34.

362 Brunner, K.T., Mauel, J., Cerottini, J.C., Chapuis, B., 1968. Количественный анализ

363 литического действия иммунных лимфоидных клеток на 51Cr-меченные аллогенные

364 клетки-мишени in vitro; ингибирование изоантител и лекарств. Иммунология

365 14, 181–196.

366Чернышов В.П., Судома И.О., Донской Б.В., Костючик А.А., Маслий Ю.В.,

3672010. Повышенная цитотоксичность NK-клеток, экспрессия CD158a в NK-клетках и

368 активированных Т-лимфоцитов в периферической крови женщин. Неудачи ЭКО.

369Ам. J. Reprod. Иммунол. 64 (1), 58–67 (PubMed: 20236262).

370Di Santo, J.P., 2006. Пути развития естественных клеток-киллеров: вопрос

371balance. Анну. Rev. Immunol. 24, 257–286.

372 Донской Б.В., Чернышов В.П., Осипчук Д.В. Иммунофенотипическая характеристика

373 двух функционально различных субпопуляций NK-клеток периферического человека

374 крови. Физиол Ж. 2011; 57 (1) перед печатью [PubMed —в процессе]

375 Джаведони, Л.D., Velasquillo, MC, Parodi, LM, Hubbard, GB, Hodara, VL,

3762000. Экспрессия цитокинов, активация естественных клеток-киллеров и фенотипические изменения

377 изменений в лимфоидных клетках макак резус во время острой инфекции

378 с патогенными микроорганизмами. вирус иммунодефицита. J. Virol. 74 (4),

–1657.

380Hussain, R.F., Nouri, A.M., Oliver, R.T., 1993. Новый подход к измерению цитотоксичности с использованием колориметрического анализа.J. Immunol. Методы 160,

38289–96.

383Iizuka, K., Chaplin, D.D., Wang, Y., Wu, Q., Pegg, L.E., Yokoyama, W.M., Fu, Y.X.,

3841999. Потребность в мембранном лимфотоксине в естественных клетках-киллерах

385development. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96 (11), 6336–6340.

386Iwao, M., Ochi, C., Kurane, I., Muraoka, S., 1998. Анализ нерадиоизотопных человеческих клеток-киллеров

387 с использованием флуоресцентного красителя родамин-123 в качестве метки

388probe.Иммунол. Вкладывать деньги. 27 (1–2), 31–45.

389Колбер, М.А., Хинонес, Р.Р., Гресс, Р.Е., Хенкарт, П.А., 1988. Измерение цитотоксичности

390 путем высвобождения клеток-мишеней и удержания флуоресцентного красителя

391 бис-карбоксиэтил-карбокси-форесцеин (BCF). J. Immunol. Методы 108,

3–264.

393 Корбел, Д.С., Ньюман, К.С., Алмейда, С.Р., Дэвис, Д.М., Райли, Е.М., 2005.

394 Гетерогенные ответы человеческих NK-клеток на Plasmodium falciparum-

395 инфицированных эритроцитов.J. Immunol. 175, 7466–7473.

396Korzeniewski, C., Callewaert, D.M., 1983. Анализ высвобождения ферментов для определения естественной цитотоксичности

397. J. Immunol. Методы 64, 313–320.

398 Ланье, Л.Л., 2003. Передача сигналов рецептора естественных клеток-киллеров. Curr. Opin. Иммунол.

39915, 308.

400Le Bouteiller, P., 2009. El Costa H, Aguerre-Girr M, Tabiasco J [Иммунитет

401 беременности: новые концепции]. Бык. Акад. Natl. Med. 193 (5), 1029–1041

402 (май).

403 Наранбхай, В., Бартман, П., Ндлову, Д., Рамкалавон, П., Ндунг’у, Т., Уилсон, Д.,

404 Альтфельд, М., Карр, WH, 2011. Воздействие крови вариации обработки естественных

405 киллерных клеток, частоты, активации, экспрессии и функции хемокиновых рецепторов.

406J. Иммунол. Методы Q12 (Epub перед печатью) PMID: 21255578).

407Nociari, M.M., Shalev, A., Benias, P., Russo, C., 1998. Новый одностадийный высокочувствительный флуорометрический анализ

408 для оценки клеточно-опосредованной цитотоксичности.J.

409 Immunol. Методы 213, 157–167 (PubMed: 96

410North, J., Bakhsh, I., Marden, C., Pittman, H., Addison, E., Navarrete, C.,

411Anderson, R., Lowdell, MW, 2007. Человеческое естественное воздействие на опухоли. killer

412 клеток лизируют NK-устойчивые опухолевые мишени: свидетельство двухэтапного процесса активации

413 покоящихся NK-клеток. J. Immunol. 178 (1), 85–94.

CD56 + CD62L- CD56 + CD62Ldim CD56 + CD62L ++ CD56 ++

% CD69 9000% экспрессия 9000 9000 + CD107a2

% .05

p <0,05

Рис. 6. Разница в экспрессии CD69 и 107 дегрануляции в различных CD62L-субпопуляциях NK-клеток. Цельную кровь инкубируют с K569 и исследуют на экспрессию CD69 или CD107

. (26 проб крови были проанализированы в 4 изолированных экспериментах).

8Б.В. Донской и др. / Journal of Immunological Methods xxx (2011) xxx – xxx

Цитируйте эту статью как: Dons’koi, BV, et al., Измерение активности NK в цельной крови с помощью активации CD69 после инкубации co-

с K562, сравнение с анализами цитотоксичности NK и….., J. Immunol. Методы (2011), doi: 10.1016 / j.jim.2011.07.016

Frontiers | Естественные клетки-киллеры дыхательных путей и бактерии в состоянии здоровья и болезней

Введение

Исторически сложилось так, что естественные клетки-киллеры человека (NK) в основном собирали и изучали в периферической крови (PB), что является простым способом доступа к ним, и где они обычно составляют 5–20% всех лимфоцитов (1–3) . Изначально были описаны два разных подмножества, названных CD56 ^bright CD16 ^– (до 10% PB NK-клеток) и CD56 ^dim CD16 ^bright (по крайней мере 90% PB NK-клеток).Фенотипические и функциональные (продукция цитокинов для первого и цитотоксическая активность для второго) характеристики различают обе популяции (1–3). Однако все не так просто, поскольку были идентифицированы четыре дополнительные субпопуляции: (i) CD56 ^{, светлый} CD16 ^{, тусклый}, (ii) CD56 ^{тусклый}, CD16, ^—, (iii) CD56 ^—, CD16. ^{, светлый,}, и, наконец, (iv) CD56, ^{, тусклый,}, CD16, ^{, тусклый,} (4), последний по-прежнему почти систематически не упоминается в литературе (5).Функции NK-клеток человека регулируются балансом между сообщениями, передаваемыми через ингибирующие рецепторы (IR), такие как KIR, CD94 / NKG2A, ILT2, TIGIT, и активирующие рецепторы (AR), такие как, в частности, NKG2D и рецепторы естественной цитотоксичности (NCR). ) НКп46, НКп30 и НКп44 (6). При стимуляции NK-клетки проявляют естественную цитотоксическую активность против опухолевых клеток и инфицированных вирусом клеток, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) по отношению к покрытым антителами клеткам-мишеням через рецептор Fcγ CD16 и продукцию цитокинов и факторов роста (2, 6).

Большинство лигандов IR представлены молекулами класса I лейкоцитарного антигена человека (HLA), так что клетки-мишени, лишенные этих молекул частично или полностью, становятся убитыми NK-клетками. Тем не менее, у IR есть еще одна важная функция, так как они отвечают за образование NK-клеток. Действительно, прежде чем развивающиеся NK-клетки станут функциональными, их самоспецифический IR должен взаимодействовать с их лигандами, экспрессируемыми клетками в их микросреде (7, 8). NK-клетки без такого IR, которые могут составлять до 20% всех NK-клеток PB, остаются необразованными и гипореактивными (7, 8).Однако они могут активироваться при определенных условиях, например, при некоторых вирусных инфекциях (9).

