Гк статья 191: ГК РФ Статья 191. Начало срока, определенного периодом времени / КонсультантПлюс

Содержание

Исчисление сроков в гражданском праве

Материал подготовлен
с использованием нормативных
правовых актов по состоянию
на 13 марта 2020 г.

В соответствии со ст. 191 Гражданского кодекса Республики Беларусь (далее – ГК) срок может определяться календарной датой, периодом времени или указанием на событие. Общие правила исчисления сроков определены главой 11 ГК «Исчисление сроков».

Исчисление срока, определенного календарной датой, в целом не вызывает затруднений, хотя и здесь возникают некоторые вопросы.

Если договор предусматривает исполнение обязательства 19 февраля, то соответственно контрагент должен исполнить свои обязательства в течение 24 часов 19 февраля. Однако, если это действие должно быть совершено в организации, то срок истекает в тот час, когда в этой организации по установленным правилам прекращаются соответствующие операции.

Письменные заявления и извещения, сданные на почту, телеграф или в иное учреждение связи до двадцати четырех часов последнего дня срока, считаются сделанными в срок (ст. 195 ГК).

Вызывают некоторые вопросы определение начала и окончания срока, определенного календарными датами.

Так, например, некоторые авторы считают, что доверенность, выданная 5 января, начинает действовать на следующий день. Несмотря на то, что законодатель в отношении доверенности четко указал в п. 6 ст. 186 ГК, что доверенность вступает в силу со дня ее совершения, либо со дня ее удостоверения, когда оно требуется, в литературе и на практике встречаются позиции, что доверенность является действительной на следующий день после ее совершения. Данная позиция основывается на применении положений ст. 192 ГК: течение срока, определенного периодом времени, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало.

По нашему мнению, законодатель и пошел на уточнение положений ст. 186 ГК (Законом Республики Беларусь от 9 июля 2012 г. № 388-З «О внесении дополнений и изменений в Гражданский кодекс Республики Беларусь и признании утратившими силу некоторых законодательных актов Республики Беларусь и их отдельных положений по вопросам аренды, залога, создания и деятельности финансово-промышленных групп» ст. 186 ГК была дополнена п. 6) только в связи с тем, чтобы исключить соответствующие ошибки на практике. Хотя этого и не требовалось, поскольку вытекало из соответствующих положений ГК.

Доверенность – это односторонняя сделка. К односторонним сделкам соответственно применяются общие положения об обязательствах и о договорах, если это не противоречит законодательству, одностороннему характеру и существу сделки (ст. 157 ГК). Если бы определялось начало действия доверенности (односторонней сделки) исходя из ст. 192 ГК (на следующий день), то таким правилам пришлось подчинить бы и все прочие сделки, включая договоры. Сделкам потребовался один день, чтобы «созреть» и вступить в силу. Например, если вы решите пойти в магазин за продуктами, то соответствующий договор вам пришлось бы заключить еще вчера, чтобы он успел вступить в силу, и ряд других примеров можно привести в этой связи.

В соответствии с п. 1 ст. 395 ГК договор вступает в силу и становится обязательным для сторон с момента его заключения. Момент заключения договора определяется по правилам ст. 403 ГК. Из совокупного толкования ст.ст. 157, 395 и 403 ГК следует, что сделка вступает в силу в момент ее совершения. Таким образом то, что доверенность вступает в силу со дня ее совершения, либо со дня ее удостоверения, следует из соответствующих положений ГК и, как уже было сказано ранее, не требовало специального закрепления в п. 6 ст. 186 ГК.

Кроме того, нет однозначности и в понимании момента окончания срока, если срок определяется «до» или «по» конкретную календарную дату. Например, в договоре может быть указано, что оплата должна быть произведена до 19 февраля или срок действия доверенности определяться по 19 февраля. В связи с этим возникают вопросы правомерности совершения действий 19 февраля, и является ли значение предлогов «до» и «по» равнозначными. В соответствии со ст. 401 ГК при толковании условий договора судом принимается во внимание буквальное значение содержащихся в нем слов и выражений. Буквальное значение условия договора в случае неясности устанавливается путем сопоставления с другими условиями и смыслом договора в целом. Однако, мнения лингвистов в вопросе буквального толкования предлогов «до» и «по» расходятся. Одни авторы считают, что при формулировке «до 19 февраля» граница, когда должно быть совершено действие, – это 24 часа 18 февраля. Если же срок определен «по 19 февраля», то граница для совершения действия – это 24 часа 19 февраля. Другие авторы считают, что предлоги «до» и «по» имеют одинаковое значение и действие может быть совершено 19 февраля.

Законодательство и правоприменительная практика не дают четкого ответа на этот вопрос. В силу ст. 195 ГК, если срок установлен для совершения какого-либо действия, то оно может быть выполнено до двадцати четырех часов последнего дня срока. Таким образом, по нашему мнению, если срок определен до или по 19 февраля, то последним днем срока будет 19 февраля. С точки зрения права, по нашему мнению, предлоги «до» и «по» имеют значение включительно. Такой позиции придерживается и высшая судебная инстанция. Например, в письме Высшего Хозяйственного Суда Республики Беларусь от 3 июня 2005 г. № 03-24/1053 «Об установлении срока погашения кредита» сообщается, что если кредитодатель предоставляет кредитополучателю кредит с окончательным сроком погашения до 1 января 2006 г., то последним днем исполнения договора, по мнению суда, является указанная в договоре календарная дата, то есть 1 января 2006 г.

Однако, следует отметить, что в методических материалах по проведению лингвистического контроля проектов правовых актов (правовых актов) содержатся рекомендации лингвистов: учитывать многозначность предлогов «по» и «до» при обозначении пределов во времени, и, если требуется указать, что называемое число или понятие входит в состав предела, во избежание неоднозначного толкования необходимо использовать слово «включительно» или слова «не позднее» [1]. Кроме того, в соответствии с ч. 2 ст. 401 ГК, если буквальное значение содержащихся в нем слов и выражений не позволяет определить содержание договора, должна быть выяснена действительная общая воля сторон с учетом цели договора. При этом принимаются во внимание все соответствующие обстоятельства, включая предшествующие договору переговоры и переписку, практику, установившуюся во взаимных отношениях сторон, последующее поведение сторон.

Кроме того, применительно к срокам определенным календарными датами, считаем отметить следующее, что если договор заключен с 1 января по 31 декабря или с 7 марта 2018 г. по 6 марта 2019 г., то данный договор считается заключенным на год.

Подытожив вышесказанное отметим, что если срок (его начало и окончание) определены календарной датой, например 13 февраля 2018 года, или период времени обозначен такими датами, например, квартира сдается на три месяца с 1 марта по 31 мая, необходимости обращаться к правилам ст. 192 ГК нет. Кроме того, предлоги «до» и «по» имеют одинаковое значение и последним днем срока является указанная дата. Однако мы согласны, что во избежание судебных споров и двоякого толкования лучше использовать слова «включительно» или слова «не позднее».

Исчисление срока, определенного периодом времени. В соответствии со ст. 191 ГК срок может определяться не только конкретными календарными датами, но и периодом времени. Например, договор может быть заключен не с 1 марта по 31 мая, а 1 марта – на три месяца, доверенность может быть выдана 1 января, но не по конкретную дату, а на месяц, год и т.п. В этих случаях срок определен периодом времени. Периодом времени в ГК определены также: срок исковой давности, гарантийные сроки, срок принятия наследства и т.п. В соответствии со ст. 191 ГК срок, определенный периодом времени, может исчисляться в часах, днях, неделях, месяцах, годах.

В отношении исчисления сроков, определенных периодом времени в литературе и на практике существуют также вопросы. Некоторые авторы указывают на неясность и неточность законодательства. Например, «несовпадение дня фактического начала срока с днем его юридического начала (исчисления) несет в себе определенное противоречие и неясность, и вместе с терминологической неточностью в законе и науке в определении (названии) этих двух дней создает дополнительные трудности» [2].

Критикуется в литературе и используемая в ГК формулировка «истекает в соответствующий день». Некоторые авторы предлагают считать «последним днем срока не день, соответствующий по названию или числу первому дню срока, а предыдущий день» [2].

На наш взгляд в законодательстве на этот счет нет никакой проблемы. Порядок исчисления сроков, определенных периодом времени, определен достаточно четко и не должен создавать никаких сложностей для правоприменителя.

Согласно ст. 192 ГК течение срока, определенного периодом времени, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало.

В соответствии со ст. 193 ГК срок, исчисляемый годами, истекает в соответствующие месяц и число последнего года срока. Срок, исчисляемый месяцами, истекает в соответствующее число последнего месяца срока. К сроку, определенному в полгода или исчисляемому кварталами, применяются правила для сроков, исчисляемых месяцами. Если окончание срока, исчисляемого месяцами, приходится на такой месяц, в котором нет соответствующего числа, то срок истекает в последний день этого месяца. Срок, определенный в полмесяца, рассматривается как срок, исчисляемый днями, и считается равным пятнадцати дням. Срок, исчисляемый неделями, истекает в соответствующий день последней недели срока.

Например, если покупателем приобретен непродовольственный товар надлежащего качества в магазине 5 марта, то в течение четырнадцати дней он может этот товар обменять или возвратить продавцу (ст. 472 ГК). Последним днем срока в данном случае будет 19 марта.

Наследство может быть принято в течение шести месяцев со дня открытия наследства (п. 1 ст. 1071 ГК). Днем открытия наследства является день смерти наследодателя (ст. 1035 ГК) и если день смерти – 5 марта, то последний день для принятия наследства – это 5 сентября.

Гарантийный срок на товар, например, составляет 2 года. Гарантийный срок начинает течь со дня передачи товара покупателю (ст. 441 ГК). Соответственно последний день, когда покупатель может предъявить претензии в отношении качества товара, приобретенного 5 марта 2019 г., – это 5 марта 2021 г.

Если последний день срока приходится на нерабочий день, днем окончания срока считается ближайший следующий за ним рабочий день.

На наш взгляд, все вопросы, связанные с исчислением сроков, определенных периодом времени, связаны со ст. 192 ГК, а именно с правилом о следующем дне.

Статья 192 ГК появилась в ГК не столько с целью установления единства исчисления сроков, а сколько с целью, чтобы избежать вычисления точных часов (минут). Конечно, можно приурочить начало течения срока ровно к моменту совершения юридического факта. Однако в реальной жизни время совершения каждого юридического факта разное. Например, одну сделку можно совершить в 6 ч 55 мин, а другую – в 16 ч 08 мин. Зафиксировав точно до минуты время совершения сделки, точно так же до минуты следовало бы фиксировать и время окончания сделки, с тем, чтобы определить (опять же до минут) момент истечения сроков, определенных периодом времени. Но это неудобно. По этим причинам в качестве «стартовой точки» для течения сроков законодатель избрал не сам момент совершения сделки, а другую отметку – это 00 час 00 мин 01 сек следующего дня. В ст. 192 ГК «стартовая точка» срока смещена вперед, несколько позже фактического времени совершения сделки. Такой законодательный прием решил проблему момента отсчета срока. В результате обеспечено единообразное исчисление сроков и в самой сделке нет нужды точно указывать начальную и конечную точки срока – эту функцию взял на себя ГК. Смысл ст. 192 ГК заключается именно в этом, а не в требовании «созревания» сделок. Правила об исчислении сроков нельзя механически переносить на вопрос о начале действия сделки или о том, что соответствующие права возникают со следующего дня. Момент, с которого сделка начинает действовать (т.е. порождает соответствующие юридические последствия), определяется соответствующими нормами о сделках.

Срок исковой давности начинает течь со дня, когда лицо узнало или должно было узнать о том, что его право нарушено, гарантийный срок – со дня передачи товара покупателю, срок для принятия наследства – со дня открытия наследства. Наличие ст. 192 ГК не исключает возможности предъявления искового требования в день, когда лицо узнало и должно было узнать, что его право нарушено, или предъявления требования в связи с недостатками товара в день его приобретения и т.д., но исчисление срока начинается на следующий день.

Таким образом, законодатель избавил стороны от подсчета до часа, минуты, секунды продолжительность периода времени. Применительно к ст. 192 ГК слово «течение» можно заменить словами «исчисление», «уменьшение» и т.д., то есть на следующий день законодатель указывает, что должен начинаться отсчет этого срока. То есть, если в договоре установлено, что покупатель должен оплатить товар в течение 5 дней со дня заключения договора, то это не значит, что покупатель не может его оплатить в день заключения договора. Может, но исчисление этого срока начнется на следующий день. Если бы срок исчислялся со дня, послужившего ему началом, и истекал в пятый день, то срок был бы менее 5 дней, поскольку договор может заключаться и в 9 утра и в 18 часов вечера.

Следует также обратить внимание на то, что законодатель не устанавливает исключение в части применения ст. 192 ГК и для определения возраста гражданина. Так, например, гражданин, родившийся 1 января 2000 г., станет достигшим 18 лет только 2 января 2018 г., потому что последний день его 17-летнего возраста, исходя из правил исчисления сроков, предусмотренных гл. 11 ГК, будет 24 часа 1 января. Как следствие, полную дееспособность гражданин приобретет только 2-го числа. В этой же связи можно привести и такой пример. Согласно ст. 1064 ГК несовершеннолетние дети имеют право на обязательную долю в наследстве. Завещатель (отец) умер 1 января. Как следствие, на момент смерти отца ребенок – несовершеннолетний и имеет право на обязательную долю в наследстве. Если бы отец умер 2 января, то ребенок являлся бы уже совершеннолетним и права на обязательную долю в наследстве не имел.

В заключение хотелось бы привести следующую таблицу, которая определяет порядок исчисления сроков, определенных периодом времени.

Календарная дата

Срок

Начало течения срока

День окончания срока

1 марта 2019 г.

10 дней

2 марта 2019 г.

11 марта 2019 г.

3 месяца

2 марта 2019 г.

3 июня 2019 г.

(с учетом того, что 1 и 2 июня 2019 г. являются нерабочими днями)

1 год

2 марта 2019 г.

2 марта 2020 г.

(с учетом того, что 1 марта 2020 г. является нерабочим днем)

СПИСОК ЦИТИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Лингвистический контроль качества подготовки правовых актов [Электронный ресурс] / Нац. центр правовой информ. Республики Беларусь. – Режим доступа: http://www.pravo.by/pravovaya-informatsiya/normotvorcheskaya-deyatelnost/poleznaya-informatsiya/ling…. – Дата доступа: 02.11.2019.

2. Смирнов, А Спорные вопросы исчисления сроков. – Режим доступа: https://www.lawmix.ru/comm/5816. – Дата доступа: 02.11.2019.

Шимкович М.Н.,
доцент кафедры правового обеспечения экономической деятельности
Академии управления при Президенте Республики Беларусь,
кандидат юридических наук, доцент

С иными материалами правоприменительной практики можно ознакомиться в системах
«ЭТАЛОН» и «ЭТАЛОН-ONLINE»

Материал предоставлен Национальным центром правовой информации Республики Беларусь
При использовании материала ссылка на Национальный центр правовой информации Республики Беларусь обязательна!

Нашли ошибку? Выделите текст с ошибкой и нажмите «Ctrl+Enter».


Статья 191 ГК РФ с комментариями. Начало срока, определенного периодом времени

Организация работы и кадровые вопросы в связи с коронавирусомОбразцы основных документов в связи с коронавирусомНерабочие дни в связи с коронавирусом

Образцы заполнения кадровых документовФормы первичных учетных документовСведения о трудовой деятельности (электронная трудовая книжка)Ведение трудовых книжек в бумажном виде

Специальная оценка условий трудаНесчастный случай на производствеОбязательные медосмотры (профосмотры)Инструктажи по охране труда

Обязательные документы при проверкахКалендарь кадровика

Хранение и использование персональных данныхМеры по защите персональных данных работниковОтветственность за нарушения законодательства о персональных данных

Привлечение иностранцевОформление иностранцев

Оформление приема на работуТрудовой договор

График отпусковЗамена отпуска денежной компенсациейОформление ежегодного оплачиваемого отпускаОтпуск по беременности и родамОтпуск по уходу за ребенкомЛьготный (дополнительный) отпуск

График работыПривлечение, оформление и оплатаУчет рабочего времениВыходные и праздничные дни

Правила внутреннего трудового распорядка (ПВТР)Дисциплинарные взысканияПорядок увольнения за нарушение трудовой дисциплины

Заработная платаРайонные коэффициенты и надбавкиМатериальная ответственность работника

Оплата больничного листа (не пилотный проект)Оплата больничного листа (пилотный проект)Заполнение больничного листа работодателемРабота с электронными больничнымиПособие по беременности и родам

Порядок проведения аттестацииОграничения на увольнение из-за непрохождения аттестацииРасходы на подготовку и переподготовку кадров

Основания для увольненияПроцедура увольнения по сокращению

Перейти в telegram-чат

§1. Исчисление срока, определенного периодом времени . Сроки. Исковая давность

Течение срока, определенного периодом времени, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало.28

Правила определения начала и окончания срока, определенного периодом времени срока, содержат в себе некоторое логическое противоречие. Срок начинает отсчитываться, течь, на следующий день после начала, не захватывая день, от которого срок начинается, но заканчивается (истекает), за исключением периода, исчисляемого днями, так как если бы включал этот день.29

Данный подход определен, прежде всего, тем, что явление действительности, от которого, строго говоря, и надо отсчитывать течение срока, может произойти в любое время суток: договор может быть подписан и в 10 часов и в 15 часов, и в 23 часа. В целях рационализации исчисления периода (невычисления периода от конкретных часов и минут) законодателем было принято правило, изложенное в статье 191 ГК РФ.

Такое обоснование начала исчисления срока было изложено в комментарии к статье 80 Проекта Гражданского уложения России и с тех пор не изменялось, как и не изменялось само правило, изложенное первоначально в статье 80 Проекта Гражданского уложения России,30 а затем в статье 72 Гражданского кодекса РСФСР 1964 года.31

Если следовать буквальному прочтению статьи 190 ГК РФ, то указание только величины периода является единственным и достаточным условием, для того чтобы считать что срок, определяемый истечением периода времени, установлен.

Однако, статью 190 ГК РФ необходимо применять с учетом положений статьи 191 ГК РФ, озаглавленной «Начало, срока определенного периодом времени»: статья 190 ГК РФ устанавливает такой способ определения срока как «период», а статья 191 ГК РФ устанавливает правила как этот способ определения срока («период») должен определяться, с какого момента начинаться.

Статья 191 ГК РФ, говоря о начале срока, определенного периодом времени, указывает на календарный день (событие) «которым определено его начало», т.е. и статья 191 ГК РФ, указывает на необходимость определения начала периода, делая начало срока существенным условием определения срока, исчисляемого периодом.

Учитывая взаимосвязь статьи 190 ГК РФ и статьи 191 ГК РФ, когда срок определен истечением периода времени, необходимо указать не только величину этого периода (столько-то лет, месяцев, кварталов, недель, дней, часов), но и необходимо указывать момент, с которого нужно отсчитывать этот период.

Если момент начала исчисления периода времени не определен, то нельзя говорить о том, что срок определен.

Какое значение имеет условие договора, что работы должны быть выполнены в течение десяти дней? С какого момента отсчитывать эти десять дней: с момента подписания договора, с момента начала работ, с момента передачи подрядчику материалов, с момента выхода из отпуска бригадира подрядчиков?

Определение начало срока, определяемого истечением периода времени, является неотъемлемой частью, сущностью данного способа определения срока. Если момент начала исчисления периода времени не определен, то срок, определяемый периодом времени, не определен.

«исходя из содержания абзаца первого ст. 190 Гражданского кодекса Российской Федерации, а также из принципа правовой определенности, для определения срока истечением периода времени необходимо точно указать календарную дату, от которой должен исчисляться период времени, с истечением которого закон или договор связывают наступление срока.

Исходя из принципа правовой определенности, для определения срока истечением периода времени начало течения этого периода времени может быть установлено указанием на событие, которое неизбежно должно наступить, а в порядке исключения – на событие, которое наступило (например, заключение договора)»32

ВАС РФ смягчил позицию федерального окружного суда и расширил круг обстоятельств,33 указание на которые делает срок согласованным: «Требования гражданского законодательства об определении периода выполнения работ по договору подряда как существенного условия этого договора установлены с целью недопущения неопределенности в правоотношениях сторон. Если начальный момент периода определен указанием на действие стороны или иных лиц, в том числе на момент уплаты аванса, и такие действия совершены в разумный срок, неопределенность в определении срока производства работ устраняется. Следовательно, в этом случае условие о периоде выполнения работ должно считаться согласованным, а договор – заключенным».34

Но в любом случае суды пришли к выводу, что определение начало срока, определяемого истечением периода времени, является неотъемлемой частью, сущностью данного способа определения срока и при таком способе определения срока необходимо указывать обстоятельство, служащее началом исчисления периода.

Срок, исчисляемый истечением периода времени, характеризуется обязательным указанием на наименование единицы времени и количество единиц времени, в которых исчисляется период. Например, срок – «один год»: наименование единицы времени – год; количество единиц времени-1.

Статья 191 ГК РФ применяется только в том случае когда, срок определен именно периодом времени, т.е. указанием на наименование единицы времени и количество единиц времени, в которых исчисляется период.

Статья 191 ГК РФ не применяется, если срок определен указанием на конкретную дату или событие, которое неизбежно должно наступить, даже если конкретные даты и событие, которое неизбежно должно наступить, ограничивают некоторый период времени, например, обязательство должно быть исполнено с 01.01.2000г. по 01.03.2000г. Да, и в этом существует указание на ограниченный период времени, но нельзя признать что срок определен периодом времени в том смысле, какой предает данному способу исчисления срока статья 190 ГК РФ, так как при данном способе ограничения периода времени нет указания на наименование единицы времени и на количество единиц времени, в которых исчисляется период.

Если срок исполнения обязательства определен конкретной датой, например, как «30.01.2000г.», то обязательство должно быть исполнено 30.01.2000г., а не 31.01.2000г.

Согласно статье 193 ГК РФ, если последний день срока приходится на нерабочий день, днем окончания срока считается ближайший следующий за ним рабочий день.

Так как статья 193 ГК РФ говорит о последнем дне срока, то данная статья не применяется для определения начала течения срока.

Статья 191 ГК РФ, устанавливая правила исчисления начало срока, определенного периодом времени, не предписывает исчислять период времени начиная с первого рабочего дня.

В силу статьи 191 ГК РФ течение срока, определенного периодом времени, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало, независимо от того является ли рабочим или нерабочим днем календарная дата, или день, на который пришлось событие.35

Данный текст является ознакомительным фрагментом.

