Гк статья 8: ГК РФ Статья 8. Основания возникновения гражданских прав и обязанностей

Содержание

ГК РФ Статья 8. Основания возникновения гражданских прав и обязанностей

1. Гражданские права и обязанности возникают из оснований, предусмотренных законом и иными правовыми актами, а также из действий граждан и юридических лиц, которые хотя и не предусмотрены законом или такими актами, но в силу общих начал и смысла гражданского законодательства порождают гражданские права и обязанности.

В соответствии с этим гражданские права и обязанности возникают:

1) из договоров и иных сделок, предусмотренных законом, а также из договоров и иных сделок, хотя и не предусмотренных законом, но не противоречащих ему;

1.1) из решений собраний в случаях, предусмотренных законом;

(пп. 1.1 введен Федеральным законом от 30.12.2012 N 302-ФЗ)

2) из актов государственных органов и органов местного самоуправления, которые предусмотрены законом в качестве основания возникновения гражданских прав и обязанностей;

3) из судебного решения, установившего гражданские права и обязанности;

4) в результате приобретения имущества по основаниям, допускаемым законом;

5) в результате создания произведений науки, литературы, искусства, изобретений и иных результатов интеллектуальной деятельности;

6) вследствие причинения вреда другому лицу;

7) вследствие неосновательного обогащения;

8) вследствие иных действий граждан и юридических лиц;

9) вследствие событий, с которыми закон или иной правовой акт связывает наступление гражданско-правовых последствий.

2. Утратил силу с 1 марта 2013 года. — Федеральный закон от 30.12.2012 N 302-ФЗ.

(см. текст в предыдущей редакции)

Открыть полный текст документа

Основания возникновения гражданских прав и обязанностей, определенные в статье 8 ГК РФ

Права и обязанности участников гражданского правового оборота являются неотъемлемой частью отношений между ними и регулируются законом. Основанием для их возникновения является само законодательство, действия субъектов права, постановления органов власти, судебные решения. Возникновение обязанностей или прав, предусмотренных законом, связано с наступлением каких-то событий. К примеру, при достижении возраста, предусмотренного законом о воинской службе, все лица мужского пола подлежат призыву в ряды вооруженных сил.

Права и обязанности имеют свойство возникать, изменяться и прекращаться. Так, при наступлении определённого возраста мужчины не могут призываться на срочную службу в армии в мирное время, а при достижении ещё одного возрастного предела выбывают из списков военнообязанных и не подлежат призыву даже в том случае, если начнётся война.

Основными правами и обязанностями, которые относятся к гражданскому правовому обороту, являются все те, что связаны с экономическими отношениями, нужными лицам для получения материальных благ. Однако материальный базис правового оборота не является непосредственным источником возникновения прав. Для этого нужны юридические основания движения гражданско-правового оборота. Их и устанавливает ст. 8 ГК РФ.

Теоретические основы возникновения прав и обязанностей в гражданском правовом обороте

Основанием для возникновения правового движения гражданского оборота является комплекс юридических явлений, которые связаны между собой и порождают различные правовые последствия, влекущие возникновение, изменение или прекращение прав и обязанностей. Сами же материальные основания лишь создают возможность для появления правовых отношений.

К примеру, покупка автомобиля связана со сбором соответствующих материальных средств, заключением сделки купли продажи, регистрацией автотранспортного средства и возникновением имущественных прав и бремени его содержания, включая оплату налогов.

Однако автомобиль лишь создаёт условия для того, чтобы возникло право владения и использования его в качестве имущества. В основе же появления права лежит воля гражданина, направленная на удовлетворение своих потребностей. Именно по этой причине он становится стороной в сделке купли-продажи.

В свою очередь нормативные и правосубъектные основания лишь создают предпосылки для динамики правоотношений. Так, право собственности на автомобиль является потенциальной основой для возможности его продать, обменять, подарить, выставить в качестве залога по сделке или использовать. Иначе это именуется предпосылками движения правовой связи.

Основанием движения гражданского-правового оборота являются юридические факты. Именно факт того, что гражданин является собственником автомобиля порождает право совершать сделки, в которых машина выступит в качестве предмета.

В гражданско-правовой сфере разрешено всё, что не запрещают какие-то правовые нормативные акты. Поэтому владелец автомобиля может заключить договор, по условиям которого с автомобилем произойдёт что-то, что не находит отражения ни в одной статье ГК РФ. К примеру, если он убеждённый коммунист, то может перевести автомобиль из личной в общую собственность, заключив с кем-либо соответствующую сделку.

С формальной точки зрения это окажется более похожим на дарение, хотя и не будет являться им в чистом виде, поскольку общая собственность оставляет за бывшим единоличным владельцем право использовать вещь тогда, когда собственники сочтут это возможным. Свобода договорных отношений, закреплённая в ст. 421 ГК РФ, допускает заключение и таких сделок. Главное их условие — это сохранение принципа взаимного юридического равенства.

Перечень оснований возникновения прав и обязанностей по ст. 8 ГК РФ

В ст. 8 ГК РФ содержится перечень оснований для возникновения прав и обязанностей у граждан:

заключение договоров и совершение других сделок, которые не противоречат закону;
утверждение решений собраний, не противоречащих закону и в случаях, когда собрание имеет полномочия наделить кого-то соответствующими правами или обременить обязанностями;
издание актов госорганами и органами местного самоуправления, которые предусмотрены законом в качестве основания для возникновения прав и обязанностей;
вынесение судебных постановлений соответствующего характера;
приобретении имущества, включая вступление в наследство и другие формы, находящиеся в соответствии с законом;
в результате творческой активности и другой интеллектуальной деятельности в области искусства, научной работы, изобретений;
причинение вреда другому лицу;
возникновение неосновательного обогащения;
иных действий физических или юридических лиц;
наступление событий, которые по закону влекут за собой правовые последствия.

Перечень носит довольно условный характер, поскольку правовые последствия могут возникнуть не в результате одного события или явления, а в силу юридического состава, как в юриспруденции принято называть комплекс причин.

До вступления в силу ФЗ от 30.12.2012 № 302-ФЗ в ст. 8 был п. 2, но теперь его содержание расширено и вынесено в отдельную часть ст. 8.1 ГК РФ. Сущность не изменилась, а содержание расширено и разделено на 10 пунктов. Все они посвящены государственной регистрации права на имущество.

Если закон требует государственной регистрации права на имущество, то оно возникает с момента осуществления этой процедуры. Так, право собственника у покупателя квартиры возникнет только в тот момент, когда в госреестре появится запись о регистрации сделки купли-продажи, а не в день подписания договора или его нотариального удостоверения.

Отражение ст. 8 ГК РФ в судебном делопроизводстве и материалах высших судов

При рассмотрении конкретных судебных споров ст. 8 ГК РФ чаще всего упоминается в списке тех основополагающих статей, которые имеют отношение к существу дел. К примеру, в определении по делу № 305-ЭС16-5121, которое рассматривалось 06.06.2016 г. судебной коллегией по экономическим спорам ВС РФ, указано, что суды руководствовались ст. ст. 8, 539, 544, 548 ГК РФ. Суть дела заключается в том, что одно юридическое лицо взыскивало задолженность за теплоснабжение и горячее водоснабжение с другой.

Комментируемая статья упомянута по той причине, что все другие относятся к заключению договоров, которые и являются основанием для возникновения прав и обязанностей у сторон. Этот пример приведён нами для того, чтобы показать универсальность статьи 8 ГК РФ, положения которой относятся не только к физическим, но и юридическим лицам, поскольку все они являются участниками гражданского правового оборота.

Статья 8 ГК РФ с комментариями — Основания возникновения гражданских прав и обязанностей

В соответствии с этим гражданские права и обязанности возникают:

1) из договоров и иных сделок, предусмотренных законом, а также из договоров и иных сделок, хотя и не предусмотренных законом, но не противоречащих ему;
1.1) из решений собраний в случаях, предусмотренных законом;
2) из актов государственных органов и органов местного самоуправления, которые предусмотрены законом в качестве основания возникновения гражданских прав и обязанностей;
3) из судебного решения, установившего гражданские права и обязанности;
4) в результате приобретения имущества по основаниям, допускаемым законом;

5) в результате создания произведений науки, литературы, искусства, изобретений и иных результатов интеллектуальной деятельности;
6) вследствие причинения вреда другому лицу;
7) вследствие неосновательного обогащения;
8) вследствие иных действий граждан и юридических лиц;
9) вследствие событий, с которыми закон или иной правовой акт связывает наступление гражданско-правовых последствий.

2. Утратил силу с 1 марта 2013 г.

Комментарий к статье 8 Гражданского Кодекса РФ

1. Комментируемая статья указывает на фактические обстоятельства, с которыми связывается возникновение гражданских прав и обязанностей. Поскольку в ГК отсутствуют общие нормы, посвященные основаниям изменения и прекращения гражданских прав и обязанностей, приведенный в комментируемой статье перечень юридических фактов может служить известным ориентиром также и для них.

2. Приведенные в комментируемой статье основания возникновения гражданских прав и обязанностей базируются на традиционной классификации юридических фактов, в соответствии с которой все юридические факты делятся на действия и события, действия подразделяются на правомерные и неправомерные, правомерные действия образуют сделки, административные акты и судебные решения и т.д.

Принципиальное значение имеет положение п. 1 ст. 8 о том, что перечень оснований возникновения гражданских прав не является исчерпывающим. В данной норме проявляется дозволительная направленность гражданско-правового регулирования.

3. Среди конкретных оснований возникновения гражданских прав и обязанностей, которые прямо названы в комментируемой статье, на первом месте стоят договоры и иные сделки. Это понятно, поскольку гражданские права и обязанности устанавливаются прежде всего волевыми действиями участников гражданского оборота, специально направленными на порождение тех или иных юридических последствий.

При этом субъекты гражданского права могут заключать между собой как предусмотренные, так и не предусмотренные законом договоры и иные сделки. В последнем случае важно лишь, чтобы договор или иная сделка не противоречили закону или иному правовому акту.

Подпункт 1 п. 1 ст. 8 открывает возможность заключения и таких договоров и иных сделок, которые содержат элементы различных договоров, предусмотренных законом или иными правовыми актами.

Указанные положения получили развитие в ст. 421 ГК, раскрывающей принцип свободы договора.

4. Возникновение гражданских прав и обязанностей непосредственно из актов государственных органов и органов местного самоуправления, о котором говорится в подп. 2 п. 1 ст. 8, — явление относительно редкое и возможное лишь в случаях, прямо предусмотренных законом. Примером может служить решение уполномоченного государственного органа о реквизиции имущества у собственника при обстоятельствах, носящих чрезвычайный характер (ст. 242 ГК). Однако в большинстве случаев гражданские права и обязанности возникают из сложного юридического состава, в котором акт государственного органа или органа местного самоуправления является лишь одним из его элементов.

По смыслу закона в подп. 2 п. 1 ст. 8 имеются в виду лишь правомерные акты органов государственной власти и органов местного самоуправления. Акты, принятые указанными органами в противоречии с законом, равно как и бездействие этих органов в условиях, когда они обязаны были действовать, порождают гражданские права и обязанности лишь в связи с причинением ими вреда другому лицу.

5. Под судебным решением как основанием возникновения гражданских прав и обязанностей понимаются судебные акты любых судов, принятые ими при разрешении конкретных дел, законная сила которых признана на территории РФ. Такими судебными актами могут быть не только собственно решения, но и определения и постановления судебных инстанций, акты судов общей юрисдикции, арбитражных и третейских судов, акты не только российских, но и иностранных судов и т.п.

Конечно, с теоретической точки зрения соответствующие права и обязанности возникают не из судебных актов, а из тех фактических обстоятельств, которые ими установлены. Судебные акты лишь подтверждают наличие этих прав и обязанностей у участников гражданского оборота. В большинстве случаев для констатации этого обстоятельства достаточно вступления судебного акта в законную силу и не требуется совершения каких-либо дополнительных действий по исполнению судебного решения. Так, при разрешении судом спора об изменении договора в связи с существенным изменением обстоятельств (ст. 451 ГК РФ) измененные судом условия договора вступают в действие вместе со вступлением в законную силу самого судебного решения независимо от того, внесли ли стороны изменения в сам договор. В равной мере не требует нотариального удостоверения сделка, признанная действительной решением суда в условиях, когда одной из сторон сделка фактически исполнена, а другая сторона уклоняется от ее нотариального удостоверения (ст. 165 ГК). Однако тогда, когда в соответствии с действующим законодательством права нуждаются в регистрации (например, права на недвижимость), они возникают в результате такой регистрации, основанием для которой служит судебный акт.

6. Такое основание возникновения гражданских прав и обязанностей, как приобретение имущества по основаниям, допускаемым законом, особо выделено в законе для того, чтобы охватить им случаи приобретения имущества, которые не подпадают под договоры, иные сделки и другие предусмотренные настоящей статьей основания. В частности, сюда относятся создание новой вещи (п. 1 ст. 218 ГК), переработка (ст. 220 ГК), обращение в собственность общедоступных для сбора вещей (ст. 221 ГК), приобретение права собственности на находку (ст. 228 ГК) и др.

7. Указание подп. 5 п. 1 ст. 8 на то, что гражданские права и обязанности возникают в результате создания объектов интеллектуальной собственности, является верным в отношении не всех объектов, а лишь тех, которые становятся охраняемыми с самого момента их создания и, разумеется, придания им объективной формы, допускающей их восприятие другими людьми. К ним, в частности, относятся произведения науки, литературы и искусства, объекты смежных прав, топологии интегральных микросхем и др. Напротив, изобретения и другие объекты патентного права нуждаются в признании их таковыми в установленном законом порядке. Поэтому помимо их создания требуется выполнение ряда формальностей, связанных с оформлением и подачей соответствующей заявки, ее рассмотрением патентным ведомством и т.д.

8. Причинение вреда другому лицу и неосновательное обогащение (подп. 6 и 7 п. 1 ст. 8) объединяет то, что в обоих случаях гражданские права (право потерпевшего требовать возмещения причиненного вреда или возврата неосновательного обогащения) и обязанности (обязанность возместить вред или возвратить неосновательное обогащение) возникают в результате неправомерного поведения должника. Оно может выражаться как в его противоправных действиях, так и в бездействии, а также быть виновным или невиновным.

9. Подпункт 8 п. 1 ст. 8 подчеркивает, что приведенный в комментируемой статье перечень действий граждан и юридических лиц, порождающих гражданские права и обязанности, является открытым. Это действительно так, поскольку за его пределами оказались даже некоторые из тех действий, которые прямо предусмотрены законом. В частности, в него не попали акты органов управления хозяйственных обществ, кооперативов, общественных организаций и т.п., некоторые виды юридических поступков, молчание и проч.

Помимо предусмотренных законом гражданские права и обязанности могут порождать и не предусмотренные им действия граждан и юридических лиц, которые согласуются с общими началами и смыслом гражданского законодательства (п. 1 комментируемой статьи).

10. Под событиями как основаниями гражданских прав и обязанностей понимаются протекающие независимо от воли и сознания людей фактические обстоятельства, с которыми закон или иные правовые акты связывают наступление гражданско-правовых последствий. К числу событий относятся, например, стихийные бедствия, смерть и рождение людей, военные действия и т.п. К событиям следует отнести и сроки ввиду объективности их течения и наступления.

11. В п. 2 ст. 8 специально подчеркивается, что в случаях, когда права на имущество подлежат государственной регистрации, они возникают лишь в момент такой регистрации. Данное правило рассчитано прежде всего на сделки и иные действия, связанные с приобретением прав на недвижимое имущество (см. ст. 131 ГК и комментарий к ней).

Однако сформулированное в данном пункте положение имеет более широкую сферу применения и в принципе применяется во всех случаях, когда в соответствии с законом требуется обязательная регистрация тех или иных прав или действий. Например, такое же значение имеет регистрация в патентном ведомстве договоров об уступке патентных прав или выдаче лицензий.

Основания возникновения и осуществление гражданских прав и обязанностей

Полное описание

Гражданские права и обязанности по общему правилу возникают из оснований, предусмотренных актами гражданского законодательства. Но, как известно, в гражданско-правовой сфере разрешено все, что прямо не запрещено (законодательством). Поэтому гражданские права и обязанности возникают также из действий субъектов гражданского права, которые хотя и не предусмотрены актами гражданского законодательства, но в силу общих начал и смысла гражданского законодательства порождают гражданские права и обязанности.

Например, собственник жилого помещения заключает с кем-либо соглашение, в соответствии с которым оно станет общей собственностью. Если это возмездная сделка, то она похожа на куплю-продажу, а если безвозмездная — то на дарение. Но это не купля-продажа и не дарение «в чистом виде». Это отношения, не предусмотренные законодательством, но ему не противоречащие и поэтому признаваемые и защищаемые государством. Соответствующее соглашение в силу общих начал и смысла гражданского законодательства порождает гражданские права и обязанности.

Основания движения гражданского правоотношения подразделяются на действия и события.

Гражданские права и обязанности могут порождаться (изменяться, прекращаться) как правомерными, так и неправомерными действиями. К числу первых относятся, например, договоры и иные сделки, не противоречащие закону. Неправомерным является, к примеру, причинение вреда другому лицу.

В соответствии с этим гражданские права и обязанности возникают:

из договоров и иных сделок, предусмотренных законом, а также из договоров и иных сделок, хотя и не предусмотренных законом, но не противоречащих ему;
из актов государственных органов и органов местного самоуправления, которые предусмотрены законом в качестве основания возникновения гражданских прав и обязанностей;
из судебного решения, установившего гражданские права и обязанности;
в результате приобретения имущества по основаниям, допускаемым законом;
в результате создания произведений науки, литературы, искусства, изобретений и иных результатов интеллектуальной деятельности;
вследствие причинения вреда другому лицу;
вследствие неосновательного обогащения;
вследствие иных действий граждан и юридических лиц;
вследствие событий, с которыми закон или иной правовой акт связывает наступление гражданско-правовых последствий.

К договорам, упоминаемым в п.1 ст. 8 ГК РФ, относятся такие гражданско-правовые соглашения, как договоры купли-продажи, дарения, найма, безвозмездного пользования и т.д.

В ряде случаев закон не упоминает о договоре, но договорная природа отношений не вызывает сомнения, например соглашение о вселении временных жильцов (ст.680 ГК).

Данный вопрос рассматривался Постановлением Десятого арбитражного апелляционного суда от 11.03.2012 по делу N А41-36702/11

Суд, анализируя положения ст. 8 и ст.153 ГК РФ, пришел к выводу о том, что основаниями возникновения обязательств являются не только договор, но и действия сторон, направленные на возникновение обязательств.

При этом судебная практика отмечает, что отсутствие между сторонами письменного договора не является основанием для невозникновения гражданских прав и обязанностей.

В постановлении Четырнадцатого арбитражного апелляционного суда от 28.07.2010 по делу N А44-2994/2009 указано:

По мнению суда, сославшегося на п. 1 ст. 8, ст. ст. 309, 544 ГК РФ, поскольку в рассматриваемом случае истец поставил электрическую энергию на объекты ответчика, у последнего в силу ст. 8 ГК РФ возникла обязанность оплатить истцу стоимость полученной тепловой энергии и горячей воды, а у истца — право требовать этой оплаты. Как отметил суд, отсутствие письменного договора не освобождает фактического потребителя от обязанности возместить стоимость тепловой энергии и горячей воды, потребленных принадлежащими ему объектами.

Говоря об «иных сделках», упоминание о которых также содержится в статье 8 ГК РФ можно указать, например, на завещательный отказ: на наследника, к которому переходит жилой дом, квартира или иное жилое помещение, завещатель может возложить обязанность предоставить другому лицу на период жизни этого лица или на иной срок право пользования этим помещением либо его определенной частью. Волеизъявление на получение завещательного отказа также есть односторонняя сделка, входящая в юридический состав, порождающий право отказополучателя пользоваться жилым помещением. Напротив, отказ от принятия завещательного отказа представляет собой одностороннюю сделку, препятствующую возникновению права пользования. Односторонней сделкой является публичное обещание награды и т.д.

При этом важно отметить, что если сделка признана незаключенной в соответствии с положениями, установленными в ГК РФ , то она не порождает никаких права и обязанностей:

Постановление Восемнадцатого арбитражного апелляционного суда от 21.04.2010 N 18АП-2124/2010 по делу N А76-35248/2009

Суд разъяснил, что незаключенная сделка в силу ст.8 ГК РФ не влечет правовых последствий и не порождает для сторон возникновение прав и обязанностей, соответственно, не может являться документом — основанием для государственной регистрации.

Акты государственных органов и органов местного самоуправления сравнительно редко порождают (изменяют, прекращают) гражданские права и обязанности. К их числу относятся, например, акты государственной регистрации прав на недвижимость (ст. 131 ГК), государственной регистрации юридического лица (ст.51 ГК), решения об изъятии земельного участка (ст. 279 ГК) и др.

Решение суда чаще всего призвано защитить уже существующее право. Вместе с тем нередко решение суда порождает (изменяет, прекращает) гражданские права и обязанности. Так, по решению суда может быть признано право муниципальной собственности на бесхозяйную недвижимую вещь п.3 ст. 225 ГК). В установленных законом случаях по решению суда договор может быть изменен или расторгнут (ст. 450 ГК РФ). На основании решения суда возможно принудительное изъятие имущества у собственника путем обращения взыскания по обязательствам собственника (ст.237 ГК РФ).

Так как решение суда является равноправным основанием возникновения гражданских прав и обязанностей, то в случае, если решение суда отменяется вышестоящей инстанцией, основание возникновения гражданских правоотношений так же признается несуществующим.

Так, Тринадцатый Апелляционный суд в своем постановлении от 13.03.2009 по делу N А56-25439/2008 установил, что судебный акт, на основании которого была произведена государственная регистрация прав ответчика на объект недвижимости, впоследствии был признан незаконным и отменен. В этой связи суд разъяснил, что государственная регистрация указанного объекта являлась также незаконной, поскольку такая регистрация при отсутствии оснований возникновения права противоречила ст.8 ГК РФ.

Иногда возникновение (изменение, прекращение) гражданских прав и обязанностей гражданским законодательством связывается с наступлением определенного события. Так, правоспособность гражданина возникает в момент его рождения и прекращается смертью (ст. 17 ГК). Наличие у гражданина психического расстройства, в результате которого он не может понимать значение своих действий или руководить ими, является основанием для признания его недееспособным; над ним устанавливается опека (п.1 ст.29 ГК).

Обязательство прекращается невозможностью исполнения, если она вызвана обстоятельством, за которое ни одна из сторон не отвечает (п.1 ст.416 ГК).

Нередко динамика гражданского правоотношения связывается с таким своеобразным событием, как истечение срока (см., например, ст. 225, 228 ГК).

С учетом сказанного следует принять во внимание некоторую условность перечня оснований возникновения гражданских прав и обязанностей, содержащегося в ст.8 ГК РФ. Нередко гражданское правоотношение порождается не одним из оснований, указанных в ней, но определенным юридическим составом. Так, наследование по завещанию осуществляется на основании юридического состава, включающего в себя следующие юридические факты: а) смерть завещателя или объявление его умершим; б) завещание; в) принятие наследства.

Так, в Постановлении Восемнадцатого арбитражного апелляционного суда от 05.03.2012 N 18АП-628/2012 по делу N А47-9836/2010 устанавливается, что по смыслу п.1 ст.8 ГК РФ и ст. 29 и 36 ЗК РФ правоотношения по предоставлению в собственность земельных участков возникают на основании сложного юридического состава, включающего издание собственником земли соответствующего распоряжения и заключение договора купли-продажи.

Об этом так же свидетельствует:

Постановление Третьего арбитражного апелляционного суда от 24.11.2010 по делу N А33-4407/2010: Суд разъяснил, что акт сверки может являться доказательством отгрузки (передачи) товара, но только в совокупности с другими документами. Акт не создает прав и обязанностей у лиц, которые в нем названы, и сам по себе не является бесспорным доказательством отсутствия или наличия у ответчика долга, не может привести к возникновению обязательства. В силу ст.8 ГК РФ права и обязанности не возникают из актов сверки.

В соответствии с ГК РФ одним из оснований возникновения гражданских прав и обязанностей является неосновательное обогащение.

В судебной практике часто встречаются случаи столкновения интересов в данной области. Так, например,

ФАС Волго-Вятского округа в своем постановлении от 27.02.2012 по делу N А39-41/2011 отметил, что ст.8 ГК РФ указывает на неосновательное обогащение как одно из оснований возникновения гражданских прав и обязанностей. При этом суд, ссылаясь также на п.1 ст.1102 ГК РФ, пояснил, что, заявив требование о взыскании неосновательного обогащения, истец должен доказать: факт получения ответчиком имущественной выгоды за счет истца при отсутствии соответствующих оснований, установленных законом, иными правовыми актами или договором, и размер неосновательного обогащения. Недоказанность хотя бы одного из перечисленных элементов является основанием для отказа в удовлетворении требования о взыскании неосновательного обогащения.

Нередко встречаются постановления, дающие разъяснения всех необходимый условий, при которых права и обязанности в гражданских правоотношениях будут возникать на основании ст. 8 ГК РФ.

Примерами таких постановлений являются:

Постановление Третьего арбитражного апелляционного суда от 05.10.2010 по делу N А33-1407/2010
Постановление Второго арбитражного апелляционного суда от 24.09.2010 по делу N А82-2800/2010-39

Суды разъясняют, что для возникновения обязательства из неосновательного обогащения необходимо наличие следующих трех условий:

имеет место приобретение или сбережение имущества, то есть увеличение стоимости собственного имущества приобретателя, присоединение к нему новых ценностей или сохранение того имущества, которое по всем законным основаниям неминуемо должно было выйти из состава его имущества;
приобретение или сбережение произведено за счет другого лица, а имущество потерпевшего уменьшается вследствие выбытия из его состава некоторой части или неполучения доходов, на которые это лицо правомерно могло рассчитывать;
отсутствуют правовые основания, то есть когда приобретение или сбережение имущества одним лицом за счет другого не основано ни на законе (иных правовых актах), ни на сделке, а значит, происходит неосновательно.

П.2 ст. 8 ГК РФ устанавливает, что права на имущество, подлежащие государственной регистрации, возникают с момента регистрации соответствующих прав на него, если иное не установлено законом.

Данный пункт закрепляет очень важное правило, касающееся прав на недвижимое имущество. Такие права подлежат государственной регистрации ( ст.131 ГК), и именно с моментом регистрации связывается возникновение права (нет регистрации — нет права).

Об этом свидетельствует Постановление ФАС Дальневосточного округа от 29.08.2011 N Ф03-3732/2011 по делу N А24-4582/2010

Суд, ссылаясь на ст. 8 ГК РФ, п.1 ст.2 ФЗ «О государственной регистрации прав на недвижимое имущество и сделок с ним», разъяснил, что сам по себе акт регистрации (регистрационная запись) носит правоподтверждающий характер и не является самостоятельным основанием возникновения гражданских прав.

При этом специальное законодательство устанавливает иные условия возникновения прав и обязанностей, в зависимости от своего предмета регулирования:

Законом (и только законом) могут устанавливаться исключения из указанного правила. Их немного. Так, член потребительского кооператива, другие лица, полностью внесшие паевой взнос за квартиру, дачу, гараж, иное помещение, предоставленное этим лицам кооперативом, приобретают право собственности на данное имущество ( п. 4 ст.218 ГК). Названные лица становятся собственниками с момента выплаты паевого взноса. В соответствии со ст. 1152 ГК РФ принятое наследство признается принадлежащим наследнику со дня открытия наследства независимо от времени его фактического принятия, а также независимо от момента государственной регистрации права наследника на наследственное имущество, если такое право подлежит государственной регистрации.

Постановление Девятого арбитражного апелляционного суда от 11.10.2010 N 09АП-23831/2010 по делу N А40-48749/10-120-180

По мнению суда, из системного толкования п.2 ст. 8 ГК РФ, ст.16 ФЗ «О введении в действие Жилищного кодекса Российской Федерации» следует, что для лиц, являющихся собственниками помещений в многоквартирном доме, установлен иной момент возникновения права собственности на земельный участок. Этим моментом является дата введения в действие ЖК РФ, при условии если земельный участок был сформирован и в отношении его был проведен государственный кадастровый учет.

Адишова Алина

Юридическая фирма Москва

Статья 8 ГК РФ с комментариями

Полный текст ст. 8 ГК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 8 ГК РФ.

В соответствии с этим гражданские права и обязанности возникают:
1) из договоров и иных сделок, предусмотренных законом, а также из договоров и иных сделок, хотя и не предусмотренных законом, но не противоречащих ему;
1.1) из решений собраний в случаях, предусмотренных законом;
2) из актов государственных органов и органов местного самоуправления, которые предусмотрены законом в качестве основания возникновения гражданских прав и обязанностей;
3) из судебного решения, установившего гражданские права и обязанности;
4) в результате приобретения имущества по основаниям, допускаемым законом;
5) в результате создания произведений науки, литературы, искусства, изобретений и иных результатов интеллектуальной деятельности;
6) вследствие причинения вреда другому лицу;
7) вследствие неосновательного обогащения;
8) вследствие иных действий граждан и юридических лиц;
9) вследствие событий, с которыми закон или иной правовой акт связывает наступление гражданско-правовых последствий.

2. Пункт утратил силу с 1 марта 2013 года — Федеральный закон от 30 декабря 2012 года N 302-ФЗ.

Комментарий к статье 8 ГК РФ

1. Возникновение гражданских прав и обязанностей обусловлено определенными обстоятельствами, встречающимися в жизнедеятельности людей и предусмотренных законом и иными правовыми актами. Следует также иметь в виду, что когда речь идет о возникновении гражданских прав и обязанностей, то предусматривается их изменение и прекращение, что может привести к возникновению других прав и обязанностей. Те конкретные обстоятельства, которые приводят к таким юридическим последствиям, как возникновение, изменение и прекращение определенных гражданских прав и обязанностей (а не к любым правам и обязанностям), называются основаниями возникновения гражданских прав и обязанностей.

Так, договор о производстве ремонтно-строительных работ, заключенный между предприятием и гражданином, становится основанием возникновения между этими сторонами правоотношения подрядного характера, предусматривающего права и обязанности сторон. Основанием изменения ранее возникшего правоотношения будет соглашение о замене исполнения обязательства. Далее, утрата вещи служит основанием прекращения правоотношения, возникшего по поводу индивидуально-определенной вещи.

2. В ст. 8 ГК РФ содержится перечень оснований возникновения гражданских прав и обязанностей.

Первым и наиболее распространенным основанием ст. 8 ГК РФ указывает на договоры и иные сделки, а также на договоры и иные сделки, хотя и не предусмотренных законом, но и не противоречащих ему.

Сделки являются одним из главных юридико-фактических оснований возникновения, изменения и прекращения гражданских прав и обязанностей.

В соответствии со ст. 153 ГК РФ сделками признаются действия граждан и юридических лиц, направленные на установление, изменение и прекращение гражданских прав и обязанностей.

Сделки обладают определенными признаками. Во-первых, сделка есть юридический факт — юридическое действие, преследующее достижение определенной цели результата. Во-вторых, сделка — это волевой акт. Сущность сделки как действия составляют воля и волеизъявление. Воля есть внутреннее осознанное намерение лица совершить сделку. Волеизъявление — это выраженная вовне воля лица, доведение до сведения других лиц желания лица заключить сделку. Иначе говоря, сделка должна получить внешнее (объективированное) выражение, например, устно или путем объявления в печати, по телевидению и т.д. В-третьих, сделка характеризуется особой направленностью. Она всегда направлена на достижение определенного правового результата. В-четвертых, сделка — это правомерное юридическое действие. Несоответствие сделки закону или иному правовому акту влечет ее абсолютную или относительную недействительность (ст. 168 ГК РФ).

Действительность сделки должна соответствовать определенным требованиям, условиям. Это следующие условия: 1) сделки могут совершаться и совершаются правоспособными и дееспособными лицами; 2) по своему содержанию сделка должна соответствовать закону и должны быть совершена управомоченным лицом; 3) сделка должна отвечать требованию единства воли и волеизъявления; 4) должна быть соблюдена форма сделки. Сделки совершаются устно или в письменной форме (ст. 158 ГК РФ). Письменная форма подразделяется на простую и нотариально удостоверенную. Статья 164 ГК РФ предусматривает государственную регистрацию сделок с землей и другими объектами, относящимся к недвижимому имуществу, в случаях, предусмотренных законом (ст. 131 ГК РФ).

Общие положения и требования о сделках распространяются на договоры, являющиеся разновидностью сделок и основанием возникновения гражданских прав и обязанностей (например, из договоров купли-продажи (ст. 454 ГК РФ), мены (ст. 567), дарения (ст. 572), аренды (ст. 606), найма жилого помещения (ст. 671), подряда (глава 37 ГК РФ), перевозки (ст. 784 ГК РФ), хранения (ст. 886), страхования (ст. 927, 929) и др.).

Права и обязанности могут возникать из договоров и иных сделок, хотя и не предусмотренных законом, но и не противоречащих ему. Например, договоры между гражданами о совместном приобретении билетов денежно-вещевой лотереи. В договоре обычно предусматриваются условия о разделе между участниками договоров выигрышей по таким билетам.

Следующим основанием возникновения прав и обязанностей являются акты государственных органов и органов местного самоуправления. Для государственных, кооперативных и общественных организаций, а также и для граждан важным основанием возникновения прав и обязанностей являются акты государственных органов и органов местного самоуправления. Здесь могут быть планирования, акты, связанные с управленческой деятельностью, действием хозяйственного механизма и его влиянием на формирование и становление рыночных отношений. Например, ФЗ от 13.12.94 N 60-ФЗ «О поставках продукции для федеральных государственных нужд» устанавливается порядок заключения контрактов (договоров) на поставку товаров для государственных нужд. Соответствующие нормативные акты устанавливают порядок заключения государственных контрактов (договоров) на выполнение подрядных работ для государственных нужд. Индивидуальные правовые акты также направлены на возникновение прав и обязанностей. Например, выдача ордера на занятие жилого помещения определенному гражданину создает для него права требовать от собственника (наймодателя) заключения договора найма жилого помещения.

Судебное решение также является основанием возникновения прав и обязанностей. Например, суд своим решением признал право гражданина на определенную спорную вещь или восстановил положение, существовавшее до нарушения права.

Приобретение имущества по основаниям, допускаемым законом — одно из оснований возникновения гражданских прав и обязанностей. Существуют различные способы приобретения имущества: создание вещи, имущества в результате производственной (предпринимательской) деятельности, когда создается новая вещь, продукт; получение плодов, доходов; получение вещи в порядке наследования; приобретение по договорам купли-продажи, мены, дарения и по другим основаниям, предусмотренным законом и не противоречащим ему.

Права и обязанности возникают в результате создания произведений науки, литературы, искусства, изобретений и иных результатов интеллектуальной деятельности. Акты интеллектуальной деятельности отличаются от сделок тем, что в них нет характерного для сделок признака — направленности действий на создание гражданских прав и обязанностей, так как в отношениях творчества правовые последствия возникают независимо от воли автора и его дееспособности.

Совершение открытий, изобретений, создание полезных моделей, промышленных образцов и внесение рационализаторских предложений всегда признавались и признаются основаниями возникновения личных неимущественных прав (право на имя, опубликование, переиздание) и имущественных прав (право на вознаграждение — гонорар).

Права и обязанности возникают также вследствие причинения вреда другому лицу. У потерпевшего, прежде всего, возникает право на возмещение имущественного вреда, а в ряде случаев и морального вреда. Возмещение вреда регулируется главой 59 ГК РФ. В соответствии со статьей 1064 ГК РФ, вред, причиненный личности или имуществу гражданина, а также вред, причиненный имуществу юридического лица, подлежит возмещению в полном объеме лицом, причинившим вред. Полный объем означает не только расходы, произведенные потерпевшим на возмещение вреда, но и неполученные доходы, которые потерпевший мог бы получить, если бы ему не был причинен вред (ст. 15 ГК РФ). Компенсация морального вреда (причинение физических или нравственных страданий) определяется судом в соответствии со ст. 151 ГК РФ. Компенсация морального вреда осуществляется независимо от подлежащего возмещению имущественного вреда (п.3 ст. 1099 ГК РФ). Компенсация морального вреда осуществляется независимо от вины причинителя вреда в случаях, когда:
— вред причинен источником повышенной опасности;
— вред причинен в результате незаконного осуждения лица, незаконного привлечения к уголовной ответственности;
— вред причинен распространением сведений, порочащих честь, достоинство и деловую репутацию лица, а также в иных случаях, предусмотренных законом.

Компенсация морального вреда осуществляется в денежной форме (п.1 ст. 1101 ГК РФ).

Неосновательное обогащение также является одним из оснований возникновения прав и обязанностей. В данном случае одно лицо (приобретатель) обогащается за счет другого лица (потерпевшего) без достаточных к тому оснований. Например, подрядчик не возвратил заказчику остатки материала по окончании всех работ, выполнявшихся из материалов заказчика по договору подряда, то есть сберег имущество, принадлежащее другому лицу. Может иметь место ошибочного повторного исполнения по договору займа, то есть необоснованное приобретение имущества.

Предусмотренные главой 60 ГК РФ правила о возврате неосновательно приобретенного или сбереженного имущества, применяются к требованиям о возврате исполненного по недействительной сделке, об истребовании имущества собственником из чужого незаконного владения, о возмещении вреда причиненного недобросовестным поведением обогатившегося лица. Если речь идет об имуществе, то оно должно быть возвращено потерпевшему в натуре. При невозможности возвратить в натуре, возмещается стоимость этого имущества. Кроме того, потерпевшему возвращаются все доходы, которые оно могло бы извлечь из этого имущества за период его нахождения у приобретателя.

Правила главы 60 ГК РФ применяются независимо от того, явилось ли неосновательное обогащение результатом поведения приобретателя имущества, самого потерпевшего, третьих лиц или произошло помимо их воли (п.2 ст. 1102 ГК РФ).

Права и обязанности могут возникать вследствие иных действий граждан и юридических лиц. Примером таких оснований могут служить действия, связанные с находкой вещи (ст. 227 ГК РФ) и обнаружением клада (ст. 233 ГК РФ). Нашедший потерянную вещь обязан уведомить лицо, потерявшее вещь. Если это лицо неизвестно, то следует заявить о находке в полицию или в орган местного самоуправления. Нашедший вещь имеет право на возмещение расходов, связанных с хранением.

Определенные права и обязанности возникают и по поводу действий, связанных с обнаружением клада. Клад — это зарытые в землю или скрытые иным способом деньги и ценные предметы, собственник которых не установлен. Клад поступает в собственность лица, которому принадлежит имущество, строение, земельный участок, где обнаружен клад и лица, обнаружившего клад, в равных долях (п.1 ст. 233).

Права и обязанности могут возникать в связи с действиями, связанными с задержанием безнадзорного и пригульного скота (ст. 230 и 231 ГК РФ).

Множество гражданских прав и обязанностей возникает в результате различных обстоятельств. Обстоятельства, с которыми закон связывает возникновение, изменение и прекращение гражданских прав и обязанностей, называются юридическими фактами. Это факты реальной действительности. Юридические факты делятся на две большие группы: действия и события. Действия представляют собой определенную форму поведения людей. Действия совершаются по воле человека.

События — это объективное явление внешнего мира, наступающее независимо от воли человека. К событиям относятся явления стихийного характера (наводнения, землетрясения, оползни, извержения вулканов, пожары и т.д.), а также явления, с которыми закон связывает возникновение прав и обязанностей (рождение человека, его смерть, истечение срока и т.п.).

Стихийные явления причиняют значительный ущерб народному хозяйству, имуществу юридических лиц и граждан, а также ущерб здоровью граждан. В целях возмещения имущественных потерь в стране созданы и действуют страховые фонды, осуществляется страхование от наступления случайных событий. Проводится личное и имущественное страхование, когда риск переводится на страховщика. Страхование регулируется главой 48 ГК РФ. Отношения по страхованию возникают на основании договора, предусматривающего права и обязанности сторон, в том числе вследствие наступления событий.

Новшеством ст. 8 ГК РФ является подп.1.1 — возникновение прав и обязанностей из решений собраний в случаях, предусмотренных законом.

Таковы основания возникновения, гражданских прав и обязанностей, предусмотренных ст. 8 ГК РФ.

Консультации и комментарии юристов по ст 8 ГК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 8 ГК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Справка по вопросу об оценке судом кассационной инстанции факта непривлечения авторов к участию в делах о взыскании компенсации за нарушение исключительного права на произведение

Утверждена
постановлением президиума
Суда по интеллектуальным правам
от 22 августа 2014 года № СП-21/10

Статьей 8¹ Гражданского кодекса Российской Федерации (в редакции Федерального закона от 30.12.2012 № 302-Ф3, далее — ГК РФ) установлены общие правила, касающиеся государственной регистрации прав на имущество. В частности пунктом 7 этой статьи определено, что в отношении зарегистрированного права в государственный реестр может быть внесена в порядке, установленном законом, отметка о возражении лица, соответствующее право которого было зарегистрировано ранее.

В судебной практике возник вопрос о применимости положений этой статьи к интеллектуальным правам, подлежащим регистрации.

Так, Роспатент отказывает во внесении отметки о наличии спора о праве на товарный знак в Государственный реестр товарных знаков и знаков обслуживания Российской Федерации (далее — реестр) со ссылкой на то, что сведения о наличии судебных споров, касающихся товарных знаков, к перечню сведений, подлежащих внесению в реестр и установленных пунктом 16 Административного регламента исполнения Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам государственной функции по осуществлению ведения реестров зарегистрированных объектов интеллектуальной собственности, публикации сведений о зарегистрированных объектах интеллектуальной собственности, поданных заявках и выданных по ним патентах и свидетельствах, о действии, прекращении действия и возобновлении действия правовой охраны в отношении объектов интеллектуальной собственности, передаче прав на охраняемые объекты, об официальной регистрации объектов интеллектуальной собственности, утверждённого приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от 12.12.2007 № 346 (далее — Административный регламент), не относятся.

Следует отметить, что довод об отсутствии обязанности вносить сведения о судебном споре, определенной Административным регламентом, следует признать ненадлежащим, так как Административный регламент является подзаконным нормативным правовым актом, и в случае его противоречия ГК РФ применению подлежит последний.

С учетом этого оценке подлежит сама статья 8¹ ГК РФ.

Исходя из пункта 10 статьи 8¹ ГК РФ правила, установленные этой статьей, применяются, если иное не установлено ГК РФ.

Положения части IV ГК РФ устанавливают иные правила к регистрации исключительных прав.

Так, статья 1232 ГК РФ определяет случаи и порядок государственной регистрации результатов интеллектуальной деятельности и средств индивидуализации. Установлены, в том числе, иные правила государственной регистрации договоров об интеллектуальных правах (как в действующей редакции ГК РФ, так и вступающей в действие с 01.10.2014).

Пункт 6 статьи 8¹ ГК РФ определяет, что зарегистрированное право может быть оспорено только в судебном порядке. Вместе с тем в силу пункта 2 статьи 1248 ГК РФ для рассмотрения дел, связанных с государственной регистрацией результатов интеллектуальной деятельности и средств индивидуализации, в ряде случаев определён административный (внесудебный) порядок.

Кроме того, следует отметить, что статья 8¹ ГК РФ текстуально указывает на то, что она касается регистрации прав на имущество (очевидно, имея в виду в первую очередь вещные права). В отношении же исключительных прав регистрация осуществляется не в отношении прав на имущество, а в отношении самого имущества (исключительное право статьей 1226 ГК РФ признано имущественным правом, а статья 128 ГК РФ говорит о том, что имущественное право охватывается понятием «имущество»).

Положения ГК РФ о государственной регистрации результатов интеллектуальной деятельности и средств индивидуализации законодатель косвенно признал иными по отношению к положениям статьи 8¹ ГК РФ, о чем свидетельствуют положения о залоге.

Так, подпунктом 1 пункта 1 статьи 339¹ ГК РФ определено, что залог подлежит государственной регистрации и возникает с момента такой регистрации, если в соответствии с законом права, закрепляющие принадлежность имущества определенному лицу, подлежат государственной регистрации (статья 8¹).

В отличие от этого пунктом 2 статьи 358¹⁸ ГК РФ установлено, что государственная регистрация залога исключительных прав осуществляется в соответствии с правилами раздела VII ГК РФ.

Таким образом, следует признать, что положения статьи 8¹ ГК РФ как в целом, так и в части ее пункта 7 не применимы к отношениям в сфере государственной регистрации результатов интеллектуальной деятельности и средств индивидуализации.

Ст. 8 Конституции РФ с Комментариями. Последняя редакция с изменениями на 2021 год

Последняя редакция Статьи 8 Конституции РФ гласит:

1. В Российской Федерации гарантируются единство экономического пространства, свободное перемещение товаров, услуг и финансовых средств, поддержка конкуренции, свобода экономической деятельности.

2. В Российской Федерации признаются и защищаются равным образом частная, государственная, муниципальная и иные формы собственности.

См. комментарии к статье 8 Конституции РФ

Комментарий к Ст. 8 КРФ

1. Статья 8 и следующая за ней статья 9 составляют группу статей, специально посвященных экономическим основам конституционного строя России.

Первая часть ст. 8 устанавливает и гарантирует единство экономического пространства в России. Это понятие охватывает единство рынка, установление правовых основ которого, согласно п. «ж» ст. 71, находится в ведении РФ. Единство рынка означает не только свободное перемещение товаров, услуг и финансовых средств, поддержку конкуренции, свободу законной экономической деятельности на территории всей России и недопущение деятельности, направленной на монополизацию и недобросовестную конкуренцию (ст. 34, 74 и комм. к ним), но также свободное перемещение рабочей силы (т.е. единство также рынка труда, ибо труд в значительной мере остается товаром, а его принципиально единое правовое регулирование, условия и т.д., как и правовое единство всего рынка, имеют не только юридическое и экономическое, но также социальное, культурное и политическое значение). Единство рынка труда не упомянуто в ст. 8 (и ст. 34), по-видимому, потому, что о праве каждого, кто законно находится на территории России, свободно передвигаться, выбирать место пребывания и жительства как об одном из основных прав и свобод человека и гражданина говорится в ст. 27, а о свободе и условиях труда — в ст. 37 Конституции РФ.

Нарушение по решению властей многих субъектов РФ единства экономического пространства путем создания зональных, региональных или местных более или менее изолированных рынков с запрещением или ограничением перемещения определенных товаров, рабочей силы и т.п. представляет собой по существу форму частичного социально-экономического сепаратизма или по крайней мере нарушения единства и отчасти целостности государства, как и установленного Конституцией РФ в ст. 19 (ч. 2) равенства прав человека и гражданина независимо от места жительства. Опыт нашей страны в данном отношении богат.

Эти явления имеют еще средневековые исторические корни. По крайней мере с 60-х годов ХХ в. несколько съездов КПСС отмечали вредность создания фактических таможенных границ между республиками, краями и областями в СССР. Курская и некоторые другие области годами запрещали «вывоз» картофеля или других продуктов за свои «пределы». Сбыт любой издательской продукции, прошедшей все виды цензурного или иного контроля, в любой республике, крае или области мог быть произвольно запрещен секретарем соответствующего комитета КПСС. Генсек партии Л.И. Брежнев жаловался на подобные явления. Но изменить все это никто не мог: власть «удельных князей» усиливалась.

Поэтому стало необходимым закрепление в Конституции РФ принципа единства экономического пространства, единого рынка товаров, услуг, финансов, а также труда. Эта необходимость прямо выражена в ст. 8, а также в ст. 27, 34, 35 (ч. 2), 37, 71 (ч. 1 п. «ж»), 74 Конституции (см. комм. к указанным статьям).

Сложнее обстояло дело с единым рынком свободного труда. В 1932 г. советская власть восстановила отмененную еще Временным правительством в 1917 г. систему внутренних паспортов, вновь связав ее с разрешительным (в основном запретительным) режимом прописки в городах и аналогичным — выписки в сельской местности, но без паспортизации сельского населения. Такое закрепление рабочей силы за совхозами и колхозами, создание закрытых территориальных рынков труда сохранилось и после того, как в 70-х годах паспорта были выданы и сельским жителям, ибо требование соблюдения паспортного режима (т.е. обязательность проживания по месту прописки) стало еще более жестким. Даже после того как заключением Комитета конституционного надзора СССР от 11 октября 1991 г. (Ведомости СССР. 1991. N 46. ст. 1307), а затем Законом РФ от 25 июня 1993 г. прописка была отменена и введен регистрационный учет населения, регистрация (или ее отсутствие) перестала быть законным основанием для проживания, а нередко и работы в определенном месте, фактически сохраняя прежний режим.

С нарушениями единства экономического пространства связаны ограничения как рыночной конкуренции, так и свободы экономической деятельности даже после формальной отмены многих административно-правовых и уголовно-правовых мер, направленных против свободы экономической, в особенности частнопредпринимательской, прежде всего торговой, деятельности. Поэтому важной задачей государственной власти в России после провала августовского путча 1991 г., распада СССР и ликвидации монопольного господства аппарата КПСС стало восстановление единства экономического пространства России.

На создание гарантий такого единства был направлен также Указ Президента РСФСР о едином экономическом пространстве от 12 декабря 1991 г. (Ведомости РСФСР. 1991. N 51. ст. 1830), согласно которому должны признаваться недействительными акты органов «власти и управления» и решения должностных лиц, ограничивающие движение товаров, работ и услуг на внутреннем рынке России.

Дальнейшее развитие правового режима единого экономического пространства связано прежде всего с Конституцией 1993 г. В соответствии с рядом постановлений Конституционного Суда РФ, в частности Постановлением от 4 апреля 1996 г. N 9-П (СЗ РФ. 1996. N 16. ст. 1909), все нормативные акты о разрешительном порядке прописки, а также связанные с ними ограничения прав собственников по своему усмотрению владеть, пользоваться и распоряжаться принадлежащим им жильем и другим имуществом независимо от регистрации были вновь признаны неконституционными, противоречащими международным актам о правах человека и утратившими юридическую силу.

Однако положение изменилось лишь отчасти. Органы государственной власти ряда субъектов РФ и органы местного самоуправления крупных городов продолжали настаивать на сохранении мер административного (запретительного) и экономического препятствования свободному передвижению граждан и выбору ими места пребывания, жительства и труда. Но граждане должны быть равно свободны на территории всей России, за исключением особых местностей или случаев, которые могут быть установлены только федеральным законом в соответствии с ч. 3 ст. 55 и ч. 2 ст. 74 Конституции.

Конституционные обязанности государства, его органов и их должностных лиц (см. ч. 2 ст. 15 и комм. к ней) охватывают создание и поддержание такого единства экономического пространства, которое соответствует всем его свойствам, вытекающим не только из ст. 8 Конституции, но также из других ее положений. Установление правовых основ единого рынка в России предусмотрено только в ст. 71 как одна из проблем, относящихся к исключительному ведению РФ. Но все конституционные положения об экономике определяют именно единую рыночную экономику с ее свободой экономической деятельности в рамках всей страны для каждого человека согласно ч. 1 ст. 34, как и для всех других, равноправных с ними собственников (Федерации, ее субъектов, муниципалитетов, предприятий и др.).

Но эта свобода собственников не является абсолютной. Конституция демократического, правового и социального государства, признавая, соблюдая и защищая эту свободу, не может допустить злоупотребления ею с чьей бы то ни было стороны. Поэтому Конституция РФ устанавливает такие основы разграничения предметов ведения и полномочий между Федерацией, ее субъектами и местными самоуправлениями в экономической области (ч. 3 ст. 11, ст. 12, 71-74, 130-133), а отчасти и компетенцию некоторых органов государственной власти в сфере экономики (например, ст. 75, ч. 3 ст. 104, ст. 105, п. «а-«г», «е» ч. 1 ст. 114, ст. 127, 130, 132 и др.), не только разграничивает властные полномочия этих органов власти и предусматривает разграничение их статусов как собственников, но и определяет ряд ограничений свободы всех субъектов законной экономической деятельности (например, ч. 2 ст. 34 и др.). Конституция гарантирует равным образом защиту всех форм собственности, поддержку добросовестной конкуренции, не допускает монополизацию.

Эти меры вытекают прежде всего из содержания прав и свобод человека и гражданина, а также из обязанности государства их признавать, соблюдать и защищать (ст. 2, 17, 18). Поскольку политика государства направлена на создание условий, обеспечивающих достойную жизнь и свободное развитие человека, в том числе в сфере труда и его оплаты (ст. 7), уплаты налогов (ст. 57) и т.п., ясно, что свобода экономической деятельности не должна противоречить таким государственным правилам в этой сфере.

Если Конституция предписывает, что земля и другие природные ресурсы должны использоваться и охраняться как основа жизни и деятельности народов, проживающих на соответствующей территории (ст. 9), то очевидно, что экономическая деятельность, настолько свободная, что она разрушала бы эту основу, недопустима, как и свободное владение, пользование и распоряжение природными ресурсами со стороны их собственников (при любых формах собственности), если это наносит ущерб окружающей среде или нарушает права и законные интересы других лиц (ст. 9, ч. 2 ст. 36 и др.).

Если, согласно ч. 3 ст. 35 Конституции, возможно даже принудительное отчуждение имущества для государственных нужд в судебном порядке и при соблюдении определенных условий, то нельзя не признать, что это тоже некоторое ограничение экономической свободы и права собственности.

Обязанность каждого сохранять природу и окружающую среду (ст. 58), отнесение охраны окружающей среды и обеспечения экологической безопасности к совместному ведению РФ и ее субъектов (п. «в» и «д» ч. 1 ст. 72), как и право каждого на благоприятную окружающую среду, на достоверную информацию о ее состоянии и на возмещение ему ущерба, причиненного экологическим правонарушением (ст. 42), препятствуют злоупотреблениям свободой экономической деятельности, хищническому использованию природных ресурсов и т.п. Обязанность каждого платить законно установленные налоги (ст. 57) может противоречить праву на свободную экономическую деятельность и даже праву собственности: высокие налоги могут сильно ограничивать, а низкие налоги — поощрять свободную экономическую деятельность. Оптимальную меру налогообложения, которое должным образом пополняло бы казну и одновременно регулировало бы различные виды экономической деятельности в соответствии с общественными интересами, пока найти во многих случаях не удалось, хотя реформой налогового законодательства принят ряд мер в этом направлении.

Права и свободы человека и гражданина на экономическую деятельность могут быть наряду с его остальными правами и свободами ограничены федеральным законом только в той мере, в какой это необходимо в целях защиты основ конституционного строя, нравственности, здоровья, прав и законных интересов других лиц, обеспечения обороны страны и безопасности государства (ч. 3 ст. 55). Права и свободы в сфере экономической деятельности, установленные в ст. 27 (свобода передвижения, выбора места пребывания и жительства), ч. 1 ст. 34 (свободное использование каждым своих способностей и имущества для такой деятельности), ст. 35 (права частной собственности и наследования), ст. 36 (право собственности на землю и другие природные ресурсы, свобода владения, пользования и распоряжения ими), ст. 37 (свобода труда), ст. 42 (право на благоприятную окружающую среду) и др., могут быть ограничены в условиях чрезвычайного положения (ст. 56). Для иностранцев и лиц без гражданства, пользующихся правами и несущих обязанности наравне с гражданами России, федеральным законом или международным договором могут быть установлены дополнительные ограничения (см. комм. к ч. 3 ст. 62).

В ряде случаев Конституция лишь в общей форме говорит о возможности запрещения законом (Федерации или ее субъекта) некоторых видов экономической деятельности. Существуют, например, такие запреты на выращивание растительного сырья для производства наркотиков, на такое производство и на торговлю содержащими наркотики веществами без особого на то разрешения и контроля со стороны государства. Экономическая деятельность граждан и юридических лиц, предприятий и т.д. вообще должна проходить в рамках их специальной правоспособности.

Единство экономического пространства России требует единства законодательства о народном хозяйстве. Это законодательство должно предусматривать признание на всей территории России актов (документов) органов государственной власти и органов местного самоуправления всех уровней. Оно должно поддерживать конкуренцию, ограничивая монополизм, контролируя и регулируя его неизбежные тенденции (прежде всего в области естественных монополий), содействуя созданию и развитию новых самостоятельных предприятий, особенно малых и средних, в частности в уже монополизированных секторах рынка. Начало осуществлению этих идей было положено в 90-х годах прошлого века.

Потребность в создании стабильных общеобязательных правил функционирования свободной рыночной экономики, не противоречащих индивидуальным, коллективным и всеобщим правам, свободам и законным интересам, в значительной мере удовлетворена принятием и введением в действие ГК РФ. В нем подробно и в соответствии с Конституцией урегулированы правовое положение физических и разнообразных юридических лиц, право собственности и другие вещные права, общие вопросы обязательственного права и виды обязательств, наследственное право и др. Пока остаются лишь отчасти урегулированными на основе Конституции 1993 г. отношения по использованию и охране природных ресурсов, в частности законодательное определение условий владения, пользования и распоряжения землями сельскохозяйственного назначения, ограничивающих право собственности и рыночный оборот этих земель в целях обеспечения их всестороннего и высокоэффективного использования как в индивидуальных интересах собственников, арендаторов, пользователей, так и во всеобщих интересах.

Осуществлению конституционного единства экономического пространства и, более того, государственной целостности России может препятствовать и недостаточно четкое и обоснованное разграничение государственной собственности, предметов ведения и полномочий между федеральными органами государственной власти и органами власти субъектов РФ, а также органами местного самоуправления. Это выражается в том, что, с одной стороны, федеральные органы стремятся забрать в свое ведение у субъектов РФ максимум ресурсов, передавая этим регионам свои обязанности без их достаточного обеспечения необходимыми ресурсами; подобным образом субъекты РФ иногда действуют по отношению к органам местного самоуправления. Нередко представители отдельных субъектов РФ утверждают, что наша «метрополия» ведет чуть ли не «колониальную» политику по отношению к тем или иным субъектам РФ. С другой стороны, власти этих субъектов РФ и местных самоуправлений иногда в ответ подвергаются обоснованной «центральной» критике со стороны органов власти РФ за неумение эффективно использовать все возможности для всестороннего социально-экономического развития своих регионов, городов и районов.

Определенные трудности возникают также из-за не всегда правильного распределения бюджетных средств и материальных ресурсов в пользу регионов-«доноров» (городов федерального значения и нескольких субъектов РФ, располагающих богатыми природными ресурсами, принадлежащими всей России) за счет многих иных регионов, постоянно нуждающихся в федеральных дотациях.

Экономическая роль правового, демократического, социального государства в условиях рыночной экономики сводится в основном к осуществлению трех функций.

1. Законодательное определение круга субъектов права на отдельные виды хозяйственной деятельности, а также ее объектов и взаимоотношений между ними, иначе говоря — юридических правил, по которым осуществляется экономическая деятельность.

2. Поощрение, защита и охрана социально и экономически справедливых, целесообразных и законных форм этой деятельности (поведения ее участников), осуществляемые главным образом с помощью регулятивных мер преимущественно экономического характера (повышение или понижение ставок налогов, банковского процента при кредите, предоставляемом государственными или полугосударственными банками, регулирование цен на продукцию и услуги, производимые по государственному заказу, и т.п.), но в определенных пределах — и мерами властными, внеэкономическими, особенно при решении сложных трудовых, экологических, здравоохранительных и других социальных проблем.

3. Разграничение двух направлений деятельности органов публичной власти (т.е. государственной власти и местного самоуправления) — осуществления властных полномочий и характерной для предприятий хозяйственной деятельности, направленной на получение прибыли, за исключением случаев, когда их объединение прямо и обоснованно допускается законом.

Обеспечение единства экономического пространства России приобретает особое значение в связи со стремлением развивать интеграционные процессы в рамках СНГ, ведущие к постепенному объединению экономического пространства России и других суверенных государств, в котором осуществлялось бы свободное перемещение товаров, услуг, финансовых средств, рабочей силы, согласование законодательства, регулирующего экономическую деятельность.

2. Часть 2 ст. 8 Конституции провозглашает признание и защиту равным образом различных форм собственности, приводя их не исчерпывающий, а примерный перечень; речь идет о частной, государственной, муниципальной и иных формах собственности; он повторен в ч. 2 ст. 9 применительно к собственности на землю и другие природные ресурсы.

В строго юридическом смысле Конституция фактически говорит о двух типах собственности: частной (индивидуальной и коллективной, о чем прямо сказано в ч. 2 ст. 35) и публичной, т.е. государственной (федеральной и принадлежащей субъектам РФ) и муниципальной. Не исключены также признание и защита иных форм собственности; так, в настоящее время явно растет церковная собственность. Коллективная частная собственность может быть кооперативной, принадлежать иным общественным организациям, акционерным обществам и т.д.

Имеет место и выделение форм собственности не по субъектам, а по объектам этого права. Так, статьи 9 и 36 Конституции говорят о собственности на природные ресурсы, выделяя из нее собственность на землю и иные виды таких ресурсов, а статьи 44 (ч. 1) и 71 (п. «о») — об интеллектуальной собственности. Упомянутые в п. «к» ч. 1 ст. 72 жилищная, земельная, водная, лесная, горная (о недрах) и другие отрасли законодательства органически связаны с соответствующими формами права собственности. По этой линии идет и ГК РФ.

По-видимому, было бы полезно различать и формы собственности, определяемые содержанием соответствующих правовых предписаний: от тех форм, объекты которых имеют режим неограниченного свободного владения, пользования и распоряжения, до форм, абсолютно исключенных из любого гражданского рыночного оборота.

Важной, не всегда принимаемой во внимание особенностью конституционного перечня форм собственности является вынесение частной собственности на первое место в ст. 8 и 9, а также особое внимание к ней в ст. 34-36. Это тесно связано и с провозглашением человека, его прав и свобод высшей ценностью, а их признания, соблюдения и защиты — обязанностью государства, и со стремлением сохранить характерную именно для права собственности заинтересованность собственника, весьма эффективную также для всего общества, и с необходимостью, возрождая частную собственность и подчиняя почти любое право собственности также и его социальным задачам, существенно ограничить возможности злоупотребления этим правом вопреки общественным и иным законным интересам. Но некоторые законы (например, Земельный, Лесной и другие кодексы) явно рассчитаны на противоречащее Конституции максимальное сохранение монополии государственной и отчасти муниципальной собственности, а также на ограничение права частной собственности как по размерам, кругу объектов, так и по объему правомочий, но без необходимого отделения ограничений, в соответствии с общественными интересами требующих рационального использования объектов этого права, от иных ограничений, соответствующих эгоистическим и даже хищническим интересам монополий, олигархов, бюрократов и новых латифундистов.

Особенностью ст. 8, ст. 9, 34-36 является отсутствие в них, как и во всей Конституции России 1993 г., каких-либо общих определений понятий собственности (т.е. имущества) и права собственности. Это связано, в частности, с тем, что возникла потребность в новой общей теории социально ориентированного права собственности. Отсюда — теория права собственности как социальной функции и обеспечивающего выполнение этой функции государства как социальной службы (Л. Дюги и многие другие). Дальнейшее развитие повело ко все более частому законодательному закреплению расщепления единого и полного права собственности на отдельные правомочия (право собственности различных субъектов на один и тот же объект), самостоятельно фигурирующие как объект договоров и т.п. в гражданском обороте.

Законы многих демократических правовых государств в ХIХ в., а в ХХ в. и их конституции существенно обновили общую концепцию права собственности. К традиционным, «классическим» полномочиям владения, пользования и распоряжения объектами этого права (с отдельными ограничениями по закону) добавлены многочисленные социальные, экологические экономические, здравоохранительные и тому подобные ограничения и обязанности. Наиболее ранние меры в этом направлении развиваются в Великобритании и других англосаксонских странах, нередко через судебную практику, правовые обычаи, и не только через закон. Затем это развитие распространилось на многие другие страны. Особенно четким и последовательным оно стало в странах, после Второй мировой войны осуществлявших переход от павших тоталитарных режимов к демократическому правовому обществу и государств. В Основном законе ФРГ сказано, что содержание и пределы прав собственности и наследования устанавливаются законами; что право собственности обязывает, а использование его должно одновременно служить общему благу (ч. 1 и 2 ст. 14). Из таких конституционных положений вытекают изменения в содержании права собственности, раскрываемые в современном трудовом, гражданском, земельном, административном и ином законодательстве и обобщаемые новыми конституционными положениями или новым аналогичным толкованием положений более ранних конституций.

В этом отразился переход от классической палеолиберальной теории «священного и неприкосновенного» права собственности как неограниченной власти собственника над его имуществом, свободного владения, пользования и распоряжения им с правом устранения вмешательства со стороны других лиц (даже государства), допускавшей только отдельные исключения в виде ограничения или даже отобрания этого имущества и этих прав государством при непременной полной и предварительной компенсации — к иной, новой, социально ориентированной концепции права собственности. Допускавшихся законом исключений постепенно стало очень много, так как были введены существенные ограничения прав собственности, свободы договоров и т.д. в отралевом законодательстве по отношению к социальным, дефицитным, опасным и другим объектам этого права, в том числе по единым для всех форм собственности законам, регулирующим многие процессы производства, охрану труда, деятельность средств массовой информации и др.

В этом современном развитии права собственности выражается исторический компромисс между эгоистической и эксплуататорской частной собственностью и публично-правовым регулированием под общественным контролем. Такой компромисс рассчитан на сохранение ценных качеств обеих систем и на преодоление их пороков. Собственник остается свободным в пределах установленных правом социальных ограничений и обязанностей, включаемых ныне в определение его прав собственности.

Поэтому ошибочно господствовавшее в советской литературе с 30-х годов ХХ в. и сохраняющееся в современной российской литературе по гражданскому праву мнение, согласно которому в частном праве многих стран все еще господствуют принципы римского права, а гражданские кодексы и другие законы XIX в. принципиальным изменениям и дополнениям до сих пор не подверглись (см., например: Гражданское и торговое право зарубежных стран. Т. 1. М., 2004. С. 329-359).

Отсутствие в Конституции РФ общей характеристики права собственности (единой для всех ее форм) не означает отказа от этой идеи. Ее наличие в Конституции РФ, хотя и в не столь явной форме, проявляется во всех тех ограничениях права собственности и свободы экономической деятельности, о которых говорится в комментарии к ч. 1 рассматриваемой статьи. Общей характеристике права собственности посвящены статьи 209-212 ГК. В них изложена традиционная концепция права собственности, состоящего из трех названных свободно осуществляемых правомочий с весьма многочисленными оговорками («если иное не предусмотрено законом» и т.п.). Эти оговорки охватывают весь объем ограничений и обязанностей, входящих в современную концепцию права собственности. Но, по-видимому, слишком традиционное выражение ее содержания недостаточно ясно выражает присущие ей принципиально новые социально справедливые и экономически эффективные черты, еще далеко не полностью воспринятые общественным сознанием.

Может быть, на нынешнем этапе политических и экономических преобразований такое решение является оптимальным. Включение в Конституцию и законы России формул, обобщающих не только права, но и ограничения этих прав, а также обязанности собственников, осуществляемые под контролем общества и государства, отчасти понято бюрократами как сохранение возможностей для их произвола, крупными собственниками — как их полная власть над наемными работниками, арендаторами, квартирантами и т.д., а частными лицами — как продолжение их бесправия в данной сфере.

Конституционное закрепление признания и защиты равным образом всех форм собственности нашло свое выражение в ГК и в уголовном законодательстве РФ. Единая правовая охрана всех форм собственности (ст. 158-168 УК РФ), а также независимая от форм собственности, единая для всех ее форм трактовка преступлений в сфере экономической деятельности (ст. 169-204 УК РФ) заменили как усиленную охрану государственной и фактически огосударствленной колхозно-кооперативной, профсоюзной и тому подобной собственности, так и ослабленную защиту личной собственности граждан. Последовательное осуществление социального содержания прав собственности и равноправия всех ее форм остается важной задачей.

Устойчивая доставка IL-1Ra из геля PF127 снижает гипергликемию у диабетических GK-крыс

Abstract

Интерлейкин-1бета (ИЛ-1β) является основной причиной индукции различных воспалительных механизмов, которые решающим образом участвуют в патогенезе сахарного диабета 2 типа (СД2). Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra), встречающийся в природе противовоспалительный антагонист IL-1β, был недавно одобрен для лечения T2DM, но из-за его короткого периода полувыведения требуются более высокие дозы и частые интервалы дозирования.Плюроник F-127 (PF127), как ранее было показано, продлевает высвобождение различных белковых препаратов и их период полужизни в сыворотке. Впоследствии, в нашей предыдущей работе, мы разработали новую лекарственную форму IL-1Ra с использованием PF127 и исследовали его эффекты in vitro и in vivo. В настоящей работе мы расширили этот подход на диабетических крысах Goto-kakizaki (GK). Мы вводили IL-1Ra, загруженный в гель PF127, подкожно в течение одного месяца крысам GK. IL-1Ra, загруженный в гель PF127, проявлял устойчивые и пролонгированные гипогликемические эффекты на обработанных животных.Результаты теста на внутрибрюшинную толерантность к глюкозе (IPGTT) показали, что IL-1Ra, загруженный в гель PF127, увеличивал толерантность к глюкозе наряду с повышенной чувствительностью к инсулину и секреторной функцией β-клеток у обработанных крыс. Кроме того, также наблюдалось значительное снижение соотношения проинсулин / инсулин, липидных профилей и интерлейкина 6 (IL-6). Иммуногистохимический анализ показал небольшую инфильтрацию макрофагов в островки поджелудочной железы. Гистохимический анализ не выявил индуцированного PF127 изменения нормальной физиологии кожи и почек обработанных животных.Таким образом, мы пришли к выводу, что IL-1Ra, загруженный в гель PF127, может проявлять противовоспалительное действие широкого спектра, облегчая симптомы СД2.

Образец цитирования: Akash MSH, Rehman K, Sun H, Chen S (2013) Устойчивая доставка IL-1Ra из геля PF127 снижает гипергликемию у диабетических GK-крыс. PLoS ONE 8 (2): e55925. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925

Редактор: Альберико Катапано, Миланский университет, Италия

Поступила: 16.10.2012; Принята к печати: 3 января 2013 г .; Опубликовано: 8 февраля 2013 г.

Авторские права: © 2013 Akash et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа финансировалась грантом (№ 2010C13006) Департамента науки и технологий провинции Чжэцзян, Китай. IL-1Ra был щедро предоставлен Hisun Pharmaceuticals. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: У авторов есть следующие интересы: IL-1Ra был щедро предоставлен Hisun Pharmaceuticals. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Сахарный диабет является одной из основных причин смертности и входит в пятерку основных смертельных заболеваний, которые могут вызывать диабет, микрососудистые (ретинопатия, нефропатия и нейропатия) [1] и макрососудистые (коронарные артерии, цереброваскулярные и периферические сосудистые заболевания). ) осложнения [2].В последнее время воспалению уделяется значительное внимание в патогенезе сахарного диабета, в связи с чем оно недавно было признано хроническим ауто-воспалительным синдромом [3], [4], в котором задействованы различные воспалительные механизмы [5]. Одной из решающих причин прогрессирования сахарного диабета является глюколиптоксичность, которая вызвана недостаточной секрецией инсулина β-клетками островков поджелудочной железы и / или нарушением захвата глюкозы периферическими тканями [6], [7]. Аномально повышенные уровни глюкозы и свободных жирных кислот (СЖК) могут оказывать цитотоксическое действие на β-клетки островков поджелудочной железы [8] за счет активации различных провоспалительных медиаторов [9].Как только эти провоспалительные медиаторы активируются, они могут не только повредить β-клетки, но также могут снизить потенциальную способность оставшихся β-клеток секретировать адекватное количество инсулина в соответствии с потребностью в глюкозе крови при обоих типах диабета [10 ]. С другой стороны, эти потенцированные провоспалительные медиаторы могут также инициировать воспаление в периферических тканях, нарушая усвоение глюкозы [9], и могут приводить к резистентности к инсулину. Следовательно, инсулинорезистентность связана с состоянием слабого воспаления [11], [12] и считается отличительной чертой СД2.Как только развивается инсулинорезистентность, циркулирующие уровни глюкозы и / или FFA становятся опасно высокими, и, попадая в β-клетки островков поджелудочной железы, они могут индуцировать выработку IL-1β вместе с другими IL-1-зависимыми цитокинами и хемокинами [9 ], [13], [14].

Среди этих провоспалительных медиаторов IL-1β является основным провоспалительным цитокином, который играет решающую роль в прогрессировании СД2. Регулирует воспалительные процессы в различных тканях [15]. Повышенный уровень глюкозы и некоторые связанные с ним метаболические нарушения (дислипидемия и / или инсулинорезистентность) могут привести к гипергликемии, что еще больше усиливает продукцию IL-1β из β-клеток [16], [17].Тем не менее, IL-1β считается основной причиной недостаточной секреции инсулина, апоптоза β-клеток и / или резистентности к инсулину в периферических тканях, это также предполагает, что воспаление может быть непосредственно вовлечено в патогенез сахарного диабета [5], [9] однако противовоспалительные терапевтические методы могут помочь предотвратить воспаление [18], [19]. IL-1Ra является естественным противовоспалительным антагонистом IL-1β, который конкурентно связывается с рецептором интерлейкина-1-I (IL-1RI) [20], [21] и защищает β-клетки от функционального нарушения, вызванного глюколипотоксичностью, и апоптоза. .Были проведены различные исследования, в которых терапевтические эффекты IL-1Ra наблюдались на мышах с индуцированным диетой диабетом [22], крысах GK [19], культивируемых островках поджелудочной железы человека [16], [23] и людей с СД2 [18], [24]. IL-1Ra обладает способностью блокировать синтез не только IL-1β [25], но также IL-1-зависимых цитокинов и хемокинов [17], [19], [23]. Хотя IL-1Ra был одобрен для лечения T2DM [18], [22], но короткий биологический период полувыведения (6-8 часов) IL-1Ra был основным препятствием для его терапевтической эффективности, что усложняло дозировку. корректировка и частота приема препарата.

Принимая во внимание терапевтический потенциал широкого спектра действия IL-1Ra, недавно в нашей предыдущей работе мы разработали систему устойчивой доставки для IL-1Ra, основанную на одобрении Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) биоразлагаемого полимера PF127 в качестве термочувствительного геля [26 ]. В водных растворах PF127 имеет свойство термообратимого гелеобразования и увеличивает стабильность белков [26] — [29] за счет их полного восстановления при растворении при температуре тела [30]. В зависимости от используемой концентрации при комнатной температуре PF127 существует в виде раствора и может быть легко введен парентерально.После введения он быстро превращается в жестко-полутвердую гелевую сеть при температуре тела [26]. Ранее его уже использовали для длительной доставки различных белков [31] — [35].

Здесь, в нашей настоящей работе, мы расширили наш предыдущий подход, используя диабетических самцов крыс GK и / или Wistar для изучения эффектов замедленного высвобождения IL-1Ra из геля PF127. В качестве контроля использовали четырехнедельных крыс GK и крыс линии Wistar. Крысы GK специально созданы из крыс линии Вистар после их повторного инбридинга [36], выбранных на верхнем пределе нормальной толерантности к глюкозе.У крыс GK снижение массы β-клеток происходит во время их внутриутробного развития с последующей легкой гипергликемией, которая появляется после отлучения от груди в возрасте 3-4 недель после рождения [37], что снижает способность β-клеток секретировать инсулин в ответ на повышают уровень глюкозы. В нашем настоящем исследовании мы вводили гель PF127, содержащий IL-1Ra, в течение одного месяца, а затем исследовали влияние IL-1Ra на различные метаболические параметры. Более того, мы также сосредоточили внимание на любых побочных эффектах PF127, связанных с функцией почек и в месте введения лекарства.

Материалы и методы

Животные

Экспериментальные исследования были выполнены на вскармливаемых крысах-самцах линии GK и недиабетических крысах линии Вистар соответствующего возраста. Крысы GK с диабетом были получены из Академии медицинских наук, Чжэцзян, Китай. Крыс линии Wistar, не страдающих диабетом, использовали в качестве контроля. Животные были отлучены от груди на 28 день, с водой ad libitum, кормили коммерческими кормами в помещении с контролируемой температурой, влажностью и освещением (12-часовые циклы). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с принятыми стандартами ухода за животными, утвержденными лабораторией центра животных Чжэцзянского университета Ханчжоу, Китай.

Приготовление 25% геля PF127 и обработка IL-1Ra in vivo

Гель PF127 (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Китай) готовили, как описано ранее [26]. Перед подкожным введением IL-1Ra в дряблую кожу на плече / шее крыс GK, IL-1Ra (10 мг / кг веса тела крысы) смешивали с 200 мкл предварительно стерилизованного 25% геля PF127. Лечение было начато через 2–3 дня после отлучения (4 недели), после начала легкой гипергликемии при кормлении [38] и продолжалось до 4 недель.После этого гликемию без еды определяли с помощью анализатора глюкозы (AccuChek Active, Roche Diagnostics, США) 2–3 раза в неделю в 9–10 утра. По истечении одного месяца лечения крыс подвергали анестезии пентобарбиталом. Кровь собирали из брюшной вены в стерильный шприц (вместимостью 5 мл) с иглой для подкожных инъекций (21 G). Сыворотку отделяли от собранной крови центрифугированием (5000 об / мин, 20 мин) при 4 ° C. Сыворотку хранили при -20 ° C до дальнейшего анализа.Ткани кожи и почек собирали для окрашивания H&E. Отдельная ткань поджелудочной железы также была собрана для проведения иммуногистохимии. Все образцы тканей сохраняли в 10% растворе формалина до дальнейшего анализа.

Тест на толерантность к глюкозе внутрибрюшинно (IPGTT)

IPGTT было проведено на последней неделе лечения животным без анестезии. Раствор глюкозы (Sinopharm Chemical reagent Co., Китай) вводили животным (2 мг / кг массы тела) после ночного голодания.Затем кровь собирали из хвоста за 5 минут до инъекции, а также через каждые 15, 30, 60 и 120 минут инъекции для измерения сывороточного инсулина, тогда как; в каждый момент времени глюкозу измеряли глюкометром [39].

Определение чувствительности к инсулину

Модель оценки гомеостаза (HOMA) для индекса инсулинорезистентности (HOMA-IR) рассчитывалась следующим образом; и секреция инсулина [функция клеток β (HOMA- β )] рассчитывалась как; [40].Отношение инсулина натощак / глюкоза натощак (FIGR) рассчитывали как; [41]. Индекс количественной проверки чувствительности к инсулину (QUICKI) рассчитывался как; [42]. Уровни глюкозы и инсулина в сыворотке крови оценивали натощак.

Биохимический анализ

Сывороточный инсулин и проинсулин анализировали с помощью набора для ELISA для инсулина крысы и проинсулина (Mercodia AB, Швеция). СЖК в сыворотке анализировали с использованием ферментного колориметрического анализа Autosera NEFA (Sekisui Medical Co., Япония). Уровни азота мочевины (UN), мочевой кислоты (UA), триглицеридов (TG) и общего холестерина (TC) в сыворотке измеряли с помощью ферментативного анализа (Beckman coulter, США).Креатинин сыворотки, липопротеины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) определялись с помощью ферментативного анализа (Autec Diagnostica, Германия). Уровень IL-6 в сыворотке измеряли с использованием набора ELISA Quantikine для крысиного IL-6 (R&D System, Inc., США). Все параметры сыворотки измеряли в условиях кормления.

Анализ мочи

Мочу собирали у всех крыс в безметалловые пропиленовые пробирки в течение 24 часов. После сбора образцы мочи центрифугировали при 5000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C для удаления клеток и другого материала дебриса перед дальнейшим анализом.Альбумин и креатинин в суточной моче измеряли с помощью нефелометрии крыс (Beckman Coulter, США) и ферментативного анализа (Autec Diagnostica, Германия) соответственно. Отношение альбумин / креатинин в моче (ACR) рассчитывалось на основе этих двух измерений.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимию проводили для мышиных моноклональных антител CD68 (Abcam) с изолированными островками поджелудочной железы от умерщвленных крыс. Окрашивание визуализировали с использованием вторичного антитела, связанного с пероксидазой, с последующей инкубацией.Визуализировали окрашенную антителами площадь поверхности островков поджелудочной железы, снятую одним слепым наблюдателем с использованием цветной видеокамеры Olympus с программным обеспечением Histolab (Biocom).

Гистохимический анализ

Кожные ткани и почки умерщвленных крыс отделяли и фиксировали в 10% растворе формалина. После фиксации проводили обработку тканей кожи и почек с различным процентным содержанием этанола, а затем заливали парафином на 6 часов. Тонкие срезы обработанной кожи и почек разделяли с помощью микротоминга, которые затем фиксировали на предметных стеклах с желатином и выдерживали в печи в течение 12 часов при 58 ° C.Наконец, эти слайды обрабатывали гематоксилином и эозином (H&E) и наблюдали за гистохимическими изменениями в этих тканях. Изображения были получены одним слепым наблюдателем с использованием цветной видеокамеры Olympus с программным обеспечением Histolab (Biocom).

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение с указанием количества отдельных экспериментов. Все данные были проанализированы с использованием нелинейного регрессионного анализа с использованием призмы GraphPad 5. Уровень значимой разницы был оценен с использованием теста Стьюдента t и дисперсионного анализа (ANOVA) с помощью постхосточного теста Ньюмана-Кеулса для анализа множественных сравнений.Уровень значимости различий между группами был установлен на уровне P <0,05 в целевых параметрах.

Результаты

IL-1Ra снижает степень гипергликемии у крыс GK

Для оценки терапевтического потенциала IL-1Ra на крысах GK без ожирения мы вводили IL-1Ra (10 мг / кг веса тела крысы), загруженный в 25% гель PF127, один раз в день через подкожную инъекцию в течение 4 недель. В этом исследовании мы использовали одномесячных крыс линии GK и линии Wistar соответствующего возраста. Крысы GK обладают способностью к развитию легкой гипергликемии после отъема в возрасте 3-4 недель [37].В день начала лечения значения глюкозы в плазме крови после кормления составляли 7,56 ± 0,42 мМ для крыс линии Вистар, 12,30 ± 1,24 * мМ для GK-физиологического раствора и 12,00 ± 0,68 * мМ для GK-Gel (*, P <0,05 по сравнению с wistar), тогда как их масса тела составляла 100,20 ± 1,85 г, 90,30 ± 1,86 г и 94,00 ± 1,94 г соответственно. IL-1Ra, загруженный в гель PF127, показал снижение гипергликемии после кормления (фиг. 1A и B) без влияния на массу тела во время периода лечения (фиг. 1C).

Рисунок 1. Устойчивая доставка IL-1Ra из 25% геля PF127 предотвращает степень гипергликемии у диабетических GK-крыс.

Лечение было начато у самцов крыс линии Вистар и GK в возрасте 4 недель. 200 мкл NS вводили крысам линии Wistar (n = 5) и GK (n = 5) один раз в день, тогда как IL-1Ra (10 мг / кг массы тела) в 200 мкл предварительно стерилизованного геля PF127 в GK (n = 5) крысы. В начале лечения у групп животных были разные значения глюкозы в крови (см. Текст). Введение IL-1Ra и измерение уровня глюкозы в крови проводили в 9–10 часов утра. Показаны (A) дельта (Δ) уровня глюкозы в крови после введения, (B) AUC для значений уровня глюкозы в крови после введения Δ за 4 недели лечения и (C) Δ веса тела во время лечения.«N» представляет общее количество животных в каждой группе. ^*, P <0,05; ^**, P <0,01; по сравнению с группами крыс линии Вистар. ^#, P <0,05; ^##, P <0,01 по сравнению с группой GK-физиологического раствора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g001

На протяжении всего периода лечения мы измеряли уровни глюкозы в плазме крови после кормления 2–3 раза в неделю. ГК-физиологический раствор против ГК-геля, но явная значимая разница (P <0.05) был замечен среди крыс GK-Saline и GK-Gel по сравнению с крысами Wistar. После 15 дней непрерывной устойчивой доставки IL-1Ra через гель PF127 появилась значительная разница (P <0,05) в значениях введенной глюкозы плазмы между GK-физиологическим раствором и GK-гелем до последнего дня лечения. В конце лечения значения глюкозы в условиях кормления для крыс Wistar, GK-Saline и GK-Gel составляли 7,08 ± 1,36 мМ, 15,31 ± 1,57 * мМ и 7,58 ± 0,69 ^# мМ (*, P <0,05 по сравнению с wistar крысы и ^#, P <0.05 против GK-Saline) соответственно. В конце периода лечения также не наблюдалось значительной разницы между массой тела GK-Saline и GK-Gel.

IL-1Ra, содержащийся в геле PF127, улучшает толерантность к глюкозе у крыс GK

IPGTT выполняли для проверки способности IL-1Ra, загруженного в гель PF127, индуцировать секрецию инсулина в ответ на введение глюкозы. Во время IPGTT GK-солевой раствор проявлял значительно (P <0,05) высокие гликемические значения до (0 мин) и после введения глюкозы по сравнению со значениями у животных Wistar и GK-Gel, оцененных во все моменты времени.В случае GK-Gel, хотя значения глюкозы до (0 мин) и после введения глюкозы были высокими по сравнению с крысами линии Вистар во все моменты времени, но значительно (P <0,05) сниженные пиковые уровни глюкозы наблюдались в каждый момент времени. по сравнению с GK-Saline (рис. 2A). Через 120 минут уровни глюкозы в плазме в GK-физиологическом растворе оказались значительно высокими по сравнению с группами GK-Gel и wistar. При IPGTT не было обнаружено значимой разницы (P <0,01) между базальными уровнями глюкозы в плазме wistar и GK-Gel от уровней глюкозы в плазме, наблюдаемых после 120 минут введения глюкозы, тогда как очень значимая разница (P <0.001) наблюдали между базовыми уровнями глюкозы в плазме и уровнями глюкозы в плазме после 120 минут введения глюкозы (фиг. 2A) в GK-физиологическом растворе.

Рисунок 2. Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе.

Временные изменения сывороточных уровней (A) глюкозы и (B) инсулина выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение. (C) HOMA-IR, (D) HOMA-β, (E) FIGR и (F) QUICKI также рассчитывались с использованием значений сывороточных уровней глюкозы и инсулина. n = 4 для крыс линии Вистар, n = 5 для обеих групп крыс GK.^*, P <0,05; ^**, P <0,01; по сравнению с группами крыс линии Вистар. ^#, P <0,05; ^##, P <0,01 по сравнению с группой GK-физиологического раствора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g002

Во время IPGTT уровни инсулина в сыворотке для этих групп также измерялись во всех временных точках (рис. 2B). В GK-Saline уровень инсулина в сыворотке крови был в 1,5 раза выше по сравнению с крысами линии Wistar и в 0,9 раза в группе GK-Gel до (0 мин) введения глюкозы.После введения глюкозы у крыс линии Вистар наблюдались высокие уровни инсулина в сыворотке (в 6 раз от их исходного уровня инсулина в сыворотке натощак) в ответ на глюкозу через 30 минут, тогда как сывороточные уровни инсулина в GK-Gel были увеличены в 3,7 раза по сравнению с их исходным уровнем. уровни инсулина в сыворотке натощак. Уровень инсулина в сыворотке не увеличился значительно (только в 1 раз по сравнению с исходным уровнем инсулина натощак) в GK-физиологическом растворе. У крыс Wistar уровень инсулина в сыворотке натощак был в 2,1 раза ниже (P <0.05) до (0 мин) и повышение уровня инсулина в сыворотке в 1,24 раза по сравнению с GK-солевым раствором после 30 минут введения глюкозы. Группа GK-Gel продемонстрировала значительно более низкие уровни инсулина в сыворотке крови натощак (0,9 раза; P <0,05) до (0 мин) и повышенные уровни инсулина в сыворотке (1,21 раза) по сравнению с GK-солевым раствором после 30 минут введения глюкозы. По сравнению с группой Wistar и GK-Gel, сывороточные уровни инсулина в GK-солевом растворе до (0 мин) и через 120 минут введения глюкозы были значительно (P <0.05) высокий (рис. 2Б).

Определение чувствительности к инсулину

Поскольку мы наблюдали защитные терапевтические эффекты IL-1Ra, загруженного в гель PF127, на уровни глюкозы в крови, толерантность к глюкозе и секрецию инсулина во время IPGTT, мы дополнительно выяснили эти эффекты, анализируя резистентность к инсулину, функцию β-клеток по секреции инсулина и чувствительность. с вычислением HOMA-IR, HOMA-β, FIGR и QUICKI. Эти параметры были основаны на уровнях глюкозы и инсулина натощак (IPGTT).Значение HOMA-IR (фиг. 2C) для GK-физиологического раствора было в 4,28 раза (P <0,05) выше по сравнению с крысами линии Wistar и в 2,3 раза (P <0,05) по сравнению с группой GK-Gel. Значение HOMA-IR для GK-Gel показало, что IL-1Ra, загруженный в PF127, может повышать чувствительность к инсулину в группе GK-Gel. Функцию β-клеток по секреции инсулина оценивали с помощью HOMA-β, и значение HOMA-β для GK-солевого раствора было в 0,7 раза (P <0,01) и 0,8 раза (P <0,05) выше по сравнению с wistar и GK- Группа гелей соответственно (рис. 2D). Удивительно, но не было существенной разницы в HOMA-β между группами wistar и GK-Gel.Аналогичные результаты наблюдались также при вычислении FIGR (фиг. 2E). Впоследствии мы рассчитали QUICKI для этих групп, и наблюдалась очень значимая разница для GK-Saline по сравнению с wistar (P <0,01) и GK-Gel (P <0,001), тогда как между значениями QUICKI не наблюдалось значимой разницы. животных групп Wistar и GK-Gel (рис. 2F).

Влияние IL-1Ra, содержащегося в геле PF127, на метаболические параметры

По истечении одного месяца лечения крыс милосердно умерщвляли, и их сыворотку отделяли от собранных образцов крови центрифугированием.Анализируемые метаболические параметры суммированы в Таблице 1. Было обнаружено, что масса тела GK-Saline и GK-Gel была значительно ниже (P <0,05), чем у группы Wistar. GK-Saline проявлял значительную гипергликемию [36] по сравнению с wistar и GK-Gel (P <0,05), тогда как из-за непрерывной устойчивой доставки IL-1Ra из геля PF127 мы не обнаружили какой-либо значимой разницы между уровнями глюкозы в крови после еды. животных группы Вистар и ГК-Гель (табл. 1). Длительная доставка IL-1Ra также показала его большие терапевтические возможности для снижения циркулирующих уровней инсулина и проинсулина у крыс GK.В конце лечения наблюдалась значительная разница (P <0,05) между циркулирующими уровнями инсулина, проинсулина и соотношением проинсулин / инсулин для животных групп GK-солевого раствора и GK-Gel (рис. 3A, B и C. соответственно), тогда как мы не наблюдали какой-либо значимой разницы между этими параметрами у животных группы GK-Gel и Wistar. Мы также измерили различные биомаркеры липидного профиля (FFAs, TGs, TC, HDLs, LDLs и VLDLs), чтобы предсказать эффект IL-1Ra посредством длительной доставки из геля PF127.Уровни циркуляции этих параметров были значительно снижены в группе GK-Gel по сравнению с GK-Saline (P <0,05), тогда как в группе Gk-Saline также наблюдалась очень значимая разница по сравнению с животными из группы Wistar (Таблица 1). Мы также рассчитали отношения TC / HDL, TG / HDL и LDL / HDLs среди животных той же группы. Высоко значимая разница (P <0,01) наблюдалась, когда соотношения TC / HDL, TG / HDL и LDL / HDLs в GK-солевом растворе сравнивались с соотношениями wistar и GK-Gel по отдельности (Таблица 1).Мы также рассчитали системный воспалительный маркер (IL-6) во всех группах. Значения IL-6 в группе GK-солевого раствора были значительно (P <0,05) высокими по сравнению с животными из групп Wistar и GK-Gel, тогда как между уровнями сывороточного IL-6 в GK-Gel и GK-Gel наблюдалась незначительная разница. y животные группы Вистар (Таблица 1). Наконец, длительная доставка IL-1Ra, загруженного в гель PF127, показала способность предотвращать гиперинсулинемию, гиперлипидемию и повышенные уровни IL-6 у крыс GK.

Рисунок 3.В конце лечения сывороточные уровни (А) введенного инсулина, (В) проинсулина и (С) соотношения проинсулин / инсулин.

^*, P <0,05; по сравнению с группами крыс линии Вистар. ^#, P <0,05; по сравнению с группой GK-Saline. n = 4 для крыс линии Вистар, n = 5 для обеих групп крыс GK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g003

Влияние IL-1Ra и PF127 на функцию почек крыс GK

В конце периода лечения мы наблюдали функции почек во всех группах.Мы измерили азот мочевины, креатинин и мочевую кислоту в сыворотке. Сывороточные уровни азота мочевины, креатинина и мочевой кислоты в группах с GK-физиологическим раствором были значительно (P <0,05) выше, чем в группе Wistar (Таблица 2), тогда как длительная доставка IL-1Ra, загруженного в гель PF127, значительно подавляла Уровни мочевины, креатинина и мочевой кислоты в группе GK-Gel близки к уровням сыворотки, наблюдаемым в группе Wistar (Таблица 2). Мы собрали 24-часовую мочу у всех крыс в безметалловые пропиленовые пробирки для измерения значения pH, альбумина и креатинина в моче.Мы также рассчитали ACR по этим измеренным значениям. Группы GK-солевого раствора выделяли большой объем мочи темно-коричневого цвета за 24 часа по сравнению с группой Wistar и GK-Gel (P <0,001). Значение pH GK-физиологического раствора также было высоким по сравнению с группой Вистар (Таблица 2). Группа GK-физиологического раствора продемонстрировала значительное увеличение альбумина в моче, креатинина и ACR по сравнению с животными группы Wistar (P <0,01). В случае животных группы GK-Gel, IL-1Ra, загруженный в гель PF127, оказывал сильное влияние на маркеры мочи.У животных группы GK-Gel наблюдалось очень значимое снижение (P <0,01) альбумина, креатинина и ACR в моче, что свидетельствует о нетоксическом воздействии PF127 на почки (таблица 2). Следовательно, длительная доставка IL-1Ra значительно подавляла развитие альбуминурии у крыс GK в соответствии с отражением безопасного использования PF127.

Иммуногистохимический анализ CD68 в островках поджелудочной железы

Чтобы исследовать проявление воспаления в островках поджелудочной железы, был проведен иммуногистохимический анализ на CD68, взяв инфильтрацию макрофагов в качестве маркера (рис.4). Островки крыс GK, обработанных IL-1Ra, загруженным в гель, представляли значительно сниженное мечение CD68, указывающее на минимальную инфильтрацию макрофагами в островке (фиг. 4C). Кроме того, сверхэкспрессия CD68 наблюдалась в островках группы GK-солевого раствора (фиг. 4B), свидетельствуя о том, что лечение IL-1Ra могло снизить воспалительные реакции в островках GK, обработанных IL-1Ra, наиболее вероятно за счет уменьшения инфильтрации иммунных клеток в крысы GK, получавшие IL-1Ra, загруженные в гель PF127 (фиг. 4D).

Рисунок 4.Иммуногистохимическое окрашивание маркера инфильтрации макрофагов (CD68) в островках поджелудочной железы (IHC × 400): (A) крыса Wister (B) группа GK-физиологического раствора, показывающая обильное мечение CD68, представляющее богатую инфильтрацию макрофагов (C) Группа GK-геля, показывающая нормальную организацию островки с минимальной инфильтрацией макрофагов.

(D) Количественная оценка иммунных клеток / островков поджелудочной железы с помощью иммуногистохимии. ^*, P <0,05; по сравнению с группами крыс линии Вистар. ^#, P <0,05; по сравнению с группой GK-Saline.n = 3 для крыс линии Вистар, n = 4 для обеих групп крыс GK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g004

Гистопатологическое исследование срезов кожи

Патологическое исследование гистологических срезов (H и E × 100) кожи с места инъекции проводилось в конце лечения для исследования любых признаков воспалительных реакций. Как показано на фиг. 5, в месте инъекции не наблюдалось появления макрофагов или лимфоцитов, что свидетельствует об отсутствии значительного воспаления в окружающих тканях в месте инъекции, что свидетельствует о безопасном введении PF127 посредством подкожных инъекций.

Рисунок 5. Гистологические микрофотографии среза кожи, окрашенного гематоксилин-эозином (H и E × 100), показывающие нормальную подкожную ткань: (A) группы крыс Wister (B) группы GK-физиологического раствора (C) группы GK-геля. n = 3 для крыс линии Вистар, n = 4 для обеих групп крыс GK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g005

Гистопатологическое исследование отделов почек

Гистопатологическое исследование среза почки (H & E × 100) выявило нормальные клубочки и канальцы крысы Wister (рис.6А). Внешний вид почки крысы с GK-физиологическим раствором также показал нормальные канальцы, просвет и клубочки (рис. 6В). Интересно, что почка крыс GK-Gel не выявила патологических изменений в почечной ткани, канальцах, просвете и клубочках (фиг. 6C), что позволяет предположить, что PF127 не оказывает значительного повреждающего воздействия на выделительный орган.

Рисунок 6. Гистологические микрофотографии окрашенного гематоксилином-эозином среза почки (H и E × 100): (A) крысы Wister с нормальными клубочками и канальцами, (B) группа GK-физиологического раствора, показывающая нормальный внешний вид канальцев, просветов и клубочков (C) Группа GK-Gel, показывающая нормальную почечную ткань, канальцы, просвет и клубочки.n = 3 для крыс линии Вистар, n = 4 для обеих групп крыс GK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055925.g006

Неблагоприятные события

Мы не наблюдали каких-либо значительных изменений массы тела крыс GK, получавших гель, по сравнению с крысами GK, получавших физиологический раствор. Ни одна крыса не умерла из-за побочных эффектов, связанных с IL-1Ra и / или PF127. В частности, мы также не наблюдали острой гипогликемии в обработанной группе крыс GK. Во время наших обследований не наблюдалось значительного некроза тканей, кровоизлияний, гиперемии, отека или повреждения мышц.

Обсуждение

В последние годы исследования доказали, что СД2 — это хронический аутовоспалительный синдром [3], [4], при котором ИЛ-1β играет ключевую роль в инициации различных воспалительных механизмов распространения СД2 [9], [43]. IL-1Ra является естественным противовоспалительным антагонистом IL-1β, который недавно был одобрен FDA для лечения T2DM, но из-за его короткого периода полувыведения требуются более высокие дозы с частыми интервалами между дозами. В нашей предыдущей работе мы разработали новую лекарственную форму для IL-1Ra с использованием трех различных концентраций PF127 (20, 25 и 30%) и исследовали его эффекты in vitro и in vivo [26].Среди этих трех концентраций было обнаружено, что состав геля 25% PF127 является лучшим, который продлевает высвобождение in vitro и in vivo , демонстрирует большую эффективность для индукции гипогликемии и ингибирует стимулированное IL-1β производство IL-6 в организме человека. крыс линии Wistar по сравнению с таковой в растворе IL-1Ra. 25% гель PF127 значительно поддерживал концентрацию IL-1Ra в плазме в течение более длительного периода времени по сравнению с 20% гелем PF127 и / или чистым раствором IL-1Ra у крыс линии Wistar. Максимальная концентрация в плазме (C _max) IL-1Ra, загруженного в 25% гель PF127, была достигнута через 4 часа, тогда как C _max для чистого раствора IL-1Ra была достигнута в течение 15 минут.Из-за замедленного высвобождения IL-1Ra из 25% геля PF127 период полужизни IL-1Ra в плазме был значительно высоким (12,53 часа) по сравнению с периодом полураспада чистого раствора IL-1Ra. Основываясь на эффектах замедленного высвобождения IL-1Ra, загруженного в 25% гель PF127, здесь, в нашей настоящей работе, мы расширили этот подход, используя диабетических крыс GK, которые генетически произошли от крыс линии Wistar. Мы вводили IL-1Ra, загруженный в гель PF127, в течение одного месяца крысам GK. Оптимальная доза (10 мг / кг) была стандартизирована и подтверждена предыдущим исследованием [19].Наши настоящие исследования показывают, что IL-1Ra, загруженный в гель PF127, проявлял устойчивые гипогликемические и защитные эффекты на обработанных животных. Во время периода лечения мы наблюдали значительное снижение уровня глюкозы в плазме у обработанных животных по сравнению (P <0,05) с GK-физиологическим раствором (фиг. 1A). Наши результаты хорошо поддерживаются уже опубликованными отчетами [19], [22], [44]. Непрерывная устойчивая доставка IL-1Ra, высвобождаемого из геля PF127, устраняет вредные эффекты глюкозы, блокируя провоспалительную передачу сигналов IL-1β [16], [23], что приводит к увеличению пролиферации β-клеток.Предыдущие исследования показали, что IL-1Ra обладает способностью восстанавливать выживаемость β-клеток и увеличивать стимулированную глюкозой секрецию инсулина у диабетических крыс GK [19] крыс, получавших диету с высоким содержанием жиров [16] и островков поджелудочной железы человека [22], а также повышает уровень инсулина. чувствительность в периферических тканях [19].

Повышенный уровень глюкозы в плазме разрушает секреторные функции β-клеток, индуцируя секрецию IL-1β в островках поджелудочной железы [4], что не только ухудшает функцию β-клеток и вызывает апоптоз, но также вызывает инсулинорезистентность в периферических тканях.У диабетических крыс GK непереносимость глюкозы увеличивается после отъема [37]. Наши результаты IPGTT показывают, что длительная доставка IL-1Ra увеличивала толерантность к глюкозе (фиг. 2A), секрецию инсулина (фиг. 2B) в группе GK-Gel по сравнению с группой GK-физиологического раствора. Интересно, что улучшенная толерантность к глюкозе в группе GK-Gel сильно коррелирует с увеличением секреции инсулина в ответ на введенную глюкозу, что предполагает роль провоспалительных механизмов в дисомеостазе глюкозы, и наши настоящие результаты согласуются с уже опубликованными отчетами.[22], [38], [44].

Инсулинорезистентность является отличительной чертой патогенеза СД2, и модель оценки гомеостаза (HOMA) и QUICKI широко используются для количественной оценки инсулинорезистентности и секреторной функции β-клеток [42], [45] — [47]. Эти две математические формулы различаются только коэффициентом нормализации, то есть постоянным знаменателем в HOMA и логарифмическим преобразованием в QUICKI. Эти формулы наиболее похожи на биологический феномен инсулинорезистентности, и их воспроизводимость зависит исключительно от уровней глюкозы и инсулина натощак, используемых для расчета их значений [48].Используя HOMA, мы оцениваем, что снижение функции β-клеток по секреции инсулина связано с нарушением реакции β-клеток на концентрацию глюкозы в плазме. В нашем настоящем исследовании IL-1Ra, загруженный в гель PF127, значительно улучшил секреторную функцию β-клеток и снизил инсулинорезистентность в ответ на экзогенно вводимую глюкозу в группе GK-Gel (рис. 2C и D). Наши результаты согласуются с уже опубликованными отчетами [19], [45]. Значения HOMA-IR, HOMA-β, FIGR и QUICKI (рис. 2C, D, E и F соответственно) из этих трех групп сильно коррелируют с результатами IPGTT независимо и соответствуют нашим предыдущим результатам [44].

Дисфункция

β-клеток напрямую коррелирует с воспалением островков [13], [15], которое может вызывать нарушение секреции инсулина β-клетками и повышенную резистентность к инсулину в периферических тканях. Благодаря широкому спектру противовоспалительных эффектов IL-1Ra проявляет двойной терапевтический потенциал. Во-первых, он защищает β-клетки островков поджелудочной железы при процессинге инсулина и / или передаче сигналов от прямых цитотоксических эффектов IL-1β, а, во-вторых, он также блокирует индуцированные IL-1β другие цитокины и хемокины в островках поджелудочной железы [19].Наше настоящее исследование показывает, что длительная доставка IL-1Ra из геля PF127 не только уменьшала степень гипергликемии в группе GK-Gel (рис. 1A), но также улучшала секреторную функцию β-клеток для обработки инсулина (о чем свидетельствует снижение значения соотношения проинсулин / инсулин (рис. 3C) и HOMA-β (рис. 2D) в группе GK-Gel по сравнению с GK-солевым раствором) и чувствительность к инсулину (о чем свидетельствует снижение HOMA-IR и увеличение значений QUICKI для Группа GK-Gel (фиг. 2C и F) по сравнению с группой GK-солевого раствора).

Гипергликемия и гиперлипидемия играют свою разрешающую роль в запуске секреции IL-1β из островков поджелудочной железы и вызывают дисфункцию β-клеток у диабетических GK крыс [23], [49], [50]. Из-за снижения дисфункции β-клеток у крыс GK дополнительно развиваются повышенные уровни TG, FFA, TC, HDL и / или соотношения TC / HDL [19], [44], [47], [51] и нарушается индуцированная глюкозой секреция инсулина. из островков поджелудочной железы [19], [44], [50]. Повышенные уровни циркулирующих липидных профилей могут вызывать стимуляцию провоспалительных цитокинов и / или хемокинов эндотелиальными клетками и гладкими мышцами сосудов, что приводит к усилению окислительного стресса [44].Эти воспалительные реакции перемещаются вокруг β-клеток островков поджелудочной железы и продуцируют дополнительные провоспалительные медиаторы, которые могут разрушать β-клетки [4], [9], [43]. IL-1Ra связывается с β-клетками IL-1RI с высокой аффинностью, не вызывая какого-либо ответа, и предотвращает связывание IL-1β. Высокие уровни липидных профилей (таблица 1) подавляются непрерывной доставкой IL-1Ra из геля PF127 после одного месяца лечения, при котором секреция инсулина увеличивалась, что подтверждено уровнями инсулина в сыворотке, измеренными во время IPGTT (рис.2B), HOMA-β (рис. 2D). Подобные типы находок, в которых IL-1Ra снижает липидные профили, также сообщалось в других работах [19], [44].

Диабетическая нефропатия — один из основных факторов заболеваемости и смертности, с которым чаще всего сталкиваются пациенты с диабетом, который обычно приводит к терминальной стадии почечной недостаточности. В клинической практике одним из основных побочных эффектов антидиабетического средства является нефротоксичность, которая часто приводит к острой почечной недостаточности. Модели на животных используются для исследования желаемых терапевтических и нежелательных цитотоксических эффектов, поскольку это очень важно, поскольку повреждение почек может изменить структуру и функцию почек, что может иметь серьезные последствия для общего метаболизма организма.BUN, продукт метаболизма белков, UA, продукт пуриновых нуклеотидов и креатинина, рассматриваются как биомаркеры почечной функции при диабетической нефропатии [52]. Повышенные концентрации BUN, UA и креатинина с повышенным диурезом могут указывать на почечную недостаточность при сахарном диабете [53], [54]. Обработка IL-1Ra, загруженного в гель PF127, вернула эти параметры к нормальным значениям у крыс линии Wistar (таблица 2), что могло быть связано со снижением метаболических нарушений белков, о чем свидетельствует улучшение гликемического контроля во время IPGTT (рис.2). Наши результаты широко поддерживаются уже опубликованными отчетами [55], [56]. Диабетическая нефропатия — это клиническое проявление развитой микроальбуминурии, которая может быть следствием нарушения канальцевой реабсорбции и / или утечки альбумина из-за поврежденных клубочков [57], что может привести к изменению селективных барьеров клубочков. Альбумин и креатинин в моче считаются защитными биомаркерами для диагностики диабетической нефропатии [58]. Аномально их повышенный уровень может вызвать почечную недостаточность [59].Здесь, в нашем исследовании, мы сообщаем, что в группе GK-физиологического раствора значения ACR были значительно (p <0,01) высокими по сравнению с крысами Wistar и / или группой GK-Gel, тогда как IL-1Ra, загруженный в гель PF127, подавлял этот эффект. которые согласовывались с уже опубликованными отчетами в других местах [60] - [63].

В последнее время воспаление привлекло большое внимание в патогенезе СД2 [3], [4], [64], в котором задействованы многие воспалительные механизмы и реакции [5]. Воспалительные реакции могут характеризовать присутствие различных провоспалительных медиаторов (цитокинов и хемокинов), иммунных клеток и инфильтрации макрофагов, амилоидных отложений, апоптотических клеток и фиброза.Следовательно, очень важно модулировать воспалительные реакции внутри островков. IL-1Ra может иметь потенциал для подавления этих воспалительных механизмов и ответов в островках поджелудочной железы [3], [13], [19], [65]. По нашим данным, IL-1Ra, высвобождаемый из геля PF127, может в достаточной степени уменьшить воспаление островков в группе GK-Gel за счет снижения экспрессии маркера инфильтрации макрофагов CD68 (рис. 4), и наши результаты согласуются с уже опубликованными отчетами в другом месте [13], [19], [65].

Интересный и важный вывод нашего настоящего исследования заключается в том, что мы не обнаружили никаких изменений в нормальной гистологии кожи и почек из-за непрерывного приема PF127 в течение одного месяца в группе GK-Gel.Мы также оценили нормальные функции почек путем измерения различных маркеров функции почек и, к удивлению, не заметили каких-либо значительных изменений маркеров функции почек по сравнению с таковыми у крыс линии Вистар. Насколько нам известно, примечательно, что ранее не проводилось исследований, в которых наблюдались бы результаты такого рода, показывающие безопасное использование PF127 для непрерывной доставки любого белкового препарата, такого как IL-1Ra, непрерывно в течение одного месяца. Здесь мы впервые сообщаем, что PF127 безопасен и не может изменять нормальные физиологические функции организма и продлевать терапевтический потенциал IL-1Ra за счет его длительной доставки.

Здесь, в нашем настоящем исследовании, мы также сравнили терапевтическую эффективность IL-1Ra, загруженного в гель PF127, с нашими уже опубликованными результатами для раствора IL-1Ra на крысах GK [44]. Сравнение терапевтической эффективности IL-1Ra в различных лекарственных формах представлено в таблице 3. В нашей настоящей работе доза IL-1Ra, загруженная в гель PF127, составляла 10 мг / кг / день, тогда как для раствора IL-1Ra она составляла 20 мг. мг / кг / сут. Из результатов таблицы 3 было четко установлено, что, хотя доза IL-1Ra, загруженного в гель PF127, была на 50% меньше, чем доза раствора IL-1Ra, но терапевтическая эффективность IL-1Ra, загруженного в гель PF127, была значительно высокой. для устранения симптомов гипергликемии и гиперлипидемии у диабетических крыс GK по сравнению с раствором IL-1Ra.

Из различных предыдущих исследований было доказано, что PF127 безопасен для длительной доставки различных белков, таких как IL-2 [31], инсулин [29], [32], рекомбинантный гирудин [33], окситоцин [34] и лизоцим [35] и продлевает стабильность белков [26] — [29]. С клинической точки зрения наши исследования, основанные на экспериментальном протоколе, могут стимулировать дальнейшие клинические испытания на пациентах с диабетом 2 типа для ускорения терапевтического использования PF127 для безопасной и эффективной доставки IL-1Ra, который демонстрирует эффекты длительного высвобождения, не нарушающие нормальные физиологические функции. тела и защиты эффективности инкапсулированного IL-1Ra до его доставки в целевой сайт.

Заключение

В заключение, наши открытия предлагают лучшее понимание безопасного и эффективного использования биоразлагаемого полимера PF127 для непрерывной устойчивой доставки IL-1Ra подкожным путем до одного месяца. Наши результаты также показывают, что PF127 продлевает терапевтический потенциал IL-1Ra без изменения нормальных физических функций организма. Защитное использование PF127 для длительной доставки IL-1Ra может объяснить длительные эффекты IL-1Ra при использовании однократной дозы IL-1Ra у крыс GK, несмотря на любые побочные эффекты для организма, без изменения нормальных функций почек.Наши данные также подчеркивают потенциальную роль биоразлагаемого полимера PF127 для эффективной доставки IL-1Ra. Следовательно, противодействие короткому биологическому периоду полужизни IL-1Ra с использованием PF127 для его длительной доставки является одним из способов лечения T2DM.

Благодарности

Мы благодарим Совет по стипендиям Китая за предоставление полной блестящей стипендии на степень доктора философии Мухаммаду Саджиду Хамиду Акашу и Канвалу Рехману. Один из авторов также хотел бы восхититься своей женой г-жой Акаш за ее поддержку и мотивацию.Без нее написание этой рукописи было бы невозможным.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MSHA SC. Проведенные эксперименты: МСХА КР. Проанализированы данные: МСХА КР. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MSHA KR HS. Написал статью: МСХА КР.

Ссылки

1. Brownlee M (2001) Биохимия и молекулярная клеточная биология диабетических осложнений. Природа 414: 813–820.
2.Creager MA, Luscher TF, Cosentino F, Beckman JA (2003) Диабет и сосудистые заболевания: патофизиология, клинические последствия и медицинская терапия: Часть I. Циркуляция. 108: 1527–1532.
3. Донат М.Ю., Эллингсгаард Х., Шуман Д.М., Перрен А., Фауленбах М. и др. (2008) Воспаление островков при диабете 2 типа: от метаболического стресса к терапии. Уход за диабетом 31: S161 – S164.
4. Dinarello CA (2011) Блокирование интерлейкина-1β при острых и хронических ауто-воспалительных заболеваниях.J Intern Med 269: 16–28.
5. Донат М.Ю., Шелсон С.Е. (2011) Диабет 2 типа как воспалительное заболевание. Нат Рев Иммунол 11: 98–107.
6. Schroder K, Zhou R, Tschopp J (2010) Инфламмасома NLRP3: датчик метаболической опасности? Наука 327: 296–300.
7. Aggeli IK, Theofilatos D, Beis I, Gaitanaki C (2011) Инсулино-индуцированный окислительный стресс активирует гемоксигеназу-1 посредством различных сигнальных каскадов в клеточной линии скелетных миобластов C2.Эндокринология 152: 1274–1283.
8. Акаш МСХ, Рехман К., Расул Ф., Сетхи А., Абрар М.А. и др. (2011) Альтернативная терапия сахарного диабета 2 типа (СД2) с помощью чернушки (Ranunculaceae). J Med Plants Res 5: 6885–6889.
9. Akash MSH, Shen Q, Rehman K, Chen S (2012) Антагонист рецептора интерлейкина-1: новая терапия сахарного диабета 2 типа. J Pharm Sci 101: 1647–1658.
10. Батлер А.Е., Янсон Дж., Боннер-Вейр С., Ритцель Р., Рицца Р.А. и др.(2003) Дефицит бета-клеток и повышенный апоптоз бета-клеток у людей с диабетом 2 типа. Диабет 52: 102–110.
11. Веллен К.Е., Хотамислигил Г.С. (2005) Воспаление, стресс и диабет. Дж. Клин Инвест 115: 1111–1119.
12. Navab M, Gharavi N, Watson AD (2008) Воспаление и метаболические нарушения. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 11: 459–464.
13. Эхсес Дж. А., Перрен А., Эпплер Е., Рибо П., Посписилик Дж. А. и др. (2007) Увеличение количества макрофагов, ассоциированных с островками, при диабете 2 типа.Диабет 56: 2356–2370.
14. Ehses JA, Meier DT, Wueest S, Rytka J, Boller S и др. (2010) Мыши с дефицитом Toll-подобного рецептора 2 защищены от инсулинорезистентности и дисфункции β-клеток, вызванных диетой с высоким содержанием жиров. Диабетология 53: 1795–1806.
15. Homo-Delarche F, Calderari S, Irminger JC, Gangnerau MN, Coulaud J и др. (2006) Островковое воспаление и фиброз на спонтанной модели диабета 2 типа у крысы GK. Диабет 55: 1625–1633.
16.Маэдлер К., Сергеев П., Эхсес Дж. А., Мате З., Боско Д. и др. (2004) Лептин модулирует экспрессию антагониста рецептора IL-1 β-клетками и высвобождение IL-1β в островках человека. Proc Natl Acad Sci USA 101: 8138–8143.
17. Бони-Шнетцлер М., Боллер С., Дебрей С., Бузакри К., Мейер Д. Т. и др. (2009) Свободные жирные кислоты вызывают провоспалительный ответ в островках через обильно экспрессируемый рецептор интерлейкина-1 I. Эндокринология. 150: 5218–5229.
18. Ларсен С.М., Фауленбах М., Вааг А., Велунд А., Эхсес Дж. А. и др.(2007) Антагонист рецептора интерлейкина-1 при сахарном диабете 2 типа. N Engl J Med 356: 1517–1526.
19. Эхсес Дж. А., Лакраз Дж., Жируа М., Шмидлин Ф., Куло Дж. И др. (2009) Антагонизм IL-1 снижает гипергликемию и воспаление тканей у крыс GK с диабетом 2 типа. Proc Natl Acad Sci USA 106: 13998–14003.
20. Dinarello CA (1996) Биологическая основа интерлейкина-1 при болезни. Кровь 87: 2095–2147.
21. Dinarello CA (2000) Роль антагониста рецептора интерлейкина-1 в блокировании воспаления, опосредованного интерлейкином-1.N Engl J Med 343: 732–4.
22. Sauter NS, Schulthess FT, Galasso R, Castellani LW, Maedler K (2008) Противовоспалительный цитокиновый антагонист рецептора интерлейкина-1 защищает от гипергликемии, вызванной диетой с высоким содержанием жиров. Эндокринология 149: 2208–2218.
23. Маэдлер К., Сергеев П., Рис Ф., Оберхольцер Дж., Джоллер-Джемелка Х.И. и др. (2002) Индуцированная глюкозой продукция IL-1β β-клетками вносит свой вклад в глюкотоксичность островков поджелудочной железы человека. Дж. Клин Инвест 110: 851–860.
24. Ларсен С.М., Фауленбах М., Вааг А., Эхсес Дж. А., Донат М.Ю. и др. (2009) Устойчивые эффекты лечения антагонистом рецептора интерлейкина-1 при диабете 2 типа. Уход за диабетом 32: 1663–1668.
25. Dinarello CA (2004) Терапевтические стратегии по снижению активности IL-1 при лечении местного и системного воспаления. Curr Opin Pharmacol 4: 378–385.
26. Akash MSH, Rehman K, Li N, Gao JQ, Sun H и др. (2012) Длительная доставка IL-1Ra из термочувствительного геля на основе Pluronic F127 продлевает его терапевтический потенциал.Pharm Res. 29: 3475–3485.
27. Ван П.Л., Джонстон Т.П. (1993) Повышенная стабильность двух модельных белков в среде перемешиваемого раствора с использованием полоксамера 407. J Parenter Sci Technol 47: 183–189.
28. Катакам М., Белл Л.Н., Банга А.К. (1995) Влияние поверхностно-активных веществ на физическую стабильность rhGH. J Pharm Sci 84: 713–716.
29. Das N, Madan P, Lin S (2012) Статистическая оптимизация нагруженных инсулином гелей Pluronic F-127 для буккальной доставки базального инсулина.Фарм Дев Технол 17: 363–374.
30. Stratton LP, Dong A, Manning MC, Carpenter JF (1997) Матрица для доставки лекарств, содержащая осадки нативного белка, суспендированные в геле поломаксамера. J Pharm Sci 86: 1006–1010.
31. Johnston TP, Punjabi MA, Froelich CJ (1992) Устойчивая доставка интерлейкина-2 из гелевой матрицы полоксамера 407 после внутрибрюшинной инъекции мышам. Pharm Res 9: 425–434.
32. Баричелло Дж. М., Моришита М., Такаяма К., Нагаи Т. (1999) Абсорбция инсулина из гелей Pluronic F-127 после подкожного введения крысам.Int J Pharm 184: 189–198.
33. Лю Ю., Лу В.Л., Ван Дж.К., Чжан Х, Чжан Х. и др. (2007) Контролируемая доставка рекомбинантного гирудина на основе термочувствительного гидрогеля Pluronic® F127 для подкожного введения: характеристика in vitro и in vivo. J Control Release 117: 387–395.
34. Чайбва Ф.А., Уокер Р.Б. (2007) Сравнение методов высвобождения in vitro для оценки высвобождения окситоцина из парентеральных препаратов pluronic® f127. Технологии растворения 14: 15–26.
35. Hiwale P, Lampis S, Conti G, Caddeo C, Murgia S и др. (2011) Высвобождение лизоцима из желатиновых микросфер in vitro: влияние сшивающих агентов и термообратимого геля в качестве суспендирующей среды. Биомакромолекулы 12: 3186–3193.
36. Portha B, Lacraz G, Kergoat M, Homo-Delarche F, Giroix MH и др. (2009) Бета-клетка крысы GK: прототип больной бета-клетки человека при диабете 2 типа? Эндокринол клеток Mol 297: 73–85.
37. Portha B (2005) Запрограммированные нарушения развития и функционирования бета-клеток как одна из причин диабета 2 типа? Парадигма крысы GK.Diab Metab Res Rev 21: 495–504.
38. Мовассат Дж., Баилбе Д., Лубрано-Бертелье С., Пикарель-Бланшо Ф., Бертен Э. и др. (2008) Наблюдение за крысами GK во время предиабета подчеркивает повышенное действие инсулина и отложение жира, несмотря на низкую секрецию инсулина. Am J Physiol Endocrinol Metab 294: E168 – E175.
39. де Ассис А.М., Ригер Д.К., Лонгони А., Батту С., Раймунди С. и др. (2009) Диеты с высоким содержанием жиров и высокотермолизованными жирами способствуют развитию инсулинорезистентности и увеличивают повреждение ДНК у крыс.Exp Biol Med (Maywood) 234: 1296–1304.
40. Мэтьюз Д.Р., Хоскер Дж. П., Руденски А.С., Нейлор Б.А., Тричер Д.Ф. и др. (1985) Оценка модели гомеостаза: инсулинорезистентность и функция бета-клеток на основе концентрации глюкозы в плазме натощак и концентрации инсулина у человека. Диабетология 28: 412–419.
41. Caro JF (1991) Инсулинорезистентность у мужчин с ожирением и без ожирения. J Clin Endocrinol Metab 73: 691–695.
42. Кац А., Намби С.С., Мазер К., Барон А.Д., Фоллманн Д.А. и др.(2000) Количественный индекс проверки чувствительности к инсулину: простой и точный метод оценки чувствительности к инсулину у людей. J Clin Endocrinol Metab 86: 2402–2410.
43. Akash MSH, Rehman K, Chen S. (2012) Роль воспалительных механизмов в патогенезе сахарного диабета 2 типа. J Cell Biochem. DOI: 10.1002 / jcb.24402.
44. Akash MSH, Rehman K, Sun H, Chen S. (2013) Антагонист рецептора интерлейкина-1 улучшает нормогликемию и чувствительность к инсулину у диабетических крыс Goto-Kakizaki.Eur J Pharmacol. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2013.01.008
45. Song Y, Manson JE, Tinker L, Howard BV, Kuller LH и др. (2007) Чувствительность к инсулину и секреция инсулина, определенные с помощью оценки модели гомеостаза и риска диабета в многоэтнической когорте женщин: обсервационное исследование инициативы по охране здоровья женщин. Уход за диабетом 30: 1747–1752.
46. Бойко EJ, Jensen CC (2007) Знаем ли мы, какие меры оценки модели гомеостаза измеряют? Если нет, то какое это имеет значение? Уход за диабетом 30: 2729–36.
47. Уоллис Р.Х., Уоллес К.Дж., Коллинз С.К., Мак-Атир М., Аргуд К. и др. (2004) Повышенная секреция инсулина и метаболизм холестерина в родственных линиях спонтанно диабетических (Тип 2) крыс Goto Kakizaki контролируются независимыми генетическими локусами в хромосоме 8 крысы. Diabetologia 47: 1096–1106.
48. Антуна-Пуэнте Б., Фарадж М., Карелис А.Д., Гаррель Д., Прюдом Д. и др. (2008) HOMA или QUICKI: полезно ли проверять воспроизводимость формул? Метабы диабета 34: 294–296.
49. Gaisano HY, Ostenson CG, Sheu L, Wheeler MB, Efendic S (2002) Аномальная экспрессия экзоцитотических рецепторов растворимого N-этилмалеимида чувствительного к N-этилмалеимида белка рецепторов белка прикрепления экзоцитоза островков поджелудочной железы у крыс Goto-Kakizaki частично восстанавливается обработкой флоризином и усиливается обработкой высоким содержанием глюкозы . Эндокринология 143: 4218–4226.
50. Briaud I, Kelpe CL, Johnson LM, Tran PO, Poitout V (2002) Дифференциальные эффекты гиперлипидемии на секрецию инсулина в островках Лангерганса у гипергликемических и нормогликемических крыс.Диабет 51: 662–668.
51. Argoud K, Wilder SP, McAteer MA, Bihoreau MT, Ouali F, et al. (2006) Генетический контроль уровней липидов в плазме у кросса, полученного от нормогликемических крыс Brown Norway и спонтанно диабетических крыс Goto-Kakizaki. Диабетология 49: 2679–2688.
52. Perone RD, Madias NE, Levey AS (1992) Креатинин сыворотки как показатель функции почек. Новое понимание старых концепций. Clin Chem 38: 1933–1953.
53. Шинде У.А., Гоял Р.К. (2003) Влияние пиколината хрома на гистопатологические изменения у STZ и новорожденных крыс с STZ диабетом.J Cell Mol Med 7: 322–329.
54. Муруган П., Пари Л. (2007) Влияние тетрагидрокуркумина на функциональные маркеры печени и почек и уровни белка у экспериментальных крыс с диабетом 2 типа. Basic Clin Pharmacol Toxicol 101: 241–245.
55. Mansour HA, Newairy AA (2000) Улучшение нарушенной функции почек, связанной с диабетом, с помощью плодов Balanites aegyptiaca у крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом. J Med Res Inst 21: 115–125.
56. Kaleem M, Medha P, Ahmed Q U, Asif M, Bano B (2008) Благоприятные эффекты экстракта Annona squamosa у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином.Singapore Med J 49: 800–804.
57. Gomes MB, Lucctetti MR, Gonacalvez MFR (1997) Влияние объема первой утренней мочи, крови натощак и гликозилированного гемоглобина на экскрецию альбумина с первой утренней мочой. Braz J Med Biol Res 30: 191–196.
58. Pawluczyk IZ, Harris KP (1997) Макрофаги способствуют просклеротическим ответам в культивируемых мезангиальных клетках крыс: механизм инициации гломерулосклероза. J Am Soc Nephrol 8: 1525–1536.
59. Schrijvers BF, De Vriese AS, Van de Voorde J, Rasch R и др.(2004) Долгосрочные почечные изменения у крыс Goto – Kakizaki, модель худого диабета 2 типа. Пересадка нефрола Dial 19: 1092–1097.
60. Ohta T, Miyajima K, Komuro G, Furukawa N, Yonemori F (2003) Антидиабетический эффект хронического введения JTT-608, нового гипогликемического агента, у диабетических крыс Goto-Kakizaki. Eur J Pharmacol 476: 159–166.
61. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving H (2004) Протеинурия, цель для ренопротекции у пациентов с диабетической нефропатией 2 типа: уроки от RENAAL.Почки Int 65: 2309–2320.
62. Sohn EJ, Kim C-S, Kim YS, Jung DH, Jang DS и др. (2007) Влияние магнолола (5,5′-диаллил-2,2′-дигидроксибифенила) на диабетическую нефропатию у крыс Goto-Kakizaki с диабетом 2 типа. Life Sci 80: 468–475.
63. Fu J, Li Y, Wang L, Gao B, Zhang N и др. (2009) Пеонифлорин предотвращает диабетическую нефропатию у крыс. Comp Med 59: 557–566.
64. Donath MY, Boni-Schnetzler M, Ellingsgaard H, Ehses JA (2009) Воспаление островков нарушает β-клетки поджелудочной железы при диабете 2 типа.Физиология (Bethesda) 24: 325–331.
65. Ричардсон SJ, Willcox A, Bone AJ, Foulis AK, Morgan NG (2009) Связанные с островком макрофаги при диабете 2 типа. Диабетология 52: 1686–1688.

Генетический анализ инсулиннезависимого сахарного диабета у крыс GK

WHO Tech. Rep. Ser. В Профилактика сахарного диабета. Т. 844 (ВОЗ, Женева, 1994).

Bennett, P.H. Эпидемиология сахарного диабета.В Сахарный диабет. Теория и практика . (ред. Рифкин, Х. и Порт, Дж. Д.) 357–377 (Эльзевир, Нью-Йорк, 1990).

Google Scholar

Гото Ю., Какизаки М. и Масаки Н. Спонтанный диабет, вызванный селективным разведением нормальных крыс линии Вистар. Proc. Япония. Акад. 51 , 80–85 (1975).

Артикул Google Scholar

Сузуки, К.-I., Goto, Y. & Toyota, T. Спонтанно диабетические крысы GK (Goto-Kakizaki). В книге Уроки диабета животных . (ред. Шафрир, Э.) 107–116 (Смит-Гордон, Лондон, 1992).

Google Scholar

Portha, B. и др. . Нечувствительность β-клеток к глюкозе у крыс GK, модель спонтанного отсутствия ожирения для диабета типа II. Диабет. 40 , 486–491 (1991).

CAS Статья Google Scholar

Бисбис, С. и др. . Инсулинорезистентность у крыс GK: уменьшенное количество рецепторов, но нормальная активность киназы в печени. Am. J. Physiol. 265 , E807 – E813 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Ostenson, C.-G. и др. . Аномальная секреция инсулина и метаболизм глюкозы в островках поджелудочной железы у крыс GK со спонтанным диабетом. Diabetologia. 36 , 3–8 (1993).

CAS Статья Google Scholar

Абдель-Халим, С.М. и др. . Влияние диабетической наследственности на толерантность к глюкозе и секрецию инсулина у крыс GK-Wistar со спонтанным диабетом. Диабет 43 , 281–288 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Gauguier, D. et al . Более высокая материнская, чем отцовская наследственность диабета у крыс GK. Диабет 43 , 220–224 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Hughes, S.J., Suzuki, K. & Goto, Y. Роль секреторной функции островков в развитии диабета у крыс GK Wistar. Diabetologia 37 , 863–870 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Вильяр-Паласи, К.И Фарезе, Р. Нарушение активации гликогенсинтазы скелетных мышц инсулином у крыс Goto-Kakizaki (GK). Diabetologia 37 , 885–888 (1994).

CAS Статья Google Scholar

С., Райт Генетика количественной изменчивости. В Эволюция и генетика популяций. Генетика и биометрические основы . 373–420 (Чикагский университет Press, Чикаго, 1968).

Google Scholar

Лендер, Э.С. и Ботштейн, Д. Сопоставление менделевских факторов, лежащих в основе количественных характеристик, с использованием карт связи RFLP. Genetics 121 , 185–199 (1989).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Мартин А.О., Симпсон Дж. Л., Обер К. и Фрейнкель Н. Частота сахарного диабета у матерей пробандов с гестационным диабетом: возможная предрасположенность к гестационному диабету. Am. J. Obstet Gynec. 151 , 471–475 (1985).

CAS Статья Google Scholar

Дорнер Г., Плагеманн А. и Рейнагель Х. Семейная агрегация диабета у диабетиков I типа: гестационный диабет — очевидный фактор риска повышенной восприимчивости к диабету у потомства. Exp. Clin. Эндокринол. 89 , 84–90 (1987).

CAS Статья Google Scholar

Харлан Л.К., Хариан, В. Р., Ландис, Дж. Р., Гольдштейн, Н. Г. Факторы, связанные с толерантностью к глюкозе у взрослых в США. Am. J. Epidemiol. 126 , 674–684 (1987).

CAS Статья Google Scholar

Alcolado, J.C. & Alcolado, R. Важность материнского анамнеза инсулинозависимых пациентов с диабетом. Br. Med. J. 302 , 1178–1180 (1991).

CAS Статья Google Scholar

Митчелл, Б.Д. и др. . Различия в распространенности диабета и нарушения толерантности к глюкозе в зависимости от материнского или отцовского анамнеза диабета. Diabefes Care. 16 , 1262–1267 (1993).

CAS Статья Google Scholar

Thomas, F., Balkau, B., Vauzelle-Kervroedan, F., Papoz, L. и Исследовательская группа CODIAB-INSERM-Zeneca. Материнский эффект и семейная агрегация при NIDDM. Исследование CODIAB. Диабет. 43 , 63–67 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Mitchell, B.D., Kammerer, C.M., Reinhart, L.J., Stern, M.R., MacCluer, J.W. Существует ли избыток передачи ИНЗСД от матери? Diabetologia. 38 , 314–317 (1995).

CAS Статья Google Scholar

Джейкоб, Х.Дж. и др. . Карта генетического сцепления лабораторной крысы, Rattus norvegicus . Nature Genet. 9 , 63–69 (1995).

CAS Статья Google Scholar

Lander, E.S. И Шорк, Н.Дж. Генетическое вскрытие сложных признаков. Наука. 265 , 2037–2048 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Митраков, А. и др. . Роль сниженного подавления выработки глюкозы и уменьшения раннего высвобождения инсулина в нарушении толерантности к глюкозе. New Engl. J. Med. 326 , 22–29 (1992).

CAS Статья Google Scholar

Lillioja, S. et al . Нарушение толерантности к глюкозе как нарушение действия инсулина. Продольные и поперечные исследования индейцев пима. New Engl. J. Med. 318 , 1217–1225 (1988).

CAS Статья Google Scholar

Россетти, Л., Джаккари, А. и ДеФронцо, Р.А. Токсичность глюкозы. Уход за диабетом. 13 , 610–630 (1990).

CAS Статья Google Scholar

Walker, M.D.T., Boulet, A.M & Rutter, W.J. Клеточно-специфическая экспрессия, контролируемая 5′-фланкирующей областью генов инсулина и химотрипсина. Nature 306 , 557–561 (1983).

CAS Статья Google Scholar

Alperet, S., Hanahan, D. & Teitelman, G. Гибридные гены инсулина выявляют линию развития эндокринных клеток поджелудочной железы и предполагают связь с нейронами. Cell 53 , 295–308 (1988).

Артикул Google Scholar

Кариссон, О., Edlund, T., Moss, J.B., Rutter, W.J. & Walker, M.D. Мутационный анализ области контроля транскрипции гена инсулина: экспрессия в бета-клетках зависит от двух связанных последовательностей в энхансере. Proc. Natl. Акад. Sci. США 84 , 8819–8823 (1987).

Артикул Google Scholar

Немецкий, M.S. И Ван Дж. Ген инсулина содержит несколько транскрипционных элементов, которые реагируют на глюкозу. Molec. Клетка. Биол. 14 , 4067–4075 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Джейкоб, Х.Дж. и др. . Генетическое картирование гена, вызывающего гипертензию, у склонных к инсульту крыс со спонтанной гипертензией. Cell 67 , 213–224 (1992).

Артикул Google Scholar

Лакшмикумаран, М.С., Д’Амброзио, Э., Лайминс, Л.А., Лин, Д.Т., Фурано, А.В. Длинно вкрапленная повторяющаяся ДНК (LINE) вызывает полиморфизм в локусе инсулина 1 крысы. Molec. Клетка. Биол. 5 , 2197–2203 (1985).

CAS Статья Google Scholar

Wedell, A., Ritzen, E.M., Haglund-Stengler, B. & Luthman, H. Дефицит стероидной 21-гидроксилазы: три новых мутировавших аллеля и установление фенотип-генотипических отношений общих мутаций. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 89 , 7232–7236 (1992).

CAS Статья Google Scholar

Chomczynski, P. & Sacchi, N. Одностадийный метод выделения РНК кислотной экстракцией тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния. Analyt. Biochem. 162 , 156–159 (1987).

CAS Статья Google Scholar

Норгрен, С., Zierath, J., Wedell, A.H., Wallberg-Henriksson, H. & Luthman, H. Регуляция сплайсинга РНК рецептора человеческого инсулина in vivo. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 91 , 1465–1469 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Границы | Характеристика сайтов связывания для GK домена DLG1 и DLG4 с помощью моделирования молекулярной динамики

Введение

Семейство ассоциированных с мембраной гуанилаткиназ (MAGUK) представляет собой широко экспрессируемую и хорошо консервативную группу белков каркаса, обеспечивающую структурную основу для образования белковых комплексов и играющую важную роль в регуляции передачи клеточного сигнала (Kim, 1995; Funke и другие., 2005). Домен гуанилаткиназы (GK), первоначально служивший катализатором обратимого переноса фосфата от АТФ к GMP (Anderson, 2015), содержащий сайт связывания для GMP. Однако домен GK MAGUK, который превратился в модуль межбелкового взаимодействия без какой-либо обнаруживаемой каталитической активности, мог связываться с разными видами белков. Эти связывающие GK домен белки играют разные роли в развитии тканей, контроле клеточной полярности, формировании синапсов и пластичности (Zhu et al., 2012).

каркасные белки семейства Discs large (DLG), класс MAGUKs, включают пять паралогов у млекопитающих (DLG1-5) посредством двух раундов дупликаций генома на протяжении всей эволюции (Wakabayashi et al., 2003; Roberts et al., 2012). DLG известны как синапс-ассоциированный белок SAP97 (DLG1), PSD-93 / Chapsyn-110 (DLG2), SAP102 (DLG3), PSD-95 / SAP90 (DLG4) и P-DLG (DLG5) соответственно. DLG выполняют те же функции, что и ключевые архитектурные белки, ответственные за закрепление различных постсинаптических компонентов, включая рецепторы глутамата, расположенные ниже по течению каркасные белки и сигнальные ферменты (Zhu et al., 2016а). Как компонент комплекса полярности каракулей, DLG также играют критическую роль в различных клеточных процессах, включая регуляцию апикально-базальной полярности эпителиальных клеток (Wang and Margolis, 2007), а также другие процессы полярности, такие как асимметричное деление клеток и клеточное деление. вторжение. Нарушение функции DLG приводит к неконтролируемой пролиферации эпителиальных клеток и переходу от эпителия к мезенхиме (Roberts et al., 2012; Liu et al., 2019; Marziali et al., 2019).

Несомненно, все пять DLG обладают высокой идентичностью аминокислотной последовательности и очень похожей модульной структурной организацией, которая состоит из трех доменов PDZ на N-конце и тандема Sh4-GK на половине C-конца (Craven and Bredt , 1998).Точно так же домен GK DLG складывается в аналогичные структурно супрамодули и разделяет уникальный режим распознавания цели со своими партнерами по связыванию, такими как LGN, GKAP / DLGAP / SAPAP, SPAR, AKAP79, MAP1A, GAKIN, BEGAIN и GUK-holder (Zhu et al. ., 2012). Недавно было сообщено о семи кристаллических структурах DLG с различными пептидами, включая DLG1 GK / p-LGN (PDB ID: 3UAT), DLG4 GK / p-LGL2 (PDB ID: 3WP0, 3WP1), DLG4 GK / p-SAPAP (PDB ID: 5YPO), DLG4 GK / Kif13b (ID PDB: 5B64), DLG4 GK / MAP1A (ID PDB: 5GNV) и DLG4 GK / GKI-QSF (ID PDB: 5YPR) (Таблица S3).Структурная биология показала, что эти комплексы имеют несколько высококонсервативных взаимодействий, включая сайт фосфора, образованный Arg755, Tyr796 и Glu761 в DLG1 (Arg568, Tyr609 и Glu574 в DLG4), и гидрофобный сайт, образованный Tyr791, Tyr796 и Gly 789 в DLG1 (Tyr604, Tyr 609 и Gly602 в DLG4) (Zhu et al., 2011, 2014, 2016b, 2017; Xia et al., 2017). Однако динамические взаимодействия DLG и фосфорилированных / нефосфорилированных пептидов, которые должны быть полезны для понимания их физиологической функции (Hu et al., 2019; Luo et al., 2019), не были полностью выведены. В этой статье мы исследовали структурные сходства и различия GMP-связывающего субдомена DLG1 и DLG4 с помощью молекулярно-динамического моделирования описанных кристаллических структур, чтобы понять свойства GK-доменов и продолжить разработку нового связующего.

Методы

Получение кристаллических структур белка

Кристаллические структуры были получены из банка данных белков RCSB (идентификатор PDB: 3UAT, 3WP0, 5YPO, 5GNV и 5YPR) (Zhu et al., 2011, 2014, 2017; Xia et al., 2017). Чтобы повысить эффективность моделирования, избыточная часть кристаллической структуры DLG1 на N-конце была удалена по сравнению с DLG4, поскольку эти аминокислоты находились далеко от кармана связывания. Затем структуры были подготовлены с помощью программы SYBYL-X 2.0 (Tripos International, 2012) методом Пауэлла в условиях силового поля AMBER7 FF99 и зарядов AMBER. Состояния протонирования ионизируемых остатков и остатков гистидина были предсказаны в соответствии с микросредой и значениями p K , рассчитанными сервером PDB2PQR (http: // nbcr-222.ucsd.edu/pdb2pqr_2.0.0/) (Dolinsky et al., 2004) при pH = 7,0.

Исследование молекулярного докинга комплекса DLG1 / GKI-QSF

Кристаллические структуры пептида DLG1 и GKI-QSF экстрагировали из комплекса DLG1 / p-LGN и DLG4 / GKI-QSF, соответственно (PDB ID: 3UAT, 5YPR). Для стыковки белков и белков сервер ZDOCK (http://zdock.umassmed.edu/) был применен для создания начальной модели стыковки (Pierce et al., 2014; Shan et al., 2019). Подготовленные структуры пептида DLG1 и GKI-QSF были загружены на веб-сервер.Стыковка производилась с параметрами по умолчанию. Среди предсказанных комплексов был выбран разумный комплекс, в котором GKI-QSF расположен в том же месте, что и DLG4.

Моделирование молекулярной динамики

Все МД-моделирование проводилось с использованием AMBER14 (Case et al., 2014) с силовым полем ff14SB (Maier et al., 2015). Структуры были приготовлены с помощью модуля tleap (Case et al., 2005) и минимизированы с помощью pmemd.MPI . Моделирование MD было выполнено с использованием pmemd.cuda.MPI с использованием модуля Graphical Units Processors (Götz et al., 2012; Salomon-Ferrer et al., 2013). Системы нейтрализовали сначала Na ⁺ или Cl ^—, затем сольватировали в модели воды TIP3P (Jorgensen et al., 1983), а затем помещали в обычный шестигранник с минимальным расстоянием 12 Å для растворенного вещества от границы коробки. Параметры AMBER фосфорилированного серина были получены из базы данных параметров AMBER (http: //research.bmh.manchester.ac.uk/bryce/amber) (Craft and Legge, 2005). После минимизации и уравновешивания было выполнено моделирование МД для различных систем соответственно. Триста пятьдесят наносекунд моделирования МД выполнялись при периодических граничных условиях с использованием ансамбля NPT при 300 К (Sun et al., 2018, 2019).

Анализ траектории

Траектории моделирования были проанализированы с использованием модуля cpptraj (Roe and Cheatham, 2013) из Amber 14. Были рассчитаны среднеквадратичное отклонение (RMSD), среднеквадратичное отклонение (RMSF) и водородные связи.Равновесие системы определяли по значениям RMSD. По временам моделирования МД, когда белок достиг равновесия, средние структуры моделей были рассчитаны с использованием модуля cpptraj . Механизмы связывания между DLG1 / 4 и фосфор-пептидами были охарактеризованы с помощью LigPlot + (Laskowski and Swindells, 2011; Suresh et al., 2018).

Расчет свободной энергии связи

Для расчета энергии связывания DLG1 и DLG4 с их соответствующими лигандами проводили моделирование МД за 350 нс с использованием вышеупомянутого протокола МД, пока системы не достигли равновесия.Свободные энергии связи были рассчитаны с использованием метода MM / GBSA (Hou et al., 2011), реализованного в AMBER 14. Всего было извлечено 100 снимков из равновесной траектории для расчета свободной энергии MM / GBSA. Для оценки энергетического вклада каждого остатка в системах также выполняли разложение по энергии остатка. Все остальные параметры оставлены по умолчанию.

Экспрессия и очистка белка

Домен

DLG1 GK был клонирован в модифицированный вектор pET-15b с N-концевой His6-меткой.Конструкцию экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21 (DE3) и индуцировали 0,2 М изопропил-β-D-тиогалактозидом (IPTG) в течение 18 часов при 16 ° C. Меченный His6 белок был сначала очищен с использованием агарозной аффинной хроматографии Ni ²⁺ -NTA (GE Healthcare), а затем дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex-200 26/60, GE Healthcare) в буфере, содержащем 50 мМ Трис pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ.

Анализ ITC

Измерения

ITC проводили на системе MicroCal-iTC200 (Malvern) в буфере, содержащем 50 мМ Трис, pH 8.0, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 1 мМ DTT при 25 ° C. Концентрации белков, загруженных в шприц (GKI-QSF) и клетку (DLG1 GK), составляли 0,5 и 0,05 мМ соответственно. Данные титрования анализировали с использованием Origin7.0 от MicalCal и подгоняли с помощью модели связывания с одним сайтом.

Результаты

Сравнение домена GK в DLG

Белок DLGs человека содержит домен PSD95 / DLG / ZO-1 (PDZ), модуль взаимодействия Src homology3 (Sh4), домен Lin-2 / Lin-7 (L27), домен рекрутирования каспаз (CARD) и домен гуанилаткиназы (GK).Более подробно, DLG2-4 имеет три домена PDZ, один домен Sh4 и домен GK, в то время как DLG1 имеет дополнительный домен L27 на N-конце, а DLG5 имеет один домен CARD и еще один домен PDZ на N-конце (рисунок 1A).

Рисунок 1. (A) Доменная организация белка DLGs. (B) Выравнивание аминокислотных последовательностей доменов GK DLG с использованием Clustal W. Высококонсервативные остатки (оценка консервации> 0,7) были выделены синим цветом в соответствии с физико-химическими свойствами. (C) Структурные особенности домена DLG1 GK. (D) Поддомен домена DLG1 GK. Субдомен связывания GMP, субдомен Core и субдомен LID были окрашены в морской, зеленый и оранжевый цвета соответственно.

Чтобы сравнить сходство аминокислотных последовательностей между доменами GK DLG1-5, мы выполнили выравнивание аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W (Robert and Gouet, 2014; Madeira et al., 2019). Как показано на рисунке 1B, домены GK в DLG1-5 показали консенсус аминокислотной последовательности более 97%.С точки зрения последовательности, GK-домены DLG были подобны друг другу, за исключением того, что GK-домен DLG5 имел два небольших сегмента с немного разными последовательностями. В целом, домен GK, который был более консервативной последовательностью в этом семействе белков, мог бы выполнять общую биологическую функцию, действуя как белок-связывающий модуль.

По данным анализа структуры белка, домен GK состоял из 7 α-спиралей (α1-α7) и 9 β-листов (β1-β9), образующих Core, LID и GMP-связывающий субдомен (Фигуры 1C, D).Предыдущие сообщения охарактеризовали фосфорилированные лиганды, взаимодействующие с GMP-связывающим субдоменом, который был предковыми ферментативными GKs, используемыми для координации нуклеотидфосфата (Zhu et al., 2012). Поскольку кристаллические структуры DLG1 GK и DLG4 GK были доступны в базе данных PDB, мы обработали и выровняли их, и обнаружили, что их трехмерные структуры были почти одинаковыми, в то время как только несколько петель показали небольшие нюансы. Это указывает на то, что последовательность и структура домена DLG GK были высокогомологичными, обеспечивая структурную основу для их сходных свойств связывать лиганды зависимым от фосфорилирования образом.

Исследование молекулярной динамики комплекса DLG1 с пептидом P-LGN

Чтобы понять связывающее взаимодействие DLG1 и пептида p-LGN, мы провели долгосрочное моделирование молекулярной динамики в течение 350 нс. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) отслеживали во время моделирования для исследования стабильности комплекса DLG1 / p-LGN.

По сравнению с кристаллической структурой, остатки рядом с границей связывания DLG1 после молекулярной динамики показали небольшие колебания, в то время как петля на С-конце имела большие изменения.Структура пептида p-LGN также сохранила аналогичную конформацию, особенно для короткой α-спирали (рис. 2А). Согласно анализу RMSD, DLG1 и p-LGN достигли стабильности при ~ 30 нс, со значением RMSD 2,23 ± 0,45 и 1,57 ± 0,42 Å соответственно (рис. 2B). Анализ RMSF показал, что взаимодействие DLG1 с лигандом значительно снижает подвижность белка, поскольку остатки сайта фосфора обладают низкими значениями RMSF <1 Å. Остатки субдомена LID (840–865) имели более крупный RMSF с максимальным значением 4 Å, что могло быть результатом нестабильных петлевых структур.Точно так же конец С-конца (900–908) показал большие вариации со значениями RMSF 10 Å. С другой стороны, RMSF пептида p-LGN также имел более низкое отклонение, за исключением остатков на обоих концах (остаток при -2, 11 и 12) (рис. 2B). Эти результаты свидетельствуют о том, что интерфейс связывания между DLG1 и пептидом p-LGN был стабильным и подходящим для анализа взаимодействия связывания.

Рис. 2. (A) Кристаллическая структура, наложенная на последнюю конфигурацию после 350 нс моделирования для DLG1 и p-LGN.Для DLG1 начальная и последняя конфигурация были показаны лимонным и голубым цветом соответственно. Для p-LGN начальная и последняя конфигурация показаны зеленым и синим цветом соответственно. (B) RMSD и RMSF DLG1 и p-LGN. (C) Репрезентативное динамическое расстояние внутри ключевых остатков в комплексе DLG1 / p-LGN. (D) 2D-визуализация и взаимодействие между DLG1 и p-LGN. Водородные связи и гидрофобные взаимодействия показаны пунктирными линиями зеленого цвета и красными дугами соответственно.

Результат МД-моделирования показал, что существует шесть важных остатков DLG1, проявляющих сильное взаимодействие с пептидом p-LGN посредством водородных связей. Мы обнаружили, что фосфатная группа p-Ser (Sep) из p-LGN может связываться с Arg758, Arg755, Tyr767 и Tyr796 в DLG1, что указывает на то, что фосфорилирование очень важно для связывания. Эти остатки в DLG1 образовывали прочную сеть водородных связей, которые находились в динамическом циклическом изменении с фосфорилированным серином лиганда во время моделирования MD (Рисунок 2C, Рисунок S1A).Расстояние между тяжелыми атомами (атом азота или кислорода) аминокислотных остатков Arg758, Arg755, Tyr767 и Tyr796 DLG1 и атомом фосфора Sep1 (пептид p-LGN) слегка колеблется в пределах 3,60 ± 0,20, 3,79 ± 0,39, 3.70 ± 0.20 и 4.03 ± 0.53 Å соответственно. Мы также выяснили некоторые водородные связи рядом с сайтом связывания фосфора. Например, расстояние между атомом O Ala788 (DLG1) и атомом N Met8 (пептид p-LGN) сохранялось на уровне 2,93 ± 0,19 Å, а также между атомом N Gln790 (DLG1) и атомом O Glu6 (p- Пептид LGN) был стабильным со значением 3.04 ± 0,20 Å (Рисунок 2C, Рисунок S1C). Помимо водородных связей, мы также обнаружили некоторые другие связывающие взаимодействия во время моделирования MD, такие как гидрофобные взаимодействия между Ile780 на спирали α2, Phe785, Ile786, Glu787, Ala788, Gly789 и Tyr791 на β5 листе DLG1 и пептида p-LGN ( Рисунок 2D, Рисунок S1B). Интересно, что некоторые связывающие взаимодействия, которые не были очевидны в кристаллических структурах, были обнаружены путем анализа МД-моделирования, такие как водородные связи между Asp736, Asp766, Asp816 с Arg (-1), а также Asp736, Asp766 с Arg (-2). .Вкратце, помимо Arg758, Arg755, Tyr767 и Tyr796 в качестве сайтов связывания фосфатных групп также были предложены Asp736, Asp766, Asp816 и гидрофобные остатки β5-листа (788-791) для связывающего взаимодействия пептида p-LGN.

Исследование молекулярной динамики комплекса DLG4 с пептидом P-LGL2

Аналогичным образом, длительное МД-моделирование комплекса DLG4 / p-LGL2 было выполнено в течение 350 нс. Структура DLG4 была стабильной во время моделирования МД, в то время как остатки на N-конце p-LGL2 колебались немного больше, чем в других областях, поскольку петли на N-конце выходили за пределы белковой полости, вызывая значительный позиционный сдвиг (рис. 3A). ).DLG4 поддерживал стабильную структуру на протяжении всего моделирования со значением RMSD 1,29 ± 0,19 Å, в то время как p-LGL2 достигал равновесия через 10 нс со значением RMSD 2,82 ± 0,43 Å. Более высокое значение RMSD p-LGL2 может быть результатом летучего N-конца (570–573), который имеет более высокое значение RMSF 4–6 Å (Рисунок 3B).

Рис. 3. (A) Кристаллическая структура, наложенная на последнюю конфигурацию после 350 нс моделирования для DLG4 и p-LGL2. Для DLG4 начальная и последняя конфигурация были показаны лимонным и голубым цветом соответственно.Для p-LGL2 начальная и последняя конфигурация были показаны зеленым и синим цветом соответственно. (B) RMSD и RMSF DLG4 и p-LGL2. (C) Репрезентативное динамическое расстояние внутри ключевых остатков в комплексе DLG4 / p-LGL2. (D) 2D-визуализация и взаимодействие между DLG4 и p-LGL2. Водородные связи и гидрофобное взаимодействие показаны пунктирными линиями зеленого цвета и красными дугами соответственно.

Подобно DLG1 / p-LGN, остатки фосфосвязывающего сайта образовывали водородные связи с фосфатной группой p-LGL2 во время МД-моделирования, такие как Arg568, Arg571, Tyr580 и Tyr609, хотя мы не наблюдали водородных связей. между Arg571 и p-LGL2 в кристаллической структуре.Было обнаружено, что Arg637 на спирали α4 образует водородные связи с Phe584, который стабилизирует C-конец p-LGL2. Asp629 на спирали α1 связывался с Lys577 (p-LGL2) водородными связями на расстоянии 3,44 ± 1,10 Å. Кроме того, β5-лист DLG4 (601-604) также был обнаружен как важный субдомен для связывания водородными связями и гидрофобными взаимодействиями, такими как водородные связи между Ala601 (DLG4) и Phe584 (p-LGL2) с расстоянием между тяжелыми атомами. (N или O) со значениями 3,29 ± 0,65 Å.Остатки, включая Pro564 на β3-листе, Glu600, Ala601, Gly602, Tyr604 на β5-листе, Ile593 на α2-спирали и Arg637 на α4-спирали, образуют гидрофобную среду, которая контактирует с остатками p-LGL2. Вибрация расстояния между ключевыми остатками между DLG4 и p-LGL2 была показана на фиг. 3C, а другие взаимодействия связывания можно найти на фиг. 3D и фиг. S2.

Важные связующие остатки в DLG1 и DLG4

Для изучения взаимодействий в двух системах был выполнен расчет свободной энергии MM / GBSA.Свободная энергия связи включала в себя энергию VDW (ΔE _vdw), электростатическую энергию (Δ _{Eelectrostatic}), свободную энергию от сольватации электростатического заряда (ΔG _GB) и неполярную свободную энергию сольватации (ΔG _SA) со значениями -65,33 ± 6,65, -532,78 ± 81,94, 520,96 ± 76,35 и -11,62 ± 1,02 ккал / моль в системе DLG1 и -52,85 ± 5,82, -490,41 ± 95,23, 472,51 ± 94,14 и -9,28 ± 0,71 ккал / моль в Система DLG4 соответственно. Согласно результатам, ΔE _vdw и ΔE _{электростатические члены} вносили основной вклад в связывание, хотя большая часть ΔE _{электростатических} была нейтрализована термами ΔG _GB, что указывает на то, что взаимодействия были в первую очередь опосредованы VDW. взаимодействия.

При сравнении энергетического разложения между системами DLG1 и DLG4, типы остатков с энергетическим вкладом <1 ккал / моль были одинаковыми, и значения энергетического вклада также были аналогичными. Два остатка тирозина и два остатка аргинина в сайте связывания фосфора внесли наиболее благоприятную энергию, за ними следуют остатки на листе β5, обеспечивающие важные гидрофобные силы (рис. 4A). Подробные результаты энергетического разложения систем DLG1 и DLG4 можно найти в таблицах S1, S2.Четыре консервативных остатка Asp732, Asp736, Pro751 и His783 в DLG1 образовывали водородные связи и гидрофобные взаимодействия с лигандом p-LGN, чего не наблюдалось в комплексе DLG4 / p-LGL2 (рис. 4B). Мы предположили, что различные аминокислотные последовательности между p-LGL2 и p-LGN, а не DLG, могут быть основной причиной различия во взаимодействии связывания. Эти результаты также показали, что домены GK белков DLG могут иметь тот же паттерн связывания, что и фосфорилированные лиганды, благодаря высокому консенсусу последовательностей и структурному сходству.

Рисунок 4. (A) Разложение свободной энергии связывания систем DLG1 и DLG4. (B) Ключевые остатки для взаимодействий в системах DLG1 / p-LGN (слева) и DLG4 / p-LGL2 (справа) во время моделирования MD. Для взаимодействий DLG4 с SAPAP, MAP1A и GKI-QSF специфические аминокислотные остатки при энергетическом разложении были отмечены красным, пурпурным и синим соответственно. (C) Разложение по свободной энергии связи DLG4 / GKI-QSF и DLG1 / GKI-QSF (слева).Измерение на основе ITC аффинности связывания взаимодействий DLG1 / GKI-QSF (справа).

Связывающее взаимодействие нефосфорилированных пептидов

Для дальнейшего подтверждения важности аминокислотных остатков в субдомене связывания GMP также была проведена молекулярная динамика комплекса DLG4 и p-SAPAP (рисунок S3A). Результаты энергетического разложения показали, что остатки фосфосвязывающего сайта и β5-листа имели сходные энергетические вклады по сравнению с DLG4 / p-LGL2 (рис. 4A).Это означало, что связывающие остатки для типов фосфорилированных белков-мишеней не имели очевидных различий, за исключением вклада неконсервативных остатков вдали от белковой полости.

Чтобы создать больше режима распознавания домена DLG4 GK, связывающие взаимодействия нефосфорилированных пептидов (MAP1A и GKI-QSF) также были проанализированы с использованием стратегии энергетического разложения (Рисунки S3B, C). Результаты показали, что, как и профиль вклада в разложение энергии DLG4 / p-LGL2, остатки сайта связывания фосфора (Arg568, Arg571, Tyr580 и Tyr609) и листа β5 (Ala601, Gly602, Gln603 и Tyr604) обеспечивает полезный вклад свободной энергии связывания даже для нефосфорилированных пептидов, имитирующих фосфор-Ser в связывании с DLG4 (фиг. 4A).Поскольку DLG1 / p-LGN, DLG4 / p-LGL2 и DLG4 / GKI-QSF имели сходный ландшафт разложения энергии, мы пришли к выводу, что GKI-QSF мог не иметь очевидной селективности среди этих DLG и мог связываться с DLG1.

Для точного прогнозирования связывающего взаимодействия была проведена молекулярная динамика DLG1 / GK1-QSF. В результате мы обнаружили, что связывание DLG1 и пептида GKI-QSF было очень стабильным (рисунок S3D). Из диаграммы энергетического разложения остатки DLG1 и DLG4 показали аналогичное распределение энергии, предполагая, что GKI-QSF может связываться с DLG1 с аналогичной аффинностью связывания (рис. 4C).Чтобы еще раз подтвердить это, сродство связывания GKI-QSF с DLG1 определяли с использованием ITC со значением 1,20 ± 0,29 мкМ, что согласуется с нашим прогнозом, поскольку сообщенные значения K d для аффинности связывания DLG4 / GKI -QSF составлял 1,14 ± 0,14 мкМ (Zhu et al., 2017).

Обсуждение

Предыдущие исследования твердо продемонстрировали, что GK домены DLGs были функционально незаменимы, хотя лежащие в основе механизмы были плохо изучены. Недавние исследования структурной биологии DLG GK-опосредованных комплексов показали, что GK-домен DLG представляет собой многофункциональный модуль белок-белкового взаимодействия, который выполняет свои биологические функции, связываясь с различными мишенями в зависимости от фосфорилирования (Xia et al., 2017). Однако исследования зависимых от фосфорилирования паттернов связывания и аминокислотных остатков, которые играли ключевую роль в связывании, полностью не выяснены.

Для демонстрации зависимых от фосфорилирования механизмов молекулярного связывания домена DLG GK были выбраны кристаллические структуры белков DLG1 и DLG4 для моделирования молекулярной динамики и пост-динамического анализа. Поскольку мы сосредоточились на доменах GK DLG, все избыточные аминокислоты, такие как домен Sh4 в комплексе DLG1 / p-LGN (PDB ID: 3UAT), были удалены для молекулярной динамики.Молекулярно-динамические исследования также показали, что удаление этих избыточных остатков оказало небольшое влияние на результаты (рис. S4). Первоначально мы выполнили динамическое моделирование длительностью 350 нс для получения относительно устойчивого равновесия системы. Затем были проведены постанализы для определения динамических характеристик и понимания того, как лиганд в деталях связывается с белком. RMSD и анализ RMSF по остаткам обнаружил, что колебания в сайте связывания, образованном GMP-связывающим субдоменом, уменьшились, тогда как в других областях были немного увеличены.Аналогичным образом, DLG4 показал почти такие же динамические характеристики. Кроме того, анализ разложения свободной энергии показал, что остатки сайта связывания фосфора играют решающую роль и вносят наиболее благоприятную энергию для связывания. Результаты согласуются с экспериментальными сообщениями о том, что мутации этих остатков в GK полностью нарушают взаимодействие между p-LGL2 и DLG4 GK (Zhu et al., 2014).

Кроме того, молекулярно-динамическое моделирование и пост-динамический анализ комплексов DLG4 с другим фосфорилированным пептидом (p-SAPAP) и нефосфорилированными пептидами (MAP1A и GKI-QSF) также были выполнены для дальнейшего подтверждения важности этих остатков.Мы обнаружили, что высококонсервативные аминокислотные остатки как на участке фосфора, так и на листе β5 обеспечивают наиболее полезный вклад энергии как для фосфорилированного пептида, так и для нефосфорилированного пептида. Результаты также подразумевают, что связывающее взаимодействие различных лигандов среди DLG должно быть одинаковым. Незначительная разница возникла только из-за селективных сайтов за пределами GMP-связывающего субдомена. Таким образом, мы пришли к выводу, что пептидное связывающее вещество, синтезируемое DLG4, GKI-QSF, также может связываться с DLG1. После анализа результатов молекулярной динамики мы предположили, что GKI-QSF может связываться с DLG1 с аналогичной аффинностью связывания, что было дополнительно подтверждено с использованием ITC со значением K d, равным 1.20 ± 0,29 мкМ. Эти результаты теоретического предсказания и экспериментальной проверки показали, что наше исследование может быть полезным для лучшего понимания биологической функции DLG и будет способствовать открытию нового связующего в будущем.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные и проанализированные для этого исследования, включены в статью / дополнительные материалы.

Авторские взносы

Все перечисленные авторы внесли существенный, прямой и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее к публикации.

Финансирование

Мы благодарны за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (2018YFA0507900), Плану обучения молодых лучших талантов Чунцина и Программе создания инновационных коллективов в высших учебных заведениях Чунцина (CXTDX201601048).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2020.00001/full#supplementary-material

Список литературы

Андерсон Д. (2015). Молекулярная эволюция домена гуанилаткиназы (Диссертация / докторская диссертация). Юджин, штат Орегон: Университет Орегона.

Google Scholar

Кейс, Д. А., Бабин, В., Берриман, Дж. Т., Бец, Р. М., Cai, Q., Cerutti, D. S., et al. (2014). ЯНТАРЬ 14 . Сан-Франциско, Калифорния: Калифорнийский университет.

Google Scholar

Case, D. A., Cheatham, T. E. III., Darden, T., Gohlke, H., Luo, R., Merz, K. M., et al. (2005). Программы биомолекулярного моделирования Amber. J. Comput. Chem. 26, 1668–1688. DOI: 10.1002 / jcc.20290