Горячей темой в области NK-клеток, конечно же, является их потенциальное использование в качестве иммунотерапевтических противораковых агентов. Для достижения этой цели изучаются несколько подходов, и, например, NK-клетки химерного антигенного рецептора (CAR), которые позволяют специфично нацеливать опухолевый антиген (10), или использовать конструкции мультиспецифических антител, направленных одновременно на несколько NK. клеточный AR и поверхностные молекулы опухоли (6) кажутся особенно многообещающими.Также было обнаружено, что NK-клетки, которые ранее считались исключительно клетками врожденного иммунитета, могут развивать поведение, подобное памяти (11). Наконец, интенсивно изучается метаболизм NK-клеток, который, по-видимому, различается между образованными и необразованными клетками (12, 13).

Другой аспект, который изменил наш взгляд на NK-клетки в последние годы, — это наблюдение широкой гетерогенности этой популяции. В PB существует не только множество субпопуляций, основанных на клональном распределении нескольких IR, незрелых, частично зрелых и полностью зрелых фракций, основанных на относительной экспрессии CD56, CD16 и IR NKG2A и KIR (14), обычных и адаптивных NK-клеток ( 14, 15), но существуют также неоднородные аспекты между ПБ и различными тканями (15, 16).Последние данные Dogra et al. (17) предлагает модель, в которой фенотип, степень зрелости и функции NK-клеток тесно зависят от анатомического расположения, без влияния возраста и пола.

NK-клетки верхних дыхательных путей

Достаточно сложно найти значительное количество упоминаний о NK-клетках верхних дыхательных путей. В статьях о людях в основном сообщалось об исследовании NK-клеток при хроническом риносинусите, воспалительном состоянии слизистой оболочки носа и носовых пазух (18), оказывающем значительное влияние на качество жизни.Различают две разные формы, одну с носовыми полипами и одну без носовых полипов (19, 20). Бактериальные возбудители считаются одним из этиологических факторов этого заболевания (18). Однако, поскольку бактериология этмоидальной биопсии была одинаковой независимо от наличия или отсутствия полипов, Niederfuhr et al. поставили под сомнение роль бактерий в патогенезе полипов, а также систематическое лечение антибиотиками (19). В исследовании 18 пациентов, разделенных на тех, кто отвечает, и тех, кто устойчив к лечению, и 19 здоровых пациентов из контрольной группы Kim et al.исследовали исключительно PB NK-клетки. Авторы продемонстрировали, что NK-клетки PB от пациентов имели пониженные эффекторные функции по сравнению со здоровыми контрольными пациентами, причем наиболее сильно страдали резистентные к лечению люди (18). Недавняя рукопись Качмарека и др. (20) сообщили не только о NK-клетках PB, но также о клетках слизистой оболочки носа и полипах носа. Однако использование материала было ограничено CD3 ^— CD56 ⁺ CD16 ⁺ событиями, что исключало популяцию NK-клеток CD56 ^bright CD16 ^—, которые могли быть численно хорошо представлены в этих тканях.Фенотипические исследования этой подгруппы в носу выявили преобладание относительно незрелых, CD27 ⁺ NK-клеток. Кроме того, AR NKG2D экспрессировался с более низкими частотами (более низкий процент клеток NKG2D ⁺) и более низкой плотностью экспрессии в слизистой оболочке носа и полипах по сравнению с PB (в тканях были идентифицированы популяции, отрицательные по NKG2D). Наконец, процент NK-клеток среди лимфоцитов (в среднем 33%) был значительно выше в полипах, чем в PB (20).

Okada et al. опубликовали статью о NK-клетках слизистой оболочки носа мыши на фоне C57BL / 6 (21), в которой они показали, что эти NK-клетки были более незрелыми (согласно относительным уровням экспрессии CD27 и CD11b) и фенотипически более значительными. активированы (сниженная экспрессия CD62L, более высокий процент клеток CD69 ⁺), чем из селезенки и легких. Около 12% экспрессировали тканевый маркер и маркер активации CD69, а одна треть из них — также CD103.Паттерн экспрессии семейства рецепторов Ly49 отличался в трех тканях. Функционально [окрашивание CD107a и продукция интерферона (IFN) -γ], назальные NK-клетки оказались гипореактивными по сравнению с их селезенкой, но не со своими легочными аналогами (21), что может быть связано с возможностью того, что фракция CD69 ⁺ NK-клеток было недостаточно для значительной активации глобальной популяции NK-клеток в выбранных экспериментальных данных.

Хотя этот набор данных интересен как таковой , не следует игнорировать то, что Casadei и Salinas (22) в обзоре различных моделей носовых инфекций и иммунитета на животных привели несколько анатомических (функциональных вомероназальных органов в отличие от человеческих, нет. Кольцо Вальдейера) и физиологические (макросматика, отсутствие кашля-чихания, более низкая чувствительность к вирусам человека) ограничений мыши в этом контексте, поэтому такие результаты всегда следует рассматривать с осторожностью, прежде чем экстраполировать на ситуацию человека.

NK-клетки в легких

NK-клеток легких недавно были подробно рассмотрены в этом журнале (23, 24), так что краткого обзора их наиболее важных характеристик может быть достаточно. Легкие постоянно подвергаются воздействию микрочастиц из окружающей среды. В частности, поскольку эпителий слизистой оболочки легких находится на границе раздела между внешним миром и организмом, он может стать местом проникновения инфекционных патогенов, будь они бактериальными, грибковыми или вирусными по своей природе. Следовательно, в этом анатомическом месте ожидается запуск обширного и сложного местного иммунного ответа, и человеческие NK-клетки, которые составляют около 5–20% лимфоцитов легких (24), являются его частью.Работа Marquardt et al. установил, что большинство NK-клеток легких человека представляют собой циркулирующую субпопуляцию и имеют фенотип зрелого CD56 ^dim CD16 ^bright (25). Они чаще экспрессировали маркер дифференцировки CD57, а также образовывали KIR, чем NK-клетки крови от тех же доноров, но были относительно гипореактивными при стимуляции линиями клеток-мишеней, отрицательных по HLA класса I. Кроме того, однако, предполагаемая тканеворезидентная подгруппа (около 20% всех NK-клеток легких), далее подразделяющаяся на относительно незрелые клетки CD56 ^bright CD16 ^— и CD56 ^dim CD16 ^— клетки (24, 25) , экспрессировали маркеры резидентности в тканях CD69, CD49a и CD103.Эти клетки были снова подробно охарактеризованы Marquardt et al. (26), которые показали, что они функционируют, особенно после стимуляции цитокином интерлейкином (IL) -15, и демонстрируют уникальный транскрипционный профиль. На основании относительной экспрессии CD49a и CD103 можно выделить несколько субпопуляций (24, 26).

Естественные клетки-киллеры также были исследованы в легких мышей, в частности Wang et al. (27) и Michel et al. (28). Обе группы обнаружили, что NK-клетки легких были более зрелыми, чем клетки селезенки (28) или других органов (27), в соответствии с относительной экспрессией CD27 и CD11b.В то время как предыдущие авторы описали более высокий уровень экспрессии IR CD94 / NKG2A и более низкий уровень AR NKG2D, вторая статья могла подтвердить эти данные только в отношении NKG2D с точки зрения средней интенсивности флуоресценции. NK-клетки легких пролиферировали меньше, меньше дегранулировали (анализ CD107a) и были менее цитотоксичными, чем NK-клетки селезенки (28), но эти функции быстро повышались при бактериальной инфекции легких (27). Это говорит о том, что при гомеостазе NK-клетки легких ингибируются, чтобы избежать повреждения нормальных аутологичных клеток, но что они могут быстро вмешаться в случае инфекционного поражения (27).Michel et al. показали в системах совместного культивирования in vitro , что макрофаги селезенки и легких могут значительно повышать цитотоксическую активность NK-клеток легких посредством контактно-зависимого механизма (28).