Продолжение на ЛитРес

Статья 191. Начало срока, определенного периодом времени

Статья 191. Начало срока, определенного периодом времени

Комментарий к статье 191

(а) Начало расчета срока в виде периода времени. Когда в силу закона, иного правового акта, условий сделки или обычаев действует тот или иной срок в виде периода времени, подлежит установлению то обстоятельство, с которым связано начало течения такого периода. Этим обстоятельством может быть либо календарная дата, либо некое иное обстоятельство (далее — обстоятельство-триггер).
(б) Календарная дата. Иногда встречаются случаи, когда срок в виде периода времени, исчисляемого в днях, неделях, месяцах или годах, отсчитывается согласно условиям договора, закону или иному правовому акту с четко зафиксированной календарной даты.
Например, такой вариант имеет место в ситуации, когда в лицензионном договоре, заключенном в декабре 2012 г., указано, что права и обязанности по нему вступают в силу 1 января 2013 г. и действуют в течение года.
Другой пример: в законе, вступающем в силу согласно положениям самого закона с 1 июня, может быть указано на срок в виде трех лет с момента указанной даты, в течение которых организации обязаны переоформить свои учредительные документы с учетом положений нового закона.
(в) Событие, которое определяет начало расчета срока. Второй указанный в комментируемой норме вариант обстоятельства, запускающего начало расчета срока в виде периода времени, — это событие. Это, в частности, может быть возникновение природного явления (например, освобождение реки ото льда, в связи с которым начинает течь срок в виде периода времени на сплавление древесины), наступление обстоятельств непреодолимой силы (например, когда в договоре установлен срок в виде периода времени на извещение контрагента о наступлении таких обстоятельств), изменение законодательства или принятие государственными органами тех или иных решений (например, когда согласно договору право на отказ может быть осуществлено в течение определенного периода времени с момента введения эмбарго или когда согласно договору срок передачи объекта недвижимости и регистрации перехода права собственности привязан к моменту регистрации права собственности на объект недвижимости, являющийся объектом отчуждения) и т.п.
Но для целей применения данной статьи под событием следует понимать и совершение тех или иных действий (или бездействие) стороной сделки или иного лица. Так, например, обстоятельством, запускающим начало течения срока в виде периода времени, может быть заключение договора, содержащего тот самый срок (например, когда в договоре установлен срок на внесение предоплаты в виде некоего периода с момента заключения договора), совершение односторонней сделки с указанием на срок (например, когда в доверенности срок ее действия указан в виде периода времени с момента ее выдачи или когда в независимой гарантии срок ее действия определен в виде периода времени с момента выдачи гарантии), исполнение некоего обязательства одной из сторон (например, когда в договоре срок исполнения обязательства одной из сторон в виде периода времени должен рассчитываться с момента исполнения обязательства другой стороной), нарушение договора (например, когда срок действия поручительства привязан к моменту просрочки), момент, когда лицо узнало или должно было узнать о нарушении своего права (в частности, при расчете срока исковой давности) и т.п.
(г) «На следующий день» применительно к привязке начала течения срока к событию или действию. Применительно к случаю, когда срок начинает течь в связи с наступлением некоего обстоятельства-триггера, правило о том, что первым днем срока будет следующий день после того дня, когда произошло соответствующее обстоятельство-триггер, кажется вполне логичным. Данный подход в полной мере соответствует тому, что указано в п. 4 ст. I.-1:110 Модельных правил европейского частного права.
Решение законодателя связано с тем, что соответствующее обстоятельство-триггер может произойти в любое время суток, включая вечер. Точное время наступления обстоятельства-триггера в течение определенного дня зачастую установить крайне сложно. Поэтому обеспечить буквальное соблюдение, например, 10-дневного срока (т.е. 240 часов) с его расчетом от соответствующих часа и минуты 1 июня (когда произошло обстоятельство-триггер фактически) до соответствующих часа и минуты 11 июня крайне сложно. Правоприменение требует упрощения и округления до суток. Право должно было решить, включать ли день наступления обстоятельства-триггера в расчет срока или нет. Поэтому в ситуации, когда срок равен 10 дням, а началом расчета срока является возникновение некоего обстоятельства, которое может произойти в любое время суток, при выборе между вариантом сокращения реального срока в 10 полных дней на то или иное количество часов (если бы день наступления обстоятельства-триггера включался в период времени) и вариантом удлинения такого срока на то или иное количество часов (в ситуации невключения дня обстоятельства-триггера в расчет периода времени) позитивное право выбирает последний вариант. Этот вариант решения проблемы следует признать вполне приемлемым.
Из указанного выше, в частности, следует, что, когда совершается сделка и имеется привязанный к моменту совершения данной сделки срок, этот срок должен отсчитываться со следующего дня в строгом соответствии с нормой комментируемой статьи. Например, срок доверенности, установленный в виде трех месяцев с момента выдачи доверенности, должен начать отсчитываться со следующего дня после даты ее фактической выдачи <1>, а срок внесения предоплаты в виде 30 дней с момента заключения договора должен начинать отсчитываться со следующего дня после дня заключения договора.
———————————
<1> Это, впрочем, не означает, что доверенность не действует в первый день ее выдачи (см. п. «з» комментария к настоящей статье).

(д) «На следующий день» применительно к привязке начала течения срока к календарной дате. Согласно комментируемой норме, если начало течения срока в виде периода времени привязано к наступлению календарной даты, соответствующий календарный день в расчет периода времени не включается. Как установлено в комментируемой норме, первым днем расчета периода времени будет следующий день.
Применительно к ситуации, когда в некой ранее заключенной сделке, принятом законе, правовом акте или судебном решении указывается на календарную дату в будущем и на срок в виде периода времени, который отсчитывается от указанной календарной даты, данное регулирование кажется не вполне оправданным. В такой ситуации исключать из расчета срока ту самую заранее определенную календарную дату, запускающую расчет срока, и, соответственно, откладывать на день начало расчета срока просто нелогично. Если начало периода времени привязано к календарной дате в будущем, первым днем срока данная дата и должна считаться. Это более логично, чем то, что закреплено сейчас в комментируемой норме. Именно такое более логичное решение закреплено в п. 2 ст. I.-1:110 Модельных правил европейского частного права.
(е) Специфика применения к срокам, исчисляемым в секундах, минутах и часах. Толкование комментируемой нормы исключает возможность ее буквального применения к срокам, исчисляемым в секундах, минутах и часах. В такого рода случаях округление до дней согласно процедуре, предусмотренной в комментируемой статье, не производится.
В то же время положения комментируемой нормы применимы к подобным ситуациям по аналогии закона с необходимыми адаптациями. Если, например, в договоре срок установлен как 240 часов с момента наступления того или иного обстоятельства, суду следует определить точный час, когда соответствующее обстоятельство наступило фактически, и отсчитывать срок длиной в 240 часов от часа, следующего за часом наступления такого обстоятельства. Аналогичное решение закреплено и в п. 4 ст. I.-1:110 Модельных правил европейского частного права.
Если точное время наступления обстоятельства-триггера в течение соответствующего дня установить не удается, отсчет срока в 240 часов должен осуществляться с 00 часов 00 минут дня, следующего за днем, в течение которого наступило обстоятельство-триггер.
(ж) Определение начала расчета срока в ситуации, когда обстоятельством-триггером является истечение другого срока. Нередко возникает ситуация, когда некий срок начинает течь с момента истечения другого срока. В такой ситуации первым днем второго срока будет день, следующий за последним днем первоначального срока. Например, согласно условиям «обоюдного» опциона начало расчета срока на акцепт одной из сторон включенной в опцион оферты длительностью в 10 дней привязано к моменту оформления опциона, но предусмотрено, что в случае непоступления акцепта от этой стороны в течение данного срока у другой стороны возникает право на акцепт зеркальной оферты в течение 5 дней. Если опцион был оформлен 1 июня, период первого 10-дневного срока начинает согласно комментируемой норме исчисляться 2 июня и истекает в конце дня 11 июня. Соответственно, 5-дневный срок на акцепт оферты второй стороной начинает исчисляться 12 июня и истекает в конце дня 16 июня.
(з) Положение сторон сделки в день ее совершения с учетом правила о «следующем дне». Если некий срок в виде периода времени отсчитывается с момента совершения сделки и согласно правилам комментируемой статьи первым днем срока будет следующий день, встает важный вопрос о том, существует ли сама сделка и порождает ли она правовые последствия в тот день, когда она совершена.
Представим такой пример: человек приходит на общее собрание акционеров с доверенностью, выданной в день проведения самого собрания. Имеет ли данный человек полномочия принимать участие в собрании или голосовать? Либо его полномочия возникнут только на следующий день после дня выдачи?
Ответ должен быть таким. Правило комментируемой статьи определяет дату начала течения срока в виде периода времени для целей определения момента его окончания. Именно в фиксации последнего дня срока и состоит цель определения первого дня срока, определяемого периодом времени. Цель комментируемой нормы отнюдь не состоит в том, чтобы отсрочить возникновение правового эффекта сделки до 00:01 дня, следующего за днем совершения сделки. Поэтому полномочия представителя должны считаться возникшими немедленно с момента выдачи доверенности (если более поздняя дата не указана в тексте доверенности). Округление, предусмотренное в комментируемой статье, необходимо лишь для фиксации момента истечения срока.
(и) Особенность применения данной статьи к расчету срока исковой давности. Согласно п. 1 ст. 200 ГК РФ «течение срока исковой давности начинается со дня, когда лицо узнало или должно было узнать о нарушении своего права и о том, кто является надлежащим ответчиком по иску о защите этого права». Кроме того, при определении на основании ст. 181 ГК РФ сроков исковой давности на признание сделки ничтожной и на предъявление исков о реституции по ничтожной сделке законодатель указывает, что давность считается со дня, когда «началось исполнение сделки», а в отношении оспаривания сделки со дня прекращения насилия или угрозы или со дня, когда лицо узнало или должно было узнать об иных основаниях недействительности.
Иногда утверждается, что расчет срока давности должен осуществляться без учета комментируемой нормы ст. 191 ГК РФ, и тот день, когда лицо узнало или должно было узнать о нарушении своего права и надлежащем ответчике, а также тот день, с которого начинается отсчет срока давности по правилам ст. 181 ГК РФ, должен являться первым днем течения срока давности. В качестве обоснования такой позиции называются нормы п. 1 ст. 200 ГК РФ и ст. 181 ГК РФ, согласно которым течение срока исковой давности начинается со дня наступления обстоятельства, указанного в данных статьях и запускающего начало течения срока. Соответственно, положения п. 1 ст. 200 ГК РФ и ст. 181 ГК РФ такими юристами рассматриваются как специальные нормы по отношению к комментируемой статье.
С таким подходом сложно согласиться. Никакой логики в ином принципе округления сроков в случае со сроками исковой давности, чем это предусмотрено для всех остальных сроков в гражданском праве, не наблюдается. Соответственно, как представляется, норма п. 1 ст. 200 ГК РФ и положения ст. 181 ГК РФ лишь указывают на то обстоятельство, наступление которого и запускает срок давности, но не имеют в виду закрепить исключение из общего правила ст. 191 ГК РФ.
На то, что первым днем срока расчета давности должен являться не день наступления обстоятельства, с которым закон связывает начало его течения, а следующий день, сейчас указано прямо в п. 8 Постановления Пленума ВС РФ от 29 сентября 2015 г. N 43 <1>. Соответственно, если кредитор узнал или должен был узнать об указанных обстоятельствах (например, выявил или должен был выявить дефекты уже в день приемки товара), то день приемки в расчет срока исковой давности не включается, и первым днем срока давности на предъявление в суд требований, связанных с дефектами, будет следующий день.
———————————
<1> Этот вывод в полной мере применим и ко многим другим нормам закона, в которых указывается на то, что некий срок начинает течь со дня, когда происходит то или иное обстоятельство. Во всех подобных случаях, если иное явным образом не следует из текста закона, воля законодателя состоит отнюдь не в изменении правил ст. 191 ГК РФ про «следующий день», а в установлении того обстоятельства-триггера, который запускает срок в виде периода времени.

В ситуации просрочки в исполнении обязательства возникает крайне интересный вопрос, когда следует считать кредитора узнавшим о просрочке. Если исковая давность рассчитывается в связи с просрочкой в исполнении обязательства, следует презюмировать, что кредитор должен был узнать о просрочке в 23:59 последнего дня срока на исполнение, а не в 00:01 дня, следующего за последним днем срока на исполнение. Это крайне важное уточнение, так как если бы право исходило из обратного и днем, когда кредитор узнал или должен был узнать о просрочке, считался бы день, следующий за последним днем срока на исполнение, то срок исковой давности в строгом соответствии с нормой комментируемой статьи должен был начинать исчисляться еще на один день позже. Иначе говоря, если последний день срока на платеж — это 31 мая, формально просрочка должна считаться наступившей, а кредитор — узнавшим о ней в последнюю секунду 31 мая, а это открывает возможность считать первым днем срока исковой давности 1 июня без отступления от буквы комментируемой нормы. Если бы мы констатировали просрочку лишь на 1 июня и считали бы именно это число днем, когда кредитор узнал или должен был узнать о нарушении своего права, последовательное применение комментируемой нормы приводило бы к тому, что давность считалась бы начавшей исчисляться лишь с 2 июня. Последнее кажется нелогичным и противоречит устоявшейся судебной практике.
(к) Диспозитивность. Правило комментируемой нормы в тех случаях, когда оно применяется к срокам, которые установлены в договоре или в нормах закона (как минимум диспозитивных), регулирующих договорные отношения, носит диспозитивный характер. Стороны своим соглашением всегда могут установить иное регулирование вопроса о моменте начала течения такого рода сроков. При этом данная свобода, видимо, не распространяется на те сроки, которые установлены в императивных нормах закона (например, сроки исковой давности).

Ст. 191. ГК РФ Незаконный оборот драгоценных металлов, природных драгоценных камней или жемчуга

Бесплатные консультации

Статья 191 «Незаконный оборот драгоценных металлов, природных драгоценных камней или жемчуга» предусматривает уголовную ответственность за нарушение правил сдачи государству драгоценных металлов и драгоценных камней. В данном случае обьект преступления – это порядок сдачи драгоценных металлов и камней, который установлен на территории РФ. Статья 191 УК РФ делится по своей сути на две стороны – обьективную и субьективную. Первая по статье 191 УК РФ заключается в нарушении правил сдачи государству драгоценных металлов и камней. Нарушение правил сдачи драгоценных камней и драгоценных металлов карается либо штрафом, исправительными работами, люио лишением свободы сроком до шести месяцев. Если же говорить о субьективной стороне вопроса – это прямой умысел. Субьект преступления по статье 191 УК РФ является вменяемым лицом, которое достигло шестнадцати лет на момент совершения преступления.

Статья 191 «Незаконный оборот драгоценных металлов, природных камней или жемчуга » имеет несколько слабых сторон, которые могут осложнить рассмотрение дела. Во-первых данная статья несет в себе по большому счету два состава преступления – это как совершение незаконной сделки, так и незаконная перевозка, пересылка или хранение драгоценных металлов или камней. Есть определенная проблема, с которой сталкиваются юристы и которая часто приводит к неоднозначному решению суда. Это неопределенный факт того, что считать окончанием вышеупомянутой сделки. От этого момента часто зависит определение состава преступление и количества участников, что существенно влияет на вынесенное в последствии решение. Во-вторых часто не фигурирует понятие стоимости драгоценных металлов, камней или жемчуга, что влечет за собой проблему определения размера преступления и также может повлечь некорректность приговора.

Так как статья 191 УК РФ вызывает много споров и разногласий, мы предлагаем в случае неуверенности в правильности действий обвинения, суда или прочих проблем обратится к нашим юристам, которые имеют опыт в работе с данной статьей. Мы знаем какие шаги необходимо предпринять, чтобы отстоять права нашего клиента в суде и добиться наиболее обьективного решения проблемы.

Задайте свой вопрос прямо сейчас и получите юридическую консультацию бесплатно!

На ваши вопросы отвечают компетентные юристы, специализирующиеся на различных областях права. Для того чтобы направить свой вопрос профильному специалисту, пожалуйста, заполните поля с контактными данными — укажите свое имя, актуальный телефон с кодом города, кратко опишите проблему, отправьте заявку и получите помощь юриста по телефону через 15 минут!

Задайте свой вопрос и получите юридическую консультацию бесплатно!

Конфиденциальность информации гарантируется

Опишите свою ситуацию и получите квалифицированную юридическую помощь прямо сейчас!

Дополнительные материалы по теме: Ст. 191. ГК РФ Незаконный оборот драгоценных металлов, природных драгоценных камней или жемчуга

Исчисление сроков | Конкуренция и рынок

 

Статья 190. Определение срока
срок определяется календарной датой или истечением периода времени. Период времени  исчисляется годами, месяцами, неделями, днями или часами.

Срок может определяться также указанием на событие, которое должно неизбежно наступить.

Статья 191. Начало срока, определенного периодом времени
Течение срока, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало.


Статья 192. Окончание срока, определенного периодом времени
1. Срок, исчисляемый годами, истекает в соответствующие месяц и число последнего года срока.
К срокам, определенным в полгода и кварталами, применяются правила для сроков, исчисляемых месяцами.
3. Срок, исчисляемый месяцами, истекает в соответствующее число последнего месяца срока.
Если окончание срока, исчисляемого месяцами, приходится на такой месяц, в котором нет соответствующего числа, то срок истекает в последний день этого месяца.
4. Срок, исчисляемый неделями, истекает в соответствующий день последней недели срока.

Статья 193. Окончание срока в нерабочий день
Если последний день срока приходится на нерабочий день, днем окончания срока считается ближайший следующий за ним рабочий день.

Статья 194. Порядок совершения действий в последний день срока
1. Если срок установлен для совершения какого-либо действия, оно может быть выполнено до двадцати четырех часов последнего дня срока.
Однако если это действие должно быть совершено в организации, то срок истекает в тот час, когда в этой организации по установленным правилам прекращаются соответствующие операции.
2. Письменные заявления и извещения, сданные в организацию связи до двадцати четырех часов последнего дня срока, считаются сделанными в срок.


«Обзор судебной практики Верховного Суда Российской Федерации N 2 (2020)»
В соответствии с п. 1 ст. 314 ГК РФ, если обязательство предусматривает или позволяет определить день его исполнения либо период, в течение которого оно должно быть исполнено (в том числе в случае, если этот период исчисляется с момента исполнения обязанностей другой стороной или наступления иных обстоятельств, предусмотренных законом или договором), обязательство подлежит исполнению в этот день или, соответственно, в любой момент в пределах такого периода.
Согласно п. 1 ст. 314 ГК РФ исчисление срока исполнения обязательства допускается в том числе с момента исполнения обязанностей другой стороной или наступления иных обстоятельств, предусмотренных законом или договором. Подобным же образом в силу ст. 327.1 ГК РФ исполнение обязанностей, а равно и осуществление, изменение и прекращение определенных прав по договорному обязательству может быть обусловлено совершением или несовершением одной из сторон обязательства определенных действий либо наступлением иных обстоятельств, предусмотренных договором, в том числе полностью зависящих от воли одной из сторон

Верховный суд объяснил, как исчисляются сроки президентов палат | Российское агентство правовой и судебной информации

МОСКВА, 30 дек — РАПСИ. Верховный суд РФ объяснил, как исчисляются сроки президента нотариальной палаты: изменения в закон не имеют обратной силы, поэтому запрет на занятие поста два срока подряд не распространяется на прошедшее время.

Высшая инстанция рассмотрела жалобу на избрание президентом Московской областной нотариальной палаты Станислава Смирнова: заявитель счёл, что победитель не имел права выдвигаться, так как ранее уже дважды занимал пост президента палаты, а 1 февраля 2014 года вступили в силу поправки, разрешающие исполнять должность президента нотариальной палаты одним и тем же лицом не более двух сроков подряд. Аналогичное требование было внесено в новую редакцию Устава Московской областной нотариальной палаты.

Таким образом, считает истец, избрание Смирнова президентом Московской областной нотариальной палаты на третий срок подряд является неправомерным. Однако Замоскворецкий суд Москвы его позицию не поддержал и иск отклонил. Суд первой инстанции исходил из того, что поправкам к закону не придана обратная сила, поэтому сроки пребывания Смирнова в должности президента палаты, предшествовавшие внесению изменений, не должны учитываться. По мнению суда, после вступления в силу законодательных новелл о нотариате (с 1 февраля 2014 года) срок осуществления Смирновым полномочий президента (с февраля 2014 года по февраль 2019 года) являлся для него первым, а последующее избрание — вторым. В связи с чем суд не обнаружил нарушений действующего законодательства. 

Но апелляционная инстанция это решение отменила и признала недействительным решения общего собрания членов палаты об избрании президентом Смирнова. Она сочла, что несмотря на вступление в силу новой редакции закона, предыдущий опыт президента все же учитывается. Второй кассационный суд общей юрисдикции это решение поддержал.

Однако ВС счёл, что эти выводы ошибочными.

Позиция ВС

Течение срока, определённого периодом времени, начинается на следующий день после календарной даты или наступления события, которыми определено его начало (статья 191 Гражданского кодекса). Общим принципом действия гражданского законодательства во времени определено, что акты гражданского законодательства не имеют обратной силы и применяются к отношениям, возникшим после введения их в действие (статья 4 ГК РФ).

Как неоднократно отмечал Конституционный суд (КС) РФ, принцип закона во времени имеет целью обеспечение правовой определённости и стабильности законодательного регулирования и означает, что действие закона распространяется на отношения, права и обязанности, возникшие после введения его в действие, и только законодатель вправе распространить новые нормы на факты и порождённые ими правовые последствия, возникшие до введения соответствующих норм в действие, то есть придать закону обратную силу (постановление от 22 апреля 2014 года №12-П; определения от 18 января 2005 года №7-0, от 21 ноября 2013 года №1840-О, от 2 июля 2015 года №1539-0, от 16 июля 2015 года №1779-0, от 9 февраля 2017 года №219-0 и др.).

«Основным принципом существования закона во времени является немедленное действие; придание обратной силы закону — исключительный тип его действия во времени, использование которого относится к прерогативе законодателя; при этом либо в тексте закона содержится специальное указание о таком действии, либо в правовом акте о порядке вступления закона в силу имеется подобная норма; законодатель, реализуя своё исключительное право на придание закону обратной силы, учитывает специфику регулируемых правом общественных отношений», — приводит ВС позицию коллег из КС. 

Согласно материалам дела, Смирнова избрали на должность президента палаты в октябре 2008 года, а в феврале 2013 года было принято решение о продлении срока его полномочий на 4 месяца. Позднее в закон о нотариате внесли изменения, которые ввели ограничение на занятие одним и тем же лицом должности президента нотариальной палаты не более двух сроков подряд. Через четыре дня после вступления в силу этих поправок Смирнова вновь избрали президентом. 

Таким образом, до 1 февраля 2014 года ограничение числа сроков занятия должности президента нотариальной палаты предусмотрено не было, а когда ее ввели, то закону не придали обратную силу, напоминает высшая инстанция. 

«Соответственно, если избрание общим собранием членов нотариальной палаты президента нотариальной палаты на установленный уставом нотариальной палаты срок имело место до 1 февраля 2014 года, то этот срок не подлежит зачёту при исчислении количества сроков занятия лицом должности президента нотариальной палаты», — поясняет ВС. 

В связи с чем Судебная коллегия по гражданским делам ВС РФ определила отменить решения апелляционной и кассационной инстанций и оставить в силе решение Замоскворецкого суда Москвы.

Что такое закон о борьбе с дезертирством? Подробно обсудите особенности закона и другие исключения из него.

