Гк рф статья 508: ГК РФ Статья 508. Периоды поставки товаров / КонсультантПлюс

Содержание

Ст. 508 ГК РФ. Периоды поставки товаров

1. В случае, когда сторонами предусмотрена поставка товаров в течение срока действия договора поставки отдельными партиями и сроки поставки отдельных партий (периоды поставки) в нем не определены, то товары должны поставляться равномерными партиями помесячно, если иное не вытекает из закона, иных правовых актов, существа обязательства или обычаев делового оборота.

2. Наряду с определением периодов поставки в договоре поставки может быть установлен график поставки товаров (декадный, суточный, часовой и т.п.).

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.

Товары, поставленные досрочно и принятые покупателем, засчитываются в счет количества товаров, подлежащих поставке в следующем периоде.

См. все связанные документы >>>

— прямым указанием в договоре поставки. В этом случае в договоре поставки в качестве отдельного условия или приложения либо дополнительного соглашения устанавливается график поставки, то есть определяется конкретная дата (время) в сутках, в неделе, в декаде, в месяце и т.д., в которой должна быть осуществлена поставка очередной партии товаров;

— поставка товаров равными партиями каждый месяц. Такой способ определения периодов поставки определяется в случае, если такие периоды изначально не оговорены в договоре поставки. В этом случае поставка может осуществляться в конце каждого месяца. Например, если предметом договора поставки являются натуральные пакетированные соки и в договоре поставки установлено, что в течение полугода поставщик обязан передать покупателю шестьдесят коробок натурального сока, но при этом периоды поставки в договоре не определены. В этом случае допустимо, чтобы поставщик осуществлял поставку коробок натурального сока в количестве десяти коробок до тридцатого числа каждого месяца поставки.

Такие способы определения периодов поставки товаров устанавливаются, если в договоре поставки установлен определенный срок его действия, например, месяц, полгода, год. Если же такой конкретный период не установлен, то, полагаем, периоды поставки могут определяться по соглашению сторон в зависимости от потребностей покупателя.

Поставщик вправе поставить покупателю товары досрочно, которые в этом случае зачтутся в счет поставки товаров в следующем периоде.

2. Судебная практика:

— Постановление ФАС Восточно-Сибирского округа от 08.10.2012 N Ф02-4311/12 по делу N А19-1927/2012;

— Постановление ФАС Московского округа от 02.06.2010 N КА-А40/4976-10 по делу N А40-92717/09-102-767;

— Постановление ФАС Московского округа от 31.08.2007 N КГ-А40/8482-07;

— Постановление Двенадцатого арбитражного апелляционного суда от 23.10.2013 N 12АП-7957/13;

— Постановление Восьмого арбитражного апелляционного суда от 02.12.2008 N 08АП-4819/2008;

— Постановление Пятнадцатого арбитражного апелляционного суда от 01.11.2008 N 15АП-6293/2008.

Ст. 508 ГК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.

Комментарий к Ст. 508 ГК РФ

1. Содержание данной нормы права свидетельствует о том, что договор поставки чаще всего заключается на длительный срок. В большинстве случаев поставка необходима для осуществления экономических связей между предпринимателями в течение хозяйственного года. Поэтому заключение договоров происходит в конце календарного года, с тем чтобы в наступающем году не возникло перерыва в экономических связях на период заключения договора. С учетом места нахождения сторон договоры заключаются одногородние, если поставщик и покупатель находятся в одном населенном пункте, междугородние, когда субъекты находятся в разных населенных пунктах, и международные, если контрагенты находятся в разных странах. С учетом места нахождения сторон в договорах предусматриваются и периоды поставки. Сроки поставки являются существенным условием для нормальной хозяйственной деятельности любого предпринимателя. Если окажется, что в конкретном договоре частные сроки (периоды) поставки не определены, то действует правило о помесячной поставке товаров равными партиями. Однако практически при заключении договора стороны предусматривают не только периоды поставки, но детализируют их подекадно, посуточно с почасовой разбивкой. Так, по договору одногородней поставки товаров народного потребления (хлеб, молоко, мясопродукты и др.) в торговую сеть предусматривается график поставки ежедневно с почасовой разбивкой.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

В договорах междугородней поставки (например, комплектующих изделий в машиностроении) предусматриваются подекадные поставки, обеспечивающие непрерывность конвейерной сборки готовой продукции производителем.

График поставки может быть включен непосредственно в текст договора или оформлен в виде приложения со ссылкой на договор. В договоре может быть установлен порядок, в соответствии с которым будет определяться срок поставки каждой партии.

Отсылка в договорах поставки к срокам, предусмотренным в ином документе (например, ежедневном почасовом графике поставки для скоропортящейся продукции), влечет признание такого условия существенным с учетом определения договора поставки, предусмотренного ст. 506 ГК РФ, и отсутствие такого документа влечет признание договора незаключенным в силу ст. 432 ГК РФ.

2. Внешнеторговые договоры заключаются между поставщиками и покупателями, находящимися в разных странах. Грамотное заключение и исполнение внешнеторговых сделок представляет большую сложность из-за специфики правоотношений, которая объясняется различием нормативной базы разных стран, имеются также различия в единицах измерения, мере веса, названиях некоторых товаров и т.д. Поэтому существует свод международных правил толкования наиболее часто встречающихся терминов во внешней торговле — «Инкотермс» (в редакции 2010 г.).

Этим документом устанавливается унифицированный подход к толкованию базисных условий поставки. При заключении договора необходимо определить порядок действия указанных правил. Как отмечается в литературе, «в каждом внешнеторговом контракте должны быть четко определены условия поставки — базис поставки, так как именно базисные условия определяют момент перехода права собственности от продавца к покупателю и риска случайной гибели и другие условия» .

———————————
Свод хозяйственных договоров и документооборота предприятий: В 2 т. / Под ред. А.В. Брызгалина. М.: Аналитика Пресс, 1999. Т. 2. С. 34.

Предмет поставки (товар) с необходимой технической характеристикой, количеством, качеством и другими данными, сроки поставки являются существенными условиями договора.

3. Пункт 3 статьи предусматривает досрочную поставку товаров лишь с согласия покупателя, что соответствует общему положению ст. 315 ГК РФ о досрочном исполнении обязательства из предпринимательской деятельности.

Как отмечается в п. 17 Постановления Пленума ВАС РФ от 22 октября 1997 г. N 18, при разрешении споров по расчетам за товары, поставленные с согласия покупателя досрочно (п. 3 ст. 508 ГК), следует учитывать, что такое согласие само по себе не меняет условий договора о сроках оплаты и порядке расчетов, и в отсутствие соглашения сторон об ином оплата таких товаров должна производиться в порядке и сроки, предусмотренные договором.

Если порядок и форма расчетов договором не определены и расчеты в силу ст. 516 ГК РФ должны осуществляться платежными поручениями, покупатель, согласившийся принять товар досрочно, обязан совершить действия, необходимые для оплаты товаров, не позднее следующего дня с момента их получения.

В случаях, когда договором поставки установлена обязанность покупателя оплатить товары в течение определенного времени с момента их получения, срок платежа за товары, поставленные с согласия покупателя досрочно, исчисляется с момента их фактического получения.

Споры по расчетам за товары, поставленные досрочно без согласия покупателя, но принятые или использованные последним (не принятые на ответственное хранение), судам необходимо рассматривать с учетом изложенных выше правил.

Статья 508 ГК РФ с комментариями — Периоды поставки товаров

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.

Комментарий к статье 508 Гражданского Кодекса РФ

1. В годовых или иных долгосрочных договорах поставки при длящихся отношениях, когда исполнение договора осуществляется частями, стороны могут предусмотреть периоды поставки. Деловой практике известны квартальные, месячные, декадные и иные периоды. Под периодом понимается равномерный промежуток времени, в течение которого производится поставка предусмотренного договором количества товаров отдельными партиями (по частям). Комментируемая норма носит диспозитивный характер, т.е. предусмотренные ею месячные периоды поставки применяются только в случае отсутствия в договоре конкретной даты передачи товара или условий об иных периодах. При определении периодов поставки стороны могут указать количество товаров, которое подлежит поставке в каждый период. В противном случае поставка осуществляется в каждый период равными партиями.

Период поставки товаров имеет значение для применения условий договора или диспозитивной нормы, устанавливающей сроки представления отгрузочной разнарядки (ст. 509 ГК), нормы, предусматривающей порядок восполнения недопоставки товаров (ст. 511 ГК). Досрочная поставка или просрочка поставки, если в договоре отсутствует конкретный срок поставки, также определяются исходя из установленного договором или предусмотренного комментируемой нормой периода поставки.

2. Определяемые сторонами графики устанавливают сроки передачи товаров в пределах периода поставки. Их назначение — обеспечить равномерную передачу товаров, в т.ч. скоропортящихся либо товаров, для хранения которых необходимы емкости. Если ответственность за нарушение графика в виде неустойки (штрафа) не определена договором, то это дает право другой стороне требовать возмещения убытков.

3. Досрочной называется поставка до наступления предусмотренной договором календарной даты передачи товара либо периода поставки. Согласие покупателя на досрочную поставку может быть предусмотрено непосредственно в договоре либо сообщено им поставщику в письменной форме по конкретной поставке. Такое согласие необходимо независимо от того, установлен в договоре строго определенный срок исполнения обязанности поставки или нет (см. коммент. к ст. 457).

Комментируемая статья воспроизводит ранее действовавшую норму о зачете досрочно поставленных товаров в счет количества, подлежащего поставке в следующем периоде, если покупатель принял эти товары.

В соответствии со сложившейся практикой при досрочной поставке без согласия покупателя и его отказе принять для использования досрочно поставленные товары они принимаются им на ответственное хранение и подлежат оплате по цене, действующей на момент наступления срока поставки.

Если же покупатель принял или использовал товар, поставленный досрочно без его согласия (не оставил товар на ответственном хранении), то он обязан произвести оплату в соответствии с условиями договора о сроках и порядке расчетов. Так же решается вопрос об оплате товаров, переданных досрочно с согласия покупателя.

Судебная практика исходит из того, что само по себе согласие на досрочную поставку не меняет условия договора о сроках оплаты и порядке расчетов. Действия, необходимые для оплаты товаров, отгруженных досрочно с согласия покупателя, он должен совершить не позднее следующего дня с момента получения товаров, если договором не установлены иные сроки оплаты или сторонами не достигнуто соглашение о других сроках оплаты (п. 17 Постановления Пленума ВАС РФ N 18).

Статья 508 ГК РФ. Периоды поставки товаров

Гражданский кодекс Российской Федерации:

Статья 508 ГК РФ. Периоды поставки товаров

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.

Вернуться к оглавлению документа: Гражданский кодекс РФ Часть 2 в действующей редакции

Комментарии к статье 508 ГК РФ, судебная практика применения

В п. 17 Постановления Пленума ВАС РФ от 22.10.1997 N 18 «О некоторых вопросах, связанных с применением Положений Гражданского кодекса Российской Федерации о договоре поставки» содержатся следующие разъяснения:

Досрочная поставка товаров с согласия покупателя

При разрешении споров по расчетам за товары, поставленные с согласия покупателя досрочно (пункт 3 статьи 508 Кодекса), следует учитывать, что такое согласие само по себе не меняет условий договора о сроках оплаты и порядке расчетов, и в отсутствие соглашения сторон об ином оплата таких товаров должна производиться в порядке и сроки, предусмотренные договором.

Если порядок и форма расчетов договором не определены и расчеты в силу статьи 516 Кодекса должны осуществляться платежными поручениями, покупатель, согласившийся принять товар досрочно, обязан совершить действия, необходимые для оплаты товаров, не позднее следующего дня с момента их получения.

Статья 508 ГК РФ и комментарии к ней

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.Товары, поставленные досрочно и принятые покупателем, засчитываются в счет количества товаров, подлежащих поставке в следующем периоде.

Комментарий к статье 508 ГК РФ

1. Поскольку положения § 3 гл. 30 ГК не предусматривают иного, поставка товаров по общему правилу должна осуществляться в полном объеме в виде однократного акта (см. ст. 311 ГК). Если в качестве предмета договора поставки выступает единичная вещь, данный постулат является незыблемым. Однако в ситуации, когда предметом поставки является определенная совокупность вещей, стороны могут изменить общее правило, предусмотрев передачу товара по частям, т.е. отдельными партиями. Сроки передачи отдельных партий товара именуются периодами поставок.

Периодичность поставок определяется договором, однако не относится к числу его существенных условий. Если периоды поставок соглашением сторон не установлены и иное не вытекает из закона, существа обязательства или обычаев делового оборота, товары должны поставляться равномерными партиями помесячно (п. 1 коммент. ст.).

Данное правило подчеркивает существенность условия о сроке (см. коммент. к ст. 506 ГК). Ведь если общий срок договора соглашением сторон не определен, применение положений п. 1 коммент. ст. окажется невозможно.

2. Наряду с указанием периодов поставки договор может предусматривать график поставки. Последний по смыслу п. 2 коммент. ст. представляет собой более детальное уточнение периода поставки, служащее целям ритмичной передачи товаров.

3. Основное назначение периодичности поставки состоит в уточнении срока поставки отдельной партии товара. Досрочная поставка или просрочка поставки определяются исходя из установленного договором или предусмотренного п. 1 коммент. ст. периода поставки. Кроме того, период поставки товаров имеет значение для применения правил о сроках представления отгрузочной разнарядки (см. п. 2 ст. 509 ГК и коммент. к нему), о порядке восполнения недопоставки (см. ст. 511 ГК и коммент. к ней).

Поскольку существо периодов и графика поставки не имеет принципиальных отличий, указанные выше правила могут быть распространены и на сроки, установленные графиком поставки (см.: Комментарий к Гражданскому кодексу Российской Федерации. Часть вторая (постатейный). 2-е изд., перераб. и доп. / Под ред. А.П. Сергеева, Ю.К. Толстого. С. 83 (автор комментария — И.В. Елисеев)).

4. Досрочная поставка допускается только с согласия покупателя (абз. 1 п. 3 коммент. ст.). Данное правило применяется к любому договору поставки независимо от того, кто выступает в качестве покупателя и связано ли для последнего обязательство поставки с осуществлением предпринимательской деятельности (ср. со ст. 315 ГК). Согласие покупателя на принятие досрочно поставленных товаров необходимо также независимо от того, установлен в договоре строго определенный срок исполнения обязанности поставки или нет (см. п. 2 ст. 457 ГК и коммент. к нему).

Покупатель обязан принять на ответственное хранение переданные товары, на досрочную поставку которых он не давал согласия (см. ст. 514 ГК и коммент. к ней).

Досрочно поставленные и принятые покупателем товары засчитываются в счет количества товаров, подлежащих поставке в следующем периоде.

Согласие покупателя на принятие досрочно поставленных товаров само по себе не меняет условий договора о сроках оплаты и порядке расчетов. В отсутствие соглашения сторон об ином оплата таких товаров должна производиться в порядке и сроки, которые предусмотрены договором (см. ст. 6.1.5 (2) Принципов международных коммерческих договоров УНИДРУА; п. 17 Постановления ВАС N 18). Аналогично разрешается ситуация, когда товары поставлены досрочно без предварительного согласия покупателя, но приняты или использованы последним (не приняты на ответственное хранение) (см. Постановление ФАС Северо-Кавказского округа от 3 марта 2003 г. N Ф08-517/2003).

Другой комментарий к статье 508 Гражданского Кодекса РФ

———————————
<1> Свод хозяйственных договоров и документооборота предприятий: В 2 т. / Под ред. А.В. Брызгалина. М.: Аналитика Пресс, 1999. Т. 2. С. 34.

Ст 508 ГК РФ с комментариями, статья 508

Полный текст ст. 508 ГК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2020 год. Консультации юристов по статье 508 ГК РФ.

Комментарий к статье 508 ГК РФ

1. Периоды поставки товаров — это отдельные сроки, в течение которых товары должны поставляться покупателю отдельными партиями от всего количества товаров, которые должны быть переданы в целом покупателю. Эти периоды могут определяться двумя способами:
— прямым указанием в договоре поставки. В этом случае в договоре поставки в качестве отдельного условия или приложения либо дополнительного соглашения устанавливается график поставки, то есть, определяется конкретная дата (время) в сутках, в неделе, в декаде, в месяце и т.д., в которой должна быть осуществлена поставка очередной партии товаров;
— поставка товаров равными партиями каждый месяц. Такой способ определения периодов поставки определяется в случае если такие периоды изначально не оговорены в договоре поставки. В этом случае поставка может осуществляться в конце каждого месяца. Например, если предметом договора поставки являются натуральные пакетированные соки, и в договоре поставки установлено, что в течение полугода поставщик обязан передать покупателю шестьдесят коробок натурального сока, но при этом периоды поставки в договоре не определенны. В этом случае допустимо, чтобы поставщик осуществлял поставку коробок натурального сока в количестве десяти коробок до тридцатого числа каждого месяца поставки.

Такие способы определения периодов поставки товаров устанавливаются, если в договоре поставки установлен определенный срок его действия, например, месяц, полгода, год. Если же такой конкретный период не установлен, то, полагаем, что периоды поставки могут определяться по соглашению сторон в зависимости от потребностей покупателя.

Поставщик вправе поставить покупателю товары досрочно, который в этом случае зачтутся в счет поставки товаров в следующем периоде.

Консультации и комментарии юристов по ст 508 ГК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 508 ГК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Комментарии к статье 1. Договор поставки обычно предусматривает передачу покупателю товаров отдельными партиями в течение срока договора, т. е. определенную периодичность поставок. Но чтобы условие о периодичности поставок имело силу, его необходимо включить в договор. В противном случае поставщик обязан передать покупателю все количество товаров единовременно. Исключения из этого правила могут быть предусмотрены нормативным актом либо следовать из существа обязательства или обычаев делового оборота. Так, если ресторан по договору, заключенному сроком на один год, закупает 20 т парного мяса, то очевидно, что его поставка должна осуществляться отдельными партиями с известной периодичностью. Вряд ли можно ожидать, что покупатель способен хранить такое количество товара в течение целого года и что качество продукта за время столь длительного хранения не ухудшится.
Если из договора вытекает необходимость периодичных поставок, однако сами периоды (сроки) поставок не определены, поставщик по общему правилу обязан передавать товары покупателю равномерными партиями помесячно. Если общий срок договора с условием о периодичности поставок не превышает одного месяца, возникает вопрос, с какой частотой должны осуществляться отгрузки (подекадно, еженедельно, ежедневно и т. д.). В данном случае периодичность поставок должна определяться обычаями делового оборота.
2. Наряду с указанием периодов поставок договор может предусматривать и согласованный график поставки товаров в пределах одного периода. Из содержания п. 2 коммент. ст. можно заключить, что законодатель различает условие о периодах поставки товаров, с одной стороны, и график их поставки — с другой. Однако оба эти условия определяют сроки передачи отдельных партий товара и в этом смысле друг от друга принципиально не отличаются.
С определением в договоре периодов поставки закон связывает ряд практически значимых последствий. Так, срок направления поставщику отгрузочной разнарядки (п. 2 ст. 509 ГК) привязан к установленному договором периоду поставки. Восполнение недопоставки товаров (ст. 511 ГК) также производится с учетом договорной периодичности поставок. Указанные правила действуют не только в отношении периодов поставки, предусмотренных договором, но и могут быть распространены на сроки передачи отдельных партий товара, установленные графиком их поставки.
3. Положение о недопустимости досрочной поставки товаров без согласия покупателя, предусмотренное п. 3 коммент. ст., отчасти дублирует норму ст. 315 ГК. Однако общее правило ст. 315 ГК допускает досрочное исполнение обязательства, связанного с осуществлением предпринимательской деятельности, не только с согласия кредитора (покупателя), но и в случаях, когда такая возможность предусмотрена нормативным актом либо следует из существа обязательства или обычаев делового оборота. Вряд ли договор поставки настолько специфичен, что правила о его досрочном исполнении должны существенно отличаться от общих положений ГК. Видимо, смысл абз. 1 п. 3 коммент. ст. надлежит толковать распространительно и понимать его аналогично ст. 315 ГК.
Положение о том, что досрочно поставленные и принятые товары засчитываются в счет следующего периода поставки, нуждается в уточнении. Закон обязывает покупателя принять на ответственное хранение любой товар, поступивший в его адрес, даже если он его вообще не заказывал (ст. 514 ГК). В связи с этим зачету в счет количества товаров, подлежащих поставке в следующем периоде, подлежат лишь те товары, которые были приняты покупателем не на ответственное хранение, а в качестве надлежащего исполнения по договору.

2. Судебная практика:

— Постановление ФАС Восточно-Сибирского округа от 08.10.2012 N Ф02-4311/12 по делу N А19-1927/2012;

— Постановление ФАС Московского округа от 02.06.2010 N КА-А40/4976-10 по делу N А40-92717/09-102-767;

— Постановление ФАС Московского округа от 31.08.2007 N КГ-А40/8482-07;

— Постановление Двенадцатого арбитражного апелляционного суда от 23.10.2013 N 12АП-7957/13;

— Постановление Восьмого арбитражного апелляционного суда от 02.12.2008 N 08АП-4819/2008;

— Постановление Пятнадцатого арбитражного апелляционного суда от 01.11.2008 N 15АП-6293/2008.

3. Досрочная поставка товаров может производиться с согласия покупателя.

Договор поставки | JBI в прессе

Одним из наиболее часто встречающихся в хозяйственной практике предпринимательских договоров является договор поставки. Являясь с одной стороны разновидностью распространенной купли-продажи, договор поставки с другой стороны – один из немногих гражданско-правовых договоров, заключаемых исключительно между субъектами предпринимательской деятельности. Вот об особенностях такого типично предпринимательского договора пойдет речь сегодня.
Статья 506 ГК РФ, позволяет вывести ряд признаков, характеризующих договор поставки:
Во-первых, как уже было сказано, сторонами договора поставки могут быть только зарегистрированные в установленном порядке субъекты предпринимательской деятельности: организации и ПБОЮЛ.
Во-вторых, законодатель прямо указывает на необходимость наличия существенного условия о предмете договора – товаре, его количестве, ассортименте и др. характеристик, позволяющих достоверно его идентифицировать. Даже содержащееся в понятии договора поставки (506 ГК РФ) упоминание об определенных сроках не является необходимым условием.
И, в третьих, поскольку сторонами являются юридические лица (и (или) ПБОЮЛ), согласно ст.ст. 160-161 ГК РФ данный договор должен быть обязательно письменным.
В связи с этим на практике возникает вопрос, является ли оплата покупателем выставленного поставщиком счета, в т. ч. по факсимильной связи, заключением между сторонами договора. Согласно ст. 432 ГК РФ договор считается заключенным, если между сторонами в письменной форме достигнуто соглашение по всем существенным условиям договора, каковыми в отношении договора поставки является предмет договора: т.е. указанные в счете наименование, количество, цена товара (продукции).
В соответствии со ст.ст. 434, 435, 438 ГК РФ письменная форма договора в данном случае считается соблюденной, поскольку поставщик посредством факсимильной связи сделал покупателю предложение (оферту) о поставке товара, а покупатель совершил действия по выполнению условий договора (акцепт) — оплатил в установленный срок действия счета обусловленную офертой цену, т.е. согласился с предложением поставщика.
С момента зачисления на расчетный счет поставщика денежных средств, перечисленных банком по поручению покупателя на реквизиты, указанные в счете, согласно ст. 433 ГК РФ договор поставки считается заключенным.
Если же выставленный к оплате счет не содержит условия о сроке поставки (а так обычно и бывает), товар должен быть поставлен согласно ст. 314 ГК РФ в разумный срок. Если в разумный срок (определяемый поставщиком субъективно) товар поставлен не будет, покупатель вправе направить требование поставщику о поставке продукции в семидневный срок.
Срок поставки вообще является одним из практически не урегулированных вопросов: законодатель устанавливает весьма широкие границы для применения права (закона) по аналогии, обычаев и обыкновений делового оборота.
При этом необходимо сразу разъяснить положения ст. 508 ГК РФ, которая допускает неопределенность сроков, но только по отношению к периодичности поставок товара (поставка несколькими партиями), и лишь при расширительном толковании может быть отнесена к срокам в договоре поставки вообще.
Указание какого-либо конкретного срока поставки необходимо и в случае, если досрочное исполнение обязательства по договору поставки является нарушением, и признается просрочкой поставщика. В таком случае излишнее рвение поставщика может обернуться против него, если покупатель не согласится принять товар ранее оговоренного срока.
Таким образом, мы рекомендуем все же подробно регламентировать в договоре сроки поставки. Исключение могут составлять лишь устоявшиеся, крепкие, доверительные и долгосрочные отношения между контрагентами с уже сложившимися деловыми обычаями в сфере поставки определенного товара.
Особенное внимание следует уделить способам погрузки, отгрузки, доставки товара, процедуры осмотра и выборки, ассортимента и комплектности товара, всех его реквизитов, т.е. всего того, что позволит максимально полно индивидуализировать и определить товар, являющийся предметом сделки.
Также следует отметить, что при отсутствии в договоре условий о том, кто будет заниматься перевозкой товара, доставкой последнего до места назначения занимается поставщик. Он также решает вопросы о способах, виде транспорта, тары и иные вопросы, касающиеся непосредственно перевозки товара и доставки его по месту назначения. Расходы по перевозке товаров распределяются в соответствии с договором, а если такие условия отсутствуют, то в равных частях или иным способом, а при недостижения согласия в порядке, определяемым судом.
Положения о поставляемом товаре, его ассортименте, комплектности и т.д. решается на основе общих статей о купле-продаже с учетом специфики договора поставки. При этом необходимо иметь в виду, что действующими до сих пор Инструкцией о порядке приемки продукции производственно — технического назначения и товаров народного потребления по количеству, утвержденной Постановлением Госарбитража СССР от 15.06.65 N П-6, и Инструкцией о порядке приемки продукции производственно — технического назначения и товаров народного потребления по качеству, утвержденной Постановлением Госарбитража СССР от 25.04.66 N П-7, стороны договора могут руководствоваться только в случаях, когда это прямо предусмотрено самим договором.
Также необходимо заметить, что при расчетах за товар платежными поручениями, когда иные порядок и форма расчетов, а также срок оплаты товара соглашением сторон не определены, покупатель должен оплатить товар непосредственно после получения, и просрочка с его стороны наступает по истечении предусмотренного законом или в установленном им порядке срока на осуществление банковского перевода, исчисляемого со дня, следующего за днем получения товара.
Еще одной особенностью договора поставки является возможность одностороннего отказа от исполнения договора. Такое досрочное расторжение договора возможно по воле как поставщика так и покупателя при наличии ряда условий (ст. 523 ГК РФ).
Следует особо выделить тот момент, что на фоне основного принципа гражданско-правовой ответственности за вину, ответственность в предпринимательских отношениях вообще и, в частности, по договору поставки строится на смешанных началах.
По общему правилу, ответственность по договору поставки не наступает только при наличии непреодолимой силы, объективно не зависящей от стороны по договору, к коим не относятся всяческие потрясения на рынке или отсутствие, например, денежных средств у должника. В остальных же случаях при нарушении положений договора, недобросовестная сторона автоматически превращается в должника. Т.е., для наступления ответственности, совершенно не требуется наличие вины, достаточно лишь возникновение факта нарушения своих обязательств по договору.
В то же время, при наличии вины кредитора, размер ответственности должника может быть уменьшен, и весьма значительно. Также практический интерес представляет условие договора об ответственности участников договора за действия третьих лиц: например, ответственность поставщика за действия перевозчика, покупателя — за действия получателя товара. Одновременно, закон дает возможность субъекту (поставщику или покупателю), исполнившему обязательства, вытекающие из наступившей ответственности, возместить свои убытки путем предъявления регрессного иска к соответствующему лицу (соответственно, перевозчику или получателю).
Итак, подведем итог. Несмотря на кажущуюся простату договора поставки, при заключении последнего, особенно с новым контрагентом, во избежание негативных последствий рекомендуем обратиться к профессиональному юристу за консультацией. В следующем номере мы расскажем об особенностях договора займа, в том числе между юридическими лицами, налогообложении сторон договора займа и сложившейся в связи с этим практике. До встречи.
Юрист ООО «Юридическая фирма «Эксперт»
Ким Владимир

Не все физические ошибки могут быть линейными картами CPTP в корреляционном пространстве

Допущение

В этой статье мы делаем следующие предположения: Поскольку MPS, уравнение. (1), представляет собой состояние ресурса для квантовых вычислений на основе измерений, мы можем предположить без ограничения общности, что A [α _{θ, φ}], A [β _{θ, φ}], A [2], A [3],…, A [ d — 1] унитарны с точностью до констант:

, где c _α, c _β, c ₂,… c _d ₋₁ — действительные положительные числа, U _α, U _β, U ₂,…, U d _-1 являются унитарными операторами, а

Это означает, что любая операция, реализованная в корреляционном пространстве путем измерения на одном физическом кудите, является унитарной.Обратите внимание, что это предположение является разумным, поскольку в противном случае не представляется полезным в качестве ресурса для квантовых вычислений, основанных на измерениях. Фактически, все известные на данный момент состояния ресурсов, включая состояние кластера и состояние AKLT, удовлетворяют этому предположению, соответствующим образом меняя каждый локальный физический базис. Кроме того, мы можем взять c _α, c _β, c ₂,…, c _d _-1 так, что

и мы можем переопределить.

Моделирование состояния AKLT с помощью ансамблевого метода

Рассмотрим сначала прямое применение ансамблевого метода, описанного в [5,16]. ^18,19, который использовался для состояния кластера, в состояние AKLT. Как показано в работах. ^18,19, все физические ошибки могут быть линейными картами CPTP в корреляционном пространстве состояния кластера. (Это также относится к состоянию трикластера ³⁰. См. Разделы III и IV дополнительных материалов.) Однако здесь мы показываем, что если мы непосредственно применим метод ансамбля к состоянию AKLT, не все физические ошибки могут быть устранены. линейные карты CPTP в корреляционном пространстве состояния AKLT.

Грубо говоря, в методе ансамбля мы рассматриваем смесь всех результатов измерений (историй измерений) на этапе прямой связи. Для состояния кластера это работает хорошо, поскольку желаемая операция затвора может быть реализована детерминированно из-за прямой связи, и если мы отследим состояния, которые зарегистрировали результаты каждого измерения после прямой связи, все состояние снова станет чистым. (Подробнее см. Ref. ¹⁹ и дополнительные материалы.)

Одномерное состояние AKLT — это состояние матричного произведения, определяемое как d = 3, A [0] = X , A [1] = XZ и A [2 ] = Z . Предположим, что ошибка CPTP, где, возникает на физическом кутрите состояния AKLT. Если мы моделируем квантовые схемы в корреляционном пространстве состояния AKLT после этой ошибки методом ансамбля, карта

реализуется в корреляционном пространстве, где Ξ _j — это определенные операторы, которые зависят от { F _j}.(Подробности см. В разделе II дополнительных материалов.) Например, рассмотрим ошибку с. Тогда мы можем показать, что

, где δ — некоторое положительное число. Это означает, что карта _AKLT не является линейной CPTP.

Интуитивные объяснения

Мы видели, что метод ансамбля из работ [10,11]. ^18,19 для состояния кластера не может быть напрямую применено к другим состояниям ресурсов, таким как одномерное состояние AKLT. Почему состояние кластера такое особенное? И почему это не работает для других состояний ресурсов? Хотя полный ответ на эти вопросы выходит за рамки данной статьи, поскольку исследование самой QCTN не было полностью разработано (например, никто не знает необходимое и достаточное условие для того, чтобы состояния тензорной сети были универсальными состояниями ресурсов) , давайте попробуем дать здесь несколько интуитивных объяснений.

Рисунок 1 иллюстрирует причину, по которой все физические ошибки становятся картами CPTP в корреляционном пространстве одномерного состояния кластера. Давайте сначала рассмотрим идеальный случай (а), где нет ошибки. Фактический протокол (a-1) математически эквивалентен изображению «ввод-вывод» (a-2), где физическое состояние ввода | ψ〉 телепортируется на левый край короткой цепочки кластеров (обозначено желтым ), и, наконец, физическое состояние выхода | ψ ′〉 извлекается из правого края короткой цепочки кластеров (обозначено желтым цветом).Поскольку и | ψ〉, и | ψ ′〉 являются физическими состояниями, то, что происходит в корреляционном пространстве, которое отображает входное состояние | ψ〉 в выходное состояние | ψ ′〉, можно описать линейной операцией CPTP. Другими словами, если мы можем описать основанные на измерениях квантовые вычисления с помощью этого изображения «ввод-вывод» ¹⁹, карта, реализованная в корреляционном пространстве, гарантированно будет линейной операцией CPTP ¹⁹.

Рисунок 1
Изображение «ввода-вывода» для состояния одномерного кластера.
Для состояния кластера это изображение «ввода-вывода» также сохраняется, даже если есть ошибка. ¹⁹: В несовершенном случае, рис. 1 (b), предположим, что состояние ввода ухудшается из-за ошибки и переходит в смешанное состояние ρ. Мы также предполагаем, что измерения несовершенны. Тем не менее, мы все еще можем рассмотреть аналогичное изображение «ввода-вывода» (b-2) ¹⁹, которое соответствует фактическому протоколу (b-1), и снова физическое состояние ρ отображается в другое физическое состояние ρ ‘, которое означает, что то, что происходит в корреляционном пространстве, которое отображает ρ в ρ ‘, может быть описано линейной операцией CPTP.

Обратите внимание, что два специальных свойства состояния кластера позволяют получить такую картинку «ввод-вывод». Во-первых, состояние одномерного кластера можно разложить на небольшие части состояний одномерного кластера, применяя унитарные операции двух тел ближайшего соседа (то есть вентили C Z ). Как видно из рис. 1 (a-2) и (b-2), это свойство необходимо для разрешения изображения «ввод-вывод». Во-вторых, количество кубитов, которые измеряются, чтобы реализовать конкретный вентиль, не зависит от результатов измерения.Другими словами, для состояния кластера может быть реализован конкретный вентиль вплоть до побочных продуктов Pauli на фиксированном узле независимо от результатов измерения. Такая детерминированная реализация логического элемента на фиксированном узле необходима для детерминированного (т. Е. Сохраняющего след) «выхода» в изображении «вход-выход», поскольку в методе ансамбля ансамбль (смесь) всех результатов измерений считаются: Если место, где желаемая операция затвора завершена, зависит от результатов измерения, мы не сможем извлечь такое же выходное состояние на фиксированном сайте независимо от результатов измерения, как показано на рис.1 (а-2) и (б-2).

С другой стороны, такое изображение «ввода-вывода» кажется невозможным для одномерного состояния AKLT по следующим двум причинам: во-первых, как показано на рис. 2 слева, нет двух ближайших соседей. Унитарная операция с телом может разложить одномерную цепочку AKLT на две цепочки из-за существования отличной от нуля двухточечной корреляции в состоянии AKLT. (Если одномерная цепочка AKLT может быть разложена на две цепочки таким унитаром, это противоречит хорошо известному факту, что двухточечная корреляция не обращается в нуль в состоянии AKLT.Во-вторых, мы не можем детерминированно реализовать конкретный вентиль на фиксированном участке цепочки AKLT независимо от результатов измерений ^4,5,28. Короче говоря, картина «ввод-вывод» кажется невозможной для состояния AKLT. Если мы больше не можем использовать изображение «вход-выход», вполне разумно, что у нас есть некоторые аномальные карты в корреляционном пространстве, поскольку корреляционное пространство — это не физическое пространство, а абстрактное математическое пространство.

	Режим наследования	Локус гена	Ген	Мутации	Ссылка
Раннее начало FECD
		AD ^**	1p34.3-p32.3	COL8A2	Q455K L450W Q455V	46, 47, 54–57
Позднее начало FECD	13pTel-q12.13	Неизвестно		64
FCD2 / FECD3 (OMIM)	AD	18q21.2-q21.32
FCD3 / FECD5 (OMIM)	AD	5q33.1-q35.2	Неизвестно		66
FECD4 (OMIM)	?	20p13-p12	SLC4A11	E399K G709E T754M c.99-100delTC	28
	Комплексное 40		Неизвестно	X,	Неизвестно
	AD	1 (53 см) 17q (107-126 см)	Неизвестно		67

Рисунок 2
Слева: состояние AKLT не может быть разложено на две цепочки локальным унитаром.Справа: тензорная сеть реф. ³¹.
Моделирование квантовых схем методом траектории
Как мы видели, для общих состояний ресурсов не всегда возможно реализовать конкретный вентиль в фиксированном месте независимо от результатов измерения. Этот факт запрещает общему состоянию ресурса допускать изображение «ввода-вывода». Можно подумать, что если мы откажемся от такого детерминированного «выхода» на фиксированном участке для всех результатов измерений и если мы просто рассмотрим конкретную историю (траекторию) результатов измерений, мы сможем избежать появления ошибок, не связанных с CPTP, например _AKLT.(Физически это означает, что мы проецируем систему в чистое состояние на каждом шаге измерения:
с соответствующим проектором P . Обратите внимание, что рассмотрение конкретной траектории определенных результатов измерения не означает, что если мы получим другие траектории, такие события отбрасываются, как это делается, например, в линейных оптических квантовых вычислениях. Скорее это означает, что мы описываем основанные на измерениях квантовые вычисления относительно каждой траектории, а не ансамбля всех траекторий.) Если предполагается, что система не содержит ошибок, этот «метод траектории» является еще одним стандартным способом моделирования квантовых схем в корреляционном пространстве ^4,5,6,10,28. (Обратите внимание, что в этом методе траектории правильные унитарные операторы могут быть реализованы в корреляционном пространстве, если нет ошибки, хотя то, что мы делаем физически, является проекциями, то есть операциями, не сохраняющими след).
Однако здесь мы показываем, что такой естественный другой способ моделирования квантовых схем не работает, если d ≥ 3.Другими словами, мы можем показать следующую теорему. (Для доказательства см. Методы.)
Теорема: Если d ≥ 3, существует ошибка CPTP с одним кудитом, которая имеет следующее свойство: предположим, что она применяется к единственному физическому кудиту уравнения. (1). Если измерение выполняется для этого затронутого qudit и если в результате вся система проецируется в чистое состояние, в корреляционном пространстве реализуется операция без TP.
Первоначальный отчет Hunter Outcome Survey
1
Neufeld EF, Muenzer J, Мукополисахаридозы.В: Scriver CR, редактор. Метаболические и молекулярные основы наследственного заболевания. Нью-Йорк: Макгроу-Хилл, 2001; 3421–3452
2
Бах Г., Айзенберг Ф. младший, Канц М., Нойфельд Э. Ф. Дефект синдрома Хантера: дефицит сульфоидуронатсульфатазы. Proc Natl Acad Sci U S A 1973; 70 : 2134–2138.
CAS Статья Google ученый
3
Baehner F, Schmiedeskamp C, Krummenauer F, et al.Совокупные показатели заболеваемости мукополисахаридозами в Германии. J Inherit Metab Dis 2005; 28 : 1011–1017.
CAS Статья Google ученый
4
Мейкл П.Дж., Хопвуд Дж.Дж., Клэг А.Е., Кэри В.Ф. Распространенность лизосомных нарушений накопления. JAMA 1999; 281 : 249–254.
CAS Статья Google ученый
5
Poorthuis BJ, Wevers RA, Kleijer WJ, et al.Частота лизосомных болезней накопления в Нидерландах. Hum Genet 1999; 105 : 151–156.
CAS Статья Google ученый
6
Нельсон Дж. Заболеваемость мукополисахаридозами в Северной Ирландии. Hum Genet 1997; 101 : 355–358.
CAS Статья Google ученый
7
Нельсон Дж., Кроухерст Дж., Кэри Б., Жадность Л.Заболеваемость мукополисахаридозами в Западной Австралии. Am J Med Genet 2003; 123 : 310–313.
Артикул Google ученый
8
Лоури РБ, Ренвик DH. Относительная частота синдромов Херлера и Хантера. N Engl J Med 1971; 284 : 221–222.
CAS PubMed Google ученый
9
Эпплгарт Д.А., Тун-младший, Лоури РБ.Частота врожденных нарушений обмена веществ в Британской Колумбии, 1969–1996 гг. Педиатрия 2000; 105 : e10.
CAS Статья Google ученый
10
Уилсон П.Дж., Сазерс Г.К., Каллен Д.Ф. и др. Частые делеции в Xq28 указывают на генетическую гетерогенность синдрома Хантера. Hum Genet 1991; 86 : 505–508.
CAS Статья Google ученый
11
Kim CH, Hwang HZ, Song SM, et al.Мутационный спектр гена идуронат-2-сульфатазы у 25 неродственных пациентов с синдромом Корейского Хантера: идентификация 13 новых мутаций. Hum Mutat 2003; 21 : 449–450.
CAS Статья Google ученый
12
Lissens W, Seneca S, Liebaers I. Молекулярный анализ в 23 семьях болезни Хантера. J Inherit Metab Dis 1997; 20 : 453–456.
CAS Статья Google ученый
13
Вафиадаки Э, Купер А, Хептинстолл ЛЭ, Хаттон CE, Торнли М, Рэйф Дж.Анализ мутаций у 57 неродственных пациентов с МПС II (болезнь Хантера). Arch Dis Child 1998; 79 : 237–241.
CAS Статья Google ученый
14
Young ID, Harper PS. Естественное течение тяжелой формы синдрома Хантера: исследование на 52 случаях. Dev Med Child Neurol 1983; 25 : 481–489.
CAS Статья Google ученый
15
Young ID, Harper PS.Легкая форма синдрома Хантера: клиническая картина по 31 случаю. Arch Dis Child 1982; 57 : 828–836.
CAS Статья Google ученый
16
Мартин Р., Бек М., Джульяни Р., Харматц П., Муньос М.В., Мюнцер Дж. Распознавание и диагностика мукополисахаридоза II (синдрома Хантера). Педиатрия 2008; 121 : e377 – e386.
Артикул Google ученый
17
Coppa GV, Gabrielli O, Zampini L, et al.Трансплантация костного мозга при синдроме Хантера (мукополисахаридоз типа II): двухлетнее наблюдение за первым итальянским пациентом и обзор литературы. Ped Med Chir 1995; 17 : 227–235.
CAS Google ученый
18
Маккиннис Э.Дж., Зульцбахер С., Рутледж Дж. С., Сандерс Дж., Андерс Дж., Скотт К.Р. Трансплантация костного мозга при синдроме Хантера. J Pediatr 1996; 129 : 145–148.
CAS Статья Google ученый
19
Веллоди А., Янг Е., Купер А., Лидчи В., Винчестер Б., Рэйф Дж. Долгосрочное наблюдение после трансплантации костного мозга по поводу болезни Хантера. J Inherit Metab Dis 1999; 22 : 638–648.
CAS Статья Google ученый
20
Петерс С., Кривит В. Трансплантация гемопоэтических клеток при мукополисахаридозе IIB (синдром Хантера). Пересадка костного мозга 2000; 25 : 1097–1099.
CAS Статья Google ученый
21
Мюнцер Дж., Рэйт Дж. Э., Бек М. и др. Фаза II / III клинического исследования заместительной ферментной терапии идурсульфазой при мукополисахаридозе II (синдром Хантера). Genet Med 2006; 8 : 465–473.
CAS Статья Google ученый
22
Young ID, Harper PS.Психосоциальные проблемы при синдроме Хантера. Девелопмент по охране здоровья детей 1981; 7 : 201–209.
CAS Статья Google ученый
23
Schwartz IV, Ribeiro MG, Mota JG, et al. Клиническое исследование 77 пациентов с мукополисахаридозом II типа. Acta Paediatr Suppl 2007; 96 : 63–70.
Артикул Google ученый
24
Young ID, Harper PS.Отдаленные осложнения синдрома Хантера. Clin Genet 1979; 16 : 125–132.
CAS Статья Google ученый
25
Морхед Дж. М., Парсонс Д. С.. Трахеобронхомаляция при синдроме Хантера. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 1993; 26 : 255–261.
CAS Статья Google ученый
26
Benson PF, Button LR, Fensom AH, Dean MF.Поясничный кифоз при болезни Хантера (МПС II). Clin Genet 1979; 16 : 317–322.
CAS Статья Google ученый
27
Брама I, Гей I, Фейнмессер Р., Спрингер К. Обструкция верхних дыхательных путей при синдроме Хантера. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 1986; 11 : 229–235.
CAS Статья Google ученый
28
Национальная образовательная программа по вопросам высокого кровяного давления Четвертый отчет о диагностике, оценке и лечении высокого кровяного давления у детей и подростков. Педиатрия 2004; 114 : 555–576.
Артикул Google ученый
29
Kuczmarski RJ, Ogden CL, Guo SS, et al. Диаграммы роста CDC 2000 для США: методы и развитие. Vital Health Stat 2002; 11 : 1–190.
Google ученый
30
Nellhaus G. Окружность головы от рождения до восемнадцати лет. Практические составные международные и межрасовые графики. Педиатрия 1968; 41 : 106–114.
CAS PubMed Google ученый
31
Хантер С. Редкое заболевание у двух братьев. Proc R Soc Med 1917; 10 : 104–116.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
32
Чобанян А.В., Бакрис Г.Л., Блэк Х.Р. и др. Седьмой отчет Объединенного национального комитета по профилактике, обнаружению, оценке и лечению высокого кровяного давления: отчет JNC 7. JAMA 2003; 289 : 2560–2571.
CAS Статья Google ученый
33
Who Многоцентровая контрольная группа по изучению роста Исследование развития моторики ВОЗ: окна достижений для шести основных этапов развития моторики. Acta Paediatr Suppl 2006; 450 : 86–95.
Google ученый
34
Schum TR, Kolb TM, McAuliffe TL, Simms MD, Underhill RL, Lewis M.Последовательное приобретение навыков приучения к туалету: описательное исследование гендерных и возрастных различий у нормальных детей. Педиатрия 2002; 109 : E48.
Артикул Google ученый
35
Швартинг А., Дехаут Ф., Фериоцци С. и др. Заместительная ферментная терапия и функция почек у 201 пациента с болезнью Фабри. Клин Нефрол 2006; 66 : 77–84.
CAS Google ученый
36
Linhart A, Kampmann C, Zamorano JL, et al.Сердечные проявления болезни Андерсона-Фабри: результаты международного исследования результатов Фабри. Eur Heart J 2007; 28 : 1228–1235.
Артикул Google ученый
37
Eng CM, Fletcher J, Wilcox WR, et al. Болезнь Фабри: исходные медицинские характеристики когорты из 1765 мужчин и женщин в реестре Фабри. J Inherit Metab Dis 2007; 30 : 184–192.
CAS Статья Google ученый
38
Pastores GM, Arn P, Beck M, et al.Реестр MPS I: дизайн, методология и первые результаты глобального реестра заболеваний для мониторинга пациентов с мукополисахаридозом типа I. Mol Genet Metab 2007; 91 : 37–47.
CAS Статья Google ученый
39
Каплан П., Андерссон Х.С., Касена К.А., Йи Дж.Д. Клинико-демографические характеристики ненейронопатической болезни Гоше у 887 детей при постановке диагноза. Arch Pediatr Adolesc Med 2006; 160 : 603–608.
Артикул Google ученый
40
Собрейра Э, Пирес РФ, Чизмарик М, Грабовский Г.А. Фенотипическая и генотипическая гетерогенность при болезни Гоше 1 типа: сравнение Бразилии и остального мира. Mol Genet Metab 2007; 90 : 81–86.
CAS Статья Google ученый
41
Weinreb NJ, Aggio MC, Andersson HC, Andria G и др.Болезнь Гоше 1-го типа: пересмотренные рекомендации по обследованию и мониторингу для взрослых пациентов. Semin Hematol 2004; 41 : 15–22.
Артикул Google ученый
42
Венструп Р.Дж., Касена К.А., Каплан П.и др. Влияние заместительной ферментной терапии имиглюцеразой на МПК при болезни Гоше 1 типа. J Bone Miner Res 2007; 22 : 119–126.
CAS Статья Google ученый
43
Charrow J, Dulisse B, Grabowski GA, Weinreb NJ.Влияние заместительной ферментной терапии на костный перелом и боль в костях у пациентов с болезнью Гоше 1 типа. Clin Genet 2007; 71 : 205–211.
CAS Статья Google ученый
Фукс эндотелиальная дистрофия роговицы
Abstract
Фукс эндотелиальная дистрофия роговицы (FECD) характеризуется прогрессирующей потерей эндотелиальных клеток роговицы, утолщением мембраны Десцемента и отложением внеклеточного матрикса в форме кишок.Когда количество эндотелиальных клеток становится критически низким, роговица отекает и вызывает потерю зрения. Клинический курс FECD обычно составляет 10–20 лет. Трансплантация роговицы в настоящее время является единственным методом восстановления зрения. За последние несколько десятилетий генетические исследования выявили несколько генов, а также области хромосомных локусов, связанных с заболеванием. Протеомные исследования породили несколько гипотез относительно патогенеза FECD. Этот обзор расширяет недавние результаты протеомных и генетических исследований и основывается на последних достижениях в понимании причин этого распространенного заболевания роговицы.
Ключевые слова: Фукс эндотелиальная дистрофия роговицы, эндотелий роговицы, протеомика, генетика, патофизиология, окислительный стресс, апоптоз, антиоксиданты, коллаген VIII
I. ВВЕДЕНИЕ Fuchs
Цель этой недавней статьи — обзор и обзор результатов. эндотелиальная дистрофия роговицы ( FECD ) с акцентом на генетику и молекулярные механизмы. В последнее десятилетие была проделана обширная работа по определению патогенеза FECD, включая классификацию подтипов FECD, открытие новых мутаций, картирование хромосомных локусов и исследование нескольких гипотез относительно этиологии заболевания.Протеомный и геномный анализы дополнительно пролили свет на молекулярные механизмы, измененные в FECD. Эти направления исследований обеспечивают новую основу для выяснения первичной этиологии FECD и будут резюмированы в этом обзоре.
II. МЕТОДЫ
Идентификация данных производилась посредством обширного компьютерного поиска в PubMed статей на английском языке с последующей перекрестной проверкой их ссылок. В этот обзор были включены статьи, содержащие последние данные о патофизиологии, генетике и протеомике FECD.Выборка данных включала опубликованные оригинальные работы по FECD и информацию, содержащуюся в нескольких обзорных статьях по этому заболеванию; статьи до июня 2009 г. были включены.
III. ЧТО МЫ ЗНАЕМ
A. Обзор
Эндотелий роговицы расположен во внутренней части роговицы и выполняет ключевую функцию по поддержанию прозрачности роговицы. Эндотелий роговицы ( CE, ) образует монослой гексагональных клеток, который прикреплен к его базальной мембране, называемой мембраной Десцемета ( DM ), и находится в прямом контакте с водянистой влагой.Одной из основных функций CE является сохранение прозрачности роговицы за счет функций эндотелиального барьера и помпы. Эрнст Фукс описал двустороннюю дистрофию роговицы в 1902 году, позже опубликованную в 1910 году, ¹, теперь известную как FECD. Считается, что первичный дефект связан с функционированием слоя эндотелиальных клеток, что подтверждается ультраструктурными исследованиями. ² FECD характеризуется морфологическими изменениями гексагональной мозаики, ускоренной потерей эндотелиальных клеток и сопутствующим увеличением отложения внеклеточного матрикса на уровне СД.В результате эндотелиальный слой в конечном итоге больше не может поддерживать расщепление роговицы (состояние, при котором строма роговицы поддерживается относительно обезвоженной), что приводит к отеку роговицы и снижению остроты зрения (). Эти данные обычно становятся клинически очевидными в четвертом и пятом десятилетиях жизни. ³ ^— ⁵ Сначала пациент замечает нечеткое зрение, затем симптомы прогрессируют по мере прогрессирования болезни через свои стадии, часто заканчивающиеся слепотой.
Патогенез FECD. Генетические факторы и факторы окружающей среды приводят к потере эндотелиальных клеток роговицы, что приводит к отеку роговицы и нечеткости зрения. Некоторые характерные гистологические находки включают морфологические изменения эндотелиальных клеток, утолщение десцеметовой мембраны и образование кишок.
B. Клиническая стадия
В прошлом использовалось несколько систем стадирования для FECD; одна из часто используемых систем описывает развитие болезни в четыре этапа. ⁶ ^, ⁷
Стадия 1
На этом этапе биомикроскопия роговицы выявляет гутты роговицы, которые представляют собой бугорчатые наросты, растущие из DM, которые считаются отличительным признаком FECD.Кишки обычно начинаются в центральной части роговицы и распространяются к периферии. На этой стадии кишки обычно центральные и не сливаются. На этом этапе у пациентов нет симптомов.
Стадия 2
На этой стадии роговичные кишки начинают сливаться и распространяться дальше к периферической роговице. Гутты растут вдоль DM и сопровождаются истончением, увеличением и потерей гексагональной формы эндотелиальных клеток. ⁸ ^, ⁹ Число гутт обратно пропорционально плотности эндотелиальных клеток, поскольку слияние гутт сопровождается постоянной потерей эндотелиальных клеток.Пациенты начинают испытывать безболезненное снижение зрения и симптомы ослепления из-за нарастания отека стромальных слоев.
Стадия 3
На этой стадии отек стромы прогрессирует в направлении эпителиального слоя и вызывает образование эпителиальных и субэпителиальных булл. ⁶ Разрыв этих булл вызывает приступы боли ¹⁰ ^, ¹¹ и подвергает пациента более высокому риску инфицирования.
Стадия 4
На этой стадии роговица становится плотно непрозрачной и васкуляризованной.⁶ ^, ⁷ В ответ на длительный и хронический отек происходит отложение субэпителиальной фиброзной ткани. На этом этапе острота зрения сильно снижается, но обычно боль утихает.
Интересно, что также описана не гуттовая форма FECD. не относится к категории FECD.¹⁵ Гутты роговицы, обнаруженные только на периферии, могут быть нормальным явлением у стареющего населения и называются тельцами Хассаля-Генле и никогда не приводят к отеку роговицы. ⁶ ^, ⁹ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ Стволы роговицы также могут образовываться вторично после травмы, ⁷ токсинов, ¹⁷ или инфекций. ¹⁸ ^— ²¹ Таким образом, диагноз FECD не может быть поставлен только на основании наличия роговичных гутт; Также должен присутствовать отек роговицы.
C. Новая классификация и наследование IC3D
Новая классификация IC3D для дистрофий роговицы состоит из четырех категорий, которые отражают известные генетические и патологические доказательства данной дистрофии. ²² FECD попадает в категории 1-3 по классификации IC3D. Категория 4 зарезервирована для подозрений на новую дистрофию роговицы и не соответствует профилю FECD. Некоторые из наследственных случаев FECD являются аутосомно-доминантными. ²³
Категория 1 указывает на четко выраженную дистрофию роговицы, при которой ген был идентифицирован и известна конкретная мутация.FECD с ранним началом, сопоставленный с COL8A2 (FECD C1), попадает в эту категорию. Раннее начало FECD обычно начинается в первом десятилетии и становится клинически выявляемым в течение 2 ^-го-го и 3 ^-го-го десятилетий.
Категория 2 указывает на четко выраженную дистрофию роговицы, которая была картирована в 1 или несколько конкретных хромосомных локусов, но ген (ы) еще предстоит идентифицировать. Семейный FECD включен в эту категорию (FECD C2), где были картированы несколько хромосомных локусов.Семейный FECD описывается в литературе как преимущественно аутосомно-доминантное заболевание. ²³ ^— ²⁵
Категория 3 указывает на четко выраженную дистрофию роговицы, при которой хромосомный локус не был идентифицирован, и включает большой процент семейных случаев FECD.
Примечание (1) классификация IC3D применяется только к наследственным случаям FECD и не применяется, если нет доказательств наследования. (2) Некоторые авторы утверждают, что большинство случаев FECD больше похоже на дегенерацию, чем на дистрофию из-за позднего начала FECD, отсутствия семейного анамнеза болезни и случайной асимметричной картины, обычно связанной с дегенерацией.⁶ ^, ⁸
D. Распространенность
FECD можно разделить на раннее начало (проявляющееся в 3 ^{-й декаде} года жизни) и позднее начало (проявляющееся в 5 ^{-й декаде} года). жизнь, в среднем). Формы как с ранним, так и с поздним началом имеют преобладание самок в соотношении 2,5–3: 1. ³ ^, ¹² ^, ²³ ^— ²⁶ Хотя некоторые авторы не сообщают о расовом неравенстве, ¹⁵ Santo et al.Номер ²⁷ заявил, что FECD крайне редко встречается в Японии. Это также необычно для Саудовской Аравии и китайцев Сингапура. ²⁸ В США распространенность составляет примерно 4% населения старше 40 лет. ²⁶ Трудности, с которыми сталкиваются многие исследователи при выполнении анализа распространенности с помощью FECD, заключаются в позднем начале заболевания и нехватке полных родословных. живых пациентов с FECD для анализа. Вялотекущее течение болезни позволяет многим пациентам с FECD оставаться невыявленными и потенциально снижает статистическую силу результатов исследований.Это способствует различию в отчетах о пенетрантности и соотношении полов. Magovern et al. ²⁵ сообщили о равном соотношении женщин и мужчин со 100% пенетрантностью у 16 больных из четырех поколений, в то время как Rosenblum et al. ²⁴ сообщили о соотношении женщин и мужчин 7: 1 с переменной выраженностью и повышенной тяжестью в женской популяции. Их результаты были объединены с 102 пациентами из 25 семей.
E. Сопутствующие условия
Существуют противоречивые данные о том, существует ли связь с открытоугольной глаукомой и FECD.²⁹ ^— ³¹ Бакстон и др. ³⁰ обнаружили, что дренаж водянистой жидкости был уменьшен в глазах пациентов с FECD по сравнению с нормальным контролем. Исследование пришло к выводу, что трабекулярная сеть может быть вовлечена в процесс болезни. Точно так же исследования показали, что внутриглазное давление у пациентов с FECD значительно выше, чем у здоровых людей. Кроме того, возможна ошибка занижения из-за значительного увеличения центральной толщины роговицы, обнаруженного у пациентов с FECD.³² Напротив, другие исследования не обнаружили ухудшения оттока воды ³¹ и никакой связи между открытоугольной глаукомой и FECD. ²⁵
FECD был связан с более высокой заболеваемостью кератоконусом ³³ ^— ³⁵, возрастной дегенерацией желтого пятна ³⁶ и сердечно-сосудистыми заболеваниями. ³⁷ В отчете Олсена предполагалось, что повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний у 27 обследованных пациентов с FECD (44% против 11%) был вызван патологией общего эндотелиального фактора, ³⁷, хотя известно, что происхождение эндотелиальных клеток роговицы отличается от эндотелия сосудов.Возможно, что такие зарегистрированные ассоциации заболеваний связаны с более сложным взаимодействием восприимчивости пациентов к факторам окружающей среды, что приводит к преждевременным дегенеративным изменениям не только в CE, но также в тканях сетчатки и сердечно-сосудистой системы.
F. Барьер или дисфункция помпы
Эндотелиальные клетки представляют собой селективные барьеры, позволяющие утечке растворенных веществ и питательных веществ из водянистой влаги в бессосудистую роговицу. С другой стороны, насосы Na-K АТФазы, расположенные в базолатеральных мембранах CE, активно транспортируют жидкость из роговицы и обратно в водянистую влагу, чтобы поддерживать роговицу в относительном состоянии детургесценции.Дисфункция барьера или насосов приводит к отеку роговицы, как видно из FECD.
Burns et al. ³⁸ изучали пациентов с FECD с увеличенной толщиной центральной роговицы, но без отека эпителия. Основным открытием было увеличение скорости проницаемости в FECD CE без разницы в скорости накачки, предполагая, что самый ранний дефект в FECD — это нарушение барьерной функции эндотелиальный монослой, который вызывает повышенный поток жидкости в роговицу без достаточного компенсаторного увеличения насосной функции.Однако в более позднем исследовании Wilson et al. ³⁹ не обнаружили никакой разницы в скорости проницаемости у большей выборки пациентов с FECD по сравнению с нормальными добровольцами, предполагая, что скорость накачки снижена, а барьерная функция не нарушена в FECD. Несоответствие между двумя исследованиями может отражать тот факт, что помповая и барьерная функции могут по-разному влиять на разные стадии заболевания.
Несколько других исследований показали, что измененная дисфункция помпы играет ключевую роль в FECD.Бергмансон и др. ⁴⁰ исследовали гистопатологические срезы роговицы FECD и обнаружили, что аберрантное отложение внеклеточного матрикса вызывает растяжение и истончение CE-клеток, расположенных на вершине кишок. Тела клеток были смещены к периферии ствола гутт, в то время как над вершинами гутт клеточные мембраны остались нетронутыми. Поскольку на этих растянутых участках не было места для органелл, авт. Утверждали, что маловероятно, что функция насоса CE клеток не нарушена на этих участках.Аналогичным образом, другие исследования насосной активности Na-K-АТФазы при отеке роговицы, такие как наблюдаемые при FECD и псевдофакической буллезной кератопатии ( PBK ), показали, что плотность помпы заметно снижается в терминальной стадии заболевания. ⁴¹ Таким образом, потеря эндотелиальных клеток приводит к нарушению барьерной функции. Даже несмотря на то, что оставшиеся эндотелиальные клетки пытаются компенсировать это за счет увеличения насосной функции, продолжающаяся потеря клеток приводит к критически низкому количеству участков накачки и неспособности роговицы поддерживать детургесцентное состояние.
G. Гистопатология
Поскольку эндотелиальные клетки задерживаются в постмитотическом состоянии и проявляют минимальную способность к делению in vivo, потеря эндотелиальных клеток, наблюдаемая при FECD, является постоянной. Наряду со снижением количества эндотелиальных клеток, в мозаике эндотелиальных клеток роговицы наблюдаются заметные морфологические изменения, которые клинически видны при зеркальной микроскопии (). Вариабельность размера эндотелиальных клеток роговицы человека ( HCEC ) обозначается как полимегатизм, а вариабельность формы эндотелиальных клеток — плеоморфизм.Темные овальные и круглые области между гиперрефлективными деформированными эндотелиальными клетками представляют собой кишки.
Зеркальная микроскопия пациента с FECD. Стрелки указывают на вариабельность, наблюдаемую в размере эндотелиальных клеток роговицы (полимегатизм) и форме (плеоморфизм). Звезды обозначают гутты.
Хотя большинство исследователей согласны с тем, что первичная аномалия FECD лежит в эндотелии, дегенеративные изменения были обнаружены во всех слоях роговицы, пораженной FECD.Ультраструктурные исследования FECD предполагают, что первичное заболевание находится в эндотелии роговицы и что сопутствующие изменения в десцеметовой мембране, строме и эпителии вторичны по отношению к патологии. ² ^, ³ ^, ⁶ Эндотелий роговицы пациентов с FECD показал заметную шероховатую эндоплазматическую сеть, лизосомы и повышенное присутствие покрытых везикул в цитоплазме. Некоторые эндотелиальные клетки показали заметные цитоплазматические процессы, которые привели к гипотезе трансформации эндотелиальных клеток в фибробласты при FECD.² ^, ³ ^, ⁶ Кроме того, в эндотелиальных клетках были обнаружены заметные меланосомы вместе с набухшими митохондриями, расширенным грубым эндоплазматическим ретикулумом и расширенными межклеточными пространствами. ⁴² Важно отметить, что электронно-микроскопические исследования роговицы FECD выявили дегенерацию всех слоев, включая стромальные кератоциты, эпителий и фибриллы стромального коллагена.
При нормальном развитии тонкие и короткие нити откладываются перпендикулярно плоскости DM и обнаруживаются уже на 4-м месяце беременности.Пренатальный СД является пластинчатым и образует полосчатые слои, которые можно различить примерно на 8-м месяце беременности. ⁴³ ^, ⁴⁴ Этот полосатый слой позади стромы называется передним полосчатым слоем ( ABL ). Этот процесс изменяется при рождении, когда отложения больше не имеют полос, образуя дискретный второй слой DM; это новое не полосчатое, неламеллярное отложение называется задним небеленым слоем ( PNBL ). ⁷ ^, ⁴⁵ Путем постепенного увеличения толщины примерно на 0.1 мкм / год нормальная PNBL достигает толщины примерно 10 мкм в возрасте 80 лет. ⁴⁶
Гистологическое и ультраструктурное сравнение нормальных роговиц FECD с ранним началом (в частности, образцов, взятых у пациентов с мутацией L450W COL8A2 ) и часто наблюдаемых роговиц с поздним началом FECD демонстрирует различные гистологические паттерны. ⁴⁶ ^, ⁴⁷ В нормальных роговицах α1 и α2 компоненты коллагена VIII равномерно распределены в ABL DM.Однако в FECD с ранним и поздним началом волокна α1 и α2 распределяются нерегулярно.
В отличие от FECD с поздним началом, FECD с ранним началом заметно утолщает ABL (10 мкм против 3,1 мкм). ⁴⁴ ^, ⁴⁵ Поскольку предполагается, что ABL развивается на раннем этапе жизни плода, изменения ABL, как видно при раннем начале FECD, могут представлять патологические процессы, которые начинаются в утробе матери и продолжают развиваться во взрослой жизни. ² ^, ⁴⁶ Другой характерной гистологической находкой при раннем начале FECD является образование нового слоя, называемого задним внутренним коллагеновым слоем (ICL) , который содержит плотный волокнистый компонент и широко расставленный коллаген, расположенный беспорядочно. .Большая задняя часть DM при раннем начале FECD состоит из заднего поперечно-полосатого слоя ( PSL ), который содержит коллаген IV, фибронектин и ламинин, аналогично базальным слоям других тканей. ⁴⁶
При позднем начале FECD характерное утолщение DM связано с отложением дополнительного, PBL , позади PNBL. ² ^, ⁷ PBL заметно утолщен, от 10 до 20 мкм, ² и содержит аномально отложенный коллаген и классические задние выросты, гутты.⁴⁶ У некоторых пациентов с поздним началом FECD даже был обнаружен задний фиброзный слой ( PFL ) между PBL и эндотелием. ² ^, ⁴⁸ ^— ⁵⁰ При СД с поздним началом FECD ABL имеет почти нормальную толщину, и основные аномалии присутствуют в послеродовых слоях. PNBL тоньше обычного или в некоторых случаях даже отсутствует. ² ^, ⁴⁶
IV. ГЕНЕТИКА
A. Ген COL8A2
Генетические мутации
Основным компонентом нормального DM является коллаген VIII типа, который секретируется эндотелием роговицы и собирается в гексагональную решетчатую структуру ⁵¹ посредством взаимодействия полипептидов коллагена VIII α1 и α2 .Обычно коллаген VIII является особенно заметной составляющей ABL DM. ⁵² ^, ⁵³ Одним из первых генетических дефектов, выявленных в FECD, были мутации в гене COL8A2 , которые связаны с ранним началом FECD ()
Таблица 1
Резюме недавних генетических исследований пациентов с FECD.
4033 104 FECD 33 102 FECD AD
Режим наследования Локус гена Ген Мутации Ссылка
Раннее начало FECD
AD ^** 1p34.3-p32.3 COL8A2 Q455K
L450W
Q455V 46, 47, 54–57
Позднее начало FECD 13pTel-q12.13 Неизвестно 64
FCD2 / FECD3 (OMIM) AD 18q21.2-q21.32
FCD3 / FECD5 (OMIM) AD 5q33.1-q35.2 Неизвестно 66
FECD4 (OMIM) ? 20p13-p12 SLC4A11 E399K
G709E
T754M
c.99-100delTC 28
Комплексное 40 Неизвестно X, Неизвестно
AD 1 (53 см)
17q (107-126 см) Неизвестно 67
Biswas et al.⁵⁴ продемонстрировали сцепление с хромосомой 1p34.3-p32 в трех поколениях семьи с высокопенетрантной формой FECD с ранним началом. Среди пострадавших в семье диагноз FECD был поставлен в возрасте от 21 до 48 лет; почти половине участников потребовалась трансплантация роговицы. После секвенирования гена у пораженных пациентов была идентифицирована миссенс-мутация Gln455Lys (Q455K) в гене COL8A2 , который кодирует цепь α2 коллагена VIII типа. Замена Gln455Lys включает замену высококонсервативного глутамина на отрицательно заряженный лизин, что может изменить третичную структуру белка.Кроме того, другое семейство с ранним началом FECD и одно семейство с задней полиморфной дистрофией ( PPCD ) продемонстрировали такую же точечную мутацию в гене COL8A2 . Поскольку коллаген VIII является основным компонентом DM и избыточно продуцируется при FECD, эта мутация указывает на возможную роль коллагена VIII в влиянии на терминальную дифференцировку эндотелиальных клеток роговицы и вызывает молекулярную дисфункцию внеклеточного эндотелиального матрикса при FECD.
Аналогичным образом, Gottsch et al.⁵⁵ проанализировали одну семью из нескольких поколений с ранним началом FECD, в которой было 17 затронутых и 5 здоровых членов семьи. Полногеномный анализ сцепления продемонстрировал новую точечную мутацию в гене COL8A2 с заменой Leu450Trp (L450W). Пациенты, пораженные мутацией, в среднем имели на 40 лет раньше начало тяжелой степени (степень 3 или выше), чем заболевание с поздним началом. Интересно, что соотношение женщин и мужчин составляло 1: 1, что не показывало преобладания женщин, как это видно при позднем начале заболевания.Кроме того, клинический фенотип заболевания отличался; Конфокальная зеркальная микроскопия выявила единственную гутту с низким возвышением, связанную с отдельными клетками в раннем начале заболевания, в отличие от резко выступающих гутт с большим возвышением и зонами слияния в позднем начале заболевания. Интересно, что скорость прогрессирования заболевания была сходной между ранней мутацией L450W и подтипами с поздним началом FECD, продолжительность которых составляет около 25 лет.
Кроме того, Mok et al. ⁵⁶ идентифицировал мутацию Q455V во 2 экзоне COL8A2 у корейских пациентов с FECD.Мутация присутствовала у 12 пациентов из 6 родословных с семейным анамнезом FECD и в 2 из 9 неродственных случаев. Внешний вид гутт был подобен таковому у пациентов с мутациями L450W и Q455K.
Несмотря на идентификацию вариантов аминокислотной последовательности COL8A2 при FECD с ранним началом, ассоциации между этими генными мутациями и более распространенными вариантами FECD с поздним началом не выявлено. в более распространенных вариантах FECD с поздним началом. Кобаяши и др. ⁵⁷ не обнаружил мутаций COL8A2 у японских пациентов с FECD.Аналогичным образом, Aldave et al. ⁵⁸ не обнаружил ассоциации между мутациями COL8A1 и COL8A2 с вариантами FECD с поздним началом.
Мыши с дефицитом коллагена VIII
Чтобы лучше понять роль коллагена VIII в развитии дистрофий роговицы, ⁵⁴ Hopfer et al. генерировали мышей с дефицитом α1 и α2 цепей коллагена VIII. ⁵⁹ Такое нарушение коллагена типа VIII не привело к гистологическим отклонениям в большинстве органов и не повлияло на фертильность, развитие или продолжительность жизни мышей.⁵⁹ На роговице, с другой стороны, были обнаружены кератоглобоподобные выпячивания с диффузным истончением стромы роговицы. DM был заметно истончен и не имел ABL, как и ожидалось, поскольку коллаж VIII является ключевым компонентом ABL. ⁵² ^, ⁵³ Никаких гутт и признаков помутнения роговицы не было. Количество HCEC было уменьшено, и наблюдались морфологические изменения в виде повышенного полиморфизма и полимегатизма. Авторы предположили, что во время эмбриологического развития коллаген VIII необходим для управления миграцией и пролиферацией мезенхимальных клеток роговицы, таким образом, отсутствие такого слоя ухудшает развитие роговицы и приводит к образованию тонких роговиц с низким числом эндотелиальных клеток.При позднем начале FECD патогенез заболевания основан на повышенной секреции коллагена VIII в более поздние годы жизни (в отличие от эмбриогенеза), что, в свою очередь, приводит к аномальному утолщению DM и апоптозу эндотелиальных клеток. Эти данные предполагают, что патогенные механизмы, скорее всего, сильно различаются у мышей с дефицитом коллагена VIII и отложения коллагена VIII у пациентов с FECD. Тем не менее, понимание взаимодействия коллагена VIII с эндотелиальными клетками может обеспечить лучшее понимание аберрантного отложения внеклеточного матрикса при FECD.
B. Ген SLC4A11
Генетический дефект в FECD
Vithana et al. ²⁸ показали, что гетерозиготная мутация в SLC4A11 связана с поздним началом FECD у 89 неродственных пациентов китайского и индийского происхождения. Только 10 из 89 пациентов имели семейный анамнез FECD, таким образом, большинство случаев были классифицированы как спорадические. В исследовании 4 новые гетерозиготные мутации гена SLC4A11 (3 миссенс-мутации и 1 делеционная мутация) были идентифицированы в когорте FECD, которые отсутствовали в более чем 350 этнически подобранных контрольных группах.Проявление фенотипа FECD у лиц с гетерозиготными мутациями SLC4A11 предполагает, что FECD будет наследоваться как доминантный признак. Они пришли к выводу, что примерно 5% FECD у китайских пациентов и 4% FECD у индийских пациентов могут быть связаны с мутациями в гене SLC4A11 .
Ген SLC4A11 кодирует NaBC1 , который является членом семейства растворенных носителей 4, которые действуют как переносчики бикарбоната и, в частности, как котранспортеры бората натрия.⁶⁰ ^, ⁶¹ Ранее было показано, что мутации в SLC4A11 вызывают врожденную наследственную эндотелиальную дистрофию ( CHED ). ⁶² Vithana et al. ²⁸ показали, что миссенс-мутации в гене SLC4A11 приводят к аберрантному гликозилированию и снижению нацеливания белка SLC4A11 на поверхность клетки, что приводит к недостаточным уровням белка SLC4A11 на поверхности эндотелиальных клеток роговицы.
SLC4A11 Нокаут-мышь
Для исследования роли NaBC1 в нейросенсорной системе млекопитающих была разработана мышь с нокаутом SLC4A11 .⁶³ Поскольку известно, что мутации в гене SLC4A11 вызывают синдром Харбояна, который проявляется потерей слуха, животные с делецией гена SLC4A11 имели значительные нарушения в аудиовестибулярной системе. С другой стороны, не наблюдалось значительных различий в размере, форме и плотности эндотелиальных клеток между совпадающими по возрасту мышами SLC4A11 — / — и SLC4A11 + / + в возрасте 3, 5 и 10 месяцев. Кроме того, DM не обнаружил каких-либо отклонений у мышей с нокаутом.Первичным фенотипическим изменением, наблюдаемым в роговице, было увеличение абсолютной высоты базальных эпителиальных клеток роговицы. Толщина центрального слоя роговицы и эпителиального слоя оставалась прежней, но отношение базального слоя к общей толщине эпителия было больше у мышей с нокаутом. Такое различие в фенотипе роговицы между людьми и мышами, дефицитными по NaBC1, может быть связано с различиями в роли NaBC1 в анатомии, физиологии, развитии и взаимодействии генов и окружающей среды между видами.Тем не менее, понимание того, почему роговица мыши не проявляет дистрофического фенотипа, может обеспечить лучшее понимание молекулярных основ FECD, а также таких состояний, как CHED.
C. Хромосомные локусы
До 2005 года единственные зарегистрированные генетические мутации, участвующие в FECD, были обнаружены в подтипе с ранним началом. ⁵⁴ ^, ⁵⁵ Первый генетический локус для более распространенного FECD с поздним началом был картирован Sundin et al. ⁶⁴ к хромосоме 13, называемой локусом 1 дистрофии роговицы Фукса ( FCD 1).Впоследствии два других локуса, FCD2 и FCD3, были картированы в хромосомах 18, ^{, 65,} и 5, ⁶⁶ соответственно. Кроме того, Afshari et al. ⁶⁷ предоставили доказательства потенциального сцепления в хромосомах 1, 7, 15, 17 и X с помощью анализа сцепления в масштабе всего генома. Некоторые из этих исследований предполагали сложный образец наследования в семейном FECD, ⁶⁷, в то время как другие указывали на аутосомно-доминантный образец. ⁶⁵ ^, ⁶⁶
Первый генетический локус для FECD с поздним началом (называемый FCD1), который был сопоставлен с 13pTel-13q12.13-й интервал соответствовал типичному аутосомно-доминантному типу наследования. ⁶⁴ Когорта состояла из 4 поколений из 20 затронутых особей европейского происхождения. Хотя сообщаемое соотношение пострадавших и незатронутых составляло 1: 1, предполагалось, что предвзятость в установлении имеет значение. Несмотря на идентификацию генетического локуса, гены-кандидаты было трудно определить. 13p12 известен как организатор ядрышка RNR1, состоящий в основном из тандемных повторов рибосомных генов 5s, 18s и 28s.⁶⁴ Гены в секвенированном q-плече интервала 13q12.11-13q12.13 были исследованы, но ни один из них не оказался основным компонентом роговицы или DM. Возможные трудности в идентификации мутации FCD1 связаны с ее доминантной природой и мягким фенотипом с поздним началом. Кроме того, мутация может происходить в некодирующей промоторной области, что вызывает умеренное изменение уровней мРНК. Другая возможность заключается в том, что мутация FCD1 может быть делецией гена, которую нельзя обнаружить с помощью обычного скрининга экзонов.⁶⁴
Второй локус для позднего начала FECD (FCD2) был сопоставлен с 18q21.2-q21.32. ⁶⁵ Это результат анализа генетического сцепления 3-х больших семей, который показал аутосомно-доминантное наследование с поздним началом FECD. Как пенетрантность (90%), так и фенокопия (22%) в этой исследуемой популяции были выше, чем в общей популяции, и могли быть объяснены систематической ошибкой установления. Хотя эта область хромосомы 18 (18q21) охарактеризована лучше, чем локус FCD1, и в настоящее время исследуются 28 потенциальных генов, конкретная мутация, вызывающая фенотип FCD2, остается неизвестной.
Совсем недавно локус FCD3 был идентифицирован в одной большой семье. ⁶⁶ Ни один из известных локусов FCD1, FCD2 и COL8A2 не был обнаружен ни в одном из членов этого семейства, а сканирование по всему геному дало сцепление в интервале 5q33.1-q35.2. Значение генов, охватывающих этот интервал, не определено, и идентификация этого третьего локуса дополнительно поддерживает гетерогенность для позднего начала FECD. FCD3 обычно менее серьезен с точки зрения возраста начала и скорости прогрессирования по сравнению с локусами FCD1 и FCD2.
В исследовании Afshari et al. ⁶⁷, первый анализ сцепления FECD по всему геному был проведен путем анализа как многопоколенческих, так и сложных семей, в отличие от других исследований, обсуждавшихся ранее. Исследование 22 семейств выявило потенциальные области сцепления на хромосомах 1, 7, 15, 17 и X. Интересно, что пик сцепления на хромосоме 1 находился всего в 3 Mb от гена COL8A2 ; однако скрининг этой популяции пациентов на наличие мутаций COL8A2, L450W и Q455K был отрицательным.Находки по хромосомам 7, 15 и X были получены как из малых, так и из больших семейных агрегатов и подтверждают идею о том, что FECD может наследоваться как аутосомно-доминантным, так и сложным образом. ⁶⁷
V. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
A. Апоптоз
Апоптоз — это признанный механизм гибели клеток, вовлеченный во множественные болезненные процессы в организме. ⁶⁸ ^— ⁷² Аналогичным образом, при FECD было показано, что апоптоз играет важную роль в гибели эндотелиальных клеток роговицы.
Borderie et al. ⁷³ были первыми, кто обнаружил апоптоз в эндотелиальных клетках с помощью методов мечения ядер, просвечивающей электронной микроскопии ( TEM ) и мечения концевых ник-концов TdT-dUTP ( TUNEL ) на роговице, пораженной FECD. Морфологическая оценка с использованием эпифлуоресцентного микроскопа после мечения ядра с помощью Hoeschst 33258 показала значительно больше апоптотических эндотелиальных клеток в образцах FECD по сравнению с нормальными; частота апоптоза составила 2,65% в группе FECD и 0.23% в контрольной группе. При использовании другого анализа апоптоза, анализа TUNEL, 42 из 47 образцов эндотелия FECD оказались положительными на апоптоз, в то время как апоптоз отсутствовал в контрольных кнопках роговицы. Однако использование ТЕА не дало убедительных доказательств апоптоза, что согласуется с предыдущими исследованиями. ² ^, ⁶ ^, ¹² ^, ⁴⁸ ^, ⁷⁴ Возможное объяснение такого несоответствия результатов заключалось в том, что только небольшой процент эндотелиальных клеток подвергался апоптозу в время анализа, что затрудняет обнаружение апоптотической эндотелиальной клетки в поперечном срезе.Кроме того, апоптоз был обнаружен в слое базальных эпителиальных клеток при FECD всеми тремя методами. ⁷³
Аналогичным образом Li et al. ⁷⁵ идентифицировали апоптоз в эндотелии, строме и эпителии роговицы FECD с помощью анализа TUNEL. Обнаружение апоптотической гибели клеток в кератоцитах при FECD, но не в других патологических образцах, вызвало гипотезу о том, что стромальные клетки потенциально могут участвовать в дегенерации эндотелия, наблюдаемой при FECD. Авторы обнаружили статистически значимое различие в продукции Bax (проапоптотический белок) в строме, но не в эндотелии роговицы FECD.Они также показали повышенный уровень Bax (проапоптотический белок), но пониженный уровень Bcl-2 (антиапоптотический белок) в кератоцитах FECD после воздействия камптотецина (индуктора апоптоза). ⁷⁵ Спорный вопрос, являются ли обнаружение апоптоза в слоях эпителиальных и стромальных клеток при FECD патогенетическим механизмом или вторичными по отношению к дегенерации эндотелия и, как следствие, отеку роговицы. Исследования, которые показывают изменение маркера апоптотических клеток в эпителиальных клетках роговицы, а не в эндотелии, в FECD ⁷⁶ могут предполагать, что эндотелий гораздо труднее окрашивать и исследовать с помощью иммуногистологических красителей в гистологических поперечных срезах.
B. Экспрессия генов и протеомный анализ
Протеомный анализ и анализ экспрессии генов могут помочь в прояснении основного механизма и этиологии FECD. Было исследовано несколько профилей экспрессии генов, и было обнаружено, что они отличаются в FECD роговице по сравнению с нормальной роговицей. На основе этого анализа появляется все больше доказательств того, что взаимодействие между генетическими факторами и факторами окружающей среды способствует сложным изменениям протеома и генома пораженных эндотелиальных клеток, и что рассмотрение таких взаимодействий позволит лучше охарактеризовать задействованные патогенные механизмы.
В некоторых начальных исследованиях использовался серийный анализ экспрессии генов ( SAGE ) для сравнения профилей экспрессии генов между эндотелием роговицы, взятым у FECD и здоровых пациентов. Анализ выявил изменение экспрессии генов, регулирующих клеточный энергетический метаболизм, насосные функции, а также апоптотическую и антиоксидантную защиту клеток. Транскрипты с пониженной регуляцией превышали транскрипты с повышенной регуляцией, и митохондриальные транскрипты составляли большинство этих генов с пониженной регуляцией.Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали снижение плотности митохондрий и участков помпы в FECD ⁴¹ ^, ⁷⁷ и указывают на возможное снижение митохондриальной доставки адекватного источника энергии. Кроме того, сравнение между библиотеками нормальных и FECD генов выявило значительное снижение экспрессии белка-1, связанного с переносчиком бикарбоната. Это открытие потенциально связано с генетическими недостатками в гене SLC4A11 , хотя эта связь на сегодняшний день полностью не исследована.
Чтобы проверить гипотезу о дифференциальной дисрегуляции синтеза и / или секреции белка в клетках, пораженных FECD, был проведен протеомный анализ для идентификации белков, продуцируемых по-разному в FECD по сравнению с нормальным эндотелием. ⁷⁸ ^— ⁸⁰ Белки были извлечены из природного FECD и соответствующего возрасту нормального комплекса эндотелий-десцеметовая мембрана, и был проведен двухмерный гель-анализ. Белки идентифицировали протеомным анализом.Было обнаружено несколько различий, что побудило к дальнейшим исследованиям, чтобы лучше охарактеризовать патогенные механизмы в FECD.
Кластерин и белок, индуцированный трансформирующим фактором роста-β
Исследования по сравнению белков из комплексов эндотелиальных клеток роговицы человека и десцеметовой мембраны выявили выраженную сверхэкспрессию проагрегативного шапероноподобного белка, называемого кластерином ( CLU ) в FECD образцы ⁷⁹. Как правило, CLU сверхэкспрессируется во многих тканях, подвергающихся стрессу, в том числе при раке и нейродегенеративных расстройствах, и способствует выживанию клеток в цитотоксических условиях ⁸¹ ^— ⁸³.Благодаря своим цитопротекторным и антиапоптотическим свойствам секреторный CLU ( sCLU ) действует как фактор выживания для большинства клеток ⁸⁴ ^, ⁸⁵. Другая форма CLU, ядерная CLU ( nCLU ), расположенная в ядре, способствует апоптозу в стрессированных клетках, действуя как проапоптотический белок ⁸⁶ ⁸⁸. nCLU — это нерасщепленная и негликозилированная форма CLU, нацеленная на ядро. Было обнаружено, что экспрессия pre-sCLU и nCLU значительно увеличивалась в образцах FECD по сравнению с нормальными декадно подобранными контролями.Для сравнения, экспрессия мРНК CLU при других отечных патологиях, таких как PBK HCEC-DM, была ниже, чем в нормальном контроле, что указывает на то, что это явление более специфично для роговицы FECD. Иммуноцитохимические исследования выявили кластеризацию эндотелиальных клеток розеточного типа вокруг гутт и повышенное внутриклеточное окрашивание CLU как внутриклеточно, так и в центрах гутт. Считалось, что это представляет собой клеточный мусор в кишечнике ⁷⁹. Ядра эндотелиальных клеток также были сгруппированы вокруг кишок, возможно, из-за агрегативной и, возможно, защитной функции CLU ⁸⁹ ^, ⁹⁰.
Дальнейший анализ протеомного состава кишечника показал, что белок, индуцированный трансформирующим фактором роста β ( TGFBIp ), играет ключевую роль в формировании кишечника. ⁷⁸ TGFβIp представляет собой адгезионную молекулу внеклеточного матрикса, которая взаимодействует с коллагенами, интегринами и фибронектинами ⁹¹ ^— ⁹⁵. Исследование протеолитического процессинга TGFβIp в нормальном эндотелии человека выявило возрастную посттрансляционную модификацию различных форм TGFβIp.Полученные данные согласуются с постепенным утолщением DM на протяжении всей жизни и с увеличением накопления TGFβIp, который, как известно, имеет физиологическое взаимодействие с коллагенами. Кроме того, двухмерный гель-анализ показал повышенную продукцию TGFBIp в комплексах FECD HCEC-DM по сравнению с контрольными субъектами ⁷⁹. Сравнивая уровни протеолитически модифицированных форм между нормальным эндотелием и эндотелием FECD, было обнаружено пятикратное увеличение полосы 68 кДа (полноразмерный белок) и увеличение полос 58 кДа и 39 кДа в эндотелии FECD.ПЦР в реальном времени выявила повышенную регуляцию уровней мРНК TGFβI в эндотелии FECD по сравнению с контролем, показав, что разница связана с уровнем транскрипции гена. Наконец, непрямой иммунофлуоресцентный анализ выявил совместную локализацию CLU и TGFβIp в эндотелии FECD с заметно повышенной интенсивностью в центрах гутт (2). TGFβIp обнаруживал значительное окрашивание на уровне DM, причем наиболее интенсивное окрашивание имело тенденцию к нижним частям кишок, в то время как CLU локализовалось выше TGFβIp.Схематическое изображение образования гутты в FECD () изображает постепенное утолщение DM за счет накопления TGFβIp; Избыточная экспрессия и секреция CLU стрессовыми клетками наблюдается в «самых молодых» частях кишечника. ().
Совместная локализация кластерина (красный) и TGF β Ip (зеленый) в эндотелии, пораженном FECD. Ядра эндотелиальных клеток (синие) кластеры вокруг гутты (A). Схематическое изображение образования гутты и постепенного накопления кластерина (CLU) и TGF β Ip или кератоэпителина (KE) в десцеметовой мембране (B).
Несмотря на то, что точное значение взаимодействия CLU и TGFβIp неясно, перепроизводство этих белков может быть связано со стрессовой реакцией, во время которой клетки пытаются агрегировать посредством взаимодействий клетка-клетка и клетка-субстрат и противодействовать проапоптотическим стимулам. .
Пероксиредоксины и антиоксидантная защита
Протеомный анализ нормального эндотелия роговицы выявил присутствие нового класса антиоксидантов, пероксиредоксинов ( PRDX s), которые действуют путем удаления перекиси водорода из клеток и ингибирования апоптоза в ответ на реактивные формы кислорода ( ROS ).Анализ двумерного геля и вестерн-блоттинга, сравнивающий FECD и соответствующих возрасту доноров роговицы, показал значительно сниженные уровни изоформ PRDX-2 и -6 в эндотелиальных клетках FECD по сравнению с нормальными образцами. ⁸⁰ PRDX-2 особенно важен для антиапоптотической защиты, ингибируя высвобождение цитохрома с из митохондрий и регулируя транскрипцию генов посредством его ингибирующего действия на активацию NF-kB, индуцированную перекисью водорода. ⁹⁶ ^— ⁹⁸ PRDX-3 и -5 не были обнаружены в образцах эндотелиальных клеток FECD по сравнению с нормальным контролем.Аналогичное открытие снижения экспрессии PRDX-3 было показано при других заболеваниях, в которых участвует апоптоз, индуцированный ROS; Болезнь Альцгеймера и синдром Дауна. ⁹⁹ ^, ¹⁰⁰ Первичный сайт PRDX-3 находится в митохондриях для антиоксидантной защиты в дыхательной цепи. ⁹⁶ PRDX-5 был обнаружен в митохондриях, пероксисомах и ядре для антиапоптотической функции и защиты от АФК. ¹⁰¹ ^— ¹⁰³
В литературе появляется все больше доказательств того, что хронический окислительный стресс способствует клеточному и молекулярному повреждению в генетически и / или экологически восприимчивых эндотелиальных клетках роговицы человека, что, в свою очередь, приводит к патологическим результатам FECD.Первоначальное исследование Buddi et al. ¹⁰⁴ использовали антитела против перекисного окисления липидов и других побочных продуктов АФК и идентифицировали окислительное повреждение роговицы FECD. Wang et al. ¹⁰⁵ показали повышенные уровни конечных продуктов гликирования ( AGE ) и их рецепторов ( RAGE ) в DM и эндотелии роговицы образцов пациентов с FECD. Отложения AGE располагались в переднем сегменте DM, который является самой старой частью DM с наиболее длительным воздействием окислительного стресса; такие результаты предоставили важные доказательства того, что пагубные эффекты окислительного стресса могут возникать очень рано и продолжаться в течение всей жизни в эндотелии роговицы пациентов с FECD ¹⁰⁵.
Помимо снижения антиоксидантной защиты, исследования выявили отчетливое окислительное повреждение ДНК, измеряемое окислительно-модифицированным основанием гуанозина ( 8-OHdG ), в эндотелии роговицы, пораженном FECD. Окислительное повреждение локализовано в митохондриальной ДНК, указывая на то, что митохондрии являются основными мишенями окислительного повреждения в FECD ¹⁰⁶. Дыхательная цепь митохондрий является основным внутренним источником производства АФК; таким образом, митохондрии накапливают окислительные повреждения быстрее, чем остальная часть клетки.¹⁰⁷ Известно, что повреждение митохондриальной ДНК вызывает дисфункциональный синтез митохондриального белка, потерю целостности потенциала внутренней митохондриальной мембраны и апоптическую гибель клеток. Интересно, что более ранние исследования Tuberville et al. ⁷⁷ показали уменьшение количества митохондрий и снижение активности цитохромоксидазы в митохондриях отечных FECD роговиц. Результаты снижения антиоксидантной защиты и окислительного повреждения тканей при FECD указывают на важный этиологический компонент дистрофической дегенерации, наблюдаемой при FECD.
Инфекционная гипотеза болезни Альцгеймера
Образец цитирования: Seaks CE, Wilcock DM (2020) Инфекционная гипотеза болезни Альцгеймера. PLoS Pathog 16 (11): e1008596. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008596
Редактор: Ребекка Эллис Датч, Университет Кентукки, США
Опубликовано: 12 ноября 2020 г.
Авторские права: © 2020 Seaks , Уилкок. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Финансирование данной работы авторами не поступало.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера (БА) является ведущей причиной деменции во всем мире, на нее приходится почти 70% всех случаев деменции, и она является одним из наиболее быстро растущих цен на медицинские услуги. Патологически БА характеризуется наличием бляшек бета-амилоида (Aβ) и нейрофибриллярных клубков, состоящих из агрегированного белка тау, связанного с микротрубочками.Клинически БА проявляется прогрессирующим снижением когнитивных функций и ухудшением памяти [1]. Традиционная гипотеза о прогрессировании патологий AD гласит, что бляшки Aβ появляются первыми, вызывая гиперфосфорилирование тау-белка, что приводит к клубкам и нейродегенерации. Однако в связи с продолжающимся провалом клинических испытаний, направленных на уменьшение бляшек Aβ, эта гипотеза подверглась тщательному анализу, в то время как альтернативные гипотезы изучаются. Одной из наиболее спорных возникающих гипотез является инфекционная гипотеза.
Инфекционная гипотеза
Инфекционная гипотеза предполагает, что патоген (вирус, бактерии, прион и т. Д.) Является основной причиной БА [2]. Гипотеза подтверждается данными о том, что некоторые патогены, такие как герпесвирусы и определенные виды бактерий, чаще встречаются у пациентов с БА. В области инфекционных гипотез существуют некоторые вариации в отношении того, как инфекционный патоген объясняет патологические признаки БА. Прямая инфекция и возможная гибель клеток центральной нервной системы (ЦНС) патогенами могут объяснить когнитивный дефицит и усиленное воспаление, обнаруженные при БА [3].Взаимосвязь между воспалением и признаками БА была признана давно, при этом предполагается, что воспаление вызывает повреждение тканей, приводящее к образованию белковых агрегатов, таких как бляшки и клубки Aβ, что, в свою очередь, может привести к усилению воспаления [4]. Этот каскад может быть инициирован рядом эндогенных и внешних факторов, включая микробные патогены. Альтернативно, Aβ и тау могут быть продуктами нормального ответа на инфекцию, предназначенными для изоляции угроз для ЦНС [5]. Накопление Aβ и тау может происходить тогда, когда образование агрегатов опережает очищение микроглией в головном мозге, процесс, вызванный естественным процессом старения [5].Такая антимикробная ролевая модель проиллюстрирована на рис. 1. Было показано, что сами агрегаты также запускают нейровоспаление [6]. Недавние открытия выдвинули на первый план ряд патогенов как потенциальных движущих сил БА, но наиболее изученным семейством патогенов являются вирусы герпеса [7].
Вирусы герпеса и потенциальный вклад в болезнь Альцгеймера: что известно в настоящее время?
Герпесвирусы представляют собой семейство двухцепочечных ДНК-вирусов с оболочкой, способных инфицировать широкий спектр видов млекопитающих [8].Распространенность вирусов герпеса во всем мире, как правило, высока из-за их относительно широкого тропизма, при этом некоторые виды, такие как вирусы простого герпеса, достигают более 80% серологической распространенности среди людей [7]. Вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) является наиболее часто изучаемым патогеном в контексте БА, в первую очередь из-за идентификации много лет назад ДНК ВПГ-1 в мозге пациентов с БА при вскрытии [9,10]. Первое из этих исследований [10] идентифицировало латентный вирус как в нормальном мозге, так и в мозге с БА, но постулировало, что различия в вирусной экспрессии и восприимчивости могут лежать в основе вклада ВПГ-1 в БА.Затем Ицхаки и его коллеги [9] продемонстрировали, что присутствие ApoE4, сильнейшего генетического фактора риска БА, и ВПГ-1 вместе было более сильным фактором риска для развития БА, чем любой фактор по отдельности. В то время как роль HSV-1 давно подозревалась в AD, в последнее время были вовлечены другие члены герпесвирусов, включая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра и вирус герпеса человека 6 (HHV6) [11]. В основном эти исследования состояли из скрининга образцов пациентов на наличие этих вирусов либо путем определения титров иммуноглобулинов, либо путем прямой ПЦР-амплификации вирусной ДНК, а затем сравнения между пациентами с БА и здоровыми пациентами.Более конкретная работа была сосредоточена на способности HHV6 засеивать бляшки Aβ in vitro и in vivo [12].
HSV-1 устанавливает латентный период в ганглиях тройничного нерва, обеспечивая ему доступ к ЦНС после начальной инфекции в периферических тканях губ и рта [8]. Латентность HSV-1 поддерживается транскриптом РНК, известным как транскрипт латентности [13]. Это не позволяет иммунной системе хозяина идентифицировать зрелые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, которые могут вызвать врожденный иммунный ответ [8].Эта задержка может быть нарушена рядом факторов, включая УФ-свет, физическое повреждение, гормональные изменения и нецелевые эффекты фармацевтических препаратов, приводящие к возобновлению активной инфекции [13]. Основным клиническим индикатором этой реактивации является наличие герпетических поражений, в просторечии известных как «герпес» или «лихорадочные пузыри». У здорового человека инфекция остается на периферии, поскольку внутренний иммунитет мозга предотвращает дальнейшее распространение вируса в ЦНС [14].Однако у пожилых людей или людей с ослабленным иммунитетом этот внутренний иммунитет нарушается, что позволяет вирусу распространяться в остальную часть мозга [15].
Присутствие вирусов герпеса в ЦНС может клинически прогрессировать по разным причинам. Наиболее тяжелым, но относительно редким исходом является усиленный иммунный ответ, приводящий к энцефалиту простого герпеса [16]. Потенциально более актуальным для развития БА является субклиническая инфекция, в результате которой вирус устанавливает латентный период в резидентных клетках ЦНС [17].Отсюда вирус может периодически реактивироваться, распространяться дальше и создавать более латентные популяции. Этот цикл активных и латентных состояний может также объяснить стареющую природу БА с определенным количеством циклов реактивации для достижения уровня вирусной нагрузки, необходимого для подавления реакции мозга или причинения достаточного ущерба для проявления клинических симптомов [17]. Де Кьяра и его коллеги продемонстрировали, что рецидивирующая реактивация ВПГ-1 на мышиной модели дикого типа может вызвать характерную патологию БА, сопровождаемую когнитивным дефицитом, — интригующий результат, подтверждающий гипотезу о том, что реактивация имеет решающее значение в связи между герпесвирусами и БА.
Вирусы герпеса были вовлечены в БА благодаря выделению вирусной ДНК от пациентов с БА, а также по эпидемиологическим данным [18]. Относительно недавнее исследование с использованием информации о национальном страховании на Тайване показало, что у пациентов с инфекцией герпесвирусов с большей вероятностью будут диагностированы множественные формы деменции, включая БА. В частности, пациенты, инфицированные ВПГ-1, имели отношение рисков 2,564, что указывает на 2,56-кратное увеличение вероятности развития деменции [18].Кроме того, они показали, что лечение антигерпетическими препаратами, в частности ацикловиром, значительно снижает вероятность диагностирования тех же форм деменции. Использование любых антигерпетических средств привело к соотношению рисков значительно ниже 1,0, что указывает на снижение риска развития деменции.
Будущие направления инфекционной гипотезы
Инфекционная гипотеза получает все больше поддержки и доказательств. На многочисленных конференциях, посвященных AD, в последние годы увеличилось количество рефератов, посвященных изучению связи между патогенами и развитием AD, и начали возникать специальные сессии и группы.Однако еще предстоит проделать большую работу, чтобы более убедительно связать AD и инфекционных агентов. Прежде всего, остаются нерешенными важные вопросы о взаимосвязи между установленными факторами риска БА и патогенными инфекциями. Всегда оставался нерешенным вопрос о том, насколько патогены, повсеместно распространенные среди большей части населения, вызывают заболевание только у части этой популяции. Ответ на эту избирательную уязвимость, вероятно, лежит во взаимодействии инфекционной гипотезы с другими теориями и факторами риска.Может ли клиренс Aβ и тау, используемых для остановки распространения HSV-1, быть нарушен из-за изменений в здоровье сосудов? Может ли нарушение гематоэнцефалического барьера с возрастом открывать новые места проникновения других патогенов? Следовательно, существует необходимость в расширении исследований в области БА в отношении инфекционных патогенов. Многие из хорошо известных генов риска БА, такие как аполипопротеин-Е, связаны с иммунитетом или, в некоторых случаях, с жизненным циклом патогенов [11]. Обзор д-ра Стивена Харриса и д-ра Элизабет Харрис, в котором обсуждается то, что мы уже знаем об этих взаимодействиях, рекомендуется всем заинтересованным читателям (см. [13]).Вместо того чтобы рассматривать инфекционную гипотезу как отдельную сущность, ее следует исследовать через призму взаимодействия с другими компонентами болезни. Такие целостные, инклюзивные подходы являются естественным прогрессом к более широкой гипотезе, процессу, который должна была пройти гипотеза Aβ, что затем приводит к другому вопросу: почему этот процесс был таким медленным для инфекционной гипотезы?
Область болезни Альцгеймера и инфекционная гипотеза
Ответ, вероятно, связан с составом области AD.Несмотря на расширение и диверсификацию, большинство исследователей AD не являются микробиологами или вирусологами. Обычно это нейробиологи, биохимики, невропатологи, нейропсихологи и фармакологи. Между дисциплинами явно отсутствует частичное совпадение, которое иногда бывает трудно преодолеть с точки зрения налаживания сотрудничества или продуктивного диалога. Число людей, которые работают с БА и идентифицируют себя как микробиолог или вирусолог, чрезвычайно мало.
Давняя поддержка исследований Aβ огромна, несмотря на высокую частоту неудач терапевтических средств, сосредоточенных на модуляции Aβ [19].На момент написания этой статьи финансирование NIH исследований AD составляло 2,3 миллиарда долларов, уровень финансирования отражает неминуемую проблему со здоровьем, которую представляет AD. Из финансирования NIH AD ничтожно малая сумма используется для исследования патогенов при AD [20]. Однако недавнее объявление Национального института старения (NIA) об особом интересе к грантам, исследующим потенциальную связь между патогенами и БА, представляет собой важный шаг в увеличении финансирования в этой области (Уведомление №: NOT-AG-19-012).
Несмотря на проблемы, с которыми сталкивается инфекционная гипотеза, есть основания надеяться на дальнейшие исследования в этой области.Недавние исследования предоставили значительные доказательства инфекционной гипотезе и привлекли внимание общественности [12,21]. Eimer и его коллеги [12], как упоминалось ранее, продемонстрировали способность герпесвирусов засеивать бляшки Aβ и показали, что эти бляшки действуют противовирусным образом. Это обеспечило четкую механистическую связь между вирусами герпеса и развитием патологии. Ридхед и его коллеги [21] показали значительное перекрытие затронутых путей при инфекции HHV6 и AD, в частности, связанное с процессингом белка-предшественника амилоида (APP) в пептид Aβ, с образованием олигомеров и, в конечном итоге, с амилоидными бляшками.Эта связь в путях убедительно подтверждает теорию о том, что герпесвирусы способствуют развитию БА, и соответствует теории антимикробного Aβ с наличием герпесвирусов, запускающих повышающую регуляцию метаболизма АРР.
Организации, связанные с инфекционной гипотезой, также растут, в том числе Alzheimer’s Germ Quest, Inc, основанная доктором Лесли Норинс для присуждения награды за исследования по выявлению возбудителя болезни Альцгеймера. Представители Human Herpesvirus 6 Foundation предлагали помощь в виде реагентов и финансирования группам, заинтересованным в установлении связи HHV6 с AD.Также была подана петиция об увеличении ассигнований на исследования, связанные с инфекционным БА, и возможности финансирования, такие как те, которые предоставляет NIA, дадут возможности для дальнейших исследований. В конце концов, возможности для значимого исследования инфекционных гипотез никогда не были лучше. Альтернативные гипотезы БА рассматриваются более открыто, чем когда-либо в прошлом, учитывая неудачи испытаний, и давние исследователи в этой области борются за возможности, которые теперь становятся реальностью.
Трудно предсказать следующий этап исследования инфекционных гипотез. Недавняя работа высветила связь между реактивацией HSV-1 и патологией AD [7]. Клинические испытания проводятся исследователями, которые изучают возможность использования противовирусных препаратов при лечении БА (идентификатор ClincialTrials.gov: NCT03282916). Гингивит и хламидиоз также были недавно связаны с БА, что подтверждает идею о том, что бляшки Aβ представляют собой широкий антимикробный пептид [22,23]. Определение общих характеристик патогенов, которые способствуют развитию БА, было бы шагом вперед, так как это позволило бы исследователям идентифицировать другие потенциальные патогены и отсеивать область потенциально значимых взаимодействий с факторами риска.Существует большое количество выявленных факторов риска БА, и установление того, как патогены могут взаимодействовать с ними, является важным вопросом. В конечном счете, эти вопросы требуют ответов, которые будут приходить медленно; однако для ответа на них потребуется повышенное внимание, сотрудничество и финансирование.
Для тех, кто больше интересуется конкретными аспектами инфекционной гипотезы, мы рекомендуем более подробные обзоры, написанные доктором Рут Ицхаки, которая часто публикует научные обзоры по этой теме.
Список литературы
1. Mirra SS, Heyman A, McKeel D, Sumi SM, Crain BJ, Brownlee LM, Vogel FS, Hughes JP, van Belle G, Berg L. Консорциум по созданию реестра болезни Альцгеймера (CERAD). Часть II. Стандартизация невропатологической оценки болезни Альцгеймера. Неврология. 1991. 41 (4): 479–86. Epub 1991/04/01. pmid: 2011243.
2. Sochocka M, Zwolinska K, Leszek J. Инфекционная этиология болезни Альцгеймера. Curr Neuropharmacol.2017; 15 (7): 996–1009. Epub 2017/03/16. pmid: 28294067; PMCID: PMC5652018.
3. Лин В.Р., Возняк М.А., Купер Р.Дж., Уилкок Г.К., Ицхаки РФ. Герпесвирусы головного мозга и болезнь Альцгеймера. J Pathol. 2002. 197 (3): 395–402. Epub 13.07.2002. pmid: 12115887.
4. Акияма Х. Воспаление и болезнь Альцгеймера. Нейробиология старения. 2000. 21 (3): 383–421. pmid: 10858586
5. Буш А.И., Сосиа С.Дж., Кирби Д.Е., Вашикоски К.Дж., Такер С.М., Ингельссон М., Хайман Б., Бертон М.А., Голдштейн Л.Е., Дуонг С., Танзи Р.Э., Мойр Р.Д.Амилоидный β-белок, ассоциированный с болезнью Альцгеймера, является антимикробным пептидом. PLoS ONE. 2010; 5 (3). pmid: 20209079
6. МакГир П.Л., Роджерс Дж., МакГир Э.Г. Воспаление, противовоспалительные агенты и болезнь Альцгеймера: последние 22 года. J. Alzheimers Dis. 2016; 54 (3): 853–7. Epub 2016/10/08. pmid: 27716676.
7. Ицхаки РФ. Подтверждение основной роли вируса простого герпеса типа 1 в болезни Альцгеймера. Front Aging Neurosci. 2018; 10: 324. Epub 2018/11/09.pmid: 30405395; PMCID: PMC6202583.
8. Чаявичицилп П., Баквальтер СП, Краковский А.С., Фридлендер С.Ф. Простой герпес. Pediatr Rev. 2009; 30 (4): 119–29; викторина 30. Epub 2009/04/03. pmid: 19339385.
9. Ицхаки Р.Ф., Лин В-Р, Шан Д., Уилкок Г.К., Фарагер Б., Джеймисон Г.А. Вирус простого герпеса 1 типа в головном мозге и риск болезни Альцгеймера. Ланцет. 1997. 349 (9047): 241–4.
10. Джеймисон Г.А., Мейтленд Нью-Джерси, Уилкок Г.К., Краск Дж., Ицхаки РФ.Скрытый вирус простого герпеса типа 1 в нормальном мозге и мозг при болезни Альцгеймера. J Med Virol. 1991. 33 (4): 224–7. Epub 1991/04/01. pmid: 1649907.
11. Ниина Хемлинг MR, Ринне Юха, Поулланен Паю, Броберг Эева, Тапио Вирпи, Валберг Теро, Хукканен Вейо. Герпесвирусы в головном мозге при болезнях Альцгеймера и Паркинсона. Американская неврологическая ассоциация. 2003. 54: 267–71.
12. Эймер В.А., Виджая Кумар Д.К., Навалпур Шанмугам Н.К., Родригес А.С., Митчелл Т., Вашикоски К.Дж., Дьердь Б., Брейкфилд XO, Танзи Р.Э., Мойр Р.Д.Бета-амилоид, связанный с болезнью Альцгеймера, быстро высевается Herpesviridae для защиты от инфекции мозга. Нейрон. 2018; 99 (1): 56–63 e3. Epub 2018/07/13. pmid: 30001512; PMCID: PMC6075814.
13. Харрис С.А., Харрис Е.А.. Молекулярные механизмы патогенеза вируса простого герпеса типа 1 при болезни Альцгеймера. Front Aging Neurosci. 2018; 10: 48. Epub 2018/03/22. pmid: 29559905; PMCID: PMC5845560.
14. Наир S, Diamond MS. Врожденные иммунные взаимодействия в центральной нервной системе модулируют патогенез вирусных инфекций.Curr Opin Immunol. 2015; 36: 47–53. Epub 2015/07/15. pmid: 26163762; PMCID: PMC4593735.
15. Возняк М.А., Шипли С.Дж., Комбринк М., Уилкок Г.К., Ицхаки РФ. Продуктивный вирус простого герпеса в головном мозге здоровых пожилых людей и пациентов с болезнью Альцгеймера. J Med Virol. 2005. 75 (2): 300–6. Epub 2004/12/17. pmid: 15602731.
16. Брэдшоу М.Дж., Венкатесан А. Энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса-1, у взрослых: патофизиология, диагностика и лечение. Нейротерапия.2016; 13 (3): 493–508. Epub 2016/04/24. pmid: 27106239; PMCID: PMC4965403.
17. Де Кьяра Дж., Пьячентини Р., Фабиани М., Мастродонато А., Маркоччи М. Э., Лимонги Д., Наполетани Дж., Протто В., Колуччо П., Селестино И., Ли Пума Д. Д., Грасси С., Паламара А. Т.. Рецидивирующая инфекция вирусом простого герпеса-1 вызывает признаки нейродегенерации и когнитивного дефицита у мышей. PLoS Pathog. 2019; 15 (3): e1007617. Epub 2019/03/15. pmid: 30870531; PMCID: PMC6417650.
18. Ценг Н.С., Чанг СН, Линь Ф.Х., Чанг С.П., Йе ЦБ, Хуанг С.И., Лу РБ, Чанг Х.А., Као Ю.С., Йе Х.В., Чанг В.С., Чжоу Ю.С., Цао Ц., Ву Ю.Ф., Цзянь WC.Противогерпетические препараты и снижение риска деменции у пациентов с инфекциями, вызванными вирусом простого герпеса, — общенациональное популяционное когортное исследование на Тайване. Нейротерапия. 2018; 15 (2): 417–29. Epub 2018/03/01. pmid: 29488144; PMCID: PMC5935641.
19. Риччарелли Р., Феделе Э. Гипотеза амилоидного каскада при болезни Альцгеймера: пришло время изменить наше мнение. Curr Neuropharmacol. 2017; 15 (6): 926–35. Epub 2017/01/18. pmid: 28093977; PMCID: PMC5652035.
20. Здоровье НИО.Портфолио исследований Интернет-репортаж — Список проектов по болезни Альцгеймера и связанным с ней деменциям по категориям ОТЧЕТ NIH: Национальный институт здравоохранения; 2018 [цит. По 21.06.2019]. Доступно по адресу: https://report.nih.gov/categorical_spending_project_listing.aspx?FY=2018&ARRA=N&DCat=Alzheimer%27s%20Disease%20including%20Alzheimer%27s%20Disease%20Related%20Dementias%20 )(AD).
21. Считывающая головка B, Haure-Mirande JV, Funk CC, Richards MA, Shannon P, Haroutunian V, Sano M, Liang WS, Beckmann ND, Price ND, Reiman EM, Schadt EE, Ehrlich ME, Gandy S, Dudley JT.Многоуровневый анализ независимых когорт болезни Альцгеймера обнаруживает нарушение молекулярных, генетических и клинических сетей вирусом герпеса человека. Нейрон. 2018; 99 (1): 64–82 e7. Epub 2018/06/26. pmid: 29937276.
22. Балин Б.Дж., Хаммонд С.Дж., Литтл С.С., Хингли С.Т., Аль-Атраче З., Аппельт Д.М., Уиттум-Хадсон Д.А., Хадсон А.П. Chlamydia pneumoniae: этиологический агент поздней деменции. Front Aging Neurosci. 2018; 10: 302. Epub 2018.10.26. pmid: 30356749; PMCID: PMC6189393.
23.Singhrao SK, Olsen I. Оценка роли Porphyromonas gingivalis в периодонтите для определения причинной связи с болезнью Альцгеймера. J Oral Microbiol. 2019; 11 (1): 1563405. Epub 2019/02/08. pmid: 30728914; PMCID: PMC6352933.
Мышь NSY: новая животная модель спонтанного NIDDM с умеренным ожирением
1.
Weir GC, Leahy JC (1994) Патогенез инсулиннезависимого (типа II) сахарного диабета. В: Kahn CR, Weir GC (eds) Сахарный диабет Джослина XIII.Lea & Febiger, Пенсильвания, стр. 240–264
Google ученый
2.
Hamman RF (1992) Генетические и экологические детерминанты инсулиннезависимого сахарного диабета (NIDDM). Диабет Метаб. Ред. 8: 287–338
PubMed Google ученый
3.
Kanety H, Moshe S, Shafrir E, Lunenfeld B, Karasik A (1994) Гиперинсулинемия вызывает обратимое нарушение функции рецепторов инсулина, приводящее к диабету в модели инсулиннезависимого сахарного диабета на песчаных крысах.Proc Natl Acad Sci USA 91: 1853–1857
PubMed Google ученый
4.
Shafrir E (1990) Диабет у животных. В: Rifkin H, Porte D Jr (eds) Сахарный диабет: теория и практика IV. Elsevier Science, Нью-Йорк, стр. 299–340
Google ученый
5.
Portha B, Serradas P, Bailbé D, Suzuki K, Goto Y, Giroix M (1991) Β -клеточная нечувствительность к глюкозе у крыс GK, спонтанная модель без ожирения для диабета типа II.Диабет 40: 486–491
PubMed Google ученый
6.
östenson CG, Khan A, Abdel-Halim SM et al. (1993) Аномальная секреция инсулина и метаболизм глюкозы в островках поджелудочной железы у крыс GK со спонтанным диабетом. Диабетология 36: 3–8
PubMed Google ученый
7.
Tsuura Y, Ishida H, Okamoto Y et al. (1993) Чувствительность к глюкозе АТФ-чувствительного канала K ⁺ нарушена в -клетках крысы GK.Диабет 42: 1446–1453
PubMed Google ученый
8.
Shafrir E (1992) Животные модели инсулиннезависимого диабета. Диабет Метаб. Ред. 8: 179–208
PubMed Google ученый
9.
Шибата М., Ясуда Б. (1980) Новые экспериментальные мыши с врожденным диабетом (мыши N. S. Y.). Tohoku J Exp Med 130: 139–142
PubMed Google ученый
10.
Shibata M (1983) Микроангиопатия у мышей N. S. Y. с диабетом. В: Abe H, Hoshi M (eds) Диабетическая макроангиопатия. University of Tokyo Press, Tokyo, pp 457–466
Google ученый
11.
Surwit RS, Kuhn CM, Cochrane C, McCubbin JA, Feinglos MN (1988) Диета-индуцированный диабет типа II у мышей C57BL / 6J. Диабет 37: 1163–1167
PubMed Google ученый
12.
Festing MFW (1979) Инбридинг и его последствия, а также история инбредных линий.В: Festing MFW (eds) Инбредные штаммы в биомедицинских исследованиях. The Macmillan Press Ltd., Лондон, стр. 10
. Google ученый
13.
Lewis BD (1992) Лабораторная оценка глюкометра Glucocard ^TM. Clin Chem 38: 2093–2095
PubMed Google ученый
14.
Yamato E, Ikegami H, Tahara Y et al. (1993) Клеточный механизм индуцированной глибуридом экспрессии гена инсулина в изолированных островках крысы.Biochem Biophys Res Commun 197: 957–964
Статья PubMed Google ученый
15.
McEvoy RC (1984) Культура тканей островков поджелудочной железы плода крысы: количественное определение изменений количества островковых клеток во время культивирования. В: Ларнер Дж., Поль С.Л. (ред.) Методы исследования диабета, часть А. Джон Вили, Нью-Йорк, стр. 236
Google ученый
16.
Yamato E, Noma Y, Tahara Y et al.(1990) Подавление синтеза и высвобождения глюкагона глюкагоноподобным пептидом-1 (амид 7–36) без влияния на уровень мРНК в изолированных островках крысы. Biochem Biophys Res Commun 167: 431–437
PubMed Google ученый
17.
Hinegardner RT (1971) Улучшенный флуорометрический анализ ДНК. Анал Биохим 39: 197–201
PubMed Google ученый
18.
Fujioka S, Matuzawa Y, Tokunaga K, Tarui S (1987) Вклад накопления внутрибрюшного жира в нарушение метаболизма глюкозы и липидов при ожирении у человека.Метаболизм 36: 54–59
Статья PubMed Google ученый
19.
Ohmura T, Ueda K, Kiyohara Y et al. (1994) Связь синдрома инсулинорезистентности с нарушенной толерантностью к глюкозе и NIDDM у населения Японии в целом: исследование Hisayama. Диабетология 37: 897–904
Статья PubMed Google ученый
20.
Saad MF, Knowler WC, Pettitt DJ, Nelson RG, Mott DM, Bennett PH (1988) Естественная история нарушения толерантности к глюкозе у индейцев пима.N Engl J Med 8: 1500–1506
Google ученый
21.
DeFronzo RA (1979) Непереносимость глюкозы и старение. Диабет 28: 1095–1101
PubMed Google ученый
22.
Groop LC, Widen E, Ferrannini E (1993) Инсулинорезистентность и дефицит инсулина в патогенезе сахарного диабета 2 типа (инсулиннезависимого): ошибки метаболизма или методов? Диабетология 36: 1326–1331
PubMed Google ученый
23.
Pfeifer MA, Halter JB, Porte D Jr (1981) Секреция инсулина при сахарном диабете. Am J Med 70: 579–588
Статья PubMed Google ученый
24.
Seino Y, Kurahachi H, Goto Y, Taminato T, Ikeda M, Imura H (1975) Сравнительные инсулиногенные эффекты глюкозы, аргинина и глюкагона у пациентов с сахарным диабетом, эндокринными расстройствами и заболеваниями печени. Acta Diabetol Lat 12: 89–99
PubMed Google ученый
25.
Йонеда Х., Икегами Х., Ямамото Й. и др. (1992) Анализ ранней фазы инсулинового ответа у субъектов, не страдающих ожирением, с легкой непереносимостью глюкозы. Уход за диабетом 15: 1517–1521
PubMed Google ученый
26.
Kadowaki T, Miyake Y, Hagura R et al. (1984) Факторы риска развития диабета у субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе. Диабетология 26: 44–49
PubMed Google ученый
27.
Мартинес С.М., Таррес М.С., Пичена Дж.С. и др. (1993) крыса eSS, животная модель для изучения спонтанного инсулинозависимого диабета. В: Shafrir E (eds) Уроки диабета животных IV. Смит-Гордон и Компания Лимитед, Лондон, стр. 75–90
Google ученый
28.
Макино С., Кунимото К., Мораока Ю., Мидзусима Ю., Катагири К., Точино Ю. (1980) Селекция мышей без ожирения и диабета. Exp Anim 29: 1–13
Google ученый
29.
Макино С., Ямасита Х, Кунимото К., Цукахара К., Учида К. (1992) Разведение мышей NON и их генетические характеристики. В: Сакамото Н., Хотта Н., Учида К. (редакторы) Текущие концепции новой модели животных: НЕ мышь. Elsevier, Амстердам Лондон Нью-Йорк Токио, стр. 3–10
Google ученый
30.
King H, Rewers M et al. (1993) Глобальные оценки распространенности сахарного диабета и нарушения толерантности к глюкозе у взрослых. Уход за диабетом 16: 157–177
PubMed Google ученый
31.
Fujimoto WY, Леонетти DL, Bergstrom RW, Kinyoun JL, Stolov WC, Wahl PW (1991) Толерантность к глюкозе и диабетические осложнения среди американок японского происхождения. Diabetes Res Clin Pract 13: 119–130
Статья PubMed Google ученый
32.
Dietrich WF, Katz H, Lincoln SE et al. (1992) Генетическая карта мыши, пригодная для типирования внутривидовых скрещиваний. Генетика 131: 423–447
PubMed Google ученый
Границы | АДФ-зависимые киназы архей отряда Methanosarcinales адаптируются к соли с помощью неканонической эволюционно консервативной стратегии
Введение
Галофильные организмы — это организмы, обитающие в сложных осмотических условиях, соленость которых варьируется от умеренной до экстремальной, где соли достигают предела своей растворимости.Эти организмы присутствуют в трех сферах жизни, объединяясь в четко определенные филогенетические группы (Oren, 2008; Weinisch et al., 2018). У архей галофильные организмы были идентифицированы в типе Euryarchaeota , где они представлены в трех филогенетических группах; Nanohaloarchaea (пока еще некультивируемая группа организмов) (Narasingarao et al., 2012), Halobacteria и Methanosarcinales (Oren, 2008). Хотя организмы из Halobacteria и Methanosarcinales демонстрируют разные фенотипы, они были признаны филогенетически родственными (Burggraf et al., 1991). Halobacteria является крупнейшим филогенетическим классом в Euryarchaeota и из-за высокой солености, необходимой для его роста, стала классической моделью для исследований галофильной адаптации (Larsen, 1967; DasSarma and DasSarma, 2015). За некоторыми исключениями, эти аэробные организмы не могут расти при солености ниже 3 M NaCl и процветать при ее предельных значениях (5 M NaCl). Поскольку эта экстремальная среда создает большое осмотическое давление, Halobacteria разработали механизм противовеса, чтобы выжить за счет накопления до 4 ионов MK ⁺ и Cl ^— в их цитозоле (Christian and Waltho, 1962; Youssef et al. ., 2014). Эволюционное давление также привело к появлению уникальных модификаций молекулярного механизма этих организмов. Например, наличие смещенного аминокислотного состава в белках из Halobacteria (Reistad, 1970; Lanyi, 1974) было признано более 50 лет назад. Эти модификации основаны на взаимодействии следующих стратегий: (i) увеличение содержания кислотных остатков (Asp и Glu) вместе с уменьшением содержания Lys, что приводит к отрицательно заряженной молекулярной поверхности, которая составляет наиболее заметную особенность белков из Halobacteria , (ii) уменьшение Lys также приводит к уменьшению гидрофобной области, подверженной воздействию растворителя, и (iii) уменьшение общего содержания крупных гидрофобных остатков (Ile, Leu, Phe, Met) и сопутствующее предпочтение меньших остатков, таких как Ala и Val, приводящее к уменьшению объема гидрофобного ядра (Paul et al., 2008; Грациано и Мерлино, 2014; Нат, 2016).
Хотя заказ Methanosarcinales включает галофильные организмы, стратегии, ответственные за адаптацию белков к высоким концентрациям соли в этих организмах, еще предстоит решить. С точки зрения потребности в солях эти анаэробные организмы более универсальны, чем Halobacteria , поскольку они растут в средах с соленостью от 0 до 5 M NaCl и, следовательно, также включают негалофильные организмы.Чтобы приспособить свое осмотическое давление к разной солености, организмы из Methanosarcinales используют механизм смешанного осмотического противовеса, основанный на накоплении неорганических ионов (до 3 MK ⁺ у большинства галофильных организмов) (Lai and Gunsalus, 1992) и внутриклеточное накопление нескольких небольших органических молекул, называемых осмолитами, известное как стратегия «совместимых растворенных веществ» (Lai et al., 1991). Среди используемых осмолитов глицин бетаин является одним из тех, которые преимущественно накапливаются организмами, населяющими наиболее соленую среду (Lai et al., 1991).
До сих пор не было сообщений о механизме галофильной адаптации, встречающейся в белках из Methanosarcinales . Учитывая их тесную филогенетическую связь с Halobacteria , было бы интересно спросить, разделяют ли обе группы общую стратегию или белки из Methanosarcinales эволюционировали по-другому. С другой стороны, поскольку порядок Methanosarcinales включает как галофильные, так и негалофильные организмы, было бы также интересно определить, является ли галофильный признак наследственным или представляет собой эволюционную новизну.
Чтобы ответить на эти вопросы, мы взяли АДФ-зависимые сахарные киназы из Methanosarcinales в качестве модельной системы. Эти ферменты принадлежат к суперсемейству рибокиназ и катализируют фосфорилирование глюкозы или фруктозо-6-фосфата, используя АДФ в качестве донора фосфорила при гликолизе, центральном пути производства энергии. Некоторые члены суперсемейства являются субстрат-специфическими для глюкозы или фруктозы-6P (GK-ADP или PFK-ADP), тогда как другие являются бифункциональными ферментами (PFK / GK-ADP).Недавно сообщалось, что ферменты из Methasanosarcinales, которые были аннотированы как АДФ-специфичные, на самом деле являются бифункциональными и, следовательно, способны катализировать фосфорилирование обоих субстратов (Zamora et al., 2017). Путем сочетания биоинформатики и экспериментальных подходов наряду с реконструкцией предковых ферментов мы определили структурные свойства, которые определяют галофильный характер этих белков и эволюционную траекторию этого признака.
Материалы и методы
Модели гомологии белков и структурные анализы
Последовательности для моделирования гомологии АДФ-зависимых сахарных киназ из Halobacteria, Methanosarcinales и Eukarya были получены из баз данных UniProt и NCBI (дополнительная таблица S1).Построенные модели были разделены на четыре группы на основе таксономической категоризации исходного организма и их способности расти в условиях высокой солености, как сообщается в литературе. Были определены следующие группы: Halobacteria , галофильные Methanosarcinales , негалофильные Methanosarcinales и Eukarya , последняя использовалась в качестве контрольной внешней группы. В каждой группе использовалось шесть последовательностей, за исключением галофильного Methanosarcinales , для которого доступно только пять последовательностей.Гомологические модели для ферментов архей были построены с использованием четырех шаблонных структур; ADP-GK из Thermococcus litoralis (PDB: 4B8R), ADP-GK и ADP-PFK из Pyrococcus horikoshii (PDB: 1L2L и 1U2X, соответственно) и последний общий предок Methanococles и Thermococcales (PDB: 5K27). Для ферментов Eukaryotic использовали две матрицы; ADP-GK из T. litoralis и ADP-GK из Mus musculus (PDB: 5CCF).Поскольку эукариотические белки имеют вставку, образующую N-концевой спиральный домен (Richter et al., 2016), моделировалась только гомологичная область, содержащая каталитический домен. Пятьдесят моделей для каждого белка были созданы с использованием Modeller v9.15 (Eswar et al., 2008) и оценены на основе потенциала ДОФЭ. После визуального осмотра лучших моделей модели с аномальными конфигурациями контуров были уточнены с помощью сервера GalaxyWEB (Ko et al., 2012). Качество полученных моделей оценивалось с помощью ProSA-web (Wiederstein and Sippl, 2007), Procheck (Laskowski et al., 1993) и Verify3D (Eisenberg et al., 1997). Лучшие созданные модели были подвергнуты минимизации энергии с использованием стандартного протокола в NAMD с силовым полем CHARMM27 для дальнейшего анализа (Phillips et al., 2005).
Чтобы оценить распределение остатков по различным структурным моделям, площадь молекулярной поверхности каждого остатка была определена с использованием веб-сервера WHAT-IF (Vriend, 1990). Остатки были разделены на две категории в зависимости от их доступной площади поверхности; если это было ≥5 Å ², остаток считался обнаженным на поверхности (внешняя оболочка) (дополнительная таблица S2), в противном случае считалось, что он погребен внутри белкового ядра (внутренняя оболочка) (дополнительная таблица S3).Существование статистически значимых различий оценивали с помощью теста Краскела-Уоллиса в сочетании с апостериорным тестом Данна . Полярная и заряженная доступная площадь поверхности определялась с помощью веб-сервера VADAR (Willard et al., 2003). Поверхности электростатического потенциала репрезентативных моделей были созданы с помощью плагина APBS Tools для PyMOL.
Вывод филогении и реконструкция последовательности предков
Наследственная последовательность последнего общего предка ферментов Methanosarcinales была выведена с использованием иерархического байесовского метода (Huelsenbeck and Bollback, 2001) с использованием CpREV в качестве эволюционной модели.Выравнивание всех последовательностей из ADP-зависимого семейства (120 последовательностей в январе 2015 г.) и обновленное выведенное филогенетическое дерево показано на дополнительном рисунке S1. Анализ был проведен с 10 ⁷ поколениями и частотой выборки 1000. Из полученных 20 000 деревьев 40% были отброшены на этапе приработки и, наконец, 12 000 деревьев были использованы при вычислении апостериорных вероятностей. Для каждой позиции выравнивания выбирали остаток с наивысшей апостериорной вероятностью (PP).Полученную последовательность скорректировали на наличие пропусков по методу Холла (Hall, 2006), получив конечную последовательность из 490 аминокислотных остатков. Эту последовательность проверяли на наличие консервативных мотивов и каталитических остатков, все из которых присутствовали с апостериорной вероятностью, равной 1,0. Распределение вероятностей предполагаемой наследственной последовательности показано на дополнительном рисунке S2.
Экспрессия и очистка белков
АДФ-зависимая фосфофруктокиназа (PFK) из Methano halobium evestigatum (MevePFK / GK) очищали, как описано ранее (Zamora et al., 2017). ПФК из Methanosarcina mazei (MmazPFK / GK) очищали следующим образом: клеток Escherichia coli C41 трансформировали плазмидой pET-15b, несущей de novo и кодон-оптимизированный ген для последовательности белка MmazPFK / GROKT. code: Q8PZL9), включая поли-гистидиновую метку на N-конце и устойчивость к ампициллину. Ночную культуру этих клеток использовали для инокуляции 4 л потрясающего бульона, содержащего 100 мкг мл ^-1 ампициллина.Экспрессию белка индуцировали при OD 0,6 с помощью 0,5 мМ IPTG. Клетки выращивали в течение ночи при 30 ° C, а затем среду центрифугировали при 8000 g в течение 10 минут для получения осадка клеток, который суспендировали в буфере для лизиса (1 М NaCl, 25 мМ Трис pH 7,8, 5 мМ MgCl _{. 2}, 1 мМ PMSF) и разрушили обработкой ультразвуком при 4 ° C. Этот объем центрифугировали при 15000 г в течение 20 минут для удаления клеточного дебриса и полученный супернатант нагревали при 50 ° C в течение 30 минут. Этот объем снова центрифугировали при 15000 г в течение 20 минут для удаления денатурированного белка и полученный супернатант загружали в колонку 5 мл Ni ⁺² -NTA (GE-Healthcare).Белок элюировали линейным градиентом имидазола от 20 до 300 мМ (25 мМ Tris pH 7,8 и 500 мМ NaCl). Фракции с АДФ-зависимой киназной активностью объединяли и диализовали против 1 л буфера (20 мМ Tris pH 8,2, 100 мМ NaCl). Диализованный белок загружали в анионообменную колонку HiTrap-Q (GE-Healthcare) и элюировали линейным градиентом от 100 до 1000 мМ NaCl. Фракции с ферментативной активностью объединяли и диализовали против буфера (25 мМ Tris pH 8,2, 300 мМ NaCl и 5 мМ MgCl ₂).
Для последнего общего предка PFK из Methano sarcinales (AncMsPFK / GK) последовательность гена была оптимизирована по кодонам для экспрессии в E. coli и синтезирована GENSCRIPT (Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США), клонирован в pET-15. BL21 Клетки E. coli трансформировали экспрессирующим вектором и культивировали в 1 л среды LB со 100 мкг мл ^-1 ампициллина до достижения OD ₆₀₀, равного 0,6. Экспрессию белка индуцировали с использованием 1 мМ IPTG в течение ночи при 37 ° C.Клетки центрифугировали (8000 г в течение 15 минут при 4 ° C) и суспендировали в буфере для лизиса (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 20 мМ имидазол, 1 М NaCl и 5 мМ MgCl ₂). Впоследствии клетки разрушали обработкой ультразвуком (12 импульсов по 20 с, с амплитудой 40% и 1-минутными интервалами), и полученный лизат центрифугировали (15000 г в течение 20 минут при 4 ° C). Супернатант нагревали при 80 ° C в течение 20 минут и денатурированные белки удаляли центрифугированием (15000 г в течение 20 минут при 4 ° C).Супернатант фильтровали и загружали в колонку High Performance Ni ⁺² -Sepharose 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную буфером A (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 20 мМ имидазол, 500 мМ NaCl и 5 мМ MgCl _2).). Белок элюировали линейным градиентом от 20 до 200 мМ имидазола в том же буфере. Активные фракции объединяли и диализовали против буфера для хранения белка (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 50% глицерин) и хранили при -80 ° C.
Измерения активности ферментов
PFK и GK ADP-зависимые активности определяли, как сообщалось ранее (Kengen et al., 1994). Вкратце, активность GK определяли путем восстановления NAD ⁺ при 340 нм в сочетании анализа с 10-13 единицами G6PDH из Leuconostoc mesenteroides , который гетерологично экспрессировался в E. coli и очищен в нашем лаборатория. Анализ также содержал 25 мМ HEPES pH 7,8 и 0,5 мМ NAD ⁺.Активность PFK-ADP измеряли путем окисления NADH при 340 нм в сочетании со следующими вспомогательными ферментами: α-глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (5 единиц), триозофосфатизомераза (50 единиц) и альдолаза (1,3 единицы). ) все из мышц кролика (Sigma-Aldrich) вместе с 25 мМ PIPES pH 6,5 и 0,2 мМ NADH. Все определения активности фермента проводили при 40 ° C, а удельную активность рассчитывали на основе данных начальной скорости. За единицу активности фермента (U) принимали конверсию 1 мкмоль субстрата в минуту.Кинетические параметры активностей PFK и GK-ADP определяли, варьируя концентрацию одного субстрата при фиксированной и насыщающей концентрации вспомогательного субстрата. Определенные начальные скорости были скорректированы либо по уравнениям Михаэлиса-Ментен, либо по уравнениям ингибирования субстратом с помощью нелинейной регрессии.
Определение активности глюкокиназы в присутствии соли
Активность
GK-ADP была выбрана для мониторинга эффектов NaCl и KCl на активность MevePFK / GK и MmazPFK / GK, поскольку вспомогательный фермент, используемый в непрерывном анализе GK-ADP, не ингибируется высокими концентрациями этих солей.Для обоих ферментов реакционная смесь содержала насыщающие концентрации субстратов глюкозы и Mg-ADP (в соответствии с кинетической характеристикой каждого фермента), 25 мМ HEPES pH 7,8, 0,5 мМ NAD ⁺ и 40 единиц / мл G6PDH.
Определение активности фосфофруктокиназы в присутствии соли
Для оценки влияния солей на активность AncMsPFK / GK PFK использовали прерывистый анализ, поскольку вспомогательные ферменты непрерывного анализа PFK-ADP ингибируются концентрациями NaCl выше 300 мМ.Активность фермента определяли при 40 ° C в инкубационной смеси, содержащей 25 мМ Pipes pH 6,5, 15 мМ MgCl ₂, 3 мМ фруктозы-6P, 10 мМ АДФ и 0,004 U AncMsPFK / GK в конечном объеме 0,20. мл. Реакцию останавливали добавлением хлорной кислоты до конечной концентрации 3,7% об. / Об. Раствор охлаждали на льду в течение 5 мин и нейтрализовали добавлением бикарбоната натрия. Затем образец центрифугировали при 18000 g и 4 ° C в течение 10 минут, после чего выделяли растворимую фракцию.Продукт реакции PFK-ADP, фруктозо-1,6-бисфосфат, количественно определяли спектрофотометрическим титрованием до конечной точки, следуя окислению NADH при 340 нм. По существу, реакционная смесь для титрования содержала 50 мМ Pipes pH 6,5, 0,2 мМ NADH, 5 ед. Α-глицерофосфатдегидрогеназы, 50 ед. Триозофосфат-изомеразы и 1,3 ед. Альдолазы в конечном объеме 0,50 мл. Влияние KCl на активность AncMsPFK / GK PFK не анализировалось из-за влияния этой соли на реакцию гашения.
Термическая стабильность
Термостабильность белка анализировали путем отслеживания содержания вторичной структуры в спектрополяриметре Jasco J-1500, оборудованном системой Пельтье (PTC-517), с использованием кюветы с длиной пути 1 мм. Использовали концентрации белка от 2 до 5 мкМ, и образцы готовили в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,8, при различных концентрациях KCl или глицинбетаина. За изменением сигнала КД наблюдали при 222 нм с линейным изменением температуры 1 ° С / мин.
Анализ кинетической стабильности
Белки инкубировали в 20 мМ буфере HEPES pH 7,0 и различных концентрациях KCl (0, 0,1, 1 и 2 М) при конечной концентрации белка в диапазоне от 0,02 до 0,03 мг / мл ^-1. Растворы MevePFK / GK / GK и MmazPFK / GK / GK инкубировали при 40 ° C, но, учитывая их термофильный характер, анализ AncMsPFK / GK проводили при 60 ° C. В моменты времени, указанные на фиг. 6, отбирали образцы и центрифугировали (13000 × г в течение 20 минут) для удаления денатурированного белка.Для трех ферментов активность PFK-ADP отслеживали на микропланшет-ридере при 30 ° C (Sinergy 2, Biotek) с использованием реакционного объема 250 мкл и насыщающих концентраций субстрата.
Рентгеновская кристаллография
Очищенные MeveFK / GK, MmazPFK / GK и ancMsPFK / GK были первоначально проверены на условия кристаллизации с коммерческими наборами с использованием робота-кристаллизатора ARI Gryphon (Arts Robbins Instruments LLC) методом диффузии пара сидя. Предварительные кристаллы были получены только для ancMsPFK / GK с использованием набора реагентов PEGrx (Hampton Research Corp), что привело к последующим раундам оптимизации.Кристаллы хорошего качества получали с использованием капли 1 мкл белка (10 мг / мл ^-1, 2,5 мМ АДФ, 200 мМ NaCl, 7,5 мМ MgCl ₂, 25 мМ HEPES, pH 7,8 и 1 мМ 2-меркаптоэтанола. ) и 1 мкл резервуарного раствора, содержащего 20 мМ CdCl ₂, 20 мМ MgCl ₂, 20 мМ NiCl ₂, 24% PEG MME 2000 и 100 мМ ацетат натрия и pH 4,5. Кристаллы появлялись через 2 недели при 19 ° C и были погружены в криозащитный раствор, состоящий из раствора для кристаллизации плюс 25% PEG 400, и мгновенно замораживались в жидком азоте.Данные дифракции рентгеновских лучей собирали при 100 К на канале MX2 в Бразильской лаборатории синхротронного света (LNLS Campinas-SP) с использованием детектора PILATUS 2M (Dectris Ltd.) и длины волны рентгеновского излучения 1,459 Å. Данные были проиндексированы, интегрированы и масштабированы с помощью XDS (Kabsch, 2010) и объединены с использованием Aimless из пакета CCP4 (Evans and Murshudov, 2013). Фазы были решены путем молекулярного замещения Молрепом (Вагин, Тепляков, 2010) с использованием структуры предковой АДФ-зависимой киназы (PDB ID 5K27; Castro-Fernandez et al., 2017) разделены на малые и большие домены в качестве поисковых моделей. Структура уточнялась с использованием Phenix (Adams et al., 2010) и COOT (Emsley, Cowtan, 2004). Ионы АДФ, воды, магния и никеля помещали с помощью COOT и уточняли с помощью ионных ограничений в Phenix. Полная статистика сбора и уточнения данных представлена в таблице 2.
Результаты
Филогенетический анализ
Methanosarcinales ферментов
Чтобы охарактеризовать распределение ферментов ADP-PFK / GK, присутствующих в порядке Methanosarcinales , мы извлекли депонированные последовательности из неизбыточной базы данных и обновили предыдущее филогенетическое дерево, указанное для того же семейства белков (Zamora et al. ., 2017). Как показано на рисунке 1, ADP-PFK / GK присутствуют во всех организмах из Methanosarcinales , секвенированных на сегодняшний день (всего 13), и охватывает виды, обитающие в окружающей среде от 0 до 5 M NaCl (дополнительная таблица S1).
РИСУНОК 1. Филогенетические отношения между Euryarchaeota ADP-зависимых киназ. (A) Филогенетическое дерево максимального правдоподобия для АДФ-зависимых киназ из секвенированных организмов. Цвета представляют разные филогенетические группы.Указаны значения теста отношения правдоподобия для каждого узла. (B) Схема семейства Methanosarcinales ADP-зависимых киназ. В скобках указана оптимальная молярная концентрация NaCl для роста каждого организма. N.D. означает «не определено». Самый галофильный организм группы ( M. evestigatum ) выделен синим цветом, негалофильный организм ( M. mazei ) — черным, а последний общий предок группы (ancMs) — красным. М.zhilinae способен выращивать до 2,5 М NaCl, поэтому он был включен в состав галофильных организмов.
Предполагаемое дерево (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1) показывает, что Halobacteria и Methanosarcinales являются тесно связанными филогенетическими группами. Топология группы Methanosarcinales показывает, что большинство ADP-PFK / GK из негалофильных организмов объединяются в группу A. Однако два (из Methanococcoides burtonni и Methanococcoides methylutens ) филогенетически более тесно связаны с от галофильных организмов ( Methanohalobium evestigatum, Methanohalophilus mahii, Methanosalsum zhilinae, Methanohalophilus halophilus и Methanohalophilus portucalensis ) и входят в группу B.Присутствие этих двух групп согласуется с предыдущими филогенезами, о которых сообщалось для Methanosarcinales организмов (Liu, 2010). Учитывая филогенетическую близость Halobacteria и Methanosarcinales и присутствие галофильных организмов в обеих группах, возникает интересный вопрос, все ли такие белки адаптированы к высоким концентрациям соли с помощью общей стратегии. Кроме того, учитывая, что отряд Methanosarcinales включает как галофильные, так и негалофильные организмы, мы оценили, является ли галофильный характер сохраняющимся или возникающим в процессе эволюции признаком.
Анализ аминокислотного состава
Для оценки структурных адаптаций, присутствующих в ферментах из Methanosarcinales , мы построили модели гомологии и оценили состав и распределение остатков для белков галофильных и негалофильных организмов. Эти данные сравнивали с моделями, созданными для ферментов из Halobacteria и Eukarya , которые служили контролем для чрезвычайно галофильных и негалофильных белков, соответственно.Среднее содержание аминокислот показано на рисунке 2 (дополнительные таблицы S2, S3). На каждом графике результаты для Halobacteria и как галофильных, так и негалофильных белков Methanosarcinales всегда сравниваются с результатами, полученными для белков из Eukarya . АДФ-ПФК из Halobacteria демонстрируют классическое распределение аминокислот, описанное для белков этого филогенетического класса (Fukuchi et al., 2003; Paul et al., 2008). Внутренняя оболочка белков Halobacteria характеризуется увеличением небольшого остатка Ala (70% по сравнению с Eukarya ) и уменьшением крупных гидрофобных остатков, таких как Ile, Met, Leu, Phe и Trp (22, 20, 20, 49 и 69% соответственно) (рис. 2А).Интересно, что нет значительных различий между внутренними оболочками белков галофильных и негалофильных организмов Methanosarcinales (рис. 2В). Тем не менее, когда это распределение сравнивается с распределением, наблюдаемым для внутренней оболочки белков из Eukarya , ни одна из групп Methanosarcinales не показывает увеличения содержания малых гидрофобных остатков, а, скорее, значительного увеличения содержания больших гидрофобных остатков. гидрофобный остаток Ile (97% для галофильных M и 93% для негалофильных M).Примечательно, что этот аминокислотный состав отличается от описанного для Halobacteria , где увеличение содержания малых гидрофобных остатков было указано как ключевой компонент механизма адаптации (Paul et al., 2008; Nath, 2016). С другой стороны, внешняя оболочка белков Halobacteria характеризуется хорошо известным увеличением кислотных остатков (Asp и Glu, 109 и 46% соответственно) вместе со значительным снижением Lys (около 72%) и общее снижение нейтральных полярных остатков, таких как Ser, Gln и Asn (42, 63 и 66%, соответственно) (рис. 2C).Еще раз, когда сравнивали внешнюю оболочку негалофильных и галофильных белков Methanosarcinales , был обнаружен почти идентичный аминокислотный состав (рис. 2D). Однако наблюдалось заметное увеличение содержания Asp с галофильными белками, представляющими 72% различия по сравнению с Eukarya , тогда как в негалофильных белках это было только 39%.
РИСУНОК 2. Аминокислотный состав внутренней и внешней оболочки АДФ-зависимых киназ из Halobacteria и Methanosarcinales. точек на графиках представляют средний процент каждого остатка, находящегося в соответствующей оболочке моделей гомологии. Все результаты сравниваются с АДФ-зависимыми киназами из Eukarya в качестве контроля. (A) Внутренняя оболочка белков из Halobacteria . (B) Внутренняя оболочка белков из Methanosarcinales (Ms). (C) Белки внешней оболочки из Halobacteria . (D) Внешняя оболочка белков из Methanosarcinales (Ms).
Наиболее разительным отличием по сравнению с внешней оболочкой, наблюдаемым у белков из Halobacteria , является большое увеличение Lys (примерно в два раза по сравнению с Eukarya и в семь раз по сравнению с Halobacteria ). Это стоит отметить, поскольку некоторые авторы предположили, что содержание Lys по сравнению с Asp / Glu является основной основой галофильного характера белков из Halobacteria из-за уменьшения гидрофобной области, подверженной воздействию растворителя (Paul et al., 2008; Тадео и др., 2009).
Для дальнейшего анализа распределения остатков, наблюдаемого в моделях, мы оценили две основные структурные особенности, связанные со стабильностью соли, которые напрямую коррелируют с аминокислотным составом белка; электростатический поверхностный заряд и гидрофобные взаимодействия в ядре. На рис. 3А показана полярная и заряженная доступная площадь поверхности (ASA) для белков из каждой группы. Белки из Halobacteria демонстрируют заметное увеличение заряженного АСК по сравнению с полярным АСК, в то время как белки из галофильных и негалофильных организмов Methanosarcinales также обладают этим признаком, но менее выраженным.С другой стороны, эукариотические белки показывают почти равное количество заряженной и полярной АСК. Эти характеристики подчеркнуты на рисунке 3B, который показывает типичную поверхность электростатического потенциала для каждой группы. АДФ-ПФК из Halobacteria имеют преимущественно отрицательно заряженную поверхность, которая значительно уменьшена у Eukarya . С другой стороны, обе группы Methanosarcinales показывают сильный положительный компонент на своей поверхности, вероятно, из-за высокого содержания Lys.На рис. 3С представлена графическая иллюстрация пространственного распределения остатков, составляющих ядро белка. В белках из Halobacteria ядро менее обширно по сравнению с ядром белков из эукариот или видов Methanosarcinales .
РИСУНОК 3. Галофильных признаков моделей гомологии, сконструированных для ADP-PFK / GK из Halobacteria, Eukarya , галофильных и негалофильных Methanosarcinales . (A) Площадь полярной и заряженной поверхности, выраженная в процентах от ASA. (B) Поверхность электростатического потенциала репрезентативных моделей была сгенерирована, синяя для положительного и красная для отрицательного заряда (± 3 k _B T / e ). (C) Остатки ядра белка (внутренней оболочки) с использованием в качестве критерия экспонирования поверхностных остатков менее 5 Å. ². Показана репрезентативная модель каждой группы; Natronorubrum bangense ( Halobacteria ), Homo sapiens ( Eukarya ), Methanohalobium evestigatum (галофильный Methanosarcinales ) и Methanosarcinales ) и Methanosarcinales .
Наши результаты показывают, что белки галофильных организмов порядка Methanosarcinales не обладают ни структурными чертами, ни аминокислотным составом, классически наблюдаемым в Halobacteria , что поднимает вопрос о том, как эти белки способны осуществлять катализ в молярных концентрациях. соли. Поэтому мы приступили к экспериментальной оценке галофильного характера белков Methanosarcinales .
Влияние соли и глицинбетаина на активность существующих и наследственных
Methanosarcinales ферментов
Галофильный характер ферментов из Methanosarcinales был оценен путем выбора белков негалофильных и галофильных организмов (рисунок 1B и дополнительная таблица S1).PFK / GK из M. mazei (MmazPFK / GK) и M. evestigatum (MevePFK / GK) были выбраны в качестве репрезентативных примеров, соответственно. Чтобы дополнить сравнительное исследование и проследить эволюцию галофильного признака, мы вывели и экспериментально воскресили последнего распространенного предка PFK / GK-ADP порядка Methanosarcinales (AncMsPFK / GK) (дополнительный рисунок S2) (см. Раздел «Материалы»). и методы »).
Таблица 1 показывает, что три гетерогенно экспрессируемых фермента способны катализировать фосфорилирование обоих субстратов.Это согласуется с аннотациями, которые подразумевают, что они являются бифункциональными ферментами. С точки зрения активности ПФК-АДФ три фермента обладают сходными значениями k _cat и K _M. Однако в отношении их активности GK-ADP были обнаружены различия между предком и существующими ферментами, и как MevePFK / GK, так и MmazPFK / GK показали аналогичные значения K _M для глюкозы, тогда как для предка они были в 10 раз выше. Кроме того, для предкового фермента насыщение субстрата АДФ не было достигнуто даже при 30 мМ, что запрещает определение k _cat.
ТАБЛИЦА 1. Кинетические параметры Methanosarcinales ADP-зависимых киназ.
При насыщающей концентрации субстрата (рисунки 4A – C и дополнительный рисунок S3) мы обнаружили, что существующие ферменты Methanosarcinales ведут себя аналогичным образом в зависимости от концентрации соли, независимо от того, происходят ли они от негалофильных или галофильных организмов. Кроме того, активность обоих ферментов, по-видимому, снижается при повышенных концентрациях соли, и неожиданно негалофильная модель представила оптимальную потребность в соли выше, чем галофильная модель.Учитывая их способность сохранять значительную активность при высокой концентрации соли, их поведение можно рассматривать как галотолерантное, подобное тому, которое наблюдается для некоторых ферментов из Halobacteria (Pugh et al., 1970; Brown-peterson and Salin, 1993; Bonete et al. др., 1996). Кроме того, влияние NaCl на активность MevePFK / GK и MmazPFK / GK аналогично тому, которое наблюдается для KCl (дополнительный рисунок S3). Интересно, что предковый фермент не только активен при высоких концентрациях NaCl, но, по-видимому, фактически активируется им.Однако активность предкового фермента не может быть измерена в присутствии KCl, поскольку высокие концентрации этой соли вызывают осаждение в присутствии хлорной кислоты.
РИСУНОК 4. Влияние KCl, NaCl и глицинбетаина на активность ADP-PFK / GK из Methanosarcinales . Влияние KCl или NaCl на активность: (A) MevePFK / GK (галофильный), (B) MmazPFK / GK (негалофильный) и (C) ancMsPFK / GK (предок) в отсутствие и присутствие 1 М глицинбетаина. (D) Активность MevePFK / GK, MmazPFK / GK и ancMsPFK / GK в зависимости от концентрации глицинбетаина в отсутствие соли. Во всех случаях определения активности проводили при насыщающих концентрациях субстрата. Активность выражали в процентах от активности, полученной в отсутствие как соли, так и глицинбетаина.
Другим важным аспектом галофильной адаптации является присутствие глицинбетаина или других осмолитов в качестве защитных агентов против вредного воздействия гиперосмотической среды.Когда действие глицинбетаина (1,0 М) было проанализировано вместе с молярными концентрациями KCl, очевидно, что защитный эффект наблюдался для активности MevePFK / GK и MmazPFK / GK, в то время как явного влияния на активность AncMsPFK / GK обнаружено не было. Однако различные концентрации глицин-бетаина очень по-разному влияли на ферментативную активность в зависимости от исследуемого фермента. В то время как в случае галофильной модели наблюдался относительно небольшой эффект, 50% -ная активация наблюдалась в случае негалофильного фермента.Напротив, предковый фермент ингибировался глицин-бетаином, сохраняя только 50% своей активности при этой концентрации (рис. 4D).
Влияние соли и глицинбетаина на стабильность
метаносарциналов белков
Учитывая, что Methanosarcinales ADP-зависимые киназы обладают лишь умеренной устойчивостью к ингибированию KCl и NaCl, и чтобы получить хорошее представление о галофильной адаптации этих белков, мы оценили влияние этих солей на стабильность белка (дополнительный рисунок S4).Используя круговой дихроизм, мы определили температуру плавления (Tm) как для существующих ферментов Methanosarcinales , так и для предка в присутствии различных концентраций KCl (рис. 5). Три фермента показали линейное увеличение их Tm с увеличением концентрации KCl, что согласуется с предыдущими исследованиями, которые показывают способность хосмотропных ионов повышать температуру плавления белков (Von Hippel and Schleich, 1969). Tm галофильного белка MevePFK / GK показывает наибольшее увеличение (около 12 ° C) в присутствии 2.0 М. соли. Примечательно, что при 0,5 М KCl Tm для предкового белка примерно на 30 ° C выше, чем для существующих ферментов, что подразумевает, что его следует классифицировать как гипертермофильный белок. Глицин бетаин вызывает смещение Tm MmazPFK / GK и MevePFK / GK до более высоких значений как при низких, так и при высоких концентрациях KCl. В случае MevePFK / GK и MmazPFK / GK наблюдался частично аддитивный эффект между глицинбетаином и KCl, что предполагает аналогичный механизм, лежащий в основе увеличения Tm, вызываемого этими двумя эффекторами (Roesser and Müller, 2001).
РИСУНОК 5. Температурная стабильность АДФ-зависимых киназных белков из Methanosarcinales. Температура плавления (Tm) как функция концентраций KCl и глицинбетаина. Красные столбцы указывают на различные концентрации KCl, тогда как синие столбцы показывают определения, сделанные также в присутствии глицинбетаина.
Белки MmazPFK / GK и MevePFK / GK были нестабильными при низких концентрациях KCl и постепенно стабилизируются при более высоких концентрациях.Интересно, что AncMsPFK / GK показал очень стабильный профиль при всех протестированных концентрациях KCl (от 0 до 2 M KCl) при инкубации при 60 ° C (рис. 6). Такая высокая стабильность согласуется с его гипертермофильным характером и может быть связана с повышенной стабильностью, демонстрируемой воскрешенными предковыми белками в целом (Trudeau et al., 2016).
РИСУНОК 6. Кинетическая стабильность существующих и предковых АДФ-зависимых киназ из Methanosarcinales . Остаточная активность PFK-ADP для ферментов Methanosarcinales определяли с течением времени при различных концентрациях KCl; Кинетическую стабильность MevePFK (A) и MmazPFK (B) анализировали при 40 ° C, в то время как для ancMsPFK (C) использовали 60 ° C.В указанные моменты времени отбирали аликвоту, центрифугировали и анализировали ее активность при 30 ° C.
Определение структуры последнего общего предка ПФК / ГК по
Methanosarcinales
Учитывая отсутствие экспериментально определенных структур для АДФ-зависимых киназ из Methanosarcinales , были выполнены скрининга кристаллизации ферментов, охарактеризованных здесь. Мы получили только кристаллы для ancMsPFK / GK в комплексе с ADP, который был решен путем молекулярного замещения и уточнен до 2.Разрешение 86 Å. Сбор данных и статистика уточнения приведены в таблице 2. Структуру предкового фермента можно разделить на большие и малые альфа / бета домены, показывающие классическую укладку АДФ-зависимой киназы. Большой домен несет в себе архитектуру складки Россмана (α / β / α) с одиннадцатью β-листами, окруженными четырнадцатью α-спиралями, а малый домен состоит из семи β-цепей и четырех α-спиралей, которые действуют как крышка. для активного сайта (рис. 7А). Молекула АДФ расположена в мелком кармане внутри большого домена, где сохраняются взаимодействия, наблюдаемые в других АДФ-зависимых киназах.(Рисунок 7B; Ито и др., 2001). Ион Mg ⁺² координирует α- и β-фосфаты ADP вместе с четырьмя молекулами воды (дополнительный рисунок S5), показывая, что это первая структура ADP-зависимой киназы, в которой металл активного центра взаимодействует только косвенно с белок через молекулы воды. Эти взаимодействия включают: боковые цепи Glu313 (мотив NXXE), Glu282 (мотив HXE) и Thr284 и карбонил основной цепи Phe283. Глутаминовые кислоты мотивов NXXE и HXE были ранее описаны как необходимые для связывания АДФ-Mg в семействе белков в целом и для образования тройных комплексов на уровне суперсемейства рибокиназ (Abarca-Lagunas et al., 2015).
ТАБЛИЦА 2. Статистика сбора и уточнения данных для родительской структуры.
РИСУНОК 7. Кристаллографическая структура ancMsPFK / GK, сайтов связывания Mg-ADP и катионов. (A) Мультяшное изображение, окрашенное в соответствии с вторичной структурой; α-спирали окрашены в желтый цвет, β-тяжи — в синий, а петли — в зеленый. Молекула АДФ показана в виде палочек. Ионы Mg ²⁺ и Ni ²⁺ показаны красными и серыми сферами соответственно. (B) Сайт связывания АДФ, желтые пунктирные линии указывают полярные контакты, рассчитанные с помощью PyMOL. (C) Связывание Ni ²⁺ в минорном домене, координированном тремя остатками Asp (42, 44 и 45). (D) Связывание двух других ионов Ni ²⁺ в основном домене.
Другой особенностью этой структуры является связывание 3 катионов (Ni ²⁺), что может быть связано с высокой концентрацией металла, присутствующего в кристаллизационном растворе.Один из них расположен в начале α-спирали 2 и включает остатки Asp42, Asp44 и Asp45 (сайт I), происходящие из одной и той же цепи (рис. 7C). Два других узла образованы остатками, образующими контакты упаковки кристалла; сайт II состоит из His227 и Glu230 из двух симметрично связанных молекул, в то время как сайт III образован Asp298 из одной молекулы и Asp47 из симметрично связанной цепи (рис. 7D).
Сравнение структур ancMsPFK / GK и существующих PFK из Pyrococcus horikoshii (PhPFK, PDB 1U2X) из порядка Thermococcales показывает очень высокую структурную консервативность предкового фермента.Структурная суперпозиция обоих ферментов показала общее среднеквадратичное значение 2,2 Å между α-атомами углерода, хотя их последовательности идентичны только на 40%. Предковый фермент находится в немного более открытой конформации, чем PhPFK, что становится очевидным при сравнении расстояния между центрами масс малых и больших доменов, которое составляет 32 Å в PhPFK и 34 Å в ancMsPFK / GK. Анализ малого домена PhPFK и ancMsPFK / GK показал точно такие же элементы вторичной структуры с α-углеродным RMSD, равным 1.44 Å. Однако в большой области наблюдается внедрение некоторых дополнительных структурных элементов. Например, α-спираль 17 и β-цепь 17 отсутствуют в PhPFK, тогда как в предковом ферменте присутствует более крупная спираль 1 (на 20 остатков длиннее). Следовательно, RMSD α-углерода для больших доменов выше и составляет 1,77 Å. Примечательно, что области, соответствующие вставкам дополнительных элементов вторичной структуры, наблюдаемые в ancMsPFK / GK, также присутствуют в последовательностях всех ферментов Methanosarcinales , показывая, что это структурное различие, присутствующее в Methanosarcinales ADP-PFK / GKs по сравнению с ADP-PFK из Thermococcales (рис. 8A).
РИСУНОК 8. Галофильные черты строения предков. (A) Структура предка, окрашенная в соответствии с структурной консервативностью через семейство АДФ-зависимых киназ с использованием матрицы BLOSUM30, сохранение последовательности от высокого (синий) к низкому (красный). (B) Аминокислотный состав основных изменений, выявленных на рисунке 2 на внутренней и внешней оболочке, и процент площади полярной и заряженной экспонированной поверхности (ASA), рассчитанный с использованием веб-сервера VADAR.Соответствующее среднее содержание белков Eukarya (зеленый), галофильных Ms (голубой), негалофильных (оранжевый) и Halobacteria (красный) показано пунктирными линиями. (C) Поверхность электростатического потенциала предка, сгенерированная с помощью плагина APBS Tools для PyMOL, синяя для положительного заряда и красная для отрицательного заряда (± 3 k _B T / e ). На рисунке показана конструкция, повернутая на 180 °. (D) Остатки ядра белка (внутренней оболочки) с использованием в качестве критерия экспонирования поверхностных остатков менее 5 Å. ².
Анализ ключевых остатков, присутствующих во внешней оболочке структуры ancMsPFK / GK, показывает несколько специфических особенностей (рис. 8B). В соответствии с тем, что было обнаружено в белках Halobacteria , предок демонстрирует значительное увеличение содержания Glu, даже большее, чем наблюдаемое в Halobacteria , вместе с увеличением содержания Asp. Однако наиболее заметным является содержание лизина предка, которое даже больше, чем наблюдаемое в существующих белках из Methanosarcinales , и достигает почти девятикратного увеличения по сравнению с белками из Halobacteria .
Эти изменения влияют на полярный и заряженный ASA белка (рис. 8B), где размер заряженной поверхности аналогичен размерам, обнаруженным в белках из Halobacteria , в то время как размер его полярной поверхности остается ближе к размеру из Methanosarcinales. белков. Заметное увеличение содержания Lys приводит к заметному положительному заряду на поверхности молекулы, что легко увидеть по электростатическому потенциалу кристаллической структуры (рис. 8C).С другой стороны, внутренняя оболочка белка ancMsPFK / GK демонстрирует тенденцию, аналогичную тенденции, наблюдаемой в белках Methanosarcinales (рис. 8B), показывая не преобладание остатков Ala, а скорее увеличение содержания Ile, что, в свою очередь, приводит к обширное гидрофобное ядро (рис. 8D). Эти результаты показывают, что ancMsPFK / GK достигает своей высокой концентрационной стабильности в основном за счет сильно заряженной поверхности без восстановления его гидрофобного ядра.
Обсуждение
Галофильная адаптация белков стала предметом интенсивных исследований в последние годы.Тем не менее, всеобъемлющая модель, которая объединяет то, как эти молекулы остаются растворимыми и сталкиваются с различными средами, в которых обитают галофильные организмы, все еще отсутствует. В течение последних 50 лет исследования были сосредоточены на белках порядка Halobacteria , которые являются классической моделью для изучения этих молекулярных адаптаций (Lanyi, 1974). Однако в настоящее время признано, что многие галофильные организмы принадлежат к порядку Methanosarcinales , который демонстрирует большое разнообразие от негалофильных видов до экстремальных галофилов.Однако галофильные адаптации, встречающиеся в белках этих организмов, еще предстоит решить.
Три основных различия в распределении аминокислот галофильных ( Halobacteria ) и негалофильных белков широко известны. Один из них — это избыток кислотных остатков на поверхности белка, другой — значительное уменьшение открытой гидрофобной области (в основном вызванное уменьшением открытых остатков лизина), а третье — уменьшение объема гидрофобного ядра. .При сравнении аминокислотного состава внутренней и внешней оболочки АДФ-зависимых ферментов из галофильных и негалофильных видов Methanosarcinales не было обнаружено значительных различий, хотя они оба отличаются от классических сигнатур, присутствующих в галофильных белках из Halobacteria . или негалофильные белки из Eukarya . В частности, наблюдалось увеличение содержания изолейцина во внутренней оболочке. Эта тенденция противоположна описанной для Halobacteria , где сообщалось об уменьшении больших гидрофобных остатков (Leu, Phe, Ile) (Lanyi, 1974; Paul et al., 2008; Siglioccolo et al., 2011). Вероятно, ограниченная конформационная свобода и размер боковой цепи изолейцина приводят к меньшей потере конформационной энтропии при сворачивании белка, одновременно сохраняя большую площадь гидрофобного контакта, что приводит к общему увеличению стабильности. Другой известный механизм включает увеличение содержания аланина, что дает большее энтропийное преимущество, но приводит к уменьшению размера гидрофобного ядра. Этому также способствовала бы среда с высокой ионной силой, которая усиливает гидрофобный эффект.Однако уменьшение размера гидрофобного ядра явно не является адаптивным механизмом, возникшим у Methanosarcinales.
С другой стороны, внешняя оболочка обеих групп Methanosarcinales разделяла с белками Halobacteria увеличение Asp и Glu и снижение Ser. Однако наиболее разительным отличием является содержание Lys во внешней оболочке. В белках из Halobacteria этот остаток практически не уменьшается, тогда как в белках Methanosarcinales он увеличивается в два раза по сравнению с Eukarya .Это конкретное аминокислотное распределение белков Methanosarcinales поддерживает идею новых и неканонических молекулярных адаптаций, чтобы противостоять жизни в галофильной среде. Более того, эта стратегия присутствует в белков Methanosarcinales , начиная от негалофильных организмов и заканчивая экстремальными галофилами. Очевидно, что они разработали совершенно другую стратегию с точки зрения их гидрофобного ядра и, тем не менее, частично аналогичную с точки зрения их молекулярной поверхности, по крайней мере, в той степени, в которой они имеют сильно заряженные поверхности по сравнению с Eukarya .Чистое увеличение заряженных остатков (Lys, Asp, Glu) во внешней оболочке белков Methanosarcinales может быть связано с тем фактом, что эти остатки считаются лучшими кандидатами для увеличения растворимости белка при высоких концентрациях соли (Trevino и др., 2007). Что касается механизма адаптации, представленного в Halobacteria , содержание Lys было выделено как основной ответственный остаток, поскольку двукратное уменьшение его содержания приводит к четырехкратному уменьшению площади, подверженной воздействию гидрофобного растворителя, вносимой этим остатком (Britton et al., 2006). Этот факт напрямую связан с дестабилизацией, проявляемой Halobacteria при низких концентрациях KCl (Tadeo et al., 2009). Взятые вместе, наши результаты подтверждают механизм адаптации к галофильной среде, который отличается от текущих моделей, предложенных для белков из Halobacteria (Madern et al., 2000; Qvist et al., 2012).
Для дальнейшего изучения вклада этих остатков в галофильный характер белков Methanosarcinales следует провести всесторонний мутационный анализ.Однако такого рода исследования очень сложны, поскольку, как продемонстрировала новаторская работа по мутациям белков из Halobacteria , один и тот же остаток, расположенный в разных положениях на поверхности белка, может по-разному влиять на галофильный характер. Это может быть связано с его потенциальными эпистатическими взаимодействиями, его вкладом в формирование вторичной структуры или стабильности белка, среди других факторов (Jolley et al., 1997; Esclapez et al., 2007; Tadeo et al., 2009).
Другой примечательной особенностью галофильных белков является присутствие соли как предпосылки для активности (Mevarech et al., 2000). Во многих случаях при удалении соли обнаруживается потеря ферментативной активности, и это можно коррелировать со структурными данными. Тем не менее, сообщается о некоторых исключениях, когда ферменты оставались полностью активными и структурированными даже в отсутствие соли (Madern and Zaccai, 2004; Hutcheon et al., 2005). Эти результаты отличаются от результатов, наблюдаемых для ферментов негалофильных организмов, которые лишь незначительно активны при концентрациях NaCl / KCl выше 0,5 М и полностью неактивны при молярных концентрациях соли (Wright et al., 2002). Таким образом, что касается солевой зависимости изученных здесь ферментов от Methanosarcinales видов, их можно отнести к умеренно галофильным белкам из-за существенного сохранения активности ферментов при молярных концентрациях солей.
С другой стороны, организмы Methanosarcinales представляют более сложную стратегию в отношении осмотического противовеса, поскольку они накапливают не только внутриклеточные неорганические ионы до концентраций выше 1 М, но также осмолиты, такие как глицин бетаин (Lai and Gunsalus, 1992).Этот осмолит способен защищать активность ферментов от ингибирования NaCl / KCl, а также повышать термостабильность белков (Bowlus and Somero, 1979; Pollard and Wyn Jones, 1979). Наши анализы показали, что присутствие 1 M глицинбетаина наряду с высокими концентрациями соли имеет различный эффект в зависимости от исследуемого фермента; он защищает ферментативную активность галофильных и негалофильных модельных ферментов, но не оказывает значительного влияния на предков. Хотя для подтверждения этой тенденции необходимы дальнейшие эксперименты, результаты предполагают, что глицин-бетаиновая защита активности фермента в галофильной модели могла быть возникающим признаком, который отсутствовал у последнего общего предка PFK / GK-ADP.Более того, подобное поведение, наблюдаемое для ферментов Methanosarcinales с точки зрения активности и стабильности в присутствии соли, может быть объяснено их сходным аминокислотным составом, тогда как защитное действие глицин-бетаина на ферментативную активность галофильной модели может быть связано с на его взаимодействие со специфическими аминокислотными остатками, связанными с активным центром.
Галофильный характер также отражен в данных кругового дихроизма, которые показывают линейное увеличение стабильности (температуры плавления) в зависимости от концентрации KCl.Хотя увеличение Tm неорганическими ионами является общей характеристикой белков (Von Hippel, Schleich, 1969), эта особенность более выражена в галофильных белках, скорее всего, из-за дестабилизации развернутого состояния (Ortega et al., 2015). Здесь эта особенность была воспроизведена как для существующих, так и для предковых ферментов, как показано в данных термической и кинетической стабильности. В соответствии с предыдущими сообщениями, описывающими влияние глицинбетаина на Tm, мы обнаружили, что этот осмолит увеличивает температуру плавления белков Methanosarcinales (Bowlus and Somero, 1979).Однако, когда глицин бетаин анализируется в присутствии KCl, наблюдался неаддитивный эффект, предполагающий, что аналогичный механизм может лежать в основе действия обоих соединений. Опосредованное осмолитом увеличение Tm объясняется балансом двух эффектов; с одной стороны, способность осмолитов предпочтительно гидратировать белки, приводя к стабилизации белков, а с другой — дестабилизирующий эффект из-за умеренно благоприятного взаимодействия открытых гидрофобных боковых цепей с неполярными частями осмолита (Santoro et al., 1992; Auton et al., 2011). Стратегии адаптации, принятые белками Methanosarcinales , могут быть результатом совместной эволюции осмолитов, которая снизила адаптивное давление, действующее на их белки.
Неожиданно оказалось, что АДФ-ПФК / ГК из негалофильных и галофильных организмов обладали несколькими галофильными характеристиками, описанными выше. Это привело нас к рассмотрению галофильного характера последнего общего предка этих организмов. Предковый фермент был так же устойчив к соли, как и галофильные белки из Halobacteria .Хотя структурно предковый белок не обнаруживает существенных отличий от существующих АДФ-зависимых киназ с точки зрения его аминокислотного состава, он имеет несколько поразительных особенностей. Среди них выделяются содержание Lys на его поверхности и отсутствие уменьшения размера гидрофобного ядра. Эти особенности являются общими для тех, которые мы наблюдаем у существующих ферментов, и, по-видимому, они вносят наибольший вклад в неканоническую стратегию галофильной адаптации в этом семействе белков.Вероятно, галофильные черты, присутствующие в предковом ферменте, были сохранены во время эволюции даже у негалофильных организмов, поскольку они представляют собой недостаточный недостаток, чтобы быть быстро устраненными естественным отбором и оставались следствием эволюции.
Поразительно, но предковый фермент также демонстрирует чрезвычайно высокую температуру плавления (примерно 90 ° C), что согласуется с предыдущими сообщениями, показывающими высокую стабильность воскрешенных предковых белков. Кроме того, предковый фермент демонстрирует высокую кинетическую стабильность и повышенную активность при молярных концентрациях соли.Мы утверждаем, что реконструкция предковых ферментов открывает новые направления исследований для изучения галофильного характера предковых ферментов как потенциального инструмента в биотехнологии и раскрытия молекулярной эволюции галофильных организмов и их белков.
Авторские взносы
VC-F, FG-O и VG разработали проект и разработали исследовательский компьютер, построив модели структуры белка и выполнив биоинформатический анализ. ФГ-О, РЗ и ПК провели филогенетический анализ.FG-O, NF-U и SM провели эксперимент по кинетике и стабильности ферментов. FG-O, NF-U, SM, DL, RG и VC-F выполнили и проанализировали эксперимент по кристаллографии белка. Документ написали FG-O, PC, RG, VC-F и VG.
Финансирование
Эта работа была поддержана Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt Grant 1150460 для VG и 3160332 для VC-F). Стипендия Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo (VID-Universidad de Chile) FG-O поддержала стипендию для проведения исследовательской работы в клинике Dr.Лаборатория Ричарда Гарратта, поддерживаемая FAPESP, включая обучение в DL. Оборудование для кругового дихроизма финансировалось Fondequip EQM 140151. Высокопроизводительный робот-кристаллизатор ARI финансировался Fondequip EQM 120208.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарны Матиасу Фуэнтеалба и докторуРикардо Кабрера (Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile) за доступ и техническую поддержку в использовании высокопроизводительного робота-кристаллизатора, а также д-ра Ану ПУ Араужу и д-ра Умберто М. Перейру (Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, Brazil) за техническую поддержку CD и анализов кристаллизации соответственно. Мы также благодарим разработчиков и преподавателей кристаллографической школы CCP4 / APS (2017), доктора Фелипе Транджтенберга и доктора Алехандро Бускьяццо (Institut Pasteur de Montevideo), участвовавших в процессе успешного определения, уточнения и проверки кристаллической структуры.В этом исследовании использовались ресурсы Бразильской лаборатории синхротронного света (LNLS), открытого национального центра, управляемого Бразильским центром исследований в области энергетики и материалов (CNPEM) Министерства науки, технологий, инноваций и коммуникаций Бразилии (MCTIC). Благодарим сотрудников компании MX2 за помощь во время дифракционных экспериментов.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.01305/full#supplementary-material
Список литературы
Абарка-Лагунас, М. Дж., Ривас-Пардо, Дж. А., Рамирес-Сармьенто, К. А. и Гиксе, В. (2015). Анализ функциональных ролей консервативных мотивов NXXE и HXE АДФ-зависимой глюкокиназы из Thermococcus litoralis . FEBS Lett. 589, 3271–3276. DOI: 10.1016 / j.febslet.2015.09.013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Адамс, П.Д., Афонин, П. В., Бункоци, Г., Чен, В. Б., Дэвис, И. В., Эчолс, Н. и др. (2010). PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярных структур. Acta Crystallogr. 66, 213–221. DOI: 10.1107 / S0490
25
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Auton, M., Rösgen, J., Sinev, M., Marcelo, L., Holthauzen, F., and Bolen, D. W. (2011). Осмолит влияет на стабильность и растворимость белка: баланс между основной цепью и боковыми цепями. Biophys. Chem. 159, 90–99. DOI: 10.1016 / j.bpc.2011.05.012
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бонете, М. Дж., Пире, К., Ллорка, Ф. И. и Камачо, М. Л. (1996). Глюкозодегидрогеназа из галофильных архей Haloferax mediterranei : очистка фермента, характеристика и N-концевая последовательность. FEBS Lett. 383, 227–229. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (96) 00235-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Bowlus, R.Д. и Сомеро Г. Н. (1979). Совместимость растворенных веществ с функцией и структурой ферментов: обоснование выбора осмотических агентов и конечных продуктов анаэробного метаболизма у морских беспозвоночных. J. Exp. Zool. 208, 137–151. DOI: 10.1002 / jez.1402080202
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бриттон К. Л., Бейкер П. Дж., Фишер М., Ружейников С., Гилмор Д. Дж., Бонете М.-Дж. и др. (2006). Анализ взаимодействия белков-растворителей в глюкозодегидрогеназе из крайнего галофила Haloferax mediterranei . Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 4846–4851. DOI: 10.1073 / pnas.0508854103
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Браун-Петерсон, Н. Дж., И Салин, М. Л. (1993). Очистка каталазы-пероксидазы из Halobacterium halobium : характеристика некоторых уникальных свойств галофильного фермента. J. Bacteriol. 175, 4197–4202. DOI: 10.1128 / jb.175.13.4197-4202.1993
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бургграф, С., Чинг, А., Стеттер, К. О., и Вёзе, К. Р. (1991). Последовательность Methanospirillum hungatei 23S рРНК подтверждает специфическую связь между крайними галофилами и Methanomicrobiales. Syst. Прил. Microbiol. 14, 358–363. DOI: 10.1016 / S0723-2020 (11) 80310-3
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кастро-Фернандес, В., Эррера-Моранде, А., Замора, Р., Мерино, Ф., Гонсалес-Орденес, Ф., Падилья-Салинас, Ф. и др. (2017).Реконструированные предковые ферменты показывают, что отрицательный отбор управлял эволюцией субстратной специфичности АДФ-зависимых киназ. J. Biol. Chem. 292, 15598–15610. DOI: 10.1074 / jbc.M117.7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кристиан, Дж. Х. Б. и Уолто, Дж. (1962). Концентрации растворенных веществ в клетках галофильных и негалофильных бактерий. Биохим. Биофиз. Acta 65, 506–508. DOI: 10.1016 / 0006-3002 (62)
-5
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Айзенберг, Д., Лути Р. и Боуи Дж. (1997). VERIFY3D: оценка моделей белков с трехмерными профилями. Methods Enzymol. 277, 396–404. DOI: 10.1016 / S0076-6879 (97) 77022-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эсклапес, Дж., Пире, К., Баутиста, В., Мартинес-Эспиноза, Р. М., Феррер, Дж., И Бонете, М. Дж. (2007). Анализ кислой поверхности глюкозодегидрогеназы Haloferax mediterranei методом сайт-направленного мутагенеза. FEBS Lett. 581, 837–842. DOI: 10.1016 / j.febslet.2007.01.054
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эсвар, Н., Эрамиан, Д., Уэбб, Б., Шен, М.-Й., и Сали, А. (2008). «Моделирование структуры белка с помощью MODELLER», в Structural Proteomics , ред. Б. Кобе, М. Гусс и Т. Хубер (Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press), 145–159. DOI: 10.1007 / 978-1-60327-058-8_8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фукути, С., Ёсимунэ, К., Вакаяма, М., Моригути, М., и Нисикава, К. (2003). Уникальный аминокислотный состав белков галофильных бактерий. J. Mol. Биол. 327, 347–357. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (03) 00150-5
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hutcheon, G. W., Vasisht, N., and Bolhuis, A. (2005). Характеристика высокостабильной α-амилазы из галофильной археи Haloarcula hispanica . Экстремофилы 9, 487–495. DOI: 10.1007 / s00792-005-0471-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ито, С., Фушинобу, С., Йошиока, И., Кога, С., Мацудзава, Х., и Вакаги, Т. (2001). Структурная основа АДФ-специфичности новой глюкокиназы из гипертермофильных архей. Строение 9, 205–214. DOI: 10.1016 / S0969-2126 (01) 00577-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джолли, К. А., Рассел, Р. Дж. М., Хью, Д. У. и Дэнсон, М. Дж. (1997). Сайт-направленный мутагенез и галофильность дигидролипоамиддегидрогеназы из галофильных архей, Haloferax volcanii . евро. J. Biochem. 248, 362–368. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1997.00362.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кенген, С. В., Де Бок, Ф. А., Ван Лоо, Н. Д., Дейкема, К., Стамс, А. Дж., И Де Вос, В. М. (1994). Доказательства действия нового пути Эмбдена-Мейерхофа, который включает АДФ-зависимые киназы во время ферментации сахара с помощью Pyrococcus furiosus . J. Biol. Chem. 269, 17537–17541.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Лай, М.К. и Гансалус Р. П. (1992). Глицин бетаин и ион калия являются основными совместимыми растворенными веществами в чрезвычайно галофильном метаногене, штамме Z7302 Methanohalophilus. J. Bacteriol. 174, 7474–7477. DOI: 10.1128 / jb.174.22.7474-7477.1992
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лай, М. К., Сауэрс, К. Р., Робертсон, Д. Э., Робертс, М. Ф., и Гансалус, Р. П. (1991). Распределение совместимых растворенных веществ в галофильных метаногенных архебактериях. J. Bacteriol. 173, 5352–5358. DOI: 10.1128 / jb.173.17.5352-5358.1991
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ланьи, Дж. К. (1974). Солевозависимые свойства белков чрезвычайно галофильных бактерий. Бактериол. Ред. 38, 272–290.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Ларсен, Х. (1967). Биохимические аспекты крайней галофильности. Adv. Microb. Physiol. 1, 97–132. DOI: 10.1016 / S0065-2911 (08) 60251-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ласковски, Р.А., Макартур, М. В., Мосс, Д. С., и Торнтон, Дж. М. (1993). PROCHECK: программа для проверки стереохимического качества белковых структур. J. Appl. Кристаллогр. 26, 283–291. DOI: 10.1107 / S00218898⁹⁴⁴
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лю Ю. (2010). « Methanosarcinales » в Справочнике по углеводородной и липидной микробиологии , изд. К. Н. Тиммис (Гейдельберг: Springer).
Google Scholar
Мадерн, Д., Эбель, К., и Заккаи, Г. (2000). Галофильная адаптация ферментов. Экстремофилы 4, 91–98. DOI: 10.1007 / s0070142
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мадерн Д. и Заккаи Г. (2004). Молекулярная адаптация: малатдегидрогеназа из крайне галофильной бактерии Salinibacter ruber ведет себя как негалофильный белок. Biochimie 86, 295–303. DOI: 10.1016 / j.biochi.2004.04.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нарасингарао, П., Podell, S., Ugalde, J. A., Brochier-Armanet, C., Emerson, J. B., Brocks, J. J., et al. (2012). Метагеномная сборка de novo выявляет многочисленные новые основные линии архей в гиперсоленых микробных сообществах. ISME J. 6, 81–93. DOI: 10.1038 / ismej.2011.78
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ортега, Г., Диркс, Т., и Миллет, О. (2015). Адаптация галофильных белков является результатом синергических взаимодействий остатков и ионов в свернутом и развернутом состояниях. Chem. Биол. 22, 1597–1607. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2015.10.010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пол С., Бэг С. К., Дас С., Харвилл Э. Т. и Датта К. (2008). Молекулярная подпись гиперсоленой адаптации: выводы из генома и протеомного состава галофильных прокариот. Genome Biol. 9: R70. DOI: 10.1186 / GB-2008-9-4-r70
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Филлипс, Дж.К., Браун, Р., Ван, В., Гумбарт, Дж., Тайхоршид, Э., Вилья, Э. и др. (2005). Масштабируемая молекулярная динамика с NAMD. J. Comput. Chem. 26, 1781–1802. DOI: 10.1002 / jcc.20289
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пью, Э. Л., Васеф, М. К., и Кейтс, М. (1970). Ингибирование синтетазы жирных кислот в Halobacterium cutirubrum и Escherichia coli за счет высоких концентраций соли. Банка. J. Biochem. 49, 953–958.DOI: 10.1139 / o71-138
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Qvist, J., Ortega, G., Tadeo, X., Millet, O., and Halle, B. (2012). Динамика гидратации галофильного белка в свернутом и развернутом состояниях. J. Phys. Chem. В 116, 3436–3444. DOI: 10.1021 / JP3000569
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рихтер, Дж. П., Горонси, А. К., Ронимус, Р. С., Сазерленд-Смит, А. Дж. (2016). Структурная и функциональная характеристика АДФ-зависимой глюкокиназы млекопитающих. J. Biol. Chem. 291, 3694–3704. DOI: 10.1074 / jbc.M115.679902
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Русер М., Мюллер В. (2001). Осмоадаптация у бактерий и архей: общие принципы и различия. Environ. Microbiol. 3, 743–754. DOI: 10.1046 / j.1462-2920.2001.00252.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Санторо, М. М., Лю, Ю., Хан, С. М., Хоу, Л. X., и Болен, Д.W. (1992). Повышенная термостабильность белков в присутствии осмолитов природного происхождения. Биохимия 31, 5278–5283. DOI: 10.1021 / bi00138a006
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сиглиокколо А., Пайардини А., Пискителли М. и Паскарелла С. (2011). Структурная адаптация экстремально галофильных белков за счет уменьшения консервативной гидрофобной контактной поверхности. BMC Struct. Биол. 11:50. DOI: 10.1186 / 1472-6807-11-50
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тадео, X., Лопес-Мендес, Б., Тригуэрос, Т., Лаин, А., Кастаньо, Д., и Милле, О. (2009). Структурные основы аминокислотного состава белков галофильных архей. PLoS Biol. 7: e1000257. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1000257
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тревино, С. Р., Шольц, Дж. М., и Пейс, К. Н. (2007). Вклад аминокислот в растворимость белка: Asp, Glu и Ser вносят более благоприятный вклад, чем другие гидрофильные аминокислоты в РНКазе Sa. J. Mol. Биол. 366, 449–460. DOI: 10.1016 / j.jmb.2006.10.026
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Трюдо Д. Л., Кальтенбах М. и Тауфик Д. С. (2016). О потенциальных источниках высокой стабильности реконструированных предковых белков. Мол. Биол. Evol. 33, 2633–2641. DOI: 10.1093 / molbev / msw138
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фон Хиппель, П. Х., и Шлейх, Т. (1969).Влияние ионов на структуру раствора биологических макромолекул. В соотв. Chem. Res. 2, 257–265. DOI: 10.1021 / ar50021a001
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вринд, Г. (1990). ЧТО ЕСЛИ: программа молекулярного моделирования и дизайна лекарств. J. Mol. График. 8, 52–56, 29. doi: 10.1016 / 0263-7855 (90) 80070-V
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Weinisch, L., Kühner, S., Roth, R., Grimm, M., Roth, T., Netz, D. J. A., et al. (2018).Идентификация осмоадаптивных стратегий у галофильных гетеротрофных инфузорий Schmidingerothrix salinarum . PLoS Biol. 16: e2003892. DOI: 10.1371 / journal.pbio.2003892
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Видерштейн, М., и Сиппл, М. Дж. (2007). ProSA-web: интерактивный веб-сервис для распознавания ошибок в трехмерных структурах белков. Nucleic Acids Res. 35, W407 – W410. DOI: 10.1093 / нар / гкм290
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уиллард, Л., Ранджан, А., Чжан, Х., Монзави, Х., Бойко, Р. Ф., Сайкс, Б. Д. и др. (2003). VADAR: веб-сервер для количественной оценки качества структуры белков. Nucleic Acids Res. 31, 3316–3319. DOI: 10.1093 / nar / gkg565
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Райт, Д. Б., Бэнкс, Д. Д., Ломан, Дж. Р., Хильзенбек, Дж. Л., и Глосс, Л. М. (2002). Влияние солей на активность и стабильность дигидрофолатредуктаз Escherichia coli и Haloferax volcanii . J. Mol. Биол. 323, 327–344. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (02) 00916-6
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Юсеф, Н. Х., Сэвидж-Эшлок, К. Н., Маккалли, А. Л., Людтке, Б., Шоу, Э. И., Хофф, В. Д. и др. (2014). Биосинтез трегалозы / 2-сульфотрегалозы и захват глицин-бетаина являются широко распространенными механизмами осмоадаптации в Halobacteriales. ISME J. 8, 636–649. DOI: 10.1038 / ismej.2013.165
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Замора, Р.А., Гонсалес-Орденес, Ф., Кастро-Фернандес, В., и Гиксе, В. (2017). АДФ-зависимые фосфофруктокиназы из архей порядка Methanosarcinales проявляют избыточную глюкокиназную активность. Arch. Biochem. Биофиз. 633, 85–92. DOI: 10.1016 / j.abb.2017.09.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Антиоксиданты | Бесплатный полнотекстовый | Карбонилирование белков у пациентов с миелодиспластическим синдромом: возможность терапии деферазироксом
1.Введение
Миелодиспластические синдромы (МДС) представляют собой гетерогенную группу нарушений гемопоэтических стволовых клеток, характеризующихся наличием незрелых миелоидных предшественников (бластов) и диспластическим гемопоэзом в костном мозге (КМ). В настоящее время «горячей» темой в исследованиях МДС является окислительный стресс и его потенциальное влияние на клеточную биологию, повреждение ДНК и канцерогенез [1,2]. В то время как происхождение заболевания МДС теперь лучше изучено, у пациентов с этим заболеванием были зарегистрированы высокие уровни активных форм кислорода (АФК) и последующее окислительное повреждение кроветворных клеток [3,4,5,6], но последствия меньше Чисто.Известно, что регуляция внутриклеточных уровней ROS является ключом к поддержанию баланса между самообновлением, пролиферацией и дифференцировкой клеток-предшественников, и потеря этого контроля может привести к заболеваниям, характеризующимся недостаточностью костного мозга [7,8]. Потенциальные эффекты АФК на гемопоэтические клетки особенно важны, поскольку они очень уязвимы для окислительного повреждения, связанного с накоплением свободных радикалов [9]. Исследования показали, что клетки костного мозга от пациентов с МДС имеют повышенные уровни внутриклеточного пероксида и сниженные уровни антиоксидант глутатион (GSH) по сравнению с нормальными клетками [10,11,12].Важно отметить, что пациенты с МДС и с высоким уровнем АФК или низким уровнем GSH и высоким соотношением супероксид / пероксид имеют более низкую общую выживаемость [10]. Эффекты увеличения внутриклеточной продукции ROS хорошо известны и включают прямое повреждение биомолекул и / или нарушение регуляции ROS-зависимых сигнальных путей [8,13,14]. В контексте клеток крови сообщалось о взаимодействии между окислительным повреждением ДНК в клетках CD34 + и последующим повышенным уровнем окисления в клетках-предшественниках, таких как бласты или предшественники эритроидов [4].Кроме того, окислительный стресс коррелирует с гиперметилированием ДНК у пациентов с МДС [11] и другими патологическими состояниями [15]. Белки являются важными мишенями ROS [16], и окисление может приводить к агрегации, полимеризации, разворачиванию или конформационным изменениям, которые вызывают структурные или функциональная потеря. Хотя возможно несколько окислительных модификаций белков, большинство из них связано с образованием карбонильных групп, которые необратимо вводятся в белки [17,18,19]. Карбонилирование белков может происходить несколькими путями, но двумя основными факторами являются: (i) прямое катализируемое металлами окисление определенных аминокислотных остатков (лизина, аргинина, пролина и треонина) и (ii) вторичные реакции нуклеофильных аминокислотных сторон. цепи с продуктами перекисного окисления липидов, индуцированными АФК, такими как 4-гидроксиноненаль (HNE) [17,19].Эти модификации, вероятно, играют важную роль в передаче сигналов клетками [18,20]. В качестве специфического маркера окислительного повреждения оценка карбонилирования белка полезна для понимания роли окислительного стресса при некоторых заболеваниях [19]. Обычный метод обнаружения карбонилирования белков включает дериватизацию 2,4-динитрофенилгидразином (DNPH) с образованием стабильного продукта динитрофенилгидразона (DNP), который впоследствии обнаруживается специфическими антителами для визуализации карбонильных групп, связанных с тканями и клетками.Таким образом, этот метод может предоставить информацию как о распределении окислительного повреждения in vivo, так и об идентификации их белковых мишеней дополнительными методами, такими как масс-спектрометрия (МС) [18,21,22]. Сигнальные пути, активируемые окислительным стрессом, могут контролировать клеточный цикл через ген p53 [23]. Действительно, ген-мишень p53 p21, ингибитор циклин-зависимой киназы, участвует в клеточном ответе на генотоксический стресс [16] и играет роль в регуляции старения, контролируя пролиферацию [24].Неправильная активация p21 может привести к лейкемогенезу [25,26]. В этой связи было высказано предположение, что во время первой фазы МДС неэффективное созревание гематопоэтических клеток-предшественников связано с увеличением апоптоза, тогда как на более поздних стадиях клетки костного мозга переключаются на пролиферативный фенотип с незначительным контролем апоптоза [27 ]. Многим пациентам с МДС требуются частые переливания крови, и у них может развиться перегрузка железом в зависимости от переливания крови [28], что, в свою очередь, может привести к увеличению выработки АФК [29].Соответственно, терапия хелаторами железа была предложена для устранения первичного окислительного стресса при МДС [28,30,31]. Действительно, Neukirchen et al. [32] представили данные, показывающие улучшение выживаемости пациентов с МДС с низким риском, получающих хелатную терапию с железом. Одним из таких методов лечения окислительного стресса, который применялся у пациентов с МДС, является хелатор железа деферазирокс (DFX) [33]. DFX, по-видимому, ограничивает повреждение АФК путем активации факторов транскрипции и митохондриального биогенеза [34], а также путем ингибирования генерации свободных радикалов de novo посредством подавления активных окислительно-восстановительных форм железа [35].Карбонилирование белков можно уменьшить / устранить с помощью DFX, который может улавливать ионы Fe-III, образуя октаэдрический комплекс 1: 2 и предотвращая их восстановление [36].
В этом отчете мы впервые демонстрируем терапевтическое преимущество DFX в ингибировании карбонилирования белков, связанного с MDS. Кроме того, мы предоставляем прямые доказательства наличия четырех белков с повышенным карбонилированием в BM пациентов. Наконец, наши результаты показывают, что окислительное повреждение при МДС связано, по крайней мере частично, с сигнальными путями, регулирующими клеточный цикл через p53 / p21, которые регулируются обработкой DFX, что в целом подчеркивает важную роль DFX в контроле реакция на оксидативный стресс при МДС.
2. Материалы и методы.
образцов КМ были получены от пациентов с диагнозом МДС (n = 21, средний возраст 75 лет; диапазон 57–90 лет), которые были сгруппированы в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной ткани Всемирной организации здравоохранения. (2008) и Международной прогностической балльной системы [37]. Основные характеристики пациентов представлены в таблице 1.
Контрольная группа состояла из лиц (n = 13, средний возраст 69 лет; диапазон 29–94 года) без признаков заболевания в BM, без инфильтрации заболевания в BM. .Исследование было одобрено Комитетом Ético de Investigación Clínica Института биомедицинских исследований больницы 12 октября, и все пациенты подписали информированное согласие после того, как поняли все вопросы, связанные с участием в исследовании, в соответствии с руководящими принципами, описанными в Хельсинкская декларация, Конвенция Совета Европы о правах человека и биомедицине, Всеобщая декларация Организации Объединенных Наций по вопросам образования, науки и культуры о геноме человека и правах человека и требования, установленные в испанском законодательстве в области биомедицинских исследований, защиты персональных данных и биоэтики.
Иммуногистохимический анализ был проведен в MDS (n = 9), контрольных (n = 7) и DFX-обработанных (n = 6) образцах, как описано ранее [19], с некоторыми изменениями. Мазки BM, предварительно зафиксированные в метаноле, обновляли в забуференном фосфатом физиологическом растворе / 1% бычьего сывороточного альбумина, и эндогенную пероксидазу инактивировали инкубацией в течение 5 минут с 3% перекисью водорода. Демаскирование и восстановление антигена выполняли путем теплового извлечения антигена с цитратным буфером. Карбонилирование белка было обнаружено дериватизацией образца с помощью DNPH (см.04732) и специфическое обнаружение производных DNP путем непрямого окрашивания пероксидазой [19] с использованием кроличьих антител против DNP (разведение 1/200; каталожный номер D9656) (оба от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Также был проведен иммуногистохимический анализ с использованием кроличьих антител против 4-HNE (разведение 1: 100, ссылка ab46545) (Abcam, Кембридж, Великобритания). Мазки контрастировали с раствором гематоксилина Карацци. Наконец, образцы дегидратировали в серии этанола (100%, 96%), очищали в ксилоле и покрывали покровной средой DPX (Sigma-Aldrich).Образцы визуализировали и отображали с помощью микроскопа Nikon Eclipse 80i (Nikon, Токио, Япония), оснащенного цифровой камерой Nikon. Все клетки были подсчитаны из 4 случайно выбранных полей и усреднены. Первичные культуры, используемые для анализов OxyBlot, были получены из образцов костного мозга пациентов с МДС (n = 8) и контрольных субъектов (n = 6). Мононуклеарные клетки разделяли центрифугированием в градиенте плотности через фиколл (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США). Затем клетки CD34 + отбирали с использованием набора CD34 + Microbead Kit и магнитного разделения клеток (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия).Как описано ранее [38], клетки культивировали в обогащенной среде Stem Spam с эритропоэтином (0,5 Ед / мл, который увеличивался через шесть дней), фактором стволовых клеток (100 нг / мл), ИЛ-3 (10 нг / мл). , липопротеины (40 мкг / мл), дексаметазон (1 мкМ), глутамин (2 мМ) и 1% пенициллин-стрептомицин с целью стимулирования развития предшественников эритроидов. Все продукты для культивирования клеток были приобретены в Stem Cell Technologies (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада), за исключением липопротеинов (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).Для характеристики эритробластов после 10 дней культивирования клетки окрашивали красителем Райта и анализировали проточной цитометрией на цитометре BD FacsAria Fusion (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Стратегия стробирования была основана на мертвых / живых клетках и различении дублетов. По возможности анализировалось не менее 10 000 событий интересующей совокупности. Профиль экспрессии антигена эритробластов оценивали путем мечения флуоресцентно-конъюгированными антителами CD71-APC и CD36-PE.Для анализа данных использовали FCS Express 6 (De NovoSoftware, Глендейл, Калифорния, США) (рис. A1). После 10 дней культивирования клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, pH 8, 50 мМ NaCl, 3% (масс. / v) CHAPS и ингибиторы протеаз. Лизаты общего белка денатурировали при 100 ° C в течение 3 минут в присутствии 6% додецилсульфата натрия (SDS), а затем дериватизировали, как описано ранее [18], с некоторыми модификациями. К образцам добавляли один объем раствора, содержащего 10 мМ ДНФГ в 10% трифторуксусной кислоте, с последующей инкубацией в течение 10 мин при 25 ° C.Смесь нейтрализовали добавлением одного объема стоп-раствора (2 М трис, 30% глицерин и 15% β-меркаптоэтанол). Образцы осаждали и ресуспендировали в буфере, содержащем 7 M мочевины, 2 M тиомочевины, 3% (мас. / Об.) CHAPS, 0,5% (мас. / Об.) MEGA-10, 0,5% (мас. / Об.) LPC и 10 мМ дитиоэритритола. . Количественное определение белка проводили с помощью реагента Bradford 1 × Dye Reagent Quick Start ™ от Bio-Rad (Геркулес, Калифорния, США), а оптическую плотность при 595 нм считывали на планшет-ридере EPOCH (BioTek, Highland Park, VT, США) с использованием Gen5 2.0 (BioTek).
После количественного определения выполняли одномерный (1D) -OxyBlot с 4 мкг образцов белка, подвергнутых электрофорезу через денатурирующий 10% SDS-полиакриламидный гель и перенесенных на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF). Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичным антителом против DNP (как в иммуногистохимическом анализе, но в разведении 1/10 000), а затем с вторичным антителом против IgG кролика, связанным с HRP (разведение 1/5000; ссылка 7074). , Cell Signaling Technologies, Данверс, Массачусетс, США).Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (антитело, ссылка AM4300, Ambion / ThermoFisher, Waltham, MA, USA) использовали в качестве контроля загрузки. Хемилюминесценцию использовали для визуализации белков в соответствии с протоколом ECL Prime Western Kit Blotting Detection Reagent Amersham от Sigma-Aldrich на системе визуализации ChemiDoc ™ MP (Bio-Rad). Изображения были получены и проанализированы с помощью программы ImageLab 5.0 (Bio-Rad).
Для 2D-OxyBlot и препаративного гель-электрофореза четыре геля (n = 2 из образцов MDS; n = 2 из контрольных образцов), со 100 мкг белка на образец, запускали параллельно в идентичных условиях и переносили на PVDF-мембраны.Мембраны инкубировали с первичными антителами против DNP и вторичными антителами против IgG кролика, связанными с HRP, как описано для 1D-OxyBlot. Хемилюминесценцию проводили, как описано выше, с экспонированием на пленке Curix RP2 PLUS (AGFA, Mortsel, Бельгия). Из-за ограничения доступного белка, дополнительный SDS-полиакриламидный гель, содержащий репрезентативный пул образцов (400 мкг), запускали параллельно и окрашивали коллоидным кумасси бриллиантовым синим G250 для отображения общих белков и для последующей идентификации белков с помощью анализа MS.
Интересующие пятна вручную вырезали из 2D препаративного геля, восстанавливали в геле, алкилировали, а затем расщепляли трипсином, как описано в другом месте [18]. Белки были идентифицированы путем сопоставления массы пептида, расщепленного трипсином, с базой данных SwissProt (последовательности SwissProt 553231; 197953409 остатков) с использованием MASCOT 1.9 (http://www.matrixscience.com) через Global Protein Server (v3.5) от Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния, США). Параметры для поиска пептидных массовых отпечатков пальцев были следующими: модификация остатков цистеина карбамидометилированием была установлена как фиксированная модификация; окисление метионина рассматривалось как переменная модификация; максимальное количество пропущенных триптических расщеплений — одно; толерантность к массе пептида была установлена на уровне 50 частей на миллион и учитывались моноизотопные массы.В некоторых случаях таксономия была ограничена человеком. Все идентифицированные белки соответствовали критерию значимости (P39) с идентификационным кодом PXD013609. Чтобы подтвердить, что уровень сигнала был обусловлен исключительно более высоким уровнем карбонилирования, а не более высокой экспрессией белка, специфические антитела к идентифицированным белкам Анализ экспрессии мРНК p21 проводили с помощью количественной ПЦР (кПЦР). Синтез кДНК из РНК, экстрагированной BM из MDS (n = 5), контрольных (n = 8) и обработанных DFX (n = 3) образцов выполняется с помощью набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (ThermoFisher) на 96-луночной платформе Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), поддерживая соотношение буфера обратной транскриптазы и РНК 1: 1.Уровни экспрессии гена p21 (ссылка Hs00355782_m1) и конститутивного гена β-глюкуронидазы (Gus) (ссылка Hs00939627_m1) измеряли в соответствии с протоколом анализа экспрессии гена TaqMan ^®, предоставленным ThermoFisher. В качестве положительного контроля использовали образцы с известной активацией транскрипции p21 в качестве эталона. Все образцы были протестированы в трех экземплярах, и изменения в экспрессии генов были рассчитаны с использованием сравнительного метода ΔCT [40]. Ген Gus служил эндогенным контролем для любого небольшого изменения начальной концентрации РНК, качества общей РНК, а также конверсии и эффективности реакции обратной транскрипции.Наконец, уровни экспрессии были нормализованы для контрольных образцов.
Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между двумя группами проводилось с использованием параметрического t-критерия Стьюдента или непараметрического U-критерия Манна-Уитни, в зависимости от ситуации. Множественные сравнения групп были выполнены с использованием параметрического дисперсионного анализа (ANOVA) или непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Статистически значимыми считали различия при P ≤ 0,05. Все анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США).
4. Обсуждение
Окислительный стресс и его влияние на клеточную биологию, повреждение ДНК и канцерогенез важны в патогенезе МДС [9,10]. Пытаясь идентифицировать возможные эффекторы окислительного повреждения, здесь мы предоставляем первый, насколько нам известно, анализ карбонилирования белков в гемопоэтических клонах пациентов с МДС. Однако это было сложной задачей из-за ограниченного числа пациентов с этой патологией, ограниченного количества образцов, доступных для исследования, и трудностей с размножением клеток-предшественников.Для анализа образцов костного мозга с помощью протеомики требуется большое количество образцов, что, вероятно, объясняет ограниченное количество протеомных исследований, проведенных для этой патологии. Иммуногистохимический анализ выявил увеличение карбонилирования белка в образцах костного мозга от пациентов с МДС, в основном в клетках миелоидного ряда. Вероятно, это не было вызвано перекисным окислением липидов, что отражено в сходстве окрашивания 4-HNE между образцами от пациентов и контрольной группой. Поскольку уровни железа у пациентов с МДС повышены (таблица 1), окисление, катализируемое металлами, должно вносить основной вклад в повреждение белков миелоидных клеток.Протеомный анализ также выявил усиление карбонилирования белков в предшественниках эритроидов, что может быть связано с повышенным повреждением ДНК в клетках MDS CD34 + [4,41]. Действительно, недавнее исследование продемонстрировало увеличение повреждения ДНК у пациентов с МДС, которое было восстановлено лечением хелатором железа [6]. Настоящее исследование впервые демонстрирует, что карбонилирование белка в образцах костного мозга от пациентов с МДС снижается при лечении DFX, указывая на важную роль перегрузки железом и потенциальную терапевтическую пользу хелаторов железа, как это было описано у пациентов с низким риском. МДС [30].Предыдущие оценки окислительного стресса в костном мозге пациентов с МДС с использованием антиоксидантных биомаркеров показали, что все типы клеток костного мозга имеют дисбаланс уровней АФК, что связано с более низкой общей выживаемостью [6,10,42]. Этот фенотип также был обращен хелатированием железа [6,42], что позволяет предположить, что улучшение эффектов окислительного стресса с помощью лечения DFX полезно для этих пациентов. Действительно, ранее сообщалось об улучшении патогенеза МДС после терапии DFX [20,33].
Интересно, что результаты анализа 2D-OxyBlot предполагают, что, возможно, только несколько белков ответственны за основную часть общего карбонилирования белка в образцах MDS.Четыре карбонилированных белка были успешно идентифицированы с помощью МС-анализа и обсуждаются ниже.
Актин чрезвычайно чувствителен к карбонилированию [43]. Этот процесс, по-видимому, происходит при степени окислительного воздействия выше, чем вызывающее окисление некоторых критических аминокислотных остатков, и вызывает разрушение цитоскелета. Действительно, увеличение карбонилированного актина, обнаруживаемое при ряде заболеваний, связано с серьезными окислительными модификациями, ведущими к функциональным нарушениям [44].Карбонилирование актина также происходит при злокачественной трансформации [43] и, соответственно, наши данные позволяют предположить, что эта модификация может быть маркером патогенеза МДС. Лактатдегидрогеназа, окислительно-восстановительный фермент, обратимо превращает пируват в лактат во время анаэробного гликолиза [45]. Интересно, что в контексте окислительного стресса клетки сильно зависят от анаэробного гликолиза для производства АТФ [46]. Больные клетки активируют анаэробные гликолитические ферменты — особенно ЛДГ — для увеличения энергии в форме АТФ для поддержания гомеостаза [47, 48].Окисление ЛДГ приводит к потере его каталитической активности из-за модификации функциональных остатков белка [47, 49], а карбонилирование ЛДГ связано со снижением активности при нарушениях, связанных с дисбалансом окислительного стресса [50]. Наши данные предполагают, что окислительное повреждение ЛДГ, наблюдаемое при МДС, может быть ключевым переключателем клеточной дисплазии, наблюдаемой при этом заболевании. Белки 14-3-3 — это повсеместно распространенные белки, участвующие во множестве процессов, включая регуляцию метаболизма, передачу сигналов, контроль клеточного цикла через путь p53 / p21 [51], апоптоз, перенос белков, транскрипцию, стрессовые реакции и злокачественную трансформацию. [52].Известно, что они регулируют активность широкого спектра мишеней посредством белок-белковых взаимодействий, модулируя сигнальные пути, связанные с окислительно-восстановительной регуляцией [53,54]. Кроме того, остатки цистеина в белках 14-3-3 являются окислительно-восстановительными сенсорами, которые в окисленном состоянии влияют на их биологическую активность [55]. Эти окисленные посттрансляционные модификации белков 14-3-3 являются известными маркерами заболевания при атеросклерозе [56] и неврологических расстройствах [52], а также могут служить индикаторами МДС. Наконец, ZNF846 участвует в регуляции транскрипции через свою ассоциацию с сайтами связывания ДНК, чтобы контролировать экспрессию множества генов, а также действует как коадъютант фактора транскрипции РНК-полимеразы II благодаря своей специфической для последовательности ДНК-связывающей активности [57].Окислительная модификация ZNF846 с помощью тиолов цистеина цинковых пальцев приводит к высвобождению молекул цинка из сайта связывания. Это приводит к потере функции белка цинкового пальца, связанной со связыванием ДНК, а также к увеличению свободного цинка, который может стимулировать и мешать клеточным сигнальным каскадам [58,59]. Эти процессы могут способствовать множественным клеточным дисфункциям, вовлеченным в патогенез и прогрессирование МДС. Следовательно, необходимо дальнейшее изучение этого маркера как потенциального ключевого фактора заболеваний, связанных с МДС.Интересно, что регуляторный сайт связывания фактора транскрипции для p53 в промоторе гена ZNF846 был обнаружен в базе данных GeneCards (www.genecards.org). Сигнальные пути, активируемые окислительным стрессом, могут контролировать клеточный цикл через p53 [23]. Как и ожидалось, мы обнаружили, что экспрессия мРНК p21 была значительно увеличена у пациентов с МДС по сравнению с контролем и значительно снизилась при лечении DFX. Таким образом, механически уменьшение окислительного стресса с помощью DFX, по-видимому, затрагивает, по крайней мере частично, путь p53 / p21, который является основным сигнальным путем, активируемым окислительным стрессом и измененным при MDS [24].Насколько нам известно, это первое исследование, которое демонстрирует смягчающий эффект DFX на экспрессию p21 в контексте MDS. В целом, наши данные предполагают, что лечение МДС с помощью DFX может быть эффективным в (1) ингибировании / обращении карбонилирования белка и его вредных последующих последствий и (2) восстановлении измененных сигнальных путей, связанных с окислительным стрессом.