Что касается гомеостатической ситуации, исследования последних лет показали, что в отличие от более старого представления о легких как о стерильных органах, микробиота легких присутствует в нижних дыхательных путях, что оказывает значительное влияние на здоровье и болезни, хотя и не так широко. как в кишечнике (29–32).Термин «микробиота» относится ко всем присутствующим микроорганизмам, а именно бактериям, грибам, простейшим и вирусам (29), но здесь мы будем рассматривать только роль бактерий. В нижних дыхательных путях преимущественно представлены шесть типов: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria (31, 32), Acidobacteria и Fusobacteria (32). Предполагается, что эта микробиота является преходящей у здоровых доноров и должна быть установлена на основе микроабсорбции и ингаляции (32), а ее состав в любой заданный момент времени зависит от параметров прибытия бактерий, удаления бактерий и местных иммунных ответов (32, 33). ).Таким образом достигается состояние равновесия, которое также сильно зависит от микробиоты кишечника через различные бактериальные метаболиты и способствует поддержанию гомеостаза в нижних дыхательных путях (ось кишечник — легкие) (32–34). Все, что нарушает этот баланс, например, некоторые лекарства и особенно антибиотики, увеличение количества питательных веществ (диета с высоким содержанием жиров, диета с низким содержанием клетчатки), сигаретный дым, инфекционные агенты, хроническое воспаление, может нарушить работу кишечника, а также микробиоту легких и привести к состояние дисбактериоза, характеризующееся увеличением количества бактерий дыхательных путей и изменением их состава.Дисбиоз тесно связан с несколькими тяжелыми заболеваниями легких [астмой, хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), инфекциями, раком] (29–35).

Естественные клетки-киллеры, насколько нам известно, на сегодняшний день подробно не исследованы в контексте нормальной микробиоты легких. Поскольку большинство NK-клеток легких не активированы и не резидентны в тканях (о чем свидетельствует их отрицательность в отношении CD69), они могут не очень сильно реагировать на нормальную микробиоту. Однако, поскольку они экспрессируют несколько специфичных для бактерий толл-подобных рецепторов (TLR), которые сигнализируют о присутствии бактериальных патогенов (36), можно предположить, что они также могут вызвать иммунный ответ на компоненты микробиоты, и что это будет способствовать гомеостаз.Общее иммуносупрессивное состояние NK-клеток легких на исходном уровне поможет избежать агрессии со стороны безвредных и полезных бактерий и неинфицированных аутологичных клеток (31). Ян и др. (31), а также Fuchs и Colonna (37) обсуждают данные, утверждающие, что в стабильном состоянии альвеолярные макрофаги секретируют иммуносупрессивные цитокины, которые поддерживают NK-клетки. Это контрастирует с результатами Michel et al. (28), о чем говорилось выше. Однако макрофаги и дендритные клетки (ДК) переключаются на продукцию провоспалительных цитокинов в случае бактериальной или вирусной инфекции и тем самым активируют NK-клетки.

Хроническая обструктивная болезнь легких

Этот субъект является третьей причиной смертности в Соединенных Штатах Америки (3) и во всем мире (38) и в большинстве случаев является следствием длительного курения сигарет (39). Он характеризуется обструкцией воздушного потока, эмфиземой, рецидивирующими инфекциями (24, 39), хроническим воспалением и избыточным выделением слизи (40). Острые обострения значительно снижают качество жизни пациентов (38, 39). Обострения в основном вызваны вирусными или бактериальными инфекциями, последняя чаще всего вызывается Haemophilus influenzae , Streptococcus pneumoniae и Moraxella catarrhalis (39). Pseudomonas aeruginosa — еще одна часто встречающаяся бактерия, одна из самых опасных из-за ее высокопатогенных свойств (39) и замечательного уровня устойчивости к антибиотикам.

Естественные клетки-киллеры были исследованы при ХОБЛ человека, а также на животных моделях этого заболевания. Motz et al. продемонстрировали, что воздействие на лейкоциты легких вирусных патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMP) индуцировало более высокие функциональные свойства (дегрануляция, измеренная с помощью анализа CD107a, и продукция IFN-γ) ex vivo при хроническом воздействии сигаретного дыма, чем в необработанном C57BL / 6 мышей (40).Интересно, что бактериальный PAMP оказался менее эффективным в этой модели, поскольку среди пяти протестированных молекул только FSL-1 (бактериальный липопептид, агонист TLR2 / 6) и липополисахарид (LPS, лиганд TLR4) увеличивали процентное содержание IFN-γ ⁺. NK-клетки выше одной из мышей, не подвергавшихся воздействию. Напротив, в других работах сообщалось, что функции NK-клеток снижены при ХОБЛ (41).

Кроме того, было неоднократно продемонстрировано, что на моделях ХОБЛ или соответствующих животных цитотоксическая активность NK-клеток повышена по сравнению с курильщиками, не страдающими ХОБЛ, и здоровыми людьми (23, 24).Исходя из модели исходной гипореактивности NK-клеток легких, сигаретный дым и, в еще большей степени, воспалительное состояние нижних дыхательных путей при ХОБЛ активируют альвеолярные макрофаги и индуцируют выработку ими провоспалительных цитокинов. Это, в свою очередь, высвободит NK-клетки и повысит их цитотоксическую активность, экспрессию цитокинов и хемокинов, что приведет к дальнейшему обострению воспаления и клиническому статусу пациентов.

Действительно, в соответствии с этой концепцией Freeman et al.(42) показали, что клетки CD56 ⁺ (на самом деле смесь NK-клеток и CD56 ⁺ Т-лимфоцитов), выделенные из образцов паренхимы легких курильщиков, не страдающих ХОБЛ, и пациентов с ХОБЛ, курящих в анамнезе, хотя схожие по частотам между когортами имели разную цитотоксическую активность по отношению к аутологичным эпителиальным клеткам легких. Лимфоциты CD56 ⁺ от пациентов с ХОБЛ были более цитотоксичными, чем клетки от курильщиков без ХОБЛ, в экспериментальной установке без дополнительной стимуляции.Предполагалось, что клетки-мишени будут в основном эпителиальными клетками на основании их положительности в отношении CD326, их размера и их отрицательности в отношении маркера гемопоэтических клеток CD45. Цитотоксичность измеряли как процент клеток-мишеней Аннексина V ⁺ после совместного культивирования с эффекторами, и в большинстве образцов она составляла около 10%. Это было немного, но NK-клетки и CD56 ⁺ T-клетки иначе не активировались. Большинство паренхиматозных NK-клеток легких были CD56 ⁺ CD16 ⁺ и второстепенные остатки CD56 ⁺ CD16 ^— (42).

Еще одно исследование было проведено той же группой в 2018 г. (43). Было показано, что изолированные очищенные NK-клетки легких индуцируют апоптоз аутологичных эпителиальных клеток. На этот раз средний уровень цитотоксичности был довольно высоким по сравнению с предыдущей статьей, и он был значительно выше у пациентов с ХОБЛ, чем у курильщиков, не курящих. NK-клетки, но не клетки-мишени, определяли эту повышенную цитотоксическую активность, потому что K562, линия HLA-негативных клеток миелоидного лейкоза I класса, используемая в качестве стандартной мишени для NK-клеток, также более эффективно лизировалась NK-клетками ХОБЛ, чем их неорганическими клетками. -COPD аналоги.Авторы подтвердили свои данные на мышиной модели, а затем показали, что NK-клетки были примированы DC посредством транс--презентации IL-15 (43), феномен, впервые описанный в 2007 году Андреасом Дифенбахом и его группой (44). Это хорошо объясняет более высокий уровень цитотоксичности NK-клеток, наблюдаемый при ХОБЛ.

По той же линии Okamoto et al. вводили IL-2 и IL-18 нормальным мышам и наблюдали летальный эффект в течение 4 дней, избирательно поражая легкие, с глубокой интерстициальной инфильтрацией лимфоцитов, в которой преобладали NK-клетки (45).Высокие уровни различных цитокинов и хемокинов были обнаружены в сыворотке и легких. Истощение NK-клеток антителами полностью аннулировало летальное повреждение, что является убедительной демонстрацией потенциально деструктивной силы цитокинов, активирующих NK-клетки, и самих NK-клеток (45). Эта работа была задумана как вклад в выяснение патогенеза интерстициальной пневмонии, но аналогичные механизмы при наличии высоких уровней провоспалительных цитокинов при бактериальных инфекциях могут способствовать развитию ХОБЛ.У больных раком человека введение высоких доз ИЛ-2 вызывало синдром сосудистой утечки, когда так называемые лимфокин-активированные киллерные клетки (эквивалентные высокоактивированным NK-клеткам) разрушали эндотелиальные клетки, вызывая генерализованный отек и повреждая несколько органов (46). .

Hodge et al. продемонстрировали большее количество NK-клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) пациентов с ХОБЛ (когорта состояла из нынешних курильщиков и бывших курильщиков), чем у здоровых курильщиков (47), более высокое содержание цитолитической молекулы гранзима B и , что наиболее важно, значительно повышенная цитотоксическая активность против K562.Они также обнаружили снижение процента NK-клеток BALF, экспрессирующих CD94 (который они считают IR, хотя это скорее молекула-шаперон для истинного IR NKG2A). Тем не менее, этот косвенный показатель подавления NKG2A может указывать на то, что он способствует более высокой цитотоксической активности NK-клеток, наблюдаемой при ХОБЛ (47).

Недавно Остербург и др. представили многопараметрическое исследование проточной цитометрии PB NK-клеток от пациентов с ХОБЛ по сравнению с курильщиками и никогда не курившими (38).В отличие от них, пациенты с ХОБЛ и курильщики высоко экспрессировали маркер созревания CD57, а также AR NKp46 и NKp44 (обычно присутствующие только на активированных, но не на исходных NK-клетках), но более низкие уровни CD56. Определенные субпопуляции NK-клеток свидетельствовали о предшествующих обострениях (38).

AR NKG2C, который в значительной степени присутствует только на адаптивных NK-клетках от людей, инфицированных цитомегаловирусом человека (CMV), не экспрессируется по-разному в PB пациентов с ХОБЛ, курящих в анамнезе, и у здоровых добровольцев, но присутствует на более высоком проценте NK-клеток. у пациентов с наиболее частыми обострениями и наиболее сниженной мышечной массой (48).В этом контексте нельзя исключить взаимосвязь с бактериальной нагрузкой, поскольку может существовать корреляция между вирусной реактивацией и бактериальной колонизацией, что вместе способствует большему количеству обострений.

Большинство работ, обсужденных выше, исследовали цитотоксичность NK-клеток по отношению к аутологичным клеткам или обычным NK-клеткам-мишеням, но как насчет потенциального прямого уничтожения бактерий? NK-клетки при соответствующей стимуляции высвобождают цитолитические молекулы, называемые перфорином, гранзимами и, у человека, но не у мышей, гранулизином, которые обладают аддитивным или синергетическим цитолитическим действием по отношению к бактериям (49).Они могут образовывать поры в стенках клеток-мишеней и тем самым уничтожать микроорганизмы, но, кроме того, они способны уничтожить некоторые типы клеток эукариот, инфицированных бактериями (41, 49, 50). Кроме того, в дополнение к прямому эффекту, NK-клетки встроены в иммунологическую сеть и реагируют (за счет повышенной цитотоксической активности и продукции цитокинов) на иммунные клетки и цитокины / хемокины в их среде (50), которая имеет сильную форму. случай бактериальной инфекции [«межклеточные помехи» (50)].

Данные о хроническом риносинусите, полипозе носа и ХОБЛ обобщены в таблице 1.

Таблица 1. Natural Killer (NK) клетки при заболеваниях дыхательных путей.

синегнойная палочка

Как упоминалось выше, этот вездесущий грамотрицательный патоген является частью тех, кто колонизирует нижние дыхательные пути при ХОБЛ, но он также является серьезной проблемой при муковисцидозе и внутрибольничных инфекциях с высокой заболеваемостью и смертностью (51). Роль NK-клеток в защите хозяина от этой бактерии была довольно подробно изучена командой Майкла Т.Borchers (51, 52) в моделях мышей. В первой хронологической работе беспородных мышей CD-1 интраназально инфицировали лабораторным штаммом PAO1 P. aeruginosa (52) и оценивали через 24 часа. Полученные данные можно резюмировать следующим образом: (i) инфекция увеличивала экспрессию лигандов AR NKG2D, присутствующих почти на всех NK-клетках, но также и в субпопуляции CD8 ⁺ Т-лимфоцитов, in vivo ; (ii) аналогичным образом эти лиганды увеличиваются в инфицированной линии эпителиальных клеток легких человека in vitro ; (iii) ингибирование AR NKG2D моноклональным антителом значительно снижает клиренс P.aeruginosa из легких; (iv) опосредованная антителами блокада NKG2D подавляла количество цитокинов IL-1β, IFN-γ и фактора некроза опухоли (TNF) -α, а также оксида азота; и, наконец, (v) тот же эксперимент также выявил трехкратное снижение повреждения эпителиальных клеток, измеряемое по оттоку этих клеток в ЖБАЛ (52). Последний пункт снова подводит нас к повторяющейся теме повреждения клеток легких, которое может быть вызвано активированными NK-клетками, при этом необходимо определить, является ли это полезным (устранение инфицированных клеток NK-клетками) или вредным (преувеличенное повреждение клеток). эпителий).

В последующей работе (51) была представлена условная модель мыши с индуцибельной экспрессией лигандов NKG2D на эпителиальных клетках легких. Здесь бактериальный клиренс был значительно выше у тех мышей, которые сверхэкспрессировали лиганды NKG2D. Более того, выживаемость до 96 часов после заражения и уровень фагоцитоза были значительно увеличены в последней группе. Аналогичным образом, в экспериментах in vitro , где NK-клетки стимулировали LPS, процент NK-клеток, продуцирующих IFN-γ, был намного выше у мышей с повышенной экспрессией лигандов NKG2D.Как и ожидалось, этот процент снизился (но не был полностью устранен) в NK-клетках инфицированных мышей, обработанных антителом против NKG2D (51).

Однако было показано, что экзотоксин А, производный P. aeruginosa , который в сочетании с IL-1α может вызывать опасное воспалительное состояние с повреждением тканей у хозяина, также ингибирует цитотоксическую активность NK-клеток против K562, даже в наличие обычно стимулирующих цитокинов, таких как IL-2 (53). Ингибирование было почти полным при высокой дозе токсина и все еще частичным при низкой дозе (53).Эффекторные клетки были не очищенными NK-клетками, а мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), так что косвенное влияние на NK-лимфоциты могло играть роль в этом считывании.

Кроме того, Педерсен и Харамзи описали еще в 1987 году, что щелочная протеаза и эластаза, производные P. aeruginosa , ингибируют цитотоксическую активность NK-клеток против K562, предположительно из-за снижения образования конъюгата эффектор-мишень (54). Кроме того, эти молекулы сильно снижали связывание анти-CD16 (в то время называемого Leu-11) антителом (54).

Burkholderia cepacia Комплекс

Эта группа патогенных грамотрицательных бактерий состоит из нескольких видов, некоторые из которых опасны для пациентов с муковисцидозом, поскольку обладают высокой устойчивостью к нескольким антибиотикам (55). Ли и др. (55) исследовали взаимодействие между Burkholderia cenocepacia и NK-клетками и впервые продемонстрировали, что линия NK-подобных лейкозных клеток YT (56), а также первично очищенные NK-клетки человека значительно снижают количество живых бактерий (измеряемое как КОЕ) после совместной инкубации от 2 до 4 часов.Результаты были подтверждены методами визуализации живых клеток и бактериальным поглощением пропидия йодида (PI). Затем авторы захотели узнать, является ли убивающая активность контактно-зависимой или нет, и сначала показали, что клетки YT связываются с меченными флуорохромом бактериями. Затем они смогли продемонстрировать, что прямой контакт необходим для убивающей активности, поскольку с бактериями ничего не происходит, когда они отделяются от NK-клеток пористой мембраной, позволяющей проходить растворимым молекулам, но не клеткам (55).Большинство бактерий оставались внеклеточными и не поглощались клетками YT. Киллинг был почти полностью отменен после обработки хлоридом стронция (SrCl ₂), который, как известно, истощает NK-клетки из их цитотоксических гранул (57). Наконец, было установлено, что киназы семейства Src активируются в клетках YT после контакта с B. cenocepacia (55). Это очень хорошая демонстрация того, что NK-клетки способны напрямую убивать определенные внеклеточные виды бактерий через контакт NK-клетки с бактериями, хотя точный механизм до сих пор неизвестен.Другими возможными механизмами опосредованного NK-клетками элиминации бактерий являются лизис внутриклеточных патогенов внутри инфицированных клеток и активация других иммунных клеток, особенно макрофагов, посредством цитокинов, производных от NK-клеток (таких как IFN-γ) (55). , и, скорее всего, также уничтожение инфицированных бактериями клеток, экспрессирующих лиганды для AR NK-клеток.

Klebsiella pneumoniae

Это еще один грамотрицательный патоген, который представляет серьезную проблему из-за его частого причинного участия в нозокомиальных инфекциях (особенно при пневмонии) и неуклонном росте штаммов с множественной устойчивостью к антибиотикам (58).Chalifour et al. (59) продемонстрировали, что белок A внешней мембраны (KpOmpA) этого микроорганизма, который, как известно, передает сигнал через TLR2, индуцировал синтез и высвобождение IFN-γ и α-дефенсина (антимикробный пептид) в NK-клетках человека. Было описано, что у мышей IFN-γ, происходящий из NK-клеток (58), и IL-22 (60), необходимы для бактериального клиренса (58, 60). В статье Xu et al. С помощью генетического контроля и экспериментов по истощению было хорошо показано, что иммунная защита против этого патогена действительно глубоко затрагивает NK-клетки и что их подмножество продуцирует IL-22.NK-клетки имели обычный зрелый фенотип (меньше CD27 ⁺, больше KLRG1 ⁺), отличный от других врожденных лимфоидных клеток (ILC) (60). Ивин и др. основное внимание уделялось тому факту, что продукция IFN-γ NK-клетками, также необходимая для устранения бактерий через сеть с альвеолярными макрофагами, зависит от внутренней стимуляции NK-клеток IFN типа I, в свою очередь индуцируемой K. pneumoniae. (58). В отличие от решающей роли цитокинов, происходящих из NK-клеток, их гранзимы (A и B), один из компонентов литических гранул, по-видимому, не играют важной роли в этой модели (61).Однако это не исключает того, что у человека гранулизин и перфорин вместе могут оказывать цитотоксическое действие на эти бактерии.

Другие грамотрицательные бактерии

В случае Helicobacter pylori , ответственного за хроническое воспаление желудка с потенциалом привести к язве или раку, предварительная инкубация с фиксированными бактериями увеличивала цитотоксическую активность PBMC, обогащенных NK-клетками, в отношении K562 и других опухолевых клеток-мишеней, поскольку а также высвобождение IFN-γ (62).Кроме того, Rudnicka et al. показали, что бактериальный экстракт глициновой кислоты индуцировал рост NK-клеток и продукцию IFN-γ, тогда как LPS из тех же бактерий ингибировали эти параметры и вместо этого способствовали появлению NK-клеток, продуцирующих IL-10 (63). Хотя это может незначительно иметь отношение к NK-клеткам в легких, тем не менее, это показывает, в какой степени эти клетки могут реагировать на бактерии и как последние пытаются манипулировать ими.

Legionella pneumophila , возбудитель болезни легионеров, реплицируется внутриклеточно в макрофагах.Здесь опять же, продукция IFN-γ NK-клетками, индуцированная, вероятно, через прямые сообщения TLR (64), IL-12 [продуцируемая DC (65)] и IL-18 [продуцируемая нейтрофилами (66)], имела решающее значение для бактериальной клиренс из легких. Кроме того, Blanchard et al. в 1988 г. уже наблюдали на мышиной модели, что этот патоген стимулировал NK-клетки in vivo и in vitro для производства IFN-γ и повышения их цитотоксической активности по отношению к линиям опухолевых клеток, причем самые высокие уровни были измерены в легких ( 67).

Грамположительные бактерии

Одним из наиболее частых виновников внебольничной пневмонии является S. pneumoniae . Что касается роли NK-клеток в этой инфекции, их положительное или вредное действие зависело от серотипа патогена (68). Таким образом, контроль серотипа 1 зависел от NK-клеток, как продемонстрировали Baranek et al. в модели мыши (68). Эти авторы исследовали последствия дефекта транскрипционного кофактора Четыре с половиной LIM-only белка 2 (FHL-2) на NK-клетки в целом и на пневмококковую инфекцию в частности.Ранее было установлено, что IFN-γ снова является решающим фактором защиты хозяина в этом контексте, и что NK-клетки являются одними из его основных продуцентов (69). В селезенке и легких мышей с нокаутом FHL-2 (KO) количество NK-клеток и их экспрессия AR NKG2D и NK1.1 (CD161c) подавлялись, и это отрицательно влияло на созревание NK-клеток. наблюдалось. Смертность от инфекции легких S. pneumoniae была сильно увеличена у мышей KO, но ее можно было спасти путем адоптивного переноса NK-клеток дикого типа.Наконец, авторы показали, что продукция IFN-γ NK-клетками сильно снижена и что меньше нейтрофилов рекрутируется в легкие KO животных (68).

Роль в основном иммуносупрессивного цитокина IL-10 в ослаблении иммунного ответа на пневмококковую инфекцию была показана в 1996 г., когда van der Poll et al. патоген вводили интраназально вместе с IL-10 и наблюдали раннюю смертность и снижение уровней провоспалительных факторов IFN-γ и TNF. И наоборот, все это было восстановлено, когда мышей предварительно обработали антителом против IL-10 (70).

Эти результаты совсем недавно были подтверждены Clark et al. (71), которые работали с репортером IL-10 и мышами IL-10-KO, чтобы заметить, что S. pneumoniae индуцировала продукцию IL-10 NK-клетками (около 50% от общего количества NK-клеток легких) с отрицательным эффектом на животных. выживаемость и что бактериальная нагрузка в легких мышей KO была уменьшена по сравнению с животными дикого типа. Истощение последних в NK-клетках вызвало сильное снижение количества бактерий в легких и IL-10. Кроме того, у мышей с дефицитом ИЛ-10 в инфицированных легких было значительно больше нейтрофилов и моноцитов.Наконец, белок вирулентности Spr1875 из S. pneumoniae был идентифицирован как фактор, индуцирующий IL-10 (71).

Ни одна из этих работ не исследовала потенциальный баланс между провоспалительным и противовоспалительным действием IFN-γ и IL-10, соответственно, на исход этой инфекции, что в любом случае было бы технически сложной задачей. Можно было бы предположить, что IL-10 действует для подавления подавляющего иммунного ответа, который может повредить ткани легких, но, с другой стороны, слишком большое его ослабление и, таким образом, потеря контроля над патогенами может оказаться контрпродуктивным (72). .Другие группы описали, что человеческие NK-клетки, а также мышиные NK-клетки могут продуцировать и высвобождать IL-10 (73, 74), хотя, согласно Perona-Wright et al., Это происходило только в случае системного, но не локализованного легочная инфекция (с грамотрицательной бактерией Yersinia pestis ) (74). В случае системных инфекций, вызванных Listeria monocytogenes и Y. pestis , примерно 50% NK-клеток крови превратились в IL-10 ⁺, и цитокин продуцировался подмножеством NK-клеток, циркулирующих в крови до заражения. (74).

Перед изучением S. pneumoniae (71), Clark et al. уже показали, что L. monocytogenes вызывает продукцию IL-10 NK-клетками через фактор вирулентности p60 (с, как следствие, ингибированием рекрутирования и активации миелоидных клеток) на мышиной модели системной инфекции, где легкие в дальнейшем не исследовались (75).

Другой часто встречающийся нозокомиальный и мультирезистентный инфекционный агент — это Staphylococcus aureus .Смолл и др. может продемонстрировать фундаментальную роль NK-клеток в ответе на эти бактерии в случае инфекций легких у мышей (76), поскольку (i) количество NK-клеток в дыхательных путях увеличивалось; (ii) in vitro, контактирует с продуктами патогенов, активированных NK-клетками; (iii) совместное культивирование NK-клеток с альвеолярными макрофагами увеличивало фагоцитарную активность последних, (iv) мыши IL-15-KO были намного более восприимчивы к инфекции, чем мыши дикого типа, тогда как у них было гораздо больше нейтрофилов и макрофагов в легкие; и (v) истощение NK-клеток делает даже мышей дикого типа высокочувствительными, несмотря на консервативную продукцию IL-15 (76).Эти результаты действительно еще раз демонстрируют важную роль NK-клеток в иммунной защите от внеклеточных бактерий.

В соответствии с этой моделью Zhao et al. показали, что конкретное вещество, эпидемиологически связанное с увеличением числа легочных инфекций, уменьшает количество NK-клеток, мигрирующих в легкие крысы в случае инфицирования S. aureus , тогда как адоптивный перенос NK-клеток восстанавливает энергичный ответ NK-клеток (77). В экспериментах ex vivo NK-клетки улучшили, как и в предыдущем исследовании, фагоцитоз патогенов альвеолярными макрофагами.

Хорошо известно, что после гриппа выздоравливающие пациенты очень восприимчивы к бактериальной суперинфекции, особенно к S. pneumoniae и S. aureus (78). Вклад NK-клеток в это явление был продемонстрирован на мышиной модели инфицирования вирусом гриппа h2N1 с последующей интратрахеальной инстилляцией S. aureus . Последовательно дважды инфицированные мыши были намного более восприимчивы к инфекции (потеря веса, выживаемость), чем мыши, получавшие PBS или только бактерии.Это сопровождалось серьезными изменениями в гистопатологическом аспекте легких и заметным снижением количества локальных NK-клеток и TNF-α ⁺ NK-клеток. Кроме того, концентрации TNF-α и хемокинов IP-10 и MIP-1α были уменьшены в BALF. Адаптивный перенос наивных NK-клеток может восстановить иммунный ответ. NK-клетки нуждались в TNF-α для выполнения своего антибактериального эффекта, и это было организовано через взаимодействие с альвеолярными макрофагами и усиление фагоцитоза (78).

Из всех этих статей можно сделать вывод, что NK-клетки очень важны, по крайней мере, на моделях мышей, для иммунного ответа и защиты от легочных инфекций, вызываемых грамположительными бактериями, с другой стороны, пагубное влияние этих лимфоцитов в случае, если они производят слишком много иммуносупрессивных факторов [та же старая история (72)].

Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерии
Mycobacterium tuberculosis — возбудитель туберкулеза (ТБ), инфекционного заболевания, которое ложится тяжелым бременем на население в развивающихся, но также и в развитых странах и все более проявляет устойчивость к обычным антибиотикам.По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (79, 80), он латентно инфицирует около 25% всего населения и клинически проявляется у десяти миллионов пациентов в год, что делает его серьезной проблемой общественного здравоохранения. Как недавно было написано Cong и Wei (23), NK-клетки могут взаимодействовать с этим внутриклеточным патогеном через AR NKp46, NKp44 и NKG2D, а также TLR2. Хотя они активировались в этих условиях, они, по-видимому, играли лишь незначительную защитную роль, согласно Junqueira-Kipnis et al.(81). Эти авторы показали на мышиной модели, что количество NK-клеток легких увеличивалось в течение первых 3 недель после воздействия аэрозолей, содержащих микобактерии и активированные CD69, IFN-γ и перфорин. Однако их истощение нисколько не изменило кинетику инфекции. Человеческие РВ-NK-клетки также активируют IFN-γ после контакта с M. tuberculosis (23).
Barcelos et al. (82) сравнили PB NK-клетки в когортах пациентов с активным туберкулезом, изолированными туберкулиновыми ⁺ кожными пробами и туберкулиновыми ^— здоровых доноров.Они обнаружили различное распределение подмножеств в зависимости от когорт, у предполагаемых лиц, подвергшихся воздействию ТБ, но устойчивых (определяемых как лица с положительным туберкулиновым тестом), у которых в целом меньше NK-клеток, но повышенный процент CD56 ^— CD16 ⁺, CD56 ⁺ CD16 ^— и особенно CD56 ^bright CD16 ^{— / +} субнаборов NK-клеток по сравнению с двумя другими донорскими группами. Напротив, у больных ТБ наблюдались более низкие частоты CD56 ⁺ CD16 ⁺ клеток.Авторы предположили, что это различное распределение подмножеств могло быть связано с устойчивостью или чувствительностью к активному ТБ, но, конечно, поскольку клетки происходят из PB, этот набор данных, возможно, следует интерпретировать с некоторой осторожностью.
Однако удивительно, что Roy Chowdhury et al. (80), проследив за когортой подростков из эндемичного региона Южной Африки, смогли продемонстрировать с помощью массовой цитометрии и функциональных экспериментов, что латентный ТБ был связан с повышенными ответами PB NK-клеток, с особой ролью AR CD16.Действительно, процентное содержание NK-клеток среди всех живых клеток, от общего количества клеток CD16 ⁺, клеток гранзима B ⁺ и клеток перфорина ⁺ было значительно выше у пациентов с латентным ТБ, чем у здоровых, неинфицированных доноров. Кроме того, ADCC (опосредованный CD16) против клеток-мишеней P815 также был выше при латентном ТБ. Следя за другими когортами, авторы обнаружили, что процент PB NK-клеток динамически регулируется во время латентного периода, прогрессирования заболевания и ответа на лечение антибиотиками.Этот уровень NK-клеток в PB даже обратно коррелировал с воспалением в легких пациентов с активным туберкулезом (80). Такие наблюдения снова выдвигают NK-клетки на передний план иммунной защиты при туберкулезе и их возможную роль в поддержании латентного периода.
Используя аналогичный когортный подход, Harris et al. (79) оценили фенотип и функции NK-клеток у лиц с латентным туберкулезом по сравнению со здоровым контролем. Кроме того, участники были разделены на инфицированных и неинфицированных в эндемичном по туберкулезу регионе в Кении и когорту здоровых добровольцев из США.Среди трех групп у людей из США был значительно самый низкий процент клеток CD56 ^—, которые, как известно, разрастаются при хронической инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и других вирусных заболеваниях и являются дисфункциональными (83). Кенийские добровольцы продемонстрировали среди NK-клеток CD56 ^dim более высокую экспрессию гранзима B и не-MHC класса I IR TIGIT, с самыми высокими уровнями, обнаруженными в когорте здоровых людей. Кроме того, эти люди имели повышенную экспрессию AR NKp46.В субпопуляции CD56 ^bright кенийские участники продемонстрировали повышенную экспрессию NKG2D, но снова пониженные уровни NKp46 по сравнению с когортой из Соединенных Штатов. Функционально дегрануляция (анализ CD107a), продукция IFN-γ (внутриклеточная проточная цитометрия) и экспрессия CD69 сравнивались между тремя когортами после совместного культивирования с клетками K562 (оценка естественной цитотоксичности) и клетками мыши P815 плюс антимышиное антитело (оценка ADCC). В то время как для последнего параметра не наблюдалось никаких существенных различий, частота NK-клеток CD69 ⁺, CD107a ⁺ и IFN-γ ⁺ оказалась значительно выше в исследуемой популяции Соединенных Штатов, например, если бы среда, эндемичная для ТБ, может повлиять на способность NK-клеток к «отсутствию самопознания» (79).Такие же региональные различия наблюдались после стимуляции общих PBMC тремя различными экстрактами антигенов из M. tuberculosis , и было показано, что реактивность к этим антигенам, по крайней мере, частично зависит от присутствия IL-12 и IL-18, предположительно происходить из дополнительных клеток.
Conradie et al. (84) описали, что уровень активации PB NK-клеток (частота событий CD69 ⁺ и CD69 ⁺ HLA-DR ⁺) позволяет, среди других параметров, различать M.tuberculosis -индуцированный синдром восстановления иммунитета, ВИЧ-инфекция и коинфекция обоими патогенами.
Хотя эти три статьи предполагают некоторое влияние M. tuberculosis на PB NK-клетки, еще не ясно, в какой степени NK-клетки действительно вмешиваются в иммунную защиту против этого патогена, который сохраняется в легких. Исследование туберкулезного плеврита (85) выявило большое преобладание CD56 ^ярких CD16 ^— NK-клеток в плевральной жидкости и апоптотический эффект растворимых факторов из этой среды преимущественно на NK-клетки CD16 ⁺. M. tuberculosis индуцировал продукцию IFN-γ из CD56 ^ярких NK-клеток в отсутствие моноцитов, T-клеток и B-клеток, оставляя открытой возможность прямого продуктивного взаимодействия между бактериями и NK-клетками.
Lai et al. (86) представили работу о нетуберкулезных микобактериальных инфекциях легких, что означает, что они вызваны другими видами микобактерий, такими как Mycobacterium abscessus и Mycobacterium kansasii . Поскольку последние становятся все более и более распространенными в развитых странах, эти авторы провели исследование на мышах C57BL / 6, инфицированных интратрахеально M.kansasii . Они обнаружили, что истощение NK-клеток увеличивает бактериальную нагрузку, смертность и патогенетические постинфекционные изменения (фагоцитоз макрофагов, активация DC, выработка цитокинов и развитие гранулемы). Такие же наблюдения были сделаны на IFN-γ-KO животных и восстановлены после переноса NK-клеток дикого типа. Эти клетки также были наиболее важным продуцентом IFN-γ в этой модели (86). Lai et al. далее цитировались статьи, которые продемонстрировали аналогичный защитный эффект IFN-γ, продуцируемого NK-клетками, при инфекциях, вызываемых Bordetella pertussis , Francisella tularensis и Chlamydia muridarum на мышиных моделях респираторной инфекции.
Предыдущие публикации той же группы показали, что NK-клетки могут непосредственно лизировать M. tuberculosis и M. kansasii через цитотоксические белки гранулизин и перфорин контактно-зависимым образом, нарушая целостность клеточной стенки микобактерий (87), и что у некоторых пациентов с микобактериальными инфекциями были обнаружены аутоантитела к IFN-γ (88). Процесс уничтожения включает передачу сигналов через NKG2D и NCR, а также через киназы MAP, что позволяет предположить, что аналогичные механизмы задействованы в уничтожении бактерий и эукариотических клеток-мишеней (87).Это потенциально очень важное наблюдение, поскольку оно убедительно свидетельствует о том, что как традиционные цитотоксические механизмы, так и продукция цитокинов могут иметь отношение к антимикобактериальной защите.

Некоторые исследования были также выполнены на Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), аттенуированном штамме микобактерий, используемом в качестве противотуберкулезной вакцины (89). Например, было продемонстрировано in vitro , что NK-клетки CD56 ^bright реагировали на этот микроорганизм путем пролиферации и продукции IFN-γ, тогда как их аналоги CD56 ^dim лучше регулировали цитолитические белки перфорин и гранзим A (90). , все это в значительной степени ожидалось, основываясь на том, что известно о функциональной специализации этих двух подмножеств NK-клеток (1–3).В модели мыши in vivo, где БЦЖ вводили непосредственно (интратрахеально) в легкие, продукция IFN-γ, опосредованная NK-клетками, быстро увеличивалась в первые дни после заражения, подобно количеству NK-клеток легких (89). . После истощения NK-клеток снижение массы тела было менее выраженным по сравнению с не истощенными мышами, тогда как бактериальная нагрузка оставалась идентичной. Важно отметить, что воспаление и повреждение легочных структур были гораздо менее выражены у животных с истощением NK-клеток, что указывает на патогенную роль этих лимфоцитов.Действительно, уровень провоспалительных цитокинов и хемокинов также был снижен в отсутствие NK-клеток, а процентное содержание IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ и IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток было значительным. увеличилось у этих мышей. Макрофаги, инфицированные Bacillus Calmette-Guérin, активировали лиганды NKG2D, что индуцировало их лизис посредством этого взаимодействия рецептор-лиганд. Наконец, блокирование NKG2D моноклональным антителом восстановило выживаемость макрофагов и опосредованный Т-клетками иммунный ответ (89).

Трудно провести последовательный синтез всех этих наблюдений над NK-клетками и микобактериями, но, тем не менее, весьма привлекательно то, что снова описаны положительные, отрицательные и нейтральные аспекты, которые могут варьироваться в зависимости от моделей и экспериментальной установки. Это показывает, что NK-клетки по-прежнему скрывают множество секретов, касающихся их функции при антимикобактериальных инфекциях, а также в бактериальном патогенезе в целом. Сводка взаимоотношений между обсуждаемыми бактериями и NK-клетками представлена в таблице 2.

Таблица 2. Естественные киллерные (NK) клетки и различные бактерии.

Хламидиоз

Это облигатные внутриклеточные патогенные бактерии, вызывающие несколько типов заболеваний человека и мышей. Различные исследования, посвященные этому типу микроорганизмов, проиллюстрировали концепцию о том, что NK-клетки обычно не реагируют как чистая популяция, как это может иметь место в экспериментах in vitro, , но что in vivo они являются частью строго контролируемой иммунной сети, состоящей из клеток, цитокинов, хемокинов и экзосом.

Таким образом, на мышиных моделях NK-клетки влияли на взаимодействие между DC, Т-хелпером (h) 1 и Т-лимфоцитами Th27 при инфекции легких C. muridarum (91), модулировали баланс между Т-клетками Th2 и Th27 и Т-регуляторными клетками. (Treg) при том же типе инфекции (92), и снова положительно регулирует взаимодействия между DC и Т-лимфоцитами против Chlamydophila pneumoniae (93). Во всех этих ситуациях NK-клетки проявляли защитный и контролирующий заболевание эффект через свое влияние на мост между врожденными и адаптивными иммунными ответами.

С амбициозной целью экспериментального исследования знаменитой «гигиенической гипотезы» Han et al. (94) изучали мышей, инфицированных C. muridarum и у которых была аллергия на овальбумин (OVA). Они заметили, что предшествующая инфекция могла подавить, по крайней мере, некоторые параметры аллергии. Однако истощение NK-клеток частично подавляло «положительный» эффект легочной инфекции. Адоптивный перенос NK-клеток от инфицированных мышей частично подавлял развитие аллергической реакции у неинфицированных реципиентов.Мыши, лишенные NK-клеток, когерентно продуцировали больше цитокинов типа Th3 («проаллергических» цитокинов Th3, IL-4 и IL-5), чем IFN-γ («противоаллергических» цитокинов Th2).

Пагубное действие NK-клеток было показано на иммунный ответ на респираторный патоген грызунов Mycoplasma pulmonis , связанный с инфекционным агентом человека Mycoplasma pneumoniae . Действительно, в довольно сложной экспериментальной установке Бодханкар и др. продемонстрировали, что истощение NK-клеток положительно влияет на развитие защитного адаптивного иммунитета после назально-легочной иммунизации бактериальными антигенами (95).Это можно объяснить тем, что NK-клетки формируют цитокиновый ответ Т-клеток на большее количество IL-4, IL-13 и IL-17, но не на продукцию IFN-γ.

Природные киллерные клетки как клинические индикаторы респираторных инфекционных заболеваний у детей

Wurzel et al. представили большие когортные исследования детей с затяжным бактериальным бронхитом (ПББ) и легкими бронхоэктазами, связанными или не связанными с коинфекцией аденовируса человека (96, 97). Помимо типичных социально-экономических и клинических факторов, повышенное количество NK-клеток по сравнению со значениями здоровых детей того же возраста наблюдалось в PB больных детей в целом и с аденовирусом вида C в частности.Фенотип и функция NK-клеток в дальнейшем не исследовались.

Кир человека распознает консервативный бактериальный эпитоп

Недавно Sim et al. (98) сделали важное открытие, что HLA-C-специфический активирующий KIR2DS4 действительно распознает консервативный бактериальный пептид, представленный HLA-C, а точнее HLA-C ^* 05:01. Последовательность пептида, необходимая для этого распознавания, была «редким» самопептидом, но интересующий эпитоп консервативен в рекомбиназе A (RecA) многих видов бактерий (более 1000 по заявлению авторов), большинство из них они принадлежат к серьезным патогенам человека, таким как Helicobacter pylori , Brucella, Campylobacter jejuni и Chlamydia trachomatis (98).Интересно, что активации покоящихся NK-клеток с помощью одного только KIR2DS4 было достаточно, чтобы вызвать дегрануляцию и продукцию цитокинов, тогда как для всех других известных AR, кроме CD16, требуется по крайней мере одна коактивирующая молекула, задействованная одновременно (99). Кроме того, наблюдалась обратная корреляция между частотой полноразмерного гена KIR2DS4 и аллелем HLA-C ^* 05:01. Таким образом, похоже, что семейство KIR участвует не только в лицензировании NK-клеток и во множественных ассоциациях болезней, но также, скорее всего, в антибактериальной защите.К этой статье прилагается комментарий Питера Пархема, в котором результаты помещаются в более широкий контекст молекул KIR и HLA класса I (100).

Подводя итог, можно сказать, что NK-клетки могут напрямую активироваться различными бактериями через контактно-зависимые механизмы, способы функционирования которых до сих пор неизвестны, через TLR, через KIR2DS4 или, более косвенно, через повышающую регуляцию лигандов для их AR, таких как NKG2D. инфицированными клетками. Они также могут реагировать на цитокины, высвобождаемые в микроокружение антигенпрезентирующими клетками (макрофагами, ДК).

Современные методы исследования легких

Dietert et al. опубликовали призыв к гистопатологической оценке последствий различных инфекционных заболеваний легких на моделях мышей и описали патоген-специфические особенности, характерные для каждой из них (101). Действительно, наблюдались многие различия между инфекционными микроорганизмами, будь они бактериальными или вирусными по своей природе. Авторы подчеркнули, что гистопатология остается «наиболее убедительным и практическим методом» для оценки воздействия различных инфекционных моделей на легкие мыши.

Хотя это правда, более «современные» и современные методы разрабатываются и вот-вот войдут в лаборатории, как следствие общего научно-технического прогресса, а также подхода «3R» в отношении экспериментов с животные.

В 2019 году команда Ханса Клеверса описала создание органоидов дыхательных путей человека, полученных из хирургического материала или из ЖБАЛ (102). Это были долговременно пролиферирующие структуры, которые воспроизводили нормальные дыхательные пути с различными типами клеток, которые физиологически присутствуют in vivo .Красота системы как таковая уже была достижением, но ее можно было использовать для изучения различных заболеваний легких, таких как муковисцидоз, рак или вирусные инфекции (102). Следовательно, вполне вероятно, что бактериальные инфекции можно было бы аналогичным образом исследовать в этой системе, и полученные данные, вероятно, были бы более актуальными для патологии человека, чем простые мышиные модели (и, кстати, спасли бы жизнь многих мышей).

В том же году Росс и др. (103) опубликовали обзор « ex vivo легкого человека.Они работали с донорскими легкими, не оставшимися для трансплантации, извлекали из них первичные клетки и разработали «единичное легкое человека с перфузией ex vivo, », которое позволило бы исследовать различные заболевания легких. Система кажется на первый взгляд менее элегантной, чем органоиды легких, и, возможно, также более ограничена в спектре возможных патологий, которые можно исследовать. Преимущество состоит в том, что доступен целый орган, а не только органоид.

Еще один вариант — «альвеола на чипе», разработанный Deinhardt-Emmer et al.(104). Это была трехмерная структура с воздушной фазой и жидкой фазой, где можно было совместно культивировать эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и макрофаги. В представленной работе была исследована первичная вирусная инфекция гриппа, за которой последовала суперинфекция S. aureus , и было показано, что эндотелий был серьезно поврежден в этих условиях.

Аналогичным образом, транскриптомика одиночных клеток является мощным инструментом, который может раскрыть огромное количество деталей обо всех типах иммунных клеток, в том числе NK-клетках, например, иммуноцитами, инфильтрирующими рак легких, у человека и мыши (105).

Естественные клетки-киллеры как терапевтический вариант при инфекциях дыхательных путей? Пещера Канем!

Одним из аспектов NK-клеток является их предполагаемый потенциал для двойной роли как «провоспалительных» и «регулирующих» эффекторов, которые могут быть опосредованы разными подмножествами (106). Наша группа ранее затрагивала проблему, заключающуюся в том, что NK-клетки на самом деле являются палкой о двух концах, а это означает, что они могут иногда иметь положительные, а иногда и вредные эффекты (72). Это снова стало ясно в ходе данного обзора, хотя представленные и обсужденные модели и исследования были почти однородными.Можно ожидать, что это изменится в ближайшие годы, если все больше и больше команд будут использовать органоидные технологии и технологии «орган на кристалле» и заниматься различными «омиками». В целом, учитывая текущую и обоснованную шумиху вокруг NK-клеток как эффективных агентов для иммунотерапии рака, было бы трудно убедить сообщество NK в том, что их любимые клетки также могут иметь темную сторону. Мы подчеркиваем, что нескольких методов повышения противоопухолевой эффективности NK-клеток, таких как, в частности, CAR-NK-клетки (10) и вовлечение NK-клеток, недавно описанные группой Vivier (107), должно быть достаточно, чтобы поддержать использование NK-клеток в это указание.

Однако как быть с показаниями к применению NK-клеток при инфекционных заболеваниях в целом и легких в частности? В связи с нынешней пандемией COVID-19 этот вопрос вызвал повышенный интерес (108, 109), и, кроме того, большинство обсуждаемых здесь статей, описывающих влияние NK-клеток на течение заболевания в дыхательных путях, завершаются утверждением, что NK-клетки должны быть нацелены на респираторные инфекции. Но было ясно показано, что эти лимфоциты могут иметь пагубные побочные эффекты и вызывать значительное повреждение дыхательных путей, по крайней мере, при вирусных заболеваниях (108, 109).В доступной литературе нет четких указаний относительно бактериального патогенеза, но этот вопрос уже обсуждался в 2012 году, когда задавался вопрос, являются ли NK-клетки ангелами или дьяволами при бактериальных инфекционных заболеваниях (50). Эта проблема, по нашему мнению, еще не решена, и в этой области потребуется много исследовательской работы, имея в виду, что количество мультирезистентных бактериальных штаммов растет ужасающими темпами и что необходимо найти альтернативы антибиотикам. и развивался.

Наконец, общей проблемой в данной области и предостережением для многих представленных исследований является сложность различения NK-клеток, надежно формирующих ILC1, которые также продуцируют IFN-γ в качестве сигнатурного цитокина и имеют частично перекрывающийся фенотип. Высокая пластичность в семействе ILC делает даже возможным превращение NK-клеток в определенных микросредах в ILC1-подобные клетки (110–112). Однако, в то время как и NK-клетки, и ILC1 нуждаются в транскрипционном факторе T-bet для своего развития и функционирования, NK-клетки нуждаются и дополнительно экспрессируют Eomes.ILC1 преимущественно локализуются в тканях и очень редко встречаются в периферической крови, в отличие от NK-клеток. Таким образом, можно быть уверенным, что обсуждаемые здесь исследования, которые работали с NK-клетками крови (человека) и крови или селезенки (мыши), действительно исследовали NK-клетки, а не ILC1. Для тканевых исследований различия могут быть более нечеткими, хотя ILC1 считаются нецитотоксическими клетками (110–112). Эти трудности соответствуют растущему числу «новых» типов клеток, которые в настоящее время открываются [например, Т-клетки MR1 (113)], как следствие постоянно растущей диверсификации и эффективности экспериментальных инструментов в иммунологии.

Авторские взносы

MT и NP разработали статью, участвовали в библиографическом исследовании и критически рассмотрели окончательный вариант отредактированной рукописи. JZ задумал статью и написал рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

NP был поддержан грантом гордости Люксембургского национального исследовательского фонда (FNR): PRIDE / 11012546 / NEXTIMMUNE.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить профессора доктора Маркуса Оллерта, доктора медицины, директора Департамента инфекций и иммунитета Люксембургского института здравоохранения, за его постоянную поддержку.

Список литературы

1. Купер М.А., Фенигер Т.А., Калиджури М.А. Биология естественных подмножеств клеток-киллеров человека. Trends Immunol. (2001) 22: 633–40. DOI: 10.1016 / S1471-4906 (01) 02060-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4.Аманд М., Изерентант Дж., Поли А., Слейман М., Фьевес В., Санчес И. П. и др. Человеческие CD56 ^dim CD16 ^dim клетки как индивидуализированная подгруппа естественных клеток-киллеров. Front Immunol. (2017) 8: 699. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00699