Нк рф статья 16: Статья 16. Информация о налогах / КонсультантПлюс

Содержание

Ст. 16 НК РФ. Информация о налогах

1. Информация и копии законов, иных нормативных правовых актов об установлении, изменении и прекращении действия региональных и местных налогов направляются органами государственной власти субъектов Российской Федерации и органами местного самоуправления в территориальные органы федерального органа исполнительной власти, уполномоченного по контролю и надзору в области налогов и сборов, по соответствующему субъекту Российской Федерации и финансовые органы соответствующих субъектов Российской Федерации.

2. Указанная в пункте 1 настоящей статьи информация представляется в территориальные органы федерального органа исполнительной власти, уполномоченного по контролю и надзору в области налогов и сборов, по соответствующему субъекту Российской Федерации в электронной форме. Форма, формат и порядок направления указанной информации в электронной форме утверждаются федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным по контролю и надзору в области налогов и сборов.

Комментарий эксперта:

Информация о налогах в свете положений ст. 16 НК РФ >>>

Местные и региональные налоги устанавливаются законодательными органами областей, краёв, округов и республик, входящих в состав РФ, в рамках полномочий, которые даны им федеральным законодательством.

См. все связанные документы >>>

Комментируемая статья устанавливает обязанность для уполномоченных органов субъектов РФ и муниципальных образований направлять в Минфин России и ФНС России, а также территориальные налоговые органы и финансовые органы субъектов РФ сведения об установленных региональных и местных налогах.

В судебной практике существует решение, в котором неисполнение обязанности, предусмотренной статьей 16 НК РФ, наряду с другими представленными доказательствами позволило суду прийти к выводу о неустановлении регионального налога (см. Постановление ФАС Поволжского округа от 13.04.2007 N А55-14116/2006).

Следует отличать информирование о действующих региональных и местных налогах и сборах, о котором идет речь в статье 16 НК РФ, и предоставление налоговыми органами сведений о действующих налогах и сборах.

Опубликование сведений о действующих налогах и сборах налоговыми органами не связано с официальным опубликованием нормативных правовых актов. Разъяснения налоговых органов в отношении налогов и сборов носят рекомендательный характер (см. Постановление ФАС Северо-Кавказского округа от 15.08.2006 N Ф08-3578/2006-1545А).

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 16 НК РФ.

1. Информация и копии законов, иных нормативных правовых актов об установлении, изменении и прекращении действия региональных и местных налогов направляются органами государственной власти субъектов Российской Федерации и органами местного самоуправления в территориальные органы федерального органа исполнительной власти, уполномоченного по контролю и надзору в области налогов и сборов, по соответствующему субъекту Российской Федерации и финансовые органы соответствующих субъектов Российской Федерации.

2. Указанная в пункте 1 настоящей статьи информация представляется в территориальные органы федерального органа исполнительной власти, уполномоченного по контролю и надзору в области налогов и сборов, по соответствующему субъекту Российской Федерации в электронной форме. Форма, формат и порядок направления указанной информации в электронной форме утверждаются федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным по контролю и надзору в области налогов и сборов.

Комментарий к Ст. 16 Налогового кодекса

В комментируемой статье устанавливается обязанность органов государственной власти субъектов Российской Федерации и органов местного самоуправления направлять информацию и копии законов, иных нормативных правовых актов об установлении, изменении и прекращении действия региональных и местных налогов.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

Установление этой обязанности в НК РФ представляет собой важную организационно-правовую гарантию единства законодательства о налогах и сборах, которое в соответствии со ст. 1 НК РФ, помимо собственно федерального законодательства (законодательства Российской Федерации о налогах и сборах), включает в себя региональный и муниципальный уровни законодательства, насчитывающие сотни и тысячи нормативных правовых актов.

Комментируемая норма гарантирует публичность правового регулирования налоговых отношений на всей территории Российской Федерации.

Получателями информации в соответствии с комментируемой статьей являются, во-первых, Министерство финансов РФ и финансовые органы субъектов РФ, которые, среди прочего, в соответствии со ст. 34.2 НК РФ предоставляют письменные разъяснения налоговым органам, налогоплательщикам и налоговым агентам по вопросам применения законодательства о налогах и сборах. Во-вторых, соответствующая информация должна предоставляться также в соответствии с комментируемой статьей НК РФ ФНС России и ее территориальным органам. Не имея информации о состоянии нормативно-правовой базы на региональном и муниципальном уровнях, налоговые органы не смогут выполнять свою основную функцию - контролировать соблюдение законодательства о налогах и сборах на всей территории Российской Федерации.

Статья 15. Местные налоги и сборы

К местным налогам и сборам относятся:

1) земельный налог;

2) налог на имущество физических лиц;

3) торговый сбор.

Комментарий к ст. 15 НК РФ

Местными налогами признаются налоги, которые установлены настоящим Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований о налогах и обязательны к уплате на территориях соответствующих муниципальных образований, если иное не предусмотрено настоящим пунктом и настоящим Кодексом.

Местные налоги вводятся в действие и прекращают действовать на территориях муниципальных образований в соответствии с настоящим Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований о налогах.

К местным налогам относятся:

1) земельный налог;

2) налог на имущество физических лиц.

Земельный налог и налог на имущество физических лиц устанавливаются настоящим Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов поселений (муниципальных районов), городских округов о налогах и обязательны к уплате на территориях соответствующих поселений (межселенных территориях), городских округов, если иное не предусмотрено настоящим Кодексом. Земельный налог и налог на имущество физических лиц вводятся в действие и прекращают действовать на территориях поселений (межселенных территориях), городских округов в соответствии с настоящим Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов поселений (муниципальных районов), городских округов о налогах (указанные в настоящем абзаце положения с 1 января 2005 г. и до 1 января 2006 г. применяются исключительно в части полномочий представительных органов поселений (муниципальных районов) и городских округов, вновь образованных в соответствии с Федеральным законом от 6 октября 2003 г. N 131-ФЗ, по установлению земельного налога и налога на имущество физических лиц и принятию указанными представительными органами решений о введении в действие этих налогов, которые вводятся в действие не ранее 1 января 2006 г).

Местные налоги в городах федерального значения Москве и Санкт-Петербурге устанавливаются настоящим Кодексом и законами указанных субъектов Российской Федерации о налогах, обязательны к уплате на территориях этих субъектов Российской Федерации, если иное не предусмотрено настоящим Кодексом. Местные налоги вводятся в действие и прекращают действовать на территориях городов федерального значения Москвы и Санкт-Петербурга в соответствии с настоящим Кодексом и законами указанных субъектов Российской Федерации.

При установлении местных налогов представительными органами муниципальных образований (законодательными (представительными) органами государственной власти городов федерального значения Москвы и Санкт-Петербурга) определяются в порядке и пределах, которые предусмотрены настоящим Кодексом, следующие элементы налогообложения: налоговые ставки, порядок и сроки уплаты налогов. Иные элементы налогообложения по местным налогам и налогоплательщики определяются настоящим Кодексом.

Представительными органами муниципальных образований (законодательными (представительными) органами государственной власти городов федерального значения Москвы и Санкт-Петербурга) законодательством о налогах и сборах в порядке и пределах, которые предусмотрены настоящим Кодексом, могут устанавливаться налоговые льготы, основания и порядок их применения.

Судебная практика по статье 15 НК РФ

Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 17.05.2019 N 38-АПА19-3

Налог на имущество физических лиц относится к местным налогам, устанавливается Налоговым кодексом Российской Федерации и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с НК РФ и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статьи 15, 399 НК РФ).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 22.05.2019 N 43-АПА19-4

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.

Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда РФ от 21.06.2019 N 9-АПА19-12

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 11.06.2019 N 9-АПА19-9

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 11.06.2019 N 55-АПА19-6

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда РФ от 11.06.2019 N 15-АПА19-2

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 21.06.2019 N 46-АПА19-8

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 14.08.2019 N 80-АПА19-4

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 14.08.2019 N 80-АПА19-5

В соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом.
Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 27.09.2019 N 18-АПА19-60

Статьей 15 НК РФ определено, что налог на имущество физических лиц относится к местным налогам и сборам. В соответствии со статьей 399 НК РФ данный налог устанавливается указанным кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (пункт 1).


Апелляционное определение Судебной коллегии по административным делам Верховного Суда Российской Федерации от 04. 12.2019 N 59-АПА19-9

При этом суд правильно указал, что в соответствии со статьей 15 Налогового кодекса Российской Федерации налог на имущество физических лиц является местным налогом. Налог на имущество физических лиц устанавливается названным Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований, вводится в действие и прекращает действовать в соответствии с Кодексом и нормативными правовыми актами представительных органов муниципальных образований и обязателен к уплате на территориях этих муниципальных образований (статья 399 Налогового кодекса Российской Федерации).


Денежные взыскания (штрафы) | ФНС России

Наименование доходов

Коды бюджетной классификации

Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за осуществление предпринимательской деятельности без государственной регистрации или без специального разрешения (лицензии))

182 1 16 01141 01 0001 140

Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за незаконную организацию и проведение азартных игр)

182 1 16 01141 01 0101 140

Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение организаторами азартных игр в букмекерской конторе и тотализаторе требований к заключению пари на официальные спортивные соревнования и проведению других азартных игр)

182 1 16 01141 01 0111 140

Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за продажу товаров, выполнение работ либо оказание услуг при отсутствии установленной информации либо неприменение в установленных федеральными законами случаях контрольно-кассовой техники)

182 1 16 01141 01 0005 140

Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации),  налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение срока постановки на учет в налоговом органе)

182 1 16 01151 01 0003 140

Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации),  налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение сроков представления налоговой декларации (расчета по страховым взносам))

182 1 16 01151 01 0005 140

Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации),  налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за непредставление (несообщение) сведений, необходимых для осуществления налогового контроля)

182 1 16 01151 01 0006 140

Административные штрафы, установленные Главой 18 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области защиты государственной границы Российской Федерации и обеспечения режима пребывания иностранных граждан или лиц без гражданства на территории Российской Федерации, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы)

182 1 16 01181 01 9000 140

Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за невыполнение в срок законного предписания (постановления, представления, решения) органа (должностного лица), осуществляющего государственный надзор (контроль), организации, уполномоченной в соответствии с федеральными законами на осуществление государственного надзора (должностного лица), органа (должностного лица), осуществляющего муниципальный контроль)

182 1 16 01191 01 0005 140

Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за непредставление сведений (информации)

182 1 16 01191 01 0007 140

Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за осуществление деятельности, не связанной с извлечением прибыли, без специального разрешения (лицензии)

182 1 16 01191 01 0020 140

Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за воспрепятствование законной деятельности должностного лица органа государственного контроля (надзора), должностного лица организации, уполномоченной в соответствии с федеральными законами на осуществление государственного надзора, должностного лица органа муниципального контроля)

182 1 16 01191 01 0401 140

Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы)

182 1 16 01191 01 9000 140

Штрафы, установленные Главой 22 Уголовного кодекса Российской Федерации, за преступления в сфере экономической деятельности

182 1 16 03122 01 0000 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка постановки на учет в налоговом органе)

182 1 16 05160 01 0001 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление налоговой декларации (расчета финансового результата инвестиционного товарищества, расчета по страховым взносам))

182 1 16 05160 01 0002 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение установленного способа представления налоговой декларации (расчета))

182 1 16 05160 01 0003 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за представление в налоговый орган управляющим товарищем, ответственным за ведение налогового учета, расчета финансового результата инвестиционного товарищества, содержащего недостоверные сведения)

182 1 16 05160 01 0004 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за грубое нарушение правил учета доходов и расходов и объектов налогообложения (базы для исчисления страховых взносов))

182 1 16 05160 01 0005 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за несоблюдение порядка владения, пользования и (или) распоряжения имуществом, на которое наложен арест или в отношении, которого налоговым органом приняты обеспечительные меры в виде залога)

182 1 16 05160 01 0006 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление налоговому органу сведений, необходимых для осуществления налогового контроля)

182 1 16 05160 01 0007 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за представление налоговым агентом налоговому органу документов, содержащих недостоверные сведения)

182 1 16 05160 01 0008 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неявку либо уклонение от явки без уважительных причин лица, вызываемого по делу о налоговом правонарушении в качестве свидетеля, неправомерный отказ свидетеля от дачи показаний, а равно дача заведомо ложных показаний)

182 1 16 05160 01 0009 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за отказ эксперта, переводчика или специалиста от участия в проведении налоговой проверки, дача заведомо ложного заключения или осуществление заведомо ложного перевода)

182 1 16 05160 01 0010 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное несообщение сведений налоговому органу)

182 1 16 05160 01 0011 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка регистрации объектов игорного бизнеса)

182 1 16 05160 01 0012 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное непредставление уведомления о контролируемых сделках, представление недостоверных сведений в уведомлении о контролируемых сделках)

182 1 16 05160 01 0013 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное непредставление уведомления о контролируемых иностранных компаниях, уведомления об участии в иностранных организациях, представление недостоверных сведений в уведомлении о контролируемых иностранных компаниях, уведомлении об участии в иностранных организациях)

182 1 16 05160 01 0014 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за ненаправление (невключение) организацией финансового рынка финансовой информации о клиентах организации финансового рынка, выгодоприобретателях и (или) лицах, их контролирующих)

182 1 16 05160 01 0015 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение организацией финансового рынка порядка установления налогового резидентства клиентов организаций финансового рынка, выгодоприобретателей и лиц, прямо или косвенно их контролирующих)

182 1 16 05160 01 0016 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление уведомления об участии в международной группе компаний, представление уведомления об участии в международной группе компаний, содержащего недостоверные сведения)

182 1 16 05160 01 0017 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление странового отчета, представление странового отчета, содержащего недостоверные сведения)

182 1 16 05160 01 0018 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление документации по международной группе компаний)

182 1 16 05160 01 0019 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка и (или) сроков передачи налогоплательщиками сведений о произведенных расчетах при реализации товаров (работ, услуг, имущественных прав)

182 1 16 05160 01 0020 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка и (или) сроков передачи сведений о произведенных расчетах операторами электронных площадок и кредитными организациями)

182 1 16 05160 01 0021 140

Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (иные штрафы)

182 1 16 05160 01 9000 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение банком порядка открытия счета)

182 1 16 05180 01 0001 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение срока исполнения поручения о перечислении налога (сбора, страховых взносов), авансового платежа, единого налогового платежа физического лица, пеней, штрафа)

182 1 16 05180 01 0002 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неисполнение банком решения налогового органа о приостановлении операций по счетам налогоплательщика, плательщика сбора, плательщика страховых взносов или налогового агента, счету инвестиционного товарищества)

182 1 16 05180 01 0003 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неисполнение банком поручения налогового органа о перечислении налога, авансового платежа, сбора, страховых взносов, пеней, штрафа)

182 1 16 05180 01 0004 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление банком справок (выписок) по операциям и счетам (счету инвестиционного товарищества) в налоговый орган)

182 1 16 05180 01 0005 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение банком обязанностей, связанных с электронными денежными средствами)

182 1 16 05180 01 0006 140

Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (иные штрафы)

182 1 16 05180 01 9000 140

Штрафы, неустойки, пени, уплаченные в случае просрочки исполнения поставщиком (подрядчиком, исполнителем) обязательств, предусмотренных государственным контрактом, заключенным федеральным государственным органом, федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией (иные штрафы)

182 1 16 07010 01 9000 140

Иные штрафы, неустойки, пени, уплаченные в соответствии с законом или договором в случае неисполнения или ненадлежащего исполнения обязательств перед федеральным государственным органом, федеральным казенным учреждением, Центральным банком Российской Федерации, государственной корпорацией (иные штрафы)

182 1 16 07090 01 9000 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в федеральный бюджет по нормативам, действовавшим в 2019 году (за исключением доходов, направляемых на формирование Федерального дорожного фонда)

182 1 16 10121 01 0001 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет субъекта Российской Федерации по нормативам, действовавшим в 2019 году (за исключением доходов, направляемых на формирование дорожного фонда субъекта Российской Федерации, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом субъекта Российской Федерации о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10122 01 0001 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов внутригородских муниципальных образований городов федерального значения за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0031 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских округов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0041 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов муниципальных районов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0051 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов сельских поселений за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности

182 1 16 10123 01 0101 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских округов с внутригородским делением за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0111 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов внутригородских районов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0121 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских поселений за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0131 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в федеральный бюджет и бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году

182 1 16 10129 01 0000 140

Возмещение ущерба при возникновении страховых случаев, когда выгодоприобретателями выступают получатели средств федерального бюджета (иные штрафы)

182 1 16 10012 01 9000 140

Платежи в целях возмещения убытков, причиненных уклонением от заключения с федеральным государственным органом (федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией) государственного контракта, а также иные денежные средства, подлежащие зачислению в федеральный бюджет за нарушение законодательства Российской Федерации о контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд (за исключением государственного контракта, финансируемого за счет средств Федерального дорожного фонда) (иные штрафы)

182 1 16 10051 01 9000 140

Платежи в целях возмещения ущерба при расторжении государственного контракта, заключенного с федеральным государственным органом (федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией), в связи с односторонним отказом исполнителя (подрядчика) от его исполнения (за исключением государственного контракта, финансируемого за счет средств Федерального дорожного фонда) (иные штрафы)

182 1 16 10071 01 9000 140

Денежные средства, обращенные в собственность государства на основании обвинительных приговоров судов, подлежащие зачислению в федеральный бюджет

182 1 16 08010 01 0000 140

Прочее возмещение ущерба, причиненного федеральному имуществу (за исключением имущества, закрепленного за федеральными бюджетными (автономными) учреждениями, унитарными предприятиями)

182 1 16 10013 01 0000 140

Денежное возмещение в размере двукратной суммы причиненного ущерба, перечисляемое в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности

182 1 16 10091 01 0000 140

 

Доход, полученный в результате совершения преступления, и денежное возмещение в размере двукратной суммы дохода, полученного в результате совершения преступления, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности

182 1 16 10092 01 0000 140

 

Денежная сумма, эквивалентная размеру убытков, которых удалось избежать в результате совершения преступления, и денежное возмещение в размере двукратной суммы убытков, которых удалось избежать в результате совершения преступления, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности

182 1 16 10093 01 0000 140

 

Денежная сумма, эквивалентная размеру совершенного деяния, предусмотренного соответствующей статьей Особенной части Уголовного кодекса Российской Федерации, и денежное возмещение в двукратном размере этой суммы, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности

182 1 16 10094 01 0000 140

 

Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы, за исключением штрафов за административные правонарушения в области производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции)

 

182 1 16 01141 01 9002 140

Административные штрафы, установленные главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение валютного законодательства Российской Федерации и актов органов валютного регулирования)

182 1 16 01151 01 0025 140

Административные штрафы, установленные главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы, за исключением штрафов за административные правонарушения в области производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции)

182 1 16 01151 01 9002 140

Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов муниципальных округов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)

182 1 16 10123 01 0141 140

Денежные средства, обращенные в собственность государства на основании обвинительных приговоров судов, подлежащие зачислению в федеральный бюджет

182 1 16 08030 01 0000 140

Глава 16.

Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение

Читайте также

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений[7]

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений[7] Статья 106. Понятие налогового правонарушения 1. Судебная практика1. При привлечении налогоплательщика к ответственности за совершение налогового правонарушения необходимо

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений 1. Судебная практика1. В соответствии с НК РФ января 1999 года филиалы и представительства российских юридических лиц не рассматриваются в качестве участников налоговых правоотношений и не

Глава 16.

Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение

Глава 16. Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение Статья 116. Нарушение срока постановки на учет в налоговом органе 1. Законодательные и иные нормативные акты{66}2. Нормативные акты министерств и ведомств, официальные разъяснения{67}3. Судебная

Глава 18. Виды нарушений банком обязанностей, предусмотренных законодательством о налогах и сборах, и ответственность за их совершение[8]

Глава 18. Виды нарушений банком обязанностей, предусмотренных законодательством о налогах и сборах, и ответственность за их совершение[8] Статья 132. Нарушение банком порядка открытия счета налогоплательщику (в ред. Федерального закона от 09.07.1999 N 154-ФЗ) 1. Нормативные акты

Глава 15.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ОБ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА СОВЕРШЕНИЕ НАЛОГОВЫХ ПРАВОНАРУШЕНИЙ

Глава 15. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ОБ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА СОВЕРШЕНИЕ НАЛОГОВЫХ ПРАВОНАРУШЕНИЙ Статья 106. Понятие налогового правонарушения Налоговым правонарушением признается виновно совершенное противоправное (в нарушение законодательства о налогах и сборах) деяние (действие

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений 1. Ответственность за совершение налоговых правонарушений несут организации и физические лица в случаях, предусмотренных главами 16 и 18 настоящего Кодекса.2. Физическое лицо может быть

Глава 16. ВИДЫ НАЛОГОВЫХ ПРАВОНАРУШЕНИЙ И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ИХ СОВЕРШЕНИЕ

Глава 16. ВИДЫ НАЛОГОВЫХ ПРАВОНАРУШЕНИЙ И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ИХ СОВЕРШЕНИЕ Статья 116. Нарушение срока постановки на учет в налоговом органе 1. Нарушение налогоплательщиком установленного настоящим Кодексом срока подачи заявления о постановке на учет в налоговом органе

Глава 18. ВИДЫ НАРУШЕНИЙ БАНКОМ ОБЯЗАННОСТЕЙ, ПРЕДУСМОТРЕННЫХ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВОМ О НАЛОГАХ И СБОРАХ, И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ИХ СОВЕРШЕНИЕ

Глава 18. ВИДЫ НАРУШЕНИЙ БАНКОМ ОБЯЗАННОСТЕЙ, ПРЕДУСМОТРЕННЫХ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВОМ О НАЛОГАХ И СБОРАХ, И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ИХ СОВЕРШЕНИЕ Статья 132. Нарушение банком порядка открытия счета налогоплательщику 1. Открытие банком счета организации, индивидуальному

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений Статья 106. Понятие налогового правонарушенияНалоговым правонарушением признается виновно совершенное противоправное (в нарушение законодательства о налогах и сборах) деяние (действие

Глава 16. Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение

Глава 16. Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение Статья 116. Нарушение срока постановки на учет в налоговом органе1. Нарушение налогоплательщиком установленного статьей 83 настоящего Кодекса срока подачи заявления о постановке на учет в налоговом

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений Об отказе в принятии к рассмотрению запроса о проверке конституционности статьи 106 см. Определение Конституционного Суда РФ от 18.01.2005

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений 1. Ответственность за совершение налоговых правонарушений несут организации и физические лица в случаях, предусмотренных главой 16 настоящего Кодекса.2. Физическое лицо может быть

Глава 18. Виды нарушений банком обязанностей, предусмотренных законодательством о налогах и сборах, и ответственность за их совершение

Глава 18. Виды нарушений банком обязанностей, предусмотренных законодательством о налогах и сборах, и ответственность за их совершение Статья 132. Нарушение банком порядка открытия счета налогоплательщику (в ред. Федерального закона от 09.07.1999 №154-ФЗ)1. Открытие банком счета

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений

Глава 15. Общие положения об ответственности за совершение налоговых правонарушений Об отказе в принятии к рассмотрению запроса о проверке конституционности статьи 106 см. Определение Конституционного Суда РФ от 18.01.2005

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений

Статья 107. Лица, подлежащие ответственности за совершение налоговых правонарушений 1. Ответственность за совершение налоговых правонарушений несут организации и физические лица в случаях, предусмотренных главой 16 настоящего Кодекса.2. Физическое лицо может быть

Глава 16. Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение

Глава 16. Виды налоговых правонарушений и ответственность за их совершение Статья 116. Нарушение срока постановки на учет в налоговом органе КонсультантПлюс: примечание.По вопросу, касающемуся административной ответственности должностных лиц за нарушение срока

Оперштаб Москвы и РПН ответили на главные вопросы работодателей об обязательной вакцинации 60% персонала

В связи с поступающими вопросами от работодателей об обязательной вакцинации 60% работников учреждений, определённых Постановлением Главного государственного санитарного врача Москвы, Оперштаб Москвы и Руководитель Управления Роспотребнадзора по Москве выступают с разъяснениями.

1. Обязан ли работодатель организовать вакцинацию от COVID-19 работников, сотрудников, входящих в перечень сфер, утвержденных Постановлением?

Да. В силу требований федерального законодательства руководители организаций, индивидуальные предприниматели (далее – работодатели) в период эпиднеблагополучия обязаны обеспечить проведение вакцинации работников, сотрудников от COVID-19 в сроки, установленные Главным государственным санитарным врачом по г. Москве.

В соответствии с п. 6 ч. 1 ст. 51 Федерального закона от 30.03.1999 №52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (далее – Федеральный закон № 52-ФЗ), ст. 10 Федерального Закона от 17.09.1998 № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» (далее - Закон № 157-ФЗ), п. 18.3 СП 3.1/3.2.3 146-13 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней», приказом Минздрава России от 21.03.2014 № 125н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям» (зарегистрировано в Минюсте России 25.04.2014 N 32115) Главным государственным санитарным врачом по г. Москве принято постановление от 15.06.2021 № 1, предусматривающее проведение обязательной вакцинации отдельных групп населения по эпидемическим показаниям.

В силу ст. 10, ст. 11 Федерального закона № 52-ФЗ граждане, а также работодатели обязаны выполнять требования санитарного законодательства, а также постановлений, предписаний осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор должностных лиц.

При этом работодатели обязаны проводить санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия. К таким мероприятиям относятся, в том числе и профилактические прививки, проводимые в целях предупреждения возникновения и распространения инфекционных заболеваний (п. 2 ст. 25, п. п. 1 и 3 ст. 29, ст. 35 Федерального Закона № 52-ФЗ).

Профилактика инфекционных заболеваний осуществляется работодателями, в частности, путем осуществления программы иммунопрофилактики инфекционных болезней в соответствии с национальным календарем профилактических прививок, которые доступны для всех граждан и проводятся бесплатно (ч. 1 ст. 30 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Закон № 323-ФЗ), п. 2 ст. 4 Закона № 157-ФЗ). Прививки от COVID-19 включены в национальный календарь профилактических прививок, утвержденный Приказом Минздрава России от 21.03.2014 № 125н (далее – НК).

Также, согласно ч. 1 ст. 209, ст. 212 Трудового Кодекса Российской Федерации (далее – ТК РФ) работодатель обязан обеспечить безопасные для работников условия труда и охраны труда, в том числе и путем проведения санитарно-противоэпидемических (профилактические) мероприятий, т.е. организационных, административных, медико-санитарных и иных мер, направленных на предотвращение возникновения и распространения инфекционных заболеваний и их ликвидацию.

2. В постановлении указана цифра 60% вакцинированных от общей численности сотрудников. Кто имеется в виду – только вакцинированные? Или в этих 60% также учитываются лица, имеющие медицинский отвод от прививки и ранее переболевшие COVID-19 с наличием антител?

В 60% учитываются исключительно работники (сотрудники), получившие вакцинацию. Они могут быть привиты любой зарегистрированной вакциной.

В оставшихся 40% как раз учитываются те, кто имеют временные медицинские отводы, те, кто переболели коронавирусом и другие лица на усмотрение самих организаций. Например, люди, которые по каким-то причинам еще не приняли для себя решение получить надежную защиту. У этих групп работников оснований надеяться на наличие иммунитета меньше.

3. Если в компании есть региональные подразделения, то как будет считаться общая численность сотрудников, подлежащих вакцинации? От общей численности сотрудников всех подразделений компании или только от численности сотрудников подразделений, находящихся на территории Москвы?

Для расчета общей штатной численности сотрудников в части 60% обязательных к вакцинации в расчет берется численность только работающих в Москве.

4. Сотрудники, работающие удаленно (дистанционно) и самозанятые, привлеченные на основании договоров, включаются в общий штат при определении процента вакцинированных?

Да.

5. На основании каких требований будет осуществляться отнесение сферы деятельности юридического лица к перечисленным в пункте 1 постановления, в частности – торговля (ОКВЭД/ОКОНХ, иные критерии)?

В постановлении определяется категория лиц, которые по сфере своей деятельности имеют высокий уровень эпидемиологических контактов и участвуют в цепочке передачи вирусов. К сфере торговли относится не только розничная торговля (продажа на месте товаров розничному потребителю-гражданину) но и оптовая и дистанционная торговля. Она не предусматривает посещения гражданами общественных мест, но тем не менее предполагает прямой контакт с конечным потребителем в момент получения товара.

Под транспортом общего пользования, указанным п.1 Постановления понимается исключительно общественный транспорт и такси (пассажирский транспорт), предусматривающий контакт сотрудников с гражданами-пассажирами.

6. Кому положен медицинский отвод, то есть кто из работников не подлежит обязательной вакцинации.

Перечень заболеваний и состояний для медицинского отвода от проведения прививки против COVID-19 небольшой. Врачи рекомендуют временно отложить прививку при острых инфекционных заболеваниях, обострении серьезных хронических заболеваний, при жизнеугрожающих и неотложных состояниях. Как правило, в таком состоянии люди находятся на больничном или даже на госпитализации и вряд ли могут продолжать работу. Основанием для медицинского отвода также является беременность и перенесенная менее 6 месяцев назад коронавирусная инфекция. Такие работники не подлежат обязательной вакцинации.

В перечне медицинских противопоказаний для вакцинации наличие антител не значится. Кроме того, в настоящее время не существует как единой отработанной методики измерения уровня антител, достаточного для создания у человека иммунитета, так и системы оценки эффективности и быстроты адаптации антител к мутирующим штаммам вируса.

7. Надо ли предоставлять справку о наличии медотвода в Правительство Москвы, Роспотребнадзор?

Нет, для проведения проверок справки не нужны. Мы осуществляем автоматическую сверку данных о вакцинированных работниках с ЕМИАС и государственной информационной системой Минздрава России (Единый по стране регистр вакцинированных) и проверяем выполнение показателя в 60%. Информация о медотводах, прошедшей болезни и других причинах отказа от прививки – скорее полезна самому работодателю, для понимания уровня защищенности его коллектива и клиентов. Такие работники относятся к оставшимся 40%.

8. Какие титры антител к коронавирусу приравниваются к прививке?

При оценке исполнения работодателем требований Постановления – никакие. В настоящее время имеющиеся в городе (городские и частные лаборатории) тест-системы, делающие ИФА, имеют разные единицы изменения и не сопоставимы с точки зрения их результатов. Поэтому на текущий момент ориентироваться на результаты ИФА-тестирования некорректно.

С точки зрения экспертов, наличие высокого уровня иммуноглобулина G не является противопоказанием для вакцинирования.

9. Каким образом можно организовать выбор вакцины и вакцинацию от коронавируса с выездом на рабочие места и выделенным врачом, чтобы контролировать побочные эффекты (линия моральной и физической поддержки)?

Выбор вакцины в первую очередь определяется по медпоказаниям. Вопрос выезда для централизованной вакцинации сотрудников необходимо решать индивидуально с медицинскими организациями любых форм собственности, осуществляющими данный вид деятельности.

У городских медучреждений в настоящий момент выездная вакцинация не предусмотрена, однако федеральные и частные медучреждения такие услуги осуществляют.

В Москве обеспечены широчайшие возможности вакцинации. Работает 100 пунктов на базе городских поликлиник, павильоны «Здоровая Москва» переориентированы исключительно под вакцинацию и работают до последнего посетителя, работают выездные бригады вакцинации в торговых центрах и популярных общественных пространствах. Получить прививку можно как по записи, так и без нее по живой очереди. Кроме того, город передал вакцину частным медорганизациям, 116 из которых тоже проводят процедуру вакцинации.

10. Обязательно ли прохождение теста на антитела с титром перед вакцинацией? Какие обследования необходимо пройти, чтобы убедиться в отсутствии противопоказаний к вакцине?

Прохождение тестирования на наличие антител перед вакцинацией от COVID-19 не рекомендуется и не является обязательным, как и перед другими прививками. Перед проведением прививки медицинским работником проводится стандартный осмотр, каких-либо специальных обследований, проходить не требуется.

11. Какие основания предусмотрены законодательством для отстранения от работы сотрудника, отказавшегося от проведения профилактической прививки от COVID-19

Ст. 76 ТК РФ установлено что в случаях, предусмотренных федеральными законами и иными нормативными правовыми актами Российской Федерации работодатель обязан отстранить работника от работы .

В соответствии с п. 6 ч. 1 ст. 51 Федерального Закона № 52-ФЗ при угрозе возникновения и распространения инфекционных заболеваний, представляющих опасность для окружающих, к которым относится COVID-19, главный государственный санитарный врач субъекта Российской Федерации выносит постановление о проведении профилактических прививок по эпидемическим показаниям, в котором определяет отдельные группы граждан, а также сферы услуг (перечень работ) с высоким риском заболевания инфекционными болезнями в условиях неблагополучной эпидемиологической ситуации.

При этом не применяются иные федеральные законы, акты Правительства Российской Федерации (Федеральный закон от 17.09.1998 № 157 "Об иммунопрофилактике инфекционных болезней", Перечень работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными болезнями и требует обязательного проведения профилактических прививок, утвержден постановлением Правительства Российской Федерации от 15.07.1999 № 825, НК). Требование о проведении профилактических прививок в период эпиднеблагополучия распространяется только на группы граждан и сферы услуг (работ), указанные в постановлении Главного государственного врача по городу Москве.

При вынесении постановления Главным государственным врачом по городу Москве, граждане, отнесенные к группам населения, подлежащего обязательной вакцинации, могут отказаться от прививок, но в этом случае они должны быть отстранены от выполняемых работ на период эпиднеблагополучия. Данная позиция отражена в письме Роспотребнадзора от 01.03.2021 N 02/3835-2021-32: при угрозе возникновения и распространения инфекционных заболеваний, представляющих опасность для окружающих (в том числе и новой коронавирусной инфекции), главные государственные санитарные врачи субъектов Российской Федерации и их заместители наделены полномочиями выносить мотивированные постановления о проведении профилактических прививок гражданам или отдельным группам граждан по эпидемическим показаниям (ст. 51 ФЗ N 52-ФЗ, ст. 10 ФЗ N 157-ФЗ). И только при наличии таких постановлений отказ от вакцинации по эпидемическим показаниям может повлечь отстранение граждан, не имеющих прививок, от работы.

На основании вышеизложенного, работодатель обязан отстранить от работы работника (сотрудника) выразившего отказ от проведения профилактической прививки от COVID-19 (иммунизации) при отсутствии медицинских противопоказаний.

В период отстранения от работы (недопущения к работе) заработная плата работнику не начисляется. Кроме того, время отсутствия работника на работе без уважительных причин, в том числе вследствие его отстранения от работы в случаях, предусмотренных ст. 76 ТК РФ, не включается в стаж, дающий право на ежегодный основной оплачиваемый отпуск (ч. 2 ст. 121 ТК РФ).

Работодатель вправе предложить сотруднику перейти на удаленный режим работы, но этот вопрос должен решаться индивидуально, законом не предусмотрены такие гарантии работникам, отказавшимся от проведения профилактической прививки.

12. Что делать, если работник уклоняется или отказывается от оформления письменного отказа от профилактической прививки?

В случае уклонения работника (сотрудника) от оформления письменного отказа от проведения прививки работодателю необходимо зафиксировать этот факт, составив в письменной форме соответствующий акт.

13. Как будет осуществляться контроль за исполнением работодателями постановления Главного государственного санитарного врача по г. Москве от 15.06.2021 № 1?

Для подтверждения выполнения требований постановления Главного государственного санитарного врача по городу Москве организации, индивидуальные предприниматели в период с 1 июля 2021 г. по 15 июля 2021 г. представляют в электронном виде с использованием личного кабинета юридического лица, индивидуального предпринимателя на официальном сайте Мэра и Правительства Москвы сведения о сотрудниках. В автоматическом режиме вся представленная информация будет сопоставляться с данными о вакцинированных лицах, которая содержится в ЕМИАС и государственной информационной системе Минздрава России (Единый по стране регистр вакцинированных). При выявлении несоответствия установленному требованию о вакцинировании не менее 60% работников (сотрудников) информация о нарушении будет незамедлительно передаваться в Управление Роспотребнадзора по г. Москве.

Контроль будет проводиться в форме сплошных проверок, в отношении всех работодателей.

14. Какие санкции ожидают работодателя, в случае не соблюдения требования о количестве вакцинированных сотрудников и (или) не предоставления отчета о вакцинации сотрудников?

В силу ч. 2,3 ст. 6.3 КоАП РФ за нарушение законодательства в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения, выразившееся в нарушении действующих санитарных правил и гигиенических нормативов, невыполнении санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий предусмотрено административное наказание в виде штрафа или административного приостановления деятельности на срок до 90 суток.

С учетом неблагоприятной эпидемической ситуации по COVID-19 Управление Роспотребнадзора по г. Москве при направлении в суд материалов будет просить о применении санкции только в виде административного приостановления деятельности на срок до 90 суток.

15. Можно ли работать без масок и перчаток тем, кто привит или имеет справку с антителами?

Нет. Требование о соблюдении масочно-перчаточного режима сохраняется для всех работников (сотрудников) вне зависимости от прохождения вакцинации.

16. Где вакцинироваться иностранцам и мигрантам?

Сразу после принятия решения Правительством Российской Федерации о возможности применения вакцин, зарегистрированных в России, иностранным гражданам, в Москве заработают пункты платной вакцинации иностранных граждан, работающих в сферах, указанных в Постановлении. В настоящее время проводится организационная работа по развертыванию таких прививочных пунктов.

17. Возможно ли включить прививку от COVID-19 в список обязательных прививок в санитарные книжки и ставить отметки о ней?

Подтверждением вакцинации является исключительно сертификат, оформленный в электронной форме. Отметка в личной медицинской книжке работника (сотрудника), может рассматриваться только как дополнительная опция, при этом в записи о вакцинации обязательно должны содержаться сведения о полученном сертификате о вакцинации.

18. Возможно ли использование в примерочных магазинов рециркуляторов закрытого типа, работающих всё время работы самого магазина без указания графика очистки (так как процесс очистки идет непрерывным циклом, в отличие от кварцевания)?

Да

Совет Федерации одобрил переход к проактивному администрированию налога на имущество организаций

ФНС России 24 июня 2021 11:46

Совет Федерации одобрил закон, отменяющий налоговую отчетность в отношении объектов недвижимости российских юрлиц, облагаемых налогом на имущество организаций исходя из кадастровой стоимости.

Такой порядок вводится с 2023 года, то есть за налоговый период 2022 года и последующие периоды. При этом налогоплательщики - российские организации перестанут включать в декларацию по налогу на имущество сведения об объектах, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость. Если у юрлица в истекшем налоговом периоде имелись только объекты, облагаемые налогом по кадастровой стоимости, налоговая декларация не представляется.

Для обеспечения полноты уплаты налога (сверки платежей) налоговые органы будут направлять организациям сообщения об исчисленных суммах налога. Представление налогоплательщиками пояснений и (или) документов, подтверждающих правильность исчисления, полноту и своевременность уплаты налога, обоснованность применения пониженных налоговых ставок, налоговых льгот или наличие оснований для освобождения от уплаты налога, рассмотрение пояснений и (или) документов осуществляются в порядке и сроки, предусмотренные пп. 4 - 7 ст. 363 НК РФ. Требование об уплате налога направляется организации, если выявлена недоимка по результатам рассмотрения её пояснений и (или) документов, либо если недоимка была выявлена при их отсутствии.

С 2022 года российские компании, имеющие право на льготы по налогу на имущество организаций в отношении объектов, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость, представляют в налоговый орган заявление о предоставлении такой льготы и подтверждающие документы. Рассмотрение заявления, направление налогоплательщику уведомления о предоставлении льготы либо сообщения об отказе осуществляются в порядке, предусмотренном п. 3 ст. 361.1 НК РФ. Если налогоплательщик, имеющий право на льготу, не представил в налоговый орган заявление о ее предоставлении или не сообщил об отказе от её применения, налоговая льгота предоставляется на основании сведений, полученных налоговым органом в соответствии с федеральными законами начиная с периода, в котором у налогоплательщика возникло право на льготу.

Кроме того, с 2022 года вводятся единые сроки уплаты налога на имущество организаций и авансовых платежей по нему. Так, налог следует уплатить не позднее 1 марта года, следующего за истекшим налоговым периодом, а авансовые платежи – не позднее последнего числа месяца, следующего за истекшим отчетным периодом.

Закон направлен для подписания Президенту России.

Пресс-релиз подготовлен на основании материала, предоставленного организацией. Информационное агентство AK&M не несет ответственности за содержание пресс-релиза, правовые и иные последствия его опубликования.

границ | Генетическая манипуляция NK-клетками для иммунотерапии рака: методы и клиническое значение

Введение

Естественные киллеры (NK) - это иммунные клетки, которые в основном обнаруживаются в крови, печени, селезенке, костном мозге и, в меньшей степени, в лимфатических узлах (1). Первоначально они были идентифицированы на основании их способности лизировать опухолевые клетки без необходимости прайминга (2–5). В настоящее время известно, что NK-клетки играют важную роль в иммунитете хозяина как против рака, так и против некоторых вирусных инфекций (6–8).

NK-клетки могут опосредовать цитотоксичность посредством множества различных механизмов. Дегрануляция - наиболее изученный путь цитотоксичности, при котором NK-клетки выделяют цитотоксические гранулы при контакте с мишенью. Цитотоксичность по этому пути определяется балансом сигналов от набора кодируемых зародышевой линией активационных и ингибирующих рецепторов клеточной поверхности. Большинству рецепторов активации требуется одновременная костимуляция другими рецепторами активации, чтобы вызвать цитотоксичность NK-клеток (9). Единственным исключением из этого правила является Fc-рецептор CD16, который сам по себе может запускать дегрануляцию NK-клеток против покрытых антителами клеток-мишеней посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (9).Другими путями, с помощью которых NK-клетки могут убивать мишени, являются пути рецепторов смерти TRAIL / TRAIL-R и Fas / FasL. Вместо того, чтобы запускать высвобождение цитотоксических гранул, пути рецептора смерти вызывают апоптоз через активацию каспазы в клетках-мишенях.

Прошло более десяти лет с тех пор, как в первых сообщениях был установлен противоопухолевый потенциал NK-клеток у больных раком. Эти исследования показали, что гаплоидентичные донорские NK-клетки могут предотвратить рецидив острого миелоидного лейкоза (AML) после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) и что адоптивно введенные зрелые донорские NK-клетки могут вызвать ремиссию у пациентов с AML (6, 10).Несмотря на это открытие, остаются сомнения относительно истинного терапевтического потенциала NK-клеток в иммунотерапии рака. В отличие от терапии с использованием Т-лимфоцитов, энтузиазм по поводу иммунотерапии на основе NK-клеток сдерживается неуверенностью в их устойчивости in vivo и сомнениями относительно их способности мигрировать в опухолевые ткани после адоптивных инфузий. Хотя недавние данные показали, что реактивация ЦМВ снижает риск рецидива ОМЛ после ТГСК (11), потенциально вызванного ЦМВ-индуцированными NK-клетками, перекрестно реагирующими с ОМЛ-клетками, NK-клетки, в отличие от Т-клеток, не обладают антигенной специфичностью, что еще больше снижает энтузиазм по поводу их использование в качестве иммунных эффекторов в клеточной терапии.

Генетические манипуляции с NK-клетками для улучшения их устойчивости, цитотоксичности, способности нацеливаться на опухоль и способности к локализации участков болезни in vivo имеет потенциал для повышения эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток. Однако до относительно недавнего времени генетические манипуляции с NK-клетками оказались сложной задачей. Вирусная трансдукция, успешно используемая для Т-клеток, была связана с низким уровнем экспрессии трансгена и неблагоприятным влиянием на жизнеспособность клеток при использовании с NK-клетками.Недавняя оптимизация вирусной трансдукции и создание технологий электропорации для эффективной трансфекции генов возродили энтузиазм в отношении исследований по оценке генетической модификации NK-клеток. Исследователи во всем мире в настоящее время изучают возможность генетического перепрограммирования множества различных модальностей NK-клеток с общей целью дальнейшего улучшения их способности уничтожать опухоли у онкологических больных. Одним из примеров того, как этот метод может быть использован, является введение генов в NK-клетки, кодирующие гамма-цитокины (IL-2 и IL-15), чтобы вызвать независимость от обязательной потребности экзогенных цитокинов для надлежащего in vivo персистентности и размножения после настой.Эта и аналогичные стратегии могут дополнительно повысить эффективность иммунотерапии на основе NK-клеток, поскольку, как сообщается, регресс опухоли после инфузии адоптивных NK-клеток у пациентов с AML зависит от их способности увеличивать in vivo (6), хотя и ограничивается регуляторные Т-клетки также мобилизовались после введения экзогенных цитокинов (12, 13). Введение химерных антигенных рецепторов (CAR) и подавление ингибирующих рецепторов NK-клеток, таких как NKG2A, являются дополнительными примерами специфических генетических манипуляций, которые можно использовать для улучшения результатов адоптивной иммунотерапии NK-клетками.

Учитывая быстрый и эффективный метод распознавания опухолевых клеток, NK-клетки представляют собой уникальную иммунную клетку, которую можно генетически перепрограммировать с целью улучшения результатов клеточной иммунотерапии рака. В этом обзоре рассматриваются методы введения трансгенов в NK-клетки, а также преимущества и ограничения таких стратегий. Он также дает обзор стратегий генетического репрограммирования NK-клеток, которые были оценены на сегодняшний день, и взгляд на то, как эти конкретные стратегии могут быть наилучшим образом использованы в клинике для максимизации противоопухолевого потенциала иммунотерапии на основе NK-клеток.

Методы и проблемы с генетической манипуляцией NK-клеток: вирусная трансдукция против трансфекции

Генетические манипуляции с Т-клетками успешно использовались как в доклинических, так и в клинических исследованиях (14). Напротив, исследования генно-инженерных NK-клеток исторически были ограничены низкой эффективностью доставки трансгена и существенным апоптозом NK-клеток, связанным с процедурой. В этом разделе мы обсуждаем доступные подходы для доставки генов в NK-клетки, характеризуя развитие каждого подхода с течением времени, выделяя положительные и отрицательные аспекты каждого метода (вставка 1).

Ящик 1 . Плюсы и минусы методов генетической модификации NK-клеток .

Вирусная трансдукция

Пониженная эффективность вирусной трансдукции NK-клеток по сравнению с T-клетками может частично быть связана с врожденными свойствами, которые характеризуют NK-клетки. Врожденные иммунные рецепторы, такие как рецепторы распознавания образов, которые распознают чужеродный геномный материал, вероятно, участвуют в запуске апоптоза NK-клеток после вирусной трансдукции (15).Наилучшие результаты исследований вирусной трансдукции NK-клеток были достигнуты с использованием линий NK-клеток или первичных NK-клеток, подвергшихся экспансии ex vivo (Таблица 1). Напротив, вирусная трансдукция первичных покоящихся NK-клеток человека обычно приводит к существенно более низкой эффективности трансдукции. В большинстве исследований вирусной трансдукции NK-клеток использовались ретро- и лентивирусные векторы. Хотя векторы вирусов аденовируса и осповакцины использовались для трансдукции NK-клеток, их использование было ограничено, и они не будут обсуждаться далее в этом обзоре.

Таблица 1 . Обзор методов, используемых для генетической модификации NK-клеток с указанием эффективности доставки генов и влияния на жизнеспособность клеток . а

Ретровирусные векторы были первыми вирусными векторами, использованными для генетической модификации NK-клеток. Первый отчет о ретровирусной трансдукции NK-клеток был опубликован в конце 1990-х годов и был посвящен генетическим манипуляциям с линией NK-клеток NK-92 (16).В этом исследовании сообщается об эффективности трансдукции всего 2–3%. Оптимизация подходов к ретровирусной трансдукции за последнее десятилетие привела к более высокой эффективности трансдукции, особенно при использовании с человеческими NK-клетками, которые подверглись экспансии ex vivo (Таблица 1). Недавний отчет показал, что ретровирусная трансдукция ex vivo увеличила NK-клетки с генами, кодирующими либо IL-15, либо мембраносвязанный IL-15 (mbIL-15), приводила к средней эффективности трансдукции 69 и 71% соответственно (25).Хотя сообщалось, что ретровирусная трансдукция NK-клеток не изменяет функцию, фенотип и пролиферативную способность NK-клеток (20, 23), об их жизнеспособности после ретровирусной трансдукции сообщалось редко. Существенное пагубное влияние на жизнеспособность первичных NK-клеток, подвергающихся ретровирусной трансдукции, может помешать использованию этого подхода в клинических условиях. Кроме того, ретровирусная трансдукция также требует активного деления клеток, что затрудняет использование этого метода с первичными неактивированными NK-клетками.Это ограничение менее важно, когда ретровирусная трансдукция используется с линиями NK-клеток, такими как NK-92, которые обладают непрерывной и неограниченной способностью к пролиферации. Однако, как обсуждается далее в этом обзоре, важно отметить, что эта линия NK-клеток действительно имеет фенотипические и функциональные отличия от первичных NK-клеток человека, что может иметь терапевтическое значение для клинической терапии.

Лентивирусные векторы

Совсем недавно были проведены исследования по оценке трансдукции NK-клеток с использованием лентивирусных векторов.В отличие от трансдукции ретро- и аденовирусными векторами, лентивирусные векторы могут включать трансгены в геном неделящихся клеток. Кроме того, лентивирусные векторы позволяют модификацию генов NK-клеток без изменения их фенотипических и функциональных свойств, как это происходит после стимуляции, например, цитокинами. Первое сообщение об успешном использовании лентивирусных векторов для генетической модификации NK-клеток было выполнено на первичных NK-клетках мыши (42), а последующие исследования установили, что лентивирусная трансдукция NK-клеток человека также может быть достигнута (Таблица 1).Хотя в большинстве исследований сообщается о лентивирусной трансдукции линий NK-клеток с эффективностью 15-40% (27, 28), эффективность сильно варьируется от нескольких процентов до почти 100%, а в некоторых случаях требуется несколько раундов трансдукции ( 26, 29). Последние данные показывают, что эффективность трансдукции первичных NK-клеток человека может быть увеличена за счет лекарственного ингибирования внутриклеточных рецепторов врожденного иммунитета в NK-клетках (15). К сожалению, как и в исследованиях с использованием ретровирусной трансдукции, о жизнеспособности NK-клеток после лентивирусной трансдукции сообщалось редко.Используя оптимизированный протокол, наша лаборатория достигла максимальной экспрессии трансгена в 60% из ex vivo NK-клеток через 3 дня после лентивирусной трансдукции GFP без каких-либо пагубных эффектов на жизнеспособность, фенотип или функцию NK-клеток (личное сообщение , Р. Чайлдс).

Таким образом, вирусная трансдукция NK-клеток приводит к вариабельной эффективности трансдукции и может потребовать нескольких раундов трансдукции и / или посттрансдукционного обогащения клеток для достижения приемлемой экспрессии трансгена.Кроме того, вирусная гибель клеток и потребность в обогащении после трансдукции могут поставить под угрозу клиническую применимость этого подхода. Наконец, хотя риск может быть низким, при использовании этой методологии в клинике необходимо учитывать возможность индуцированного вирусом инсерционного мутагенеза и иммуногенности (43, 44), возникающих после трансдукции. Тем не менее, вирусная трансдукция NK-клеток действительно обеспечивает стабильную экспрессию трансгена, которая, в зависимости от того, как NK-клетка подвергается генетической модификации, может потребоваться для индукции стойкого и длительного клинического ответа.

Трансфекция

По сравнению с вирусной трансдукцией, трансфекция NK-клеток, по-видимому, связана с более низкой степенью апоптоза, меньшей межиндивидуальной и межэкспериментальной вариабельностью, при этом эффективность доставки трансгена полностью не зависит от клеточного деления. В большинстве случаев этот подход приводит к более быстрой, хотя и временной, экспрессии трансгена по сравнению с вирусной трансдукцией, когда гены должны быть сначала включены в клеточный геном, прежде чем может произойти экспрессия.Перенос гена с использованием трансфекции может быть достигнут либо путем электропорации (включая нуклеофекции ), либо путем липофекции . Поскольку последний использовался только в нескольких исследованиях (45), в этом обзоре будут рассмотрены стратегии, использующие метод электропорации.

Электропорация - это метод, при котором генетический материал доставляется в клетки после короткого электрического импульса, который временно создает небольшие поры в клеточной мембране, позволяя заряженным молекулам, таким как ДНК и РНК, перемещаться в клетку.Эта технология была впервые использована с линиями NK-клеток в конце 1990-х годов (32, 36–38, 46, 47), а в последнее время использовалась для генетического манипулирования первичными NK-клетками для экспрессии CAR (35, 39, 48) или цитокинов для аутокринной системы. стимуляция роста (49). Благодаря техническому прогрессу и использованию мРНК вместо кДНК эффективность трансфекции резко возросла, достигая 90% или более, при этом оказывая лишь минимальное вредное воздействие на жизнеспособность клеток (таблица 1). Примечательно, что с помощью электропорации мРНК эффективность трансфекции 80–90% может быть достигнута не только в ex vivo увеличенных клетках, но также и в первичных покоящихся (не активированных цитокинами) человеческих NK-клетках (40).Несмотря на это замечательное достижение, подробная характеристика эффектов электропорации на фенотип, функцию и пролиферативную способность NK-клеток после электропорации еще не опубликована.

Поскольку электропорация не включает вирусные векторы, ее использование в доклинических и клинических условиях связано с меньшими проблемами регулирования. Кроме того, как указано выше, электропорация чаще всего приводит к временной экспрессии трансгена, что можно рассматривать с точки зрения безопасности, когда новые трансгены с неизвестной потенциальной токсичностью исследуются в ранних клинических испытаниях.Схемы, в которых используется технология электропорации ДНК, применялись для создания стабильных экспрессирующих трансген клеток. Хотя эффективность этого подхода обычно ниже, чем эффективность, достигаемая с помощью вирусной трансдукции, его можно улучшить, если комбинировать с методами целевой интеграции, которые позволяют избежать случайной интеграции в неактивных областях гетерохроматина. Такие стратегии также снижают риск нецелевых эффектов, включая молчание генов из-за случайной интеграции в активные гены и интеграции в горячих точках, которые могут вызвать злокачественную трансформацию.Обладая преимуществами в дизайне управляющих РНК и лучшей специфичностью по отношению к мишени по сравнению с другими технологиями редактирования генов, такими как нуклеаза Zink-Finger (ZFN) и технологиями эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), недавно разработанные технологии регулярно сгруппированы в короткие промежутки времени. Метод палиндромных повторов (CRISPR) быстро стал популярным инструментом для целевой интеграции генов (50). Система CRISPR / Cas9 вызывает постоянные модификации в определенных сайтах генома посредством двухцепочечных разрывов (DSB) и может использоваться для интеграции новых генов в определенные сайты посредством гомологически направленной рекомбинации (50).Хотя сегодня с помощью этого метода в настоящее время достигаются лишь умеренные степени интеграции генома, систему CRISPR / Cas9 можно использовать для получения стабильно трансдуцированных NK-клеток путем редактирования генов первичных NK-клеток до их экспансии ex vivo .

Стратегии модификации генов, направленные на повышение эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток

Благодаря новым достижениям в этой области генетические манипуляции с NK-клетками открыли возможности для изучения множества различных путей, участвующих в нацеливании NK-клеток на опухоль, и способности генетически модифицировать NK-клетки для улучшения их цитотоксичности опухоли.Здесь мы обсудим описанные стратегии модификации генов, которые могут улучшить устойчивость и распространение in vivo , миграцию опухолевой ткани и способность адоптивно введенных NK-клеток к опухоли (рисунок 1, таблица 2 и вставка 2).

Рис. 1. Схематический обзор того, как генетические манипуляции могут быть использованы для повышения эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток в клинике . Генетическая инженерия NK-клеток для обеспечения устойчивости и размножения за счет стимуляции аутокринных цитокинов, миграции в опухолевую ткань посредством введения рецепторов, участвующих в клеточном хоминге (т.е., хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии), а также усиление их противоопухолевой цитотоксичности посредством введения CAR или активации рецепторов NK-клеток (aNKR) или посредством подавления ингибиторных рецепторов NK-клеток (iNKR), защиты от супрессивных цитокинов в опухоли. окружающей среды и усиление функции за счет стимуляции аутокринных цитокинов.

Таблица 2 . Обзор стратегий, оцененных для улучшения противоопухолевой эффективности первичных человеческих NK-клеток и линий NK-клеток in vitro и на доклинических моделях животных .

Ящик 2 . Примеры модальностей NK-клеток для манипулирования генами для повышения клинической эффективности .

Стратегии повышения устойчивости и увеличения количества введенных NK-клеток

Было показано, что сохранение и размножение инфузированных NK-клеток in vivo имеет решающее значение для индукции регрессии опухоли после инфузии адоптивных NK-клеток (6). Используя ретровирусную трансдукцию гена IL-2 в клетки NK-92, Nagashima et al.смогли размножить эту линию NK-клеток до 5 месяцев in vitro без добавления экзогенных цитокинов (16). Кроме того, было показано, что экспрессирующие IL-2 клетки NK-92 также обладают повышенной цитотоксичностью опухоли по сравнению с нетрансдуцированными родительскими клетками NK-92, которые стимулировались экзогенным IL-2. В соответствии с этими данными in vitro , эти генетически модифицированные клетки показали улучшенную устойчивость in vivo и противоопухолевые ответы при введении мышам с опухолями.Аналогичные данные о доставке гена IL-2 в увеличенные NK-клетки были получены Konstantinidis et al. (51). Как наблюдали с трансдуцированными IL-2 клетками NK-92, ретровирусная трансдукция ex vivo NK-клеток с геном mbIL15 также резко увеличивала их выживаемость in vitro ; Среднее восстановление клеток составляло 85% для NK-клеток mbIL-15 после 7 дней культивирования без IL-2, тогда как ложно-трансдуцированные NK-клетки практически не определялись (25). Следовательно, стратегия введения генов, кодирующих гамма-цитокины, для улучшения персистенции и размножения in vivo NK-клеток после инфузии, независимо от введения экзогенных цитокинов, представляется многообещающей.