Десятое приложение к Конституции Индии широко известно как Закон о борьбе с дезертирством. Он был включен в Конституцию в 1985 году правительством Раджива Ганди. Закон устанавливает положения о дисквалификации избранных членов на основании перехода в другую политическую партию.
Характеристики:

  • Статьи 102 (2) и 191 (2) посвящены борьбе с побегом
  • Основания для дисквалификации следующие:

Члены, принадлежащие к политическим партиям

  • Если член добровольно отказался от членства в политической партии
  • Если он голосует или воздерживается от голосования в таком доме вопреки любому распоряжению политической партии, к которой он принадлежит, без получения предварительного разрешения такой политической партии

� Член, избранный не как кандидат, учрежденный какой-либо политической партией

  • Избранный член Палаты, который был избран в качестве такового иначе, чем как кандидат, созданный любой политической партией. партия должна быть дисквалифицирована как член Палаты, если он присоединится к какой-либо политической партии после таких выборов

Назначенные члены

900 07
  • Назначенный член Палаты должен быть дисквалифицирован как член Палаты, если он присоединится к любой политической партии по истечении шести месяцев с даты его вступления в должность
  • Случаи раскола

    • Ни один член не будет дисквалифицирован из числа членов Палаты, если он и другие члены его законодательной партии составляют группу, представляющую фракцию, возникшую в результате раскола в его первоначальной политической партии
    • С тех пор это положение было исключено из десятого приложения Конституцией.Следовательно, в настоящее время недопустимо заявлять о расколе в законодательной партии.

    Случаи слияния

    • Ни один член не будет дисквалифицирован из состава палаты, где его первоначальная политическая партия сливается с другой политической партией.

    Вопрос о том, стал ли член Палаты Парламента или Законодательного собрания штата подлежать дисквалификации, будет решаться Председателем / Спикером Палаты, и его решение будет окончательным.

    Электронная книга: 042 — Основные особенности Закона о представительстве народов

    Последние электронные книги

    Закон о 52-й поправке к Конституции, 1985 г.

    Опубликован: 12 сентября 2016 г.

    Конституция 52 и Закон о поправках , В 1985 году были предусмотрены положения, касающиеся борьбы с дезертирством в Индии. Этой поправкой были изменены статьи 101, 102, 190 и 191. В нем изложена процедура, в соответствии с которой законодатели могут быть дисквалифицированы по причине их отступничества, и добавлено приложение 10.

    Ключевые положения

    Он устанавливает процедуру, в соответствии с которой законодатели могут быть дисквалифицированы по причине их дезертирства. Согласно этому процессу, член парламента или законодательного собрания штата может быть дисквалифицирован по следующим основаниям:

    Члены политической партии
    • Когда добровольно вышел из своей партии или не подчинился директивам партийного руководства при голосовании.
    • Когда не голосует / воздерживается по партийному кнуту. Однако, если член получил предварительное разрешение или если партия попустительствует ему в течение 15 дней с момента голосования или воздержания, член не может быть дисквалифицирован.
    Независимые члены

    Если член был избран «Независимым», он / она будет дисквалифицирован, если вступит в политическую партию.

    Назначенные члены

    Назначенные члены, не являющиеся членами партии, могли принять решение присоединиться к партии в течение шести месяцев; после этого периода они рассматривались как член партии или независимый член.

    Исключения
    • Если человек избран спикером или председателем, он может выйти из своей партии и снова присоединиться к партии, если он отказался от этой должности.Никакой дисквалификации в этом случае.
    • Партия может быть объединена с другой, если не менее одной трети законодателей ее партии проголосовали за слияние . Первоначально закон разрешал разделение партий, но теперь это уменьшилось на две трети.
    10
    расписание
    • Поправка добавила десятое приложение к Конституции, которое содержит положения о дисквалификации на основании дезертирства.
    • Коллегия судов : ни один суд не имеет юрисдикции в отношении любого вопроса, связанного с дисквалификацией члена Палаты согласно десятому Приложению.

    В статью 102 Конституции были внесены поправки, предусматривающие, что лицо должно быть дисквалифицировано в качестве члена любой из палат парламента, если оно дисквалифицировано в соответствии с десятым приложением. Аналогичным образом в статью 191 была внесена поправка, предусматривающая, что лицо должно быть дисквалифицировано как член Законодательного собрания или Законодательного совета штата, если оно дисквалифицировано согласно Десятому Приложению.

    Последствия

    Когда этот закон был принят, он был встречен резкими возражениями по логике, что он посягает на право законодателей на свободу слова.PIL был подан в Верховный суд по делу Kihoto Hollohon vs Zachillhu and Others (1992) . Этот PIL поставил под сомнение конституционную силу закона. Но СК подтвердил конституционную силу 10-го графика. Суд также постановил, что закон не нарушает никаких прав на свободу слова или основных структур парламентской демократии.

    Тем не менее, Верховный суд также сделал некоторые замечания по разделу 2 (1) (b) Десятого приложения. Раздел 2 (1) (b) гласит, что член должен быть дисквалифицирован, если он голосует или воздерживается от голосования вопреки любому указанию, изданному политической партией.В решении подчеркивается необходимость ограничить дисквалификацию голосами , имеющими решающее значение для существования правительства , и вопросами , являющимися неотъемлемой частью избирательной программы партии , чтобы не «необоснованно посягать» на свободу слова. членов. Это привело к принятию 91-й поправки к Закону 2003 года. {Закон о борьбе с дезертирством подробно обсуждался здесь}

    Последние электронные книги

    Как различие между общими знаниями и конкретными знаниями может улучшить основу и практику оценки рисков и рисков -информированное принятие решений

    https: // doi.org / 10.1016 / j.ress.2019.106553Получить права и контент

    Основные моменты

    В документе обсуждаются управление рисками и знания.

    Различают общие знания и специальные знания.

    Представлена ​​модель, которая проясняет связи между этими двумя типами знаний.

    Модель предоставляет руководство по выбору соответствующих стратегий управления.

    Это относится к различным этапам проекта, а также к использованию и контролю допущений.

    Реферат

    Растет понимание и признание важности отражения знаний и отсутствия знаний в отношении понимания, оценки и управления рисками. Была начата значительная исследовательская работа, чтобы лучше увязать риск и знания. Настоящая статья призвана внести свой вклад в эту работу, проводя различие между различными типами знаний: общими и конкретными.Например, применительно к морской установке, первая фиксирует информацию о том, что может произойти и почему на морских установках в целом, тогда как последняя охватывает более подробные знания, относящиеся к конкретной интересующей установке и ее эксплуатации. Управление рисками рассматривается как процесс обеспечения достаточного и эффективного использования общих знаний, включая определение необходимых конкретных знаний, а также обеспечение наличия у нас достаточных конкретных знаний и контроля при оценке риска и принятии решений.В статье мы представляем структуру управления рисками, основанную на этих идеях и различии знаний. Эта структура разъясняет взаимодействие между двумя базами знаний и то, как эти базы могут быть использованы для улучшения основы и практики оценки и управления рисками.

    Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

    © 2019 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd.

    Рекомендуемые статьи

    Цитирование статей

    О природе рентгеновского источника в ГК Персей

    S.Vrielmann 1 , J.-U. Несс 2 и Дж. Х. М. М. Шмитт 1

    1 Hamburger Sternwarte, Universität Hamburg, Gojenbergsweg 112, 21029 Hamburg, Germany Электронная почта: [svrielmann; jschmitt] @ hs.uni-hamburg.de
    2 Департамент физики, Центр теоретической физики Рудольфа Пайерлса, Оксфордский университет, 1 Keble Road, Oxford OX1 3NP, Великобритания e-mail: [email protected]

    Мы сообщаем XMM-Newton наблюдений промежуточный полярный (ИП) ГК Пер на подъеме до вспышки 2002 г. и сравните их с наблюдениями Chandra в состоянии покоя.Асимметричная кривая блеска спина предполагает асимметричную форму полупрозрачная аккреционная завеса, и мы предлагаем модель ее форма. Низкое Fe xvii (15,01 / 15,26 Å) коэффициент потока линий подтверждает необходимость асимметричной геометрии и существенные эффекты резонансного линейного рассеяния. Среднее разрешение PN спектры во вспышке и ACIS-S спектры в состоянии покоя могут быть оснащены излучающим поглотителем модель жесткого рентгеновского излучения после шока, черное тело (вспышка) термализованного рентгеновского излучения белого карлика и оптически тонкий спектр.Разница в дырявом поглотитель излучения между высоким и низким спином, а также состояния квазипериодических колебаний (QPO) или вспышек могут быть полностью объясняется изменением плотности поглощающего столба. Для объяснение разницы между вспышкой и покоем a сочетание изменения плотности столба и электронного и плотности ионов. Флуоресценция Fe при 6.4 кэВ с эквивалентной шириной 447 эВ и возможной комптоновской вклад рассеяния в красном крыле линии не значительно варьируется во время цикла отжима или в периоды QPO, т.е.е. а значительная часть линии берет начало в широкой аккреции шторы. Спектры РГО высокого разрешения показывают ряд эмиссионных линий от H-подобные и He-подобные элементы. Линии шире, чем инструментальный отклик с примерно постоянной дисперсией скоростей для разных строк, указывая на одинаковое происхождение. He-подобная эмиссия линии используются, чтобы дать значения для электронной плотности . Мы не обнаруживаем никаких изменений в эмиссии. линии во время цикла отжима, подразумевая, что линии не заметно затемнены или поглощены.Мы заключаем, что они происходят из завесы нарастания, и это нарастание может происходить от всех азимуты.

    Ключевые слова: звезды: двойные: близкие / звезды: новые, катаклизмические переменные / звезды: индивидуальные: GK Per / рентгеновские лучи: звезды / аккреция, аккреционные диски

    Обострение аллерген-индуцированной экземы при TLR4- и TRIF-дефиците Мыши

    Abstract

    Несмотря на его присутствие на резидентных клетках кожи, роль TLR4 в кожных заболеваниях остается малоизученной.Это очень важно, потому что биом кожи богат потенциальными агонистами TLR4. Мы стремились установить вклад TLR4 в атопический дерматит и определить механизм, с помощью которого TLR4 действует в экспериментальной модели атопического дерматита. MyD88, TLR4 или Toll-IL-1R-домен-содержащий адаптер-индуцирующий IFN-β (TRIF) -дефицит и мыши дикого типа подвергались эпикутанному воздействию аллергена Aspergillus fumigatus в течение 3 недель. Нарушение барьерной функции кожи оценивали путем измерения трансэпидермальной потери воды (TEWL).Количественно определены уровни врожденных и адаптивных генов в коже. В экспериментальной модели атопического дерматита TEWL, аллергическая сенсибилизация и толщина эпидермиса увеличивались после воздействия кожного аллергена, и они еще больше усиливались в отсутствие TLR4. Повышенные аллерген-индуцированные уровни в коже врожденных (S100A8 / A9, IL-1β, TNF-α и CXCL2) и Th27 генов (IL-17A и IL-17F) наблюдались у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с мышами дикого типа. Отсутствие MyD88 облегчает заболевание (снижение TEWL, толщины кожи, провоспалительных цитокинов), тогда как дефицит TRIF усугубляет заболевание.В заключение, передача сигналов через пути TLR4 и TRIF ограничивает дисфункцию кожного барьера, кожную аллергическую сенсибилизацию и выработку провоспалительных цитокинов.

    Введение

    Атопический дерматит (БА) — хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание кожи, распространенность которого в промышленно развитых странах почти утроилась за последние 30 лет (1). Все больше данных свидетельствует о том, что дефекты врожденной иммунной системы способствуют развитию и тяжести БА и лежат в основе повышенной восприимчивости этих пациентов к кожным патогенам (2).Дефекты, о которых сообщалось при БА, включают те, которые влияют на барьерную функцию кожи, экспрессию антимикробных белков, функцию и / или экспрессию рецепторов распознавания образов и врожденных иммунных клеток, таких как субпопуляции дендритных клеток (2). Более 20 исследований сообщили о положительной связи между полиморфизмами в гене важного кожного барьера (филаггрин) и БА (3). У мышей спонтанный AD-подобный фенотип кожи развивается, когда мышей с дефицитом филаггрина стареют в обычных условиях, что подчеркивает ключевую роль кожного барьера и патогенов окружающей среды как движущих сил заболевания (4, 5). Золотистый стафилококк колонизирует кожу> 90% пациентов с БА, часто способствуя обострениям заболевания (6).

    TLR — это рецепторы распознавания образов, участвующие в распознавании патогенов и способствующие развитию патоген-специфичных врожденных и адаптивных иммунных ответов. TLR участвуют в суперинфекции пораженной кожи при БА (2, 7, 8). Генетический полиморфизм в TLR2 был связан с увеличением тяжести инфекции S. aureus у пациентов с БА (9). Кроме того, S.aureus у мышей с дефицитом TLR2 приводила к более серьезным повреждениям (10). Генетические полиморфизмы в адапторном белке MyD88, подобном адаптеру, TLR9 и CD14, адапторном белке TLR4, также участвуют в AD (11-13). Недавно ПЦР-анализ последовательностей 16S рРНК показал, что кожная флора жилых помещений намного разнообразнее, чем считалось ранее (14). У мышей грамотрицательные бактерии, распознаваемые TLR4, составляют большую часть комменсальной флоры кожи (15, 16). Соответственно, TLR4 вовлечен в AD, в частности, в контексте колонизации Escherichia coli или инфекции коровьей оспы (17, 18).

    Все TLR, присутствующие на кератиноцитах, за исключением TLR3, передают сигнал через MyD88. Таким образом, связывание LPS с TLR4 на плазматической мембране индуцирует путь MyD88. Однако LPS может также индуцировать CD14-опосредованный эндоцитоз TLR4, который способствует передаче сигналов через адаптер-индуцирующий Toll-IL-1R домен IFN-β (TRIF) и связанную с TRIF молекулу адаптера, подобно связыванию вирусной РНК с TLR3 (19, 20). ).

    Несмотря на все более очевидное признание роли врожденного иммунитета в патогенезе БА и экспрессии TLR4 на кератиноцитах и ​​других клетках врожденного и адаптивного иммунитета, присутствующих в коже (7, 21), роль TLR4 при БА еще предстоит исследовать. (2, 5).В этом исследовании наши данные показывают, что, в то время как передача сигналов через MyD88 способствует индуцированной аллергеном дисфункции кожного барьера, передача сигналов через TLR4 и TRIF является защитной.

    Материалы и методы

    Мыши

    Мыши с дефицитом TLR4, TRIF и MYD88 на фоне C57BL / 6 и контрольные мыши C57BL / 6 (Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, Мэн) содержались в специальной среде, свободной от патогенов. среда. Все процедуры выполнялись в соответствии с этическими принципами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Институционального комитета по уходу и использованию животных, утвержденному отделом ветеринарных служб Исследовательского фонда медицинского центра детской больницы Цинциннати.

    Воздействие кожного аллергена

    Мышей анестезировали изофлураном (IsoFlo; Abbott Laboratories, Северный Чикаго, Иллинойс), и их спины брили электрической бритвой за 1 день до первого воздействия аллергена. Либо 200 мкл стерильного физиологического раствора, либо экстракт Aspergillus fumigatus (Asp; Greer Laboratories, Lenior, NC), ресуспендированный в физиологическом растворе с концентрацией 1 мг / мл, наносили на пластырь размером 2 × 2 см из стерильной марли. Пластырь был закреплен TegaDerm, а мышь была обернута лейкопластырем и водонепроницаемой лентой.Через 6 дней пластырь удаляли, а через 24 часа накладывали новый пластырь, всего три пластыря в течение 3-недельного периода, как показано на фиг. 1A. Уровни эндотоксинов в Asp оценивали с помощью теста Cambrex QCL1000 (1 мг / мл содержит 1,5–2 EU / мл или 0,3–0,4 нг / мл эндотоксинов, что приводит к экспозиции эндотоксина 0,06–0,08 нг на пластырь).

    Измерение трансэпидермальной потери воды

    Трансэпидермальную потерю воды (TEWL) измеряли с помощью прибора DermaLab (модуль DermaLab USB; Cortex Technology, Хадсунд, Дания), как описано ранее (22).Вкратце, TEWL оценивали в течение 1-минутного периода, помещая зонд на поверхность кожи в центре области, подверженной воздействию пластыря, пропитанного физиологическим раствором / аллергеном. Использовали среднее значение двух показаний на мышь, и измерения TEWL регистрировали в граммах на квадратный метр в час.

    Система оценки кожи

    Мышей оценивали визуально на предмет экскориации, эритемы и утолщения кожи в области, покрытой повязкой. Утолщение кожи получило оценку 0 (толщина, сопоставимая с кожей мыши дикого типа [WT]), 1 (небольшое утолщение кожи), 2 (значительное утолщение кожи по крайней мере на одной трети спины) и 3 ( значительное утолщение кожи как минимум на двух третях спины).Экскориации оценивались в баллах 0 (без царапин), 1 (1-3 ссадины), 2 (множественные ссадины на одной трети спины) и 3 (множественные ссадины на большей части спины). Измерения проводились двумя независимыми исследователями, и фиксировалось среднее значение баллов по каждому параметру. Общий балл по ссадинам и утолщению представлен как балл по коже для каждой мыши.

    Уровни аллерген-специфических антител

    Aspergillus -специфические уровни IgG1, IgG2c и IgE в плазме измеряли с помощью ELISA.Вкратце, планшеты покрывали Asp (100 мкг / мл) в течение ночи при 4 ° C. Блокирование осуществляли с помощью 10% FBS в PBS, и все отмывки выполняли 0,05% Tween 20 в PBS. Образцы плазмы разводили 1:10, 1:25 и 1: 100 для IgG1 и 1: 5 для IgG2c и IgE. После 2 ч инкубации планшеты промывали и либо конъюгированные с HRP антимышиные IgG1 (X56; 1: 1000; BD Biosciences-Pharmingen), HRP-конъюгированные антимышиные IgG2c (1: 400; Southern Biotech) или биотиновые антитела. IgE мыши (R35-118; 1: 250; BD Pharmingen) добавляли в течение 1 ч с последующей инкубацией со стрептавидином-HRP (R&D Systems; DY998; 1: 200) в случае IgE.Реакцию, вызванную добавлением реагента тетраметилбензидинового субстрата (BD Biosciences), останавливали 2 н. H 2 SO 4 ; поглощение считывали при 450 нм.

    Окрашивание тучных клеток и измерение толщины кожи

    Кожные ткани фиксировали в 10% формалине сразу после умерщвления мышей. Залитые парафином ткани разрезали на срезы размером 5 мкм и окрашивали либо H&E для оценки толщины кожи, либо окрашиванием по Ледеру для идентификации тучных клеток (23).Толщина эпидермиса была определена количественно с использованием морфометрического программного обеспечения (Image Pro Plus 4.1; Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

    Иммуногистохимия

    Образцы тканей фиксировали в 10% формалине и обрабатывали стандартными гистологическими методами. Вкратце, срезы размером 5 мкм гасили H 2 O 2 , блокировали 3% нормальной козьей сывороткой и окрашивали в течение ночи при 4 ° C основным белком антимышиного миелина крысы (1: 1000; подарок J . and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ) или крысиные антимышиные Ly6G (1: 200; BioLegend).Срезы промывали и инкубировали с биотинилированными антителами против крысиного Ab и авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain ABC Peroxidase Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Затем предметные стекла проявляли диаминобензидином никеля с образованием черных осадков (DAB Kit; Vector Laboratories) и контрастировали с ядерно-стойким красным. Количественный анализ окрашенных клеток на поле дермы выполняли вслепую (анализировали 15-20 полей при 40-кратном объективе на срез кожи).

    Выделение и культивирование клеток лимфатических узлов

    Дренирующие кожу паховые и подмышечные лимфатические узлы объединяли и измельчали ​​резиновым шприцем через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм.Выделенные клетки подсчитывали и высевали из расчета 10 6 клеток / лунку в 24-луночный планшет. Затем клетки стимулировали Asp (30 мкг / мл) и культивировали при 37 ° C в течение 5-6 дней. Уровни IL-4 и IL-17A в супернатантах культур оценивали с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителя (BioLegend).

    ПЦР в реальном времени

    Общая РНК была выделена из гомогенизированной кожи мыши с использованием TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя и обработана ДНКазой (Qiagen, Валенсия, Калифорния) перед обратной транскрипцией с помощью набора для синтеза надстрочного индекса первой цепи (Invitrogen) .Количественный ПЦР-анализ кожи мышей в реальном времени проводили с использованием LightCycler FastStart DNA master SYBR Green I в качестве готовой к использованию реакционной смеси (Roche). кДНК амплифицировали с использованием следующих праймеров, и экспрессию гена нормализовали по гипоксантинфосфорибозилтрансферазе (HPRT), прямая, 5′-TGCCGAGGATTTGGAAAAAG-3 ‘и обратная, 5′-ССТTTGAGCACACAG-3′; IFN-γ прямой, 5’-CAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGG-3 ‘и обратный, 5′-TTTCCGCTTCCTGAGGCTGGAT-3′; ИЛ-4 прямой, 5’-CTGTAGGGCTTCCAAGGTGCTTCG-3 ‘и обратный, 5′-CCATTTGCATGATGCTCTTTAGGC-3′; IL-17A прямой, 5’-ACTACCTCAACCGTTCCACG-3 ‘и обратный, 5′-AGAATTCATGTGGTGGTCCA-3′; IL-17F прямой, 5’-TGGAGAAACCAGCATGAAGTG-3 ‘и обратный, 5′-AGTCCCAACATCAACAGTAGC-3′; IL-17C прямой, 5’-CTGGAAGCTGACACTCACGA-3 ‘и обратный, 5′-ACACAAGCATTCTGCCACC-3′; тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) вперед, 5’-TCAATCCTATCCCTGGCTG-3 ‘и обратно, 5′-GCATGAAGGAATACCACAATCTTA-3′; IL-1β прямой, 5’-AAGCCTCGTGCTGTCGGACC-3 ‘и обратный, 5′-CCAGCTGCAGGGTGGGTGTG-3′; IL-6 прямой, 5’-TGATGCACTTGCAGAAAACA-3 ‘и обратный, 5′-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC-3′; TNF-α прямой, 5’-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3 ‘и обратный, 5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3′; S100A8 прямой, 5’-CCATGCCCTCTACAAGAATG-3 ‘и обратный, 5′-ATCACCATCGCAAGGAACTC-3′; S100A9 прямой, 5’-GAAGGAAGGACACCCTGACA-3 ‘и обратный, 5′-GTCCAGGTCCTCCATGATGT-3′; CXCL1 прямой, 5’-CCACACTCAAGAATGGTCGC-3 ‘и обратный, 5′-TCTCCGTTACTTGGGGACAC-3′; CXCL2 прямой, 5’-CCAACCACCAGGCTACA-3 ‘и обратный, 5′-GCCCTTGAGAGTGGCTATGA-3’.

    Статистический анализ

    Полученные значения выражены как среднее ± SEM. Статистический анализ выполняли с использованием Prism 5 (программное обеспечение GraphPad). Во всех экспериментах был проведен односторонний дисперсионный анализ с последующими множественными сравнительными тестами Бонферрони. Корреляции оценивались с помощью непараметрического критерия Спирмена. Значимость была установлена ​​на уровне p , равном 0,05.

    Результаты

    Обострение дисфункции кожного барьера у мышей с дефицитом TLR4 после многократного воздействия кожного аллергена

    Одной из основных особенностей БА является нарушение кожного барьера, что обычно демонстрируется путем измерения увеличения TEWL (22, 24).В модели БА на мышах дефицит TLR4 не приводил к изменению TEWL на исходном уровне или у мышей, покрытых физиологическим раствором (рис. 1В). Уровни TEWL оставались неизменными после нанесения первого пластыря Aspergillus и увеличивались после каждого последующего воздействия аллергена (фиг. 1B). Повторяющееся воздействие эпикожных аллергенов приводит к воспалению кожи и утолщению эпидермиса, а также к другим клиническим признакам БА, что отражается в повышенных показателях кожи (рис. 1С). У мышей с дефицитом TLR4, покрытых Asp, заметно увеличились показатели TEWL и кожи по сравнению с мышами WT (рис.1Б, 1С).

    РИСУНОК 1.

    Нарушение функции кожного барьера после пятен A. fumigatus . ( A ) Хронология протокола экспериментов. ( B ) Спустя один день после удаления каждого пластыря, измерения TEWL были получены в области исправления. n = 4 мыши / группа; среднее ± SEM; Двусторонний дисперсионный анализ с посттестами Бонферрони, *** p <0,001. ( C ) Оценка кожного воспаления (тест Крускала – Уоллиса ANOVA, p <0,0001, затем тест Манна – Уитни U между Aspergillus -подвергнутыми воздействию мышей WT и KO, * p = 0.018). ( D ) Толщина эпидермиса оценивалась морфометрическим анализом 3-5 изображений на мышь; репрезентативные фотографии мышей, сделанные через 24 часа после удаления третьего пластыря. n = 16–19 / группа. ** p <0,01, критерий множественного сравнения Бонферрони. ( E ) Уровни Asp-специфического IgG1 в плазме выражены как OD для конкретного разведения. n = 14 мышей / группа. * p <0,05, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони.

    Из-за значительных исходных различий между самками и самцами мышей в толщине их дермы и подкожного жирового слоя мы исследовали толщину эпидермиса.Между физиологическим раствором и мышами, покрытыми Asp, наблюдалось 3–5-кратное увеличение толщины эпидермиса (рис. 1D). Толщина эпидермиса была значительно увеличена у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с мышами WT после третьего воздействия Aspergillus (фиг. 1D). Кроме того, наблюдалась значимая корреляция между TEWL и толщиной эпидермиса среди образцов кожи, подвергнутых воздействию Asp, от мышей WT и мышей с дефицитом TLR4 ( r = 0,38, p = 0,018).

    Повышенная сенсибилизация к

    Aspergillus у мышей с дефицитом TLR4

    Чтобы оценить, связано ли наблюдаемое нарушение кожного барьера с повышенной сенсибилизацией аллергеном через кожу, определяли уровни в плазме Asp-специфических IgG1, IgG2c и IgE.Три недели эпикожного воздействия Aspergillus привели к измеряемым уровням Asp-специфического IgG1 (рис. 1E), но Asp-специфические IgE или IgG2c Abs в основном не определялись (данные не показаны). Не наблюдалось значительных различий в общих исходных уровнях IgG1, IgG2c или IgE между наивными мышами с дефицитом TLR4 и мышами дикого типа (данные не показаны). Однако среди мышей, получавших Asp, мыши с дефицитом TLR4 имели значительно более высокие титры Asp-специфического IgG1 по сравнению с мышами WT, что указывает на повышенную сенсибилизацию к аллергену (рис.1E).

    Аллерген-индуцированное привлечение воспалительных клеток у мышей WT и TLR4-дефицитных мышей

    В предыдущих исследованиях сообщалось, что экспериментальная БА, возникающая в результате многократного воздействия OVA на очищенную от ленты кожу, характеризуется не только утолщением кожи и повышением OVA-специфических АТ, но и также за счет накопления в дерме клеток Th3, эозинофилов и тучных клеток (25). В нашей экспериментальной модели увеличение количества воспалительных клеток наблюдалось в дерме мышей , обработанных Aspergillus , по сравнению с мышами, обработанными физиологическим раствором.Чтобы оценить природу воспалительного инфильтрата, срезы кожи, залитые парафином, окрашивали на эозинофилы (антимиелиновый основной белок), тучные клетки (окраска по Ледеру) и нейтрофилы (анти-Ly6G). Количество тучных клеток, эозинофилов и нейтрофилов было значительно увеличено в дерме мышей, покрытых Asp (рис. 2). Однако дефицит TLR4 не повлиял существенно на количество эозинофилов, тучных клеток или нейтрофилов в дерме после воздействия Aspergillus (рис. 2). В отличие от эозинофилов и тучных клеток, нейтрофилы почти исключительно наблюдались, инфильтрируя дерму ниже экскориаций (рис.2С).

    РИСУНОК 2.

    Аллерген-индуцированное воспаление кожи, не измененное дефицитом TLR4. ( A ) Тучные клетки, окрашенные по Ледеру, подсчитывали в дерме. ( B ) Кожные эозинофилы были идентифицированы иммуногистохимическим методом на основной основной белок. ( C ) Репрезентативная фотография нейтрофилов Ly6G + , инфильтрирующих дерму под богатой нейтрофилами раной. Подсчет клеток представляет собой среднее значение 16–20 отдельных полей высокого увеличения (объектив 40 ×). ** p <0.01, *** p <0,001, критерий множественного сравнения Бонферрони.

    Повышенные аллерген-индуцированные уровни IL-17A в коже у мышей с дефицитом TLR4

    Для оценки характера адаптивного иммунного ответа мы измерили Th3 (IL-4), Th2 (IFN-γ) и Th27 (IL-17A). , IL-17F) цитокинов в коже под патчем с помощью ПЦР в реальном времени после второго и третьего патчей. После второго пластыря Asp уровни мРНК IFN-γ и IL-4 в коже остаются неизменными, тогда как уровни мРНК IL-17A и IL-17F, но не уровни мРНК IL-21 и IL-23p19, повышаются (рис.3A – C; данные не показаны). Несмотря на тенденцию, предполагающую увеличение генерации IL-4 у TLR4-дефицитных мышей после второго пластыря Asp, отсутствие TLR4 не оказало значительного влияния после третьего пластыря Asp на уровни мРНК кожи IL-4 или уровни белка IL-4 в стимулированном Asp культуры клеток лимфатических узлов (рис. 3Б, 3D). После третьего участка Asp уровни мРНК кожи IL-17A были увеличены, тогда как IFN-γ были снижены у мышей с дефицитом TLR4 (фиг. 3A, 3C). Дефицит TLR4 привел к увеличению уровня белка IL-17A в супернатанте стимулированных Asp клеток, выделенных из лимфатических узлов, дренирующих кожу (рис.3E) в соответствии с данными мРНК.

    РИСУНОК 3. Дефицит

    TLR4 увеличивает уровень IL-17A в коже после третьего пластыря Aspergillus . Уровни мРНК ( A ) IFN-γ, ( B ) IL-4 и ( C ) IL-17A и IL-17F в коже оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени после второго и третьего пластыря. n = 5–8 и n = 6–12 соответственно) и выражается как отношение к гену домашнего хозяйства HPRT. * p <0,05, ** p <0.01, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони. ( D и E ) Клетки подмышечных и паховых лимфатических узлов, собранные после третьего пластыря, стимулировали in vitro с помощью Asp (30 мкг / мл) в течение 6 дней. Уровни секретируемых IL-4 и IL-17A оценивали с помощью ELISA. n = 5–7 мышей / группа; * p <0,05, критерий множественного сравнения Бонферрони. n.s., не имеет значения).

    Повышенные уровни провоспалительных цитокинов, вызванные аллергеном, у мышей с дефицитом TLR4

    Для оценки природы врожденного иммунного ответа гены, полученные из кератиноцитов, были количественно определены после второй и третьей пластырей аллергенов.Кератиноциты являются основным источником TSLP при острых и хронических поражениях AD, а TSLP участвует в патогенезе заболевания (26–28). В нашей модели уровни мРНК кожи TSLP были увеличены после второго пластыря аллергена у TLR4-дефицитных мышей по сравнению с мышами WT, но были подобны мышам WT после третьего пластыря Aspergillus (фиг. 4A).

    РИСУНОК 4.

    Aspergillus -индуцированные воспалительные цитокины повышаются у мышей с дефицитом TLR4 после второго и третьего пластыря.( A ) TSLP, ( B ) IL-17C, ( C ) S100A8 и S100A9, ( D ) IL-1β, ( E ) IL-6, ( F ) TNF- Уровни мРНК α и ( G ) CXCL2 в коже оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени после второго и третьего пластырей ( n = 5–8 и n = 6–12, соответственно) и выражали в виде отношения над геном домашнего хозяйства HPRT. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони.n.s., не имеет значения.

    Среди членов семейства IL-17, происходящих из кератиноцитов, уровень IL-17C был значительно повышен после второго, но не третьего участка аллергена у мышей с дефицитом TLR4 (рис. 4B), тогда как уровни IL-25 в коже (IL-17E) остались. без изменений после воздействия Aspergillus (данные не показаны).

    При БА кератиноциты сверхэкспрессируют антимикробные пептиды, включая кальпротектин (гетеродимер S100A8 и S100A9). Соответственно, в нашей модели уровни S100A8 и S100A9 в коже были повышены после воздействия Aspergillus и еще больше увеличились у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с мышами WT (рис.4С).

    В отсутствие TLR4 провоспалительные цитокины (IL-1β, IL-6 и TNF-α) были повышены после второго и третьего участков с аллергеном, но только IL-1β и TNF-α были значительно увеличены при дефиците TLR4. мышей по сравнению с мышами WT (рис. 4D – F). Уровни мРНК S100A8 и A9 в коже также были увеличены у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с мышами WT после второй и третьей пластырей аллергеном (фиг. 4D и данные не показаны).

    Нейтрофильные хемокины CXCL1 (KC) и CXCL2 были увеличены после второй и третьей пластырей Asp, но только уровни мРНК кожи CXCL2 были дополнительно увеличены у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с мышами WT (рис.4G и данные не показаны). Другие хемокины (CCL2, CCL11, CCL20) не индуцировались воздействием Aspergillus (данные не показаны).

    Дефицит MyD88 является защитным, тогда как дефицит TRIF усугубляет экспериментальную AD.

    Далее мы исследовали, какой из последующих путей участвовал в TLR4-опосредованном обострении экспериментальной AD. MyD88- и TRIF-дефицитных мышей подвергали экспериментальной модели AD, описанной на фиг. 1A. В отличие от мышей с дефицитом TLR4, отсутствие MyD88 частично защищало мышей от аллерген-индуцированной экспериментальной БА, что продемонстрировано снижением TEWL, толщины эпидермиса и эпикутанной сенсибилизации (рис.5A – C). Соответственно, уровни мРНК кожи и уровни белка IL-4 и IL-17A в дренирующих лимфатических узлах, стимулированных Asp, также были снижены (фиг. 5D, 5E). Дефицит MyD88 также нарушает индукцию S100A8 / A9, IL-1β, IL-6, TNF-α и CXCL2 в коже после воздействия аллергена (фиг. 5F).

    РИСУНОК 5. Дефицит

    MyD88 облегчает вызванную Aspergillus дисфункцию кожного барьера. ( A ) Измерения TEWL проводились на следующий день после удаления каждого пластыря. n = 6–8 мышей / группа; среднее ± SEM; Двусторонний дисперсионный анализ с посттестами Бонферрони.*** р <0,001. ( B ) Толщина эпидермиса оценивалась морфометрическим анализом. ( C ) Уровни Asp-специфического IgG1 в плазме после третьего пластыря Aspergillus . ( D ) Уровни IL-4 и IL-17A в коже. ( E ) Стимулированную Asp секрецию IL-4 и IL-17A клетками лимфатических узлов оценивали с помощью ELISA. ( F ) Уровни мРНК кожи S100A8, IL-1β, IL-6 и CXCL2 оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени после третьего пластыря ( n = 3–6 мышей / группа).Репрезентативные результаты двух отдельных экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони.

    Это резко контрастировало с усиленным фенотипом, наблюдаемым у TRIF-дефицитных мышей. Подобно мышам с дефицитом TLR4, мыши с дефицитом TRIF демонстрировали нарушение функции кожного барьера, что оценивалось по повышенной потере воды (TEWL) после воздействия аллергена (фиг. 6A). Показатели кожи и толщина эпидермиса также были увеличены у TRIF-дефицитных мышей, но не достигли значимости (рис.6Б, 6С). Эпикутанная сенсибилизация была увеличена, что продемонстрировано повышенными уровнями Asp-специфических IgG1 и IgG2c в крови у TRIF- и TLR4-дефицитных мышей (фиг. 6D). Подобно мышам с дефицитом TLR4, уровни общего IgE и уровни мРНК кожи IL-4 не увеличивались в дальнейшем у TRIF-дефицитных мышей по сравнению с мышами WT, а уровни IFN-γ были снижены у TRIF-дефицитных мышей (фиг. 6D, 6E). . Неожиданно, кожный IL-17A, который был повышен у мышей с дефицитом TLR4, был снижен у мышей с TRIF-дефицитом Aspergillus (рис.6E). IL-17A, высвобождаемый стимулированными Aspergillus клетками лимфатических узлов от TRIF-дефицитных мышей, не достиг значимости (фиг. 6F). Рестимулированные in vitro клетки лимфатических узлов мышей дикого типа и TRIF-дефицитных мышей высвобождали аналогичные уровни IL-4 и IFN-γ (фиг. 6F). В соответствии с уровнями IL-17A в коже, индуцированное Aspergillus повышение уровней мРНК кожи IL-17F было нарушено у TRIF-дефицитных мышей по сравнению с мышами WT (фиг. 6G). Соответственно, уровни мРНК кожи pro-Th27 цитокина IL-6 имели тенденцию к снижению у TRIF-дефицитных мышей по сравнению с мышами WT (рис.6G). Подобно мышам с дефицитом TLR4, мыши с дефицитом TRIF продемонстрировали повышенные уровни мРНК кожи IL-1β, TNF-α и CXCL2 по сравнению с мышами WT (фиг. 6H).

    РИСУНОК 6. Недостатки

    TLR4 и TRIF усугубляют экспериментальную БА. ( A ) Измерения TEWL после третьего пластыря ( n = 9–13 мышей / группа из двух отдельных экспериментов). ( B ) Оценки кожи получали, как описано в «Материалы и методы» . Оценка кожи и толщина эпидермиса ( C ) после третьего пластыря Asp.( D ) Уровни Asp-специфических IgG1 и IgG2c в плазме и общие уровни IgE. ( E ) Уровни мРНК кожи и ( F ) белковые уровни IL-17A, IFN-γ и IL-4. Уровни мРНК кожи ( G ) IL-17F и IL-6 и ( H ) IL-1β, TNF-α и CXCL2 оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени после третьего пластыря. n = 3–6 мышей / группа; репрезентативные результаты двух отдельных экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони. n.s., не имеет значения.

    Обсуждение

    Наши данные демонстрируют, что дефектная передача сигналов TLR4 или TRIF приводит к обострению заболевания, о чем свидетельствует повышенная дисфункция кожного барьера (TEWL) и эпикутанная сенсибилизация. Таким образом, передача сигналов через TLR4 защищает от ранних воспалительных явлений, ведущих к нарушению кожного барьера и развитию заболевания. Механически этот защитный эффект, скорее всего, опосредован TRIF, а не MyD88.

    Наши данные показывают, что ранние врожденные события защищают от вызванной аллергеном дисфункции кожного барьера. Действительно, увеличение TEWL, наблюдаемое после второго участка с аллергеном у мышей с дефицитом TLR4, связано с увеличением провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α). Точно так же у пациентов с БА, несущих мутации в гене филаггрина, а также у мышей с дефицитом филаггрина наблюдались повышенные уровни IL-1β в коже (29). У мышей с дефицитом филаггрина также развивается местный ответ Th27, о чем свидетельствует повышенный уровень мРНК в коже IL-17A, тогда как повышенные уровни цитокинов Th3 в коже наблюдались только через несколько месяцев (5).Точно так же у мышей с дефицитом IgE, STAT6, IL-4, IL-13, тучных клеток или эозинофилов по-прежнему развивается AD-подобный фенотип кожи при воздействии пятен аллергенов, что указывает на то, что ни один из них не является существенным для опосредованной аллергеном кожи. воспаление (25, 30).

    Th3-промотирующий врожденный цитокин TSLP увеличивается при поражениях AD (28). Сверхэкспрессия TSLP в кератиноцитах приводила к спонтанному развитию AD-подобного фенотипа у мышей (26). В отсутствие TSLP, OVA-индуцированное увеличение цитокинов Th3 кожи отменяется (27).Кроме того, недавно было показано, что TSLP-зависимое накопление врожденных лимфоидных клеток 2 типа при БА способствует заболеванию (31). Уровни мРНК кожи TSLP были увеличены в нашей модели после второго, но не третьего пластыря Aspergillus . Принимая во внимание, что мы не можем исключить роль TSLP в инициации заболевания, подавление TSLP после третьего пластыря аллергена предполагает, что TSLP не является существенным в прогрессировании заболевания.

    Кератиноцит-специфическая сверхэкспрессия IL-17C у мышей приводила к увеличению уровней в коже IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17A и F, а также антимикробного пептида кальпротектина (S100A8 / A9) (32 ).В нашей модели уровень всех этих генов был повышен после второго пластыря аллергена, но отсутствие какой-либо индукции IL-17C после третьего пластыря Aspergillus свидетельствует против роли IL-17C в прогрессировании заболевания.

    Было высказано предположение, что кальпротектин передает сигнал через TLR4 (33). Уровни мРНК в коже S100A8 и A9 были значительно увеличены у мышей, неоднократно подвергавшихся воздействию A. fumigatus , а дефицит TLR4 был связан с повышенной экспрессией S100A8 и A9.Действительно, уровни S100A8 / A9 в коже коррелируют с дисфункцией кожного барьера, что предполагает их роль в патогенезе заболевания. Однако лечение блокирующими Abs против S100A8 и A9 существенно не изменило TEWL в нашей модели (данные не показаны).

    У мышей, подвергшихся воздействию трех пятен OVA в течение 2-месячного периода, в коже мышей BALB / c с накладками OVA наблюдалось увеличение содержания цитокинов Th27 (34 ). Авт. Предполагают, что способность эпикутанного OVA индуцировать ответ Th27 опосредуется экспрессирующими IL-23 кожными DC.В нашей модели не наблюдалось увеличения уровней мРНК IL-23p19 в коже после второго пластыря аллергена, несмотря на повышенные уровни мРНК IL-17A и IL-17F в коже, что позволяет предположить, что в нашей модели другие врожденные цитокины способствуют повышению уровня IL-17A в коже. В самом деле, IL-23 не важен для дифференцировки Th27; Было показано, что комбинации IL-1β и IL-6 способствуют дифференцировке Th27 (35).

    В отсутствие TLR4, TEWL усиливается после второго пластыря Aspergillus , тогда как кожные цитокины Th27 сходны между WT и TLR4-дефицитными мышами в этот момент времени, что позволяет предположить, что нарушение кожного барьера предшествует, а не является результатом повышенных ответов Th27. .В отличие от TLR4-дефицитных мышей, индуцированная аллергеном повышающая регуляция цитокинов Th27 (IL-17A, IL-17F) может быть нарушена у TRIF-дефицитных мышей. В отсутствие TLR4 передача сигналов через другие TLR все еще происходит. Помимо вирусной дцРНК, самокодирующая РНК, возникающая в результате повреждения кожи, также может передавать сигнал через TLR3 (36). Путь TRIF, расположенный ниже TLR3 и TLR4, опосредует активацию LPS костимулирующих молекул на макрофагах и дендритных клетках, а также индуцированную LPS активацию и высвобождение цитокинов, включая IFN типа 1, IL-6 и IL-12 (37–39). , что согласуется с более низким уровнем цитокинов Th2 и Th27 в коже.Разница в ответе IL-17A между TLR4-дефицитными и TRIF-дефицитными мышами в этой модели может объяснить более мягкий фенотип, наблюдаемый у TRIF-дефицитных мышей.

    Значительное снижение уровней мРНК кожи IFN-γ наблюдалось у мышей с дефицитом TRIF и TLR4, подвергнутых воздействию Asp. Аналогичное наблюдение было сделано на мышах с дефицитом TLR2, подвергшихся эпикутанальному воздействию трех участков OVA в течение 2-месячного периода (40). OVA-индуцированные уровни мРНК кожи Th3 цитокинов не изменились, тогда как уровни IFN-γ были снижены (40).В отличие от мышей с дефицитом TLR4, дефицит TLR2 был связан с уменьшением толщины эпидермиса (40). Авторы не исследовали, влияет ли дефицит TLR2 на цитокины Th27, которые увеличены в нашей модели. Отсутствие MyD88 в той же модели OVA было связано со снижением уровней мРНК кожи IL-17A после воздействия OVA (34). Это согласуется с опосредованной MyD88 передачей сигналов IL-1R и участием IL-1β в дифференцировке Th27. Защитная роль дефицита MyD88 в нашей модели подтверждает роль передачи сигналов MyD88 в обострении заболевания.Соответственно, уровни провоспалительных цитокинов и хемокинов в коже заметно снизились. Однако влияние на кожный барьер было более ограниченным, что позволяет предположить, что Aspergillus может вызывать кожные заболевания независимо от MyD88, возможно, через путь TRIF.

    TLR3 и TLR4, оба из которых передают сигнал через TRIF, участвовали в заживлении ран: у мышей, дефицитных по TLR4 или TLR3, наблюдалось нарушение заживления ран (41, 42). В эпителиальных клетках человека заживлению ран способствовали низкие дозы ЛПС, тогда как высокие дозы были вредными (43).Точно так же, когда мы подвергали мышей воздействию высоких доз ЛПС (1 мкг / пластырь) в присутствии Aspergillus , болезнь обострялась (данные не показаны). Как и многие аллергены, Aspergillus обладает значительной протеолитической активностью. Было показано, что протеолитическая активность аллергенов тараканов и клещей домашней пыли задерживает восстановление кожного барьера после повреждения кожи (44). Одним из преимуществ нашего исследования является то, что мы использовали аллерген, о взаимодействии которого с TLR4 не известно. Связанная с клещами домашней пыли протеаза Derp2 может взаимодействовать с TLR4 (45), тогда как загрязнение OVA эндотоксинами способствует его способности вызывать ответ Th3 (46).Уровни эндотоксина в Aspergillus были очень низкими (<0,1 нг / пластырь), но остается возможность, что в экстракте могут присутствовать другие лиганды TLR4, которые могут способствовать нашему фенотипу.

    В заключение, в экспериментальной модели аллерген-индуцированной AD дефектная передача сигналов TLR4 и TRIF приводит к обострению заболевания, о чем свидетельствует повышенная дисфункция кожного барьера (TEWL) и эпикутанная сенсибилизация, связанная с повышением провоспалительных цитокинов, особенно IL-1β и TNF. -α.

    Раскрытие информации

    У авторов нет финансового конфликта интересов.

    Благодарности

    Мы благодарим Умасундари Сивапрасада за критический обзор рукописи, Кайлу Кинкер и Брэнди Дэй за техническую помощь и Синтию Чаппелл за редакционную помощь.

    Сноски

    • Эта работа была частично поддержана грантами T32 ES010957 (для E.B.B.) и RO1AR054490 (для G.K.K.H.) Национального института гигиены окружающей среды.).

    • Аббревиатуры, использованные в этой статье:

      AD
      атопический дерматит
      Asp
      Aspergillus fumigatus экстракт
      HPRT

      4фосфораза

      TRAINTRAL 90–145
      фосфорасилфосантин 90–148148HRM 90–145 IFN-β, содержащий домен IL-1R, индуцирующий адаптер
      TSLP
      стромальный лимфопоэтин тимуса
      WT
      дикого типа.
    • Получено 22 марта 2013 г.
    • Принято 30 июля 2013 г.
    • Авторские права © 2013 Американская ассоциация иммунологов, Inc.

    Судзаку Рентгеновские наблюдения карликовой новой GK Persei вспышка в 2015 году | Ежемесячные уведомления Королевского астрономического общества

    Аннотация

    На промежуточной полярной ГК Пер в марте – апреле 2015 г. произошла вспышка карликовой новой. Suzaku Рентгеновский телескоп по счастливой случайности зафиксировал начало вспышки во время заранее запланированного наблюдения наведения, продолжавшегося четыре дня.В этой статье мы представляем результаты временного и спектрального анализа этой вспышки вместе с данными из архивных данных покоя, полученными в 2009 и 2014 годах. Наш временной анализ подтвердил ранее сообщенную спиновую модуляцию скорости счета рентгеновских лучей во вспышке с белым карликом ( WD) период вращения P WD = 351,4 ± 0,5 с. Модуляция также обнаруживается в полосе жесткого рентгеновского излучения (16–60 кэВ), а спектральное моделирование поглощения предполагает затемнение плотным поглощением с плотностью столба на луче зрения N H > 10 23 см −2 .Видна сложная временная эволюция профилей спиновой модуляции; фаза спинового минимума смещается от фазы ∼0.25 в первой половине наблюдения до ∼0.65 во второй, а форма импульса существенно меняется от эпохи к эпохе. Спектральный подбор в полосе Fe K α показал увеличение эквивалентной ширины флуоресцентной линии с ∼80 эВ (в состоянии покоя) до ∼140 эВ (вспышка). Эквивалентная ширина He-подобного и H-подобного Fe K α согласуется с постоянной величиной ~ 40 эВ в двух состояниях. Широкополосная спектральная подгонка в диапазоне 2–60 кэВ привела к субсолнечному содержанию Fe ∼0.1 Z и максимальная температура плазмы kT max ∼ 50–60 кэВ при применении модели изобарического охлаждающего потока. Основываясь на очень небольшом изменении температуры на фоне увеличения темпа аккреции в 6–7 раз, обсуждается геометрия аккреции в ранней вспышке.

    1 ВВЕДЕНИЕ

    GK Persei, далее GK Per, представляет собой систему катаклизмических переменных (CV), в которой находится намагниченный белый карлик (WD) и которую можно наблюдать как промежуточный полюс.Этот источник подвергся классическому взрыву новой в 1901 году (Hale 1901; Williams 1901), а также демонстрирует вспышки карликовой новой примерно каждые 3 года, каждая из которых длится около 50 дней (например, Шимон, 2002). Хотя GK Per представляет собой магнитную систему, которая имеет магнитоуправляемую аккрецию в своей магнитосфере, считается, что вспышка карликовой новой происходит из-за увеличения массопереноса, вызванного нестабильностью в аккреционном диске, циркулирующем вокруг магнитосферы WD (например, Nogami, Kato & Баба 2002).Моралес-Руэда и др. (2002) измерили спектр поглощения звезды-компаньона и сообщили о соотношении масс компаньона и WD как q = M K / M WD = 0,55 ± 0,21 и ограничили массу WD. как M WD > 0,87 ± 0,24 M . Сулейманов, Ревнивцев и Риттер (2005) оценили массу WD на основе рентгеновской спектральной аппроксимации как M WD = 0,59 ± 0,05 M , отметив, что это значение может быть занижено на ∼20% из-за уменьшения магнитосферной радиус во вспышке, в которой были взяты их данные RXTE .Хатису и Като (2007) получили наиболее подходящую массу WD 1,15 ± 0,1 M на основе классического моделирования кривой блеска новой.

    Благодаря своим уникальным характеристикам (т. Е. Магнитный CV с активностью классических новых / карликовых новых), GK Per был глубоко изучен в широком диапазоне длин волн; см. Nogami et al. (2002) и Takei et al. (2015) за обширные коллекции предыдущих публикаций. Среди многих исследований ключевые вехи в области рентгеновского излучения, которые имеют отношение к этой статье, включают обнаружение (1) периода вращения 351 с с использованием EXOSAT (Watson, King & Osborne 1985), (2) сложной структуры поглощения и структура эмиссионных линий Fe K α с использованием Ginga и ASCA (Ishida et al.1992; Ezuka & Ishida 1999), (3) потенциальное красное крыло в линии Fe Kα с использованием Chandra HETG (Hellier & Mukai 2004) и (4) эмиссионные линии от более легких элементов, таких как O и N, с использованием XMM– Newton RGS (Vrielmann, Ness & Schmitt, 2005). Исследования расширяющейся оболочки, излучающей рентгеновские лучи, созданной новой звездой 1901 года, показали наличие неравновесной ионизационной столкновительной плазмы в остатке новой звезды (Balman 2005; Takei et al. 2015).

    Вспышки карликовых новых GK Per предоставляют нам интересные возможности для изучения дисковой нестабильности (Kim, Wheeler & Mineshige 1992; Nogami et al.2002) и взаимодействие диска с магнитосферой при изменении темпа аккреции массы (∼ × 10–20 по сравнению с периодом покоя; Ishida et al. 1992). В этой статье мы анализируем данные рентгеновских наблюдений последней карликовой новой, произошедшей в марте – апреле 2015 г., с целью исследования геометрии аккреции и структуры области аккреции после ударной волны, такой как максимальная температура и радиус магнитосферы во вспышке. Мы также сравниваем результаты этих анализов с результатами, полученными в неактивном состоянии, когда они доступны.

    2 НАБЛЮДЕНИЕ И ОБРАБОТКА ДАННЫХ

    6 марта.84 UTC 2015 г. (MJD 57087.84), GK Per перешла в состояние вспышки карликовой новой (Wilber et al., 2015). Рентгеновский спутник Suzaku случайно наблюдал за GK Per в качестве запланированного наблюдения с 05.03.2015 18:38:56 UTC (MJD 57086.8) по 09.03.2015 18:30:11 UTC (MJD 57090.8) с сетью экспозиции 182,9 тыс. с с помощью рентгеновского спектрометра (XIS; Koyama et al. 2007) и 134,8 тыс. с с помощью детектора жесткого рентгеновского излучения (HXD; Kokubun et al. 2007; Takahashi et al. 2007). В Таблице 1 обобщены записи наблюдений.Обратите внимание, что из-за пониженной способности космического корабля генерировать электроэнергию во время этого наблюдения работала только одна установка XIS из четырех, а именно XIS3. Кроме того, HXD работал, пока солнечные лопасти освещались солнцем и выключались во время затмения землей. Как показано на рис. 1, наблюдение Suzaku охватывает переход от состояния покоя к вспышке, что позволяет нам проследить временные изменения рентгеновского излучения; на рисунке использованы результаты мониторинга переходных процессов Swift / BAT, предоставленные командой Swift / BAT (Krimm et al.2013).

    Рис. 1.

    Кривая блеска Swift / BAT со скоростью счета 15–50 кэВ, полученная с веб-сайта жесткого рентгеновского монитора переходных процессов Swift / BAT. Период наблюдения Suzaku показан заштрихованной областью.

    Рис. 1.

    Кривая блеска Swift / BAT со скоростью счета 15–50 кэВ, полученная с веб-сайта жесткого рентгеновского монитора переходных процессов Swift / BAT. Период наблюдения Suzaku показан заштрихованной областью.

    Таблица 1.

    Журнал GK По наблюдениям Suzaku .

    Идентификатор наблюдения . Дата / время начала . Экспозиция a . Точка прицеливания . № XIS b . Скорость счета c .
    403081010 2009-02-13T10: 35: 48 30.4 HXD 3 0,25
    40

    10
    2014-08-07T17: 01: 21 114,5 XIS 3 0,89
    -05 : 38: 56 182,9 XIS 1 3,08
    Идентификатор наблюдения . Дата / время начала . Экспозиция a . Точка прицеливания . № XIS b . Скорость счета c .
    403081010 2009-02-13T10: 35: 48 30,4 HXD 3 0,25
    40

    10
    XIS 3 0,89
    40

    20
    2015-03-05T18: 38: 56 182.9 XIS 1 3,08
    Таблица 1.

    Журнал GK По наблюдениям Suzaku .

    . .5
    Идентификатор наблюдения . Дата / время начала . Экспозиция a . Точка прицеливания . № XIS b . Скорость счета c .
    403081010 2009-02-13T10: 35: 48 30,4 HXD 3 0,25
    40

    10
    XIS 3 0,89
    40

    20
    2015-03-05T18: 38: 56 182,9 XIS 1 3,08
    Дата / время начала . Экспозиция a . Точка прицеливания . № XIS b . Скорость счета c .
    403081010 2009-02-13T10: 35: 48 30,4 HXD 3 0,25
    40

    10
    XIS 3 0,89
    40

    20
    2015-03-05T18: 38: 56 182,9 XIS 1 3,08
    за март 2015 г. Suzaku был направлен на цель дважды в феврале 2009 г. и августе 2014 г., когда цель находилась в состоянии покоя в оптическом режиме (Таблица 1). Данные этих наблюдений также анализируются в настоящем отчете. Отметим следующие два момента по поводу этих наблюдений; (1) хотя три блока XIS и HXD работали в феврале 2009 года, поток источника был слишком низким, чтобы его можно было обнаружить с помощью HXD; (2) в августе 2014 года три блока XIS работали, но HXD был случайно оставлен выключенным из-за отмена операций по контакту с космическими аппаратами из-за помех от тайфуна.

    Данные за март 2015 г., вместе с данными наблюдений 2009 и 2014 гг., Были обработаны и проанализированы с помощью программы heasoft 6.15, поддерживаемой и выпущенной HEASARC в Центре космических полетов имени Годдарда НАСА. Мы следовали стандартным процедурам извлечения данных и выбора событий для Suzaku . Фоновые сигналы XIS были оценены и вычтены с использованием данных, обнаруженных во внешней области области визуализации вокруг исходного изображения. HXD / PIN фон, не связанный с рентгеновскими лучами, вычитали с использованием официальной модели фона (Fukazawa et al.2009), выпущенный командой Suzaku HXD. 1 Барицентрическая поправка была применена ко времени прихода каждого фотона, зарегистрированного XIS и HXD.

    3 АНАЛИЗ И РЕЗУЛЬТАТЫ

    3.1 Временной анализ

    3.1.1 Кривые блеска

    На рис. 2 представлены кривые блеска скорости счета и соотношения жесткостей. По-видимому, мартовское наблюдение 2015 г. хорошо охватывало состояние покоя (от 0 до примерно 5 × 10 4 с) и начало вспышки карликовой новой.Темпы счета спокойного периода наблюдения в марте 2015 г. почти такие же, как и в августе 2014 г .; ∼0,1–0,3 отсчета с −1 (0,5–2 кэВ) и ∼1 отсчет с −1 (2–10 кэВ). В более поздний период мартовских наблюдений 2015 г. скорости счета довольно стабильны и составляют ∼0,1–0,2 отсчета с −1 (0,5–2 кэВ) и ∼3,5–4,5 отсчета с −1 (2–10 кэВ). .

    Рис. 2.

    Кривые блеска скоростей счета XIS трех наблюдений в феврале 2009 г., августе 2014 г. и марте 2015 г.Верхняя, средняя и нижняя панели на каждом графике показывают скорость счета в мягкой полосе (0,5–2 кэВ), скорость счета в жесткой полосе (2–10 кэВ) и отношение жесткости, рассчитанное как (2–10 скорость счета кэВ) / (скорость счета 0,5–2 кэВ). Скорость счета масштабируется на единицу XIS. Горизонтальные линии с числовыми метками на средней панели нижнего графика представляют эпохи, определенные для анализа данных за март 2015 г. (см. Текст).

    Рис. 2.

    Кривые блеска скоростей счета XIS трех наблюдений в феврале 2009 г., августе 2014 г. и марте 2015 г.Верхняя, средняя и нижняя панели на каждом графике показывают скорость счета в мягкой полосе (0,5–2 кэВ), скорость счета в жесткой полосе (2–10 кэВ) и отношение жесткости, рассчитанное как (2–10 скорость счета кэВ) / (скорость счета 0,5–2 кэВ). Скорость счета масштабируется на единицу XIS. Горизонтальные линии с числовыми метками на средней панели нижнего графика представляют эпохи, определенные для анализа данных за март 2015 г. (см. Текст).

    Кривые блеска в жестком рентгеновском диапазоне (> 16 кэВ) мартовского наблюдения 2015 г. представлены на рис.3.В отличие от сигналов мягкой полосы ниже 10 кэВ (три нижние панели рис. 2), отношение жесткости, вычисленное в диапазоне энергий HXD / PIN, более стабильно, что предполагает меньшее изменение формы спектра, чем в более мягком диапазоне энергий.

    Рис. 3.

    Кривые скорости счета HXD / PIN в полосе 16–25 кэВ (верхняя панель) и полосе 25–60 кэВ (средняя панель) для мартовских наблюдений 2015 г. На нижней панели нанесен коэффициент жесткости, рассчитанный как отношение скоростей счета (16–25 кэВ) / (25–60 кэВ).

    Рис. 3.

    Кривые скорости счета HXD / PIN в полосе 16–25 кэВ (верхняя панель) и полосе 25–60 кэВ (средняя панель) для мартовского наблюдения 2015 г. На нижней панели нанесен коэффициент жесткости, рассчитанный как отношение скоростей счета (16–25 кэВ) / (25–60 кэВ).

    В следующих анализах, чтобы изучить временную эволюцию профилей спинов и спектральных форм, мы разделили данные за март 2015 г. на шесть равноудаленных временных интервалов 57320 с (∼0,68 суток), каждый из которых имеет эффективную экспозицию XIS ∼30 тыс. от Эпохи 0 до Эпохи 5.Время начала Эпохи 0 было установлено во время первого хорошего временного интервала XIS (2015-03-05 18: 55: 48.7 UTC; MJD 57086.78954). В течение наблюдений 2009 и 2014 гг. GK Per не демонстрировали значительной изменчивости во времени, поэтому мы проанализировали их данные без разделения на более короткие временные эпохи для получения статистически значимых наборов данных.

    3.1.2 Профили вращения

    Используя данные XIS за март 2015 г., мы сгенерировали спектр мощности и периодограмму и получили период вращения WD P WD = 351.4 ± 0,5 с. На основании этого из данных XIS и HXD / PIN были извлечены кривые блеска с разрезом по энергии, полученные из данных XIS и HXD / PIN для каждой временной эпохи, как показано на рис. 4. В процессе свертывания эпоха фазы 0 была установлена ​​на 2015-03- 05 00:00:00 UTC (MJD 57086.0) и предполагалось, что период вращения составляет 351,4 с. Таблица 2 суммирует среднюю скорость счета и коэффициент модуляции, рассчитанные как полную амплитуду, деленную на среднюю скорость счета.

    Рис. 4.

    Временная эволюция спин-свернутых кривых блеска мартовских данных 2015 г. в трех диапазонах энергий; 0.5–2, 2–10 и 16–60 кэВ в левом, среднем и правом столбцах соответственно. Сверху вниз шесть панелей в каждом столбце представляют кривые блеска для эпох 0–5. На каждой панели абсцисса охватывает две фазы вращения для лучшей видимости.

    Рис. 4.

    Временная эволюция спин-свернутых кривых блеска мартовских данных 2015 г. в трех диапазонах энергий; 0,5–2, 2–10 и 16–60 кэВ в левом, среднем и правом столбцах соответственно. Сверху вниз шесть панелей в каждом столбце представляют кривые блеска для эпох 0–5.На каждой панели абсцисса охватывает две фазы вращения для лучшей видимости.

    Таблица 2.

    Средняя скорость счета и фактор модуляции спин-свернутых кривых блеска мартовской вспышки 2015 г. Для сравнения приведены также средние скорости счета по данным 2009 и 2014 гг.

    9066 907 907 907 907 0,00 68766 ± 3,767 ± 3,7 195 ± 0,010 920 ± 0,008
    . 0,5–2 кэВ . . 2–10 кэВ . . 16–60 кэВ .
    . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b .
    2009 0,104 ± 0,002 0,151 ± 0,002 Н / Д 0,1 0,730 ± 0,002 НЕТ c
    2015
    Эпоха 0 0.232 ± 0,003 44,8 ± 3,9 1,155 ± 0,006 25,3 ± 2,5 0,133 ± 0,004 74,3 ± 12,5
    Эпоха 1 2,188 ± 0,009 29,4 ± 1,9 0,335 ± 0,006 57,8 ± 6,8
    Эпоха 2 0,252 ± 0,003 42,7 ± 3,8 23,7 ± 1,5 0,624 ± 0,007 31,7 ± 4,3
    Эпоха 3 0,311 ± 0,003 53,5 ± 3,5 24767 ± 3,653 0,805 ± 0,007 40,0 ± 3,7
    Эпоха 4 0,152 ± 0,002 62,3 ± 4,6 3,404 ± 0,011 30,0 ± 1,5 38,9 ± 3,6
    Эпоха 5 0,189 ± 0,002 64,8 ± 4,2 3,583 ± 0,011 38,9 ± 1,4 ± 0,968 ± 1,4 ± 0,968 ± 0,007
    9066 907 907 907 907 0,00 68766 ± 3,767 ± 3,7 195 ± 0,010 920 ± 0,008
    . 0,5–2 кэВ . . 2–10 кэВ . . 16–60 кэВ .
    . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b .
    2009 0,104 ± 0,002 0,151 ± 0,002 Н / Д 0,1 0,730 ± 0,002 НЕТ c
    2015
    Эпоха 0 0.232 ± 0,003 44,8 ± 3,9 1,155 ± 0,006 25,3 ± 2,5 0,133 ± 0,004 74,3 ± 12,5
    Эпоха 1 2,188 ± 0,009 29,4 ± 1,9 0,335 ± 0,006 57,8 ± 6,8
    Эпоха 2 0,252 ± 0,003 42,7 ± 3,8 23,7 ± 1,5 0,624 ± 0,007 31,7 ± 4,3
    Эпоха 3 0,311 ± 0,003 53,5 ± 3,5 24767 ± 3,653 0,805 ± 0,007 40,0 ± 3,7
    Эпоха 4 0,152 ± 0,002 62,3 ± 4,6 3,404 ± 0,011 30,0 ± 1,5 38,9 ± 3,6
    Эпоха 5 0,189 ± 0,002 64,8 ± 4,2 3,583 ± 0,011 38,9 ± 1,4 ± 0,968 ± 1,4 ± 0,968 ± 8
    Таблица 2.

    Средняя скорость счета и коэффициент модуляции спин-свернутых кривых блеска мартовской вспышки 2015 г. Для сравнения приведены также средние скорости счета по данным 2009 и 2014 гг.

    0,007 653 ± 0,012

    66 907 3,407 1,5

    968 ± 0,008
    . 0,5–2 кэВ . . 2–10 кэВ . . 16–60 кэВ .
    . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b .
    2009 0,104 ± 0,002 0,151 ± 0,002 N / A 0,1 0.730 ± 0,002 НЕТ c
    2015 907 907 907 907 0,232 ± 0,003 44,8 ± 3,9 1,155 ± 0,006 25,3 ± 2,5 0,133 ± 0,004 74,3 ± 12,5
    Эпоха 1 0.302 ± 0,003 68,8 ± 3,7 2,188 ± 0,009 29,4 ± 1,9 0,335 ± 0,006 57,8 ± 6,8
    Эпоха 2 ± 0,252 3,195 ± 0,010 23,7 ± 1,5 0,624 ± 0,007 31,7 ± 4,3
    Эпоха 3 0,311 ± 0,003 53,5 ± 3,5 24,3 ± 1,5 0,805 ± 0,007 40,0 ± 3,7
    Эпоха 4 0,152 ± 0,002 62,3 ± 4,6 0,920 ± 0,008 38,9 ± 3,6
    Эпоха 5 0,189 ± 0,002 64,8 ± 4,2 3,583 ± 0,011 38,9 ± 1,4 41,2 ± 3,5
    0,00766 311 ± 0,003 0,00 902 583 ± 0,011
    . 0,5–2 кэВ . . 2–10 кэВ . . 16–60 кэВ .
    . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b . . Среднее значение a . MF b .
    2009 0,104 ± 0,002 0,151 ± 0,002 Н / Д
    162 ± 0,001 0,730 ± 0,002 НЕТ c
    2015 9066 907 907
    Эпоха 0 0,232 ± 0,003 44,8 ± 3,9 1,155 ± 0,006 25,3 ± 2,5 0.133 ± 0,004 74,3 ± 12,5
    Эпоха 1 0,302 ± 0,003 68,8 ± 3,7 2,188 ± 0,009 29,4 ± 1,9 ± 1,9
    Эпоха 2 0,252 ± 0,003 42,7 ± 3,8 3,195 ± 0,010 23,7 ± 1,5 0,624 ± 0,007 31,7 ± 4,3
    53,5 ± 3,5 3,653 ± 0,012 24,3 ± 1,5 0,805 ± 0,007 40,0 ± 3,7
    Эпоха 4 ± 0,152 3,404 ± 0,011 30,0 ± 1,5 0,920 ± 0,008 38,9 ± 3,6
    Эпоха 5 0,189 ± 0,002 64,8 ± 4,2 3 38,9 ± 1,4 0,968 ± 0,008 41,2 ± 3,5

    На рисунке видна сложная временная эволюция профилей спина; например, фаза минимума спина сдвигается от фазы 0,2–0,3 в эпохах 0–2 до 0,6–0,7 в эпохах 4–5, а форма импульса существенно меняется от эпохи к эпохе. Как сообщалось ранее для состояния вспышки (Watson et al. 1985; Norton, Watson & King 1988; Evans et al. 2009), общий профиль импульса становится пиковым, особенно в более поздние эпохи.Во все эпохи коэффициенты модуляции в мягком диапазоне выше, чем в жестком диапазоне. Кривая блеска в жестких рентгеновских лучах также модулируется с коэффициентом модуляции ~ 40% (или отношением минимум / максимум ~ 0,7) во вспышке.

    3.2 Спектральный анализ

    3.2.1 Спектральная эволюция в мягкой энергетической полосе

    На рис. 5 сравниваются средние по времени спектры трех наблюдений. Очевидно, что во вспышке источник имеет большую яркость, чем в состоянии покоя, показывая увеличение примерно на два порядка по сравнению с февралем 2009 г. при> 7 кэВ.Однако среди состояний покоя зарегистрированные потоки различаются более чем в 5 раз (см. Потоки 2–10 кэВ в Таблице 3), что подразумевает временные колебания темпа аккреции массы даже во время покоя. На основании масштабированных по интенсивности спектров справа на рис. 5 видно, что основное спектральное изменение наблюдается ниже 4 кэВ, а выше комплекса линии Fe K (> 7 кэВ) спектры хорошо перекрывают друг друга.

    Рис. 5.

    Слева: усредненные по времени XIS-спектры трех наблюдений; зеленый, оранжевый и темно-серый спектры соответствуют наблюдениям в феврале 2009 г., августе 2014 г. и марте 2015 г. соответственно.Ордината показана после масштабирования количества единиц XIS, задействованных в каждом наблюдении. Справа: те же спектры, что и на левой панели, но вертикально масштабированные для согласования друг с другом скорости счета в полосе 7–10 кэВ; масштабные коэффициенты равны 1, 0,15 и 0,06 для спектров февраля 2009 г., августа 2014 г. и марта 2015 г. соответственно.

    Рис. 5.

    Слева: усредненные по времени XIS-спектры трех наблюдений; зеленый, оранжевый и темно-серый спектры соответствуют наблюдениям в феврале 2009 г., августе 2014 г. и марте 2015 г. соответственно.Ордината показана после масштабирования количества единиц XIS, задействованных в каждом наблюдении. Справа: те же спектры, что и на левой панели, но вертикально масштабированные для согласования друг с другом скорости счета в полосе 7–10 кэВ; масштабные коэффициенты равны 1, 0,15 и 0,06 для спектров февраля 2009 г., августа 2014 г. и марта 2015 г. соответственно.

    Таблица 3.

    Эмпирическое спектральное моделирование континуума 2–10 кэВ с использованием континуума тормозного излучения и трех гауссовых компонент.2 _ {\ nu} $ | (N.D.F.) d .

    . 10 22 см −2 . 10 22 см −2 . кэВ . . 2–10 кэВ . 7,2–10 кэВ . .
    2009 | 0 руб.{+0.04} _ {- 0.04} $ | 16,4 6,46 1,10 (424)
    . N H . N PC H a . кТ . C.F. б . Флюс c .2 _ {\ nu} $ | (N.D.F.) d .
    . 10 22 см −2 . 10 22 см −2 . кэВ . . 2–10 кэВ . 7,2–10 кэВ . .
    2009 | 0 руб.{+0.04} _ {- 0.04} $ | 16,4 6,46 1,10 (424)
    Таблица 3.

    Эмпирическое спектральное моделирование континуума 2–10 кэВ с использованием континуума тормозного излучения и трех гауссовых компонент.

    . N H . N PC H a . кТ .2 _ {\ nu} $ | (N.D.F.) d .
    . 10 22 см −2 . 10 22 см −2 . кэВ . . 2–10 кэВ . 7,2–10 кэВ . .
    2009 | 0 руб.{+0.04} _ {- 0.04} $ | 16,4 6,46 1,10 (424)
    . N H . N PC H a . кТ . C.F. б . Флюс c .2 _ {\ nu} $ | (N.D.F.) d .
    . 10 22 см −2 . 10 22 см −2 . кэВ . . 2–10 кэВ . 7,2–10 кэВ . .
    2009 | 0 руб.{+0.04} _ {- 0.04} $ | 16,4 6,46 1,10 (424)

    Для данных о вспышках мы также извлекли спектры с временным разрешением для шести эпох, как показано на рис. 6. Форма и нормализация черного спектра ( Эпоха 0) почти совпадает со средним по времени спектром за август 2014 г. Исходя из этого, мы считаем, что источник находился в состоянии покоя в Эпоху 0, а затем произошел переход к вспышке карликовой новой в Эпоху 1, когда наблюдалось устойчивое увеличение скоростей счета 2–10 кэВ и 16–60 кэВ. наблюдается (рис. 2 и 3).На правой панели рис. 6 представлены масштабированные по интенсивности спектры отдельных эпох. По мере того как вспышка карликовой новой продолжается, количество фотонов мягкого рентгеновского излучения ниже ∼4 кэВ резко уменьшается. Это твердое указание на увеличение плотности абсорбционного столба во время вспышки.

    Рис. 6.

    Слева: XIS-спектры отдельных эпох мартовского наблюдения 2015 г. Справа: те же спектры, что и на левой панели, но вертикально масштабированные для согласования друг с другом скорости счета в полосе 7–10 кэВ; коэффициенты масштабирования 1, 0.48, 0,29, 0,24, 0,23 и 0,23 для эпох 0–5 соответственно.

    Рис. 6.

    Слева: XIS-спектры отдельных эпох мартовского наблюдения 2015 г. Справа: те же спектры, что и на левой панели, но вертикально масштабированные для согласования друг с другом скорости счета в полосе 7–10 кэВ; масштабные коэффициенты равны 1, 0,48, 0,29, 0,24, 0,23 и 0,23 для эпох 0–5 соответственно.

    В фазе вспышки, например, в наиболее поглощаемом спектре Эпохи 5, мы обнаружили 0,027 ± 0,001 отсчета с −1 в диапазоне 0.5–1 кэВ, и эта скорость в два или три раза выше, чем ожидалось от сильно ( N H > 10 22 см −2 ) поглощенной эмиссии плазмы после удара (т. Е. Экстраполяция E > 2 кэВ, излучение в нижнюю энергетическую зону). Основываясь на предыдущих результатах наблюдений за решеткой (Vrielmann et al. 2005), мы считаем, что это излучение в основном представляет собой сумму линейных излучений, происхождение которых точно не установлено. Детальное спектральное моделирование этого излучения очень сложно из-за ограниченного энергетического разрешения XIS; мы пытались подогнать этот компонент с несколькими гауссовыми компонентами или феноменологическим континуумом, представленным эмиссией черного тела, но приемлемого соответствия не было получено.Поэтому в следующих спектральных подгонках мы игнорируем энергии ниже 2 кэВ, чтобы избежать осложнений, вызванных этим мягким излучением.

    3.2.2 Плотность абсорбционной колонки

    Как видно из рисунков 5 и 6, поглощение фотонов мягкого рентгеновского излучения сильно варьируется даже в состоянии покоя и, очевидно, во время вспышки. Считается, что поглощение в основном присуще GK Per, вызванному аккрецирующим холодным газом до ударной волны, а не межзвездной средой. Чтобы исследовать увеличение плотности столбца поглощения, мы аппроксимировали спектры XIS, используя феноменологическую модель, состоящую из континуума тормозного излучения, подверженного поглощению.{-2} $ | (Эпоха 4). Поток 7,2–10 кэВ увеличивается в ∼4,8 раза; от 1,35 (эпоха 0) до 6,46 × 10 −11 эрг см −2 с −1 (эпоха 5). Более высокие плотности столбцов частичного покрытия ∼13–16 × 10 22 см –2 были получены в более поздние эпохи, и мы считаем, что спиновая модуляция лучевой плотности столба этого плотного поглотителя создает жесткое рентгеновское излучение. модуляция, обнаруженная HXD (рис. 4). Хотя номиналы температуры тормозного излучения колеблются от | $ 19.{+20.8} _ {- 14.5} $ | кэВ (Эпоха 1, март 2015 г.), это не считается реальным изменением, потому что температуры не могут быть точно определены только по данным XIS, когда тепловое излучение имеет температуру выше кТл ∼ 10 кэВ (см. раздел 3.2.4).

    3.2.3 Fe K α-линии

    Чтобы изучить возможную изменчивость во времени интенсивностей линий Fe Kα, мы также аппроксимировали узкополосные спектры 4–9 кэВ, используя эмпирическую модель, состоящую из степенного континуума и трех гауссиан, все подверженных однократному поглощению.Энергия центроидов и ширина трех линий были зафиксированы на канонических значениях (6,40, 6,65 и 6,97 кэВ) и 0 (т.е. без уширения), соответственно, чтобы лучше ограничить эквивалентные ширины. Наиболее подходящие модельные функции показаны на рис. 7 вместе с данными. Посадки были в целом приемлемыми, и мы получили эквивалентную ширину линий, как указано в таблице 4 и нанесено на график на рис. 8.

    Рис. 7. Линия

    Fe K соответствует трем гауссовым компонентам и степенному континууму (верхняя панель).Для лучшей наглядности остатки аппроксимации для эпох 0–2 и 3–5 отдельно нанесены на среднюю и нижнюю панели соответственно. Цветовая кодировка такая же, как на рис. 6.

    Рис. 7.

    Fe K линия соответствует трем гауссовым компонентам и степенному континууму (верхняя панель). Для лучшей наглядности остатки аппроксимации для эпох 0–2 и 3–5 отдельно нанесены на среднюю и нижнюю панели соответственно. Цветовая кодировка такая же, как на рис. 6.

    Рисунок 8.

    Эквивалентная ширина линии Fe K, полученная с помощью подгонки эмпирической модели. Эквивалентные ширины флуоресцентных, He-подобных и H-подобных линий Fe K α представлены черным, красным и зеленым цветом соответственно. E0 – E5 обозначает эпоху 0–5 мартовского наблюдения 2015 г.

    Рис. 8.

    Эквивалентная ширина линии Fe K, полученная с помощью подгонки эмпирической модели. Эквивалентные ширины флуоресцентных, He-подобных и H-подобных линий Fe K α представлены черным, красным и зеленым цветом соответственно. E0 – E5 обозначает эпоху 0–5 мартовского наблюдения 2015 г.{+10} _ {- 9} $ |

    Флуоресцентная линия Fe Kα увеличила свою эквивалентную ширину с ∼80 эВ в состоянии покоя до ∼140 эВ во вспышке. Эквивалентная ширина линий He-подобного и H-подобного Fe K α находится в диапазоне 30–50 эВ и согласуется с постоянством во всем текущем наборе данных; это качественно согласуется с тем фактом, что форма непрерывного спектра в диапазоне 7–10 кэВ очень похожа во всех наборах данных (рис. 5 и 6), что указывает на небольшое изменение температуры плазмы.

    3.2.4 Спектры жесткого рентгеновского излучения

    Чтобы охарактеризовать спектр жесткой полосы во время перехода к состоянию вспышки, мы извлекли разделенные по эпохам HXD / PIN-спектры и использовали две феноменологические модели; (1) степенная модель и (2) модель теплового тормозного излучения. Диапазон подгонки был выбран равным 16–60 кэВ (такой же, как диапазон энергии извлечения кривой блеска). Извлеченные спектры и наиболее подходящие модельные функции показаны на рисунке 9, а наиболее подходящие параметры перечислены в таблице 5.{+15.5} _ {- 8.5} $ | кэВ. Это еще один результат, подтверждающий неизменность собственной формы спектра излучения из области аккреции после ударной волны на протяжении всего периода покоя и ранней фазы вспышки. В Эпохе 0 очевидное отклонение данных и наиболее подходящая модельная кривая в диапазоне 40–60 кэВ заметно на рис. 9. Это превышение нельзя объяснить только неточным моделированием фона, как можно было бы подумать, потому что даже в Эпохе 0 (состояние покоя), скорость счета в полосе 40–60 кэВ (0.01 counts s −1 ) на порядок выше, чем точность модели фона в том же диапазоне энергий. Хотя мы не полностью понимаем происхождение избытка, исключение энергетической полосы из подгонки приводит к аналогичным параметрам наилучшего подбора, перечисленным в Таблице 5, и поэтому мы оставляем избыток, как есть в настоящем анализе.

    Рис. 9.

    Верхняя панель: разделенные по времени HXD / PIN-спектры GK Per, полученные в третьем наблюдении.Крестики — это сигналы с вычитанием фона, а сплошные линии — наиболее подходящие функции модели тормозного излучения. Нижняя панель: соответствие остатка с точки зрения χ (модель данных, разделенная на статистическую ошибку).

    Рис. 9.

    Верхняя панель: разделенные по времени HXD / PIN-спектры GK Per, полученные в третьем наблюдении. Крестики — это сигналы с вычитанием фона, а сплошные линии — наиболее подходящие функции модели тормозного излучения. Нижняя панель: соответствие остатка с точки зрения χ (модель данных, разделенная на статистическую ошибку).

    Таблица 5. Результат спектральной аппроксимации

    HXD / PIN данных за март 2015 г. с использованием степенной модели или модели тормозного излучения.

    . Параметр .
    . Степенной закон . . тормозное излучение .
    Эпоха . Γ a .{+1.5} _ {- 1.4} $ | 1,13 (84) 4,81
    Таблица 5. Результат спектральной аппроксимации

    HXD / PIN данных за март 2015 г. с использованием степенной модели или модели тормозного излучения.

    . Параметр .
    . Степенной закон . . тормозное излучение .
    Эпоха .{+1.5} _ {- 1.4} $ | 1,13 (84) 4,81
    3.2.5 Широкополосная спектральная интерпретация

    Мы также аппроксимировали широкополосные комбинированные спектры XIS и HXD / PIN в диапазоне 2–60 кэВ. Широкополосная модель состоит из модели эмиссии плазмы изобарного охлаждающего потока (разработанной для исследования скоплений галактик; Mushotzky & Szymkowiak 1988), подверженной фотопоглощению в одну колонку и фотопоглощению с частичным покрытием для имитации многоколоночного поглощения (Done & Magdziarz 1998). и спиновая модуляция плотности столбца.Отражение от недавно образовавшегося материала на поверхности WD моделируется с использованием модели свертки отражения Magdziarz & Zdziarski (1995). Гауссиан используется для моделирования флуоресцентной линии Fe K α, излучаемой отражением. Составная модель может быть обозначена в xspec как phabs × pcfabs × (отражать × mkcflow + gaus). Модель охлаждающего потока является хорошим приближением к рентгеновскому излучению из области аккреции промежуточных поляров после ударной волны (Hayashi et al. 2011; Mukai et al. 2015), и в настоящем анализе мы использовали модель, нацеленную на при оценке возможного изменения максимальной температуры в постшоковой аккреционной области.Площадь покрытия отражателя относительно облучателя (т. Е. Горячая плазма в зоне аккреции после ударной волны) и относительная нормализация отражения фиксируются на 2π и 1 соответственно, предполагая, что высота ударной волны намного меньше, чем радиус WD (для например, см. Yuasa et al. 2010). Поскольку в настоящих данных отражения, зависящие от угла, почти не обнаруживались, мы предварительно зафиксировали угол отражения или угол между нормалью отражающей поверхности и линией взгляда на значении по умолчанию cos μ = 0.45. Содержание железа в модели охлаждающего потока и модели отражения связано и может свободно изменяться.

    Спектры отдельных эпох были подобраны отдельно, и наилучшие результаты были получены, как показано на рис. 10. Таблица 6 суммирует наиболее подходящие параметры. Подборки обычно хорошие с вероятностями нулевой гипотезы, превышающими 1%, за исключением Эпохи 5 (0,1%). Общая плотность абсорбционного столбца, первый столбец таблицы 6, почти соответствует значениям, полученным при подгонке только для XIS (таблица 3) в пределах статистических ошибок подгонки, и тенденция увеличения с течением времени является общей для двух моделей.Кажущееся увеличение доли покрытия может указывать на более частое затемнение плазмы после ударной волны холодным газом до удара в более поздних фазах вспышки. Номинальные значения наивысшей температуры модели охлаждающего потока увеличиваются от Эпохи 0 до Эпохи 2 и согласуются с постоянством (в пределах ошибок) в Эпохах 2–5.

    Рис. 10.

    Результат широкополосной подгонки для эпох 0–5 мартовских данных 2015 года. Цветовая кодировка такая же, как на рис.6. На верхней панели показаны данные и наиболее подходящие модели, при этом каждый набор данных сдвинут вверх с шагом в 2 раза для лучшей наглядности. На средней и нижней панелях показаны остатки соответствий для эпох 0–2 и эпох 3–5, соответственно.

    Рис. 10.

    Результат широкополосной подгонки для эпох 0–5 мартовских данных 2015 года. Цветовая кодировка такая же, как на рис. 6. На верхней панели показаны данные и наиболее подходящие модели с каждым набором данных, сдвинутым вверх с шагом в 2 раза для лучшей видимости.На средней и нижней панелях показаны остатки соответствий для эпох 0–2 и эпох 3–5, соответственно.

    Таблица 6.

    Результат широкополосной спектральной аппроксимации с использованием модели частично поглощенного многотемпературного излучения, соединенной с моделью отражения.

    Эпоха . N H a . N PC H b .{+0.02} _ {- 0.02} $ | 1,10 (2056)
    Эпоха . N H a . N PC H b . C.F. с . kT макс d . Z Fe e .{+0.02} _ {- 0.02} $ | 1,10 (2056)
    Таблица 6.

    Результат широкополосной спектральной аппроксимации с использованием модели частично поглощенного многотемпературного излучения, свернутой с моделью отражения.

    Эпоха . N H a . N PC H b . C.F. с .{+0.02} _ {- 0.02} $ | 1,10 (2056)
    Эпоха . N H a . N PC H b . C.F. с . kT макс d . Z Fe e .{+0.02} _ {- 0.02} $ | 1,10 (2056)

    Максимальная температура, сообщаемая моделью охлаждающего потока, обычно выше, чем температура, полученная с помощью тормозного фитинга только с PIN-кодом (Таблица 5) в каждую эпоху. Это ожидаемый результат, потому что модель тормозного излучения обеспечивает только репрезентативную температуру, которая имитирует спектр из области после удара, которая имеет градиент излучательной способности, взвешенную по более низкой температурной составляющей, которая имеет более высокую излучательную способность (из-за повышенной плотности) и статистику фотонов.{+3.5} _ {- 2.8} $ | кэВ для эпох 0 и 5 соответственно.

    4 ОБСУЖДЕНИЕ

    4.1 Геометрия аккреции в состоянии покоя и вспышки

    Широкополосное спектральное моделирование во вспышке показало, что максимальная температура плазмы в области аккреции после ударной волны практически постоянна, в то время как поток жесткого рентгеновского излучения увеличивался в ∼6–7 раз от Эпохи 0 к Эпохе 5 (Таблицы 3 и 6). За тот же период плотность абсорбционной колонки увеличилась примерно в три раза (таблица 6).Мы считаем, что это увеличение отражает повышенную скорость аккреции массы, и в настоящем обсуждении мы принимаем коэффициент увеличения потока как репрезентативный для скорости массопереноса, потому что плотность столба прямой видимости может не иметь линейной зависимости от фактического увеличения массы. скорость из-за геометрического эффекта (например, Vrielmann et al. 2005). Поэтому предполагается, что в Эпоху 5 произошло примерно в 6-7 раз больше массопереноса, чем в Эпоху 0.

    В магнитных CV предполагается, что аккрецирующая материя преобразуется в аккреционную аккрецию с магнитными каналами от аккреционного диска на радиусе где магнитное давление уравновешивает давление газа.{-2/7} $ | ⁠. Поскольку в текущий период наблюдения | $ \ dot {m} $ | увеличивается в 6–7 раз, и с использованием этого масштабирования радиус магнитосферы в состоянии покоя ( R A, qui ) и вспышке ( R A, из ) можно связать как R A , из ∼ 0,6 R A, qui .

    Если мы предположим, что масса WD составляет M WD = 0,87 M (Моралес-Руеда и др., 2002) и что радиус покоящейся магнитосферы должен соответствовать радиусу совместного вращения | $ R_ \ mathrm { А, qui} = R_ \ Omega = 11.{\ mathrm {qui}} _ \ mathrm {max}. \ end {eqnarray *}

    Эта разница относительно мала по сравнению с ~ 10% статистических ошибок подгонки, связанных с максимальной температурой, полученной из широкополосной подгонки (таблица 6), и поэтому трудно окончательно обсудить возможность изменение максимальной температуры во времени из-за уменьшения внутреннего радиуса диска. Однако, исходя из того, что номиналы максимальной температуры не уменьшаются монотонно на протяжении эпох, можно считать, что во время наблюдения Suzaku , охватывающего примерно три дня после начала вспышки, внутренний радиус диска был довольно большим. стабильна на том же радиусе, что и R, , A, qui , и, вероятно, медленно переходит к новому равновесному радиусу при увеличении темпа прироста массы.В предыдущем наблюдении за вспышкой XY Ari, Hellier, Mukai & Beardmore (1997) утверждали, что переход внутреннего края диска с ∼9 R WD на ∼4 R WD произошел примерно за 1 день на основе Учитывая, что внутренний диск, который подошел к WD, закрыл вид на нижний полюс аккреции, что привело к большой (∼ × 10) амплитуде импульса во вспышке. Hellier, Harmer & Beardmore (2004) упомянули возможность подобной «блокировки полюса аккреции диском» для вспышки GK Per.Однако, по крайней мере, во время ранней вспышки (1–3 дня от начала), наш результат предполагает, что радиус внутреннего края диска довольно постоянен, а синусоидальная модуляция, наблюдаемая во вспышке, вызвана исключительно затемнением из-за нарастания пре- ударный газ.

    4.2 Форма линии флуоресценции Fe

    Красная крыловидная структура, умеренно обнаруженная и описанная Hellier & Mukai (2004) с использованием данных Chandra HETG во вспышке, представляет собой интересную тему, касающуюся линии флуоресценции Fe.Авторы считали, что красное крыло могло быть линией флуоресценции Fe с доплеровским смещением, испускаемой предварительно поглощающим ударный поток газом, движущимся со скоростями, близкими к скорости свободного падения (несколько раз 1000 км с −1 ; см. Также Hayashi et al.2011 для аналогичного исследования в V1223 Sgr).

    В настоящем исследовании, однако, линия флуоресценции Fe, измеренная с помощью XIS, может быть объяснена одним гауссианом без какого-либо уширения или смещения центроидов (раздел 3.2.3). Обнаружить указанную структуру, если она существует, будет сложно из-за ухудшенного энергетического разрешения ПЗС (FWHM ∼ 200 эВ в 2015 г.).В ближайшем будущем рентгеновский микрокалориметр ASTRO-H позволит нам детально измерить форму линии с энергетическим разрешением FHWM ∼ 5 эВ и отделить доплеровский сдвинутый компонент от линии флуоресценции от WD. поверхность. Если интерпретация отражения от газа перед ударом подтверждена, доплеровское измерение обеспечит еще одно сильное ограничение на геометрию аккреции во вспышке.

    5 ВЫВОДЫ

    • Suzaku по счастливой случайности наблюдал начало вспышки карликовой новой промежуточной полярной GK Per в марте 2015 года.Во второй части наблюдения поток достигал примерно 50% от максимума нынешней вспышки (раздел 2).

    • Период вращения WD 351,4 ± 0,5 с был четко обнаружен во вспышке, и сигналы жесткого рентгеновского излучения с энергией выше 16 кэВ также были модулированы в тот же период (раздел 3.1.2), что указывает на поглощение плотным затемнителем с N H > 10 23 см -2 .

    • Интенсивность флуоресцентной линии Fe K увеличилась с ∼80 эВ до ∼140 эВ после начала вспышки (Раздел 3.2.3).

    • Подгонка многотемпературной спектральной модели к временным широкополосным спектрам в диапазоне 2–60 кэВ не показала значительного изменения максимальной температуры постударного аккрецирующего потока во вспышке (раздел 3.2.5). Это может означать, что, хотя темп аккреции массы увеличился в ∼6–7 раз по сравнению с периодом покоя, внутренний радиус аккреционного диска мало изменился во время наблюдения до ∼3 суток после начала вспышки.

    Авторы высоко оценивают операционную группу Suzaku , которая сделала возможным это исследование.Мы также подтверждаем использование общедоступных данных из архива данных Swift. TY поддерживается специальной программой постдокторантов в RIKEN. Работа частично поддержана грантом JSPS KAKENHI № 15K17668.

    ССЫЛКИ

    2002

    Сила аккреции в астрофизике

    3-е изд.

    Кембриджского унив. Нажмите

    Кембридж

    и другие.

    2009

    PASJ

    61

    17

    и другие.

    2007

    PASJ

    59

    53

    и другие.

    2013

    ApJS

    209

    14

    1988

    НАТО Adv. Sci. Inst. Сер. C Vol. 229, Структура эллиптических галактик

    Kluwer

    Дордрехт

    53

    и другие.

    2007

    PASJ

    59

    35

    1995

    Cambridge Astrophys.Сер., Т. 28, Cataclysmic Variable Stars

    Cambridge Univ. Нажмите

    Кембридж

    2015

    Astron. Телеграмма

    7217

    1

    © 2016 Авторы, опубликованные издательством Oxford University Press от имени Королевского астрономического общества

    miR-191 и miR-135 необходимы для длительного ремоделирования позвоночника, связанного с синаптической долговременной депрессией

    Изменения транскриптома miRNA во время NMDAR-LTD

    Чтобы определить, участвуют ли miRNA в ремоделировании позвоночника, связанном с LTD, мы впервые применили глубокое секвенирование следующего поколения для систематического изучения изменения экспрессии miRNA после индукции NMDAR-LTD в гиппокампе мыши.Для индукции LTD срезы гиппокампа мышей (возраст 17-19 дней) обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин). Лечение NMDA вызывает «химический LTD», который имеет общие молекулярные механизмы с LTD, индуцированный электростимуляцией, и вызывает длительную синаптическую депрессию и потерю позвоночника в большинстве синапсов среза 13,25,26 . В соответствии с опубликованными исследованиями, после лечения NMDA мы наблюдали стойкое снижение полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов (fEPSP) нейронов CA1 (среднее ± s.e.m: 20,3 ± 4.0% от исходного уровня через 10 минут, 55,4 ± 5,4% от исходного уровня через 90 минут, 62,3 ± 5,6% от исходного уровня через 2 часа после стимуляции; n = 10 срезов для каждой группы; Дополнительный рис. 1).

    Через 90 мин после индукции LTD область CA1 удаляли для экстракции РНК и подготовки библиотек секвенирования miRNA. Всего было секвенировано восемь библиотек (четыре контрольных, обработанных NMDA и четыре ложно обработанных), с использованием анализатора Illumina GAII. В среднем из каждой библиотеки было произведено 0,92 миллиона операций чтения, 52.65% из них были картированы в зрелые миРНК. Из общего количества 3660602 картированных прочтений было идентифицировано 438 зрелых миРНК (рис. 1a, b). Количество miRNAs, обнаруженных с помощью нашего глубокого секвенирования, согласуется с предыдущими сообщениями о том, что ~ 300 miRNAs экспрессируются в головном мозге грызунов 17,27 .

    Рисунок 1: Изменение транскриптомов miRNA в гиппокампе после индукции LTD.

    Срезы гиппокампа получали от мышей (возраст 17-19 дней), подвергнутых фиктивной обработке или обработанных NMDA (30 мкМ, 5 мин) для индукции химической LTD.miRNA выделяли через 90 мин после обработки NMDA для глубокого секвенирования ( a , b ) или qRT-PCR ( c ). ( a ) Кратное изменение (шкала log2) каждого вида miRNA наносится на график против его нормализованного числа считывания (шкала log2). ( b ) Значение P (шкала log10) каждого вида miRNA наносят на график в зависимости от его кратного изменения (шкала log2). ( c ) Анализ экспрессии миРНК с помощью qRT-PCR. n = 4–10 экспериментов для каждой миРНК. В a и b миРНК со значениями P <0.05 представлены темными кругами. В c данные представлены как среднее ± s.e.m .; Для статистического анализа используется критерий Манна – Уитни U ; * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,005.

    Кратность изменения и P -значение индивидуальных miRNAs проиллюстрированы на рис. 1. Кратность изменений не зависит от количества экспрессионных тегов (рис. 1a), указывая тем самым, что наше глубокое секвенирование не было предвзятым на изобилие miRNA. Значение P было вычислено путем управления частотой ложного обнаружения (FDR) для проверки множественных гипотез 28 и пороговым значением для P , равным 0.05 применяли для отбора дифференциально экспрессируемых miRNA (рис. 1b). В общей сложности 70 miRNAs были изменены в экспрессии после индукции LTD (34 с положительной регуляцией, 36 с отрицательной регуляцией; фиг. 1a, b).

    Чтобы подтвердить результат глубокого секвенирования с помощью независимого анализа и подготовки, мы измерили изменение экспрессии нескольких miRNA в культивируемых нейронах гиппокампа с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Нейроны (DIV17) обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) и собирали через 90 мин после стимуляции для выделения РНК и qRT-PCR.Экспрессия miR-191 снизилась, miR-106b, miR-135b, miR-136-3p, miR-19a, miR-19b и miR-466b увеличилась, а экспрессия miR-218, miR-29a и miR- 32 оставался неизменным после обработки NMDA (рис. 1c). Уровень экспрессии miR-135a незначительно увеличился, но не до статистически значимого уровня ( P = 1,00). Эти результаты qRT-PCR в значительной степени согласуются с нашими выводами с использованием глубокого секвенирования.

    Взятые вместе, эти результаты показывают, что после индукции LTD транскриптом miRNA существенно изменяется, предполагая, что miRNAs могут играть роль в структурной и функциональной пластичности синапсов.

    Гены и клеточные процессы, на которые нацелены измененные miRNA

    miRNA, осуществляют свои клеточные функции в основном за счет регуляции трансляции мРНК. Каждый тип miRNA потенциально может регулировать сотни транскриптов мРНК, и в большинстве случаев одна мРНК является мишенью для нескольких видов miRNA. Чтобы получить полное представление о влиянии изменений транскриптома miRNA на физиологию клетки, мы провели анализ обогащения онтологии miR-ген-ген (GO) 27 для miRNAs, дифференциально экспрессируемых в LTD.Чтобы сосредоточиться на miRNA, которые, вероятно, оказывают значительное влияние на экспрессию генов, мы проанализировали только те, у которых число считываний> 30 во всех образцах. МикроРНК с повышенной и пониженной регуляцией анализировали в отдельных группах. Полные списки обогащенных генов и терминов GO показаны в дополнительных данных 1 и 2. Некоторые расширенные термины GO связаны с регуляцией синаптических функций и дендритных шипов, например, «синаптическая передача», «процесс на основе актиновых нитей», связывание с цитоскелетным белком »,« регуляция фосфорилирования »и« передача сигнала, опосредованная малой ГТФазой ».Эти термины GO вместе с соответствующими им miRNAs проиллюстрированы в Supplementary Fig. 2 и Supplementary Data 2. Наши результаты этих анализов подтверждают, что в нейронах, подвергающихся LTD, дифференциально экспрессируемые miRNAs регулируют множество различных клеточных процессов, участвующих в структурном и функциональном ремоделировании синапсов.

    miR-191 и miR-135 регулируют длительное ремоделирование позвоночника

    Чтобы изучить, как измененная экспрессия miRNA влияет на синаптическую модификацию после индукции LTD, мы провели покадровую визуализацию культивируемых нейронов гиппокампа.В этом тесте мы сосредоточились на miR-191 и miR-135, которые нацелены на гены и термины GO, участвующие в ремоделировании дендритных шипов и синаптической пластичности. Например, miR-191 нацелен на тропомодулин 2, который регулирует динамику актина, а ГО определяет «связывание с цитоскелетным белком» и «синаптическую передачу». Аналогичным образом miR-135 нацелен на комплексин-1 и -2, которые регулируют транспортировку рецепторов AMPA, а в GO термины «организация цитоскелета», «регуляция каскада MAPK» и «процесс, основанный на актиновых филаментах» (дополнительный рис.2, дополнительные данные 1 и 2) 29,30,31,32 .

    Наше глубокое секвенирование показывает, что хотя miR-191 подавляется, как miR-135a, так и miR-135b, две изоформы miR-135, нацеленные на одни и те же гены, активируются после индукции LTD. Чтобы противодействовать их изменениям в экспрессии во время LTD, мы трансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкциями, экспрессирующими губку miR-191 или miR-135, которая изолирует эндогенный miR-135a / b и увеличивает экспрессию его подтвержденных мишеней комплексинов-1 и -2 ( Дополнительные фиг. 3a, b и 4c) или антисмысловые олигонуклеотиды против miR-135a / b.Конструкцию, экспрессирующую венеру (мутант YFP) 33 , котрансфицировали для визуализации дендритных шипов. Через 3-5 дней после трансфекции нейроны обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) для индукции LTD. Для получения изображений одних и тех же шипов трансфицированных нейронов до и через 10, 30 и 90 минут после обработки NMDA использовали покадровую конфокальную микроскопию. Обработка NMDA вызвала быструю усадку шипов. Через 10 минут после стимуляции площадь позвоночника уменьшилась на 11,2 ± 3,0% (среднее ± стандартное отклонение; n = 8 клеток для группы, обработанной имитацией, n = 15 клеток для группы, обработанной NMDA; рис.2). Уменьшение размера позвоночника было прогрессивным и продолжительным. Через 90 минут после стимуляции размер шипов уменьшился на 24,5 ± 3,8% (среднее ± среднеквадратичное; n = 9 клеток для группы, получавшей имитацию, n = 16 клеток для группы, обработанной NMDA), и было увеличено количество шипов. втянут (рис. 2).

    Рисунок 2: miR-191 и miR-135 необходимы для длительной реструктуризации позвоночника, сопровождающей LTD.

    Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией Венеры отдельно или вместе с конструкцией, экспрессирующей miR-191, miR-32 или губку против miR-135a и miR-135b.Через 3-5 дней после трансфекции нейроны были визуализированы до и через 10, 30 и 90 минут после обработки. Анизомицин (20 мкМ) добавляли к раствору ванны за 10 мин до обработки NMDA (30 мкМ, 5 мин) и присутствовали на протяжении всего периода визуализации. ( a ) Типичные изображения. Желтые прямоугольники указывают дендриты на изображениях с большим увеличением. ( b ) Количественная оценка a . n = 7–16 нейронов для каждой группы. Данные представлены как среднее ± s.e.m. Тест Манна-Уитни U использовали для статистического анализа группы, получавшей NMDA и трансфицированную венерой, по сравнению с другими группами.*** P <0,005. Масштабные полосы, 20 мкм на верхнем изображении a , 5 мкм на большом увеличении изображения a .

    В клетках, трансфицированных конструкцией miR-191, конструкцией губки miR-135 или антисмысловыми олигонуклеотидами против miR-135, вызванное NMDA сокращение позвоночника через 10 мин после стимуляции было сравнимо с таковым в контрольных клетках (рис. Рис. 3в, г). Однако после этого размер шипов постепенно увеличивался, и уже через 30 минут после стимуляции их нельзя было отличить от клеток, подвергнутых ложной обработке (рис.2, дополнительный рис. 3c, d). Увеличение ретракции позвоночника также устранялось трансфекцией конструкцией miR-191, губкой miR-135 или антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135 (фиг. 2, дополнительные фиг. 3c, d).

    Мы также трансфицировали нейроны конструкцией, экспрессирующей miR-32, на экспрессию которой не влияла обработка NMDA (фиг. 1), или скремблированными олигонуклеотидами miR-135. Трансфекция конструкции miR-32 или скремблированных олигонуклеотидов не повлияла ни на размер шипов, ни на вызванное NMDA сокращение и ретракцию (рис.2, дополнительный рис. 3c, d). Кроме того, без обработки NMDA на размер и плотность дендритных шипов не влияла трансфекция конструкции miR-191, губки miR-135, антисмыслового олигонуклеотида miR-135 или конструкции miR-32 (дополнительный рис. 3e). Эти результаты предполагают, что влияние miR-191, губки miR-135 или антисмысловых олигонуклеотидов на индуцированную NMDA пластичность позвоночника не связано с неспецифическими изменениями в физиологии клеток.

    Взятые вместе, эти результаты показывают, что miR-191 ингибирует, тогда как miR-135 способствует NMDA-индуцированному втягиванию позвоночника и длительному сокращению позвоночника, и, следовательно, предполагают, что изменения их экспрессии в LTD необходимы для длительного ремоделирования позвоночника.

    Ремоделирование позвоночника в LTD зависит от трансляции

    Поскольку основной функцией miRNAs является регуляция трансляции, наши открытия miR-191 и miR-135 предполагают, что синтез белка может участвовать в модификации шипов во время LTD. Чтобы проверить эту возможность, мы проверили эффекты трансляционных ингибиторов анизомицина и эметина на индуцированное NMDA ремоделирование позвоночника. Перед обработкой NMDA в раствор нейронов, трансфицированных конструкцией, экспрессирующей венеру, добавляли анизомицин (20 мкМ) и эметин (20 мкМ).В клетках, обработанных ингибитором, размер шипов уменьшился через 10 минут после стимуляции NMDA, но через 30 и 90 минут после стимуляции он сопоставим с таковым в имитационно обработанных клетках (рис. 2, дополнительный рис. 3c, d). . Два ингибитора трансляции также отменяли индуцированное NMDA втягивание позвоночника (рис. 2, дополнительный рис. 3c, d). Напротив, ингибитор транскрипции актиномицин D (10 мкМ) не оказывал влияния на вызванное NMDA сокращение или втягивание позвоночника (дополнительный рис. 3c, d). Эти результаты показывают, что трансляция, но не транскрипция, необходима для индуцированного NMDA удаления шипа и стойкого уменьшения размера шипа.

    Тропомодулин 2 является мишенью miR-191 и активируется в LTD

    Чтобы определить, как miR-191 регулирует ремоделирование позвоночника, мы изучили его гены-мишени. Среди предсказанных мишеней miR-191 тропомодулин 2 (Tmod2) имеет два предсказанных сайта связывания miR-191 в его 3’UTR и наиболее общую оценку благоприятного контекста для распознавания miR-191 34,35 . Более того, на основе нашего анализа обогащения miR-ген-GO, некоторые термины GO, на которые нацелен Tmod2, такие как «связывание с цитоскелетным белком», тесно связаны с ремоделированием позвоночника (дополнительные рисунки 2 и 5a, дополнительные данные 2).Следовательно, мы проверили, опосредует ли Tmod2 влияние miR-191 на пластичность позвоночника, связанную с LTD.

    Сначала мы проверили, является ли Tmod2 истинной мишенью для miR-191. Мы создали репортерную конструкцию, вставив 3’UTR Tmod2 позади дестабилизированной последовательности mCherry. Этой репортерной конструкцией трансфицировали культивируемые нейроны гиппокампа (DIV14) вместе с плазмидой, экспрессирующей как EGFP, так и miR-191. Через 3 дня после трансфекции экспрессию mCherry оценивали путем измерения отношения интенсивностей флуоресценции, производимой mCherry и EGFP.Экспрессия mCherry репортерной конструкцией была значительно снижена при котрансфекции конструкцией miR-191, но не конструкцией, экспрессирующей miR-135b, которая, как предполагается, не взаимодействует с Tmod2, или конструкцией EGFP, не экспрессирующей miR-191 ( Рис. 3а, б). Чтобы проверить, подавляет ли miR-191 экспрессию mCherry через сайты связывания miR-191 в 3’UTR Tmod2, мы мутировали сайты связывания miR-191 в репортерной конструкции и обнаружили, что экспрессия mCherry с помощью мутированной репортерной конструкции была нарушена. трансфекция плазмиды miR-191 больше не влияет (рис.3а, б). Эти результаты показывают, что 3’UTR Tmod2 обеспечивает контроль трансляции с помощью miR-191.

    Фигура 3: Tmod2 является физиологической мишенью miR-191, и его экспрессия увеличивается при обработке NMDA.

    Культивированные нейроны гиппокампа ( a , b , e , f ) и кортикальные нейроны ( c , d ) были трансфицированы определенными конструкциями на DIV14 или трансдуцированы лентивирусом на DIV7, и визуализированы или собирают для иммуноблоттинга на DIV17.( a ) Типичные изображения нейронов, котрансфицированных miRNA и репортерными конструкциями. ( b ) Количественная оценка a . ( c ) Вестерн-блоттинг клеточных лизатов нейронов, трансдуцированных miR-191 или контрольным вирусом; n = 4 эксперимента. ( d ) Вестерн-блоттинг клеточных лизатов нейронов, трансфицированных антисмысловыми олигонуклеотидами miR-191 или скремблированными олигонуклеотидами; n = 4–9 экспериментов для каждого условия. ( e ) Типичные изображения дендритов, трансфицированных конструкцией miR-191 или контрольной плазмидой.( f ) Количественное определение e . n = 12–30 ячеек для каждой группы в b и f . Данные представлены как среднее ± s.e.m. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни U . *** P <0,005. Масштабные линейки, 20 мкм для и , 5 мкм для и .

    Чтобы проверить, регулирует ли miR-191 также эндогенную экспрессию Tmod2, культивируемые нейроны коры трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим miR-191, или трансфицировали антисмысловыми олигонуклеотидами против miR-191.Экспрессию Tmod2 анализировали иммуноблоттингом. Вирус miR-191 снижал, в то время как антисмысловые олигонуклеотиды увеличивали экспрессию Tmod2 (фиг. 3c, d и дополнительный рисунок 4a). Эти результаты подтверждают, что Tmod2 является физиологической мишенью miR-191.

    Затем мы проверили, изменяется ли экспрессия Tmod2 во время LTD. Культивированные нейроны гиппокампа обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) и окрашивали антителом Tmod2 через 90 мин после стимуляции. В клетках, трансфицированных контрольной плазмидой, обработка NMDA вызвала увеличение экспрессии Tmod2, и это увеличение было индуцировано на уровне трансляции, но не на уровне транскрипции, поскольку ингибитор трансляции анизомицин ингибировал его, а ингибитор транскрипции — нет (рис.3д, е). Чтобы проверить, вносит ли miR-191 вклад в изменение экспрессии Tmod2, мы трансфицировали нейроны конструкцией miR-191, чтобы компенсировать вызванное NMDA снижение экспрессии miR-191. Трансфекция miR-191 устраняет вызванные NMDA изменения в экспрессии Tmod2 (рис. 3e, f). Эти данные показывают, что вызванное NMDA снижение экспрессии miR-191 приводит к усилению экспрессии Tmod2.

    Взятые вместе, эти находки указывают на то, что Tmod2 является физиологической мишенью miR-191 и что снижение экспрессии miR-191 во время LTD приводит к увеличению экспрессии Tmod2.

    Tmod2 необходим для пластичности позвоночника, ассоциированной с LTD

    Продемонстрировав, что Tmod2 является мишенью для miR-191 и активируется после индукции LTD, мы затем исследовали его роль в пластичности позвоночника. С этой целью мы создали конструкцию, экспрессирующую миРНК против Tmod2. Эффективность и специфичность миРНК Tmod2 тестировали в отношении экзогенно и эндогенно экспрессируемого Tmod2 в клетках COS-7 и первичных нейронах гиппокампа, соответственно (дополнительный рис. 5b-e и дополнительный рис.4г). Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали высокоэффективной и специфической миРНК Tmod2 (миРНК-4), обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) и визуализировали до и после обработки NMDA. При измерении через 10, 30 и 90 мин после стимуляции NMDA размер шипов и количество удаленных шипов в нейронах, трансфицированных и ложно обработанных Tmod2 siRNA, были сопоставимы (фиг. 4). Трансфекция конструкции миРНК Tmod2 не изменила базальный уровень размера или плотности шипов (дополнительный рис.5е, ж). Эти результаты показывают, что Tmod2 необходим для вызванного NMDA сокращения и устранения позвоночника.

    Рисунок 4: Tmod2 опосредует эффект miR-191 на ремоделирование позвоночника во время LTD.

    Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией Венеры отдельно или вместе с обозначенными конструкциями. Через 3-5 дней после трансфекции нейроны были визуализированы до и через 10, 30 и 90 минут после обработки. ( a ) Типичные изображения. Желтые прямоугольники указывают дендриты на изображениях с большим увеличением.( b ) Количественная оценка a . n = 8–16 нейронов для каждой группы. Данные представлены как среднее ± s.e.m. Тест Манна-Уитни U использовали для статистического анализа группы, получавшей NMDA и трансфицированную венерой, по сравнению с другими группами. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,005. Масштабные полосы, 20 мкм на верхнем изображении, 5 мкм на изображении с большим увеличением.

    Чтобы проверить, опосредует ли Tmod2 функцию miR-191 в LTD, мы трансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкцией, экспрессирующей miR-191, вместе с конструкцией, экспрессирующей Tmod2, и стимулировали эти клетки с помощью NMDA (30 мкМ, 5 мин) при 3 дня после трансфекции.Размер и плотность шипов не изменились при котрансфекции миРНК Tmod2 и конструкции miR-191 (дополнительный рис. 5f, g). В то время как длительное сокращение позвоночника и устранение позвоночника, вызванные обработкой NMDA, были заблокированы в клетках, трансфицированных miR-191 (рис. 2), котрансфекция Tmod2 с конструкцией miR-191 восстановила эти изменения (рис. 4). Эти результаты показывают, что miR-191 ограничивает пластичность позвоночника, ограничивая экспрессию Tmod2.

    Чтобы проверить, регулируют ли другие гены-мишени miR-191 также ремоделирование позвоночника, мы котрансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкцией miR-191 и конструкцией, экспрессирующей EGR1 (заявленная мишень miR-191) 36 .NMDA-индуцированное сокращение и устранение позвоночника были неотличимы в клетках, котрансфицированных miR-191 и EGR1, и клетках, сверхэкспрессирующих miR-191 (дополнительный рис. 6). Следовательно, в отличие от Tmod2, EGR1 не участвует в функции miR-191 в индуцированном NMDA ремоделировании позвоночника.

    Взятые вместе, эти находки показывают, что в LTD повышенная экспрессия Tmod2 в результате снижения miR-191 необходима для поддержания изменений позвоночника.

    Tmod2 модифицирует актиновые филаменты в LTD

    Tmod2 является нейрон-специфическим членом семейства тропомодулинов 37 .Тропомодулины представляют собой белки, закрывающие концы актиновых филаментов, которые регулируют динамику, длину и количество актиновых филаментов (F-actin) 29 . Поскольку деполимеризация актина стимулируется индукцией LTD и лежит в основе сжатия позвоночника 5,31 , Tmod2 также может играть роль в регуляции актина во время LTD. Чтобы проверить эту возможность, мы трансфицировали культивированный нейрон гиппокампа (DIV14) конструкцией, экспрессирующей конструкцию миРНК Tmod2, и окрашивали F-актин фаллоидином. В нейронах, трансфицированных контрольной плазмидой, обработка NMDA вызвала снижение содержания F-актина (рис.5). Однако клетки, трансфицированные миРНК Tmod2, содержали сравнимые уровни F-актина, независимо от того, обрабатывались они NMDA или нет (фиг. 5). Аналогично, трансфекция конструкции miR-191 также блокировала индуцированное NMDA изменение F-актина (фиг. 5), и этот эффект miR-191 был устранен котрансфекцией конструкцией, экспрессирующей Tmod2 (фиг. 5). Напротив, трансфекция конструкцией miR-135b или антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135 не влияла на индуцированное NMDA снижение F-актина (фиг. 5). Эти результаты показывают, что Tmod2 необходим для NMDA-индуцированной реорганизации актина и для эффекта подавления активности miR-191 на F-актин.

    Рис. 5: Tmod2 необходим для индуцированного NMDA снижения актинового филамента.

    Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали указанными конструкциями. На этапе DIV17 нейроны окрашивали родамином фаллоидином через 90 мин после обработки NMDA (30 мкМ, 5 мин). ( a ) Типичные изображения трансфицированных дендритов. ( b ) Интегрированная интенсивность флуоресценции фаллоидина на мкм 2 площадь дендрита, нормализованная к группе ложно обработанных. n = 15–26 нейронов для каждой группы.Данные представлены как среднее ± s.e.m. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни U . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,005. Шкала 5 мкм.

    miR-135 регулирует комплексин-1/2 для ремоделирования позвоночника в LTD

    miR-135 нацелен как на комплексин-1, так и на -2 (дополнительный рис. 3a, b и дополнительный рис. 4c), которые на 86% идентичны уровня аминокислот у крыс и выполняют избыточные функции 38 . Кроме того, наш анализ обогащения miR-ген-GO показал, что комплексин-1 и -2 аннотированы терминами GO, связанными с морфогенезом позвоночника, такими как «развитие нервной системы» (дополнительные данные 2, дополнительный рис.5а), предполагая, что они могут быть вовлечены в пластичность позвоночника. Следовательно, мы проверили, опосредуют ли комплексины стимулирующий эффект miR-135 на ремоделирование позвоночника во время LTD.

    Если комплексины на самом деле являются эффекторами miR-135 в LTD, вероятно, что обработка NMDA изменит экспрессию комплексина. Чтобы проверить эту возможность, мы обработали культивированные нейроны коры (DIV17) NMDA (30 мкМ, 5 мин) и оценили экспрессию комплексина с помощью иммуноблоттинга с антителом против комплексина-1 и -2.Экспрессия как комплексина-1, так и комплексина-2 снижалась обработкой NMDA, и это снижение отменялось трансфекцией антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135 до обработки NMDA (фиг. 6a, b и дополнительный фиг. 4b). Эти результаты показывают, что путем активации miR-135 обработка NMDA снижает экспрессию комплексина-1 и -2.

    Фигура 6: Комплексины опосредуют действие miR-135 на ремоделирование позвоночника во время LTD.

    Культивированные нейроны коры (DIV14) трансфицировали антисмысловыми олигонуклеотидами против miR-135 и обрабатывали NMDA с последующим иммуноблоттингом против комплексина-1 и -2 в a и b c e культивируемые нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией Венеры отдельно или вместе с обозначенной конструкцией. Через 3-5 дней после трансфекции нейроны были визуализированы до и через 10, 30 и 90 минут после обработки. ( a ) Репрезентативные блоты. ( b ) Количественная оценка a . n = 4–7 экспериментов для каждого условия. ( c ) Репрезентативные изображения. Желтые прямоугольники указывают дендриты на изображениях с большим увеличением.( d , e ) Количественное определение c . n = 6–16 нейронов для каждой группы в d и e . Данные представлены как среднее ± s.e.m. Тест Манна-Уитни U использовали для статистического анализа группы, получавшей NMDA и трансфицированную венерой, по сравнению с другими группами. * P <0,05, *** P <0,005. Масштабные полосы, 20 мкм на верхнем изображении c , 5 мкм на большом увеличении изображения c .

    Чтобы проверить, требуется ли изменение экспрессии комплексинов для ремоделирования позвоночника, мы трансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкцией Венеры вместе с конструкцией, экспрессирующей комплексин-1, чтобы компенсировать снижение экспрессии комплексина, вызванное обработкой NMDA.Во всех исследованных временных точках после стимуляции NMDA размер шипов и элиминация были сопоставимы в клетках, трансфицированных комплексином-1, и в контрольной группе, имитирующей лечение (фиг. 6c-e). Трансфекция конструкции комплексина-1 оставила неизменным базальный уровень размера и плотности шипов (дополнительный рис. 7a, b). Эти результаты показывают, что снижение экспрессии комплексина необходимо для индуцированного NMDA сокращения и устранения позвоночника.

    Чтобы проверить, опосредуют ли комплексины влияние miR-135 на ремоделирование позвоночника, мы трансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкцией, экспрессирующей миРНК против комплексина-1 и -2 (дополнительные рисунки 4e и 7c, d) вместе с miR -135 губчатая конструкция или антисмысловые олигонуклеотиды miR-135.Котрансфекция конструкции комплексина-1 и конструкции губки miR-135 или антисмысловых олигонуклеотидов miR-135 не изменяла исходный размер и плотность шипов (дополнительные фиг. 7a, b). В то время как NMDA-индуцированное удаление позвоночника и длительное сокращение позвоночника блокировались губкой miR-135 или антисмысловыми олигонуклеотидами (рис. 2, дополнительный рис. 8), эти изменения были восстановлены в клетках, котрансфицированных конструкцией комплексина siRNA и miR- 135 губка или антисмысловые олигонуклеотиды (рис.6c – e, дополнительный рис. 8). Эти результаты показывают, что регуляция экспрессии комплексина с помощью miR-135 способствует ремоделированию позвоночника.

    Чтобы проверить, вносят ли другие мишени miR-135 также вклад в индуцированное NMDA ремоделирование позвоночника, мы котрансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) конструкцией губки miR-135 и конструкцией, экспрессирующей миРНК против Rap2, который также является геном-мишенью miR-135 (дополнительные рисунки 3a, b, 4c, f и 7e, f). Трансфекция конструкции миРНК Rap2 оставила влияние губки miR-135 на вызванное NMDA сокращение и удаление позвоночника неизменным (дополнительный рис.8), указывая на то, что Rap2 не опосредует функцию miR-135 при ремоделировании позвоночника.

    Взятые вместе, эти результаты показывают, что комплексин-1 и -2 являются мишенями для miR-135, ответственных за его функцию в индуцированном NMDA ремоделировании позвоночника.

    Пониженная экспрессия комплексина изменяет экзоцитоз рецептора AMPA

    Комплексин-1 и -2 являются белками, связывающими комплекс SNARE, и регулируют как пре-, так и постсинаптический экзоцитоз 30,39 . Хотя роль постсинаптического экзоцитоза в LTD еще предстоит исследовать, было показано, что он регулирует размер шипа во время LTP 40 .Чтобы определить механизм, с помощью которого комплексин способствует ремоделированию позвоночника, мы исследовали возможность того, что комплексины регулируют постсинаптический экзоцитоз в LTD. Во-первых, мы проверили, изменяет ли индукция LTD дендритный экзоцитоз. Экзоцитоз постсинаптической мембраны оценивали путем мониторинга экзоцитоза субъединицы рецептора AMPA GluA1 с использованием восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией DsRed (для визуализации морфологии нейронов) вместе с конструкцией, экспрессирующей GluA1, меченный pH-чувствительной формой EGFP (Super Ecliptic pHluorin, SEP), которая проявляет флуоресценцию только тогда, когда она присутствует на поверхность клетки 41,42,43 .Через 3-5 дней после трансфекции нейроны обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин). Через 30 мин после обработки NMDA небольшой дендритный сегмент (25–30 мкм) был фотообесцвечен для устранения> 95% флуоресценции SEP, после чего изображения делались каждые 2–10 мин. После фотообесцвечивания флуоресценция SEP в имитационно обработанных нейронах постепенно восстанавливалась с постоянной времени восстановления ( τ ) 21,6 ± 3,0 мин (среднее ± s.e.m, n = 12 клеток; фиг. 7). Напротив, обработка NMDA значительно замедлила восстановление GluA1 после фотообесцвечивания ( τ = 105.2 ± 11,8 мин, среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 клеток, P = 0,00008 по сравнению с имитационно обработанными контролями, U -тест; Рис.7). Эти результаты показывают, что экзоцитоз рецептора AMPA ингибируется обработкой NMDA.

    Фигура 7: Ингибирование экзоцитоза GluA1 с помощью miR-135 после обработки NMDA.

    Культивированные нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкциями DsRed и GluA1-SEP вместе с обозначенными плазмидами. Через 3-5 дней после трансфекции нейроны обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин), фотообесцвечивали и визуализировали в различные моменты времени, как указано.( a ) Схематическое изображение экспериментальной конструкции. ( b ) Репрезентативные изображения. Дендритные области в синих прямоугольниках были фотообесцвечены. ( c ) Кривая восстановления флуоресценции каждой группы. ( d ) Постоянная времени FRAP. n = 5–12 нейронов для каждой группы. Данные представлены как среднее ± s.e.m. Тест Манна-Уитни U использовали для статистического анализа группы, обработанной NMDA, DsRed и GluA1-SEP, по сравнению с другими группами. ** P <0.01, *** P <0,005. Шкала 10 мкм.

    Чтобы проверить, играет ли miR-135 роль в изменении экзоцитоза рецептора AMPA, мы трансфицировали нейроны гиппокампа (DIV14) губчатой ​​конструкцией miR-135 или антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135 для противодействия индуцированной NMDA активации miR-135, затем измеряли Экзоцитоз GluA1. После обработки NMDA экзоцитоз GluA1 происходил быстрее в губке ( τ = 22,3 ± 2,4 мин, среднее ± среднеквадратичное значение, n = 6 клеток, P = 0,0082 по сравнению с контролем, обработанным NMDA, U -тест; рис.7) или антисмысловые олигонуклеотиды ( τ = 21,3 ± 2,4 мин, среднее ± среднеквадратичное, n = 10 клеток, P = 0,0004 по сравнению с обработанными NMDA контролями, U -тест; дополнительный рис. 9) трансфицированные клетки чем в контрольных клетках, трансфицированных плазмидой. Эти результаты показывают, что miR-135 ингибирует постсинаптический экзоцитоз после лечения NMDA.

    Затем мы проверили, вносят ли комплексины вклад в вызванное NMDA замедление экзоцитоза. Нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией, экспрессирующей комплексин-1, и обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) через 3-5 дней после трансфекции.Экзоцитоз GluA1 измеряли через 30 мин после обработки NMDA с использованием FRAP. В клетках, трансфицированных конструкцией комплексина-1, восстановление GluA1 после фотообесцвечивания было быстрее, чем в контрольных клетках, трансфицированных плазмидой, и сравнимо с таковым в ложно обработанных клетках ( τ = 30,2 ± 2,8 мин, среднее ± среднеквадратичное, n = 8 клеток, P = 0,0006 по сравнению с обработанными NMDA контрольными; P = 0,12 по сравнению с фиктивно обработанными клетками, U -тест; фиг.7), что указывает на то, что снижение экспрессии комплексина, индуцированное обработкой NMDA, замедляет GluA1 экзоцитоз.

    Чтобы проверить, опосредуется ли влияние miR-135 на экзоцитоз GluA1 комплексинами, мы трансфицировали нейроны гиппокампа конструкцией миРНК комплексина вместе с конструкцией губки miR-135 или антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135. В котрансфицированных клетках экзоцитоз GluA1 после обработки NMDA был намного меньше, чем в клетках, трансфицированных конструкцией губки miR-135 или только антисмысловыми олигонуклеотидами miR-135, и сравним с таковым в контроле, обработанном NMDA (фиг. 7, дополнительный фиг. .9). Напротив, на базальный экзоцитоз GluA1 без обработки NMDA не влияли miR-135 или комплексин-1 (дополнительный рис. 10). Эти результаты показывают, что miR-135 регулирует экзоцитоз рецептора AMPA в нейронах, обработанных NMDA, путем подавления экспрессии комплексина.

    Взятые вместе, эти результаты показывают, что постсинаптический экзоцитоз снижается обработкой NMDA, и что это снижение объясняется репрессией экспрессии комплексина с помощью miR-135.

    miR-191 и miR-135 необходимы для индукции LTD

    Определив функцию miR-191 и miR-135 в пластичности позвоночника, связанную с LTD, мы приступили к проверке, играют ли они также роль в подавлении синаптической передачи. .Культивированные срезы гиппокампа трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим губку miR-191 или miR-135. Через 5 дней после трансдукции LTD индуцировалась в области CA1 путем стимуляции коллатерального пути Шаффера (1 Гц, 15 мин). В контрольных клетках, трансдуцированных вирусом, количество fEPSP снижалось при стимуляции (среднее ± среднее: 68,9 ± 2,0% от исходного уровня через 10 минут, 64,7 ± 6,1% от исходного уровня через 90 минут и 62,7 ± 4,3% от исходного уровня через 2 часа после стимуляции; n = 6 срезов; рис.9). Напротив, LTD была значительно снижена в клетках, трансдуцированных губчатым вирусом miR-191 или miR-135 (среднее значение ± s.em: 91,5 ± 7,0% ( P = 0,041 по сравнению с контролем), 101,0 ± 4,9% ( P = 0,0021 по сравнению с контролем), 101,0 ± 6,4% ( P = 0,0043 по сравнению с контролем) и 95,7 ± 7,4% ( P = 0,0043 по сравнению с контролем) от исходного уровня для miR-191; 81,9 ± 3,0% ( P = 0,0022 по сравнению с контролем), 88,0 ± 2,8% ( P = 0,026 по сравнению с контролем), 93,5 ± 6,7% ( P = 0,0087 по сравнению с контролем) и 87,5 ± 2,8% ( P = 0,0022 по сравнению с контролем) от исходного уровня для miR-135 через 10, 30, 90 и 120 минут после стимуляции, соответственно. n = 6 срезов для каждой группы, U -тест; Рис.8). Эти результаты показывают, что для индукции LTD требуются надлежащие уровни экспрессии miR-191 и miR-135.

    Фигура 8: miR-191 и miR-135 участвуют в индукции LTD.

    Культивированные срезы гиппокампа трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим губку miR-191 или miR-135. Через 5 дней после трансдукции LTD индуцировали в нейронах CA1 низкочастотной стимуляцией (900 плюсов при 1 Гц). Наклоны fEPSP, нормализованные к исходному уровню до стимуляции, наносили на график как среднее ± s.Эм. n = 6 срезов для каждой группы.

    Как первичные, так и зрелые miR-191 и miR-135b изменены в LTD

    Чтобы изучить механизмы, с помощью которых miR-191 и miR-135 изменяются в LTD, мы оценили уровни первичных и зрелых miR-191. и miR-135b в различные моменты времени после обработки NMDA. Нейроны гиппокампа (DIV17) обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) и собирали через 10, 30, 60 и 90 мин после стимуляции NMDA. Pri- и зрелые миРНК анализировали с помощью qRT-PCR. Экспрессия как зрелой, так и pri-miR-191 снижалась обработкой NMDA (рис.9а). Аналогичным образом, как зрелый, так и pri-miR-135b были изменены обработкой NMDA (фиг. 9b). Повышение уровня зрелой и pri-miR-135b, однако, начинается раньше, чем уменьшение зрелой и pri-miR-191 (рис. 9a, b), указывая тем самым, что изменения экспрессии в этих двух miRNA могут быть индуцированы разными механизмами.

    Фигура 9: miR-191 и miR-135 модулируются как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях в LTD.

    Культивированные нейроны гиппокампа обрабатывали только NMDA (30 мкМ, 5 мин) ( a , b ) или вместе с актиномицином ( c ) и собирали в указанные моменты времени для анализа qRT-PCR ( a с ).Культивированные нейроны коры обрабатывали NMDA (30 мкМ, 5 мин) и использовали для анализа CLIP через 90 мин после обработки ( d ). ( a ) Динамика индуцированных NMDA изменений первичной и зрелой miR-191; n = 4–7 экспериментов для каждой временной точки. ( b ) Временной ход NMDA-индуцированных изменений первичной и зрелой miR-135b; n = 4–5 экспериментов для каждой временной точки. ( c ) Эффект актиномицина на NMDA-индуцированные изменения зрелых miR-191 и miR-135b; n = 7 экспериментов для каждого условия.( d ) Изменение miR-191 и miR-135b, связанное с RISC; n = 4 эксперимента для каждого условия. Данные представлены как среднее ± s.e.m. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни U . * P <0,05; ** P <0,01, *** P <0,005.

    Изменения в pri-форме miR-191 и miR-135b после индукции LTD указывают на то, что эти miRNA регулируются на уровне транскрипции. Чтобы проверить, регулируются ли они также на посттранскрипционных уровнях в LTD, мы обработали нейроны гиппокампа (DIV17) ингибитором транскрипции актиномицином D (10 мкМ) вместе с NMDA.Несмотря на присутствие актиномицина D, обработка NMDA все еще изменяет уровни зрелых miR-191 и miR-135b (рис. 9c), указывая тем самым, что посттранскрипционный процессинг этих miRNAs также регулируется обработкой NMDA.

    Чтобы проверить, влияют ли вызванные NMDA изменения в miRNA на miRNA, включенные в RISC, мы проанализировали miR-191 и miR-135b, связанные с RISC, с помощью анализа перекрестного связывания и иммунопреципитации (CLIP). Мы трансдуцировали первичные нейроны коры с помощью лентивируса, экспрессирующего Flag-tagged argonoute 2 (Ago2, белковый компонент RISC).Через 10 дней после трансдукции RISC в трансдуцированных нейронах перекрестно сшивали УФ-облучением, а затем удаляли антителом против Flag. miRNAs в иммунопреципитированных RISC измеряли с помощью qRT-PCR с использованием miR-218 и miR-29a (две miRNA, не затронутые обработкой NMDA, рис. 1) в качестве контролей. Мы обнаружили, что уровень miRNA-191 в RISC был снижен, а уровень miR-135b повышен (рис. 9d).

    Взятые вместе, эти результаты показывают, что в LTD miR-191 и miR-135b регулируются как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

    Обработка NMDA изменяет дендритные miR-191 и miR-135b

    Некоторые miRNAs и белки RISC обнаруживаются в дендритах, где они могут локально регулировать трансляцию 44 . Чтобы проверить, локализованы ли miR-191 и miR-135b в дендритах, мы оценили их субклеточное распределение с помощью in situ гибридизации (ISH). Нейроны гиппокампа (DIV14) трансфицировали конструкцией EGFP для визуализации дендритов. Через 3 дня после трансфекции использовали заблокированные зонды нуклеиновых кислот для miRNA ISH.miR-191 и miR-135b были обнаружены как в соме, так и в дендритах (рис. 10a). Напротив, сигналы контрольного зонда для малой ядерной РНК U6 были обнаружены в основном в соме, а сигналы другого контрольного зонда для miR-215 (который экспрессируется на незначительном уровне в нейронах гиппокампа на основе нашего глубокого анализа секвенирования). ) были небольшими (рис. 10а), что подтверждает специфичность нашего анализа ISH. Эти результаты показывают, что miR-191 и miR-135b действительно локализуются в дендритах.

    Рисунок 10: miR-191 и miR-135 локально регулируются в дендритах с помощью различных субъединиц NMDAR.

    Культивированные нейроны гиппокампа обрабатывали только NMDA (30 мкМ, 5 мин) или вместе с различными ингибиторами, как указано, и использовали для ISH ( a d ) или qRT-PCR через 90 мин после обработки ( e ). ( a ) Субклеточная локализация miR-191 и miR-135b. ( b ) NMDA-индуцированные изменения miR-191 и miR-135b в дендритах. ( c , d ) Количественная оценка b ; n = 15–25 нейронов для каждого состояния.( и ) Регулирование miR-191 и miR-135b разными субъединицами NMDAR; n = 4–9 экспериментов для каждого условия. Масштабные линейки: 20 мкм для изображений с малым увеличением (вверху) и 5 ​​мкм для изображений с большим увеличением (внизу). Данные представлены как среднее ± s.e.m. Для статистического анализа использовали критерий Манна – Уитни U . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,005.

    Чтобы проверить, изменяются ли дендритные miR-191 и miR-135b в LTD, мы обрабатывали нейроны гиппокампа (DIV17, 3 дня после трансфекции конструкцией EGFP) NMDA (30 мкМ, 5 мин).Через 90 мин после обработки нейроны фиксировали на ISH. Примечательно, что miR-191 и miR-135b в дендритах были изменены обработкой NMDA (Fig. 10b-d).

    Чтобы проверить, могут ли дентритные miR-191 и miR-135b регулироваться локально в LTD, мы обрабатывали нейроны гиппокампа NMDA вместе с актиниомицином D (10 мкМ) для блокирования транскрипции и ингибитором полимеризации актина цитохалазином D (10 мкМ) или ингибитор полимеризации микротрубочек нокодазол (10 мкМ), препятствующий внутриклеточной транспортировке миРНК.Дендритные miR-191 и miR-135b все еще изменяются обработкой NMDA, когда транскрипция и внутриклеточный транспорт ингибируются (Fig. 10b-d). Следовательно, обработка NMDA может регулировать miR-191 и miR-135b локально в дендритах.

    Дендритная локализация miRNA-191 и miR-135b предполагает, что они могут регулировать экспрессию своих мРНК-мишеней в дендритах. Чтобы проверить эту возможность, мы сначала оценили внутриклеточную локализацию мРНК Tmod2 и комплексина-1. Наш анализ ISH показал, что мРНК Tmod2 и комплексина-1 действительно локализованы в дендритах (дополнительный рис.11а). Затем мы проверили, изменялась ли экспрессия дендритного Tmod2 и комплексина-1 в LTD путем блокирования транскрипции и внутриклеточного трафика с помощью актиномицина D, цитохалазина D и нокодазола. Несмотря на присутствие этих ингибиторов, экспрессия как дендритного Tmod2, так и комплексина-1 и -2 была изменена обработкой NMDA (Supplementary Fig. 11b-e). Эти результаты показывают, что экспрессия Tmod2 и комплексинов может регулироваться локально в дендритах во время LTD.

    Взятые вместе, эти находки указывают на то, что при LTD изменения экспрессии в miR-191, miR-135b и их мишенях вызываются, по крайней мере частично, локальным процессингом и трансляцией miRNA в дендритах.

    Различные субъединицы NMDAR регулируют miR-191 и miR-135b

    Продемонстрировав важность miRNA в NMDAR-LTD, мы продолжили тестировать роль, которую играют рецепторы NMDA в регуляции miRNA. Мы обрабатывали нейроны гиппокампа (DIV17) NMDA (30 мкМ, 5 мин) вместе с антагонистом NMDAR AP5 ((2 R ) –амино – 5 – фосфоновалериановая кислота, 100 мкМ) и выделяли РНК через 90 мин после обработки для qRT – PCR анализ миРНК. Изменения в miR-191 и miR-135b, вызванные обработкой NMDA, блокировались AP5.Следовательно, NMDAR важен для регуляции miRNAs в LTD (Fig. 10e).

    В нейронах гиппокампа NMDAR состоит из субъединиц GluN1 и GluN2 (GluN2A и GluN2B) 45 . GluN1 является облигатной субъединицей, в то время как GluN2A и GluN2B имеют разные функции. Чтобы проверить, какая субъединица GluN2 регулирует miRNAs в LTD, мы обрабатывали нейроны гиппокампа (DIV17) NMDA (30 мкМ, 5 мин) вместе с антагонистом GluN2A TCN 201 (10 мкМ) или антагонистами GluN2B Ro 25-6891 (3 мкМ) и выделенная РНК через 90 мин после обработки.Примечательно, что после стимуляции NMDA уменьшение miR-191 блокировалось антагонистами GluN2B (но не антагонистом GluN2A), в то время как увеличение miR-135 блокировалось антагонистом GluN2A (но не антагонистами GluN2B) (рис.

    Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *