Нк рф статья 16: Статья 16. Информация о налогах / КонсультантПлюс

Совет Федерации одобрил закон, отменяющий налоговую отчетность в отношении объектов недвижимости российских юрлиц, облагаемых налогом на имущество организаций исходя из кадастровой стоимости.

Такой порядок вводится с 2023 года, то есть за налоговый период 2022 года и последующие периоды. При этом налогоплательщики — российские организации перестанут включать в декларацию по налогу на имущество сведения об объектах, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость. Если у юрлица в истекшем налоговом периоде имелись только объекты, облагаемые налогом по кадастровой стоимости, налоговая декларация не представляется.

Для обеспечения полноты уплаты налога (сверки платежей) налоговые органы будут направлять организациям сообщения об исчисленных суммах налога. Представление налогоплательщиками пояснений и (или) документов, подтверждающих правильность исчисления, полноту и своевременность уплаты налога, обоснованность применения пониженных налоговых ставок, налоговых льгот или наличие оснований для освобождения от уплаты налога, рассмотрение пояснений и (или) документов осуществляются в порядке и сроки, предусмотренные пп. 4 — 7 ст. 363 НК РФ. Требование об уплате налога направляется организации, если выявлена недоимка по результатам рассмотрения её пояснений и (или) документов, либо если недоимка была выявлена при их отсутствии.

С 2022 года российские компании, имеющие право на льготы по налогу на имущество организаций в отношении объектов, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость, представляют в налоговый орган заявление о предоставлении такой льготы и подтверждающие документы. Рассмотрение заявления, направление налогоплательщику уведомления о предоставлении льготы либо сообщения об отказе осуществляются в порядке, предусмотренном п. 3 ст. 361.1 НК РФ. Если налогоплательщик, имеющий право на льготу, не представил в налоговый орган заявление о ее предоставлении или не сообщил об отказе от её применения, налоговая льгота предоставляется на основании сведений, полученных налоговым органом в соответствии с федеральными законами начиная с периода, в котором у налогоплательщика возникло право на льготу.

Кроме того, с 2022 года вводятся единые сроки уплаты налога на имущество организаций и авансовых платежей по нему. Так, налог следует уплатить не позднее 1 марта года, следующего за истекшим налоговым периодом, а авансовые платежи – не позднее последнего числа месяца, следующего за истекшим отчетным периодом.

Закон направлен для подписания Президенту России.

границ | Генетическая манипуляция NK-клетками для иммунотерапии рака: методы и клиническое значение

Введение

Естественные киллеры (NK) — это иммунные клетки, которые в основном обнаруживаются в крови, печени, селезенке, костном мозге и, в меньшей степени, в лимфатических узлах (1). Первоначально они были идентифицированы на основании их способности лизировать опухолевые клетки без необходимости прайминга (2–5). В настоящее время известно, что NK-клетки играют важную роль в иммунитете хозяина как против рака, так и против некоторых вирусных инфекций (6–8).

NK-клетки могут опосредовать цитотоксичность посредством множества различных механизмов. Дегрануляция — наиболее изученный путь цитотоксичности, при котором NK-клетки выделяют цитотоксические гранулы при контакте с мишенью. Цитотоксичность по этому пути определяется балансом сигналов от набора кодируемых зародышевой линией активационных и ингибирующих рецепторов клеточной поверхности. Большинству рецепторов активации требуется одновременная костимуляция другими рецепторами активации, чтобы вызвать цитотоксичность NK-клеток (9). Единственным исключением из этого правила является Fc-рецептор CD16, который сам по себе может запускать дегрануляцию NK-клеток против покрытых антителами клеток-мишеней посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (9).Другими путями, с помощью которых NK-клетки могут убивать мишени, являются пути рецепторов смерти TRAIL / TRAIL-R и Fas / FasL. Вместо того, чтобы запускать высвобождение цитотоксических гранул, пути рецептора смерти вызывают апоптоз через активацию каспазы в клетках-мишенях.

Прошло более десяти лет с тех пор, как в первых сообщениях был установлен противоопухолевый потенциал NK-клеток у больных раком. Эти исследования показали, что гаплоидентичные донорские NK-клетки могут предотвратить рецидив острого миелоидного лейкоза (AML) после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) и что адоптивно введенные зрелые донорские NK-клетки могут вызвать ремиссию у пациентов с AML (6, 10).Несмотря на это открытие, остаются сомнения относительно истинного терапевтического потенциала NK-клеток в иммунотерапии рака. В отличие от терапии с использованием Т-лимфоцитов, энтузиазм по поводу иммунотерапии на основе NK-клеток сдерживается неуверенностью в их устойчивости in vivo и сомнениями относительно их способности мигрировать в опухолевые ткани после адоптивных инфузий. Хотя недавние данные показали, что реактивация ЦМВ снижает риск рецидива ОМЛ после ТГСК (11), потенциально вызванного ЦМВ-индуцированными NK-клетками, перекрестно реагирующими с ОМЛ-клетками, NK-клетки, в отличие от Т-клеток, не обладают антигенной специфичностью, что еще больше снижает энтузиазм по поводу их использование в качестве иммунных эффекторов в клеточной терапии.

Генетические манипуляции с NK-клетками для улучшения их устойчивости, цитотоксичности, способности нацеливаться на опухоль и способности к локализации участков болезни in vivo имеет потенциал для повышения эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток. Однако до относительно недавнего времени генетические манипуляции с NK-клетками оказались сложной задачей. Вирусная трансдукция, успешно используемая для Т-клеток, была связана с низким уровнем экспрессии трансгена и неблагоприятным влиянием на жизнеспособность клеток при использовании с NK-клетками.Недавняя оптимизация вирусной трансдукции и создание технологий электропорации для эффективной трансфекции генов возродили энтузиазм в отношении исследований по оценке генетической модификации NK-клеток. Исследователи во всем мире в настоящее время изучают возможность генетического перепрограммирования множества различных модальностей NK-клеток с общей целью дальнейшего улучшения их способности уничтожать опухоли у онкологических больных. Одним из примеров того, как этот метод может быть использован, является введение генов в NK-клетки, кодирующие гамма-цитокины (IL-2 и IL-15), чтобы вызвать независимость от обязательной потребности экзогенных цитокинов для надлежащего in vivo персистентности и размножения после настой.Эта и аналогичные стратегии могут дополнительно повысить эффективность иммунотерапии на основе NK-клеток, поскольку, как сообщается, регресс опухоли после инфузии адоптивных NK-клеток у пациентов с AML зависит от их способности увеличивать in vivo (6), хотя и ограничивается регуляторные Т-клетки также мобилизовались после введения экзогенных цитокинов (12, 13). Введение химерных антигенных рецепторов (CAR) и подавление ингибирующих рецепторов NK-клеток, таких как NKG2A, являются дополнительными примерами специфических генетических манипуляций, которые можно использовать для улучшения результатов адоптивной иммунотерапии NK-клетками.

Учитывая быстрый и эффективный метод распознавания опухолевых клеток, NK-клетки представляют собой уникальную иммунную клетку, которую можно генетически перепрограммировать с целью улучшения результатов клеточной иммунотерапии рака. В этом обзоре рассматриваются методы введения трансгенов в NK-клетки, а также преимущества и ограничения таких стратегий. Он также дает обзор стратегий генетического репрограммирования NK-клеток, которые были оценены на сегодняшний день, и взгляд на то, как эти конкретные стратегии могут быть наилучшим образом использованы в клинике для максимизации противоопухолевого потенциала иммунотерапии на основе NK-клеток.

Методы и проблемы с генетической манипуляцией NK-клеток: вирусная трансдукция против трансфекции

Генетические манипуляции с Т-клетками успешно использовались как в доклинических, так и в клинических исследованиях (14). Напротив, исследования генно-инженерных NK-клеток исторически были ограничены низкой эффективностью доставки трансгена и существенным апоптозом NK-клеток, связанным с процедурой. В этом разделе мы обсуждаем доступные подходы для доставки генов в NK-клетки, характеризуя развитие каждого подхода с течением времени, выделяя положительные и отрицательные аспекты каждого метода (вставка 1).

Ящик 1 . Плюсы и минусы методов генетической модификации NK-клеток .

Вирусная трансдукция

Пониженная эффективность вирусной трансдукции NK-клеток по сравнению с T-клетками может частично быть связана с врожденными свойствами, которые характеризуют NK-клетки. Врожденные иммунные рецепторы, такие как рецепторы распознавания образов, которые распознают чужеродный геномный материал, вероятно, участвуют в запуске апоптоза NK-клеток после вирусной трансдукции (15).Наилучшие результаты исследований вирусной трансдукции NK-клеток были достигнуты с использованием линий NK-клеток или первичных NK-клеток, подвергшихся экспансии ex vivo (Таблица 1). Напротив, вирусная трансдукция первичных покоящихся NK-клеток человека обычно приводит к существенно более низкой эффективности трансдукции. В большинстве исследований вирусной трансдукции NK-клеток использовались ретро- и лентивирусные векторы. Хотя векторы вирусов аденовируса и осповакцины использовались для трансдукции NK-клеток, их использование было ограничено, и они не будут обсуждаться далее в этом обзоре.

Таблица 1 . Обзор методов, используемых для генетической модификации NK-клеток с указанием эффективности доставки генов и влияния на жизнеспособность клеток . ^а

Ретровирусные векторы были первыми вирусными векторами, использованными для генетической модификации NK-клеток. Первый отчет о ретровирусной трансдукции NK-клеток был опубликован в конце 1990-х годов и был посвящен генетическим манипуляциям с линией NK-клеток NK-92 (16).В этом исследовании сообщается об эффективности трансдукции всего 2–3%. Оптимизация подходов к ретровирусной трансдукции за последнее десятилетие привела к более высокой эффективности трансдукции, особенно при использовании с человеческими NK-клетками, которые подверглись экспансии ex vivo (Таблица 1). Недавний отчет показал, что ретровирусная трансдукция ex vivo увеличила NK-клетки с генами, кодирующими либо IL-15, либо мембраносвязанный IL-15 (mbIL-15), приводила к средней эффективности трансдукции 69 и 71% соответственно (25).Хотя сообщалось, что ретровирусная трансдукция NK-клеток не изменяет функцию, фенотип и пролиферативную способность NK-клеток (20, 23), об их жизнеспособности после ретровирусной трансдукции сообщалось редко. Существенное пагубное влияние на жизнеспособность первичных NK-клеток, подвергающихся ретровирусной трансдукции, может помешать использованию этого подхода в клинических условиях. Кроме того, ретровирусная трансдукция также требует активного деления клеток, что затрудняет использование этого метода с первичными неактивированными NK-клетками.Это ограничение менее важно, когда ретровирусная трансдукция используется с линиями NK-клеток, такими как NK-92, которые обладают непрерывной и неограниченной способностью к пролиферации. Однако, как обсуждается далее в этом обзоре, важно отметить, что эта линия NK-клеток действительно имеет фенотипические и функциональные отличия от первичных NK-клеток человека, что может иметь терапевтическое значение для клинической терапии.

Лентивирусные векторы

Совсем недавно были проведены исследования по оценке трансдукции NK-клеток с использованием лентивирусных векторов.В отличие от трансдукции ретро- и аденовирусными векторами, лентивирусные векторы могут включать трансгены в геном неделящихся клеток. Кроме того, лентивирусные векторы позволяют модификацию генов NK-клеток без изменения их фенотипических и функциональных свойств, как это происходит после стимуляции, например, цитокинами. Первое сообщение об успешном использовании лентивирусных векторов для генетической модификации NK-клеток было выполнено на первичных NK-клетках мыши (42), а последующие исследования установили, что лентивирусная трансдукция NK-клеток человека также может быть достигнута (Таблица 1).Хотя в большинстве исследований сообщается о лентивирусной трансдукции линий NK-клеток с эффективностью 15-40% (27, 28), эффективность сильно варьируется от нескольких процентов до почти 100%, а в некоторых случаях требуется несколько раундов трансдукции ( 26, 29). Последние данные показывают, что эффективность трансдукции первичных NK-клеток человека может быть увеличена за счет лекарственного ингибирования внутриклеточных рецепторов врожденного иммунитета в NK-клетках (15). К сожалению, как и в исследованиях с использованием ретровирусной трансдукции, о жизнеспособности NK-клеток после лентивирусной трансдукции сообщалось редко.Используя оптимизированный протокол, наша лаборатория достигла максимальной экспрессии трансгена в 60% из ex vivo NK-клеток через 3 дня после лентивирусной трансдукции GFP без каких-либо пагубных эффектов на жизнеспособность, фенотип или функцию NK-клеток (личное сообщение , Р. Чайлдс).

Таким образом, вирусная трансдукция NK-клеток приводит к вариабельной эффективности трансдукции и может потребовать нескольких раундов трансдукции и / или посттрансдукционного обогащения клеток для достижения приемлемой экспрессии трансгена.Кроме того, вирусная гибель клеток и потребность в обогащении после трансдукции могут поставить под угрозу клиническую применимость этого подхода. Наконец, хотя риск может быть низким, при использовании этой методологии в клинике необходимо учитывать возможность индуцированного вирусом инсерционного мутагенеза и иммуногенности (43, 44), возникающих после трансдукции. Тем не менее, вирусная трансдукция NK-клеток действительно обеспечивает стабильную экспрессию трансгена, которая, в зависимости от того, как NK-клетка подвергается генетической модификации, может потребоваться для индукции стойкого и длительного клинического ответа.

Трансфекция

По сравнению с вирусной трансдукцией, трансфекция NK-клеток, по-видимому, связана с более низкой степенью апоптоза, меньшей межиндивидуальной и межэкспериментальной вариабельностью, при этом эффективность доставки трансгена полностью не зависит от клеточного деления. В большинстве случаев этот подход приводит к более быстрой, хотя и временной, экспрессии трансгена по сравнению с вирусной трансдукцией, когда гены должны быть сначала включены в клеточный геном, прежде чем может произойти экспрессия.Перенос гена с использованием трансфекции может быть достигнут либо путем электропорации (включая нуклеофекции ), либо путем липофекции . Поскольку последний использовался только в нескольких исследованиях (45), в этом обзоре будут рассмотрены стратегии, использующие метод электропорации.

Электропорация — это метод, при котором генетический материал доставляется в клетки после короткого электрического импульса, который временно создает небольшие поры в клеточной мембране, позволяя заряженным молекулам, таким как ДНК и РНК, перемещаться в клетку.Эта технология была впервые использована с линиями NK-клеток в конце 1990-х годов (32, 36–38, 46, 47), а в последнее время использовалась для генетического манипулирования первичными NK-клетками для экспрессии CAR (35, 39, 48) или цитокинов для аутокринной системы. стимуляция роста (49). Благодаря техническому прогрессу и использованию мРНК вместо кДНК эффективность трансфекции резко возросла, достигая 90% или более, при этом оказывая лишь минимальное вредное воздействие на жизнеспособность клеток (таблица 1). Примечательно, что с помощью электропорации мРНК эффективность трансфекции 80–90% может быть достигнута не только в ex vivo увеличенных клетках, но также и в первичных покоящихся (не активированных цитокинами) человеческих NK-клетках (40).Несмотря на это замечательное достижение, подробная характеристика эффектов электропорации на фенотип, функцию и пролиферативную способность NK-клеток после электропорации еще не опубликована.

Поскольку электропорация не включает вирусные векторы, ее использование в доклинических и клинических условиях связано с меньшими проблемами регулирования. Кроме того, как указано выше, электропорация чаще всего приводит к временной экспрессии трансгена, что можно рассматривать с точки зрения безопасности, когда новые трансгены с неизвестной потенциальной токсичностью исследуются в ранних клинических испытаниях.Схемы, в которых используется технология электропорации ДНК, применялись для создания стабильных экспрессирующих трансген клеток. Хотя эффективность этого подхода обычно ниже, чем эффективность, достигаемая с помощью вирусной трансдукции, его можно улучшить, если комбинировать с методами целевой интеграции, которые позволяют избежать случайной интеграции в неактивных областях гетерохроматина. Такие стратегии также снижают риск нецелевых эффектов, включая молчание генов из-за случайной интеграции в активные гены и интеграции в горячих точках, которые могут вызвать злокачественную трансформацию.Обладая преимуществами в дизайне управляющих РНК и лучшей специфичностью по отношению к мишени по сравнению с другими технологиями редактирования генов, такими как нуклеаза Zink-Finger (ZFN) и технологиями эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), недавно разработанные технологии регулярно сгруппированы в короткие промежутки времени. Метод палиндромных повторов (CRISPR) быстро стал популярным инструментом для целевой интеграции генов (50). Система CRISPR / Cas9 вызывает постоянные модификации в определенных сайтах генома посредством двухцепочечных разрывов (DSB) и может использоваться для интеграции новых генов в определенные сайты посредством гомологически направленной рекомбинации (50).Хотя сегодня с помощью этого метода в настоящее время достигаются лишь умеренные степени интеграции генома, систему CRISPR / Cas9 можно использовать для получения стабильно трансдуцированных NK-клеток путем редактирования генов первичных NK-клеток до их экспансии ex vivo .

Стратегии модификации генов, направленные на повышение эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток

Благодаря новым достижениям в этой области генетические манипуляции с NK-клетками открыли возможности для изучения множества различных путей, участвующих в нацеливании NK-клеток на опухоль, и способности генетически модифицировать NK-клетки для улучшения их цитотоксичности опухоли.Здесь мы обсудим описанные стратегии модификации генов, которые могут улучшить устойчивость и распространение in vivo , миграцию опухолевой ткани и способность адоптивно введенных NK-клеток к опухоли (рисунок 1, таблица 2 и вставка 2).

Рис. 1. Схематический обзор того, как генетические манипуляции могут быть использованы для повышения эффективности иммунотерапии рака на основе NK-клеток в клинике . Генетическая инженерия NK-клеток для обеспечения устойчивости и размножения за счет стимуляции аутокринных цитокинов, миграции в опухолевую ткань посредством введения рецепторов, участвующих в клеточном хоминге (т.е., хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии), а также усиление их противоопухолевой цитотоксичности посредством введения CAR или активации рецепторов NK-клеток (aNKR) или посредством подавления ингибиторных рецепторов NK-клеток (iNKR), защиты от супрессивных цитокинов в опухоли. окружающей среды и усиление функции за счет стимуляции аутокринных цитокинов.

Таблица 2 . Обзор стратегий, оцененных для улучшения противоопухолевой эффективности первичных человеческих NK-клеток и линий NK-клеток in vitro и на доклинических моделях животных .

Ящик 2 . Примеры модальностей NK-клеток для манипулирования генами для повышения клинической эффективности .

Стратегии повышения устойчивости и увеличения количества введенных NK-клеток

Было показано, что сохранение и размножение инфузированных NK-клеток in vivo имеет решающее значение для индукции регрессии опухоли после инфузии адоптивных NK-клеток (6). Используя ретровирусную трансдукцию гена IL-2 в клетки NK-92, Nagashima et al.смогли размножить эту линию NK-клеток до 5 месяцев in vitro без добавления экзогенных цитокинов (16). Кроме того, было показано, что экспрессирующие IL-2 клетки NK-92 также обладают повышенной цитотоксичностью опухоли по сравнению с нетрансдуцированными родительскими клетками NK-92, которые стимулировались экзогенным IL-2. В соответствии с этими данными in vitro , эти генетически модифицированные клетки показали улучшенную устойчивость in vivo и противоопухолевые ответы при введении мышам с опухолями.Аналогичные данные о доставке гена IL-2 в увеличенные NK-клетки были получены Konstantinidis et al. (51). Как наблюдали с трансдуцированными IL-2 клетками NK-92, ретровирусная трансдукция ex vivo NK-клеток с геном mbIL15 также резко увеличивала их выживаемость in vitro ; Среднее восстановление клеток составляло 85% для NK-клеток mbIL-15 после 7 дней культивирования без IL-2, тогда как ложно-трансдуцированные NK-клетки практически не определялись (25). Следовательно, стратегия введения генов, кодирующих гамма-цитокины, для улучшения персистенции и размножения in vivo NK-клеток после инфузии, независимо от введения экзогенных цитокинов, представляется многообещающей.

Стратегии увеличения миграции инфузированных NK-клеток

Правильное возвращение инфузированных NK-клеток в опухолевую ткань является предпосылкой их способности вызывать регрессию опухоли. Однако исследования, характеризующие способность in vivo к миграции адоптивно введенных NK-клеток, в значительной степени игнорировались (60). Недавние данные свидетельствуют о том, что нерасширенные и увеличенные NK-клетки имеют разные паттерны миграции при введении в модели животных (61). Более того, используя трогоцитоз для переноса предварительно созданных молекул клеточной поверхности из линии питающих клеток в NK-клетки, Somanshi et al.показали, что миграция инфузированных NK-клеток может быть перенаправлена ​​путем оснащения их рецептором нахождения в лимфатических узлах CCR7 (62). Несмотря на эти данные, до сих пор ни в одном исследовании не использовались методы модификации генов для активного направления инфузированных NK-клеток к выбранным органам. Основываясь на данных Somanshi et al., Мы смогли использовать трансфекцию мРНК для генной инженерии NK-клеток с рецептором CCR7, чтобы улучшить их миграцию к одному из его лигандов CCL19 (Carlsten M., Manuscript in training, April 2015).Другие стратегии могут включать использование хемокиновых рецепторов, таких как CXCR3, для улучшения миграции NK-клеток в воспаленные ткани, например, инфильтрованные метастатическими опухолями (63).

Стратегии повышения цитотоксичности опухоли за счет инфузии NK-клеток

Большинство сообщений об экспрессии трансгенов в NK-клетках охарактеризовали эффекты CAR в линиях NK-клеток, увеличенных NK-клетках и первичных нерасширенных NK-клетках (Таблица 2). CAR представляют собой сконструированные рецепторы, которые обладают внеклеточной специфичностью антитела в сочетании с мощными адаптерами внутриклеточной передачи сигналов, такими как CD3ζ, CD28 и / или 4-1BB.Важно отметить, что эти рецепторы не требуют стимуляции через корецепторы, чтобы вызвать сильную противоопухолевую цитотоксичность. Недавний прорывной успех терапии Т-клетками против CD19 CAR у пациентов со злокачественными опухолями В-клеток стимулировал исследовательское сообщество к разработке и исследованию широкого спектра CAR против множества различных эпитопов, экспрессируемых на многих типах опухолей (64). Некоторые из этих CAR были исследованы в NK-клетках (Таблица 2). CD19 и CD20-специфические CAR против В-клеточных злокачественных новообразований (39–41, 53, 54) и CAR, нацеленные на CD33 на лейкозные клетки (38), CS1 и CD138 на миеломные клетки (24, 48, 55), GD2 на клетки нейробластомы (23 , 56), Her2 / Neu и erbB2 на клетках рака груди (22, 35), карциноэмбриональный антиген (CEA) на рак толстой кишки (36), EpCAM на эпителиальных опухолях (29), GPA7 на меланоме (59), лиганд NKG2D на лейкоз и солидные опухоли, и было показано, что TRAIL-R1 на различных опухолевых мишенях (58) обладает способностью перенаправлять цитотоксичность NK-клеток против их целевых антигенов.В большинстве этих исследований для трансдукции CAR в NK-клетки использовались вирусные векторы, хотя электропорация также использовалась в нескольких исследованиях (таблица 2).

На основании клинических данных, показывающих более высокую частоту ответа у пациентов с лимфомой, леченных ритуксимабом, гомозиготных по высокоаффинному полиморфизму CD16-158V (HA-CD16) по сравнению с пациентами с низкоаффинным полиморфизмом CD16-158F (LA-CD16) (65 , 66), несколько групп недавно рассмотрели вопрос о том, может ли введение гена HA-CD16 в NK-клетки, лишенные этого полиморфизма, использоваться в качестве стратегии для увеличения ADCC против опухолей.Этот подход привлекателен, поскольку лишь небольшая часть пациентов гомозиготна по HA-CD16 (67). Более того, в отличие от CAR NK-клеток, инфузии NK-клеток, генетически модифицированных для экспрессии HA-CD16, можно использовать для улучшения исхода практически любого злокачественного новообразования, для которого существует одобренное FDA антитело IgG1, без каких-либо серьезных побочных эффектов. -эффекты. Эксперименты in vitro , проведенные Биньямином и его коллегами, показали значительно улучшенную цитотоксичность в отношении линии клеток B-лимфомы, покрытой ритуксимабом, после стабильной трансдукции CD16-отрицательной линии клеток NK-92 HA-CD16 по сравнению с клетками NK-92, оснащенными LA- CD16 (19).Недавно наша группа исследовала аналогичный подход, когда было обнаружено, что ex vivo NK-клеток от доноров CD16-158F / F (LA-CD16) существенно увеличили ADCC после электропорации с мРНК, кодирующей HA-CD16 (68). Эти данные предполагают, что добавление гена HA-CD16 к NK-клеткам пациента, которые уже экспрессируют эндогенный CD16, можно использовать для увеличения их способности индуцировать ADCC, и что этот подход может использоваться в качестве стратегии для повышения эффективности терапии на основе антител. для онкологических больных.

Также изучалось введение генов, которые делают NK-клетки нечувствительными к супрессивным цитокинам, таким как TGF-β, тем самым сохраняя их цитотоксичность. Ян и др. создали линию клеток NK-92, устойчивую к супрессивным эффектам TGF-β, путем генетической модификации их для экспрессии на своей поверхности доминантно-отрицательной мутантной формы рецептора TGF-β типа II (DNTβRII) (34). Адоптивный перенос этих нечувствительных к TGF-β клеток NK-92 у мышей, несущих рак легкого, был связан с повышенными уровнями IFN-γ, высвобождаемого из инфузированных клеток, и приводил к увеличению выживаемости по сравнению с мышами, обработанными NK-92 дикого типа.

Генетическое репрограммирование NK-клеток также может быть направлено на достижение специфического молчания белков с целью улучшения нацеливания на опухоль путем обхода ингибирующих сигналов NK-клеток, индуцированных при взаимодействии с опухолевыми клетками. Первоначальные исследования были сосредоточены на использовании для этой цели технологии shRNA. В этом контексте shРНК, экспрессируемые внутри клеток, процессируются эндонуклеазным комплексом Dicer для создания двухцепочечных малых интерферирующих РНК, которые предотвращают трансляцию их целевых мРНК (69), shРНК успешно используются для подавления экспрессии HLA-E- связывание ингибиторного рецептора NK-клеток NKG2A (31).Используя индуцибельный вектор в NK-клетках, активированных IL-2, Figueiredo et al. наблюдали увеличение на 40% способности убивать экспрессирующие HLA-E клеточные линии K562 HLA-E. Используя аналогичный подход с линией NK-клеток NKL, наша группа наблюдала повышенную убивающую способность HLA-E, экспрессирующего 721,221 клеток , in vitro и на доклинической модели мыши (70). Дополнительные подробности о протоколах shRNA-опосредованного сайленсинга белка в NK-клетках можно найти в Purdy et al. (71). На сегодняшний день об исследованиях с использованием CRISPR, ZFN или TALEN для генетической модификации NK-клеток для подавления их ингибирующих рецепторов с той же целью повышения противоопухолевой способности NK-клеток еще не сообщалось.

В заключение, в настоящее время описан ряд стратегий модификации генов для NK-клеток. Некоторые из них обещают улучшить клинические реакции на иммунотерапию рака на основе NK-клеток. Однако на сегодняшний день лишь немногие из них были переведены в клинические исследования. В следующем разделе будет обсуждаться, как эти стратегии могут быть включены в клиническую иммунотерапию NK-клеточного рака.

Рекомендации по разработке клинических протоколов с использованием генно-инженерных NK-клеток

Проблемы, связанные с генетическими манипуляциями с NK-клетками, значительно задержали дебют этой стратегии в клинической терапии рака.Хотя недавно начатые испытания (NCT00995137 и NCT01974479), использующие роль CAR19-экспрессирующих ex vivo увеличенных NK-клеток у пациентов со злокачественными опухолями В-клеток, дадут нам первое представление о потенциале этого подхода; Дальнейшая оптимизация клинически совместимых методов генетических модификаций NK-клеток необходима для использования всего клинического потенциала этого подхода. Более того, необходимы дополнительные исследования множества аспектов нацеливания на опухоли NK-клеток, которые можно было бы изменить с помощью этого метода.Хотя клинические реакции после инфузии NK-клеток могут быть дополнительно улучшены путем простого увеличения их способности нацеливаться на опухоль, исследования, оценивающие потенциал этой технологии для улучшения устойчивости инфузированных клеток, а также способы стимулирования правильной миграции NK-клеток и их нахождения в опухолевой ткани. также имеют гарантию (Рисунок 1).

Генетическая инженерия NK-клеток, чтобы сделать их цитокин-независимыми и, таким образом, улучшить их устойчивость при одновременном повышении их цитотоксической способности, может быть одним из направлений для дальнейшего изучения.Преимущество этого подхода будет заключаться в том, что экзогенные цитокины будут ненужными после инфузии NK-клеток, что может снизить риск мобилизации регуляторных Т-клеток, которые напрямую подавляют цитотоксичность NK-клеток (13). Проблемы с применением этого подхода в клиническом контексте включают риск индуцирования синдрома высвобождения цитокинов из-за массивной и нерегулируемой пролиферации NK-клеток. Этот подход также сопряжен с потенциальным риском индуцирования злокачественной трансформации NK-клеток из-за постоянной аутокринной стимуляции роста, как это наблюдалось для Т-клеток, сконструированных с помощью IL-2 (72).Однако таких сценариев можно избежать, если гены, кодирующие IL-2 или IL-15, вводятся только временно посредством электропорации мРНК NK-клеток. Если для индуцирования надлежащей регрессии опухоли требуется стабильная экспрессия трансгена, альтернативной стратегией предотвращения беглой пролиферации NK-клеток может быть введение индуцибельного суицидного гена в модифицированные клетки (73).

Миграция в опухолевую ткань — еще один аспект, определяющий правильное нацеливание на опухоль. Этот аспект в значительной степени упускается из виду и потенциально может улучшить клинический результат, если введенные NK-клетки будут перенаправлены к месту опухоли вместо неспецифической циркуляции в тканях, в основном не несущих опухоль.Никаких исследований, направленных на улучшение хоминга in vivo инфузированных генно-инженерных NK-клеток, еще не опубликовано.

Как обсуждалось выше, были исследованы многочисленные стратегии перенаправления или усиления NK-клеток, убивающих опухоль in vitro . Внедрение CAR представляет собой наиболее изученный и разработанный подход, который недавно прошел клиническую оценку (Таблица 2). Экспрессия высокоаффинного CD16 вскоре также может быть протестирована в клинических условиях, поскольку этот подход можно комбинировать с уже клинически доступными моноклональными антителами, которые нацелены на множество антигенов, экспрессируемых на различных типах опухолей.Повышение цитотоксичности NK-клеток посредством стимуляции аутокринных цитокинов или посредством подавления ингибирующих рецепторов NK-клеток, вероятно, потребует дополнительной оценки на доклинических моделях на животных, прежде чем они могут быть включены в клинические протоколы. После того, как все эти стратегии будут полностью охарактеризованы доклинически, они могут быть объединены для дальнейшего повышения полного противоопухолевого потенциала адоптивно перенесенных NK-клеток. Например, введение CAR с одновременным подавлением подавления рецептора, ингибирующего NKG2A, может представлять один из таких будущих подходов.Можно также рассмотреть возможность добавления стимуляции аутокринными цитокинами для дальнейшего улучшения цитотоксичности при одновременном поддержании их устойчивости in vivo . Поскольку дегрануляция NK-клеток регулируется балансом активирующих и ингибирующих сигналов от четко определенных рецепторов клеточной поверхности, также можно добавить CAR или другие рецепторы активации вместе с выбранными рецепторами, которые опосредуют ингибирование через лиганды, которые экспрессируются в нормальных тканях ( а не опухолевые клетки), тем самым давая генетически перепрограммированным NK-клеткам дополнительный уровень целевой специфичности.Однако потребуется много дополнительных доклинических исследований, прежде чем эти подходы станут доступны в клинике.

Выбор метода генетического репрограммирования NK-клеток — еще один важный фактор, который необходимо учитывать при проведении генетической инженерии NK-клеток для клинической оценки. Вирусная трансдукция имеет преимущество стабильной экспрессии; однако, как упоминалось выше, вирусная трансдукция NK-клеток, особенно первичных клеток, не всегда приводит к удовлетворительному уровню экспрессии трансгена и может потребовать нескольких раундов трансдукции с последующим отбором трансген-положительных клеток.Более того, правильная экспрессия трансгенов, индуцированная вирусной трансдукцией, может занять несколько дней, что может иметь недостатки, поскольку продолжительность жизни NK-клетки может быть относительно короткой после адоптивного переноса (т.е. недели). Необходимы будущие исследования, чтобы лучше понять, могут ли многократные инфузии трансфицированных NK-клеток компенсировать временную экспрессию трансгена или стабильная экспрессия трансгена является предпосылкой для индукции клинических ответов после адоптивного переноса NK-клеток, созданных с помощью генной инженерии.Также необходимы исследования для полного понимания продолжительности жизни NK-клеток, особенно тех, которые подверглись манипуляции ex vivo .

Оптимальный метод генетической манипуляции с NK-клетками, который будет использоваться в клинических испытаниях, также может зависеть от того, какой препарат NK-клеток используется (вставка 3). Преимущество линий NK-клеток состоит в том, что их можно использовать в качестве готового продукта, стабильно трансдуцированного для экспрессии интересующего гена или генов. Они также могут быть долгоживущими при правильной цитокиновой поддержке.Однако недостатком использования линий NK-клеток, таких как NK-92, является необходимость облучения (10 Гр) перед инфузией, чтобы избежать риска приживления потенциально канцерогенных клеток in vivo (74). Более того, пациенты, получавшие инфузии линий NK-клеток, также должны будут нуждаться в предварительном кондиционировании от умеренного до высокого для подавления иммунитета хозяина, чтобы избежать отторжения этих аллогенных клеток. Более того, инфузия аллогенных клеток может повысить гуморальный иммунитет и привести к адаптивным Т-клеточным иммунным ответам, специфичным против аллоантигенов, что исключает повторные инфузии даже с использованием предварительного кондиционирования.Подобную аллореактивность можно вызвать с помощью инфузий первичных аллогенных NK-клеток. Использование аутологичных NK-клеток позволяет избежать этих рисков и исключает необходимость предварительного кондиционирования. Потенциальный недостаток использования аутологичных NK-клеток заключается в том, что эффективное нацеливание на опухоль может быть предотвращено посредством ингибирующих взаимодействий KIR с собственным HLA. Потенциальное преимущество использования линии NK-клеток по сравнению с первичными NK-клетками состоит в том, что можно вливать большое количество NK-клеток из линии NK-клеток, тогда как количество первичных клеток, доступных для инфузии, обычно гораздо более ограничено.Однако это ограничение недавно удалось обойти с помощью ряда высокоэффективных методов размножения первичных NK-клеток ex vivo для клинической инфузии (60). В идеале можно использовать инфузию аутологичных генно-модифицированных NK-клеток, чтобы избежать риска отторжения и предварительного условия. Один из подходов к преодолению ограничений инактивации аутологичных NK-клеток посредством собственного HLA состоит в том, чтобы генетически модифицировать эти эффекторы для подавления ингибирующих рецепторов связывания собственных HLA, таких как NKG2A и KIR, которые сами по себе или в комбинации, например, с CAR, могут улучшить нацеливание на опухоль. емкость NK-клеток в аутологичных условиях.

Ящик 3 . Источник NK-клеток для адоптивной иммунотерапии рака NK-клеток .

Заключительные замечания

Противоопухолевые антитела и CAR-Т-клетки сделали иммунотерапию жизнеспособным вариантом лечения больных раком. Благодаря быстрому и эффективному методу распознавания опухолевых клеток, NK-клетки представляют собой уникальную иммунную клетку, которую можно генетически перепрограммировать с целью улучшения результатов клеточной иммунотерапии рака.Однако технические и биологические проблемы, связанные с доставкой генов в NK-клетки, значительно смягчили этот подход. Вирусная трансдукция NK-клеток первоначально приводила к низкой эффективности доставки трансгена, что часто требовало нескольких раундов трансдукции и / или клеточного обогащения для достижения приемлемого количества клеток, экспрессирующих трансген. Тем не менее, недавние улучшения в ретро- и лентивирусной трансдукции NK-клеток привели к целому ряду доклинических исследований NK-клеток, созданных с помощью генной инженерии.Ряд исследований также показал, что NK-клетки можно генетически репрограммировать с помощью электропорации мРНК. В отличие от вирусной трансдукции, этот подход обеспечивает высокую эффективность трансфекции без ущерба для их жизнеспособности и не требует лабораторий высокого уровня биобезопасности. Хотя в последнее время появились многообещающие доклинические данные об электропорированных мРНК NK-клетках, возникли опасения относительно клинической применимости этого подхода, поскольку он приводит только к временной экспрессии трансгена.

Недавно начатые клинические испытания скоро дадут представление о потенциальной эффективности стратегий клеточной иммунотерапии рака, в которых используются генетически модифицированные NK-клетки. Тем не менее, дальнейшая оптимизация как вирусной трансдукции, так и электропорации NK-клеток все еще необходима, прежде чем этот подход можно будет полностью использовать в клинике. Благодаря недавнему прогрессу в нашем понимании сложных биологических сетей, которые регулируют способность NK-клеток нацеливаться и уничтожать опухоли in vivo , а также с быстрым развитием клинически совместимых методов генетического манипулирования NK-клетками, мы предвидим генную инженерию как обязательную Путь к использованию всего потенциала адоптивной иммунотерапии NK-клетками у больных раком.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность всем членам Лаборатории трансплантационной иммунотерапии NHLBI, Отделу интрамуральных исследований (DIR) NHLBI, Шведскому исследовательскому совету, стипендию декана Р. О’Нила и Эдварда Ранчика по исследованию рака за их большой вклад. и поддержка оригинального исследования, описанного в этой рукописи.

Список литературы

1. Грегуар С., Чассон Л., Люси С., Томаселло Е., Гейссманн Ф., Вивье Е. и др. Торговля естественными клетками-киллерами. Immunol Rev (2007) 220 : 169–82. DOI: 10.1111 / j.1600-065X.2007.00563.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Герберман РБ, Нанн М.Э., Холден ХТ, Лаврин Д.Х. Естественная цитотоксическая реактивность лимфоидных клеток мыши против сингенных и аллогенных опухолей.II. Характеристика эффекторных клеток. Int J Cancer (1975) 16 : 230–9. DOI: 10.1002 / ijc.2

0204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Герберман РБ, Нанн М.Э., Лаврин Д.Х. Естественная цитотоксическая реактивность лимфоидных клеток мыши против аллогенных опухолей сингенной кислоты. I. Распределение реактивности и специфичности. Int J Cancer (1975) 16 : 216–29. DOI: 10.1002 / ijc.2

0204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Кисслинг Р., Кляйн Э., Прос Х., Вигзелл Х. «Естественные» клетки-киллеры у мышей. II. Цитотоксические клетки со специфичностью к клеткам лейкемии Молони мышей. Характеристики клетки-киллера. Eur J Immunol (1975) 5 : 117–21. DOI: 10.1002 / eji.1830050208

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Кисслинг Р., Кляйн Э., Вигзелл Х. «Естественные» клетки-киллеры у мышей. I. Цитотоксические клетки со специфичностью в отношении клеток лейкемии Молони мышей. Специфичность и распределение по генотипу. Eur J Immunol (1975) 5 : 112–7. DOI: 10.1002 / eji.1830050208

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Миллер Дж. С., Суанье Ю., Паноскальцис-Мортари А., Макнирни С. А., Юн Г. Х., Фауч С. К. и др. Успешный адоптивный перенос и экспансия гаплоидентичных NK-клеток человека in vivo у больных раком. Кровь (2005) 105 : 3051–7. DOI: 10.1182 / кровь-2004-07-2974

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Фоли Б., Кули С., Вернерис М. Р., Куртсингер Дж., Луо Х, Уоллер Е. К. и др. Индуцированные цитомегаловирусом человека (CMV) NKG2C (+) NK-клетки типа памяти можно трансплантировать и размножать in vivo в ответ на антиген CMV реципиента. J Immunol (2012) 189 : 5082–8. DOI: 10.4049 / jimmunol.1201964

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Фоли Б., Кули С., Вернерис М. Р., Питт М., Куртсингер Дж., Луо Х и др. Реактивация цитомегаловируса после аллогенной трансплантации способствует длительному увеличению образованных естественных клеток-киллеров NKG2C + с мощной функцией. Кровь (2012) 119 : 2665–74. DOI: 10.1182 / кровь-2011-10-386995

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Bryceson YT, Ljunggren HG, Long EO. Минимальные требования для индукции естественной цитотоксичности и пересечения сигналов активации ингибирующими рецепторами. Кровь (2009) 114 : 2657–66. DOI: 10.1182 / кровь-2009-01-201632

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Руджери Л., Капанни М., Урбани Э., Перруччо К., Шломчик В.Д., Тости А. и др. Эффективность аллореактивности донорских естественных клеток-киллеров в несоответствующих гемопоэтических трансплантатах. Наука (2002) 295 : 2097–100. DOI: 10.1126 / science.1068440

CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Эльмаагачли А.Х., Стекель Н.К., Колдехофф М., Хегерфельдт Ю., Треншель Р., Дичковски М. и др. Ранняя репликация цитомегаловируса человека после трансплантации связана со снижением риска рецидива: данные о предполагаемом эффекте вирусной лейкемии у пациентов с острым миелоидным лейкозом. Кровь (2011) 118 : 1402–12.DOI: 10.1182 / кровь-2010-08-304121

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Бачанова В., Кули С., Дефор Т.Е., Вернерис М.Р., Чжан Б., Маккенна Д.Х. и др. Клиренс острого миелоидного лейкоза гаплоидентичными естественными клетками-киллерами улучшается при использовании слитого белка дифтерийного токсина IL-2. Кровь (2014) 123 : 3855–63. DOI: 10.1182 / кровь-2013-10-532531

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Ито С., Боллард С.М., Карлстен М., Меленхорст Дж. Дж., Бьянкотто А., Ван Э. и др. Сверхмалые дозы интерлейкина-2 стимулируют иммуномодулирующую функцию регуляторных Т-клеток и естественных киллеров у здоровых добровольцев. Mol Ther (2014) 22 : 1388–95. DOI: 10.1038 / mt.2014.50

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Сутлу Т., Нистром С., Гилджам М., Стеллан Б., Эпплквист С.Е., Алиси Э. Ингибирование внутриклеточных механизмов противовирусной защиты усиливает лентивирусную трансдукцию естественных клеток-киллеров человека: значение для генной терапии. Hum Gene Ther (2012) 23 : 1090–100. DOI: 10.1089 / hum.2012.080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Нагашима С., Мейлиард Р., Кашии Ю., Райхерт Т.Э., Херберман Р.Б., Роббинс П. и др. Стабильная трансдукция гена интерлейкина-2 в линии естественных киллеров человека и их фенотипические и функциональные характеристики in vitro и in vivo. Кровь (1998) 91 : 3850–61.

PubMed Аннотация | Google Scholar

17. Юса С., Катина Т.Л., Кэмпбелл К.С. SHP-1- и фосфотирозин-независимая ингибирующая передача сигналов цитоплазматическим доменом Ig-подобного рецептора киллерных клеток в человеческих NK-клетках. J Immunol (2002) 168 : 5047–57. DOI: 10.4049 / jimmunol.168.10.5047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Бекнелл Б., Тротта Р., Ю Дж., Динг В., Мао Х.С., Хьюз Т. и др.Эффективное инфицирование естественных клеток-киллеров человека гибридным вектором ВЭБ / ретровирус. J Immunol Methods (2005) 296 : 115–23. DOI: 10.1016 / j.jim.2004.11.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Биньямин Л., Альпау Р.К., Хьюз Т.Л., Лутц К.Т., Кэмпбелл К.С., Вайнер Л.М. Блокирование ингибирующего самораспознавания NK-клеток способствует антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели противолимфомной терапии. J Immunol (2008) 180 : 6392–401. DOI: 10.4049 / jimmunol.180.9.6392

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Guven H, Konstantinidis KV, Alici E, Aints A, Abedi-Valugerdi M, Christensson B, et al. Эффективный перенос генов в первичные естественные клетки-киллеры человека с помощью ретровирусной трансдукции. Exp Hematol (2005) 33 : 1320–8. DOI: 10.1016 / j.exphem.2005.07.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Имаи С., Ивамото С., Кампана Д. Генетическая модификация первичных естественных клеток-киллеров преодолевает тормозящие сигналы и индуцирует специфическое уничтожение лейкемических клеток. Кровь (2005) 106 : 376–83. DOI: 10.1182 / кровь-2004-12-4797

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Крушинский А., Мосманн А., Пошке И., Норелл Х., Хмелевский М., Селигер Б. и др. Конструирование антиген-специфических первичных NK-клеток человека против HER-2-положительной карциномы. Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105 : 17481–6. DOI: 10.1073 / pnas.0804788105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Альтватер Б., Ландмайер С., Пшерер С., Темме Дж., Швир К., Кайлаянгири С. и др. Передача сигнала 2B4 (CD244) рекомбинантными антигенспецифическими химерными рецепторами костимулирует активацию естественных клеток-киллеров в клетки лейкемии и нейробластомы. Clin Cancer Res (2009) 15 : 4857–66.DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-08-2810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Чанг Й.Х., Коннолли Дж., Шимасаки Н., Мимура К., Коно К., Кампана Д. Химерный рецептор со специфичностью NKG2D усиливает активацию естественных клеток-киллеров и уничтожение опухолевых клеток. Cancer Res (2013) 73 : 1777–86. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-12-3558

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25.Имамура М., Шук Д., Камия Т., Шимасаки Н., Чай С.М., Кустан-Смит Э. и др. Автономный рост и повышенная цитотоксичность естественных клеток-киллеров, экспрессирующих мембраносвязанный интерлейкин-15. Кровь (2014) 124 : 1081–8. DOI: 10.1182 / кровь-2014-02-556837

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Микуччи Ф., Зингони А., Пикколи М., Фрати Л., Сантони А., Галандрини Р. Высокоэффективный перенос генов, опосредованный лентивирусным вектором, в первичные NK-клетки человека. Exp Hematol (2006) 34 : 1344–52. DOI: 10.1016 / j.exphem.2006.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Саван Р., Чан Т., Янг Х.А. Трансдукция лентивирусных генов в линиях NK-клеток человека и мыши. Методы Мол Биол (2010) 612 : 209–21. DOI: 10.1007 / 978-1-60761-362-6_14

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Буассель Л., Бетанкур М., Лу В., Вельс В.С., Марино Т., Ван Эттен Р.А. и др. Сравнение мРНК и лентивирусной трансфекции естественных клеток-киллеров с химерными антигенными рецепторами, распознающими лимфоидные антигены. Лимфома Leuk (2012) 53 : 958–65. DOI: 10.3109 / 10428194.2011.634048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Сам С., Шонфельд К., Вельс В.С. Экспрессия IL-15 в NK-клетках приводит к быстрому обогащению и селективной цитотоксичности генно-модифицированных эффекторов, которые несут опухолеспецифический рецептор антигена. Cancer Immunol Immunother (2012) 61 : 1451–61. DOI: 10.1007 / s00262-012-1212-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Baeriswyl V, Wodnar-Filipowicz A, Kalberer CP. Эффект подавления NKG2D посредством РНК-интерференции на рецепторные функции в активируемых интерлейкином-2 естественных клетках-киллерах человека. Haematologica (2006) 91 : 1538–41.

PubMed Аннотация | Google Scholar

32.Маашо К., Марусина А., Рейнольдс Н.М., Колиган Дж. Э., Боррего Ф. Эффективный перенос генов в линию естественных киллеров человека, NKL, с использованием системы нуклеофекции амакса. J Immunol Methods (2004) 284 : 133–40. DOI: 10.1016 / j.jim.2003.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Ян Б., Лю Х., Ши В., Ван З., Сунь С., Чжан Г. и др. Блокирование сигнального пути трансформирующего фактора роста-бета усиливает противоопухолевый эффект адоптивной терапии клетками NK-92. Int Immunopharmacol (2013) 17 : 198–204. DOI: 10.1016 / j.intimp.2013.06.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Лю Х., Ян Б., Сунь Т., Линь Л., Ху Й., Дэн М. и др. Специфическое подавление роста клеток рака молочной железы человека, экспрессирующих ErbB2, генетически модифицированными клетками NK92. Oncol Rep (2015) 33 : 95–102. DOI: 10.3892 / или 2014.3548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Schirrmann T, Pecher G. Линия естественных клеток-киллеров человека, модифицированная геном химерного иммуноглобулинового Т-клеточного рецептора, приводит к ингибированию роста опухоли in vivo. Cancer Gene Ther (2002) 9 : 390–8. DOI: 10.1038 / sj.cgt.7700453

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Grund EM, Muise-Helmericks RC. Экономичный и эффективный перенос гена в линию естественных клеток-киллеров человека, NK92. J Immunol Methods (2005) 296 : 31–6.DOI: 10.1016 / j.jim.2004.10.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Ширрманн Т., Печер Г. Специфическое нацеливание лейкозных клеток CD33 (+) линией естественных клеток-киллеров, модифицированной химерным рецептором. Leuk Res (2005) 29 : 301–6. DOI: 10.1016 / j.leukres.2004.07.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39.Boissel L, Betancur M, Wels WS, Tuncer H, Klingemann H. Трансфекция мРНК для CD19-специфического рецептора химерного антигена восстанавливает опосредованное NK-клетками уничтожение клеток CLL. Leuk Res (2009) 33 : 1255–9. DOI: 10.1016 / j.leukres.2008.11.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Ли Л., Лю Л.Н., Феллер С., Аллен С., Шивакумар Р., Фратантони Дж. И др. Экспрессия химерных антигенных рецепторов в естественных клетках-киллерах невирусным методом, совместимым с нормативными требованиями. Cancer Gene Ther (2010) 17 : 147–54. DOI: 10.1038 / cgt.2009.61

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Шимасаки Н., Фудзисаки Х., Чо Д., Масселли М., Локки Т., Элдридж П. и др. Клинически адаптируемый метод повышения цитотоксичности естественных клеток-киллеров против злокачественных новообразований B-клеток. Цитотерапия (2012) 14 : 830–40. DOI: 10.3109 / 14653249.2012.671519

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45.Чжан Дж., Сун Р., Вэй Х, Чжан Дж., Тиан З. Характеристика линии естественных киллеров человека, модифицированной геном стволовых клеток, клеток NK-92: участие в адоптивной клеточной иммунотерапии на основе NK-клеток. Oncol Rep (2004) 11 : 1097–106. DOI: 10.3892 / или 11.5.1097

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. ​​Лю Дж. Х., Вэй С., Бланшар Д. К., Джеу Дж. Восстановление литической функции в линии естественных киллеров человека путем трансфекции генов. Cell Immunol (1994) 156 : 24–35. DOI: 10.1006 / cimm.1994.1150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Daldrup-Link HE, Meier R, Rudelius M, Piontek G, Piert M, Metz S, et al. Отслеживание in vivo генетически сконструированных, направленных против HER2 / neu естественных клеток-киллеров на HER2 / neu-положительные опухоли молочной железы с помощью магнитно-резонансной томографии. Eur Radiol (2005) 15 : 4–13.DOI: 10.1007 / s00330-004-2526-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Цзян Х., Чжан В., Шан П., Чжан Х., Фу В., Е Ф и др. Трансфекция химерного гена анти-CD138 усиливает активацию естественных клеток-киллеров и уничтожение клеток множественной миеломы. Mol Oncol (2014) 8 : 297–310. DOI: 10.1016 / j.molonc.2013.12.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49.Jiang W, Zhang J, Tian Z. Функциональная характеристика трансдукции гена интерлейкина-15 в линию естественных киллерных клеток человека NKL. Цитотерапия (2008) 10 : 265–74. DOI: 10.1080 / 14653240801965156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Konstantinidis KV, Alici E, Aints A, Christensson B, Ljunggren HG, Dilber MS. Нацеливание ИЛ-2 на эндоплазматический ретикулум ограничивает аутокринную стимуляцию роста клетками NK-92. Exp Hematol (2005) 33 : 159–64. DOI: 10.1016 / j.exphem.2004.11.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Jiang W., Zhang C, Tian Z, Zhang J. Модифицированные геном hIL-15 естественные клетки-киллеры человека (NKL-IL15) усиливают эффект против гепатоцеллюлярной карциномы человека in vivo. Иммунобиология (2014) 219 : 547–53. DOI: 10.1016 / j.imbio.2014.03.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Буассель Л., Бетанкур-Буассель М., Лу В., Краузе Д.С., Ван Эттен Р.А., Вельс В.С. и др. Перенацеливание клеток NK-92 с помощью CD19- и CD20-специфических рецепторов химерного антигена выгодно отличается от антителозависимой клеточной цитотоксичности. Онкоиммунология (2013) 2 : e26527. DOI: 10.4161 / onci.26527

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Muller T, Uherek C, Maki G, Chow KU, Schimpf A, Klingemann HG, et al.Экспрессия CD20-специфического рецептора химерного антигена усиливает цитотоксическую активность NK-клеток и преодолевает NK-резистентность лимфомных и лейкозных клеток. Cancer Immunol Immunother (2008) 57 : 411–23. DOI: 10.1007 / s00262-007-0383-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Чу Дж., Дэн Й., Бенсон Д.М., Хе С., Хьюз Т., Чжан Дж. И др. Клетки-киллеры, сконструированные с помощью CS1-специфического химерного антигенного рецептора (CAR), усиливают противоопухолевую активность in vitro и in vivo против множественной миеломы человека. Лейкемия (2014) 28 : 917–27. DOI: 10.1038 / leu.2013.279

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Эссер Р., Мюллер Т., Стефес Д., Клёсс С., Зайдель Д., Гиллис С.Д. и др. NK-клетки, сконструированные для экспрессии GD2-специфического рецептора антигена, проявляют встроенную ADCC-подобную активность против опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения. J Cell Mol Med (2012) 16 : 569–81. DOI: 10.1111 / j.1582-4934.2011.01343.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Lee JM, Yoon SH, Kim HS, Kim SY, Sohn HJ, Oh ST, et al. Прямые и непрямые противоопухолевые эффекты лимфоцитов периферической крови человека, экспрессирующих как химерный иммунный рецептор, так и интерлейкин-2, на модели ксенотрансплантата рака яичника. Cancer Gene Ther (2010) 17 : 742–50. DOI: 10.1038 / cgt.2010.30

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58.Кобаяси Э., Киши Х., Одзава Т., Хамана Х., Накагава Х., Джин А. и др. Химерный антигенный рецептор TRAIL-рецептора 1 индуцирует апоптоз в различных типах опухолевых клеток. Biochem Biophys Res Commun (2014) 453 : 798–803. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2014.10.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Zhang G, Liu R, Zhu X, Wang L, Ma J, Han H, et al. Перенацеливание NK-92 на активность против меланомы с помощью TCR-подобного однодоменного антитела. Immunol Cell Biol (2013) 91 : 615–24. DOI: 10.1038 / icb.2013.45

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Чайлдс Р.У., Берг М. Привлечение естественных клеток-киллеров в клинику: манипуляции ex vivo. Hematology Am Soc Hematol Educ Program (2013) 2013 : 234–46. DOI: 10.1182 / asheducation-2013.1.234

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61.Миллер Дж. С., Руни С. М., Куртсингер Дж., Макелмерри Р., Маккуллар В., Вернерис М. Р. и др. Расширение и возвращение адоптивно перенесенных естественных клеток-киллеров человека в иммунодефицитных мышей зависит от приготовления продукта и введения цитокинов in vivo: значение для клинической терапии Пересадка костного мозга Biol (2014) 20 : 1252–7. DOI: 10.1016 / j.bbmt.2014.05.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62.Соманчи С.С., Соманчи А., Купер Л.Дж., Ли Д.А. Конструирование хоминга в лимфатических узлах ex vivo естественных клеток-киллеров человека посредством трогоцитоза хемокинового рецептора CCR7. Кровь (2012) 119 : 5164–72. DOI: 10.1182 / кровь-2011-11-389924

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Веннерберг Э., Кремер В., Чайлдс Р., Лундквист А. Индуцированная CXCL10 миграция адоптивно перенесенных естественных клеток-киллеров человека в сторону солидных опухолей вызывает регрессию роста опухоли in vivo. Cancer Immunol Immunother (2015) 64 : 225–35. DOI: 10.1007 / s00262-014-1629-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Дотти Г., Готтшалк С., Савольдо Б., Бреннер М.К. Дизайн и разработка методов лечения с использованием Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы. Immunol Rev (2014) 257 : 107–26. DOI: 10.1111 / imr.12131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65.Картрон Дж., Даше Л., Саллес Дж., Солаль-Селиньи П., Бардос П., Коломбат П. и др. Терапевтическая активность гуманизированного моноклонального антитела против CD20 и полиморфизм гена FcgammaRIIIa рецептора IgG Fc. Кровь (2002) 99 : 754–8. DOI: 10.1182 / blood.V99.3.754

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Weng WK, Levy R. Два полиморфизма рецептора фрагмента C иммуноглобулина G независимо предсказывают ответ на ритуксимаб у пациентов с фолликулярной лимфомой. J Clin Oncol (2003) 21 : 3940–7. DOI: 10.1200 / JCO.2003.05.013

CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Wu J, Edberg JC, Redecha PB, Bansal V, Guyre PM, Coleman K, et al. Новый полиморфизм FcgammaRIIIa (CD16) изменяет функцию рецептора и предрасполагает к аутоиммунным заболеваниям. J Clin Invest (1997) 100 : 1059–70. DOI: 10.1172 / JCI119616

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68.Карлстен М., Ли Л., Су С., Берг М., Регер Р., Мадхусудан П. и др. Электропорация мРНК клинического уровня NK-клеток: новый и высокоэффективный метод генетического репрограммирования NK-клеток человека для иммунотерапии рака. Тезисы ежегодного собрания ASH : Сан-Франциско (2014).

Google Scholar

70. Фурутани Э., Су С., Смит А., Берг М., Чайлдс Р. Инактивация siRNA ингибиторного рецептора NKG2A усиливает противоопухолевые эффекты адоптивно перенесенных NK-клеток у несущих опухоль хозяев. Тезисы ежегодного собрания ASH : Орландо (2010).

Google Scholar

72. Карасуяма Х., Тохьяма Н., Тада Т. Аутокринный рост и онкогенность интерлейкин-2-зависимых хелперных Т-клеток, трансфицированных геном ИЛ-2. J Exp Med (1989) 169 : 13–25. DOI: 10.1084 / jem.169.1.13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74.Клингеманн Х.Г., Вонг Э., Маки Г. Линия цитотоксических NK-клеток (NK-92) для очистки крови от лейкемии ex vivo. Пересадка костного мозга Biol (1996) 2 : 68–75.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с травмой легких, вызванной вентилятором

Аннотация

Фон

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом, используемая у пациентов с острым повреждением легких (ОПЛ), может вызывать выброс воспалительных цитокинов, таких как макрофагальный воспалительный белок-2 (MIP-2), рекрутирование нейтрофилов и нарушение альвеолярного эпителиального и эндотелиального барьеров .Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) улучшают ALI у мышей, но механизмы, регулирующие взаимодействие между механической вентиляцией легких и ИПСК, полностью не выяснены. Ядерный фактор каппа B (NF-κB) и фактор репрессии NF-κB (NKRF) были предложены для модуляции активации нейтрофилов, участвующих в ALI. Таким образом, мы предположили, что внутривенная инъекция ИПСК или кондиционированной среды, полученной из ИПСК (ИПСК-КМ), снизит инфильтрацию нейтрофилов, вызванную вентиляцией с высоким дыхательным объемом, окислительный стресс и продукцию MIP-2 через пути NF-κB / NKRF.

Методы

Самцов мышей C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель и весом от 20 до 25 г подвергали механической вентиляции с высоким дыхательным объемом (30 мл / кг) комнатным воздухом в течение от 1 до 4 часов после 5 × 10 ⁷ клеток / кг мышиных ИПСК или ИПСК-КМ. В качестве контрольных групп использовали невентилируемых мышей.

Результаты

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом индуцировала увеличение интеграции ИПСК в поврежденные легкие мышей, проницаемость микрососудов, инфильтрацию нейтрофилов, малоновый диальдегид, продукцию MIP-2 и активацию NF-κB и NKRF.Индексы повреждения легких, включая воспаление, отек легких, патологические изменения ультраструктуры и нарушение функционального газообмена, вызванные механической вентиляцией, ослаблялись при введении ИПСК или ИПСК-КМ, что имитировалось фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью SN50 или экспрессии NKRF с помощью NKRF. короткая интерферирующая РНК.

Выводы

Наши данные предполагают, что терапия на основе ИПСК ослабляет повреждение легких, вызванное механической вентиляцией легких с высоким дыхательным объемом, по крайней мере частично, за счет ингибирования путей NF-κB / NKRF.Примечательно, что кондиционированная среда ИПСК показала положительные эффекты, равные таковым ИПСК.

Образец цитирования: Лю И-И, Ли Л-Ф, Ян Ц.-Т, Лу К-Х, Хуанг Ц-Ц, Као К-Ц и др. (2013) Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с повреждением легких, вызванным вентилятором. PLoS ONE 8 (6): e66760. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760

Редактор: Раджасинг Джонсон, Медицинский центр Канзасского университета, Соединенные Штаты Америки

Получено: 13 марта 2013 г .; Дата принятия: 12 мая 2013 г .; Опубликован: 26 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Liu et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа поддержана Национальным научным советом, Тайвань 101-2314-B-182A-088-MY3. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Острое повреждение легких (ОПЛ) и его наиболее тяжелое проявление, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), характеризуются повышенной проницаемостью микрососудов и утечкой капилляров из-за тяжелого повреждения эпителия и эндотелия [1], [2]. Патологическое чрезмерное растяжение легких может происходить в здоровых частях легких у пациентов с ОРДС, использующих аппарат искусственной вентиляции легких. Искусственная вентиляция легких с высокими дыхательными объемами (V _T ) вызывает вызванное вентилятором повреждение легких (VILI), характеризующееся некардиогенным отеком легких, выбросом цитокинов и хемокинов, приводящим к притоку нейтрофилов [3].Привлечение воспалительных клеток с высокой вентиляцией V _T инициируется усиленным продуцированием медиаторов воспаления, таких как воспалительный белок-2 мышиных макрофагов (MIP-2), который является функциональным гомологом человеческого интерлейкина-8 (IL-8). у грызунов. Известно, что MIP-2, мощный хемокин для нейтрофилов, вносит свой вклад в патогенез VILI за счет рекрутирования этих лейкоцитов в легкие [4] — [5]. Таким образом, нацеливание на MIP-2 является потенциальным терапевтическим преимуществом при ALI.

Ядерный фактор-κB (NF-κB) играет ключевую роль в патогенезе иммунных и воспалительных реакций [6] — [7]. Активация NF-κB может привести к экспрессии MIP-2, фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1β), которые активируют воспалительные каскады в ALI [8] — [9 ]. Ранее мы продемонстрировали, что высокая вентиляция V _T вызывает зависящее от времени увеличение активации NF-κB в модели VILI у мышей [10]. NF-κB играет важную роль в передаче воспалительного сигнала, вызываемого высвобождением IL-8 за счет вентиляции с высоким растяжением in vitro и in vivo [11] — [12].Held et al. также показали, что гипервентиляция запускает активацию NF-κB и вызывает высвобождение хемокинов и цитокинов из перфузированных легких, аналогично таковому у LPS у мышей [13]. Тем не менее, активность NF-κB контролируется на других уровнях, включая индуцибельное фосфорилирование, связывание коактиваторов и репрессоров [14].

Фактор репрессии NF-κB (NKRF) представляет собой белок-глушитель транскрипционного фактора, который специфически противодействует базовой активности нескольких NF-κB-зависимых промоторов интерлейкина-8, интерферона β (IFN-β) и индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS). ) гены путем прямого связывания со специфическими последовательностями ДНК [15] — [16].МРНК NKRF конститутивно экспрессируются во всех протестированных тканях человека. Эндогенный NKRF связывается с белками NF-κB посредством прямого межбелкового взаимодействия и участвует в ингибировании базальной активности NF-κB [17]. Интересно, что NKRF, как было показано, обладает двойной ролью регуляции транскрипции IL-8 [18] — [19]. NKRF связывается с негативными регуляторными элементами (NRE) промотора IL-8 и напрямую взаимодействует с NF-κB, подавляя экспрессию гена IL-8 в базальном (нестимулированном) состоянии, но, наоборот, превращается в коактивирование с NF-κB, чтобы индуцируют транскрипцию IL-8 при стимуляции IL-1.

Недавние исследования показали, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из эмбриональных фибробластов мыши (MEF), а также из фибробластов взрослого человека посредством ретровирусной трансфекции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, и Klf4 [20] — [22]. Морфология, пролиферативные способности, поверхностные антигены, экспрессия генов, эпигенетический статус генов, специфичных для плюрипотентных клеток, и теломеразная активность между эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) и ИПСК были сходными [21] — [22].В дополнение к особенностям самообновления и дифференцировки на три зародышевых листка, ИПСК могут быть получены из соматических клеток пациента и избежать этических противоречий и возможности иммунного отторжения после трансплантации, вызванного ESCs [23]. Следовательно, ИПСК считаются хорошим кандидатом для клеточной терапии и используются для аутотрансплантации без риска отторжения. Исследование in vivo на крысах с ишемией головного мозга показало, что ИПСК обладают способностью к множественной дифференцировке и дополнительно снижают тяжесть инфарктов головного мозга [24].Наше недавнее исследование индуцированного липополисахаридом (LPS) ALI у мышей продемонстрировало, что терапия ИПСК оказывает противовоспалительное действие [25]. Интересно, что Curley et al. показали, что терапия мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) усиливает восстановление легких после ВИЛИ посредством паракринного механизма, зависимого от фактора роста кератиноцитов [26]. Однако роль ИПСК при ВИЛИ не полностью очерчена и требует дальнейшего изучения.

В этой модели ALI с высоким уровнем механического растяжения у мышей мы исследовали взаимосвязь между вентиляцией с высоким V _T , ИПСК и производной от ИПСК кондиционированной средой (ИПСК-СМ), производством MIP-2, внутриклеточным окислительным стрессом и активацией Передача сигналов NF-κB и NKRF с использованием фармакологического ингибирования с помощью SN-50, специфического ингибитора NF-κB и короткой интерферирующей РНК (siRNA), нацеленной на NKRF.Мы предположили, что внутривенные инъекции ИПСК или ИПСК-КМ уменьшат инфильтрацию нейтрофилов, окислительный стресс, отек легких и продукцию MIP-2 у мышей, подвергшихся вентиляции с высоким уровнем V _T , посредством модуляции путей NF-κB и NKRF.

Результаты

Характеристика ИПСК, полученных из MEF

В наших настоящих и предыдущих исследованиях [25], [27] мы установили плюрипотентные ИПСК мыши без c-Myc и исследовали молекулярные характеристики и потенциал самонаведения трансплантированных ИПСК в поврежденном легком у мышей с ALI (рис. 1 и рис. S1). ).Мы также исследовали лечебные эффекты ИПСК и ИПСК-КМ и обнаружили, что ИПСК и ИПСК-КМ имели сходные эффекты в улучшении состояния мышей с ALI (рис. S2). Подробности см. В файле вспомогательной информации Text S1.

Рисунок 1. Характеристика трехгенных ИПСК мыши.

(A) Слева: трехгенные ИПСК мыши были способны образовывать колонии, похожие по внешнему виду на колонии ЭСК. Справа: колонии мышиных ИПСК с тремя генами были положительны по окрашиванию щелочным фосфатом (синий). (B) По сравнению с MEF анализ RT-PCR показал, что iPSC экспрессировали маркеры генов стволовых клеток (GAPDH: внутренний контроль).(C) Эти колонии ИПСК были положительными на SSEA-1 при иммунофлуоресцентном окрашивании. (D) Анализ микроматрицы экспрессии генов показал, что схожие профили экспрессии среди ИПСК с тремя генами, ЭСК и ИПСК с четырьмя генами с использованием иерархической тепловой карты. DAPI = 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ESC = эмбриональные стволовые клетки; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; iPSC-ALP = iPSC, окрашенный щелочным фосфатом; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; mESC = эмбриональные стволовые клетки мыши; 3F miPSC = три фактора транскрипции без iPSC мыши c-Myc; 4F miPSC = четыре фактора транскрипции iPSC мыши; SSEA-1 = специфический для стадии эмбриональный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g001

ИПСК или ИПСК-КМ, ослабленные ВИЛИ, индуцированные высоким дыхательным объемом

Мы также использовали вентиляцию с высоким дыхательным объемом (V _T 30 мл; обозначается как V _T 30) окружающим воздухом в течение 4 часов для индукции ВИЛИ у самцов мышей C57BL / 6 и исследовали лечебные эффекты внутривенно введенных ИПСК. или iPSC-CM. Физиологические условия в начале и в конце вентиляции представлены в таблице 1.Гистологические исследования показали, что легкие животных, поврежденные механической вентиляцией легких при V _T 30, имели картину альвеолярного застоя, кровотечения, утолщения альвеолярной стенки и инфильтрации нейтрофилов, которые в значительной степени были устранены введением ИПСК или ИПСК-КМ ( Рисунок 2А). Количественная оценка повреждения легких подтвердила тяжелое повреждение, вызванное V _T 30, и терапевтический потенциал ИПСК или ИПСК-КМ (рис. 2В). A V _T 30 также увеличивал содержание синего красителя Эванса (EBD) в легких и отношение влажного к сухому, что указывает на капиллярную утечку.Микроскопическая гиперемия легких и повышение проницаемости капилляров, вызванные V _T 30, не были затронуты обработкой эмбриональных фибробластов мыши (MEF), но были существенно подавлены обработкой либо ИПСК, либо ИПСК-КМ (Фигуры 2C, 1D). Таким образом, эти данные предполагают, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшают микроваскулярную утечку, отек легких и общее повреждение легких в модели VILI у мышей, индуцированной V _T 30. Количественная оценка повреждения легких (контроль, PBS = 0,46 ± 0,07, Контроль, SN50 = 0.38 ± 0,12, контроль, миРНК NKRF = 0,42 ± 0,08, контроль, инактивированный нагреванием iPSC-CM = 0,5 ± 0,1, P = 0,51), уровни EBD (контроль, PBS = 24,6 ± 1,4 нг / мг веса легких, контроль, SN50 = 22,2 ± 1,3 нг / мг веса легких, контроль, миРНК NKRF = 23,0 ± 1,8 нг / мг веса легких, контроль, термоинактивированный iPSC-CM = 25,3 ± 1,7 нг / мг веса легких, P = 0,14), влажный- соотношение массы к сухой массе (контроль, PBS = 4,2 ± 0,5, контроль, SN50 = 4,1 ± 0,3, контроль, миРНК NKRF = 4,2 ± 0,2, контроль, термоинактивированные iPSC-CM = 4,5 ± 0,4, P = 0,41). в контрольной группе мышей без вентиляции.

Рис. 2. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF снижали отек и повреждение легких, вызванные растяжением легких.

(A) Гистологическое исследование и (B) количественная оценка структурного повреждения дыхательных путей, вызванного высоким дыхательным объемом, и восстанавливающего эффекта ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF. Влияние введения ИПСК, ИПСК-ЦМ, SN-50 или миРНК NKRF на (C) EBD легких и (D) соотношение влажного и сухого состояния у мышей дикого типа, получающих механическую вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом. (V _T 30) показаны.SN50 (2 мг / кг) вводился внутрибрюшинно за 30 мин до ИВЛ. NKRF siRNA, 6 мг / кг, вводили интратрахеально за 48 ч до механической вентиляции. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. На панелях B, C и D * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм. CM = кондиционированная среда ИПСК; EBD = синий краситель Эванса; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; NKRF = фактор репрессии NF-κB; PBS = физиологический раствор с фосфатным буфером; Мошенничество = ненаправленная скремблированная миРНК; миРНК = короткая интерферирующая РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g002

Снижение воспалительного ответа, связанного с ВИЛИ, с помощью ИПСК или ИПСК-ЦМ

Затем мы идентифицировали нейтрофилы, основные воспалительные клетки, участвующие в процессе ALI [25]. Подсчет нейтрофилов и анализ миелопероксидазы (MPO) показали, что нейтрофилы мигрировали в поврежденные участки легких у мышей после механической вентиляции при V _T 30 по сравнению с невентилируемыми мышами (Фигуры 3A, 3B).Между тем, уровень малонового диальдегида (МДА), который является вторичным альдегидным продуктом перекисного окисления липидов, продуцируемых нейтрофилами, и уровни белка MIP-2 были повышены в ответ на лечение V _T 30 (Фигуры 3C, 3D), что указывает на увеличение окислительного стресс и активация хемоаттрактантов для нейтрофилов в этой модели. Примечательно, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшали миграцию нейтрофилов, MDA и повышение уровня белка MIP-2 (рисунки 3C, 3D). Эти данные демонстрируют, что ИПСК или ИПСК-КМ могут ослаблять нейтрофильную инфильтрацию и воспалительные реакции в ВИЛИ, индуцированных высоким дыхательным объемом.

Рис. 3. ИПСК или ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF ослабляют инфильтрацию нейтрофилов, вызванную растяжением легких, и оксидантный стресс.

Влияние введения ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF на (A) инфильтрацию нейтрофилов, (B) активность MPO, (C) активность MDA и (D) секрецию MIP-2 в ЖБАЛ в естественных условиях: показаны мыши, получающие искусственную вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом (V _T 30). Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * Р <0.05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V _T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество или MEF. БАЛ = жидкость бронхоальвеолярного лаважа; MDA = малоновый диальдегид; MIP-2 = воспалительный белок макрофага-2; МПО = миелопероксидаза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g003

Вентиляция с высоким дыхательным объемом вызвала повышенную проницаемость микрососудов, воспаление и повреждение легких за счет активации NF-κB и NKRF, которые ингибировались siRNA SN50 и NKRF соответственно

NF-κB и NKRF, как было показано, модулируют активацию нейтрофилов, участвующую в ALI [10], [18].Иммуногистохимия показала, что эпителий дыхательных путей окрашен положительно на NKRF и фосфо-NF-κB после механической вентиляции при V _T 30 (Фигуры 4A, 4B, 5A, 5B). Для дальнейшего изучения взаимосвязи между NF-κB и NKRF в этой модели VILI мы затем использовали миРНК NKRF или фармакологическое ингибирование NF-κB, чтобы идентифицировать участие пути NF-κB / NKRF в VILI, индуцированном высоким дыхательным объемом. В соответствии с иммуногистохимическими данными, анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия NKRF и фосфорилирование фосфо-NF-κB были увеличены у мышей, получавших ИВЛ при V _T 30, и что нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB с помощью SN50 отменяли V _T 30-индуцированная активация NKRF и фосфо-NF-κB (Фигуры 5C, 5D, 6A, 6B).Нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB также предотвращали активацию мРНК NKRF в ответ на V _T 30 (Фигуры 6C, 6D). Введение SN50 или миРНК NKRF также аннулировало баллы повреждения легких, проницаемость микрососудов, приток нейтрофилов и продукцию MDA и MIP-2 (Фигуры 2 и 3). В соответствии с предыдущими сообщениями в ALI [10], [18], наши данные показывают, что передача сигналов NF-κB / NKRF также необходима для индукции VILI.

Рисунок 4. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию NKRF, индуцированную растяжением легких, в эпителии дыхательных путей.

Иммуногистохимия (A, × 400) и количественная оценка (B) экспрессии NKRF были взяты из легких V _T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF. Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на NKRF в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета означают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов.* P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V _T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g004

Рис. 5. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли фосфорилирование NF-κB, вызванное растяжением легких.

Фосфорилирование NF-κB из легких V _T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA, как обнаружено с помощью иммуногистохимии (A, B) (× 400) и количественного определения, (C, D) Вестерн-блоттинг.Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Произвольные единицы выражали как отношение фосфо-NF-κB к NF-κB. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на фосфо-NF-κB в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета означают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V _T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших мошенничество, PBS или MEF.Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g005

Рис. 6. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию мРНК NKRF и NKRF, индуцированную растяжением легких.

Полноразмерный репрессирующий фактор NF-κB содержит связывающий домен XRN2 | Биохимический журнал

NKRF, который, как недавно было показано, играет роль в биогенезе рибосом [8,9], первоначально был идентифицирован как 43.Белок 8 кДа, который подавлял транскрипционную активность NF-κB и постоянно подавлял промотор IFN-β [16]. Однако секвенирование дополнительных клонов кДНК и анализ геномных последовательностей из тканей мыши и человека выявили ошибку секвенирования в первой опубликованной последовательности кДНК NKRF, которая привела к преждевременной терминации [16]. Была предложена новая скорректированная последовательность, которая кодировала удлинение на 302 аминокислоты на С-конце открытой рамки считывания, давая белок из 690 аминокислот (рис. 1А) с прогнозируемой молекулярной массой 77 кДа [17 ].Данные свидетельствуют о том, что белок NKRF кодируется двумя мРНК, различающимися своими 5’UTR (рис. 1A: варианты 2 и 3), и, кроме того, также был предложен альтернативный вариант сплайсинга, который может продуцировать белок из 705 аминокислот. (Рисунок 1А: вариант 1). Однако ни один из этих предсказанных размеров белка не согласуется с белком 88 кДа, соответствующим NKRF, который мы наблюдали с помощью вестерн-анализа (рис. 1B). Чтобы подтвердить специфичность антитела против NKRF, использованного в вестерн-анализе, мы попытались истощить NKRF в клетках U-2 OS, используя две разные миРНК, направленные против мРНК NKRF.Обе миРНК вызывали значительное снижение белка 88 кДа, подтверждая, что антитело обнаруживает NKRF (рис. 1B). Кроме того, подобное снижение экспрессии NKRF в ядрышке наблюдалось после истощения siRNA (дополнительный рисунок S1A). Хотя возможно, что на миграцию белка NKRF влияют посттрансляционные модификации, в первую очередь мы провели обширный биоинформатический анализ, чтобы понять несоответствие между предсказанным и наблюдаемым размером белка.Мы идентифицировали расширенную мРНК, кодирующую NKRF (рис. 1A: вариант транскрипта 201), которая была обнаружена с помощью автоматической аннотации в Ensembl как ENST00000304449.6. 5′-нетранслируемая область (5’UTR) этой мРНК на 560 нуклеотидов длиннее, чем у ранее описанного транскрипта варианта 2, и, что важно, этот более длинный 5’UTR содержит вышестоящий кодон AUG (Рисунок 1A: AUG2). Автоматическая трансляция этой последовательности по-прежнему давала эталонную последовательность белка из 690 аминокислот (77 кДа). Однако база данных коротких генетических вариаций dbSNP показала, что эталонная геномная последовательность человеческого NKRF содержит ошибку.Таким образом, 99,95% из 20 387 секвенированных геномов человека содержали дополнительный цитозиновый нуклеотид в экзоне 1 гена NKRF по сравнению с эталонной последовательностью (рисунок 1C и дополнительный рисунок S1B). Включение дополнительного цитозина сдвигает AUG2 в более длинной мРНК NKRF в ту же рамку считывания, что и ранее идентифицированная кодирующая область, расширяя открытую рамку считывания для кодирования белка из 784 аминокислот с прогнозируемой молекулярной массой 88 кДа. Важно отметить, что аминокислотная последовательность этого N-концевого удлинения является высококонсервативной у видов млекопитающих (дополнительный рисунок S1C) со всеми соответствующими геномными последовательностями, содержащими дополнительный цитозин, по сравнению с эталонной последовательностью человека.

По клеточной биологии пит-клеток, печеночно-специфические NK-клетки

По клеточной биологии пит-клеток, печеночно-специфические NK-клетки.

Дайан-Чжун Луо, Дэвид Вермиджлен, Бюлент Ахишали, Василис Триантис, Джорджия Плакуци, Филип Брает, Карин Вандеркеркен, Эдди Виссе

Дайан-Чжун Луо, Давид Вермайлен, Бюлент Ахишали, Василис Триантис, Джорджия Плакуци, Филип Брает, Эдди Висс, Лаборатория клеточной биологии и гистологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Брюссель-Джетте, Бельгия

Карин Vanderkerken, Отделение гематологии и иммунологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Брюссель-Йетте, Бельгия

Dian-Zhong Luo, Отдел патологии, Медицинский университет Гуанси, Наньнин, Китай

Филип Брает и Карин Вандеркеркен являются постдокторанты Фонда научных исследований Фландрии.

Дянь-Чжун Луо, мужчина, родился 07.07.1955 в Гуйлине, Гуанси, в 1982 году окончил Медицинский университет Гуанси, в 1987 году получил степень магистра в Медицинском университете Гуанси, а в 1994 году — в Свободном университете Брюсселя, профессор. патологии Медицинского Университета Гуанси, а теперь следит за доктором философии. программа по медицинским наукам в Свободном университете Брюсселя, Бельгия, опубликовано более 30 статей.

Номер ORCID: $ [AuthorORCIDs]

Вклад авторов : Все авторы внесли равный вклад в работу.

При поддержке грантов 3.0053.92,3.0050.95, 9.0038.96,1.5.411.98 от Национального фонда научных исследований (FWO) и грантов 194.322.1740,195.332.1310,196.322.0140 и OZR.230 от Исследовательский совет Свободного университета Брюсселя.

Для корреспонденции на : Проф. Д-р Эдди Висс, Лаборатория клеточной биологии и гистологии, Свободный университет Брюсселя (VUB), Лаарбеклан 103, B-1090 Брюссель, Бельгия. [email protected]

Телефон : + 32-2-4774404 Факс: + 32-2-4774405

Получено: 22 сентября 1999 г.
Доработано: 2 ноября 1999 г.
Принято: 15 ноября 1999 г.
Опубликовано онлайн: 15 февраля 2000 г.

ВВЕДЕНИЕ

Естественные клетки-киллеры (NK) функционально определяются их способностью убивать определенные опухолевые клетки и инфицированные вирусом клетки без предварительной сенсибилизации [1].NK-клетки составляют от 10% до 15% лимфоцитов периферической крови, и большинство этих клеток у человека и крысы имеют морфологию больших гранулярных лимфоцитов (LGL) [2]. Однако недавние исследования показали, что небольшие агранулярные лимфоциты, лишенные экспрессии CD3, обладают цитолитической активностью, сравнимой с NK-клетками [3]. Эти вариации могут быть связаны со стадией дифференцировки или гетерогенности NK-клеток [4]. Более того, некоторые цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) также обладают характеристиками LGL [4].Помимо NK-клеток в периферической крови, NK-клетки также обнаруживаются в тканевых компартментах, таких как селезенка, легкие, кишечник, лимфатические узлы, костный мозг и печень [4]. NK-клетки в печени, также называемые пит-клетками [5], составляют уникальную резидентную популяцию NK в синусоидах печени. Их иммунофенотипические, морфологические и функциональные характеристики отличаются от NK-клеток крови [6]. В настоящее время для описания пит-клеток используется несколько названий, таких как пит-клетки, печеночные NK-клетки и LGL, относящиеся к различным аспектам их морфологии или функции [6].Мы предпочитаем использовать первое название пит-клетки для этих клеток в печени, потому что оно не связано с постоянно меняющимися уровнями функции и морфологии или человеком (как клетки Купфера) [7]. Кроме того, ассоциированные с печенью лимфоциты (LAL) в некоторых случаях используются для описания общей популяции лимфоидных клеток в печени [8,9]. Однако КЛЛ содержит около 30% Т-лимфоцитов, 3% В-лимфоцитов помимо 43% пит-клеток в смыве печени человека [9]. Смывы из печени крыс содержат 43% Т-лимфоцитов, 16% В-лимфоцитов, 3.3% моноцитов и 26% пит-клеток [10].

В настоящем обзоре обсуждается биологическая значимость пит-клеток с акцентом на печень крыс.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПИТ-КЛЕТОК

Pit-клетки были впервые описаны в 1976 г. Wisse et al. [5]. Название «пит-клетка» было введено из-за характерных цитоплазматических гранул, которые на голландском языке называются ямками, напоминающими ямки в винограде [5]. Гипотеза о том, что пит-клетки могут обладать NK-активностью, была предложена Kaneda et al [11] из-за их морфологического сходства с LGL.Разработка метода выделения и очистки пит-клеток из печени крысы и доказательства того, что пит-клетки обладают спонтанной цитотоксичностью против NK-чувствительных клеток лимфомы YAC-1, подтвердили, что эти клетки являются NK-клетками печени [12,13].

Pit-клетки существуют в синусоидах печени и часто прикрепляются к эндотелиальным клеткам (Ec), хотя они случайно контактируют с клетками Купфера (Kc) (Рисунок 1). Они смотрят прямо в кровь. Псевдоподии пит-клеток могут проникать через отверстия Ec, проникать в пространство Disse и могут напрямую контактировать с микроворсинками гепатоцитов [5,14].Их появление в пространстве Диссе — не обычная черта [15]. По данным морфологического исследования, частота пит-клеток в ткани печени составляет в среднем 1 пит-клетку на 10 клеток Купфера. Таким образом, количество пит-клеток у необработанных крыс оценивается в (1,4-2) × 10 ⁶ клеток на грамм веса печени [12]. По данным иммуногистологического анализа с использованием mAb 3.2.3 против NKR-P1A (специфического маркера NK-клеток) количество пит-клеток в замороженных срезах печени крысы составляет около 13,7 на мм ² [16].После внутривенного введения модификаторов биологического ответа (BRM) количество пит-клеток увеличивается в 4-6 раз в печени крыс, получавших зимозан [17], и в 43 раза — интерлейкином-2 (IL-2) [18]. Считается, что избыток пит-клеток возникает в результате локальной пролиферации и из костного мозга [17,18]. Было обнаружено, что ямковые клетки более многочисленны в перипортальной области, чем в перицентральной области доли печени [11,16].

Рис. 1. Просвечивающая электронная микрофотография пит-клетки в синусоидальном просвете печени крысы (L). Пит-клетка показывает полярность с эксцентрическим ядром. Цитоплазма обильная и содержит характерные плотные наэлектризованные гранулы и другие органеллы, лежащие в основном с одной стороны ядра. Клетка контактирует с эндотелиальной клеткой (E) и частью клетки Купфера (K) с положительным продуктом пероксидазной реакции в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме. Бар = 1 мкм. (из Hepatology, 1988; 8: 46-52, с разрешения)

Pit-клетки имеют по существу ту же морфологию, что и NK-клетки крови и других органов, i.е . LGL (рисунок 1). Морфология LGL характеризуется относительно крупными размерами, наличием гранул в цитоплазме, выраженной асимметрией клетки и зазубренным или почковидным ядром высокой плотности [10]. Ямочные клетки крысы имеют диаметр около 7 мкм и разную форму, но при этом обладают хорошо развитыми псевдоподиями. Они демонстрируют ярко выраженную полярность с эксцентрическим ядром и большинством органелл, лежащих по одну сторону от ядра.

Самыми заметными органеллами являются электронно-плотные гранулы.Эти гранулы обладают несколькими характеристиками. Они азурофильны, поэтому окрашивание по Гимзе мазка клеток или препарата цитоспина выявляет наличие гранул в пит-клетках с помощью светового микроскопа. По данным электронной микроскопии, гранулы различаются по размеру в разных субпопуляциях пит-клеток (пит-клетки LD и HD, см. Следующую страницу), но в пределах одного типа клеток гранулы очень однородны по размеру, форме и электронной плотности [19 ]. Гранулы связаны мембраной и имеют размер от 0.2 мкм в клетках с питанием LD и 0,5 мкм в клетках LAK. Эти гранулы содержат ряд лизосомальных ферментов, таких как кислая фосфатаза [12,20]. Хотя перфорин и гранзимы, которые были выделены из гранул NK-клеток [21,22], еще не идентифицированы в гранулах пит-клеток, по аналогии считается, что эти молекулы присутствуют в гранулах пит-клеток.

Везикулы с стержневой сердцевиной — это небольшие включения диаметром от 0,17 до 0,2 мкм, которые встречаются исключительно в LGL [11]. Они содержат структуру с прямыми стержнями длиной 30-50 нм, перекрывающими весь диаметр везикулы [11,20].Везикулы с стержневыми сердцевинами образуются и преимущественно распределяются вокруг аппарата Гольджи. Возможно, везикулы с стержневой сердцевиной могут также содержать цитотоксические факторы, действующие в условиях естественной цитотоксичности [15].

Пит-клетки также существуют в печени человека и мыши, но идентификация пит-клеток в печени человека и мыши более трудна, чем у крысы, поскольку они содержат меньшее количество и меньший размер типичных плотных гранул и очень мало стержневых. везикулы [9,23,24]. С другой стороны, от 5% до 25% пит-клеток человека содержат «параллельные трубчатые массивы» (PTA), которые также были обнаружены в NK-клетках крови человека и считаются характеристикой этих клеток [6,23].

ПОВЕРХНОСТНЫЙ ФЕНОТИП ПИТ-КЛЕТОК

Обширный фенотипический анализ показал, что уникальный маркер NK-клеток еще не идентифицирован, но экспрессия набора дифференцирующих антигенов в отсутствие антиген-специфических рецепторов T- и B-лимфоцитов служит для идентификации NK клетки. NKR-P1 был впервые идентифицирован у крыс [25], и теперь было показано, что он экспрессируется также NK-клетками мыши и человека [26,27]. NKR-P1 — мембранный гликопротеин II типа суперсемейства лектинов С-типа [28].Гены N KR-P1 расположены на хромосоме 6 мыши [29], хромосоме 12 человека p 12-p13 [27] и хромосоме 4 крысы в ​​области, обозначенной как «генный комплекс NK» (NKC) [28]. Антиген NKR-P1 присутствует в 94% LGL крысы и служит запускающей структурой на этих клетках [25]. NKR-P1 считается полезным маркером для идентификации NK-клеток [25]. Однако подмножество Т-лимфоцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов также экспрессируют NKR-P1 [25,27]. CD56 и CD16 экспрессируются, по отдельности или в комбинации, на большинстве человеческих NK-клеток и наиболее широко используются в качестве «маркеров» человеческих NK-клеток для клинических и фундаментальных исследований [2].Другими поверхностными антигенами, экспрессируемыми на NK-клетках, являются: CD2, CD8, CD11a-c, CD18, CD45, CD54, CD56, CD58 и CD69 [2,4,30,31].

Большинство поверхностных антигенов, обнаруженных на клетках ямок крыс, аналогичны антигенам, обнаруженным на NK-клетках селезенки или периферической крови (Таблица 1) [13,16,32]. Было обнаружено, что все LGL из смыва печени крысы в ​​препаратах для световой и электронной микроскопии экспрессируют NKR-P1 [16] (рис. 2), как было обнаружено с помощью моноклонального муравьиного ибоди (mAb) 3.2.3 [25]. CD11a присутствует на 90% пит-клеток крысы, что отличается от NK-клеток периферической крови крыс (54%) [32].Примерно 90% клеток ямок крысы экспрессируют CD18, 35% экспрессируют CD54 и 80% экспрессируют CD2 [32]. Asialo-GM1, который экспрессируется всеми NK-клетками крови крыс [19], присутствует в 36% пит-клеток LD и 70% пит-клеток HD [13]. CD8, маркер NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [2], присутствует на всех ямках крыс [13]. Однако состав CD8 в NK-клетках и Т-лимфоцитах различен. Большинство NK-клеток CD8 ⁺ экспрессируют гомодимеры CD8a / CD8a, а не гетеродимеры CD8a / CD8a, преобладающие на цитотоксических Т-клетках [33].Кроме того, ямочные клетки крысы не экспрессируют Т-клеточный рецептор и антиген CD5 (общий Т-клеточный маркер) [13,15].

61 5,9 916 916 916 916 мкм ² )

916 916 916 916 916 916 916 916 916 916 916

Рис. 2 Электронная микрофотография с иммунопередачей, показывающая 3. 2.3 положительная LGL (пит-клетка) (стрелка) и 3.2.3 отрицательная агранулярная клетка. Пит-клетка 3.2.3 ⁺ показывает характерные электронно-плотные гранулы в цитоплазме и продукт иммунопероксидазной реакции на поверхности. Полоса = 1 мкм. (Из Hepatology, 1995; 21: 1690-1694, с разрешения)

LAL из печени человека содержат около 35% клеток CD56 ⁺ , в которых обнаружены три подгруппы: ① CD3 ⁺ / CD16 ^—, ② CD3 ^— / CD16 ^—, ③ CD3 ^— / CD16 ⁺ [8.Более того, все LAL CD56 ⁺ экспрессируют CD11a и CD18 и частично экспрессируют CD2, CD11b, CD11c, CD54 и CD58 [8,34,35].

ИЗОЛЯЦИЯ И ОЧИСТКА ПИТ-КЛЕТОК

Наш метод выделения ямочных клеток крыс основан на методе вымывания [12] с последующей очисткой, основанной на отрицательной магнитной селекции клеток с использованием mAb против поверхностных антигенов и рецепторов, обнаруженных на T и В-клетки [6,36]. Поскольку пит-клетки, по-видимому, не сильно закреплены в синусоидах печени, клетки могут быть вымыты неферментативной перфузией печени под высоким давлением (50 см воды) через воротную вену с фосфатно-солевым буфером с добавлением 0.1% ЭДТА [12]. Смыв собирали из полой вены. Эритроциты, гранулоциты и клеточный дебрис в смыве удаляли центрифугированием в градиенте фиколла-пака. Мононуклеарные клетки, выделенные из границы раздела Ficoll-Paque gradient, содержали Т-клетки, пит-клетки, В-клетки, моноциты и несколько Ec и Kc. Дополнительные моноциты и В-клетки в этой популяции могут быть выборочно удалены в колонке из нейлоновой ваты [12]. Пит-клетки дополнительно очищали с помощью магнитной сортировки клеток [36]. С помощью этой системы высокоочищенная популяция пит-клеток была получена путем отрицательной селекции i.е . устранением оставшихся моноцитов, Т- и В-клеток с использованием специфических антител и иммуномагнитных шариков. С помощью этого метода мы получили пит-клетки с чистотой более 90% и жизнеспособностью более 95% (рис. 3). Более того, этот неферментативный метод не разрушает молекулы клеточной поверхности.

Рис. 3 Световая микрофотография выделенной и очищенной популяции пит-клеток в цитоспине, окрашенном по Мэй-Грюнвальду-Гимза. Клетки содержат цитоплазматические гранулы, которые можно использовать для распознавания и подсчета количества пит-клеток в свежевыделенной популяции ассоциированных с печенью лимфоцитов.Бар = 5 мкм.

Альтернативно пит-клетки могут быть выделены ферментативными методами [5]. Тем не менее, этот метод требует много времени и трудозатрат и обеспечивает пит-клетки только 30% чистоты и 90% жизнеспособности [6,12].

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ПИТ-КЛЕТОК

Значительный набор данных указывает на то, что ямочные клетки крысы составляют гетерогенную популяцию. В зависимости от плотности клеток пит-клетки можно разделить на фракции с низкой плотностью (LD) и высокой плотностью (HD) с помощью 45% изоосмотического центрифугирования в градиенте Перколла [19].Было показано, что эти две клеточные популяции отличаются иммунофенотипически, морфологически и функционально друг от друга и от LGL крови (Таблица 1) [19,37]. Пит-клетки LD (рис. 4A) содержат больше везикул с стержневой сердцевиной и больше гранул, но меньшего размера, чем NK-клетки крови (рис. 4B) [19,37]. Количество везикул с стержневой сердцевиной и состав гранул (количество и размер) пит-клеток HD занимают промежуточное положение между пит-клетками LD и NK-клетками крови [19,37]. Иммунофенотипически почти все NK-клетки крови являются asia lo-GM1 положительными, и 70% пит-клеток HD являются сильно положительными, тогда как только 36% пит-клеток LD являются слабо положительными [19].Кроме того, между этими тремя популяциями наблюдались функциональные различия. Клетки LD pit в 5-8 раз более цитотоксичны в отношении клеток YAC-1 и клеток карциномы толстой кишки, чем NK-клетки крови [37]. Пит-клетки HD обладают промежуточной цитотоксической активностью между пит-клетками LD и NK-клетками крови [37]. Кроме того, LD-пит-клетки способны лизировать LAK-чувствительные мишени мастоцитомы P815, которые противостоят нормальным NK-клеткам крови и HD-пит-клеткам печени [37].

Рис. 4 Просвечивающие электронные микрофотографии типичной пит-клетки LD и NK-клетки крови (B). (A) Основной морфологической характеристикой пит-клеток LD по сравнению с HD-клетками и NK-клетками крови является наличие множества мелких цитоплазматических гранул. (B) Обратите внимание на несколько, но большие гранулы в NK-клетках крови. Бар = 1 мкм. (из Hepatology, 1990; 12: 70-75, с разрешения)

Pit-клетки происходят из NK-клеток крови [38,39]. Несколько свидетельств подтверждают концепцию, согласно которой NK-клетки крови иммигрируют в синусоиды печени, чтобы стать пит-клетками HD, которые далее дифференцируются в пит-клетки LD.Важно отметить, что характеристики и функции пит-клеток HD занимают промежуточное положение между NK-клетками крови и пит-клетками LD [19]. Кинетические эксперименты с сублетальным облучением всего тела (700 сГр) показали, что NK-клетки крови и пит-клетки HD истощились примерно через одну неделю после облучения, тогда как пит-клетки LD полностью исчезли через две недели после облучения [39]. Экранирование печени дало аналогичные результаты, а спленэктомия не повлияла на количество пит-клеток [39]. При внутривенной инъекции антисыворотки против asialo-GM1, пит-клетки крови NK и HD полностью исчезали в течение одной недели лечения, тогда как пит-клетки LD исчезли из печени через неделю [39].Прямое доказательство того, что пит-клетки LD происходят от asialo-GM1-положительных предшественников (NK- и HD-пит-клетки крови), было получено путем адоптивного переноса флуоресцентно меченных пит-клеток HD сингенным крысам [39]. Через три дня 5% меченых клеток были выделены во фракции LD, и эти клетки показали типичную морфологию ямчатых клеток LD [39]. Эти наблюдения также показывают, что продолжительность жизни пит-клеток в печени составляет около двух недель [6,39].

Механизм миграции NK-клеток крови в синусоиды печени до конца не изучен.Было обнаружено, что в процесс вовлечены несколько молекул адгезии [32]. NK и пит-клетки крови крыс экспрессируют молекулы адгезии LFA-1 (CD11a / CD18) и CD2 (LFA-2) [32]. Было обнаружено, что их лиганды, CD54 (ICAM-1) и CD58 (LFA-3) присутствуют на Ec печени [40]. После внутривенной инъекции антител против CD2, CD11a и CD18 крысам количество пит-клеток в печени значительно уменьшилось, что указывает на то, что взаимодействия LFA-1 / CD54 и CD2 / CD58 участвуют в рекрутинге пит-клеток в печени. [32].

Попав в синусоиды печени, предшественники NK крови далее дифференцируются в пит-клетки HD, а затем в пит-клетки LD. Считается, что за этот процесс дифференцировки отвечает микросреда синусоиды печени [41]. Vanderkerken и др. [41] обнаружили, что Kc избирательно удалялись через 3 дня после внутривенной инъекции липосом, содержащих цитотоксическое лекарственное средство дихлорметилендифосфонат. Количество пит-клеток HD снизилось через 3 дня после инъекции.Напротив, популяция пит-клеток LD не показала изменений в количестве через 3 дня, но снижение примерно на 80% наблюдалось через 7 дней после инъекции [41]. Эти данные показывают, что пит-клетки составляют популяцию, зависимую от клеток Купфера, и что Kc играют важную роль в дифференцировке пит-клеток в печени. Однако остается неясным, какой фактор (ы), секретируемый Kc, ответственен за эту дифференцировку. С другой стороны, в микросреде печени присутствуют другие состояния, , то есть .Ec и их секретируемые факторы могут работать синергетически с Kc, способствуя дифференцировке пит-клеток, поскольку совпадение пит-клеток HD с Kc не смогло вызвать полную дифференцировку HD в пит-клетки LD [41].

ФУНКЦИИ ПИТ-КЛЕТОК

NK-клетки изначально были определены как лимфоидные клетки, способные опосредовать спонтанное уничтожение клеток-мишеней, включая опухолевые и инфицированные вирусом клетки [1]. Такая цитотоксическая активность NK опосредуется без предварительной сенсибилизации и какой-либо очевидной стимуляции или активации [1].В дополнение к этому естественному спонтанному пути уничтожения опухолей, NK-клетки могут опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) с помощью механизма, включающего CD16, рецептор Fc IgG [42]. Большинство NK-клеток человека и мыши экспрессируют CD16 [2]. NK-клетки крысы содержат гены с высоким уровнем гомологии с рецепторами Fc человека и мыши [43] и способны отображать ADCC [44]. К сожалению, антител против CD16 крысы пока нет.

Хотя цитотоксическая функция NK-клеток является спонтанной, она может быть значительно усилена несколькими цитокинами [2].Было показано, что один из них, IL-2, играет центральную роль в регуляции NK-клеток, включая усиление цитотоксичности NK-клеток, расширение противоопухолевого спектра NK-клеток и индукцию пролиферации NK-клеток [4].

Цитотоксическая (т. Е. Цитолитическая) активность NK обычно определяется путем измерения высвобождения радиоактивно меченного хрома из клеток-мишеней после воздействия на эффекторные клетки [2]. Недавно был описан новый анализ с использованием проточной цитометрии для оценки активности NK-клеток, в котором различные красители используются для дифференциации жизнеспособных клеток-мишеней от мертвых [45].Первоначальные исследования показали, что этот метод является быстрым, надежным и хорошо коррелирует со стандартным анализом высвобождения Cr ⁵¹ [45].

Помимо цитотоксической функции, NK-клетки могут продуцировать различные цитокины [46], регулировать рост кроветворных тканей и трансплантатов костного мозга [47], а также участвовать в устойчивости к микробным патогенам [2].

Большинство исследований функций пит-клеток сосредоточено на цитотоксической активности. Клетки ямок крыс обладают высокой спонтанной цитотоксической активностью против различных линий опухолевых клеток, таких как YAC-1, P815, CC531s, DHD-K12, L929, 3LL и 3LL-R [10].По сравнению с NK-клетками крови, пит-клетки в четыре-восемь раз более цитотоксичны по отношению к клеткам YAC-1 и CC531s и способны убивать NK-резистентные, но чувствительные к лимфокин-активированным киллерам (LAK) клетки P815 (рис. 5) [19]. , 48]. Эти данные, кажется, подтверждают идею о том, что пит-клетки активируются, когда становятся жителями печени. Однако пока неясно, какой (-е) фактор (-ы) ответственен (-ы) за активацию пит-клеток в печени, хотя было показано, что пит-клетки зависят от наличия здоровой популяции Kc. [41].Кроме того, активность NK в печени может быть увеличена с помощью BRM, например, Propionibacterium acnes или малеинового ангидрида дивинилового эфира [24]. Интересно, что увеличение функции, по-видимому, совпадает с большим увеличением количества LGL [17,24]. Обработка ИЛ-2 приводит к резкому накоплению пит-клеток в синусоидах печени in vivo [18], индуцирует пролиферацию HD-клеток и увеличивает цитотоксическую активность HD-пит-клеток печени in vitro [49]. Напротив, лечение ИЛ-2 не индуцирует пролиферацию ЛД-пит-клеток печени [49].

Рис. 5 Сравнение цитолиза между пит-клетками N K, HD и LD крови крысы. Отношение свежевыделенных эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляло 20: 1. Цитолиз измеряли в 4-часовом анализе высвобождения Cr для клеток YAC-1 и P815 и в 16-часовом анализе высвобождения Cr для клеток CC531. клетки. Данные показывают, что пит-клетки LD более цитотоксичны в отношении YA C-1, P815 и CC531, чем клетки HD и NK-клетки крови.Значения были средними ± стандартное отклонение от трех до пяти независимых экспериментов. (Гепатология, 1990; 12: 70-75, с разрешения)

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, опосредованной NK-клетками

Считается, что цитотоксическая функция NK-клеток опосредуется несколькими путями, и каждый путь, в принципе, включает в себя каскад событий, включая распознавание клеток-мишеней, связывание эффекторных клеток к клеткам-мишеням (конъюгация), активация эффекторных клеток, доставка летального сигнала к клеткам-мишеням, а также отщепление и рециклинг эффекторных клеток [2,4,50].Хотя точные механизмы отдельных этапов этого процесса полностью не выяснены, в последнее время был достигнут значительный прогресс в идентификации ряда молекул, участвующих в цитотоксичности, опосредованной NK-клетками.

КОНЪЮГАЦИЯ

Предварительным условием уничтожения NK-клеток является связывание одной или нескольких эффекторных клеток с клеткой-мишенью, то есть конъюгация [6]. В этом процессе участвуют несколько молекул адгезии на NK-клетках, таких как CD2, CD28 и LFA-1, и на клетках-мишенях, таких как CD58, B7 и CD54, и некоторые из них могут также обладать костимулирующими или даже запускающими факторами. емкость в цитотоксическом каскаде [28,50-52].

CD2 представляет собой адгезионную молекулу суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), экспрессируемую на Т-клетках и NK-клетках [53]. Примерно 80% ямочных клеток крыс экспрессируют CD ₂ [32]. Хотя CD2 представляет собой хорошо известную активирующую структуру на Т-клетках [53], mAb против CD2, в зависимости от экспериментальных условий, либо индуцируют [54,55], либо ингибируют активность NK [31,56]. MAb против CD2 не влияло на связывание пит-клеток с клетками карциномы толстой кишки крысы (CC531s) или на цитотоксичность против CC531s [57]. Однако mAb против CD2 усиливали цитолитическую функцию ямок крыс в отношении клеток-мишеней Fcγ R ⁺ P815 [57].Лиганд CD2 представляет собой другую молекулу адгезии, CD58 (LFA-3), которая широко экспрессируется на различных типах клеток [53]. Трансфекция CD58 в линии мышиных клеток увеличивала лизис этих мишеней некоторыми клонами человеческих CD2 ⁺ NK-клеток [58]. Однако экспрессии только CD58 недостаточно для придания клеткам чувствительности к лизису, опосредованному NK-клетками, что указывает на то, что CD2 может служить костимулирующим рецептором, который увеличивает, но не инициирует первичную активацию NK-клеток [58].

Было обнаружено, что взаимодействие между интегринами β 2 (CD11a-c / CD18) и ICAM (в молекулах межклеточной адгезии) играет важную роль в связывании NK-клеток с их мишенями [31,51,56].Интегрины β 2 представляют собой гетеродимеры, содержащие общую β-цепь (CD18) и одну из трех различных β-цепей (CD11a, CD11b, CD11c). β 2 Интегрины экспрессируются только в лейкоцитах, включая NK [56] и пит-клетки [32]. Помимо эффекта на связывание с клетками-мишенями, LFA-1 (CD11a / CD18) также участвует в передаче сигнала в NK-клетках, необходимых для активации NK-клеток [59]. Известно, что перекрестное связывание LFA-1 на NK-клетках с его антителом вызывает приток кальция, обмен фосфоинозитидов, продукцию фактора некроза опухоли-α (TNF-α) [59] и ингибирует уничтожение клеток-мишеней NK-клетками [59]. 60].Было также обнаружено, что LFA-1 участвует в цитотоксичности, опосредованной пит-клетками. Антитело против LFA-1 ингибирует не только связывание пит-клеток с клетками-мишенями, но и уничтожение клеток-мишеней пит-клетками [57]. Взятые вместе, эта информация предполагает, что LFA-1 на эффекторных клетках может иметь двойную функцию связывания с клетками-мишенями и запуска цитолиза.

Исследования показали, что конъюгация между NK-клетками и клетками-мишенями необходима, но недостаточна для активности NK [50].После конъюгации необходимы дальнейшие события распознавания, опосредованные запускающими и ингибирующими рецепторами на NK-клетках, для запуска цитотоксической активности NK-клеток [2,51].

РЕЦЕПТОРОВ NK-КЛЕТОК, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРИЗНАНИИ MHC КЛАССА I

Цитотоксичность, опосредованная NK-клетками, первоначально считалась спонтанной и не ограничивалась классом I главного комплекса гистосовместимости. Однако все больше данных указывает на то, что NK-клетки предпочтительно убивают клетки, лишенные MHC класса I. Экспрессия MHC класса I на ряде клеток-мишеней коррелирует с устойчивостью клеток-мишеней к естественному уничтожению [61-65].Маскирование MHC класса I n-mAb усиливает опосредованную пит-клетками цитотоксичность в отношении клеток CC531s, указывая на то, что MHC класса I на клетках CC531s защищает эти клетки от гибели ямочными клетками крысы [66].

Объяснение этих наблюдений состоит в том, что цитотоксическая активность NK-клеток регулируется положительными и отрицательными сигналами от запускающих и ингибирующих мембранных рецепторов. Окончательный результат: , т.е. . запуск цитотоксической активности или ингибирование цитотоксичности, по-видимому, зависит от баланса между положительными и отрицательными сигналами [51,67].В последние годы описано все большее количество пусковых и тормозных рецепторов [28,68,69]. В гибридных рецепторах на NK-клетках распознаются MHC класса I, и они обычно ингибируют лизис клеток MHC класса I ⁺ [28,67-71]. Сообщается, что три семейства рецепторов, Ly49, CD94 / NKG2 и рецепторы, ингибирующие киллерные клетки (KIR), участвуют в распознавании молекул MHC класса I на клетках-мишенях [28]. Семейство Ly49 является продуктом по крайней мере девяти высокородственных генов (Ly 49A-Ly49I), присутствующих на хромосоме 6 мыши в NKC [72].Гомологии Ly-49 были идентифицированы на хромосоме 4 крысы в ​​«NKC» [73], но не были обнаружены у человека. Молекулы Ly-49 относятся к мембранным гликопротеинам II типа и относятся к суперсемейству лектинов С-типа [72]. Рецепторы Ly-49 распознают тримерный комплекс MHC класса I, состоящий из тяжелой цепи H-2D или H-2K, β 2-микроглобулина и связанного пептида. Однако состав связанного пептида, по-видимому, не влияет на взаимодействие в большой степени [68]. Большинство, но не все рецепторы Ly-49 содержат иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM) в своих цитоплазматических доменах [28,67].Рецепторы Ly-49, содержащие последовательность ITIM, ингибируют эффекторную функцию NK-клеток [28,67], тогда как Ly-49, лишенный ITIM, такой как Ly-49D и Ly-49H, может активировать опосредованную NK-клетками цитотоксичность, когда рецептор лигируется муравьем. mAb i-Ly49D [74].

KIR, ингибирующие рецепторы, распознающие MHC класса I в человеческих NK-клетках, представляют собой мономерные гликопротеины I типа, содержащие домены Ig [67]. Они кодируются генами, расположенными на хромосоме человека 19q13.4 [28]. Два подсемейства KIR можно идентифицировать по количеству Ig-подобных доменов во внеклеточных областях молекул [28].Подсемейство KIR3D содержит три Ig-подобных домена, тогда как KIR2D содержит два Ig-подобных домена [28]. Замечательной особенностью как KIR2D, так и KIR3D является неоднородность длины цитоплазматических доменов. KIR с длинными цитоплазматическими доменами, , т.е. . KIR2DL (p58) и KIR3DL (p70) содержат две последовательности ITIM, которые отвечают за ингибирующую функцию этих молекул [67,75]. KIR, содержащие короткие цитоплазматические домены, , т.е. . KIR2DS (p50) и KIR3DS лишены ITIM и потенциально активируют активность NK [76,77].Молекулы KIR2D и KIR3D связываются с тримерами HLA класса I, состоящими из тяжелой цепи класса I, микроглобулина β ² и связанного пептида [28].

Помимо KIR, человеческие NK-клетки также экспрессируют другой тип рецептора, способный распознавать MHC класса I, а именно CD94 / NKG2 [78-80]. Этот рецептор является гетеродимером и состоит из гликопротеина CD94, который дисульфидно связан либо с субъединицей NKG2A, либо с субъединицей NKG2C [58]. Гены CD94 и NKG2 присутствуют на хромосоме 12p12.3-p13 человека.1 в «NKC» [81]. Молекулы CD94 и NKG2 принадлежат к суперсемейству лектинов С-типа [81]. CD94 лишен цитоплазматического домена, что лишает его внутренней способности передавать сигнал [81]. Однако CD94 необходим для транспорта и мембранной экспрессии гликопротеинов NKG2A или NKG2C [78,80]. Поскольку NKG2A обладает последовательностью ITIM в цитоплазматическом домене, а NKG2C не имеет ITIM, комплекс CD94 / NKG2A действует как ингибирующий рецептор, тогда как комплекс CD / NKG2C действует как неингибиторный рецептор для MHC класса I на NK-клетках [28,68] .

Запуск рецепторов NK-клеток

Описано несколько мембранных молекул, которые служат в качестве запускающих рецепторов на NK-клетках, включая CD16, NKR-P1, NK-TR1, 2B4, P38 и Lag3 [28,51,69]. Только CD16 и NKR-P1 можно рассматривать как «установленные» триггерные рецепторы, тогда как роль остальных все еще не определена или спорна [51]. Однако CD16 отвечает и необходим для ADCC и не участвует в естественной киллинговой активности [28].

NKR-P1, маркер NK-клеток [25], экспрессируется NK-клетками крысы [25], мыши [82] и человека [27], включая пит-клетки [16].Есть три гомологичных гена NKR-P1, NKR-P1A, NKR-P1B и NKR-P1C, у мышей и крыс [26,82,83], в то время как был обнаружен только один ген NKR-P1 человека [27]. Было обнаружено, что МА против NKR-P1 мыши и крысы запускают опосредованный NK-клетками лизис клеток-мишеней FcR ⁺ , называемый перенаправленным ADCC [25]. Это действие также включает повышение внутриклеточного уровня Ca ²⁺ [84] и продукцию цитокинов [85]. Кроме того, mAb к NKR-P1 стимулируют оборот фосфоинозитидов [84], образование арахидоновой кислоты [86] и экзоцитоз гранул [25].NKR-P1 на пит-клетках участвует в опосредованной пит-клетками цитотоксичности в отношении мишени FcR ⁺ P815, но не в убийстве мишени FcR ^— CC531s [66]. Однако функция NKR-P1 на NK-клетках человека оказывается более сложной. Обработка человеческих NK-клеток mAb против NKR-P1 дает противоречивые результаты, такие как активация, ингибирование или отсутствие эффекта, в зависимости от изученной популяции NK-клеток [27,87]. Условия, определяющие результат вовлечения NKR-P1 в человеческие NK-клетки, неизвестны.При сравнении человеческого NKR-P с соответствующими белками крысы и мыши было обнаружено, что все NKR P1 грызунов имеют мотив C × CP, который взаимодействует с фосфорилированным P56 ^{1ck [88]} , тогда как человеческий NKR-P1 лишен этого мотива [ 28].

ДВА ОСНОВНЫХ ПУТИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЙ NK-КЛЕТКАМИ

CTL и NK-клетки, в том числе крысиные пит-клетки, убивают клетки-мишени одним из двух отдельных механизмов или обоими: некрозом и апоптозом [19,48,50,89]. Некроз или цитолиз характеризуется набуханием клетки и органелл и приводит к разрушению и утечке клеточной мембраны и к лизису [6].Повреждение клеточной мембраны является ключевым событием в цитолизе, и высвобождение цитоплазматического содержимого, возможно, приводит к воспалительной реакции in vivo [6]. Считается, что анализ высвобождения хрома ⁵¹ отражает этот тип повреждения [6].

Апоптоз или запрограммированная смерть клеток морфологически распознается по мембранным пузырям, конденсации хроматина, фрагментации ядер, сжатию, конденсации клеток и их органелл и фрагментации клеток на апоптотические тельца (рис. 6).Клеточные остатки фагоцитируются соседними клетками или макрофагами. При отсутствии фагоцитозирующих клеток апоптотические тельца прогрессируют до вторичного некроза [6,90].

Рис. 6. Электронная микрофотография апоптоза CC531s (T), совмещенная с пит-клетками (E) в течение 3 часов. Апоптотическая клетка CC531s (T) демонстрирует вакуолизацию (большая стрелка), образование пузырей на поверхности клетки (маленькая стрелка), конденсация хроматина (тонкая стрелка) и фрагментация ядра (толстая стрелка).Полоса: 2 мкм. (Гепатология, 1999; 29: 51-56, с разрешения).

Недавние исследования показали, что апоптоз, опосредованный NK-клетками, в основном может осуществляться двумя путями, , то есть . путь перфорин / гранзим (экзоцитоз гранул) и путь Fas / FasL (лиганд Fas) [91,92]. Считается, что лизис, опосредованный NK-клетками, в основном основан на экзоцитозе гранул [91], тогда как недавно сообщалось о Fas-опосредованном некрозе, когда каспазы блокируются [93].

Fas-путь апоптоза опосредуется взаимодействием лиганда CD95 (CD95 L, FasL) с молекулой индуктора апоптоза CD95 (Fas / APO-1), экспрессируемой на клетках-мишенях [91,94,95].CD95 является членом семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TN F) и фактора роста нервов (NGF) [95, 96]. CD95 широко экспрессируется в лимфоидных и нелимфоидных тканях, а также в некоторых опухолевых клетках [89,95]. Экспрессия CD95 может быть усилена интерфероном γ (IFN-γ) в различных клеточных линиях [96,97]. Цитоплазматический хвост CD95 содержит мотив, называемый «доменом смерти», который важен для передачи апоптотического сигнала [98]. CD95L — трансмембранный белок типа II семейства TNF [95]. CD95L экспрессируется активированными Т-клетками, NK-клетками и pi-Т-клетками [89,95,99,100].Связывание CD95L с его рецептором CD95 вызывает апоптоз CD95-несущих клеток [94]. Показано, что CD95 / CD 95L играет важную роль в уничтожении инфицированных вирусом клеток и опухолевых клеток CTL и NK-клетками [98]. Хотя CD95 экспрессируется на клетках CC531s, а CD95L экспрессируется на клетках ямок крыс, было обнаружено, что апоптоз CC531s, опосредованный пит-клетками, осуществляется исключительно путем экзоцитоза перфорин / гранзим [89].

Путь перфорин / гранзим является зависимым от Ca ²⁺ путем и опосредуется порообразующим белком перфорином и гранзимами, особенно гранзимом B, оба из которых хранятся в гранулах NK-клеток [92].После контакта между эффекторными клетками и клетками-мишенями перфорин и гранзимы направленным образом высвобождаются в межклеточное пространство между этими клетками. Сам по себе перфорин вызывает лизис, не вызывая апоптоза, , то есть . фрагментация ДНК клетки-мишени. Гранзимы играют решающую роль в быстрой индукции фрагментации ДНК CTL, NK-клетками и пит-клетками (рис. 7) [89,101]. Постулируется, что проникновение гранзимов в клетки-мишени происходит через поры, продуцируемые перфорином в мембране клетки-мишени.Недавние исследования показали, что гранзим B подвергается эндоцитозу клетками-мишенями независимо от перфорина, возможно, через насыщаемые участки связывания на поверхности клеток с высоким сродством. В отсутствие перфорина гранзим B имеет цитоплазматическую локализацию. Когда добавляется перфорин, гранзим B перемещается в положение ядра, быстро вызывая апоптоз [102,103]. Эти данные показывают, что сотрудничество двух молекул необходимо для индукции апоптоза, включая фрагментацию ДНК.

Рис. 7. Участие пути перфорин / гранзим в апоптозе CC531s, индуцированном пит-клетками. Отношение свежевыделенных пит-клеток к клеткам CC531s составляло 10: 1. Апоптоз измеряли с помощью 3-часового анализа с использованием ДНК-ферментации. EGTA представляет собой хелатор Ca ²⁺ , который блокирует экзоцитоз гранул и действие перфорина. DCI — ингибитор гранзима. Z-DEVD-FMK является ингибитором каспазы 3. Эти обработки полностью ингибируют апоптоз CC531s, индуцированный пит-клетками. Значения были средними ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. (Гепатология, 1999; 29: 51-56, с разрешения).

РЕЗЮМЕ

Появляется все больше свидетельств того, что пит-клетки являются высокоактивными, специфичными для печени NK-клетками.Пит-клетки расположены в синусоидах печени и могут быть легко изолированы и очищены с помощью синусоидального лаважа печени и метода магнитной сепарации. Кроме того, пит-клетки можно разделить на фракции LD и HD с помощью 45% изоосмотического центрифугирования в градиенте Per coll. Показано, что эти две популяции отличаются морфологически, фенотипически и функционально друг от друга и от NK-клеток крови. Ямочные клетки LD содержат больше везикул с стержневой сердцевиной и больше гранул меньшего размера, чем NK-клетки крови, хотя оба они имеют общую морфологию LGL.Фенотипически клетки LD имеют более высокую экспрессию LFA-1 и более низкую экспрессию молекул asialo-GM 1 по сравнению с NK-клетками крови или селезенки. Функционально пит-клетки более цитотоксичны в отношении нескольких линий опухолевых клеток по сравнению с NK-клетками крови и способны убивать резистентные к NK, но LAK-чувствительные клетки P815. Эти данные показывают, что пит-клетки являются разновидностью естественно активированных NK-клеток, и их цитотоксическая функция сравнима с IL-2 , активированными in vitro NK-клетками. Характеристики клеток HD занимают промежуточное положение между пит-клетками LD и NK-клетками крови.Скорее всего, пит-клетки происходят из NK-клеток крови, хотя при определенных стимулах они обнаруживают митоз в печени. Рекрутирование пит-клеток в печени опосредуется молекулами адгезии. Основной задачей является достижение лучшего понимания механизмов цитотоксичности пит-клеток и взаимодействия пит-клеток с другими клетками печени, , то есть . Kc, Ec и LAL. Более того, поскольку пит-клетки занимают стратегическое положение в синусоидах печени, они представляют собой первую линию клеточной защиты против метастазирующих клеток рака толстой кишки.Особого внимания заслуживает роль пит-клеток при ряде патологий печени.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Карин Сейнав и Марийке Бекеланд за их отличную техническую поддержку и Криса Дерома за ее фотографическую поддержку.

NK-клеток подавляют рост Plasmodium falciparum в эритроцитах за счет антителозависимой клеточной цитотоксичности

Рецензент № 1:

Эта рукопись представляет собой убедительный аргумент в пользу активации человеческих NK-клеток посредством ADCC против покрытых антителами малярийных эритроцитов.Нет никаких доказательств спонтанной цитотоксичности NK-клеток в отношении инфицированных эритроцитов в отсутствие антител, и для этого эффекта требуется использование сыворотки пациентов в эндемичных по малярии районах. Исследования выполнены хорошо и убедительно. Основная проблема заключается в том, что трудно понять, насколько важен этот механизм в фактическом контроле малярийной инфекции in vivo , но для этого потребуется in vivo исследований на людях, что невозможно. С другой стороны, это, по-видимому, важный концептуальный прогресс в разработке эффективных вакцин против малярии.

Было бы интересно узнать, связан ли фенотип KIR NK-клеток человека с ответом на инфицированные RBC и с соответствующими аллелями HLA NK-клеток. Но это выходит за рамки данной статьи.

Было бы интересно изучить влияние генов HLA и KIR на восприимчивость к малярии. Один вопрос заключается в том, способствует ли лицензирование NK-клеток посредством ингибирующего KIR более сильным ответам ADCC на инфицированные эритроциты. Его можно проверить с помощью многоцветного анализа фенотипов NK-клеток и функции ADCC, предпочтительно с образцами от людей, подвергшихся воздействию малярии.Одной из трудностей здесь является обширный полиморфизм генов KIR, который особенно высок в Африке. Стандартные антитела к конкретным членам семейства KIR могут пропускать некоторые полиморфные аллели. Тем не менее такое исследование выполнимо. Фенотипический и функциональный анализ NK-клеток с образцами из Африки должен быть выполнен с приоритетом фенотипов KIR и NKG2A, поскольку только для этого потребуется довольно большое количество антител. Мы еще не проводили такого исследования. Как упомянул рецензент, это выходит за рамки данной статьи.

Другой вопрос: связаны ли конкретные комбинации гаплотипов KIR и HLA с устойчивостью к малярии. Его следует изучать с большими когортами людей, для которых доступны хорошие клинические данные и генетический анализ их генов HLA и KIR. Этот конкретный вопрос, не относящийся к основной теме нашей рукописи, пока не получил широкого распространения.

Рецензент № 2:

Лонг и его коллеги исследуют, могут ли NK-клетки распознавать эритроциты, инфицированные Plasmodium falciparum, и воздействовать на них с помощью ADCC.Они используют дополнительный анализ, включая недавно разработанный анализ GIA-ADCC, чтобы исследовать способность NK-клеток убивать инфицированные клетки. Их данные ясно демонстрируют, что NK-клетки могут опосредовать ADCC с помощью естественной сыворотки и IgG инфицированных пациентов. Они демонстрируют, что это может быть опосредовано встречающимися в природе антителами к PfEMP1 и VAR2CSA, а также моноклональным антителом, распознающим антиген RIFIN. Авторы приходят к выводу, что NK-опосредованное распознавание инфицированных эритроцитов и ингибирование роста паразитов является важным антималярийным механизмом, который необходимо изучить при рассмотрении стратегий вакцинации.

В целом, эксперименты хорошо контролируются, а гипотезы и результаты ясны и хорошо написаны. В этой области имеется некоторая противоречивая информация относительно способности NK-клеток распознавать инфицированные эритроциты, и эти исследования с использованием свежеизолированных NK-клеток и сыворотки инфицированных пациентов должны прояснить это.

Недавно вышла публикация, описывающая связывание белков RIFIN с рецепторами ингибиторов как механизм иммуноэвазии (Saito et al., 2017).Авторы используют моноклональные антитела против RFIN и контроль с мутацией в домене Fc, чтобы продемонстрировать специфичность в отношении ADCC. Хотя контролируемое исследование здесь демонстрирует, что цитотоксический эффект NK, скорее всего, связан с нарушением активации, а не с блокированием лиганда ингибирующего рецептора, обсуждение и ссылка на эту недавнюю рукопись кажутся уместными.

Мы уже упомянули эту интересную статью и потенциал ингибирования NK-клеток белками Plasmodium RIFIN.Однако RIFIN не связывает LAIR-1 дикого типа, который экспрессируется на NK-клетках. Кроме того, мы наблюдали высвобождение гемоглобина после смешивания NK-клеток с P.f .-инфицированных эритроцитов, которые были отобраны по высокой экспрессии RIFIN, в присутствии человеческого моноклонального Ab к RIFIN. Мы можем быть уверены, что активация NK была вызвана не маскированием RIFIN с помощью mAb (и высвобождением из ингибирования), а активацией ADCC человеческим mAb IgG1, поскольку то же самое антитело, лишенное связывания с FcR, не активировало NK-клетки.Теперь это обсуждается в разделе «Обсуждение» исправленной рукописи.

Рецензент № 3:

В этой рукописи Арора и др. Сообщают, что человеческие NK-клетки могут эффективно лизировать эритроциты, инфицированные Plasmodium falciparum, посредством антителозависимой клеточной токсичности.

В целом, авторы представляют набор хорошо спланированных экспериментов, которые легко интерпретировать, данные подтверждают их выводы и образуют связную историю по предмету, представляющему интерес для широкой аудитории.

У меня есть несколько комментариев, которые, я думаю, помогут еще больше укрепить рукопись:

— Авторы используют сыворотку США, но плазму Мали: я думаю, было бы полезно объяснить в обсуждении, почему сыворотка была использована для контрольной группы США и может ли эта разница вообще повлиять на результат эксперимента (увеличить или уменьшить ADCC)

В когорте Мали образцы крови подвергаются антикоагуляции, что позволяет изолировать как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), так и плазму.Сыворотка, собранная от нескольких доноров из США, была получена от Valley Biomedical и использовалась в качестве контроля. Основное преимущество использования объединенной партии сыворотки заключается в том, что она обеспечивает непрерывность наших экспериментов и не вносит вариативность, присущую отдельным донорам-людям. Чтобы напрямую ответить на вопрос, поднятый автором обзора, мы очистили IgG-антитела из плазмы Мали и сыворотки крови США. Эти очищенные IgG дали результаты, аналогичные результатам, полученным с плазмой и сывороткой соответственно. В частности, IgG из контрольной группы США не связывались с инфицированными эритроцитами и не активировали NK-клетки, тогда как IgG от людей из Мали связывались с инфицированными эритроцитами и подавляли рост паразитов в анализе ингибирования роста ADCC (GIA-ADCC).В раздел результатов добавлено предложение.

— Авторы используют NK-клетки от наивных доноров из США и делают вывод, что NK «таким образом способствует защите от малярии на стадии крови»: недавний отчет Mpina et al., (2017) показывает, что частота и количество NK-клеток в крови снижаются. после (и, возможно, во время) паразитемии на стадии крови, что указывает на то, что NK-клетки, присутствующие в крови на стадии инфицирования, могут отличаться по количеству, составу и функциям от NK-клеток, присутствующих в крови здоровой когорты.В ходе обсуждения следует принять во внимание идею о том, что компартмент NK может отличаться в когортах инфицированных и наивных (потенциально влияющих на ADCC).

Наше полное предложение звучало так: «мы показали, что человеческие NK-клетки обладают потенциалом контролировать паразитемию P.f. посредством IgG-зависимой активации цитотоксичности NK-клеток и, таким образом, вносят вклад в защиту от малярии на стадии крови». Вопрос, поднятый рецензентом, обсуждался, и Mpina et al. статья была процитирована в разделе «Обсуждение» исправленной рукописи.В отдельном неопубликованном исследовании мы изучили NK-клетки в когорте людей, живущих в эндемичных по малярии регионах. В целом, NK-клетки обладают хорошей функциональностью, включая ADCC, по отношению к инфицированным RBC. Учитывая небольшое количество крови, взятой у этих людей, было бы невозможно использовать ее для проведения экспериментов, описанных в настоящей рукописи. Хотя мы не упоминаем эти неопубликованные результаты в отредактированной рукописи, они вселяют в нас уверенность в том, что наши результаты имеют отношение к болезни.

— У меня нет опыта, чтобы полностью оценить штаммы паразитов, используемые на рисунках 3 и 4, но мне интересно, может ли общая экспрессия белка паразита в iRBC измениться с удалением или усилением экспрессии интересующего белка (что повлияет на интерпретация данных)

На рисунке 3 показаны данные, полученные с помощью P.f . штамм DC-J, в котором отсутствует экспрессия PfEMP1.

В результате большая часть реактивности с Ат у взрослых Мали была потеряна с DC-J-инфицированными эритроцитами.Известно, что PfEMP1 является доминирующим белком паразита, экспрессирующимся на поверхности инфицированных эритроцитов. Целью этих экспериментов было намеренное изменение общего количества паразита PfEMP1 на iRBC. В экспериментах на фиг. 4 использовались iRBC, обогащенные для экспрессии RIFIN, или RBC, инфицированные штаммом, который экспрессирует вариант var2CSA PfEMP1. Поскольку эти эксперименты проводились с использованием антител, специфичных к каждому из этих антигенов, RIFIN или var2CSA, они не предназначались для взятия пробы общих белков паразитов на iRBC.

— Статистический анализ: укажите в легенде каждого рисунка, когда проводился t-тест по сравнению с anova

Это было сделано.