Стратегии увеличения миграции инфузированных NK-клеток

Правильное возвращение инфузированных NK-клеток в опухолевую ткань является предпосылкой их способности вызывать регрессию опухоли. Однако исследования, характеризующие способность in vivo к миграции адоптивно введенных NK-клеток, в значительной степени игнорировались (60). Недавние данные свидетельствуют о том, что нерасширенные и увеличенные NK-клетки имеют разные паттерны миграции при введении в модели животных (61). Более того, используя трогоцитоз для переноса предварительно созданных молекул клеточной поверхности из линии питающих клеток в NK-клетки, Somanshi et al.показали, что миграция инфузированных NK-клеток может быть перенаправлена ​​путем оснащения их рецептором нахождения в лимфатических узлах CCR7 (62). Несмотря на эти данные, до сих пор ни в одном исследовании не использовались методы модификации генов для активного направления инфузированных NK-клеток к выбранным органам. Основываясь на данных Somanshi et al., Мы смогли использовать трансфекцию мРНК для генной инженерии NK-клеток с рецептором CCR7, чтобы улучшить их миграцию к одному из его лигандов CCL19 (Carlsten M., Manuscript in training, April 2015).Другие стратегии могут включать использование хемокиновых рецепторов, таких как CXCR3, для улучшения миграции NK-клеток в воспаленные ткани, например, инфильтрованные метастатическими опухолями (63).

Стратегии повышения цитотоксичности опухоли за счет инфузии NK-клеток

Большинство сообщений об экспрессии трансгенов в NK-клетках охарактеризовали эффекты CAR в линиях NK-клеток, увеличенных NK-клетках и первичных нерасширенных NK-клетках (Таблица 2). CAR представляют собой сконструированные рецепторы, которые обладают внеклеточной специфичностью антитела в сочетании с мощными адаптерами внутриклеточной передачи сигналов, такими как CD3ζ, CD28 и / или 4-1BB.Важно отметить, что эти рецепторы не требуют стимуляции через корецепторы, чтобы вызвать сильную противоопухолевую цитотоксичность. Недавний прорывной успех терапии Т-клетками против CD19 CAR у пациентов со злокачественными опухолями В-клеток стимулировал исследовательское сообщество к разработке и исследованию широкого спектра CAR против множества различных эпитопов, экспрессируемых на многих типах опухолей (64). Некоторые из этих CAR были исследованы в NK-клетках (Таблица 2). CD19 и CD20-специфические CAR против В-клеточных злокачественных новообразований (39–41, 53, 54) и CAR, нацеленные на CD33 на лейкозные клетки (38), CS1 и CD138 на миеломные клетки (24, 48, 55), GD2 на клетки нейробластомы (23 , 56), Her2 / Neu и erbB2 на клетках рака груди (22, 35), карциноэмбриональный антиген (CEA) на рак толстой кишки (36), EpCAM на эпителиальных опухолях (29), GPA7 на меланоме (59), лиганд NKG2D на лейкоз и солидные опухоли, и было показано, что TRAIL-R1 на различных опухолевых мишенях (58) обладает способностью перенаправлять цитотоксичность NK-клеток против их целевых антигенов.В большинстве этих исследований для трансдукции CAR в NK-клетки использовались вирусные векторы, хотя электропорация также использовалась в нескольких исследованиях (таблица 2).

На основании клинических данных, показывающих более высокую частоту ответа у пациентов с лимфомой, леченных ритуксимабом, гомозиготных по высокоаффинному полиморфизму CD16-158V (HA-CD16) по сравнению с пациентами с низкоаффинным полиморфизмом CD16-158F (LA-CD16) (65 , 66), несколько групп недавно рассмотрели вопрос о том, может ли введение гена HA-CD16 в NK-клетки, лишенные этого полиморфизма, использоваться в качестве стратегии для увеличения ADCC против опухолей.Этот подход привлекателен, поскольку лишь небольшая часть пациентов гомозиготна по HA-CD16 (67). Более того, в отличие от CAR NK-клеток, инфузии NK-клеток, генетически модифицированных для экспрессии HA-CD16, можно использовать для улучшения исхода практически любого злокачественного новообразования, для которого существует одобренное FDA антитело IgG1, без каких-либо серьезных побочных эффектов. -эффекты. Эксперименты in vitro , проведенные Биньямином и его коллегами, показали значительно улучшенную цитотоксичность в отношении линии клеток B-лимфомы, покрытой ритуксимабом, после стабильной трансдукции CD16-отрицательной линии клеток NK-92 HA-CD16 по сравнению с клетками NK-92, оснащенными LA- CD16 (19).Недавно наша группа исследовала аналогичный подход, когда было обнаружено, что ex vivo NK-клеток от доноров CD16-158F / F (LA-CD16) существенно увеличили ADCC после электропорации с мРНК, кодирующей HA-CD16 (68). Эти данные предполагают, что добавление гена HA-CD16 к NK-клеткам пациента, которые уже экспрессируют эндогенный CD16, можно использовать для увеличения их способности индуцировать ADCC, и что этот подход может использоваться в качестве стратегии для повышения эффективности терапии на основе антител. для онкологических больных.

Также изучалось введение генов, которые делают NK-клетки нечувствительными к супрессивным цитокинам, таким как TGF-β, тем самым сохраняя их цитотоксичность. Ян и др. создали линию клеток NK-92, устойчивую к супрессивным эффектам TGF-β, путем генетической модификации их для экспрессии на своей поверхности доминантно-отрицательной мутантной формы рецептора TGF-β типа II (DNTβRII) (34). Адоптивный перенос этих нечувствительных к TGF-β клеток NK-92 у мышей, несущих рак легкого, был связан с повышенными уровнями IFN-γ, высвобождаемого из инфузированных клеток, и приводил к увеличению выживаемости по сравнению с мышами, обработанными NK-92 дикого типа.

Генетическое репрограммирование NK-клеток также может быть направлено на достижение специфического молчания белков с целью улучшения нацеливания на опухоль путем обхода ингибирующих сигналов NK-клеток, индуцированных при взаимодействии с опухолевыми клетками. Первоначальные исследования были сосредоточены на использовании для этой цели технологии shRNA. В этом контексте shРНК, экспрессируемые внутри клеток, процессируются эндонуклеазным комплексом Dicer для создания двухцепочечных малых интерферирующих РНК, которые предотвращают трансляцию их целевых мРНК (69), shРНК успешно используются для подавления экспрессии HLA-E- связывание ингибиторного рецептора NK-клеток NKG2A (31).Используя индуцибельный вектор в NK-клетках, активированных IL-2, Figueiredo et al. наблюдали увеличение на 40% способности убивать экспрессирующие HLA-E клеточные линии K562 HLA-E. Используя аналогичный подход с линией NK-клеток NKL, наша группа наблюдала повышенную убивающую способность HLA-E, экспрессирующего 721,221 клеток , in vitro и на доклинической модели мыши (70). Дополнительные подробности о протоколах shRNA-опосредованного сайленсинга белка в NK-клетках можно найти в Purdy et al. (71). На сегодняшний день об исследованиях с использованием CRISPR, ZFN или TALEN для генетической модификации NK-клеток для подавления их ингибирующих рецепторов с той же целью повышения противоопухолевой способности NK-клеток еще не сообщалось.

В заключение, в настоящее время описан ряд стратегий модификации генов для NK-клеток. Некоторые из них обещают улучшить клинические реакции на иммунотерапию рака на основе NK-клеток. Однако на сегодняшний день лишь немногие из них были переведены в клинические исследования. В следующем разделе будет обсуждаться, как эти стратегии могут быть включены в клиническую иммунотерапию NK-клеточного рака.

Рекомендации по разработке клинических протоколов с использованием генно-инженерных NK-клеток

Проблемы, связанные с генетическими манипуляциями с NK-клетками, значительно задержали дебют этой стратегии в клинической терапии рака.Хотя недавно начатые испытания (NCT00995137 и NCT01974479), использующие роль CAR19-экспрессирующих ex vivo увеличенных NK-клеток у пациентов со злокачественными опухолями В-клеток, дадут нам первое представление о потенциале этого подхода; Дальнейшая оптимизация клинически совместимых методов генетических модификаций NK-клеток необходима для использования всего клинического потенциала этого подхода. Более того, необходимы дополнительные исследования множества аспектов нацеливания на опухоли NK-клеток, которые можно было бы изменить с помощью этого метода.Хотя клинические реакции после инфузии NK-клеток могут быть дополнительно улучшены путем простого увеличения их способности нацеливаться на опухоль, исследования, оценивающие потенциал этой технологии для улучшения устойчивости инфузированных клеток, а также способы стимулирования правильной миграции NK-клеток и их нахождения в опухолевой ткани. также имеют гарантию (Рисунок 1).

Генетическая инженерия NK-клеток, чтобы сделать их цитокин-независимыми и, таким образом, улучшить их устойчивость при одновременном повышении их цитотоксической способности, может быть одним из направлений для дальнейшего изучения.Преимущество этого подхода будет заключаться в том, что экзогенные цитокины будут ненужными после инфузии NK-клеток, что может снизить риск мобилизации регуляторных Т-клеток, которые напрямую подавляют цитотоксичность NK-клеток (13). Проблемы с применением этого подхода в клиническом контексте включают риск индуцирования синдрома высвобождения цитокинов из-за массивной и нерегулируемой пролиферации NK-клеток. Этот подход также сопряжен с потенциальным риском индуцирования злокачественной трансформации NK-клеток из-за постоянной аутокринной стимуляции роста, как это наблюдалось для Т-клеток, сконструированных с помощью IL-2 (72).Однако таких сценариев можно избежать, если гены, кодирующие IL-2 или IL-15, вводятся только временно посредством электропорации мРНК NK-клеток. Если для индуцирования надлежащей регрессии опухоли требуется стабильная экспрессия трансгена, альтернативной стратегией предотвращения беглой пролиферации NK-клеток может быть введение индуцибельного суицидного гена в модифицированные клетки (73).

Миграция в опухолевую ткань - еще один аспект, определяющий правильное нацеливание на опухоль. Этот аспект в значительной степени упускается из виду и потенциально может улучшить клинический результат, если введенные NK-клетки будут перенаправлены к месту опухоли вместо неспецифической циркуляции в тканях, в основном не несущих опухоль.Никаких исследований, направленных на улучшение хоминга in vivo инфузированных генно-инженерных NK-клеток, еще не опубликовано.

Как обсуждалось выше, были исследованы многочисленные стратегии перенаправления или усиления NK-клеток, убивающих опухоль in vitro . Внедрение CAR представляет собой наиболее изученный и разработанный подход, который недавно прошел клиническую оценку (Таблица 2). Экспрессия высокоаффинного CD16 вскоре также может быть протестирована в клинических условиях, поскольку этот подход можно комбинировать с уже клинически доступными моноклональными антителами, которые нацелены на множество антигенов, экспрессируемых на различных типах опухолей.Повышение цитотоксичности NK-клеток посредством стимуляции аутокринных цитокинов или посредством подавления ингибирующих рецепторов NK-клеток, вероятно, потребует дополнительной оценки на доклинических моделях на животных, прежде чем они могут быть включены в клинические протоколы. После того, как все эти стратегии будут полностью охарактеризованы доклинически, они могут быть объединены для дальнейшего повышения полного противоопухолевого потенциала адоптивно перенесенных NK-клеток. Например, введение CAR с одновременным подавлением подавления рецептора, ингибирующего NKG2A, может представлять один из таких будущих подходов.Можно также рассмотреть возможность добавления стимуляции аутокринными цитокинами для дальнейшего улучшения цитотоксичности при одновременном поддержании их устойчивости in vivo . Поскольку дегрануляция NK-клеток регулируется балансом активирующих и ингибирующих сигналов от четко определенных рецепторов клеточной поверхности, также можно добавить CAR или другие рецепторы активации вместе с выбранными рецепторами, которые опосредуют ингибирование через лиганды, которые экспрессируются в нормальных тканях ( а не опухолевые клетки), тем самым давая генетически перепрограммированным NK-клеткам дополнительный уровень целевой специфичности.Однако потребуется много дополнительных доклинических исследований, прежде чем эти подходы станут доступны в клинике.

Выбор метода генетического репрограммирования NK-клеток - еще один важный фактор, который необходимо учитывать при проведении генетической инженерии NK-клеток для клинической оценки. Вирусная трансдукция имеет преимущество стабильной экспрессии; однако, как упоминалось выше, вирусная трансдукция NK-клеток, особенно первичных клеток, не всегда приводит к удовлетворительному уровню экспрессии трансгена и может потребовать нескольких раундов трансдукции с последующим отбором трансген-положительных клеток.Более того, правильная экспрессия трансгенов, индуцированная вирусной трансдукцией, может занять несколько дней, что может иметь недостатки, поскольку продолжительность жизни NK-клетки может быть относительно короткой после адоптивного переноса (т.е. недели). Необходимы будущие исследования, чтобы лучше понять, могут ли многократные инфузии трансфицированных NK-клеток компенсировать временную экспрессию трансгена или стабильная экспрессия трансгена является предпосылкой для индукции клинических ответов после адоптивного переноса NK-клеток, созданных с помощью генной инженерии.Также необходимы исследования для полного понимания продолжительности жизни NK-клеток, особенно тех, которые подверглись манипуляции ex vivo .

Оптимальный метод генетической манипуляции с NK-клетками, который будет использоваться в клинических испытаниях, также может зависеть от того, какой препарат NK-клеток используется (вставка 3). Преимущество линий NK-клеток состоит в том, что их можно использовать в качестве готового продукта, стабильно трансдуцированного для экспрессии интересующего гена или генов. Они также могут быть долгоживущими при правильной цитокиновой поддержке.Однако недостатком использования линий NK-клеток, таких как NK-92, является необходимость облучения (10 Гр) перед инфузией, чтобы избежать риска приживления потенциально канцерогенных клеток in vivo (74). Более того, пациенты, получавшие инфузии линий NK-клеток, также должны будут нуждаться в предварительном кондиционировании от умеренного до высокого для подавления иммунитета хозяина, чтобы избежать отторжения этих аллогенных клеток. Более того, инфузия аллогенных клеток может повысить гуморальный иммунитет и привести к адаптивным Т-клеточным иммунным ответам, специфичным против аллоантигенов, что исключает повторные инфузии даже с использованием предварительного кондиционирования.Подобную аллореактивность можно вызвать с помощью инфузий первичных аллогенных NK-клеток. Использование аутологичных NK-клеток позволяет избежать этих рисков и исключает необходимость предварительного кондиционирования. Потенциальный недостаток использования аутологичных NK-клеток заключается в том, что эффективное нацеливание на опухоль может быть предотвращено посредством ингибирующих взаимодействий KIR с собственным HLA. Потенциальное преимущество использования линии NK-клеток по сравнению с первичными NK-клетками состоит в том, что можно вливать большое количество NK-клеток из линии NK-клеток, тогда как количество первичных клеток, доступных для инфузии, обычно гораздо более ограничено.Однако это ограничение недавно удалось обойти с помощью ряда высокоэффективных методов размножения первичных NK-клеток ex vivo для клинической инфузии (60). В идеале можно использовать инфузию аутологичных генно-модифицированных NK-клеток, чтобы избежать риска отторжения и предварительного условия. Один из подходов к преодолению ограничений инактивации аутологичных NK-клеток посредством собственного HLA состоит в том, чтобы генетически модифицировать эти эффекторы для подавления ингибирующих рецепторов связывания собственных HLA, таких как NKG2A и KIR, которые сами по себе или в комбинации, например, с CAR, могут улучшить нацеливание на опухоль. емкость NK-клеток в аутологичных условиях.

Ящик 3 . Источник NK-клеток для адоптивной иммунотерапии рака NK-клеток .

Заключительные замечания

Противоопухолевые антитела и CAR-Т-клетки сделали иммунотерапию жизнеспособным вариантом лечения больных раком. Благодаря быстрому и эффективному методу распознавания опухолевых клеток, NK-клетки представляют собой уникальную иммунную клетку, которую можно генетически перепрограммировать с целью улучшения результатов клеточной иммунотерапии рака.Однако технические и биологические проблемы, связанные с доставкой генов в NK-клетки, значительно смягчили этот подход. Вирусная трансдукция NK-клеток первоначально приводила к низкой эффективности доставки трансгена, что часто требовало нескольких раундов трансдукции и / или клеточного обогащения для достижения приемлемого количества клеток, экспрессирующих трансген. Тем не менее, недавние улучшения в ретро- и лентивирусной трансдукции NK-клеток привели к целому ряду доклинических исследований NK-клеток, созданных с помощью генной инженерии.Ряд исследований также показал, что NK-клетки можно генетически репрограммировать с помощью электропорации мРНК. В отличие от вирусной трансдукции, этот подход обеспечивает высокую эффективность трансфекции без ущерба для их жизнеспособности и не требует лабораторий высокого уровня биобезопасности. Хотя в последнее время появились многообещающие доклинические данные об электропорированных мРНК NK-клетках, возникли опасения относительно клинической применимости этого подхода, поскольку он приводит только к временной экспрессии трансгена.

Недавно начатые клинические испытания скоро дадут представление о потенциальной эффективности стратегий клеточной иммунотерапии рака, в которых используются генетически модифицированные NK-клетки. Тем не менее, дальнейшая оптимизация как вирусной трансдукции, так и электропорации NK-клеток все еще необходима, прежде чем этот подход можно будет полностью использовать в клинике. Благодаря недавнему прогрессу в нашем понимании сложных биологических сетей, которые регулируют способность NK-клеток нацеливаться и уничтожать опухоли in vivo , а также с быстрым развитием клинически совместимых методов генетического манипулирования NK-клетками, мы предвидим генную инженерию как обязательную Путь к использованию всего потенциала адоптивной иммунотерапии NK-клетками у больных раком.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность всем членам Лаборатории трансплантационной иммунотерапии NHLBI, Отделу интрамуральных исследований (DIR) NHLBI, Шведскому исследовательскому совету, стипендию декана Р. О'Нила и Эдварда Ранчика по исследованию рака за их большой вклад. и поддержка оригинального исследования, описанного в этой рукописи.

Список литературы

1. Грегуар С., Чассон Л., Люси С., Томаселло Е., Гейссманн Ф., Вивье Е. и др. Торговля естественными клетками-киллерами. Immunol Rev (2007) 220 : 169–82. DOI: 10.1111 / j.1600-065X.2007.00563.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Герберман РБ, Нанн М.Э., Холден ХТ, Лаврин Д.Х. Естественная цитотоксическая реактивность лимфоидных клеток мыши против сингенных и аллогенных опухолей.II. Характеристика эффекторных клеток. Int J Cancer (1975) 16 : 230–9. DOI: 10.1002 / ijc.2

0204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Герберман РБ, Нанн М.Э., Лаврин Д.Х. Естественная цитотоксическая реактивность лимфоидных клеток мыши против аллогенных опухолей сингенной кислоты. I. Распределение реактивности и специфичности. Int J Cancer (1975) 16 : 216–29. DOI: 10.1002 / ijc.2

0204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Кисслинг Р., Кляйн Э., Прос Х., Вигзелл Х. «Естественные» клетки-киллеры у мышей. II. Цитотоксические клетки со специфичностью к клеткам лейкемии Молони мышей. Характеристики клетки-киллера. Eur J Immunol (1975) 5 : 117–21. DOI: 10.1002 / eji.1830050208

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Кисслинг Р., Кляйн Э., Вигзелл Х. «Естественные» клетки-киллеры у мышей. I. Цитотоксические клетки со специфичностью в отношении клеток лейкемии Молони мышей. Специфичность и распределение по генотипу. Eur J Immunol (1975) 5 : 112–7. DOI: 10.1002 / eji.1830050208

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Миллер Дж. С., Суанье Ю., Паноскальцис-Мортари А., Макнирни С. А., Юн Г. Х., Фауч С. К. и др. Успешный адоптивный перенос и экспансия гаплоидентичных NK-клеток человека in vivo у больных раком. Кровь (2005) 105 : 3051–7. DOI: 10.1182 / кровь-2004-07-2974

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Фоли Б., Кули С., Вернерис М. Р., Куртсингер Дж., Луо Х, Уоллер Е. К. и др. Индуцированные цитомегаловирусом человека (CMV) NKG2C (+) NK-клетки типа памяти можно трансплантировать и размножать in vivo в ответ на антиген CMV реципиента. J Immunol (2012) 189 : 5082–8. DOI: 10.4049 / jimmunol.1201964

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Фоли Б., Кули С., Вернерис М. Р., Питт М., Куртсингер Дж., Луо Х и др. Реактивация цитомегаловируса после аллогенной трансплантации способствует длительному увеличению образованных естественных клеток-киллеров NKG2C + с мощной функцией. Кровь (2012) 119 : 2665–74. DOI: 10.1182 / кровь-2011-10-386995

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Bryceson YT, Ljunggren HG, Long EO. Минимальные требования для индукции естественной цитотоксичности и пересечения сигналов активации ингибирующими рецепторами. Кровь (2009) 114 : 2657–66. DOI: 10.1182 / кровь-2009-01-201632

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Руджери Л., Капанни М., Урбани Э., Перруччо К., Шломчик В.Д., Тости А. и др. Эффективность аллореактивности донорских естественных клеток-киллеров в несоответствующих гемопоэтических трансплантатах. Наука (2002) 295 : 2097–100. DOI: 10.1126 / science.1068440

CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Эльмаагачли А.Х., Стекель Н.К., Колдехофф М., Хегерфельдт Ю., Треншель Р., Дичковски М. и др. Ранняя репликация цитомегаловируса человека после трансплантации связана со снижением риска рецидива: данные о предполагаемом эффекте вирусной лейкемии у пациентов с острым миелоидным лейкозом. Кровь (2011) 118 : 1402–12.DOI: 10.1182 / кровь-2010-08-304121

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Бачанова В., Кули С., Дефор Т.Е., Вернерис М.Р., Чжан Б., Маккенна Д.Х. и др. Клиренс острого миелоидного лейкоза гаплоидентичными естественными клетками-киллерами улучшается при использовании слитого белка дифтерийного токсина IL-2. Кровь (2014) 123 : 3855–63. DOI: 10.1182 / кровь-2013-10-532531

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Ито С., Боллард С.М., Карлстен М., Меленхорст Дж. Дж., Бьянкотто А., Ван Э. и др. Сверхмалые дозы интерлейкина-2 стимулируют иммуномодулирующую функцию регуляторных Т-клеток и естественных киллеров у здоровых добровольцев. Mol Ther (2014) 22 : 1388–95. DOI: 10.1038 / mt.2014.50

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Сутлу Т., Нистром С., Гилджам М., Стеллан Б., Эпплквист С.Е., Алиси Э. Ингибирование внутриклеточных механизмов противовирусной защиты усиливает лентивирусную трансдукцию естественных клеток-киллеров человека: значение для генной терапии. Hum Gene Ther (2012) 23 : 1090–100. DOI: 10.1089 / hum.2012.080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Нагашима С., Мейлиард Р., Кашии Ю., Райхерт Т.Э., Херберман Р.Б., Роббинс П. и др. Стабильная трансдукция гена интерлейкина-2 в линии естественных киллеров человека и их фенотипические и функциональные характеристики in vitro и in vivo. Кровь (1998) 91 : 3850–61.

PubMed Аннотация | Google Scholar

17. Юса С., Катина Т.Л., Кэмпбелл К.С. SHP-1- и фосфотирозин-независимая ингибирующая передача сигналов цитоплазматическим доменом Ig-подобного рецептора киллерных клеток в человеческих NK-клетках. J Immunol (2002) 168 : 5047–57. DOI: 10.4049 / jimmunol.168.10.5047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Бекнелл Б., Тротта Р., Ю Дж., Динг В., Мао Х.С., Хьюз Т. и др.Эффективное инфицирование естественных клеток-киллеров человека гибридным вектором ВЭБ / ретровирус. J Immunol Methods (2005) 296 : 115–23. DOI: 10.1016 / j.jim.2004.11.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Биньямин Л., Альпау Р.К., Хьюз Т.Л., Лутц К.Т., Кэмпбелл К.С., Вайнер Л.М. Блокирование ингибирующего самораспознавания NK-клеток способствует антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели противолимфомной терапии. J Immunol (2008) 180 : 6392–401. DOI: 10.4049 / jimmunol.180.9.6392

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Guven H, Konstantinidis KV, Alici E, Aints A, Abedi-Valugerdi M, Christensson B, et al. Эффективный перенос генов в первичные естественные клетки-киллеры человека с помощью ретровирусной трансдукции. Exp Hematol (2005) 33 : 1320–8. DOI: 10.1016 / j.exphem.2005.07.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Имаи С., Ивамото С., Кампана Д. Генетическая модификация первичных естественных клеток-киллеров преодолевает тормозящие сигналы и индуцирует специфическое уничтожение лейкемических клеток. Кровь (2005) 106 : 376–83. DOI: 10.1182 / кровь-2004-12-4797

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Крушинский А., Мосманн А., Пошке И., Норелл Х., Хмелевский М., Селигер Б. и др. Конструирование антиген-специфических первичных NK-клеток человека против HER-2-положительной карциномы. Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105 : 17481–6. DOI: 10.1073 / pnas.0804788105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Альтватер Б., Ландмайер С., Пшерер С., Темме Дж., Швир К., Кайлаянгири С. и др. Передача сигнала 2B4 (CD244) рекомбинантными антигенспецифическими химерными рецепторами костимулирует активацию естественных клеток-киллеров в клетки лейкемии и нейробластомы. Clin Cancer Res (2009) 15 : 4857–66.DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-08-2810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Чанг Й.Х., Коннолли Дж., Шимасаки Н., Мимура К., Коно К., Кампана Д. Химерный рецептор со специфичностью NKG2D усиливает активацию естественных клеток-киллеров и уничтожение опухолевых клеток. Cancer Res (2013) 73 : 1777–86. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-12-3558

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25.Имамура М., Шук Д., Камия Т., Шимасаки Н., Чай С.М., Кустан-Смит Э. и др. Автономный рост и повышенная цитотоксичность естественных клеток-киллеров, экспрессирующих мембраносвязанный интерлейкин-15. Кровь (2014) 124 : 1081–8. DOI: 10.1182 / кровь-2014-02-556837

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Микуччи Ф., Зингони А., Пикколи М., Фрати Л., Сантони А., Галандрини Р. Высокоэффективный перенос генов, опосредованный лентивирусным вектором, в первичные NK-клетки человека. Exp Hematol (2006) 34 : 1344–52. DOI: 10.1016 / j.exphem.2006.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Саван Р., Чан Т., Янг Х.А. Трансдукция лентивирусных генов в линиях NK-клеток человека и мыши. Методы Мол Биол (2010) 612 : 209–21. DOI: 10.1007 / 978-1-60761-362-6_14

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Буассель Л., Бетанкур М., Лу В., Вельс В.С., Марино Т., Ван Эттен Р.А. и др. Сравнение мРНК и лентивирусной трансфекции естественных клеток-киллеров с химерными антигенными рецепторами, распознающими лимфоидные антигены. Лимфома Leuk (2012) 53 : 958–65. DOI: 10.3109 / 10428194.2011.634048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Сам С., Шонфельд К., Вельс В.С. Экспрессия IL-15 в NK-клетках приводит к быстрому обогащению и селективной цитотоксичности генно-модифицированных эффекторов, которые несут опухолеспецифический рецептор антигена. Cancer Immunol Immunother (2012) 61 : 1451–61. DOI: 10.1007 / s00262-012-1212-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Baeriswyl V, Wodnar-Filipowicz A, Kalberer CP. Эффект подавления NKG2D посредством РНК-интерференции на рецепторные функции в активируемых интерлейкином-2 естественных клетках-киллерах человека. Haematologica (2006) 91 : 1538–41.

PubMed Аннотация | Google Scholar

32.Маашо К., Марусина А., Рейнольдс Н.М., Колиган Дж. Э., Боррего Ф. Эффективный перенос генов в линию естественных киллеров человека, NKL, с использованием системы нуклеофекции амакса. J Immunol Methods (2004) 284 : 133–40. DOI: 10.1016 / j.jim.2003.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Ян Б., Лю Х., Ши В., Ван З., Сунь С., Чжан Г. и др. Блокирование сигнального пути трансформирующего фактора роста-бета усиливает противоопухолевый эффект адоптивной терапии клетками NK-92. Int Immunopharmacol (2013) 17 : 198–204. DOI: 10.1016 / j.intimp.2013.06.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Лю Х., Ян Б., Сунь Т., Линь Л., Ху Й., Дэн М. и др. Специфическое подавление роста клеток рака молочной железы человека, экспрессирующих ErbB2, генетически модифицированными клетками NK92. Oncol Rep (2015) 33 : 95–102. DOI: 10.3892 / или 2014.3548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Schirrmann T, Pecher G. Линия естественных клеток-киллеров человека, модифицированная геном химерного иммуноглобулинового Т-клеточного рецептора, приводит к ингибированию роста опухоли in vivo. Cancer Gene Ther (2002) 9 : 390–8. DOI: 10.1038 / sj.cgt.7700453

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Grund EM, Muise-Helmericks RC. Экономичный и эффективный перенос гена в линию естественных клеток-киллеров человека, NK92. J Immunol Methods (2005) 296 : 31–6.DOI: 10.1016 / j.jim.2004.10.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Ширрманн Т., Печер Г. Специфическое нацеливание лейкозных клеток CD33 (+) линией естественных клеток-киллеров, модифицированной химерным рецептором. Leuk Res (2005) 29 : 301–6. DOI: 10.1016 / j.leukres.2004.07.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39.Boissel L, Betancur M, Wels WS, Tuncer H, Klingemann H. Трансфекция мРНК для CD19-специфического рецептора химерного антигена восстанавливает опосредованное NK-клетками уничтожение клеток CLL. Leuk Res (2009) 33 : 1255–9. DOI: 10.1016 / j.leukres.2008.11.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Ли Л., Лю Л.Н., Феллер С., Аллен С., Шивакумар Р., Фратантони Дж. И др. Экспрессия химерных антигенных рецепторов в естественных клетках-киллерах невирусным методом, совместимым с нормативными требованиями. Cancer Gene Ther (2010) 17 : 147–54. DOI: 10.1038 / cgt.2009.61

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Шимасаки Н., Фудзисаки Х., Чо Д., Масселли М., Локки Т., Элдридж П. и др. Клинически адаптируемый метод повышения цитотоксичности естественных клеток-киллеров против злокачественных новообразований B-клеток. Цитотерапия (2012) 14 : 830–40. DOI: 10.3109 / 14653249.2012.671519

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45.Чжан Дж., Сун Р., Вэй Х, Чжан Дж., Тиан З. Характеристика линии естественных киллеров человека, модифицированной геном стволовых клеток, клеток NK-92: участие в адоптивной клеточной иммунотерапии на основе NK-клеток. Oncol Rep (2004) 11 : 1097–106. DOI: 10.3892 / или 11.5.1097

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. ​​Лю Дж. Х., Вэй С., Бланшар Д. К., Джеу Дж. Восстановление литической функции в линии естественных киллеров человека путем трансфекции генов. Cell Immunol (1994) 156 : 24–35. DOI: 10.1006 / cimm.1994.1150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Daldrup-Link HE, Meier R, Rudelius M, Piontek G, Piert M, Metz S, et al. Отслеживание in vivo генетически сконструированных, направленных против HER2 / neu естественных клеток-киллеров на HER2 / neu-положительные опухоли молочной железы с помощью магнитно-резонансной томографии. Eur Radiol (2005) 15 : 4–13.DOI: 10.1007 / s00330-004-2526-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Цзян Х., Чжан В., Шан П., Чжан Х., Фу В., Е Ф и др. Трансфекция химерного гена анти-CD138 усиливает активацию естественных клеток-киллеров и уничтожение клеток множественной миеломы. Mol Oncol (2014) 8 : 297–310. DOI: 10.1016 / j.molonc.2013.12.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49.Jiang W, Zhang J, Tian Z. Функциональная характеристика трансдукции гена интерлейкина-15 в линию естественных киллерных клеток человека NKL. Цитотерапия (2008) 10 : 265–74. DOI: 10.1080 / 14653240801965156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Konstantinidis KV, Alici E, Aints A, Christensson B, Ljunggren HG, Dilber MS. Нацеливание ИЛ-2 на эндоплазматический ретикулум ограничивает аутокринную стимуляцию роста клетками NK-92. Exp Hematol (2005) 33 : 159–64. DOI: 10.1016 / j.exphem.2004.11.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Jiang W., Zhang C, Tian Z, Zhang J. Модифицированные геном hIL-15 естественные клетки-киллеры человека (NKL-IL15) усиливают эффект против гепатоцеллюлярной карциномы человека in vivo. Иммунобиология (2014) 219 : 547–53. DOI: 10.1016 / j.imbio.2014.03.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Буассель Л., Бетанкур-Буассель М., Лу В., Краузе Д.С., Ван Эттен Р.А., Вельс В.С. и др. Перенацеливание клеток NK-92 с помощью CD19- и CD20-специфических рецепторов химерного антигена выгодно отличается от антителозависимой клеточной цитотоксичности. Онкоиммунология (2013) 2 : e26527. DOI: 10.4161 / onci.26527

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Muller T, Uherek C, Maki G, Chow KU, Schimpf A, Klingemann HG, et al.Экспрессия CD20-специфического рецептора химерного антигена усиливает цитотоксическую активность NK-клеток и преодолевает NK-резистентность лимфомных и лейкозных клеток. Cancer Immunol Immunother (2008) 57 : 411–23. DOI: 10.1007 / s00262-007-0383-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Чу Дж., Дэн Й., Бенсон Д.М., Хе С., Хьюз Т., Чжан Дж. И др. Клетки-киллеры, сконструированные с помощью CS1-специфического химерного антигенного рецептора (CAR), усиливают противоопухолевую активность in vitro и in vivo против множественной миеломы человека. Лейкемия (2014) 28 : 917–27. DOI: 10.1038 / leu.2013.279

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Эссер Р., Мюллер Т., Стефес Д., Клёсс С., Зайдель Д., Гиллис С.Д. и др. NK-клетки, сконструированные для экспрессии GD2-специфического рецептора антигена, проявляют встроенную ADCC-подобную активность против опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения. J Cell Mol Med (2012) 16 : 569–81. DOI: 10.1111 / j.1582-4934.2011.01343.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Lee JM, Yoon SH, Kim HS, Kim SY, Sohn HJ, Oh ST, et al. Прямые и непрямые противоопухолевые эффекты лимфоцитов периферической крови человека, экспрессирующих как химерный иммунный рецептор, так и интерлейкин-2, на модели ксенотрансплантата рака яичника. Cancer Gene Ther (2010) 17 : 742–50. DOI: 10.1038 / cgt.2010.30

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58.Кобаяси Э., Киши Х., Одзава Т., Хамана Х., Накагава Х., Джин А. и др. Химерный антигенный рецептор TRAIL-рецептора 1 индуцирует апоптоз в различных типах опухолевых клеток. Biochem Biophys Res Commun (2014) 453 : 798–803. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2014.10.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Zhang G, Liu R, Zhu X, Wang L, Ma J, Han H, et al. Перенацеливание NK-92 на активность против меланомы с помощью TCR-подобного однодоменного антитела. Immunol Cell Biol (2013) 91 : 615–24. DOI: 10.1038 / icb.2013.45

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Чайлдс Р.У., Берг М. Привлечение естественных клеток-киллеров в клинику: манипуляции ex vivo. Hematology Am Soc Hematol Educ Program (2013) 2013 : 234–46. DOI: 10.1182 / asheducation-2013.1.234

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61.Миллер Дж. С., Руни С. М., Куртсингер Дж., Макелмерри Р., Маккуллар В., Вернерис М. Р. и др. Расширение и возвращение адоптивно перенесенных естественных клеток-киллеров человека в иммунодефицитных мышей зависит от приготовления продукта и введения цитокинов in vivo: значение для клинической терапии Пересадка костного мозга Biol (2014) 20 : 1252–7. DOI: 10.1016 / j.bbmt.2014.05.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62.Соманчи С.С., Соманчи А., Купер Л.Дж., Ли Д.А. Конструирование хоминга в лимфатических узлах ex vivo естественных клеток-киллеров человека посредством трогоцитоза хемокинового рецептора CCR7. Кровь (2012) 119 : 5164–72. DOI: 10.1182 / кровь-2011-11-389924

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Веннерберг Э., Кремер В., Чайлдс Р., Лундквист А. Индуцированная CXCL10 миграция адоптивно перенесенных естественных клеток-киллеров человека в сторону солидных опухолей вызывает регрессию роста опухоли in vivo. Cancer Immunol Immunother (2015) 64 : 225–35. DOI: 10.1007 / s00262-014-1629-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Дотти Г., Готтшалк С., Савольдо Б., Бреннер М.К. Дизайн и разработка методов лечения с использованием Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы. Immunol Rev (2014) 257 : 107–26. DOI: 10.1111 / imr.12131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65.Картрон Дж., Даше Л., Саллес Дж., Солаль-Селиньи П., Бардос П., Коломбат П. и др. Терапевтическая активность гуманизированного моноклонального антитела против CD20 и полиморфизм гена FcgammaRIIIa рецептора IgG Fc. Кровь (2002) 99 : 754–8. DOI: 10.1182 / blood.V99.3.754

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Weng WK, Levy R. Два полиморфизма рецептора фрагмента C иммуноглобулина G независимо предсказывают ответ на ритуксимаб у пациентов с фолликулярной лимфомой. J Clin Oncol (2003) 21 : 3940–7. DOI: 10.1200 / JCO.2003.05.013

CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Wu J, Edberg JC, Redecha PB, Bansal V, Guyre PM, Coleman K, et al. Новый полиморфизм FcgammaRIIIa (CD16) изменяет функцию рецептора и предрасполагает к аутоиммунным заболеваниям. J Clin Invest (1997) 100 : 1059–70. DOI: 10.1172 / JCI119616

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68.Карлстен М., Ли Л., Су С., Берг М., Регер Р., Мадхусудан П. и др. Электропорация мРНК клинического уровня NK-клеток: новый и высокоэффективный метод генетического репрограммирования NK-клеток человека для иммунотерапии рака. Тезисы ежегодного собрания ASH : Сан-Франциско (2014).

Google Scholar

70. Фурутани Э., Су С., Смит А., Берг М., Чайлдс Р. Инактивация siRNA ингибиторного рецептора NKG2A усиливает противоопухолевые эффекты адоптивно перенесенных NK-клеток у несущих опухоль хозяев. Тезисы ежегодного собрания ASH : Орландо (2010).

Google Scholar

72. Карасуяма Х., Тохьяма Н., Тада Т. Аутокринный рост и онкогенность интерлейкин-2-зависимых хелперных Т-клеток, трансфицированных геном ИЛ-2. J Exp Med (1989) 169 : 13–25. DOI: 10.1084 / jem.169.1.13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74.Клингеманн Х.Г., Вонг Э., Маки Г. Линия цитотоксических NK-клеток (NK-92) для очистки крови от лейкемии ex vivo. Пересадка костного мозга Biol (1996) 2 : 68–75.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с травмой легких, вызванной вентилятором

Аннотация

Фон

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом, используемая у пациентов с острым повреждением легких (ОПЛ), может вызывать выброс воспалительных цитокинов, таких как макрофагальный воспалительный белок-2 (MIP-2), рекрутирование нейтрофилов и нарушение альвеолярного эпителиального и эндотелиального барьеров .Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) улучшают ALI у мышей, но механизмы, регулирующие взаимодействие между механической вентиляцией легких и ИПСК, полностью не выяснены. Ядерный фактор каппа B (NF-κB) и фактор репрессии NF-κB (NKRF) были предложены для модуляции активации нейтрофилов, участвующих в ALI. Таким образом, мы предположили, что внутривенная инъекция ИПСК или кондиционированной среды, полученной из ИПСК (ИПСК-КМ), снизит инфильтрацию нейтрофилов, вызванную вентиляцией с высоким дыхательным объемом, окислительный стресс и продукцию MIP-2 через пути NF-κB / NKRF.

Методы

Самцов мышей C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель и весом от 20 до 25 г подвергали механической вентиляции с высоким дыхательным объемом (30 мл / кг) комнатным воздухом в течение от 1 до 4 часов после 5 × 10 7 клеток / кг мышиных ИПСК или ИПСК-КМ. В качестве контрольных групп использовали невентилируемых мышей.

Результаты

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом индуцировала увеличение интеграции ИПСК в поврежденные легкие мышей, проницаемость микрососудов, инфильтрацию нейтрофилов, малоновый диальдегид, продукцию MIP-2 и активацию NF-κB и NKRF.Индексы повреждения легких, включая воспаление, отек легких, патологические изменения ультраструктуры и нарушение функционального газообмена, вызванные механической вентиляцией, ослаблялись при введении ИПСК или ИПСК-КМ, что имитировалось фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью SN50 или экспрессии NKRF с помощью NKRF. короткая интерферирующая РНК.

Выводы

Наши данные предполагают, что терапия на основе ИПСК ослабляет повреждение легких, вызванное механической вентиляцией легких с высоким дыхательным объемом, по крайней мере частично, за счет ингибирования путей NF-κB / NKRF.Примечательно, что кондиционированная среда ИПСК показала положительные эффекты, равные таковым ИПСК.

Образец цитирования: Лю И-И, Ли Л-Ф, Ян Ц.-Т, Лу К-Х, Хуанг Ц-Ц, Као К-Ц и др. (2013) Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с повреждением легких, вызванным вентилятором. PLoS ONE 8 (6): e66760. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760

Редактор: Раджасинг Джонсон, Медицинский центр Канзасского университета, Соединенные Штаты Америки

Получено: 13 марта 2013 г .; Дата принятия: 12 мая 2013 г .; Опубликован: 26 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Liu et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа поддержана Национальным научным советом, Тайвань 101-2314-B-182A-088-MY3. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Острое повреждение легких (ОПЛ) и его наиболее тяжелое проявление, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), характеризуются повышенной проницаемостью микрососудов и утечкой капилляров из-за тяжелого повреждения эпителия и эндотелия [1], [2]. Патологическое чрезмерное растяжение легких может происходить в здоровых частях легких у пациентов с ОРДС, использующих аппарат искусственной вентиляции легких. Искусственная вентиляция легких с высокими дыхательными объемами (V T ) вызывает вызванное вентилятором повреждение легких (VILI), характеризующееся некардиогенным отеком легких, выбросом цитокинов и хемокинов, приводящим к притоку нейтрофилов [3].Привлечение воспалительных клеток с высокой вентиляцией V T инициируется усиленным продуцированием медиаторов воспаления, таких как воспалительный белок-2 мышиных макрофагов (MIP-2), который является функциональным гомологом человеческого интерлейкина-8 (IL-8). у грызунов. Известно, что MIP-2, мощный хемокин для нейтрофилов, вносит свой вклад в патогенез VILI за счет рекрутирования этих лейкоцитов в легкие [4] - [5]. Таким образом, нацеливание на MIP-2 является потенциальным терапевтическим преимуществом при ALI.

Ядерный фактор-κB (NF-κB) играет ключевую роль в патогенезе иммунных и воспалительных реакций [6] - [7]. Активация NF-κB может привести к экспрессии MIP-2, фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1β), которые активируют воспалительные каскады в ALI [8] - [9 ]. Ранее мы продемонстрировали, что высокая вентиляция V T вызывает зависящее от времени увеличение активации NF-κB в модели VILI у мышей [10]. NF-κB играет важную роль в передаче воспалительного сигнала, вызываемого высвобождением IL-8 за счет вентиляции с высоким растяжением in vitro и in vivo [11] - [12].Held et al. также показали, что гипервентиляция запускает активацию NF-κB и вызывает высвобождение хемокинов и цитокинов из перфузированных легких, аналогично таковому у LPS у мышей [13]. Тем не менее, активность NF-κB контролируется на других уровнях, включая индуцибельное фосфорилирование, связывание коактиваторов и репрессоров [14].

Фактор репрессии NF-κB (NKRF) представляет собой белок-глушитель транскрипционного фактора, который специфически противодействует базовой активности нескольких NF-κB-зависимых промоторов интерлейкина-8, интерферона β (IFN-β) и индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS). ) гены путем прямого связывания со специфическими последовательностями ДНК [15] - [16].МРНК NKRF конститутивно экспрессируются во всех протестированных тканях человека. Эндогенный NKRF связывается с белками NF-κB посредством прямого межбелкового взаимодействия и участвует в ингибировании базальной активности NF-κB [17]. Интересно, что NKRF, как было показано, обладает двойной ролью регуляции транскрипции IL-8 [18] - [19]. NKRF связывается с негативными регуляторными элементами (NRE) промотора IL-8 и напрямую взаимодействует с NF-κB, подавляя экспрессию гена IL-8 в базальном (нестимулированном) состоянии, но, наоборот, превращается в коактивирование с NF-κB, чтобы индуцируют транскрипцию IL-8 при стимуляции IL-1.

Недавние исследования показали, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из эмбриональных фибробластов мыши (MEF), а также из фибробластов взрослого человека посредством ретровирусной трансфекции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, и Klf4 [20] - [22]. Морфология, пролиферативные способности, поверхностные антигены, экспрессия генов, эпигенетический статус генов, специфичных для плюрипотентных клеток, и теломеразная активность между эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) и ИПСК были сходными [21] - [22].В дополнение к особенностям самообновления и дифференцировки на три зародышевых листка, ИПСК могут быть получены из соматических клеток пациента и избежать этических противоречий и возможности иммунного отторжения после трансплантации, вызванного ESCs [23]. Следовательно, ИПСК считаются хорошим кандидатом для клеточной терапии и используются для аутотрансплантации без риска отторжения. Исследование in vivo на крысах с ишемией головного мозга показало, что ИПСК обладают способностью к множественной дифференцировке и дополнительно снижают тяжесть инфарктов головного мозга [24].Наше недавнее исследование индуцированного липополисахаридом (LPS) ALI у мышей продемонстрировало, что терапия ИПСК оказывает противовоспалительное действие [25]. Интересно, что Curley et al. показали, что терапия мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) усиливает восстановление легких после ВИЛИ посредством паракринного механизма, зависимого от фактора роста кератиноцитов [26]. Однако роль ИПСК при ВИЛИ не полностью очерчена и требует дальнейшего изучения.

В этой модели ALI с высоким уровнем механического растяжения у мышей мы исследовали взаимосвязь между вентиляцией с высоким V T , ИПСК и производной от ИПСК кондиционированной средой (ИПСК-СМ), производством MIP-2, внутриклеточным окислительным стрессом и активацией Передача сигналов NF-κB и NKRF с использованием фармакологического ингибирования с помощью SN-50, специфического ингибитора NF-κB и короткой интерферирующей РНК (siRNA), нацеленной на NKRF.Мы предположили, что внутривенные инъекции ИПСК или ИПСК-КМ уменьшат инфильтрацию нейтрофилов, окислительный стресс, отек легких и продукцию MIP-2 у мышей, подвергшихся вентиляции с высоким уровнем V T , посредством модуляции путей NF-κB и NKRF.

Результаты

Характеристика ИПСК, полученных из MEF

В наших настоящих и предыдущих исследованиях [25], [27] мы установили плюрипотентные ИПСК мыши без c-Myc и исследовали молекулярные характеристики и потенциал самонаведения трансплантированных ИПСК в поврежденном легком у мышей с ALI (рис. 1 и рис. S1). ).Мы также исследовали лечебные эффекты ИПСК и ИПСК-КМ и обнаружили, что ИПСК и ИПСК-КМ имели сходные эффекты в улучшении состояния мышей с ALI (рис. S2). Подробности см. В файле вспомогательной информации Text S1.

Рисунок 1. Характеристика трехгенных ИПСК мыши.

(A) Слева: трехгенные ИПСК мыши были способны образовывать колонии, похожие по внешнему виду на колонии ЭСК. Справа: колонии мышиных ИПСК с тремя генами были положительны по окрашиванию щелочным фосфатом (синий). (B) По сравнению с MEF анализ RT-PCR показал, что iPSC экспрессировали маркеры генов стволовых клеток (GAPDH: внутренний контроль).(C) Эти колонии ИПСК были положительными на SSEA-1 при иммунофлуоресцентном окрашивании. (D) Анализ микроматрицы экспрессии генов показал, что схожие профили экспрессии среди ИПСК с тремя генами, ЭСК и ИПСК с четырьмя генами с использованием иерархической тепловой карты. DAPI = 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол; ESC = эмбриональные стволовые клетки; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; iPSC-ALP = iPSC, окрашенный щелочным фосфатом; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; mESC = эмбриональные стволовые клетки мыши; 3F miPSC = три фактора транскрипции без iPSC мыши c-Myc; 4F miPSC = четыре фактора транскрипции iPSC мыши; SSEA-1 = специфический для стадии эмбриональный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g001

ИПСК или ИПСК-КМ, ослабленные ВИЛИ, индуцированные высоким дыхательным объемом

Мы также использовали вентиляцию с высоким дыхательным объемом (V T 30 мл; обозначается как V T 30) окружающим воздухом в течение 4 часов для индукции ВИЛИ у самцов мышей C57BL / 6 и исследовали лечебные эффекты внутривенно введенных ИПСК. или iPSC-CM. Физиологические условия в начале и в конце вентиляции представлены в таблице 1.Гистологические исследования показали, что легкие животных, поврежденные механической вентиляцией легких при V T 30, имели картину альвеолярного застоя, кровотечения, утолщения альвеолярной стенки и инфильтрации нейтрофилов, которые в значительной степени были устранены введением ИПСК или ИПСК-КМ ( Рисунок 2А). Количественная оценка повреждения легких подтвердила тяжелое повреждение, вызванное V T 30, и терапевтический потенциал ИПСК или ИПСК-КМ (рис. 2В). A V T 30 также увеличивал содержание синего красителя Эванса (EBD) в легких и отношение влажного к сухому, что указывает на капиллярную утечку.Микроскопическая гиперемия легких и повышение проницаемости капилляров, вызванные V T 30, не были затронуты обработкой эмбриональных фибробластов мыши (MEF), но были существенно подавлены обработкой либо ИПСК, либо ИПСК-КМ (Фигуры 2C, 1D). Таким образом, эти данные предполагают, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшают микроваскулярную утечку, отек легких и общее повреждение легких в модели VILI у мышей, индуцированной V T 30. Количественная оценка повреждения легких (контроль, PBS = 0,46 ± 0,07, Контроль, SN50 = 0.38 ± 0,12, контроль, миРНК NKRF = 0,42 ± 0,08, контроль, инактивированный нагреванием iPSC-CM = 0,5 ± 0,1, P = 0,51), уровни EBD (контроль, PBS = 24,6 ± 1,4 нг / мг веса легких, контроль, SN50 = 22,2 ± 1,3 нг / мг веса легких, контроль, миРНК NKRF = 23,0 ± 1,8 нг / мг веса легких, контроль, термоинактивированный iPSC-CM = 25,3 ± 1,7 нг / мг веса легких, P = 0,14), влажный- соотношение массы к сухой массе (контроль, PBS = 4,2 ± 0,5, контроль, SN50 = 4,1 ± 0,3, контроль, миРНК NKRF = 4,2 ± 0,2, контроль, термоинактивированные iPSC-CM = 4,5 ± 0,4, P = 0,41). в контрольной группе мышей без вентиляции.

Рис. 2. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF снижали отек и повреждение легких, вызванные растяжением легких.

(A) Гистологическое исследование и (B) количественная оценка структурного повреждения дыхательных путей, вызванного высоким дыхательным объемом, и восстанавливающего эффекта ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF. Влияние введения ИПСК, ИПСК-ЦМ, SN-50 или миРНК NKRF на (C) EBD легких и (D) соотношение влажного и сухого состояния у мышей дикого типа, получающих механическую вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом. (V T 30) показаны.SN50 (2 мг / кг) вводился внутрибрюшинно за 30 мин до ИВЛ. NKRF siRNA, 6 мг / кг, вводили интратрахеально за 48 ч до механической вентиляции. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. На панелях B, C и D * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм. CM = кондиционированная среда ИПСК; EBD = синий краситель Эванса; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; NKRF = фактор репрессии NF-κB; PBS = физиологический раствор с фосфатным буфером; Мошенничество = ненаправленная скремблированная миРНК; миРНК = короткая интерферирующая РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g002

Снижение воспалительного ответа, связанного с ВИЛИ, с помощью ИПСК или ИПСК-ЦМ

Затем мы идентифицировали нейтрофилы, основные воспалительные клетки, участвующие в процессе ALI [25]. Подсчет нейтрофилов и анализ миелопероксидазы (MPO) показали, что нейтрофилы мигрировали в поврежденные участки легких у мышей после механической вентиляции при V T 30 по сравнению с невентилируемыми мышами (Фигуры 3A, 3B).Между тем, уровень малонового диальдегида (МДА), который является вторичным альдегидным продуктом перекисного окисления липидов, продуцируемых нейтрофилами, и уровни белка MIP-2 были повышены в ответ на лечение V T 30 (Фигуры 3C, 3D), что указывает на увеличение окислительного стресс и активация хемоаттрактантов для нейтрофилов в этой модели. Примечательно, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшали миграцию нейтрофилов, MDA и повышение уровня белка MIP-2 (рисунки 3C, 3D). Эти данные демонстрируют, что ИПСК или ИПСК-КМ могут ослаблять нейтрофильную инфильтрацию и воспалительные реакции в ВИЛИ, индуцированных высоким дыхательным объемом.

Рис. 3. ИПСК или ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF ослабляют инфильтрацию нейтрофилов, вызванную растяжением легких, и оксидантный стресс.

Влияние введения ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF на (A) инфильтрацию нейтрофилов, (B) активность MPO, (C) активность MDA и (D) секрецию MIP-2 в ЖБАЛ в естественных условиях: показаны мыши, получающие искусственную вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом (V T 30). Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * Р <0.05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество или MEF. БАЛ = жидкость бронхоальвеолярного лаважа; MDA = малоновый диальдегид; MIP-2 = воспалительный белок макрофага-2; МПО = миелопероксидаза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g003

Вентиляция с высоким дыхательным объемом вызвала повышенную проницаемость микрососудов, воспаление и повреждение легких за счет активации NF-κB и NKRF, которые ингибировались siRNA SN50 и NKRF соответственно

NF-κB и NKRF, как было показано, модулируют активацию нейтрофилов, участвующую в ALI [10], [18].Иммуногистохимия показала, что эпителий дыхательных путей окрашен положительно на NKRF и фосфо-NF-κB после механической вентиляции при V T 30 (Фигуры 4A, 4B, 5A, 5B). Для дальнейшего изучения взаимосвязи между NF-κB и NKRF в этой модели VILI мы затем использовали миРНК NKRF или фармакологическое ингибирование NF-κB, чтобы идентифицировать участие пути NF-κB / NKRF в VILI, индуцированном высоким дыхательным объемом. В соответствии с иммуногистохимическими данными, анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия NKRF и фосфорилирование фосфо-NF-κB были увеличены у мышей, получавших ИВЛ при V T 30, и что нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB с помощью SN50 отменяли V T 30-индуцированная активация NKRF и фосфо-NF-κB (Фигуры 5C, 5D, 6A, 6B).Нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB также предотвращали активацию мРНК NKRF в ответ на V T 30 (Фигуры 6C, 6D). Введение SN50 или миРНК NKRF также аннулировало баллы повреждения легких, проницаемость микрососудов, приток нейтрофилов и продукцию MDA и MIP-2 (Фигуры 2 и 3). В соответствии с предыдущими сообщениями в ALI [10], [18], наши данные показывают, что передача сигналов NF-κB / NKRF также необходима для индукции VILI.

Рисунок 4. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию NKRF, индуцированную растяжением легких, в эпителии дыхательных путей.

Иммуногистохимия (A, × 400) и количественная оценка (B) экспрессии NKRF были взяты из легких V T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF. Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на NKRF в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета означают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов.* P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g004

Рис. 5. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли фосфорилирование NF-κB, вызванное растяжением легких.

Фосфорилирование NF-κB из легких V T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA, как обнаружено с помощью иммуногистохимии (A, B) (× 400) и количественного определения, (C, D) Вестерн-блоттинг.Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Произвольные единицы выражали как отношение фосфо-NF-κB к NF-κB. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на фосфо-NF-κB в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета означают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество, PBS или MEF.Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g005

Рис. 6. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию мРНК NKRF и NKRF, индуцированную растяжением легких.

Экспрессия

NKRF в легких V T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF, была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга (A, B). Продемонстрированы эффекты введения ИПСК, ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF на экспрессию мРНК NKRF (C, D).Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Произвольные единицы выражали как отношение мРНК NKRF к GAPDH или мРНК NKRF к GAPDH. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS или мошенничеством, † P <0,05 по сравнению с V T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество, PBS или MEF

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g006

Ингибирование индуцированных высокой вытяжкой вентиляционных путей NF-κB / NKRF с помощью ИПСК или ИПСК-КМ, которое имитировалось фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью SN50 или экспрессии NKRF с помощью миРНК NKRF

Затем мы исследовали, опосредованы ли положительные эффекты, обеспечиваемые ИПСК или ИПСК-КМ, через пути NF-κB / NKRF.Мы определили, что введение ИПСК или ИПСК-КМ отменяет индуцированную V T 30 активацию мРНК NKRF и их продукцию белка, что было измерено с помощью экспрессии генов и вестерн-блоттинга (Фигуры 6A, 6B, 6C, 6D). Кроме того, ИПСК или ИПСК-КМ снижали индуцированное V T 30 фосфорилирование NF-κB, как измерено с помощью вестерн-блоттинга (рис. 5C, 5D). Кроме того, положительное иммуногистохимическое окрашивание на NKRF или фосфо-NF-κB в эпителии легких или интерстициальном у мышей при V T 30 было значительно ослаблено обработкой ИПСК или ИПСК-КМ (рисунки 4A, 4B и 5A, 5B) .Эти результаты показывают, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ обладают способностью подавлять индуцированный V T 30 окислительный взрыв и воспалительные реакции посредством ингибирования путей NF-κB / NKRF, что имитируется фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью Экспрессия SN-50 или NKRF с помощью миРНК NKRF, как указано выше.

Ультрамикроструктурное восстановление с помощью iPSCs, iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для определения эффектов механической вентиляции и терапии ИПСК на ультраструктуру бронхиального эпителия (рис. 7А).Введение V T 30 привело к нарушению ультрамикроструктуры дыхательных путей: уменьшению и нечеткости микроворсинок, увеличению секреторных пузырьков и сокращению ядер. Введение ИПСК или ИПСК-КМ, подобных SN50 или миРНК NKRF, последовательно восстанавливало ультраструктурную целостность дыхательных путей у мышей, подвергнутых вентиляции с высоким уровнем V T , что фактически было продемонстрировано с помощью ТЕМ. Кроме того, соотношение PaO2 / FiO2, показатель функционального газообмена, было значительно ухудшено с V T 30 по сравнению с невентилируемыми мышами (Рисунок 7B).Примечательно, что снижение оксигенации с помощью V T 30 было значительно улучшено при введении iPSC, iPSC-CM, а также siRNA SN50 или NKRF.

Рис. 7. Восстановление ультрамикроструктуры и оксигенация с помощью iPSCs или iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA.

(A) Изображение на просвечивающем электронном микроскопе, показывающее восстановление ультрамикроструктуры дыхательных путей с помощью ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF. (B) Было показано восстановление оксигенации с помощью ИПСК, ИПСК-СМ, SN50 или миРНК NKRF у мышей дикого типа, получавших вентиляцию с высоким дыхательным объемом.Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 2 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g007

Обсуждение

Вентиляция с высоким дыхательным объемом у здоровых мышей использовалась для имитации чрезмерного растяжения менее травмированных и, следовательно, более податливых областей легкого, обнаруженных при ОРДС.Предыдущие исследования показали, что гиперэкспансия легкого является механизмом волютравмы в VILI [1] - [3]. Изменения проницаемости микрососудов были связаны с тяжелым эпителиальным и эндотелиальным повреждением, вызванным рекрутированием воспалительных клеток и производством растворимых факторов, связанных с биотравмой легкого. Хотя стратегия вентиляции с защитой легких дает положительные результаты, смертность от ОРДС остается достаточно высокой [28]. Следовательно, необходимы новые методы лечения, включая клеточную терапию, для дальнейшего снижения заболеваемости и смертности от этого синдрома.Механизмы лечения ИПСК или их растворимых факторов до конца не изучены и требуют изучения в доклинических исследованиях и дальнейших клинических испытаниях. В нашем предыдущем исследовании мы наблюдали положительное влияние ИПСК или ИПСК-КМ на ЛПС-индуцированный ALI у мышей [25]. На этой модели VILI мышей мы продемонстрировали, что вентиляция с высоким уровнем V T увеличивает отек легких, проницаемость микрососудов, инфильтрацию нейтрофилов, продукцию MIP-2 из БАЛ, внутриклеточный окислительный стресс и полное повреждение легких.Важно отметить, что либо ИПСК, либо ИПСК-КМ могут защитить мышей от повреждения легких, вызванного высокой вытяжной вентиляцией, и восстановить функциональный газообмен за счет улучшения оксигенации. Мы далее исследовали роль NF-κB и NKRF в опосредовании положительных эффектов, обеспечиваемых iPSC или iPSC-CM в VILI, и обнаружили, что терапия на основе iPS-клеток снижает высокий V T вызванный механической вентиляцией окислительный стресс и воспалительную реакцию за счет ингибирования NF. -κB / NKRF-MIP-2 (IL-8) передача сигналов.

Было установлено, что терапия стволовыми клетками с ИПСК демонстрирует эффективность при лечении церебрального инсульта, травмы спинного мозга и инфаркта миокарда [24], [29] - [30]; однако влияние ИПСК на ALI остается неизвестным.Повреждающий стимул в легких вызывает высвобождение фактора стромальных клеток (SDF) -1a, вторичного лимфоидного хемокина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), цистеин-аминоцистеинового рецептора (CXCR) 4 и CXCR7, которые стимулируют Направление ИПСК в поврежденную ткань [31]. Благоприятные эффекты ИПСК обусловлены не только пластичностью приживления легких, но и их способностью секретировать паракринные факторы, которые регулируют проницаемость, воспаление и восстановление эндотелия и эпителия.В нашем предыдущем исследовании LPS-индуцированного ALI у мышей мы показали, что терапия ИПСК снижает приток нейтрофилов независимо от контакта с клетками [25]. Поскольку время, в течение которого ИПСК дифференцируются в мультипотентные предшественники легких и дыхательных путей, может составлять более одной недели [32], [33], а скорость приживления ИПСК в поврежденном легком у мышей с ALI составляет всего 4%, это последствия. растворимых факторов в iPSC-CM, которые модулируют процесс ослабления в независимом от клеточного контакта стиле [25].Накапливающиеся исследования LPS-индуцированного ALI у мышей, получавших мононуклеарные клетки костного мозга или МСК, продемонстрировали, что улучшение повреждения легких может быть связано с паракринными эффектами, несмотря на более низкий процент стволовых клеток, приживаемых в легкие [34] - [37]. Здесь мы продемонстрировали, что лечение ИПСК-КМ было столь же эффективным в обращении вспять воспаления легких, вызванного высоким дыхательным объемом, утечки микрососудов и патологического повреждения легких, как и ИПСК. Учитывая, что iPSC-CM, содержащие растворимые факторы, можно использовать для уменьшения VILI как iPSC за счет своего паракринного эффекта, а iPSC-CM считается заменой стволовых клеток для предотвращения высокого риска образования тератомы после трансплантации стволовых клеток.В противном случае в этом исследовании мы усовершенствовали нашу процедуру ИПСК для удаления онкогена путем создания эктопической трансфекции репрограммирующих факторов Oct4 / Sox2 / Klf4 без c-Myc, как описано ранее [27], и, таким образом, потенциал этих клеток в качестве клинического терапевтического средства. источник становится многообещающим.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что вентиляция с высоким уровнем V T задействовала приток нейтрофилов, измеренный по инфильтрации нейтрофилов БАЛ и общей секвестрации нейтрофилов уровнями МПО в тканях легких, и увеличила концентрацию МДА, вторичного альдегидного продукта. перекисного окисления липидов, используемого в качестве маркера окислительного повреждения.Нейтрофилы, в основном хемоаттрактивные с помощью MIP-2, являются основными воспалительными клетками, участвующими в процессе VILI, и играют важную роль в генерации огромных активных форм кислорода (ROS) [38] - [40]. NF-κB может быть активирован как чувствительный к окислительному стрессу фактор транскрипции, необходимый для максимальной экспрессии многих цитокинов, участвующих в патогенезе ALI. Кроме того, связывающие элементы для NF-κB присутствуют в промоторных областях генов цитокинов, таких как MIP-2 (IL-8) [41]. Предыдущие исследования показали, что введение стероидоблокирующего NF-κB или специфического ингибитора NF-κB SN50 улучшает проницаемость микрососудов, приток нейтрофилов в альвеолярный просвет и провоспалительные цитокины во время VILI [10], [13].Здесь мы показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ могут снижать вызванную вентиляцией высокую активацию NF-κB V T , тем самым предотвращая приток нейтрофилов в альвеолы, снижая количество MIP-2 и MDA, ослабляя альвеолярный эпителиальный капилляр. утечка и улучшила VILI. В соответствии с нашими результатами, Yang el al. описали, что трансплантация стромальных клеток костного мозга может защитить от вызванного паракватом острого повреждения легких за счет снижения активации NF-κB [42] и Yagi et al. продемонстрировали, что человеческие МСК обладают способностью ингибировать активацию NF-κB в условиях воспаления, стимулированного LPS [43].Вместе взятые, мы продемонстрировали, что ИПСК и ИПСК-КМ обладают антиоксидантной и противовоспалительной способностью уменьшать VILI за счет ослабления окислительного стресса и ингибирования активации NF-κB и его нижестоящих медиаторов воспаления.

Затем мы дополнительно исследовали, действует ли NKRF как коактиватор или репрессор, регулирующий NF-κB в условиях VILI. IL-8 действует как главный медиатор острого нейтрофил-опосредованного воспаления в ответ на механический клеточный стресс. Промотор гена IL-8 содержит элемент NF-κB, который необходим для активации во всех изученных типах клеток, но усиление транскрипционной активности, индуцированной NF-κB, может дополнительно требовать фосфорилирования субъединиц, а также связывания коактиваторов [44].NKRF, повсеместно экспрессируемый фактор ядерной транскрипции, связывается с NRE промотора IL-8, специфически ингибируя транскрипционную активность белков NF-κB. Как уже отмечалось, в экспрессии гена IL-8 было обнаружено, что исключительно NKRF выполняет двойную функцию. Он подавляет базальную транскрипцию гена IL-8 в нестимулированных клетках. Вместе с NF-κB p65, NKRF действует как коактиватор для стимуляции экспрессии гена IL-8 в обработанных IL-1 эпителиальных клетках человека [15]. Поскольку IL-8 был всесторонне изучен как ген, контролируемый NKRF, мы поэтому изучили взаимодействие NKRF с NF-κB в регуляции продукции MIP-2 в VILI.Мы продемонстрировали, что как NKRF, так и NF-κB активировались при вентиляции с высоким растяжением по отдельности. Введение либо с использованием SN50, либо короткой интерферирующей РНК NKRF может ослабить высокий уровень V T , вызванный вентиляцией ALI. Эти результаты показали, что взаимодействие NKRF с NF-κB, а не репрессия, вносит вклад в нижестоящие воспалительные каскады, индуцированные вентиляцией с высоким растяжением, и это открытие согласуется с двойной ролью NKRF в регуляции транскрипции IL-8. Вероятно, что NKRF может играть двойную роль в регуляции сигнального пути NF-κB, в зависимости от различных экспериментальных моделей e.g., хронические воспалительные заболевания дыхательных путей по сравнению с острым повреждением легких и различные типы клеток, например, гладкомышечные клетки дыхательных путей по сравнению с эпителиальных клеток дыхательных путей, расположение и время воздействия стимулов [45], [46]. В этом исследовании мы также продемонстрировали, что ИПСК или ИПСК-КМ могут снижать коактивацию NF-κB и NKRF, вызванную высоким дыхательным объемом, аналогично SN50 или РНК-интерференции NKRF, тем самым резко снижая последующий окислительный стресс и воспалительные реакции.

Поскольку ИПСК могут быть получены из собственных соматических клеток пациента, они обладают преимуществами, позволяющими избежать иммунного отторжения после трансплантации, а также этическими проблемами, вызываемыми ЭСК для целей будущего клинического использования [20] - [23].В отличие от ESC и iPS-клеток, MSC имеют ограниченную продолжительность жизни, стареют и имеют риск контаминации при культивировании in vitro [34]. Таким образом, ИПСК кажутся многообещающим источником стволовых клеток для трансплантации аутологичных клеток при определенных заболеваниях. Однако оптимальный путь доставки клеток еще предстоит определить. Предыдущие исследования терапии стволовыми клетками на мышах показали канцерогенность при прямом применении ЭСК человека [47] и замедлении применения ЭСК. Наши предыдущие исследования показали, что это безопасный способ доставки ИПСК внутривенно через хвостовую вену, и через 90 дней наблюдения не наблюдалось образования тератомы [25].Поскольку биотравма, вызванная высокой вытяжной вентиляцией, и последующее вовлечение нескольких органов могут сопровождаться VILI, внутривенный путь, используемый в этом исследовании, может быть предпочтительным подходом для оказания системного положительного эффекта, как отмечалось [48]. Тем не менее, риск образования тератомы по-прежнему является проблемой при терапии стволовыми клетками, и в будущем исследовании потребуется долгосрочное наблюдение за терапией ИПСК и модификация процедуры уточненных ИПСК.

У нашего исследования были ограничения. Стволовые клетки могут избежать клиренса иммунной системой хозяина с помощью механизмов, включая низкую экспрессию белков главного комплекса гистосовместимости (MHC) I и II, а также отсутствие костимулирующих молекул Т-клеток, CD40, CD80 и CD86 [49].Однако недавние исследования показали, что MSC могут экспрессировать более высокие уровни белков класса MHC и могут вызывать ответ хозяина и приводить к отторжению трансплантата [50], [51]. Следует тщательно прояснить иммунологическую привилегию ИПСК. Во-вторых, МСК обладают мощными иммуносупрессивными эффектами, опосредованными зависимыми от контакта и независимыми от контакта механизмами посредством высвобождения растворимых факторов, включая IL-10, простагландин E2, фактор роста кератиноцитов, фактор, стимулирующий колонию гранулоцитов, и антагонист рецептора IL-1. [35], [49] - [51].Наборы цитокинов и количественный анализ растворимых медиаторов ИПСК-КМ помогут нам идентифицировать эти полезные медиаторы в терапии стволовыми клетками. В-третьих, Lee et al. описали терапевтический потенциал МСК на двух человеческих моделях ALI, включая препарат ex vivo человеческого легкого и первичные культуры человеческих клеток альвеолярного эпителия типа II, поврежденных воспалительными инсультами [49]. Но применение персонализированной терапии ИПСК у критически больных пациентов с ОПЛ требует технологических инноваций, таких как быстрый сбор и быстрое распространение трансплантированных ИПСК.Клинические испытания будут необходимы для определения реалистичных эффектов терапии на основе ИПСК в острой и репаративной фазах у пациентов с ОРДС, использующих аппарат искусственной вентиляции легких в ближайшем будущем. Пути, участвующие в повреждении легких, вызванном эндотоксином и вентилятором, различаются. При индукции повреждения легких LPS увеличение количества повреждений легких LPS вызывает генерализованное воспаление, главным образом, в эндотелиальных клетках легкого; однако механическое растяжение, вызванное вентилятором, ведет к дестабилизации альвеолярно-эпителиального и капиллярно-эндотелиального барьеров, что приводит к повышенной проницаемости сосудов и отеку легких [52].

Выводы

Рабочая группа Национального института сердца, легких и крови по ОРДС определила, что молекулярные основы повреждения легких, вызванного механическим стрессом, являются плодотворной областью будущих исследований, поскольку ВИЛИ может привести к системной транслокации цитокинов и полиорганной недостаточности в клинические условия [53]. Используя модель in vivo мыши VILI, мы продемонстрировали, что повреждение легких, вызванное высокой вентиляцией V T , было связано с притоком нейтрофилов, окислительным стрессом, повреждением альвеолярного эпителия-капилляров и продукцией MIP-2.Это тяжелое воспаление, отек, патологическое разрушение и нарушение газообмена поврежденных легких ослаблялись либо внутривенными ИПСК, либо ИПСК-КМ, и, по крайней мере частично, опосредовались ингибированием путей NF-κB / NKRF. Примечательно, что ИПСК-КМ показал сопоставимые эффекты, аналогичные эффектам ИПСК, и кондиционированная среда, содержащая растворимые факторы, заслуживает дальнейших исследований. Понимание положительных эффектов терапии ИПСК, связанных с подавлением сигнального пути NF-κB / NKRF и воспалительными реакциями, может позволить прояснить биомолекулярные механизмы, регулирующие VILI, и дать представление о новом терапевтическом варианте для ALI / ARDS.

Материалы и методы

Этика экспериментальных животных

Самцов мышей C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель и массой от 20 до 25 г были получены из Национального центра лабораторных животных (Тайбэй, Тайвань). Исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Мемориальной больницы Чанг Гун (номер разрешения: 2011093005).Все операции проводились под анестезией кетамином и ксилазином, и были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания. Экспериментальная группа животных и процедуры, использованные в этом исследовании, приведены в таблице 2.

Протокол вентилятора

Мы использовали нашу установленную мышиную модель VILI, как описано ранее [5]. Вкратце, трахеостомия была выполнена под общей анестезией с внутрибрюшинным введением кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг), затем кетамина (0,1 мг / г / ч) и ксилазина (0.01 мг / г / ч) со скоростью 0,09 мл / 10 г / ч путем непрерывной внутрибрюшинной инфузии самцам мышей C57BL / 6. Мышей помещали в положение лежа на спине на обогревающее одеяло, а затем прикрепляли к аппарату искусственной вентиляции легких Гарвардского университета, модель 55-7058 (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс), который был запрограммирован на введение 30 мл / кг с частотой 65 вдохов за одно дыхание. мин, в течение 1–4 ч при дыхании окружающим воздухом с нулевым давлением в конце выдоха. Дыхательный объем, выдаваемый аппаратом ИВЛ, подтверждался вытеснением жидкости из перевернутого калибровочного цилиндра.Был проведен непрерывный мониторинг CO 2 в конце выдоха с помощью микрокапнографа (Columbus Instruments, Columbus, OH), и была выбрана частота дыхания 135 вдохов в минуту для 6 мл / кг и 65 вдохов в минуту для 30 мл / кг. с CO в конце выдоха 2 при 30-40 мм рт. Пиковое давление на вдохе в дыхательных путях измеряли с помощью усилителя датчика давления (Gould Instrument Systems, Valley View, OH), подключенного к трубке на проксимальном конце трахеостомы. Среднее артериальное давление контролировалось каждый час во время искусственной вентиляции легких с использованием того же усилителя датчика давления, подключенного к 0.Полиэтиленовый катетер диаметром 61 мм (внутренний диаметр 0,28 мм), оканчивающийся в общей сонной артерии. Один час механической вентиляции использовали для ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга, а 4 часа использовали для продукции MIP-2, подсчета клеток, воды в легких, синего красителя Эванса, миелопероксидазы, свободных радикалов, электронной микроскопии и гистопатологического окрашивания. на основании предыдущих исследований [5], [10]. Контрольных мышей без вентиляции подвергали анестезии и немедленно умерщвляли. В конце периода исследования гепаринизированную кровь отбирали из артериальной линии для анализа газов артериальной крови, а затем мышей умерщвляли.

Эмбриональные фибробласты мыши (MEF), ИПСК и кондиционированная среда

ИПСК мыши были получены из неперепрограммированных MEF, полученных от мышей C57BL / 6. ИПСК перепрограммировали трансдукцией ретровирусных векторов, кодирующих четыре фактора транскрипции, Oct-4, Sox2 и Klf4, как описано ранее [25], [27]. MEF (5 × 10 7 клеток / кг, суспендированных в фосфатно-солевом буфере (PBS)), ИПСК (5 × 10 7 клеток / кг, суспендированных в PBS), кондиционированная среда (200 мкл) от ИПСК, или PBS (200 мкл) вводили через хвостовую вену за 1 час до механического растяжения, основываясь на наших настоящих и предыдущих исследованиях зависимости реакции от дозы, которые показали, что 5 × 10 7 клеток / кг ИПСК и 200 мкл ИПСК-КМ улучшили повреждение легких и улучшился приток нейтрофилов ([25] и рисунок S3).Для тепловой инактивации кондиционированные среды обрабатывали при 95 ° C в течение 15 мин [54]. Подробности приведены в файле вспомогательной информации Text S1.

Короткое введение интерферирующей РНК

Однократная доза 6 мкг / г направленной siRNA NKRF Stealth или не направленной siRNA Stealth (скремблированная siRNA, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в липофектамин RNAiMAX вводилась интратрахеально за 48 ч до искусственной вентиляции легких. Дозировка была выбрана на основе наших исследований зависимости реакции от дозы, которые показали, что 6 мкг / г ингибируют активность NKRF.

Фармакологический ингибитор

Ингибитор NF-κB (SN-50, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) 2 мкг / г в PBS вводили внутрибрюшинно за 30 мин до вентиляции на основании наших исследований зависимости реакции от дозы, которые показали, что 2 мкг / г ингибируют активность NF-κB [10 ].

Измерение малонового диальдегида

Легкие гомогенизировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем бутилированный гидрокситолуол. MDA в белковых экстрактах измеряли с использованием набора для анализа Oxiselect TBARS (Cell Biolabs, Сан-Диего, Калифорния), содержащего вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой.Каждый образец анализировали в двух экземплярах и выражали в мкмоль / г белка в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуноблот-анализ

Легкие гомогенизировали в 3 мл лизирующего буфера (20 мМ HEPES pH 7,4, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 2 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N '-Тетрауксусной кислоты, 50 мкМ β-глицерофосфата, 1 мМ ортованадата натрия, 1 мМ дитиотреитола, 400 мкМ апротинина и 400 мкМ фенилметилсульфонилфторида), переносили в пробирки эппендорфа и помещали на лед на 15 мин.Пробирки центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C и супернатант мгновенно замораживали. Неочищенные клеточные лизаты подбирали по концентрации белка, разделяли на 10% бис-акриламидном геле и электропереносили на мембраны Immobilon-P (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс). Для анализа фосфорилирования NF-κB и общей экспрессии белков NF-κB и NKRF проводили вестерн-блоттинг с антителами к фосфо-NF-κB, NF-κB и NKRF (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния). Блоты проявляли с помощью усиленной хемилюминесценции (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Для выделения общей РНК ткани легких гомогенизировали в реагентах TRIzol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (PerkinElmer, Life Sciences, Inc., Бостон, Массачусетс), как описано ранее [3]. Для ПЦР использовали следующие праймеры: NKRF, прямой праймер 5′-GTTCTGCCAAACACTGGACC-3 ′ и обратный праймер 5′-CTGAGATAGGCTCCCGTATGCCC-3 ′ и GAPDH в качестве внутреннего контроля, прямой праймер 5′-AATGCATCCTGCA CCACCAA-3 ′ и обратный праймер 5′-AATGCATCCTGCA CCACCAA-3 ′ и обратный праймер -GTAGCCATATTCATTGTCATA-3 '(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) [14].

Иммуногистохимия

Легкие залили парафином, нарезали срезы толщиной 4 мкм, депарафинизировали, антиген демаскировали в 10 мМ цитрате натрия (pH 6,0), инкубировали с первичным антителом козьего NKRF или кроличьего фосфо-NF-κB (1 × 100; Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус. , CA) и биотинилированное вторичное антитело козы против кролика (1 × 100) в соответствии с инструкциями производителя для иммуногистохимического набора (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Анализ микрочипов и биоинформатика

Суммарную РНК

экстрагировали из клеток с использованием реагента Trizol (Life Technologies, Bethesda, MD, USA) и колонки Qiagen RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) для очистки.Тотальную РНК подвергали обратной транскрипции с помощью Superscript II РНКаза H-обратная транскриптаза (Gibco BRL) для создания меченных Cy3 и Cy5 (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA) зондов кДНК для контрольного и обработанного образцов соответственно. Меченые пробы гибридизовали с микрочипом кДНК, содержащим 10000 фрагментов кДНК, иммобилизованных клонами гена. Интенсивность флуоресценции мишеней Cy3 и Cy5 измеряли и сканировали отдельно с использованием сканера массива GenePix 4000B (Axon Instruments, Burlingame, CA, USA).Анализ данных выполняли с использованием программ GenePix Pro 3.0.5.56 (Axon Instruments, США) и GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent, Пало-Альто, Калифорния, США). Среднее расстояние сцепления использовалось для оценки сходства между двумя группами профилей экспрессии генов, как описано ниже. Разница в расстоянии между двумя группами выборочных профилей экспрессии до третьей оценивалась путем сравнения соответствующих средних расстояний сцепления (среднего значения всех парных связей между членами двух рассматриваемых групп).Ошибка такого сравнения была оценена путем объединения стандартных ошибок (стандартное отклонение парных связей, деленное на квадратный корень из числа связей) задействованных средних расстояний связи. Классическое многомерное масштабирование (MDS) было выполнено с использованием стандартной функции программы R, чтобы обеспечить визуальное представление о том, как связаны различные группы выборок.

Гистопатологическая классификация VILI

Ткани легких контрольных мышей без вентиляции и мышей, подвергшихся вентиляции с высоким дыхательным объемом в течение 4 ч при дыхании комнатным воздухом, были удалены en bloc и заполнены 10% нейтральным забуференным формалином (pH 6.С 8 по 7.2) при давлении H 30 см H 2 O через полиэтиленовую трубку, введенную в трахею. Легкие залили парафином, сделали срезы толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и просматривали из 10 неперекрывающихся полей одним исследователем, не знающим терапевтическую категорию мышей. Повреждение легкого оценивалось с использованием среднего балла по следующим параметрам: альвеолярный застой, кровотечение, инфильтрация нейтрофилов в воздушное пространство или стенку сосуда и толщина альвеолярной стенки [3].Оценка 0 соответствует нормальным легким; 1, легкая, поражение легких <25%; 2, умеренное поражение легких от 25% до 50%; 3 - тяжелое поражение легких от 50% до 75%; и 4 - очень серьезное поражение легких> 75%.

Просвечивающая электронная микроскопия

Легкие фиксировали 3% глутаровым альдегидом в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4) в течение 1 ч при 4 ° C. Затем легкие подвергали последующей фиксации в 1% тетроксиде осмия (pH 7,4), дегидратировали в этаноле с постепенным изменением дозы и заключали в EPON-812. Тонкие срезы (70 нм) вырезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе Hitachi H-7500 EM (Hitachi, Ltd., Токио, Япония).

Статистическая оценка

Вестерн-блоты и мРНК NKRF были количественно определены с использованием анализатора изображений Национального института здравоохранения (NIH), ImageJ 1.27z (Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) и представлены в виде произвольных единиц. Значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение по крайней мере для пяти экспериментов. Данные анализа синего красителя Эванса, соотношения влажной и сухой массы легких, MIP-2, MPO, иммуногистохимического анализа и MDA были получены с использованием Statview 5.0 (Abascus Concepts Inc.Кэри, Северная Каролина, США; SAS Institute, Inc.). Все результаты вестерн-блоттинга и мРНК NKRF были нормализованы для контрольных мышей без вентиляции с комнатным воздухом. ANOVA использовался для оценки статистической значимости различий с последующим множественным сравнением с тестом Шеффе, и значение P <0,05 считалось статистически значимым. Коэффициенты регрессии рассчитывались с помощью простого регрессионного теста в Statview.

Анализ воды в легких, подсчет клеток, анализ EBD, анализ MPO и измерения MIP-2 были выполнены, как описано ранее [3], [5].

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Вентиляция с высоким дыхательным объемом увеличила количество ИПСК, попадающих в легкие. Репрезентативные микрофотографии (× 400) с иммунофлуоресцентным окрашиванием по Hoechst (синий) замороженных срезов легких были получены от (A) контрольных мышей без вентиляции и (B) мышей, подвергнутых ИВЛ при V T 30 мл / кг в течение 4 часов с комнатным воздухом . (C) Рассеянная плотность встроенных ИПСК в легких была определена количественно как среднее количество ИПСК, меченных Hoechst, в 10 неперекрывающихся полях срезов легких.Положительное окрашивание эпителия легкого и интерстиция синим цветом указано стрелками. Положительное окрашивание Hoechst в срезах легких мышей увеличивалось после механической вентиляции при V T 30 мл / кг в течение 4 часов по сравнению с контрольными мышами, не подвергавшимися вентиляции. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, обработанным PBS. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм. ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; PBS = физиологический раствор с фосфатным буфером.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s001

(TIF)

Рисунок S2.

LPS-индуцированный ALI у мышей, получавших iPSC / iPSC-CM и MEF / MEF-CM. Мы использовали интратрахеальную инъекцию ЛПС мышам C57BL / 6, чтобы вызвать острое повреждение легких. Чтобы исследовать лечебный эффект ИПСК и кондиционированной среды, полученной из ИПСК, мы далее вводили ИПСК, MEF, iPSC-CM и MEF-CM мышам с LPS-индуцированным ALI через хвостовую вену. Наши результаты показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ значительно улучшили повреждение легких при ЛПС-индуцированном ALI у мышей по сравнению с таковыми у мышей, получавших MEF или MEF-CM.Важно отметить, что результаты анализа микрочипов показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ могут модулировать сходную экспрессию кластера генов в поражениях легких у мышей с ALI, индуцированных LPS, предполагая, что существует общий признак биомолекулярных сигнатур в ответ на LPS-индуцированные повреждение легких между ИПСК и кондиционированной средой ИПСК. ALI = острое повреждение легких; ИПСК-КМ = кондиционированная среда ИПСК; ЛПС = липополисахарид; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; MEF-CM: кондиционированная среда MEF.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s002

(TIF)

Рисунок S3.

ИПСК или ИПСК-КМ дозозависимо ослабляли повреждение легких, вызванное высоким дыхательным объемом, и инфильтрацию нейтрофилов. Влияние введения ИПСК или ИПСК-КМ на (A) количественную оценку структурного повреждения дыхательных путей и (B) инфильтрацию нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у мышей дикого типа, получающих искусственную вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом (V T 30) показаны.Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с V T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших PBS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s003

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Вэй-Хань Линя и лабораторию микроскопа, Мемориальную больницу Чанг Гун, Линкоу, за их помощь в эксперименте.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: L-FL Y-YL S-HC. Проведены эксперименты: L-FL Y-YL K-HL.Проанализированы данные: L-FL Y-YL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: C-TY K-CK C-CH. Написал статью: L-FL Y-YL S-HC.

Ссылки

  1. 1. Ricard JD, Dreyfuss D, Saumon G (2003) Повреждение легких, вызванное вентилятором. Eur Respir J 22: 2с – 9с.
  2. 2. Тремблай Л.Н., Слуцкий А.С. (2006) Вентиляторное повреждение легких: от скамьи к постели. Intensive Care Med 32: 24–33.
  3. 3. Ли Л.Ф., Хуанг С.К., Линь Х.С., Цай Ю.Х., Куинн Д.А. и др.(2009) Нефракционированный гепарин и эноксапарин уменьшают повреждение легких, вызванное высокой вытяжной вентиляцией, - предполагаемый контролируемый эксперимент на животных. Crit Care 13: R108.
  4. 4. Ли Л.Ф., Оуян Б., Чукроун Дж., Матял Р., Маскаренхас М. и др. (2003) IL-8, индуцированный растяжением, зависит от c-Jun Nh3-концевых и ядерных факторов, индуцирующих kappaB-киназы. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285: L464–475.
  5. 5. Li LF, Yu L, Quinn DA (2004) Инфильтрация нейтрофилов, вызванная вентиляцией, зависит от N-концевой киназы c-Jun.Am J Respir Crit Care Med 169: 518–524.
  6. 6. Abraham E (2000) Активация NF-каппа B. Crit Care Med 28: N100–104.
  7. 7. Zingarelli B, Sheehan M, Wong HR (2003) Ядерный фактор-каппа B как терапевтическая цель в медицине интенсивной терапии. Crit Care Med 31: S105–111.
  8. 8. Райт Дж. Г., Кристман Дж. В. (2003) Роль ядерного фактора каппа B в патогенезе легочных заболеваний: значение для терапии. Am J Respir Med 2: 211–219.
  9. 9.Мойн П., Макинтайр Р., Шварц М.Д., Канеко Д., Шенкар Р. и др. (2000) Механизмы регуляции NF-каппа B в альвеолярных макрофагах у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом. Шок 13: 85–91.
  10. 10. Лю YY, Liao SK, Huang CC, Tsai YH, Quinn DA и др. (2009) Роль ядерного фактора-каппа B в увеличенном повреждении легких из-за взаимодействия между гипероксией и вентиляцией с высоким растяжением. Перевод Рез. 154: 228–240.
  11. 11. Ning Q, Wang X (2007) Роль Rel A и IkappaB ядерного фактора kappaB в высвобождении интерлейкина-8 циклической механической деформацией в эпителиальных клетках альвеолярного типа II человека A549.Респирология 12: 792–798.
  12. 12. Улиг У., Хайцма Дж. Дж., Гольдманн Т., Поэльма Д.Л., Лахманн Б. и др. (2002) Вентиляция-индуцированная активация пути митоген-активируемой протеинкиназы. Eur Respir J 20: 946–956.
  13. 13. Held HD, Boettcher S, Hamann L, Uhlig S (2001) Вызванное вентиляцией высвобождение хемокинов и цитокинов связано с активацией ядерного фактора-каппа B и блокируется стероидами. Am J Respir Crit Care Med 163: 711–716.
  14. 14.Froese N, Schwarzer M, Niedick I., Frischmann U, Köster M, et al. (2006) Врожденные иммунные ответы у мышей с дефицитом фактора NF-каппа B. Mol Cell Biol 26: 293–302.
  15. 15. Nourbakhsh M, Hauser H (1999) Конститутивное молчание промотора IFN-бета опосредуется NRF (фактор репрессии NF-каппа B), ядерным ингибитором NF-kappaB. EMBO J 18: 6415–6425.
  16. 16. Feng X, Guo Z, Nourbakhsh M, Hauser H, Ganster R, et al. (2002) Идентификация элемента отрицательного ответа в промоторе индуцибельной синтазы оксида азота (hiNOS) человека: роль репрессирующего фактора NF-каппа B (NRF) в базальной репрессии гена hiNOS.Proc Natl Acad Sci USA 99: 14212–14217.
  17. 17. Реболл М.Р., Шведа А.Т., Бартельс М., Франке Р., Франк Р. и др. (2011) Картирование NRF-связывающих мотивов субъединицы p65 NF-каппа B. J Biochem 150: 553–562.
  18. 18. Нурбахш М., Калбл С., Дорри А., Хаузер Х., Реш К. и др. (2001) Фактор репрессии NF-каппа B вовлечен в базальную репрессию и индуцированную интерлейкином (IL) -1 активацию транскрипции IL-8 путем связывания с консервативным элементом B-фланкирующей последовательности NF-каппа.J Biol Chem 276: 4501–4508.
  19. 19. Hoffmann E, Dittrich-Breiholz ​​O, Holtmann H, Kracht M (2002) Множественный контроль экспрессии гена интерлейкина-8. J Leukoc Biol 72: 847–855.
  20. 20. Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H и др. (2008) Перепрограммирование соматических клеток человека до плюрипотентности с помощью определенных факторов. Природа 451: 141–146.
  21. 21. Такахаши К., Танабе К., Охнуки М., Нарита М., Ичисака Т. и др. (2007) Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами.Ячейка 131: 861–872.
  22. 22. Ю. Дж., Водяник М. А., Смуга-Отто К., Антосевич-Бурже Дж., Френ Дж. Л. и др. (2007) Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека. Наука 318: 1917–1920.
  23. 23. Такахаши К., Яманака С. (2006) Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Ячейка 126: 663–676.
  24. 24. Chen SJ, Chang CM, Tsai SK, Chang YL, Huang SS и др. (2010) Функциональное улучшение очаговой церебральной ишемии путем субдуральной трансплантации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с фибриновым клеем.Стволовые клетки Dev 19: 1757–1767.
  25. 25. Ян К.Ю., Ши Х.С., Хау СК, Чен С.Ю., Хсу Х.С. и др. (2011) Внутривенная доставка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ослабляет вызванное эндотоксином острое повреждение легких у мышей. Сундук 140: 1243–1253.
  26. 26. Керли Г.Ф., Хейс М., Ансари Б., Шоу Г., Райан А. и др. (2012) Мезенхимальные стволовые клетки улучшают восстановление и восстановление после повреждения легких у крыс, вызванного вентилятором. Грудь 67: 496–501.
  27. 27. Ли Х.Й., Чиен Ю., Чен Ю.Дж., Чен С.Ф., Чанг Ю.Л. и др.(2011) Репрограммирование индуцировало плюрипотентные стволовые клетки в отсутствие c-Myc для дифференцировки в гепатоцитоподобные клетки. Биоматериалы 32: 5994–6005.
  28. 28. Фуа Дж., Бадиа Дж. Р., Адхикари Н. К., Фридрих Дж. О., Фаулер Р. А. и др. (2009) Снизилась ли смертность от острого респираторного дистресс-синдрома со временем ?: Систематический обзор. Am J Respir Crit Care Med 179: 220–227.
  29. 29. Цудзи О, Миура К., Окада Ю., Фудзиёси К., Мукаино М. и др. (2010) Терапевтический потенциал правильно оцененных безопасных плюрипотентных стволовых клеток при повреждении спинного мозга.Proc Natl Acad Sci USA 107: 12704–12709.
  30. 30. Мики К., Уэнака Х., Сайто А., Миягава С., Сакагути Т. и др. (2012) Биоинженерный миокард, полученный из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, улучшает сердечную функцию и ослабляет сердечное ремоделирование после хронического инфаркта миокарда у крыс. Стволовые клетки Transl Med 1: 430–437.
  31. 31. Abreu SC, Antunes MA, Pelosi P, Morales MM, Rocco PRM (2011) Механизмы клеточной терапии при респираторных заболеваниях. Intensive Care Med 37: 1421–1431.
  32. 32. Mou H, Zhao R, Sherwood R, Ahfeldt T., Lapey A, et al. (2012) Получение мультипотентных предшественников легких и дыхательных путей из мышиных ESC и индивидуальных ИПСК кистозного фиброза. Стволовая клетка клетки 10: 385–397.
  33. 33. Кадзик Р.С., Морриси Е.Е. (2012) Направление дифференцировки энтодермы легких в плюрипотентных стволовых клетках. Стволовая клетка клетки 10: 355–361.
  34. 34. Араужо И.М., Абреу С.К., Марон-Гутьеррес Т., Круз Ф., Фуджисаки Л. и др. (2010) Терапия мононуклеарными клетками костного мозга при экспериментальном легочном и внелегочном остром поражении легких.Crit Care Med 38: 1733–1741.
  35. 35. Рохас М., Сюй Дж., Вудс С.Р., Мора А.Л., Спирс В. и др. (2005) Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга при восстановлении поврежденного легкого. Am J Respir Cell Mol Biol 33: 145–152.
  36. 36. Гупта Н., Су X, Попов Б., Ли Дж. У., Сериков В. и др. (2007) Внутрилегочная доставка мезенхимальных стволовых клеток костного мозга улучшает выживаемость и ослабляет вызванное эндотоксином острое повреждение легких у мышей. J Immunol 179: 1855–1863.
  37. 37.Lee JW, Fang X, Gupta N, Serikov V, Matthay MA (2009) Аллогенные мезенхимальные стволовые клетки человека для лечения острого повреждения легких, вызванного эндотоксином E. coli, в перфузируемом ex vivo легком человека. Proc Natl Acad Sci USA 106: 16357–16362.
  38. 38. Abraham E (2003) Нейтрофилы и острое повреждение легких. Crit Care Med 31: S195–199.
  39. 39. Park HS, Kim SR, Lee YC (2009) Влияние окислительного стресса на заболевания легких. Респирология 14: 27–38.
  40. 40.Сыркина О., Джафари Б., Хейлс К.А., Куинн Д.А. (2008) Окислительный стресс опосредует воспаление и апоптоз при повреждении легких, вызванном вентилятором. Респирология 13: 333–340.
  41. 41. Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, Kim JY, Abraham E (2004) Участие активных форм кислорода в Toll-подобном рецепторе 4-зависимой активации NF-каппа B. J Immunol 172: 2522–2529.
  42. 42. Ян Х, Вэнь И, Бин Дж, Хоу-Ю И, Ю-Тонг В. (2011) Защита мезенхимальных стволовых клеток костного мозга от острого повреждения легких, вызванного отравлением паракватом.Clin Toxicol 49: 298–302.
  43. 43. Яги Х., Сото-Гутьеррес А., Наварро-Альварес Н., Нахмиас Й., Голдвассер Й. и др. (2010) Реактивные стромальные клетки костного мозга ослабляют системное воспаление с помощью sTNFR1. Мол Тер 18: 1857–1864.
  44. 44. Schmitz ML, Bacher S, Kracht M (2001) I kappa B-независимый контроль активности NF-kappa B посредством модулирующего фосфорилирования. Тенденции Biochem Sci 26: 186–190.
  45. 45. Хо С.К., Ли К.Й., Чан Ю.Ф., Куо Л.В., Ито К. и др.(2009) Нейтрофильная эластаза подавляет синтез IL-8 / CXCL8 в клетках гладких мышц дыхательных путей человека посредством индукции фактора репрессии NF-каппа B. J Immunol 183: 411–420.
  46. 46. Ли KY, Ho SC, Chan YF, Wang CH, Huang CD и др. (2012) Снижение репрессирующего фактора ядерного фактора-κB: связь с системным воспалением при ХОБЛ. Eur Respir J 40: 863–873.
  47. 47. Nussbaum J, Minami E, Laflamme MA, Virag JA, Ware CB и др. (2007) Трансплантация недифференцированных эмбриональных стволовых клеток мыши в сердце: формирование тератомы и иммунный ответ.FASEB J 21: 1345–1357.
  48. 48. Matthay MA, Thompson BT, Read EJ, McKenna DH, Liu KD, et al. (2010) Терапевтический потенциал мезенхимальных стволовых клеток при тяжелом остром повреждении легких. Сундук 138: 965–972.
  49. 49. Lee JW, Gupta N, Serikov V, Matthay MA (2009) Возможное применение мезенхимальных клеток при остром повреждении легких. Мнение эксперта Biol Ther 9: 1259–1270.
  50. 50. Aggarwal S, Pittenger MF (2005) Мезенхимальные стволовые клетки человека модулируют ответы аллогенных иммунных клеток.Кровь 105: 1815–1822.
  51. 51. Stagg J (2007) Иммунная регуляция мезенхимальными стволовыми клетками: две стороны медали. Тканевые антигены 69: 1–9.
  52. 52. Hegeman MA, Hennus MP, van Meurs M, Cobelens PM, Kavelaars A, et al. (2010) Лечение ангиопоэтином-1 уменьшает воспаление, но не предотвращает повреждение легких, вызванное вентилятором. PLoS ONE 5: e15653.
  53. 53. Маттай М.А., Циммерман Г.А., Эсмон Ч., Бхаттачарья Дж., Коллер Б. и др. (2003) Будущие направления исследований в области острого повреждения легких: резюме рабочей группы Национального института сердца, легких и крови.Am J Respir Crit Care Med 167: 1027–1035.
  54. 54. Отте JM, Mahjurian-Namari R, Brand S, Werner I., Schmidt WE, et al. (2009) Пробиотики регулируют экспрессию ЦОГ-2 в эпителиальных клетках кишечника. Nutr Cancer 61: 103–113.
Ответы

NK-клеток смещены в сторону CD16-опосредованных эффекторных функций при хронической вирусной инфекции гепатита B

Основные моменты

Частая коинфекция HBV / HCMV связана с размножением подобных памяти NK-клеток.

Память-подобные NK-клетки в значительной степени консервативны при хронической вирусной инфекции гепатита В.

NK-клетки, подобные памяти, определяют ответ NK-клеток у пациентов с хроническим гепатитом B.

Адаптивный антителозависимый ответ NK-клеток увеличивается при хронической инфекции вируса гепатита B.

Предпосылки и цели

Фенотипические и функциональные изменения естественных киллеров (NK) -клеток хорошо описаны при хронической инфекции вируса гепатита B (cHBV).Однако в значительной степени неизвестно, являются ли эти изменения результатом общих эффектов на общую популяцию NK-клеток или появления отдельных подмножеств NK-клеток. Цитомегаловирус человека (HCMV) часто встречается при cHBV и связан с появлением NK-клеток, подобных памяти. Мы стремились оценить влияние этих клеток на инфицирование вирусом гепатита B.

Методы

Чтобы оценить влияние подобных памяти NK-клеток на фенотипические и функциональные изменения при инфекции cHBV, мы провели углубленный анализ циркулирующих NK-клеток у 52 пациентов с cHBV, 45 с хронической инфекцией вируса гепатита C и 50 здоровых доноры в отношении их серологического статуса по HCMV.

Результаты

У пациентов с cHBV / HCMV +, FcεRIγ-подобные памяти NK-клетки присутствовали с большей частотой и с большей распространенностью, чем у здоровых доноров с HCMV +. Это выраженное HCMV-ассоциированное увеличение NK-клеток, подобное памяти, может быть идентифицировано как ключевой детерминант ответа NK-клеток при заражении cHBV. Кроме того, мы наблюдали, что подобные памяти NK-клетки состоят из эпигенетически различных подмножеств и демонстрируют ключевые метаболические характеристики долгоживущих клеток. Несмотря на продолжающуюся хроническую инфекцию, фенотип подобных памяти NK-клеток сохранялся у пациентов с cHBV / HCMV +.Функциональные характеристики подобных памяти NK-клеток также в значительной степени не пострадали от инфекции cHBV, за исключением повышенной способности к дегрануляции в ответ на стимуляцию CD16, которая, однако, обнаруживалась как в подобных памяти, так и в обычных NK-клетках.

Выводы

Появление связанных с HCMV NK-клеток, подобных памяти, формирует общий ответ NK-клеток при инфекции cHBV и способствует общему сдвигу в сторону CD16-опосредованных эффекторных функций. Следовательно, коинфекцию HCMV необходимо учитывать при разработке иммунотерапевтических подходов, нацеленных на NK-клетки при cHBV.

Непрофессиональное резюме

При хронической инфекции вируса гепатита В изменяются фенотип и функция естественных киллеров (NK) -клеток. В этом исследовании мы демонстрируем, что эти изменения связаны с появлением отдельного подмножества NK-клеток, а именно, подобных памяти NK-клеток. Появление этих подобных памяти NK-клеток связано с коинфекцией цитомегаловируса человека, который поражает большинство пациентов с хроническим гепатитом B.

Ключевые слова

NK-клетки

Хроническая вирусная инфекция гепатита B

Цитомегаловирус человека

CD16

Подобный памяти

Adaptive

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2018 European Association for the Study of the Liver.Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Персистенция децидуальных NK-клеток и генотипов KIR у здоровых беременных и преэкламптических женщин: исследование случай-контроль в третьем триместре гестации | Репродуктивная биология и эндокринология

  • 1.

    Pijnenborg R, Vercruysse L, Hanssens M: Спиральные артерии матки при беременности человека: факты и противоречия. Плацента. 2006, 27: 939-958. 10.1016 / j.placenta.2005.12.006.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 2.

    Балмер Дж. Н., Моррисон Л., Лонгфелло М., Ритсон А., Пейс D: Гранулированные лимфоциты в эндометрии человека: гистохимические и иммуногистохимические исследования. Репродукция человека. 1991, 6: 791-798.

    CAS Google Scholar

  • 3.

    Кинг А., Локи Ю.В.: О природе и функции гранулярных лимфоцитов матки человека. Иммунол сегодня. 1991, 12: 432-435. 10.1016 / 0167-5699 (91) -К.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 4.

    Моффет-Кинг A: Естественные клетки-киллеры и беременность. Nat Rev Immunol. 2002, 2: 656-663. 10.1038 / nri886.

    Артикул Google Scholar

  • 5.

    Abadía-Molina AC, Ruiz C, Montes MJ, King A, Loke YW, Olivares EG: Иммунный фенотип и цитотоксическая активность лимфоцитов децидуальной оболочки человека против трофобласта. J Reprod Immunol. 1996, 31: 109-123.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 6.

    Abadía-Molina AC, Ruiz C, King A, Loke YW, Olivares EG: Лимфоциты децидуальной оболочки терминального термина человека уменьшают адгезию клеток к пластиковому субстрату. Hum Reprod. 1997, 12: 2393-2398.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 7.

    Sindram-Trujillo AP, Scherjon SA, van Hulst-van Miert PP, Kanhai HH, Roelen DL, Claas F: Сравнение децидуальных лейкоцитов после спонтанных вагинальных родов и планового кесарева сечения при неосложненной доношенной беременности у человека.J Reprod Immunol. 2004, 62: 125-137. 10.1016 / j.jri.2003.11.007.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 8.

    Poehlmann TG, Schaumann A, Busch S, Fitzgerald JS, Aguerre-Girr M, Le-Bouteiller P, Schleussner E, Markert UR: Ингибирование цитотоксичности терминальных децидуальных NK-клеток с помощью растворимого HLA-G1. Am J Reprod Immunol. 2006, 56: 275-285. 10.1111 / j.1600-0897.2006.00420.x.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 9.

    Williams PJ, Searle RF, Robson SC, Innes BA, Bulmer JN: Популяции децидуальных лейкоцитов на ранних и поздних сроках нормальной беременности у человека. J Reprod Immunol. 2009, 82: 24-31. 10.1016 / j.jri.2009.08.001.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 10.

    Koopman LA, Kopcow HD, Rybalov B, Boyson JE, Orange JS, Schatz F, Masch R, Lockwood CJ, Schachter AD, Park PJ, Strominger JL: Децидуальные естественные клетки-киллеры человека представляют собой уникальное подмножество NK-клеток. с иммуномодулирующим потенциалом.J Exp Med. 2003, 198: 1202-1212. 10.1084 / jem.20030305.

    Артикул Google Scholar

  • 11.

    Ханна Дж., Гольдман-Воль Д., Хамани И., Авраам И., Гринфилд С., Натансон-Ярон С., Прус Д., Коэн-Даниэль Л., Арнон Т. И., Манастер I, Газит Р., Юйкин В., Бенхарроч Д. , Porgador A, Keshet E, Yagel S, Mandelboim O: Децидуальные NK-клетки регулируют ключевые процессы развития на стыке плода и матери человека. Nat Med. 2006, 12: 1065-1074. 10,1038 / нм 1452.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 12.

    Ди Санто JP: Функционально различные подмножества NK-клеток: происхождение развития и биологические последствия. Eur J Immunol. 2008, 38: 2948-2951. 10.1002 / eji.200838830.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 13.

    Mselle TF, Meadows SK, Eriksson M, Smith JM, Shen L, Wira CR, Sentman CL: Уникальные характеристики NK-клеток во всем женском репродуктивном тракте человека.Clin Immunol. 2007, 124: 69-76. 10.1016 / j.clim.2007.04.008.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 14.

    Манастер I, Мандельбойм O: Уникальные свойства человеческих NK-клеток в слизистой оболочке матки. Плацента. 2008, 29 (Приложение A): 60-66. 10.1016 / j.placenta.2007.10.006.

    Артикул Google Scholar

  • 15.

    Smith SD, Dunk CE, Aplin JD, Harris LK, Jones RL: Доказательства участия иммунных клеток в ремоделировании децидуальной спиральной артериолы на ранних сроках беременности человека.Am J Pathol. 2009, 174: 1959–1971. 10.2353 / ajpath.2009.080995.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 16.

    Stallmach T, Hebisch G, Orban P, Lü X: Аберрантное расположение трофобластов и лимфоцитов на фето-материнском интерфейсе с преэклампсией. Арка Вирхова. 1999, 434: 207-211. 10.1007 / s004280050329.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 17.

    Wilczyński JR, Tchórzewski H, Banasik M, Głowacka E, Wieczorek A, Lewkowicz P, Malinowski A, Szpakowski M, Wilczyński J: Распределение подмножеств лимфоцитов и секреция цитокинов в нормальном и децидуацидном триместре беременности. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2003, 109: 8-15.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 18.

    Eide IP, Rolfseng T, Isaksen CV, Mecsei R, Roald B, Lydersen S, Salvesen KA, Harsem NK, Austgulen R: Серьезное ограничение роста плода связано с уменьшением доли естественных клеток-киллеров в decidua basalis.Арка Вирхова. 2006, 448: 269-276. 10.1007 / s00428-005-0107-z.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 19.

    Rieger L, Segerer S, Bernar T., Kapp M, Majic M, Morr AK, Dietl J, Kämmerer U. Конкретные подмножества иммунных клеток децидуальной оболочки человека различаются при нормальной беременности и преэклампсии - проспективное обсервационное исследование. Репрод Биол Эндокринол. 2009, 23: 132-142. 10.1186 / 1477-7827-7-132.

    Артикул Google Scholar

  • 20.

    Williams PJ, Bulmer JN, Searle RF, Innes BA, Robson SC: Измененные популяции децидуальных лейкоцитов в плацентарном ложе при преэклампсии и ограничении роста плода: сравнение с поздней нормальной беременностью. Репродукция. 2009, 138: 177-184. 10.1530 / REP-09-0007.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 21.

    Хонг Т.Ю. Иммуногистологическое исследование лейкоцитарного инфильтрата в тканях матки матери при нормальных и преэкламптических беременностях в срок.Am J Reprod Immunol Microbiol. 1987, 15: 1-8.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 22.

    Trowsdale J, Barten R, Haude A, Stewart AC, Beck S, Wilson M: Геномный контекст расширенных семейств генов рецепторов Natural Killer. Immunol Rev.2001, 181: 20-38. 10.1034 / j.1600-065X.2001.1810102.x.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 23.

    Баширова А., Мартин П., Мак-Викар В., Кэррингтон М.: Кластер генов-киллеров иммуноглобулиноподобных рецепторов: настройка генома для защиты.Анну Рев Геномикс Хум Генет. 2006, 7: 277-300. 10.1146 / annurev.genom.7.080505.115726.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 24.

    Каррингтон М., Мартин М. П.: Влияние вариаций в кластере генов KIR на болезни человека. Curr Top Microbiol Immunol. 2006, 298: 225-257. полный текст.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 25.

    Hiby SE, Walker JJ, O'shaughnessy KM, Redman CW, Carrington M, Trowsdale J, Moffet A: Комбинации материнского KIR и генов HLA-C плода влияют на риск преэклампсии и репродуктивного успеха.J Exp Med. 2004, 200: 957-965. 10.1084 / jem.20041214.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 26.

    Комитет ACOG по практическим бюллетеням - акушерство: Практический бюллетень ACOG. Диагностика и лечение преэклампсии и эклампсии. Номер 33, январь 2002 г. Obstet Gynecol. 2002, 99: 159-167. 10.1016 / S0029-7844 (01) 01747-1.

    Артикул Google Scholar

  • 27.

    Tuffnell DJ, Shennan AH, Waugh JJ, Walker JJ: Ведение тяжелой преэклампсии / эклампсии. Руководство RCOG. 2006 г., Принцип 10 (A): 1-11.

    Google Scholar

  • 28.

    Romero-Arauz JF: Epidemiología, clasificación y factores de riesgo en preclampsia. Преэклампсия. Enfermedades hipertensivas del embarazo. 2009, Мексика: McGrawHill, 1-15.

    Google Scholar

  • 29.

    Arcuri F, Cintorino M, Carducci A, Papa S, Riparbelli MG, Mangioni S, Di Blasio AM, Tosi P, Viganò P: децидуальные естественные клетки-киллеры человека как источник и мишень фактора ингибирования миграции макрофагов. Репродукция. 2006, 131: 175-182. 10.1530 / rep.1.00857.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 30.

    Кинг А., Берроуз Т., Верма С., Хиби С., Локе Ю.В.: Лимфоциты матки человека. Обновление Hum Reprod. 1998, 4: 480-485.10.1093 / humupd / 4.5.480.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 31.

    Redman CW, Sargent IL: Преэклампсия, плацента и системная воспалительная реакция матери - обзор. Плацента. 2003, 24 (Приложение A): 21-27. 10.1053 / plac.2002.0930.

    Артикул Google Scholar

  • 32.

    Borzychowski AM, Croy BA, Chan WL, Redman CW, Sargent IL: Изменения в системном иммунитете типа 1 и типа 2 при нормальной беременности и преэклампсии могут быть опосредованы естественными клетками-киллерами.Eur J Immunol. 2005, 35: 3054-3063. 10.1002 / eji.200425929.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 33.

    Haller H, Radillo O, Rukavina D, Tedesco F, Candussi G, Petrović O, Randić L: Иммуногистохимическое исследование лейкоцитов в эндометрии человека, базальной децидуальной оболочке первого и третьего триместра. J Reprod Immunol. 1993, 23: 41-49. 10.1016 / 0165-0378 (93)

    -Д.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 34.

    Vargas ML, Sántos JL, Ruiz C, Montes MJ, Alemán P, García-Tortosa C, García-Olivares E: Сравнение пропорций лейкоцитов в ранней и поздней децидуальной оболочке. Am J Reprod Immunol. 1993, 29: 135-140.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 35.

    Хирано Т., Хигучи Т., Уэда М., Иноуэ Т., Катаока Н., Маеда М., Фудзивара Н., Фуджи S: CD9 экспрессируется во вневорсинчатом трифобласте в ассоциации с интегрином альфа3 и интегрином альфа5.Мол Хум Репрод. 1999, 5: 162-167. 10,1093 / мольхр / 5.2.162.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 36.

    Tohami T, Drucker L, Radnay J, Shapira H, Lishner M: Экспрессия тетраспанинов в лейкоцитах периферической крови: сравнение нормальных и инфекционных состояний. Тканевые антигены. 2004, 64: 235-242. 10.1111 / j.1399-0039.2004.00271.x.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 37.

    Waterhouse R, Ha C., Devksler GS: CD9 мыши является рецептором специфичного для беременности гликопротеина 17. J Exp Med. 2002, 195: 277-282. 10.1084 / jem.20011741.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 38.

    Wilczyński JR, Tchórzewski H, Głowacka E, Banasik M, Lewkowicz P, Szpakowski M, Zeman K, Wilczyński J: Секреция цитокинов децидуальными лимфоцитами и преходящей гипертензией при беременности.Медиаторы Inflamm. 2002, 11: 105-111.

    PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

  • 39.

    Sasaki Y, Darmochwal-Kolarz D, Suzuki D, Sakai M, Ito M, Shima T, Shiozaki A, Rolinski J, Saito S: доля периферической крови и децидуальной крови CD4 (+) CD25 (светлый) регуляторный Т-клетки при преэклампсии. Clin Exp Immunol. 2007, 149: 139-145. 10.1111 / j.1365-2249.2007.03397.x.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 40.

    Gutiérrez-Rodríguez ME, Sandoval-Ramírez L, Díaz-Flores M, Marsh SG, Valladares-Salgado A, Madrigal JA, Mejía-Aranguere JM, García CA, Huerta-Zepeda A, Ibarra-Cortés Cam B, Ortega- Круз М.: Ген KIR в этнических популяциях и метисах из Мексики. Hum Immunol. 2006, 67: 85-93.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 41.

    Contreras G, Aláez C, Murguía A, García D, Flores H, Gorodezky C: Распределение иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров в мексиканских метисах.Тканевые антигены. 2007, 69 (Приложение 1): 125-129. 10.1111 / j.1399-0039.2006.76212.x.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 42.

    Флорес А.С., Маркос К.Ю., Паладино Н., Аррувито Л., Уильямс Ф., Миддлтон Д., Файнбойм Л.: рецепторы KIR и HLA-C в поддержании беременности. Тканевые антигены. 2007, 69 (Приложение 1): 112-113. 10.1111 / j.1399-0039.2006.762_8.x.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 43.

    Сайто С., Такеда Ю., Сакаи М., Накабаяхи М., Хаякава С.: Заболеваемость преэклампсией среди пар, состоящих из японских женщин и мужчин европеоидной расы. J Reprod Immunol. 2006, 70: 93-98. 10.1016 / j.jri.2005.12.005.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 44.

    Borzychowsky AM, Croy BA, Chan WL, Redman CW, Sargent IL: Изменения в системном иммунитете типа 1 и типа 2 при нормальной беременности и преэклампсии могут быть опосредованы естественными клетками-киллерами.Eur J Immunol. 2005, 35: 3054-3063. 10.1002 / eji.200425929.

    Артикул Google Scholar

  • 45.

    Tilburgs T, van der Mast BJ, Nagtzaam NM, Roelen DL, Scherjon SA, Claas FH: Экспрессия децидуальных Т-клеток рецептора NK-клеток при беременности человека. J Reprod Immunol. 2009, 80: 22-32. 10.1016 / j.jri.2009.02.004.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 46.

    Sharkey AM, Gardner L, Hiby S, Farrell L, Apps R, Masters L, Goodridge J, Lathbury L, Stewart CA, Verma S, Moffett A: экспрессия киллер-Ig-подобных рецепторов в маточных NK-клетках смещена в сторону распознавания HLA-C изменяется с возрастом беременности. J Immunol. 2008, 181: 39-46.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • Полноразмерный репрессирующий фактор NF-κB содержит связывающий домен XRN2 | Биохимический журнал

    NKRF, который, как недавно было показано, играет роль в биогенезе рибосом [8,9], первоначально был идентифицирован как 43.Белок 8 кДа, который подавлял транскрипционную активность NF-κB и постоянно подавлял промотор IFN-β [16]. Однако секвенирование дополнительных клонов кДНК и анализ геномных последовательностей из тканей мыши и человека выявили ошибку секвенирования в первой опубликованной последовательности кДНК NKRF, которая привела к преждевременной терминации [16]. Была предложена новая скорректированная последовательность, которая кодировала удлинение на 302 аминокислоты на С-конце открытой рамки считывания, давая белок из 690 аминокислот (рис. 1А) с прогнозируемой молекулярной массой 77 кДа [17 ].Данные свидетельствуют о том, что белок NKRF кодируется двумя мРНК, различающимися своими 5'UTR (рис. 1A: варианты 2 и 3), и, кроме того, также был предложен альтернативный вариант сплайсинга, который может продуцировать белок из 705 аминокислот. (Рисунок 1А: вариант 1). Однако ни один из этих предсказанных размеров белка не согласуется с белком 88 кДа, соответствующим NKRF, который мы наблюдали с помощью вестерн-анализа (рис. 1B). Чтобы подтвердить специфичность антитела против NKRF, использованного в вестерн-анализе, мы попытались истощить NKRF в клетках U-2 OS, используя две разные миРНК, направленные против мРНК NKRF.Обе миРНК вызывали значительное снижение белка 88 кДа, подтверждая, что антитело обнаруживает NKRF (рис. 1B). Кроме того, подобное снижение экспрессии NKRF в ядрышке наблюдалось после истощения siRNA (дополнительный рисунок S1A). Хотя возможно, что на миграцию белка NKRF влияют посттрансляционные модификации, в первую очередь мы провели обширный биоинформатический анализ, чтобы понять несоответствие между предсказанным и наблюдаемым размером белка.Мы идентифицировали расширенную мРНК, кодирующую NKRF (рис. 1A: вариант транскрипта 201), которая была обнаружена с помощью автоматической аннотации в Ensembl как ENST00000304449.6. 5'-нетранслируемая область (5'UTR) этой мРНК на 560 нуклеотидов длиннее, чем у ранее описанного транскрипта варианта 2, и, что важно, этот более длинный 5'UTR содержит вышестоящий кодон AUG (Рисунок 1A: AUG2). Автоматическая трансляция этой последовательности по-прежнему давала эталонную последовательность белка из 690 аминокислот (77 кДа). Однако база данных коротких генетических вариаций dbSNP показала, что эталонная геномная последовательность человеческого NKRF содержит ошибку.Таким образом, 99,95% из 20 387 секвенированных геномов человека содержали дополнительный цитозиновый нуклеотид в экзоне 1 гена NKRF по сравнению с эталонной последовательностью (рисунок 1C и дополнительный рисунок S1B). Включение дополнительного цитозина сдвигает AUG2 в более длинной мРНК NKRF в ту же рамку считывания, что и ранее идентифицированная кодирующая область, расширяя открытую рамку считывания для кодирования белка из 784 аминокислот с прогнозируемой молекулярной массой 88 кДа. Важно отметить, что аминокислотная последовательность этого N-концевого удлинения является высококонсервативной у видов млекопитающих (дополнительный рисунок S1C) со всеми соответствующими геномными последовательностями, содержащими дополнительный цитозин, по сравнению с эталонной последовательностью человека.

    По клеточной биологии пит-клеток, печеночно-специфические NK-клетки

    Авторские права © Автор (ы) 2000. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены. Мир Дж. Гастроэнтерол. 15 февраля 2000 г .; 6 (1): 1-11
    Опубликовано онлайн 15 февраля 2000 г. doi: 10.3748 / wjg.v6.i1.1

    По клеточной биологии пит-клеток, печеночно-специфические NK-клетки.

    Дайан-Чжун Луо, Дэвид Вермиджлен, Бюлент Ахишали, Василис Триантис, Джорджия Плакуци, Филип Брает, Карин Вандеркеркен, Эдди Виссе

    Дайан-Чжун Луо, Давид Вермайлен, Бюлент Ахишали, Василис Триантис, Джорджия Плакуци, Филип Брает, Эдди Висс, Лаборатория клеточной биологии и гистологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Брюссель-Джетте, Бельгия

    Карин Vanderkerken, Отделение гематологии и иммунологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Брюссель-Йетте, Бельгия

    Dian-Zhong Luo, Отдел патологии, Медицинский университет Гуанси, Наньнин, Китай

    Филип Брает и Карин Вандеркеркен являются постдокторанты Фонда научных исследований Фландрии.

    Дянь-Чжун Луо, мужчина, родился 07.07.1955 в Гуйлине, Гуанси, в 1982 году окончил Медицинский университет Гуанси, в 1987 году получил степень магистра в Медицинском университете Гуанси, а в 1994 году - в Свободном университете Брюсселя, профессор. патологии Медицинского Университета Гуанси, а теперь следит за доктором философии. программа по медицинским наукам в Свободном университете Брюсселя, Бельгия, опубликовано более 30 статей.

    Номер ORCID: $ [AuthorORCIDs]

    Вклад авторов : Все авторы внесли равный вклад в работу.

    При поддержке грантов 3.0053.92,3.0050.95, 9.0038.96,1.5.411.98 от Национального фонда научных исследований (FWO) и грантов 194.322.1740,195.332.1310,196.322.0140 и OZR.230 от Исследовательский совет Свободного университета Брюсселя.

    Для корреспонденции на : Проф. Д-р Эдди Висс, Лаборатория клеточной биологии и гистологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Лаарбеклан 103, B-1090 Брюссель, Бельгия. [email protected]

    Телефон : + 32-2-4774404 Факс: + 32-2-4774405

    Получено: 22 сентября 1999 г.
    Доработано: 2 ноября 1999 г.
    Принято: 15 ноября 1999 г.
    Опубликовано онлайн: 15 февраля 2000 г.


    ВВЕДЕНИЕ

    Естественные клетки-киллеры (NK) функционально определяются их способностью убивать определенные опухолевые клетки и инфицированные вирусом клетки без предварительной сенсибилизации [1].NK-клетки составляют от 10% до 15% лимфоцитов периферической крови, и большинство этих клеток у человека и крысы имеют морфологию больших гранулярных лимфоцитов (LGL) [2]. Однако недавние исследования показали, что небольшие агранулярные лимфоциты, лишенные экспрессии CD3, обладают цитолитической активностью, сравнимой с NK-клетками [3]. Эти вариации могут быть связаны со стадией дифференцировки или гетерогенности NK-клеток [4]. Более того, некоторые цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) также обладают характеристиками LGL [4].Помимо NK-клеток в периферической крови, NK-клетки также обнаруживаются в тканевых компартментах, таких как селезенка, легкие, кишечник, лимфатические узлы, костный мозг и печень [4]. NK-клетки в печени, также называемые пит-клетками [5], составляют уникальную резидентную популяцию NK в синусоидах печени. Их иммунофенотипические, морфологические и функциональные характеристики отличаются от NK-клеток крови [6]. В настоящее время для описания пит-клеток используется несколько названий, таких как пит-клетки, печеночные NK-клетки и LGL, относящиеся к различным аспектам их морфологии или функции [6].Мы предпочитаем использовать первое название пит-клетки для этих клеток в печени, потому что оно не связано с постоянно меняющимися уровнями функции и морфологии или человеком (как клетки Купфера) [7]. Кроме того, ассоциированные с печенью лимфоциты (LAL) в некоторых случаях используются для описания общей популяции лимфоидных клеток в печени [8,9]. Однако КЛЛ содержит около 30% Т-лимфоцитов, 3% В-лимфоцитов помимо 43% пит-клеток в смыве печени человека [9]. Смывы из печени крыс содержат 43% Т-лимфоцитов, 16% В-лимфоцитов, 3.3% моноцитов и 26% пит-клеток [10].

    В настоящем обзоре обсуждается биологическая значимость пит-клеток с акцентом на печень крыс.

    ИДЕНТИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПИТ-КЛЕТОК

    Pit-клетки были впервые описаны в 1976 г. Wisse et al. [5]. Название «пит-клетка» было введено из-за характерных цитоплазматических гранул, которые на голландском языке называются ямками, напоминающими ямки в винограде [5]. Гипотеза о том, что пит-клетки могут обладать NK-активностью, была предложена Kaneda et al [11] из-за их морфологического сходства с LGL.Разработка метода выделения и очистки пит-клеток из печени крысы и доказательства того, что пит-клетки обладают спонтанной цитотоксичностью против NK-чувствительных клеток лимфомы YAC-1, подтвердили, что эти клетки являются NK-клетками печени [12,13].

    Pit-клетки существуют в синусоидах печени и часто прикрепляются к эндотелиальным клеткам (Ec), хотя они случайно контактируют с клетками Купфера (Kc) (Рисунок 1). Они смотрят прямо в кровь. Псевдоподии пит-клеток могут проникать через отверстия Ec, проникать в пространство Disse и могут напрямую контактировать с микроворсинками гепатоцитов [5,14].Их появление в пространстве Диссе - не обычная черта [15]. По данным морфологического исследования, частота пит-клеток в ткани печени составляет в среднем 1 пит-клетку на 10 клеток Купфера. Таким образом, количество пит-клеток у необработанных крыс оценивается в (1,4-2) × 10 6 клеток на грамм веса печени [12]. По данным иммуногистологического анализа с использованием mAb 3.2.3 против NKR-P1A (специфического маркера NK-клеток) количество пит-клеток в замороженных срезах печени крысы составляет около 13,7 на мм 2 [16].После внутривенного введения модификаторов биологического ответа (BRM) количество пит-клеток увеличивается в 4-6 раз в печени крыс, получавших зимозан [17], и в 43 раза - интерлейкином-2 (IL-2) [18]. Считается, что избыток пит-клеток возникает в результате локальной пролиферации и из костного мозга [17,18]. Было обнаружено, что ямковые клетки более многочисленны в перипортальной области, чем в перицентральной области доли печени [11,16].

    Рис. 1. Просвечивающая электронная микрофотография пит-клетки в синусоидальном просвете печени крысы (L). Пит-клетка показывает полярность с эксцентрическим ядром. Цитоплазма обильная и содержит характерные плотные наэлектризованные гранулы и другие органеллы, лежащие в основном с одной стороны ядра. Клетка контактирует с эндотелиальной клеткой (E) и частью клетки Купфера (K) с положительным продуктом пероксидазной реакции в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме. Бар = 1 мкм. (из Hepatology, 1988; 8: 46-52, с разрешения)

    Pit-клетки имеют по существу ту же морфологию, что и NK-клетки крови и других органов, i.е . LGL (рисунок 1). Морфология LGL характеризуется относительно крупными размерами, наличием гранул в цитоплазме, выраженной асимметрией клетки и зазубренным или почковидным ядром высокой плотности [10]. Ямочные клетки крысы имеют диаметр около 7 мкм и разную форму, но при этом обладают хорошо развитыми псевдоподиями. Они демонстрируют ярко выраженную полярность с эксцентрическим ядром и большинством органелл, лежащих по одну сторону от ядра.

    Самыми заметными органеллами являются электронно-плотные гранулы.Эти гранулы обладают несколькими характеристиками. Они азурофильны, поэтому окрашивание по Гимзе мазка клеток или препарата цитоспина выявляет наличие гранул в пит-клетках с помощью светового микроскопа. По данным электронной микроскопии, гранулы различаются по размеру в разных субпопуляциях пит-клеток (пит-клетки LD и HD, см. Следующую страницу), но в пределах одного типа клеток гранулы очень однородны по размеру, форме и электронной плотности [19 ]. Гранулы связаны мембраной и имеют размер от 0.2 мкм в клетках с питанием LD и 0,5 мкм в клетках LAK. Эти гранулы содержат ряд лизосомальных ферментов, таких как кислая фосфатаза [12,20]. Хотя перфорин и гранзимы, которые были выделены из гранул NK-клеток [21,22], еще не идентифицированы в гранулах пит-клеток, по аналогии считается, что эти молекулы присутствуют в гранулах пит-клеток.

    Везикулы с стержневой сердцевиной - это небольшие включения диаметром от 0,17 до 0,2 мкм, которые встречаются исключительно в LGL [11]. Они содержат структуру с прямыми стержнями длиной 30-50 нм, перекрывающими весь диаметр везикулы [11,20].Везикулы с стержневыми сердцевинами образуются и преимущественно распределяются вокруг аппарата Гольджи. Возможно, везикулы с стержневой сердцевиной могут также содержать цитотоксические факторы, действующие в условиях естественной цитотоксичности [15].

    Пит-клетки также существуют в печени человека и мыши, но идентификация пит-клеток в печени человека и мыши более трудна, чем у крысы, поскольку они содержат меньшее количество и меньший размер типичных плотных гранул и очень мало стержневых. везикулы [9,23,24]. С другой стороны, от 5% до 25% пит-клеток человека содержат «параллельные трубчатые массивы» (PTA), которые также были обнаружены в NK-клетках крови человека и считаются характеристикой этих клеток [6,23].

    ПОВЕРХНОСТНЫЙ ФЕНОТИП ПИТ-КЛЕТОК

    Обширный фенотипический анализ показал, что уникальный маркер NK-клеток еще не идентифицирован, но экспрессия набора дифференцирующих антигенов в отсутствие антиген-специфических рецепторов T- и B-лимфоцитов служит для идентификации NK клетки. NKR-P1 был впервые идентифицирован у крыс [25], и теперь было показано, что он экспрессируется также NK-клетками мыши и человека [26,27]. NKR-P1 - мембранный гликопротеин II типа суперсемейства лектинов С-типа [28].Гены N KR-P1 расположены на хромосоме 6 мыши [29], хромосоме 12 человека p 12-p13 [27] и хромосоме 4 крысы в ​​области, обозначенной как «генный комплекс NK» (NKC) [28]. Антиген NKR-P1 присутствует в 94% LGL крысы и служит запускающей структурой на этих клетках [25]. NKR-P1 считается полезным маркером для идентификации NK-клеток [25]. Однако подмножество Т-лимфоцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов также экспрессируют NKR-P1 [25,27]. CD56 и CD16 экспрессируются, по отдельности или в комбинации, на большинстве человеческих NK-клеток и наиболее широко используются в качестве «маркеров» человеческих NK-клеток для клинических и фундаментальных исследований [2].Другими поверхностными антигенами, экспрессируемыми на NK-клетках, являются: CD2, CD8, CD11a-c, CD18, CD45, CD54, CD56, CD58 и CD69 [2,4,30,31].

    Большинство поверхностных антигенов, обнаруженных на клетках ямок крыс, аналогичны антигенам, обнаруженным на NK-клетках селезенки или периферической крови (Таблица 1) [13,16,32]. Было обнаружено, что все LGL из смыва печени крысы в ​​препаратах для световой и электронной микроскопии экспрессируют NKR-P1 [16] (рис. 2), как было обнаружено с помощью моноклонального муравьиного ибоди (mAb) 3.2.3 [25]. CD11a присутствует на 90% пит-клеток крысы, что отличается от NK-клеток периферической крови крыс (54%) [32].Примерно 90% клеток ямок крысы экспрессируют CD18, 35% экспрессируют CD54 и 80% экспрессируют CD2 [32]. Asialo-GM1, который экспрессируется всеми NK-клетками крови крыс [19], присутствует в 36% пит-клеток LD и 70% пит-клеток HD [13]. CD8, маркер NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [2], присутствует на всех ямках крыс [13]. Однако состав CD8 в NK-клетках и Т-лимфоцитах различен. Большинство NK-клеток CD8 + экспрессируют гомодимеры CD8a / CD8a, а не гетеродимеры CD8a / CD8a, преобладающие на цитотоксических Т-клетках [33].Кроме того, ямочные клетки крысы не экспрессируют Т-клеточный рецептор и антиген CD5 (общий Т-клеточный маркер) [13,15].

    Таблица 1 Характеристики пит-клеток LD, HD и NK-клеток периферической крови.

    77 9164 .7

    61 5,9 916 916 916 916 мкм 2 )

    916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916

    916 60 916 6 916 6 916 6 916 6 916 6 916 6 916 916 6 916 6 916 6 916 6 916 6 9 Низкий
    Артикул Пит-ячейка LD Пит-ячейка HD NK-клетка крови
    Морфология *

    24,5 24,8
    Везикулы с стержневой сердцевиной на ячейку 1,0 0,8 0,5
    Микроворсинки на ячейку 5,2 61 5,9 916 916 916 916 Меньший (0,09) Промежуточный (0,1) Большой (0,14)
    Количество гранул на ячейку Высшее (50) Среднее (20) Нижнее (1 0) )
    Поверхностные антигены +
    CD2 80 80 80
    CD8 100 100 100 100 40
    54
    CD18 90 90 90
    CD54 35 35 35
    Asialo-GM1 36 70 100
    NKR-P1 95 95 94
    Функциональные особенности
    Убийство клеток P815 Да Нет Нет

    Рис. 2 Электронная микрофотография с иммунопередачей, показывающая 3. 2.3 положительная LGL (пит-клетка) (стрелка) и 3.2.3 отрицательная агранулярная клетка. Пит-клетка 3.2.3 + показывает характерные электронно-плотные гранулы в цитоплазме и продукт иммунопероксидазной реакции на поверхности. Полоса = 1 мкм. (Из Hepatology, 1995; 21: 1690-1694, с разрешения)

    LAL из печени человека содержат около 35% клеток CD56 + , в которых обнаружены три подгруппы: ① CD3 + / CD16 -, ② CD3 - / CD16 -, ③ CD3 - / CD16 + [8.Более того, все LAL CD56 + экспрессируют CD11a и CD18 и частично экспрессируют CD2, CD11b, CD11c, CD54 и CD58 [8,34,35].

    ИЗОЛЯЦИЯ И ОЧИСТКА ПИТ-КЛЕТОК

    Наш метод выделения ямочных клеток крыс основан на методе вымывания [12] с последующей очисткой, основанной на отрицательной магнитной селекции клеток с использованием mAb против поверхностных антигенов и рецепторов, обнаруженных на T и В-клетки [6,36]. Поскольку пит-клетки, по-видимому, не сильно закреплены в синусоидах печени, клетки могут быть вымыты неферментативной перфузией печени под высоким давлением (50 см воды) через воротную вену с фосфатно-солевым буфером с добавлением 0.1% ЭДТА [12]. Смыв собирали из полой вены. Эритроциты, гранулоциты и клеточный дебрис в смыве удаляли центрифугированием в градиенте фиколла-пака. Мононуклеарные клетки, выделенные из границы раздела Ficoll-Paque gradient, содержали Т-клетки, пит-клетки, В-клетки, моноциты и несколько Ec и Kc. Дополнительные моноциты и В-клетки в этой популяции могут быть выборочно удалены в колонке из нейлоновой ваты [12]. Пит-клетки дополнительно очищали с помощью магнитной сортировки клеток [36]. С помощью этой системы высокоочищенная популяция пит-клеток была получена путем отрицательной селекции i.е . устранением оставшихся моноцитов, Т- и В-клеток с использованием специфических антител и иммуномагнитных шариков. С помощью этого метода мы получили пит-клетки с чистотой более 90% и жизнеспособностью более 95% (рис. 3). Более того, этот неферментативный метод не разрушает молекулы клеточной поверхности.

    Рис. 3 Световая микрофотография выделенной и очищенной популяции пит-клеток в цитоспине, окрашенном по Мэй-Грюнвальду-Гимза. Клетки содержат цитоплазматические гранулы, которые можно использовать для распознавания и подсчета количества пит-клеток в свежевыделенной популяции ассоциированных с печенью лимфоцитов.Бар = 5 мкм.

    Альтернативно пит-клетки могут быть выделены ферментативными методами [5]. Тем не менее, этот метод требует много времени и трудозатрат и обеспечивает пит-клетки только 30% чистоты и 90% жизнеспособности [6,12].

    ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ПИТ-КЛЕТОК

    Значительный набор данных указывает на то, что ямочные клетки крысы составляют гетерогенную популяцию. В зависимости от плотности клеток пит-клетки можно разделить на фракции с низкой плотностью (LD) и высокой плотностью (HD) с помощью 45% изоосмотического центрифугирования в градиенте Перколла [19].Было показано, что эти две клеточные популяции отличаются иммунофенотипически, морфологически и функционально друг от друга и от LGL крови (Таблица 1) [19,37]. Пит-клетки LD (рис. 4A) содержат больше везикул с стержневой сердцевиной и больше гранул, но меньшего размера, чем NK-клетки крови (рис. 4B) [19,37]. Количество везикул с стержневой сердцевиной и состав гранул (количество и размер) пит-клеток HD занимают промежуточное положение между пит-клетками LD и NK-клетками крови [19,37]. Иммунофенотипически почти все NK-клетки крови являются asia lo-GM1 положительными, и 70% пит-клеток HD являются сильно положительными, тогда как только 36% пит-клеток LD являются слабо положительными [19].Кроме того, между этими тремя популяциями наблюдались функциональные различия. Клетки LD pit в 5-8 раз более цитотоксичны в отношении клеток YAC-1 и клеток карциномы толстой кишки, чем NK-клетки крови [37]. Пит-клетки HD обладают промежуточной цитотоксической активностью между пит-клетками LD и NK-клетками крови [37]. Кроме того, LD-пит-клетки способны лизировать LAK-чувствительные мишени мастоцитомы P815, которые противостоят нормальным NK-клеткам крови и HD-пит-клеткам печени [37].

    Рис. 4 Просвечивающие электронные микрофотографии типичной пит-клетки LD и NK-клетки крови (B). (A) Основной морфологической характеристикой пит-клеток LD по сравнению с HD-клетками и NK-клетками крови является наличие множества мелких цитоплазматических гранул. (B) Обратите внимание на несколько, но большие гранулы в NK-клетках крови. Бар = 1 мкм. (из Hepatology, 1990; 12: 70-75, с разрешения)

    Считается, что

    Pit-клетки происходят из NK-клеток крови [38,39]. Несколько свидетельств подтверждают концепцию, согласно которой NK-клетки крови иммигрируют в синусоиды печени, чтобы стать пит-клетками HD, которые далее дифференцируются в пит-клетки LD.Важно отметить, что характеристики и функции пит-клеток HD занимают промежуточное положение между NK-клетками крови и пит-клетками LD [19]. Кинетические эксперименты с сублетальным облучением всего тела (700 сГр) показали, что NK-клетки крови и пит-клетки HD истощились примерно через одну неделю после облучения, тогда как пит-клетки LD полностью исчезли через две недели после облучения [39]. Экранирование печени дало аналогичные результаты, а спленэктомия не повлияла на количество пит-клеток [39]. При внутривенной инъекции антисыворотки против asialo-GM1, пит-клетки крови NK и HD полностью исчезали в течение одной недели лечения, тогда как пит-клетки LD исчезли из печени через неделю [39].Прямое доказательство того, что пит-клетки LD происходят от asialo-GM1-положительных предшественников (NK- и HD-пит-клетки крови), было получено путем адоптивного переноса флуоресцентно меченных пит-клеток HD сингенным крысам [39]. Через три дня 5% меченых клеток были выделены во фракции LD, и эти клетки показали типичную морфологию ямчатых клеток LD [39]. Эти наблюдения также показывают, что продолжительность жизни пит-клеток в печени составляет около двух недель [6,39].

    Механизм миграции NK-клеток крови в синусоиды печени до конца не изучен.Было обнаружено, что в процесс вовлечены несколько молекул адгезии [32]. NK и пит-клетки крови крыс экспрессируют молекулы адгезии LFA-1 (CD11a / CD18) и CD2 (LFA-2) [32]. Было обнаружено, что их лиганды, CD54 (ICAM-1) и CD58 (LFA-3) присутствуют на Ec печени [40]. После внутривенной инъекции антител против CD2, CD11a и CD18 крысам количество пит-клеток в печени значительно уменьшилось, что указывает на то, что взаимодействия LFA-1 / CD54 и CD2 / CD58 участвуют в рекрутинге пит-клеток в печени. [32].

    Попав в синусоиды печени, предшественники NK крови далее дифференцируются в пит-клетки HD, а затем в пит-клетки LD. Считается, что за этот процесс дифференцировки отвечает микросреда синусоиды печени [41]. Vanderkerken и др. [41] обнаружили, что Kc избирательно удалялись через 3 дня после внутривенной инъекции липосом, содержащих цитотоксическое лекарственное средство дихлорметилендифосфонат. Количество пит-клеток HD снизилось через 3 дня после инъекции.Напротив, популяция пит-клеток LD не показала изменений в количестве через 3 дня, но снижение примерно на 80% наблюдалось через 7 дней после инъекции [41]. Эти данные показывают, что пит-клетки составляют популяцию, зависимую от клеток Купфера, и что Kc играют важную роль в дифференцировке пит-клеток в печени. Однако остается неясным, какой фактор (ы), секретируемый Kc, ответственен за эту дифференцировку. С другой стороны, в микросреде печени присутствуют другие состояния, , то есть .Ec и их секретируемые факторы могут работать синергетически с Kc, способствуя дифференцировке пит-клеток, поскольку совпадение пит-клеток HD с Kc не смогло вызвать полную дифференцировку HD в пит-клетки LD [41].

    ФУНКЦИИ ПИТ-КЛЕТОК

    NK-клетки изначально были определены как лимфоидные клетки, способные опосредовать спонтанное уничтожение клеток-мишеней, включая опухолевые и инфицированные вирусом клетки [1]. Такая цитотоксическая активность NK опосредуется без предварительной сенсибилизации и какой-либо очевидной стимуляции или активации [1].В дополнение к этому естественному спонтанному пути уничтожения опухолей, NK-клетки могут опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) с помощью механизма, включающего CD16, рецептор Fc IgG [42]. Большинство NK-клеток человека и мыши экспрессируют CD16 [2]. NK-клетки крысы содержат гены с высоким уровнем гомологии с рецепторами Fc человека и мыши [43] и способны отображать ADCC [44]. К сожалению, антител против CD16 крысы пока нет.

    Хотя цитотоксическая функция NK-клеток является спонтанной, она может быть значительно усилена несколькими цитокинами [2].Было показано, что один из них, IL-2, играет центральную роль в регуляции NK-клеток, включая усиление цитотоксичности NK-клеток, расширение противоопухолевого спектра NK-клеток и индукцию пролиферации NK-клеток [4].

    Цитотоксическая (т. Е. Цитолитическая) активность NK обычно определяется путем измерения высвобождения радиоактивно меченного хрома из клеток-мишеней после воздействия на эффекторные клетки [2]. Недавно был описан новый анализ с использованием проточной цитометрии для оценки активности NK-клеток, в котором различные красители используются для дифференциации жизнеспособных клеток-мишеней от мертвых [45].Первоначальные исследования показали, что этот метод является быстрым, надежным и хорошо коррелирует со стандартным анализом высвобождения Cr 51 [45].

    Помимо цитотоксической функции, NK-клетки могут продуцировать различные цитокины [46], регулировать рост кроветворных тканей и трансплантатов костного мозга [47], а также участвовать в устойчивости к микробным патогенам [2].

    Большинство исследований функций пит-клеток сосредоточено на цитотоксической активности. Клетки ямок крыс обладают высокой спонтанной цитотоксической активностью против различных линий опухолевых клеток, таких как YAC-1, P815, CC531s, DHD-K12, L929, 3LL и 3LL-R [10].По сравнению с NK-клетками крови, пит-клетки в четыре-восемь раз более цитотоксичны по отношению к клеткам YAC-1 и CC531s и способны убивать NK-резистентные, но чувствительные к лимфокин-активированным киллерам (LAK) клетки P815 (рис. 5) [19]. , 48]. Эти данные, кажется, подтверждают идею о том, что пит-клетки активируются, когда становятся жителями печени. Однако пока неясно, какой (-е) фактор (-ы) ответственен (-ы) за активацию пит-клеток в печени, хотя было показано, что пит-клетки зависят от наличия здоровой популяции Kc. [41].Кроме того, активность NK в печени может быть увеличена с помощью BRM, например, Propionibacterium acnes или малеинового ангидрида дивинилового эфира [24]. Интересно, что увеличение функции, по-видимому, совпадает с большим увеличением количества LGL [17,24]. Обработка ИЛ-2 приводит к резкому накоплению пит-клеток в синусоидах печени in vivo [18], индуцирует пролиферацию HD-клеток и увеличивает цитотоксическую активность HD-пит-клеток печени in vitro [49]. Напротив, лечение ИЛ-2 не индуцирует пролиферацию ЛД-пит-клеток печени [49].

    Рис. 5 Сравнение цитолиза между пит-клетками N K, HD и LD крови крысы. Отношение свежевыделенных эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляло 20: 1. Цитолиз измеряли в 4-часовом анализе высвобождения Cr для клеток YAC-1 и P815 и в 16-часовом анализе высвобождения Cr для клеток CC531. клетки. Данные показывают, что пит-клетки LD более цитотоксичны в отношении YA C-1, P815 и CC531, чем клетки HD и NK-клетки крови.Значения были средними ± стандартное отклонение от трех до пяти независимых экспериментов. (Гепатология, 1990; 12: 70-75, с разрешения)

    МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, опосредованной NK-клетками

    Считается, что цитотоксическая функция NK-клеток опосредуется несколькими путями, и каждый путь, в принципе, включает в себя каскад событий, включая распознавание клеток-мишеней, связывание эффекторных клеток к клеткам-мишеням (конъюгация), активация эффекторных клеток, доставка летального сигнала к клеткам-мишеням, а также отщепление и рециклинг эффекторных клеток [2,4,50].Хотя точные механизмы отдельных этапов этого процесса полностью не выяснены, в последнее время был достигнут значительный прогресс в идентификации ряда молекул, участвующих в цитотоксичности, опосредованной NK-клетками.

    КОНЪЮГАЦИЯ

    Предварительным условием уничтожения NK-клеток является связывание одной или нескольких эффекторных клеток с клеткой-мишенью, то есть конъюгация [6]. В этом процессе участвуют несколько молекул адгезии на NK-клетках, таких как CD2, CD28 и LFA-1, и на клетках-мишенях, таких как CD58, B7 и CD54, и некоторые из них могут также обладать костимулирующими или даже запускающими факторами. емкость в цитотоксическом каскаде [28,50-52].

    CD2 представляет собой адгезионную молекулу суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), экспрессируемую на Т-клетках и NK-клетках [53]. Примерно 80% ямочных клеток крыс экспрессируют CD 2 [32]. Хотя CD2 представляет собой хорошо известную активирующую структуру на Т-клетках [53], mAb против CD2, в зависимости от экспериментальных условий, либо индуцируют [54,55], либо ингибируют активность NK [31,56]. MAb против CD2 не влияло на связывание пит-клеток с клетками карциномы толстой кишки крысы (CC531s) или на цитотоксичность против CC531s [57]. Однако mAb против CD2 усиливали цитолитическую функцию ямок крыс в отношении клеток-мишеней Fcγ R + P815 [57].Лиганд CD2 представляет собой другую молекулу адгезии, CD58 (LFA-3), которая широко экспрессируется на различных типах клеток [53]. Трансфекция CD58 в линии мышиных клеток увеличивала лизис этих мишеней некоторыми клонами человеческих CD2 + NK-клеток [58]. Однако экспрессии только CD58 недостаточно для придания клеткам чувствительности к лизису, опосредованному NK-клетками, что указывает на то, что CD2 может служить костимулирующим рецептором, который увеличивает, но не инициирует первичную активацию NK-клеток [58].

    Было обнаружено, что взаимодействие между интегринами β 2 (CD11a-c / CD18) и ICAM (в молекулах межклеточной адгезии) играет важную роль в связывании NK-клеток с их мишенями [31,51,56].Интегрины β 2 представляют собой гетеродимеры, содержащие общую β-цепь (CD18) и одну из трех различных β-цепей (CD11a, CD11b, CD11c). β 2 Интегрины экспрессируются только в лейкоцитах, включая NK [56] и пит-клетки [32]. Помимо эффекта на связывание с клетками-мишенями, LFA-1 (CD11a / CD18) также участвует в передаче сигнала в NK-клетках, необходимых для активации NK-клеток [59]. Известно, что перекрестное связывание LFA-1 на NK-клетках с его антителом вызывает приток кальция, обмен фосфоинозитидов, продукцию фактора некроза опухоли-α (TNF-α) [59] и ингибирует уничтожение клеток-мишеней NK-клетками [59]. 60].Было также обнаружено, что LFA-1 участвует в цитотоксичности, опосредованной пит-клетками. Антитело против LFA-1 ингибирует не только связывание пит-клеток с клетками-мишенями, но и уничтожение клеток-мишеней пит-клетками [57]. Взятые вместе, эта информация предполагает, что LFA-1 на эффекторных клетках может иметь двойную функцию связывания с клетками-мишенями и запуска цитолиза.

    Исследования показали, что конъюгация между NK-клетками и клетками-мишенями необходима, но недостаточна для активности NK [50].После конъюгации необходимы дальнейшие события распознавания, опосредованные запускающими и ингибирующими рецепторами на NK-клетках, для запуска цитотоксической активности NK-клеток [2,51].

    РЕЦЕПТОРОВ NK-КЛЕТОК, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРИЗНАНИИ MHC КЛАССА I

    Цитотоксичность, опосредованная NK-клетками, первоначально считалась спонтанной и не ограничивалась классом I главного комплекса гистосовместимости. Однако все больше данных указывает на то, что NK-клетки предпочтительно убивают клетки, лишенные MHC класса I. Экспрессия MHC класса I на ряде клеток-мишеней коррелирует с устойчивостью клеток-мишеней к естественному уничтожению [61-65].Маскирование MHC класса I n-mAb усиливает опосредованную пит-клетками цитотоксичность в отношении клеток CC531s, указывая на то, что MHC класса I на клетках CC531s защищает эти клетки от гибели ямочными клетками крысы [66].

    Объяснение этих наблюдений состоит в том, что цитотоксическая активность NK-клеток регулируется положительными и отрицательными сигналами от запускающих и ингибирующих мембранных рецепторов. Окончательный результат: , т.е. . запуск цитотоксической активности или ингибирование цитотоксичности, по-видимому, зависит от баланса между положительными и отрицательными сигналами [51,67].В последние годы описано все большее количество пусковых и тормозных рецепторов [28,68,69]. В гибридных рецепторах на NK-клетках распознаются MHC класса I, и они обычно ингибируют лизис клеток MHC класса I + [28,67-71]. Сообщается, что три семейства рецепторов, Ly49, CD94 / NKG2 и рецепторы, ингибирующие киллерные клетки (KIR), участвуют в распознавании молекул MHC класса I на клетках-мишенях [28]. Семейство Ly49 является продуктом по крайней мере девяти высокородственных генов (Ly 49A-Ly49I), присутствующих на хромосоме 6 мыши в NKC [72].Гомологии Ly-49 были идентифицированы на хромосоме 4 крысы в ​​«NKC» [73], но не были обнаружены у человека. Молекулы Ly-49 относятся к мембранным гликопротеинам II типа и относятся к суперсемейству лектинов С-типа [72]. Рецепторы Ly-49 распознают тримерный комплекс MHC класса I, состоящий из тяжелой цепи H-2D или H-2K, β 2-микроглобулина и связанного пептида. Однако состав связанного пептида, по-видимому, не влияет на взаимодействие в большой степени [68]. Большинство, но не все рецепторы Ly-49 содержат иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM) в своих цитоплазматических доменах [28,67].Рецепторы Ly-49, содержащие последовательность ITIM, ингибируют эффекторную функцию NK-клеток [28,67], тогда как Ly-49, лишенный ITIM, такой как Ly-49D и Ly-49H, может активировать опосредованную NK-клетками цитотоксичность, когда рецептор лигируется муравьем. mAb i-Ly49D [74].

    KIR, ингибирующие рецепторы, распознающие MHC класса I в человеческих NK-клетках, представляют собой мономерные гликопротеины I типа, содержащие домены Ig [67]. Они кодируются генами, расположенными на хромосоме человека 19q13.4 [28]. Два подсемейства KIR можно идентифицировать по количеству Ig-подобных доменов во внеклеточных областях молекул [28].Подсемейство KIR3D содержит три Ig-подобных домена, тогда как KIR2D содержит два Ig-подобных домена [28]. Замечательной особенностью как KIR2D, так и KIR3D является неоднородность длины цитоплазматических доменов. KIR с длинными цитоплазматическими доменами, , т.е. . KIR2DL (p58) и KIR3DL (p70) содержат две последовательности ITIM, которые отвечают за ингибирующую функцию этих молекул [67,75]. KIR, содержащие короткие цитоплазматические домены, , т.е. . KIR2DS (p50) и KIR3DS лишены ITIM и потенциально активируют активность NK [76,77].Молекулы KIR2D и KIR3D связываются с тримерами HLA класса I, состоящими из тяжелой цепи класса I, микроглобулина β 2 и связанного пептида [28].

    Помимо KIR, человеческие NK-клетки также экспрессируют другой тип рецептора, способный распознавать MHC класса I, а именно CD94 / NKG2 [78-80]. Этот рецептор является гетеродимером и состоит из гликопротеина CD94, который дисульфидно связан либо с субъединицей NKG2A, либо с субъединицей NKG2C [58]. Гены CD94 и NKG2 присутствуют на хромосоме 12p12.3-p13 человека.1 в «NKC» [81]. Молекулы CD94 и NKG2 принадлежат к суперсемейству лектинов С-типа [81]. CD94 лишен цитоплазматического домена, что лишает его внутренней способности передавать сигнал [81]. Однако CD94 необходим для транспорта и мембранной экспрессии гликопротеинов NKG2A или NKG2C [78,80]. Поскольку NKG2A обладает последовательностью ITIM в цитоплазматическом домене, а NKG2C не имеет ITIM, комплекс CD94 / NKG2A действует как ингибирующий рецептор, тогда как комплекс CD / NKG2C действует как неингибиторный рецептор для MHC класса I на NK-клетках [28,68] .

    Запуск рецепторов NK-клеток

    Описано несколько мембранных молекул, которые служат в качестве запускающих рецепторов на NK-клетках, включая CD16, NKR-P1, NK-TR1, 2B4, P38 и Lag3 [28,51,69]. Только CD16 и NKR-P1 можно рассматривать как «установленные» триггерные рецепторы, тогда как роль остальных все еще не определена или спорна [51]. Однако CD16 отвечает и необходим для ADCC и не участвует в естественной киллинговой активности [28].

    NKR-P1, маркер NK-клеток [25], экспрессируется NK-клетками крысы [25], мыши [82] и человека [27], включая пит-клетки [16].Есть три гомологичных гена NKR-P1, NKR-P1A, NKR-P1B и NKR-P1C, у мышей и крыс [26,82,83], в то время как был обнаружен только один ген NKR-P1 человека [27]. Было обнаружено, что МА против NKR-P1 мыши и крысы запускают опосредованный NK-клетками лизис клеток-мишеней FcR + , называемый перенаправленным ADCC [25]. Это действие также включает повышение внутриклеточного уровня Ca 2+ [84] и продукцию цитокинов [85]. Кроме того, mAb к NKR-P1 стимулируют оборот фосфоинозитидов [84], образование арахидоновой кислоты [86] и экзоцитоз гранул [25].NKR-P1 на пит-клетках участвует в опосредованной пит-клетками цитотоксичности в отношении мишени FcR + P815, но не в убийстве мишени FcR - CC531s [66]. Однако функция NKR-P1 на NK-клетках человека оказывается более сложной. Обработка человеческих NK-клеток mAb против NKR-P1 дает противоречивые результаты, такие как активация, ингибирование или отсутствие эффекта, в зависимости от изученной популяции NK-клеток [27,87]. Условия, определяющие результат вовлечения NKR-P1 в человеческие NK-клетки, неизвестны.При сравнении человеческого NKR-P с соответствующими белками крысы и мыши было обнаружено, что все NKR P1 грызунов имеют мотив C × CP, который взаимодействует с фосфорилированным P56 1ck [88] , тогда как человеческий NKR-P1 лишен этого мотива [ 28].

    ДВА ОСНОВНЫХ ПУТИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЙ NK-КЛЕТКАМИ

    CTL и NK-клетки, в том числе крысиные пит-клетки, убивают клетки-мишени одним из двух отдельных механизмов или обоими: некрозом и апоптозом [19,48,50,89]. Некроз или цитолиз характеризуется набуханием клетки и органелл и приводит к разрушению и утечке клеточной мембраны и к лизису [6].Повреждение клеточной мембраны является ключевым событием в цитолизе, и высвобождение цитоплазматического содержимого, возможно, приводит к воспалительной реакции in vivo [6]. Считается, что анализ высвобождения хрома 51 отражает этот тип повреждения [6].

    Апоптоз или запрограммированная смерть клеток морфологически распознается по мембранным пузырям, конденсации хроматина, фрагментации ядер, сжатию, конденсации клеток и их органелл и фрагментации клеток на апоптотические тельца (рис. 6).Клеточные остатки фагоцитируются соседними клетками или макрофагами. При отсутствии фагоцитозирующих клеток апоптотические тельца прогрессируют до вторичного некроза [6,90].

    Рис. 6. Электронная микрофотография апоптоза CC531s (T), совмещенная с пит-клетками (E) в течение 3 часов. Апоптотическая клетка CC531s (T) демонстрирует вакуолизацию (большая стрелка), образование пузырей на поверхности клетки (маленькая стрелка), конденсация хроматина (тонкая стрелка) и фрагментация ядра (толстая стрелка).Полоса: 2 мкм. (Гепатология, 1999; 29: 51-56, с разрешения).

    Недавние исследования показали, что апоптоз, опосредованный NK-клетками, в основном может осуществляться двумя путями, , то есть . путь перфорин / гранзим (экзоцитоз гранул) и путь Fas / FasL (лиганд Fas) [91,92]. Считается, что лизис, опосредованный NK-клетками, в основном основан на экзоцитозе гранул [91], тогда как недавно сообщалось о Fas-опосредованном некрозе, когда каспазы блокируются [93].

    Fas-путь апоптоза опосредуется взаимодействием лиганда CD95 (CD95 L, FasL) с молекулой индуктора апоптоза CD95 (Fas / APO-1), экспрессируемой на клетках-мишенях [91,94,95].CD95 является членом семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TN F) и фактора роста нервов (NGF) [95, 96]. CD95 широко экспрессируется в лимфоидных и нелимфоидных тканях, а также в некоторых опухолевых клетках [89,95]. Экспрессия CD95 может быть усилена интерфероном γ (IFN-γ) в различных клеточных линиях [96,97]. Цитоплазматический хвост CD95 содержит мотив, называемый «доменом смерти», который важен для передачи апоптотического сигнала [98]. CD95L - трансмембранный белок типа II семейства TNF [95]. CD95L экспрессируется активированными Т-клетками, NK-клетками и pi-Т-клетками [89,95,99,100].Связывание CD95L с его рецептором CD95 вызывает апоптоз CD95-несущих клеток [94]. Показано, что CD95 / CD 95L играет важную роль в уничтожении инфицированных вирусом клеток и опухолевых клеток CTL и NK-клетками [98]. Хотя CD95 экспрессируется на клетках CC531s, а CD95L экспрессируется на клетках ямок крыс, было обнаружено, что апоптоз CC531s, опосредованный пит-клетками, осуществляется исключительно путем экзоцитоза перфорин / гранзим [89].

    Путь перфорин / гранзим является зависимым от Ca 2+ путем и опосредуется порообразующим белком перфорином и гранзимами, особенно гранзимом B, оба из которых хранятся в гранулах NK-клеток [92].После контакта между эффекторными клетками и клетками-мишенями перфорин и гранзимы направленным образом высвобождаются в межклеточное пространство между этими клетками. Сам по себе перфорин вызывает лизис, не вызывая апоптоза, , то есть . фрагментация ДНК клетки-мишени. Гранзимы играют решающую роль в быстрой индукции фрагментации ДНК CTL, NK-клетками и пит-клетками (рис. 7) [89,101]. Постулируется, что проникновение гранзимов в клетки-мишени происходит через поры, продуцируемые перфорином в мембране клетки-мишени.Недавние исследования показали, что гранзим B подвергается эндоцитозу клетками-мишенями независимо от перфорина, возможно, через насыщаемые участки связывания на поверхности клеток с высоким сродством. В отсутствие перфорина гранзим B имеет цитоплазматическую локализацию. Когда добавляется перфорин, гранзим B перемещается в положение ядра, быстро вызывая апоптоз [102,103]. Эти данные показывают, что сотрудничество двух молекул необходимо для индукции апоптоза, включая фрагментацию ДНК.

    Рис. 7. Участие пути перфорин / гранзим в апоптозе CC531s, индуцированном пит-клетками. Отношение свежевыделенных пит-клеток к клеткам CC531s составляло 10: 1. Апоптоз измеряли с помощью 3-часового анализа с использованием ДНК-ферментации. EGTA представляет собой хелатор Ca 2+ , который блокирует экзоцитоз гранул и действие перфорина. DCI - ингибитор гранзима. Z-DEVD-FMK является ингибитором каспазы 3. Эти обработки полностью ингибируют апоптоз CC531s, индуцированный пит-клетками. Значения были средними ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. (Гепатология, 1999; 29: 51-56, с разрешения).

    РЕЗЮМЕ

    Появляется все больше свидетельств того, что пит-клетки являются высокоактивными, специфичными для печени NK-клетками.Пит-клетки расположены в синусоидах печени и могут быть легко изолированы и очищены с помощью синусоидального лаважа печени и метода магнитной сепарации. Кроме того, пит-клетки можно разделить на фракции LD и HD с помощью 45% изоосмотического центрифугирования в градиенте Per coll. Показано, что эти две популяции отличаются морфологически, фенотипически и функционально друг от друга и от NK-клеток крови. Ямочные клетки LD содержат больше везикул с стержневой сердцевиной и больше гранул меньшего размера, чем NK-клетки крови, хотя оба они имеют общую морфологию LGL.Фенотипически клетки LD имеют более высокую экспрессию LFA-1 и более низкую экспрессию молекул asialo-GM 1 по сравнению с NK-клетками крови или селезенки. Функционально пит-клетки более цитотоксичны в отношении нескольких линий опухолевых клеток по сравнению с NK-клетками крови и способны убивать резистентные к NK, но LAK-чувствительные клетки P815. Эти данные показывают, что пит-клетки являются разновидностью естественно активированных NK-клеток, и их цитотоксическая функция сравнима с IL-2 , активированными in vitro NK-клетками. Характеристики клеток HD занимают промежуточное положение между пит-клетками LD и NK-клетками крови.Скорее всего, пит-клетки происходят из NK-клеток крови, хотя при определенных стимулах они обнаруживают митоз в печени. Рекрутирование пит-клеток в печени опосредуется молекулами адгезии. Основной задачей является достижение лучшего понимания механизмов цитотоксичности пит-клеток и взаимодействия пит-клеток с другими клетками печени, , то есть . Kc, Ec и LAL. Более того, поскольку пит-клетки занимают стратегическое положение в синусоидах печени, они представляют собой первую линию клеточной защиты против метастазирующих клеток рака толстой кишки.Особого внимания заслуживает роль пит-клеток при ряде патологий печени.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим Карин Сейнав и Марийке Бекеланд за их отличную техническую поддержку и Криса Дерома за ее фотографическую поддержку.

    NK-клеток подавляют рост Plasmodium falciparum в эритроцитах за счет антителозависимой клеточной цитотоксичности

    Рецензент № 1:

    Эта рукопись представляет собой убедительный аргумент в пользу активации человеческих NK-клеток посредством ADCC против покрытых антителами малярийных эритроцитов.Нет никаких доказательств спонтанной цитотоксичности NK-клеток в отношении инфицированных эритроцитов в отсутствие антител, и для этого эффекта требуется использование сыворотки пациентов в эндемичных по малярии районах. Исследования выполнены хорошо и убедительно. Основная проблема заключается в том, что трудно понять, насколько важен этот механизм в фактическом контроле малярийной инфекции in vivo , но для этого потребуется in vivo исследований на людях, что невозможно. С другой стороны, это, по-видимому, важный концептуальный прогресс в разработке эффективных вакцин против малярии.

    Было бы интересно узнать, связан ли фенотип KIR NK-клеток человека с ответом на инфицированные RBC и с соответствующими аллелями HLA NK-клеток. Но это выходит за рамки данной статьи.

    Было бы интересно изучить влияние генов HLA и KIR на восприимчивость к малярии. Один вопрос заключается в том, способствует ли лицензирование NK-клеток посредством ингибирующего KIR более сильным ответам ADCC на инфицированные эритроциты. Его можно проверить с помощью многоцветного анализа фенотипов NK-клеток и функции ADCC, предпочтительно с образцами от людей, подвергшихся воздействию малярии.Одной из трудностей здесь является обширный полиморфизм генов KIR, который особенно высок в Африке. Стандартные антитела к конкретным членам семейства KIR могут пропускать некоторые полиморфные аллели. Тем не менее такое исследование выполнимо. Фенотипический и функциональный анализ NK-клеток с образцами из Африки должен быть выполнен с приоритетом фенотипов KIR и NKG2A, поскольку только для этого потребуется довольно большое количество антител. Мы еще не проводили такого исследования. Как упомянул рецензент, это выходит за рамки данной статьи.

    Другой вопрос: связаны ли конкретные комбинации гаплотипов KIR и HLA с устойчивостью к малярии. Его следует изучать с большими когортами людей, для которых доступны хорошие клинические данные и генетический анализ их генов HLA и KIR. Этот конкретный вопрос, не относящийся к основной теме нашей рукописи, пока не получил широкого распространения.

    Рецензент № 2:

    Лонг и его коллеги исследуют, могут ли NK-клетки распознавать эритроциты, инфицированные Plasmodium falciparum, и воздействовать на них с помощью ADCC.Они используют дополнительный анализ, включая недавно разработанный анализ GIA-ADCC, чтобы исследовать способность NK-клеток убивать инфицированные клетки. Их данные ясно демонстрируют, что NK-клетки могут опосредовать ADCC с помощью естественной сыворотки и IgG инфицированных пациентов. Они демонстрируют, что это может быть опосредовано встречающимися в природе антителами к PfEMP1 и VAR2CSA, а также моноклональным антителом, распознающим антиген RIFIN. Авторы приходят к выводу, что NK-опосредованное распознавание инфицированных эритроцитов и ингибирование роста паразитов является важным антималярийным механизмом, который необходимо изучить при рассмотрении стратегий вакцинации.

    В целом, эксперименты хорошо контролируются, а гипотезы и результаты ясны и хорошо написаны. В этой области имеется некоторая противоречивая информация относительно способности NK-клеток распознавать инфицированные эритроциты, и эти исследования с использованием свежеизолированных NK-клеток и сыворотки инфицированных пациентов должны прояснить это.

    Недавно вышла публикация, описывающая связывание белков RIFIN с рецепторами ингибиторов как механизм иммуноэвазии (Saito et al., 2017).Авторы используют моноклональные антитела против RFIN и контроль с мутацией в домене Fc, чтобы продемонстрировать специфичность в отношении ADCC. Хотя контролируемое исследование здесь демонстрирует, что цитотоксический эффект NK, скорее всего, связан с нарушением активации, а не с блокированием лиганда ингибирующего рецептора, обсуждение и ссылка на эту недавнюю рукопись кажутся уместными.

    Мы уже упомянули эту интересную статью и потенциал ингибирования NK-клеток белками Plasmodium RIFIN.Однако RIFIN не связывает LAIR-1 дикого типа, который экспрессируется на NK-клетках. Кроме того, мы наблюдали высвобождение гемоглобина после смешивания NK-клеток с P.f .-инфицированных эритроцитов, которые были отобраны по высокой экспрессии RIFIN, в присутствии человеческого моноклонального Ab к RIFIN. Мы можем быть уверены, что активация NK была вызвана не маскированием RIFIN с помощью mAb (и высвобождением из ингибирования), а активацией ADCC человеческим mAb IgG1, поскольку то же самое антитело, лишенное связывания с FcR, не активировало NK-клетки.Теперь это обсуждается в разделе «Обсуждение» исправленной рукописи.

    Рецензент № 3:

    В этой рукописи Арора и др. Сообщают, что человеческие NK-клетки могут эффективно лизировать эритроциты, инфицированные Plasmodium falciparum, посредством антителозависимой клеточной токсичности.

    В целом, авторы представляют набор хорошо спланированных экспериментов, которые легко интерпретировать, данные подтверждают их выводы и образуют связную историю по предмету, представляющему интерес для широкой аудитории.

    У меня есть несколько комментариев, которые, я думаю, помогут еще больше укрепить рукопись:

    - Авторы используют сыворотку США, но плазму Мали: я думаю, было бы полезно объяснить в обсуждении, почему сыворотка была использована для контрольной группы США и может ли эта разница вообще повлиять на результат эксперимента (увеличить или уменьшить ADCC)

    В когорте Мали образцы крови подвергаются антикоагуляции, что позволяет изолировать как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), так и плазму.Сыворотка, собранная от нескольких доноров из США, была получена от Valley Biomedical и использовалась в качестве контроля. Основное преимущество использования объединенной партии сыворотки заключается в том, что она обеспечивает непрерывность наших экспериментов и не вносит вариативность, присущую отдельным донорам-людям. Чтобы напрямую ответить на вопрос, поднятый автором обзора, мы очистили IgG-антитела из плазмы Мали и сыворотки крови США. Эти очищенные IgG дали результаты, аналогичные результатам, полученным с плазмой и сывороткой соответственно. В частности, IgG из контрольной группы США не связывались с инфицированными эритроцитами и не активировали NK-клетки, тогда как IgG от людей из Мали связывались с инфицированными эритроцитами и подавляли рост паразитов в анализе ингибирования роста ADCC (GIA-ADCC).В раздел результатов добавлено предложение.

    - Авторы используют NK-клетки от наивных доноров из США и делают вывод, что NK «таким образом способствует защите от малярии на стадии крови»: недавний отчет Mpina et al., (2017) показывает, что частота и количество NK-клеток в крови снижаются. после (и, возможно, во время) паразитемии на стадии крови, что указывает на то, что NK-клетки, присутствующие в крови на стадии инфицирования, могут отличаться по количеству, составу и функциям от NK-клеток, присутствующих в крови здоровой когорты.В ходе обсуждения следует принять во внимание идею о том, что компартмент NK может отличаться в когортах инфицированных и наивных (потенциально влияющих на ADCC).

    Наше полное предложение звучало так: «мы показали, что человеческие NK-клетки обладают потенциалом контролировать паразитемию P.f. посредством IgG-зависимой активации цитотоксичности NK-клеток и, таким образом, вносят вклад в защиту от малярии на стадии крови». Вопрос, поднятый рецензентом, обсуждался, и Mpina et al. статья была процитирована в разделе «Обсуждение» исправленной рукописи.В отдельном неопубликованном исследовании мы изучили NK-клетки в когорте людей, живущих в эндемичных по малярии регионах. В целом, NK-клетки обладают хорошей функциональностью, включая ADCC, по отношению к инфицированным RBC. Учитывая небольшое количество крови, взятой у этих людей, было бы невозможно использовать ее для проведения экспериментов, описанных в настоящей рукописи. Хотя мы не упоминаем эти неопубликованные результаты в отредактированной рукописи, они вселяют в нас уверенность в том, что наши результаты имеют отношение к болезни.

    - У меня нет опыта, чтобы полностью оценить штаммы паразитов, используемые на рисунках 3 и 4, но мне интересно, может ли общая экспрессия белка паразита в iRBC измениться с удалением или усилением экспрессии интересующего белка (что повлияет на интерпретация данных)

    На рисунке 3 показаны данные, полученные с помощью P.f . штамм DC-J, в котором отсутствует экспрессия PfEMP1.

    В результате большая часть реактивности с Ат у взрослых Мали была потеряна с DC-J-инфицированными эритроцитами.Известно, что PfEMP1 является доминирующим белком паразита, экспрессирующимся на поверхности инфицированных эритроцитов. Целью этих экспериментов было намеренное изменение общего количества паразита PfEMP1 на iRBC. В экспериментах на фиг. 4 использовались iRBC, обогащенные для экспрессии RIFIN, или RBC, инфицированные штаммом, который экспрессирует вариант var2CSA PfEMP1. Поскольку эти эксперименты проводились с использованием антител, специфичных к каждому из этих антигенов, RIFIN или var2CSA, они не предназначались для взятия пробы общих белков паразитов на iRBC.

    - Статистический анализ: укажите в легенде каждого рисунка, когда проводился t-тест по сравнению с anova

    Это было сделано.

    https://doi.org/10.7554/eLife.36806.017 .

    Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *