Гк рф статья 455: Ст. 455 ГК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

Содержание

Ст. 455 ГК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

1. Товаром по договору купли-продажи могут быть любые вещи с соблюдением правил, предусмотренных статьей 129 настоящего Кодекса.

2. Договор может быть заключен на куплю-продажу товара, имеющегося в наличии у продавца в момент заключения договора, а также товара, который будет создан или приобретен продавцом в будущем, если иное не установлено законом или не вытекает из характера товара.

3. Условие договора купли-продажи о товаре считается согласованным, если договор позволяет определить наименование и количество товара.

Комментарий к Ст. 455 ГК РФ

1. Как указано в п. 1 комментируемой статьи, предметом договора купли-продажи может быть любая вещь. При этом не имеет значения, является ли она индивидуально-определенной или определяемой родовыми признаками, потребляемой или непотребляемой, делимой или неделимой и т.д. (в отличие от некоторых иных договоров, предметами которых могут быть только вещи, определяемые родовыми признаками (например, заем (ст. 807)), непотребляемые вещи (например, аренда (ст. 607 ГК)) и др.).

Естественно, что при заключении договора купли-продажи должны соблюдаться установленные гражданским законодательством нормы об оборотоспособности вещей.

Наиболее общие правила об оборотоспособности вещей сформулированы в ст. 129 ГК РФ (к которой и сделана отсылка в комментируемой статье), но правила этой статьи «не работают» сами по себе. В ней содержатся отсылки к другим законам, а при более внимательном рассмотрении законодательства обнаруживается, что и иными правовыми актами также могут вводиться нормы, регламентирующие оборотоспособность вещей. Таким образом, при применении комментируемой статьи необходимо учитывать как правила ст. 129 ГК РФ, так и других законов и иных правовых актов. Вместе с тем требуется исходить из того, что в принципе полностью оборотоспособны все вещи, т.е. все они могут быть предметами договоров купли-продажи. Исключения из этого правила могут быть двоякого рода.

Во-первых, не могут быть предметами купли-продажи вещи, изъятые из гражданского оборота.

Во-вторых, существуют объекты, которые могут принадлежать лишь определенным субъектам, а также объекты, которые могут переходить от одного лица к другому только по специальному разрешению (ограниченно оборотоспособные).

Если предметом договора купли-продажи является вещь ограниченно оборотоспособная, то должны соблюдаться соответствующие правила.

Во всех случаях, когда речь идет о продаже земли или других природных ресурсов, необходимо учитывать нормы об оборотоспособности соответствующих объектов, содержащиеся в законодательстве о земле и других природных ресурсах . См. также п. п. 3, 8, 9, 11 комментария к ст. 454 ГК РФ.

———————————
Более подробно об оборотоспособности вещей см.: Комментарий к Гражданскому кодексу РФ, части первой. С. 481 — 486.

2. В п. 2 рассматриваемой статьи предусмотрено, что предметом договора купли-продажи может быть как вещь, имеющаяся у продавца, так и та, которая появится у него в будущем, поскольку иное не установлено законом и не вытекает из характера товара.

При анализе этой нормы, конечно, наибольшие затруднения возникают при уяснении того, в каких случаях предметом договора может быть вещь, которая появится у продавца в будущем (далее — будущая вещь).

Как представляется, при рассмотрении этого вопроса нужно исходить из следующего.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

По общему правилу нет никаких препятствий для заключения договора купли-продажи будущих вещей (и это отражено в комментируемой статье). Более того, иногда договор может быть заключен только по поводу будущих вещей (например, энергоснабжение). Нередко существо регулируемых гражданским правом отношений предопределяет, что договоры заключаются преимущественно по поводу передачи будущих вещей. И закон учитывает это. Так, в силу ст. 506 Гражданского кодекса РФ поставщик-продавец обязуется передать покупателю производимые или закупаемые им товары. В большинстве случаев продажа товаров по образцам (ст. 497 ГК) предполагает продажу будущего товара. Вообще, заключение договоров купли-продажи будущих товаров весьма распространенное явление.

Как представляется, сам по себе факт отсутствия товара (прав на него) у продавца на момент заключения договора купли-продажи не может являться основанием для признания договора незаключенным или недействительным (в данном случае неуместно вдаваться в обсуждение вопроса о соотношении понятий незаключенность договора и его недействительность). В том числе и тогда, когда он (товар) у него (продавца) не может появиться в принципе. Другое дело, что в каждом конкретном случае указанный факт (отсутствие товара у продавца) в совокупности с другими обстоятельствами (в том числе, возможно, зависящими от покупателя) может привести к недействительности сделки. Например, как сделки, совершенной под влиянием обмана. Сделка должна быть квалифицирована как мнимая (а значит, ничтожная) при ее совершении продавцом и покупателем лишь для вида. Сделка будет притворной, если, заключая договор купли-продажи будущей вещи, стороны имели в виду легализацию передачи денежной суммы «продавцу», не предполагая передачу (будущей) вещи «покупателю».

Если в момент заключения договора продавец не обладает товаром (правами на него) и объективно не может получить его (права на него) в будущем, о чем известно покупателю, то, очевидно, условие о предмете не считается согласованным. Предмета нет и быть не может. Следовательно, нет и договора, он не заключен.

С точки зрения, житейской в ряде случаев продажа будущей вещи может вызвать недоумение. Например, гражданин заключает договор купли-продажи вещи, которую он предполагает получить по наследству. На самом деле неизвестно, появится ли у такого лица право собственности на вещь, обозначенную в качестве предмета договора купли-продажи (вещь может погибнуть, она может быть завещана другому лицу, наследник может быть лишен наследства или отстранен от наследования, наследодатель может произвести отчуждение вещи и, следовательно, она не войдет в состав наследственной массы и т.д.).

Однако исходя из норм права нет никаких препятствий для заключения такого договора. И закон не предусматривает оснований для признания его недействительным.

Если договор купли-продажи будущей вещи не исполняется продавцом по той причине, что у него не появилось права на проданную вещь (и может быть, оно не могло появиться), то покупатель вправе отказаться от договора (п. 1 ст. 463 ГК) и, кроме того, привлечь продавца к ответственности (взыскание убытков, неустойки и т.д.).

3. Итак, по общему правилу допустима продажа будущих вещей. Иное может быть установлено законом или вытекать из характера товара (п. 2 комментируемой статьи).

Слова «установлено законом» не следует понимать буквально. Вряд ли можно обнаружить в законе указание на то, что недопустима продажа той или иной вещи, которая будет создана или приобретена продавцом в будущем. Нет и запретов на продажу будущих вещей при наличии определенных условий и т.п. Из закона может вытекать, что в том или ином случае запрещается (ограничивается) продажа будущих вещей.

Так, широкое распространение имеет строительство объектов недвижимости с привлечением денежных средств граждан и юридических лиц (так называемое долевое строительство). Соответствующие отношения оформлялись по-разному. В том числе нередко заключались договоры купли-продажи объектов в строящихся домах, с тем что покупатель получит объект по окончании строительства, т.е. в качестве предмета договора обозначалась будущая вещь. В связи с принятием Федерального закона от 30 декабря 2004 г. N 214-ФЗ «Об участии в долевом строительстве многоквартирных домов и иных объектов недвижимости и о внесении изменений в некоторые законодательные акты Российской Федерации» . Заключение таких договоров купли-продажи не допускается. В соответствующих случаях должны заключаться договоры участия в долевом строительстве по правилам, установленным названным законом (хотя по правовой природе это договоры купли-продажи будущих вещей).

———————————
Собрание законодательства РФ. 2005. N 1 (ч. 1). Ст. 40.

Как представляется, не может быть предметом договора купли-продажи жилое помещение (жилой дом, квартира, часть жилого дома или квартиры), не принадлежащее продавцу или вообще несуществующее на момент заключения договора. (Недопустим также договор купли-продажи жилого помещения как будущей вещи.) Дело в том, что в силу п. 2 ст. 558 ГК РФ договор купли-продажи жилого помещения подлежит государственной регистрации и считается заключенным с момента такой регистрации. Если лица договорились о купле-продаже жилого помещения как будущей вещи, то зарегистрировать такой договор невозможно. В случае когда жилое помещение еще не создано, на него не возникло право собственности, поскольку оно возникает с момента государственной регистрации (ст. 219 ГК). В Едином государственном реестре прав на недвижимое имущество и сделок с ним (далее — Реестр) нет данных о таком объекте. Соответственно, некуда вносить запись о регистрации договора купли-продажи. Значит, нет и договора (он не заключен). Если объект существует и продавец предполагает его приобрести, с тем чтобы затем передать его покупателю, то договор купли-продажи (будущей вещи) нельзя зарегистрировать потому, что жилое помещение принадлежит третьему лицу (что и отражено в Реестре).

Из сказанного, в частности, следует, что вопросы юридической техники тоже существенны. Изредка случается, что сама реализация субъективного права становится невозможной в связи с наличием неких препятствий юридико-технического свойства (хотя в принципе такого быть не должно). В данном же случае дело не только в юридической технике. В пользу изложенной позиции и соображения концептуального характера. Государственная регистрация прав на недвижимое имущество есть элемент особого правового режима, установленного законодательством для недвижимых вещей. Она имеет отнюдь не техническое значение. При создании недвижимой вещи регистрация входит в юридический состав, порождающий право собственности. В дальнейшем в Реестре отражается юридическая судьба объекта недвижимости. Если государственной регистрации подлежит договор с таким объектом, то именно с момента регистрации договор считается заключенным (п. 3 ст. 433 ГК). Государственная регистрация прав на недвижимость и сделок с ней призвана обеспечить прозрачность рынка недвижимости. Она должна способствовать упрочению субъективных прав. Если бы в Реестр можно было вносить сведения о несуществующих объектах или сделках с этими несуществующими объектами, то это означало бы введение в заблуждение участников рынка недвижимости: Реестр содержал бы сведения, не соответствующие действительности. Внесение в Реестр записей о договорах купли-продажи вещей, которые продавец лишь предполагает приобрести, нарушало бы права обладателей этих вещей.

По тем же соображениям не может быть договора купли-продажи предприятия как будущей вещи (п. 3 ст. 560 ГК).

4. Нередко договор купли-продажи несуществующей вещи, той, которую продавец должен создать и во исполнение договора передать покупателю, очень трудно отличить от договора подряда. Невозможно назвать некий универсальный критерий, позволяющий разграничить указанные договоры. В соответствующих случаях всякий раз необходимо выяснить действительную общую волю сторон с учетом цели договора и исходить из признаков того или другого договора. При этом анализируются договор как документ, переписка сторон, предшествовавшая заключению договора и последующая, поведение сторон и т.д.

5. Договор купли-продажи будущей вещи необходимо отличать от предварительного договора, в соответствии с которым стороны обязались в будущем заключить договор купли-продажи (некогда такое соглашение именовалось договором запродажи).

Договор купли-продажи является имущественным. Он направлен на то, чтобы право собственности на вещь перешло от продавца к покупателю.

Предварительный договор представляет собой организационный договор. Цель его состоит в организации заключения какого-либо договора в будущем, он призван обеспечить появление в будущем основного договора (ст. 429 ГК ).

———————————
См.: Комментарий к Гражданскому кодексу РФ, части первой. С. 1227 — 1229.

6. По общему правилу существенным условием договора купли-продажи является предмет договора — вещь (товар), которую продавец обязуется передать в собственность покупателю. Следовательно, опять-таки по общему правилу договор купли-продажи считается заключенным с того момента, когда стороны достигли соглашения о предмете. В п. 3 комментируемой статьи предусматривается, что такое соглашение считается достигнутым, если стороны договорились о наименовании товара и его количестве. Количество может быть установлено в единицах измерения, в денежном выражении; в договоре может быть предусмотрен порядок определения количества товара (см. ст. 465 ГК и комментарий к ней).

Статья 455 ГК РФ с комментариями — Условие договора о товаре

Комментарий к статье 455 Гражданского Кодекса РФ

1. Пункт 1 статьи признает товаром любые вещи. Вместе с тем комментируемая норма требует при совершении купли-продажи соблюдения правил, предусматривающих исключения из презумпции оборотоспособности любых вещей. Эти правила, установленные ст. 129 ГК, касаются вещей, изъятых из оборота, и вещей, оборот которых ограничен.

Изъятие из оборота может быть установлено только законом. Вещи, изъятые законом из гражданского оборота, не могут служить предметом договора, в т.ч. и купли-продажи. Так, Федеральный закон от 10.01.2002 N 7-ФЗ «Об охране окружающей среды» (СЗ РФ, 2002, N 2, ст. 133) в ст. 58 перечисляет изъятые из оборота особо охраняемые государственные природные территории — государственные природные заповедники, в т.ч. биосферные заповедники, государственные природные заказники, памятники природы, парки.

Ограничение оборотоспособности допускается в порядке, установленном законом. При этом либо устанавливаются участники гражданского оборота, которые могут обладать определенными вещами, либо отчуждение (приобретение) отдельных вещей допускается лишь при наличии специального разрешения. Например, Федеральный закон от 13.12.96 N 150-ФЗ «Об оружии» (СЗ РФ, 1996, N 51, ст. 5681) предусматривает круг лиц, которым может принадлежать оружие и которые, следовательно, могут его покупать.

Перечень продукции (товаров), которая продается (поставляется) только потребителям, имеющим разрешение (лицензию) на ее применение в Российской Федерации, определен Постановлением Правительства РФ от 10.12.92 N 959 «О поставках продукции и отходов производства, свободная реализация которых запрещена» (СА РФ, 1992, N 25, ст. 2217). Установлен ряд ограничений и по сделкам с драгоценными металлами (см. коммент. к ст. 454).

2. К товарам, служащим объектом купли-продажи, относятся как вещи, определяемые родовыми признаками, так и индивидуально-определенные. Различают также вещи движимые и недвижимые. По назначению или по цели использования вещи подразделяются на товары, предназначенные прежде всего для личного, домашнего и семейного назначения, и на товары, приобретаемые для предпринимательской деятельности, а по способу происхождения выделяется сельскохозяйственная продукция, т.е. выращенная (произведенная) в условиях сельскохозяйственного производства. Упомянутая градация вещей (товаров) имеет большое значение именно для договора купли-продажи, т.к. служит одним из признаков, позволяющих отграничить одни виды этого договора от других. Так, при продаже сельскохозяйственной продукции, не прошедшей переработку, применяется договор контрактации. Недвижимые вещи отчуждаются по договору продажи недвижимости, а предприятия как вид недвижимости — по договору продажи предприятия. Поэтому при выборе вида договора купли-продажи необходимо определить признаки вещи — объекта продажи.

К товарам, являющимся объектом договора купли-продажи, относятся также предметы внешнего мира, находящиеся в твердом, жидком, газообразном или ином физическом состоянии. Это обстоятельство является определяющим для отнесения к купле-продаже договоров продажи энергии, газа, воды.

Существовавшее ранее разграничение вещей на товары народного потребления и продукцию производственно-технического назначения утратило правовую значимость для гражданского оборота.

В комментируемой статье в качестве товара называются только вещи. Однако с учетом п. п. 2 и 4 ст. 454 ГК под товаром следует понимать и иные объекты гражданского оборота, упомянутые в ст. 128 ГК: ценные бумаги, валютные ценности, имущественные права.

3. В п. 2 статьи в качестве объекта договора упоминаются товары, уже имеющиеся в наличии в момент заключения договора, и те, которые подлежат изготовлению (выращиванию), т.е. будущие товары. Последние характерны для длящихся договоров поставки энергоснабжения и водоснабжения. Договор контрактации в основном заключается на будущие товары.

Продавцом может быть изготовитель (производитель) товара либо организация, которая приобретает товары (в т.ч. будущие) для продажи.

Таким образом, комментируемая статья не знает каких-либо ограничений ни для лиц, выступающих в качестве продавца, ни для подлежащих продаже товаров, кроме тех ограничений, которые установлены ст. 129 ГК.

4. В п. 3 статьи определены существенные (обязательные) условия договора купли-продажи, т.е. условия, при отсутствии которых он признается незаключенным в силу ст. ст. 432 и 433 ГК. По общему правилу, установленному п. 3 статьи, к существенным отнесены условия о количестве товара и его наименовании. Отсутствие упоминания в договоре таких важнейших условий, как цена, срок передачи товара и его оплаты, требования к качеству и ассортименту, не дает оснований для признания договора незаключенным. Эти условия определяются по правилам, установленным ст. ст. 314, 424, 469 и другими статьями ГК, т.е. при отсутствии соответствующих условий в договоре применяются диспозитивные нормы Кодекса.

Вместе с тем в ряде статей гл. 30 из этого общего правила предусмотрены изъятия. Так, для любого из видов договора купли-продажи с рассрочкой платежа к существенным отнесены также условия о цене, порядке, сроках и размере платежа (ст. 489 ГК). Поскольку в договоре о продаже в кредит может быть предусмотрена оплата товара в рассрочку, то соответствующие условия должны быть и в таком договоре. При продаже недвижимости в кредит, в т.ч. и с рассрочкой платежа, в договор включаются условия, предусмотренные Федеральным законом от 16.07.98 N 102-ФЗ «Об ипотеке (залоге недвижимости)» (СЗ РФ, 1998, N 29, ст. 3400), поскольку недвижимость согласно ст. ст. 488, 489 ГК признается находящейся в залоге у продавца (в залоге в силу закона).

Для договоров продажи недвижимости и предприятия существенными признаны условие о цене, а также данные, характеризующие недвижимость (ст. ст. 554, 555 ГК), для договора продажи жилых помещений — перечень проживающих в нем лиц, сохраняющих право на пользование жилым помещением (ст. 558 ГК).

Следует полагать, что цена является существенным условием договора купли-продажи и в тех случаях, когда ее невозможно определить по правилам п. 3 ст. 424 ГК. В частности, цена на некоторые индивидуально-определенные движимые вещи не может быть определена вследствие отсутствия на рынке аналогичных товаров (например, цена на уникальные произведения искусства, индивидуальное оборудование), поэтому ее должны согласовать стороны при заключении договора.

5. В соответствии со ст. 432 ГК к существенным условиям договора относится также условие о предмете договора, под которым обычно понимают действия, совершаемые сторонами договора. Предмет любого из видов договора купли-продажи составляют действия продавца по передаче товара в собственность покупателя и действия покупателя по принятию и оплате переданного товара. Таким образом, независимо от особенностей (признаков) каждого из многочисленных видов родового понятия договора купли-продажи предмет этих договоров составляет возмездная передача товара в собственность.

Статья 455. ГК РФ, часть 2 в последней редакции 2020 года

Определение ВС РФ N 19-В09-19 от 29 октября 2009 г.

Согласно статье 424 Трудового кодекса Российской Федерации настоящий Кодекс применяется к правоотношениям, возникшим после введения его в действие.

Определение ВС РФ N 51-КГ13-7 от 28 июня 2013 г.

При этом, нормативные акты СССР и Российской Федерации, изданные до введения в действие Трудового кодекса Российской Федерации, согласно ст. 423 Трудового кодекса Российской Федерации, применяются постольку, поскольку они не противоречат настоящему Кодексу.

Определение ВС РФ N 18-Г09-15 от 13 августа 2009 г.

Таким образом, следует признать обоснованным суждение суда о том, что решение об объявлении забастовки было принято с нарушениями, влекущими в силу статьи 413 Трудового кодекса РФ признание ее незаконной.

Определение ВС РФ N 78-Г08-5 от 21 марта 2008 г.

В соответствии с частью 8 статьи 412 Трудового кодекса РФ необеспечение минимума необходимых работ является основанием для признания забастовки незаконной.

Определение ВС РФ N 33-Г12-3 от 23 марта 2012 г.

В соответствии с требованиями статьи 410 Трудового кодекса Российской Федерации после пяти календарных дней работы примирительной комиссии может быть однократно объявлена часовая предупредительная забастовка, о которой работодатель должен быть предупрежден в письменной форме не позднее чем за три рабочих дня.

Определение ВС РФ N 48-Г10-24 от 8 октября 2010 г.

В силу части 2 статьи 409 Трудового кодекса РФ забастовка как средство разрешения коллективного трудового спора допускается в случаях, если примирительные процедуры не привели к разрешению коллективного трудового спора либо работодатель уклоняется от примирительных процедур, не выполняет соглашение, достигнутое в ходе разрешения коллективного трудового спора.

Определение ВС РФ N 74-Г06-4 от 10 февраля 2006 г.

Как видно из материалов дела, стороны не достигли соглашения относительно кандидатуры посредника и в силу части 3 статьи 406 ТК РФ им было необходимо приступить к созданию трудового арбитража, который в данном случае являлся обязательной процедурой, так как забастовка объявлялась в организации, в которой ее проведение ограничено законом.

Определение ВС РФ N 83-АПГ12-5 от 7 сентября 2012 г.

При объявлении забастовки предусмотренные ст. ст. 401 — 404 ТК РФ примирительные процедуры работниками ОАО не соблюдались, перечень минимума необходимых работ, выполняемых в период проведения забастовки работниками организации не устанавливался.

Определение ВС РФ N 66-Г12-2 от 2 марта 2012 г.

6 июня 2011 года состоялось заседание примирительной комиссии, по результатам работы которой, 7 июня 2011 года сторонами был подписан протокол разногласий о продолжении рассмотрения коллективного трудового спора с участием посредника, в соответствии с положениями статьи 403 Трудового кодекса Российской Федерации.

Определение ВС РФ N 45-Г07-18 от 7 сентября 2007 г.

В частности, в соответствии со ст. 402 ТК РФ решение о создании примирительной комиссии должно быть оформлено приказом работодателя — РАО.

Статья 455 ГК РФ и комментарии к ней

Обязательные признаки договора поставки

Начнем с договора поставки. Он характеризуется следующими признаками.

Во-первых, обе стороны такого договора являются участниками предпринимательской деятельности. Это означает, что продавцом по договору поставки (поставщиком) может выступать либо организация, либо индивидуальный предприниматель. Физическое лицо, не зарегистрированное в качестве ИП, поставщиком быть не может.

Что касается покупателя по договору поставки, то предполагается, что он приобретает товары для использования в предпринимательской деятельности или в иных целях, не связанных с личным, семейным, домашним и иным подобным использованием. То есть в данном случае статус покупателя не имеет значение, а важна лишь цель приобретения товаров. Поэтому покупателем по договору поставки может быть и «обычное» физлицо. Например, такое возможно, если человек только планирует зарегистрироваться в качестве ИП или создать организацию. В этом случае он может, будучи «обычным» физлицом, приобретать по договору поставки необходимые для предпринимательской деятельности товары (оргтехнику, офисную мебель, материалы для ремонта и т.п.). Об этом, в частности, сказано в пункте 5 постановления Пленума ВАС РФ от 22.10.97 № 18 «О некоторых вопросах, связанных с применением Положений Гражданского кодекса Российской Федерации о договоре поставки» (далее — постановление Пленума ВАС РФ № 18).

Бесплатно проверить контрагента на признаки фирмы‑однодневки и наличие дисквалифицированных лиц

Во-вторых, предметом договора поставки являются производимые или закупаемые продавцом товары. То есть сфера применения договора поставки ограничена двумя ситуациями: производитель реализует свой товар, либо «перекупщик» реализует товар, который ранее был закуплен именно для цели перепродажи. Наконец, в-третьих, договор поставки всегда предполагает установление срока или сроков передачи товаров. Это вполне логичное условие, так как товары приобретаются покупателем для использования в предпринимательской деятельности, которую необходимо планировать.

Заметим, что хотя формулировка статьи 506 ГК РФ не исключает возможность заключения разового договора поставки, однако по своей сути поставка подразумевает длительные отношения между сторонами. Об этом свидетельствуют, в частности, положения статьи 508 ГК РФ, которая регулирует периодичность поставок. Таким образом, классический договор поставки подразумевает некую регулярность передачи товаров и множественность партий. Например, на основании такого договора производитель может закупать у поставщиков комплектующие, необходимые для производства, либо может сам поставлять свои товары в торговую сеть или на склад дилера.

Суммируя все вышеизложенное, получаем, что договор поставки заключается, если одновременно выполняются следующие условия:

и продавец, и покупатель занимаются предпринимательской деятельностью;
товар, который продает поставщик, либо произведен им самим, либо закуплен у третьих лиц для дальнейшей перепродажи;
договором предусмотрен срок (сроки) передачи товара.

Если хотя бы одно из этих условий не выполняется, то договор поставки не применяется, и необходимо рассмотреть иные варианты оформления торговых операций.

Бесплатно составить и распечатать договор поставки по готовому шаблону

Также отметим, что договор поставки не заключается при продаже «офисных» товаров через розничные магазины. Такие отношения всегда регулируются договором розничной купли-продажи. Данное правило применяется независимо от того, кто является покупателем — «обычное» физлицо, ИП, или представитель организации (п. 5 постановления Пленума ВАС РФ № 18).

Стороны договора

Участниками соглашения о купле-продажи недвижимости выступают:

Продавец — лицо, владеющее объектом сделки на момент его заключения.
Покупатель — лицо, к которому переходит владение объектом сделки после его заключения.

Интересы каждой из сторон могут быть представлены доверенным лицо при наличии нотариально заверенной доверенности.

Участниками ДКП могут быть как физические, так и юридические лица.

В первом случае к нему предъявляются определенные требования:

Достижение возраста 18 лет.
Полная дееспособность (отсутствие нарушений как физического, так и психического здоровья).

Если продавцу еще не исполнилось 18 лет или он недееспособен, за него действует законный опекун или представитель.

Стороны ДКП должны быть конкретно определены в соглашении (вводной части). Необходимо прописать:

Наименование участников договора (если это физлица, то ФИО полностью с паспортными и контактными данными, если сторона является юридическим лицом – указание организационно-правовой формы и наименования полностью, а также название документа, на основании которого действует его представитель).
Дополнительную информацию при необходимости.

Товар покупается для личных целей

Перейдем к оставшимся двум видам договоров. Когда заключить договор розничной купли-продажи, а когда — «простой» договор купли-продажи?

Предположим, что не выполняется первое из перечисленных выше условий, необходимых для оформления договора поставки: покупателем товара выступает «обычный» человек (не имеющий статуса ИП), который приобретает товар для личного использования. Казалось бы, в этом случае нужно заключить договор розничной купли-продажи. Но этот вывод будет верным далеко не всегда. Дело в том, что розничная купля-продажа также имеет свои обязательные признаки. И условие о том, что покупателем является «обычное» физлицо, приобретающее товар для личного использования, — это только один из таких признаков.

Вторым обязательным признаком розничной купли-продажи является специализация продавца. По правилам статьи 492 ГК РФ договор розничной купли-продажи заключается только в том случае, если продавец осуществляет предпринимательскую деятельность по продаже товаров в розницу. А это значит, что если розничная торговля не является для организации видом деятельности (в частности, не указана в ЕГРЮЛ), то она не может вступать в качестве продавца по договору розничной купли-продажи. В таком случае нужно оформить «простой» договор купли-продажи, даже если покупателем будет «обычное» физлицо, которое приобретает товар для личных нужд.

Как быть, если продавец действует по доверенности

Если в роли продавца выступает не собственник помещения, а его представитель, необходимо проявить особую внимательность при заключении сделки. В первую очередь важно проверить доверенность представителя на предмет:

Полномочий, которыми он наделен (входит ли в них сделки с недвижимостью).
Определения круга покупателей (нет ли ограничений, кому может быть продана квартира).
Условий продажи, определенных собственником (стоимость, порядок расчетов и т.д.) или права доверителя действовать самостоятельно.
Срока действия доверенности (важно, чтобы она была актуальной до момента госрегистрации перехода права собственности).

Также в преамбуле договора нужно дополнительно указать помимо реквизитов сторон, также и сведения о доверенном лице.

Важно учитывать, что доверенность аннулируется в одностороннем порядке. После получения денег за квартиру собственник может просто прекратить его действие, что влечет за собой недействительность заключенной сделки.

Продажа бывшего в употреблении имущества

«Простой» договор купли-продажи следует заключить и в той ситуации, когда организация продает свое собственное, бывшее в употреблении имущество. При этом не имеет значение, кто является покупателем — другая организация или физлицо (в том числе ИП). Ведь в этом случае не выполняется второе обязательное условие договора поставки: продается товар, который закупался не для перепродажи, а для собственных нужд организации.

Таким образом, при распродаже основных средств и иного имущества, которое использовалось организацией, нужно оформить «простой» договор купли-продажи.

Обмениваться с контрагентами юридически значимой «первичкой» через интернет

Комментарий к статье 455 ГК РФ

1. В соответствии с п. 1 коммент. ст. предметом договора купли-продажи, т.е. товаром, может быть любое имущество, не изъятое из гражданского оборота (см. также коммент. к ст. 454 ГК). Продажа вещей, ограниченных в обороте, возможна с соблюдением специального правового режима: особый субъектный состав, наличие необходимых разрешений (п. 2 ст. 129 ГК).

2. Договор купли-продажи может быть заключен в отношении «будущих» вещей, т.е. таких, которые либо еще не существуют вовсе, либо не принадлежат продавцу (п. 2 коммент. ст.). Подобный подход основывается, с одной стороны, на принципиальном разграничении обязательственных и вещно-правовых последствий в рамках конструкции консенсуального договора. Поскольку для совершения консенсуального договора (в том числе и купли-продажи) наличие титула в отношении предмета не является необходимым, нет принципиальных препятствий для заключения договора в отношении чужой или еще не созданной вещи. С другой стороны, правило п. 2 коммент. ст. является отражением общемировой тенденции регулирования вопроса о первоначальной невозможности исполнения (см. ст. 3.3 Принципов международных коммерческих договоров УНИДРУА, ст. 4.102 Принципов европейского договорного права).

Основываясь на формулировке п. 2 коммент. ст., отдельные авторы полагают допустимым продажу «будущих» вещей только в ситуации, когда у продавца в момент заключения существует реальная возможность их создания или приобретения в будущем (см., например: Комментарий к Гражданскому кодексу Российской Федерации, части второй (постатейный) / Под ред. Т.Е. Абовой, А.Ю. Кабалкина. М., 2003. С. 42 (автор комментария — В.П. Мозолин)). Подобный подход сомнителен, поскольку категория «реальная возможность продавца» достаточно абстрактна и субъективна. Законодатель отнюдь не стремился ограничить оборот с помощью придания юридического значения «возможностям» (?!) продавца. Словосочетание «товар, который будет создан или приобретен продавцом в будущем» использовано в коммент. ст. исключительно в качестве антитезы «товару, имеющемуся в наличии у продавца».

3. Договор купли-продажи «будущей» вещи не приобретает черты алеаторного (рискового), оставаясь возмездной меновой сделкой. Как следствие, в отношении такого договора без всяких исключений подлежат применению правила, регулирующие последствия существенного изменения обстоятельств (ст. 451 ГК).

Договор купли-продажи «будущей» вещи следует отличать от предварительного договора (см. ст. 429 ГК).

4. Договор купли-продажи «будущей» вещи может быть заключен, если иное не установлено законом или не вытекает из характера товара. К числу подобных изъятий относятся договоры, подлежащие государственной регистрации, которые считаются заключенными с момента их государственной регистрации (см., например, п. 2 ст. 558, п. 3 ст. 560 ГК). Последняя при этом не может быть произведена, если данные о правах продавца в отношении отчуждаемой вещи не содержатся в Едином государственном реестре прав на недвижимое имущество и сделок с ним (ЕГРП).

5. Пункт 2 коммент. ст. допускает заключение договора по поводу «будущей», в том числе еще не существующей, вещи. Вопрос о возможности совершения договора в отношении уже не существующей вещи (например, уникальной вещи, уже погибшей к моменту заключения договора купли-продажи) является дискуссионным (подробнее см.: Павлов А.А. Некоторые вопросы учения о невозможности исполнения // Очерки по торговому праву. Ярославль, 2004. Вып. 11. С. 57 — 60).

6. С учетом общей отсылки п. 4 ст. 454 ГК предметом договора купли-продажи могут выступать и «будущие» имущественные права, т.е. права, которые возникнут или будут приобретены продавцом в будущем (см. п. 4 письма ВАС N 120).

7. Условие о предмете является существенным условием договора купли-продажи. Оно считается согласованным, если договор непосредственно определяет наименование и количественные характеристики товара либо эти данные определимы исходя из условий договора (п. 3 коммент. ст., см. также коммент. к ст. 465 ГК).

По общему правилу условие о предмете — единственное существенное условие договора купли-продажи. Для отдельных разновидностей купли-продажи закон называет дополнительные, помимо предмета, существенные условия. Так, в договоре поставки существенным является условие о сроке договора, в договоре продажи недвижимости — условие о цене.

Условие о сроке передачи товара

В заключение рассмотрим еще одну ситуацию. Предположим, организация закупила или произвела небольшую партию товара, и нашла на нее покупателя — другую коммерческую организацию или ИП. Как оформить такие отношения: договором поставки или «простым» договором купли-продажи?

Ответ на этот вопрос зависит от договоренности сторон насчет срока передачи товара. Если стороны согласовали такой срок и включили его в договор, то он автоматически становится договором поставки. Данный вывод подтверждается в упомянутом пункте 5 постановления Пленум ВАС РФ № 18. В нем сказано, что независимо от наименования договора, названия его сторон либо обозначения способа передачи товара в тексте документа отношения сторон должны квалифицироваться как поставка, если имеются все признаки, указанные в статье 506 ГК РФ. Напомним, что условие о сроке (сроках) передачи товара является одним из таких признаков.

А значит, если стороны договора — участники предпринимательской деятельности, предмет договора — произведенный продавцом или закупленный им для перепродажи товар, и в договоре установлен срок передачи товара, то это договор поставки. Если же в договоре такой срок не обозначен, то речь идет о «простом» договоре купли-продажи и положения ГК РФ о поставке на него не распространяются.

Порядок оплаты

В договоре важно указать:

Итоговую стоимость квартиры (цифрами и прописью).
Порядок оплаты (наличным или безналичным путем).
Обязанность покупателя по передаче аванса или задатка (при наличии).
Срок, до которого должен быть произведен окончательный расчет (следует использовать точное число, месяц и год).

Если покупка оплачивается наличными или вносится предварительный платеж (аванс или задаток), продавцу необходимо написать расписку о получении денежных средств.

Нюансы сделки с ранее приватизированным помещением

Покупка приватизированной квартиры имеет множество преимуществ:

Возможность перепланировки.
Отсутствие необходимости делать приватизацию самостоятельно, что экономит как время, так и силы.
Облегчает последующие сделки с недвижимостью (приватизированную квартиру легче и продать и сдать в аренду).

Приобретение приватизированной недвижимости происходит в том же порядке, что и стандартный договор. Здесь нужно проверить:

Правоустанавливающие документы продавца.
Справку об отсутствии задолженности по платежам.

Трактовка термина

Прежде всего, давайте развернуто ответим на самый важный вопрос: что же такое договор, какие его основные качества и характеристики, как он работает и для чего составляется? Этот термин у нас на слуху более, чем часто, он встречается не только в юрисдикции и работе крупных организаций, но и в повседневной жизни каждого человека.
Понятие договора знакомо тем, кто сдает или продает квартиру, тем, кто устраивается на работу, ну и, конечно же, всем тем, кто имеет дело с бумагами. Итак, это закрепленное на бумаге соглашение нескольких или же двух сторон, в котором идет речь об установлении, прекращении или изменении гражданских обязанностей и (или) прав.

О том, что такое заключение договорных отношений можно сказать и более простыми словами. Это соглашение, конечно же, добровольное, в котором участвует два или более лица. В ходе его составления стороны обременяются конкретными обязанностями, за невыполнение которых им предстоит уплатить денежный штраф или выполнить иные действия, предписанные в документе.

Пожалуй, это один из самых простых и доступных каждому юридических терминов, поскольку такое явление, как соглашение между сторонами, имеет место в быту каждого из нас. Даже дети заключают между собой устные договорные отношения, которые подкрепляются определенными условиями и «штрафами» за невыполнение обязательств. В российском законодательстве заключение происходит в соответствии со статьей 420 ГК РФ. В ней описаны все понятия и положения данного явления, обязательства и возможные наказания за неправомерные действия в рамках нарушения обязательств.

Нюансы сделки в случае, если квартира досталась продавцу по наследству

Если продаваемая квартира получена собственником по наследству, размер рисков такой сделки существенно выше:

На недвижимость могут предъявить права лица, являющиеся наследниками первой очереди, несмотря на то, что они не указаны в завещании.
Если приобретенная по наследству квартира находится у собственника менее 3 лет, покупателю придется заплатить налог с проведенной сделки.

Чтобы обезопасить себя от любых неприятностей, нужно полностью изучить историю жилья на наличие:

Завещательных отказов.
Арестов имущества.

Также необходимо проверить документ, служащий правом на получение наследства.

Независимо от проведенного анализа, нет абсолютной гарантии того, что в будущем не объявятся родственники, имеющие право претендовать на жилье. Поэтому не стоит покупать квартиру, полученную по наследству, не разобравшись в деле как следует.

Прекращения права собственности — cт 235 ГК РФ: Когда прекращается право собственности на недвижимость

Понятие «прекращение права собственности»

Право собственности — это зарегламентированная законом возможность владельца ресурса использовать его по своему усмотрению, распоряжаться объектом исходя из назначенных целей для решения конкретных задач.

В случае, если собственник материального ресурса принял решение, что ему нужно избавиться от него, он может передать полномочия новому собственнику. После отчуждения объекта наступает прекращение права собственности предыдущего владельца.

Согласно ГК РФ ст. 235 прекращение имущественного права собственности может быть добровольным или принудительным. Владелец земельного участка или объекта недвижимости может самостоятельно, в добровольном порядке, принять решение об отчуждении имущества и передачи владений другому лицу. В такой ситуации необходимо составить соответствующий документ-основание, согласно которому новый правообладатель получит права (купля-продажа, договор дарения).

Действующим законодательством также предусмотрены основания для приостановки прав собственника в принудительном порядке.

Основания добровольного прекращения права собственности

Каждый собственник объекта недвижимости вправе по своей воле решить отказаться от своего имущества в пользу другого лица. Данное юридическое действие основывается лишь на решении владельца.

Отчуждение собственником имущества

Если владелец недвижимости, земли или иных ресурсов решает избавиться от матценностей, он может продать их, подарить. Новый правообладатель получает полномочия на объект согласно условиям договора. Конкретный вид документа, по которому производится отчуждение объекта, зависит от способа перехода имущественного права.

Переход права собственности по наследству

Чтобы передать по наследству земельный участок или объект недвижимости, необходимо изначально зарегистрировать права на него в росреестре. Согласно ФЗ РФ № 218 каждый объект недвижимого имущества подлежит обязательному кадастровому учету. Иначе юридически полномочия собственника не закреплены. Следовательно он не может распоряжаться имуществом.

Проверить, присвоен ли наделу или строению кадастровый номер, можно с помощью выписки ЕГРН из Росреестра. В документе отражены базовые характеристики объекта, в том числе ФИО все совладельцев. Заказать справку в электронном виде проще через портал ЕГРНка.ру.

Добровольный отказ собственника от прав

Одним из оснований прекращения имущественного права является добровольный отказ владельца от действующих полномочий. В этом случае необходимо уведомить о принятом решении местную администрацию,ю где расположен объект. Если вы решил отказаться от надела или дома самостоятельно, нужно понимать, что до перехода имущественного права новому владельцу и регистрационных действий в Росреестре, вы останетесь полноценным правообладателем объекта.

Прекращение деятельности юридического лица

Если юрлицо закрывает свою деятельность, имущество, которое было на балансе организации, переходит во владение учредителей. Размер долей совладельцев и объем полученных прав зависит от учредительной документации. Порядок прекращения права собственности при ликвидации юридического лица установлен в ст. 63 ГК РФ.

Основания принудительного изъятия имущества

Без веских причин никто не вправе забрать у вас материальные ценности, земельные участки, объекты строительства. Принудительное прекращение имущественного права собственности происходит в случаях, указанных в действующем гражданском законодательстве.

Обращение взыскания на имущество по обязательствам

Согласно ст. 237 ГК РФ лишить полномочий владельца и в принудительном порядке забрать его имущество при невыполнении обязательств можно лишь по постановлению суда. Имущественное право владельца прекращается с момента перехода полномочий к новому собственнику, то есть после регистрации прав в Росреестре и выдачи выписки из ЕГРН.

Отчуждение имущества, которое в силу закона не может принадлежать данному лицу

Если владелец недвижимости получил права на нее по условиям действующих нормативных актов, но он не вправе ею распоряжаться, необходимо передать полномочия другому лицу в течение года с момента приобретения объекта. Если отчуждение объекта и прекращение права собственности на него не будет произведено в установленный ст. 238 ГК РФ срок, ресурс попадает под юрисдикцию государства и реализуется новому собственнику. При этом предыдущий владелец должен получить компенсацию.

Отчуждение недвижимого имущества в связи с изъятием участка

Если земельный надел используется не по назначению, с нарушением закона, его могут изъять в пользу муниципалитета или государства. В случаях, когда отчуждение земли невозможно без прекращения права собственности на ОКС, расположенный на изымаемой территории, представители власти обязаны выкупить недвижимость у владельца (ГК РФ, ст. 239).

Изъять недвижимое имущество, находящееся в личной собственности, невозможно, если в суде не будет доказано, что земельный участок эксплуатируется с нарушением установленных законодательных нормативов.

Реквизиция

В 242 статье ГК РФ указано, что влсучае наступления чрезвычайных ситуаций (природные катаклизмы, пандемия) у владельца позаимствовать недвижимость или иной ресурс с выплатой его стоимости. При этом, хозяин объекта может оспорить госоценку в суде.

Конфискация

В случаях, установленных ГК РФ ст. 243, основанием для прекращения полномочий на собственность с последующей конфискацией имущества является совршенное владельцем правонарушение. При этом недвижимость изымается безвозмездно и собственник не получает за нее материальную компенсацию.

Утрата возможности пользования, распоряжения и владения имуществом вследствии объективных причин

Прекращение права собственности может наступить вследствие следующих объективных оснований:

Добровольное решение владельца об отказе от владений;
Продажа имущества;
Отчуждение объекта по договору мены;
Передача ресурса наследникам;
Отказ от гражданства;
Смерть владельца;
Ликвидация юрлица;
Передача недвижимости для реализации госнужд.

В чью пользу отчуждается имущество

В случае добровольного прекращения полномочий на объект будет передан лицу, которое изъявит желание его приобрести. Также недвижимость или иные ценности могут быть отчуждены в пользу наследников владельца в случае его смерти.

Если речь идет о принудительном прекращении полномочий собственника, то имущество возвращается гражданину или организации, который незаконно лишился своих полномочий и понес материальные убытки. Законами также предусмотрены ситуации, при которых отчуждение объекта производится в пользу муниципалитета.

Что делать при несогласии с прекращением права собственности

Если владелец недвижимости или земли не согласен с принудительным прекращением полномочий, он может подать исковое заявление в суд. Основания для прекращения права собственности установлены законодательными актами и без веских причин никто не сможет отобрать ваше имущество.

Важно помнить, что до момента внесения сведений в росреестр о прекращении полномочий владельца, он является законным собственником. Проверить, кто имеет легитимные основания распоряжаться строением или землей можно из выписки ЕГРН. Заказать бланк в электронном виде онлайн можете через сервис ЕГРНка.ру. Цифровая версия справки, заверенная ЭЦП госрегистратора, равнозначна бумажному документу.

Проверить информацию по объекту на публичной карте

Видео: Когда и почему прекращается право собственности

Источник: https://egrnka.online/info/prekrashenie-prava-sobstvennosti/

Интервенционная магнитно-резонансная ангиография без привязки: Визуализация беспроводного активного катетера — Quick — 2005 — Магнитный резонанс в медицине

Превосходное качество изображения, связанное с трехмерной (3D) МР-ангиографией (МРА) с усилением гадолиния (1), послужило стимулом для различных исследователям следует рассмотреть возможность использования МРТ при сосудистых вмешательствах помимо чисто диагностической визуализации. Конечной целью этих исследований является создание интервенционной установки, основанной на уникальных возможностях визуализации МРТ, которая может выполнять прединтервенционное планирование, интервенционное управление инструментами и последующее наблюдение после интервенционной терапии.

Предпосылкой для безопасного и успешного выполнения сосудистых вмешательств с помощью МРТ является надежная визуализация катетеров и проводников с учетом морфологии окружающей ткани. Был разработан ряд подходов для визуализации инструментов, видимых в среде МРТ, включая как пассивные, так и активные методы. Пассивные методы зависят от контрастных веществ или артефактов восприимчивости, которые усиливают внешний вид катетера на самом изображении (2, 3).Активный подход к визуализации инструментов предлагает ряд неотъемлемых функций, которые полезны для управления сосудистыми вмешательствами с помощью МРТ; однако он основан на дополнительном оборудовании, встроенном в катетер, таком как радиочастотные (РЧ) антенны (4-12). До сих пор большинство предложенных конструкций для активной визуализации инструментов в МРТ требовали наличия какого-либо электропроводящего проводного соединения между инструментом и МРТ-сканером. Этот провод соединяет РЧ-катушку или дипольную антенну через корпус прибора с удаленной внешней электроникой настройки, согласования и развязки.Эта электроника обычно находится в защищенном от радиочастотном излучении блоке, который соединен с помощью интерфейсного штекера с портом поверхностной катушки сканера (4-12).

Было показано, что локальное поглощение радиочастотной энергии вокруг внутрисосудистых инструментов и связанный с этим нагрев тканей представляют потенциальную угрозу безопасности во время интервенционных процедур MRA. При включении длинного электропроводящего провода в активно визуализируемый инструмент радиочастотная энергия, передаваемая в тело через радиочастотную катушку для тела, может локально усиливаться и, таким образом, приводить к радиочастотному нагреву (13).На основании этих наблюдений было показано, что модификации используемых миниатюрных коаксиальных кабелей обеспечивают многообещающее решение проблем радиочастотного нагрева (14).

Альтернативная стратегия обхода проблем, связанных с радиочастотным нагревом, заключается в отсутствии электропроводящего кабеля. Эта стратегия основана на саморезонансных радиочастотных схемах, которые изначально успешно использовались в качестве высококонтрастных маркеров для целей локализации в МРТ (15). Такие маркеры состоят из миниатюрной высококачественной РЧ-катушки, настроенной на ларморовскую частоту сканера, и окружающей небольшой емкости, заполненной раствором короткого T ₁.Применение возбуждающих импульсов с малым углом поворота в быстрой последовательности изображений позволяет яркое изображение внутренней части катушки благодаря тому факту, что эффективный угол возбуждения внутри катушки увеличивается из-за резонанса катушки. Фон будет давать относительно слабый сигнал при таких низких углах возбуждения, что приводит к положительному контрасту между маркером и фоном. Этот метод недавно был адаптирован для отслеживания кончика инструмента (16-19), где миниатюрные резонансные контуры с соленоидными катушками были установлены на сосудистых катетерах.Оптическое волокно, проходящее через стержень катетера, передает импульсы лазерного света от сканера к фотодиоду на кончике инструмента, чтобы периодически настраивать и расстраивать резонансный контур. Этот метод обеспечивает высококонтрастную видимость и, следовательно, отслеживание кончика инструмента в реальном времени (17-19).

Отсутствие подключения электропроводящих проводов позволяет успешно устранить проблемы с высокочастотным нагревом. Однако этот подход по-прежнему требует механического соединения (лазерного волокна) между инструментом и сканером.Такие соединения (электрические или оптические) сильно затрудняют работу с хирургическими инструментами. В отличие от обычной рентгеновской рентгеноскопии, инструментами нельзя свободно манипулировать и вращать. Кроме того, катетеры и другие инструменты не могут быть легко заменены по уже установленному проволочному проводнику, что является стандартным приемом в традиционной рентгеновской рентгеноскопии.

В настоящем исследовании принцип беспроводной индуктивной связи радиочастотных катушек (20-24) применяется к катетерам, которые предназначены для содержания продольных одноконтурных радиочастотных резонансных контуров.Таким образом, катетеры действуют как внутрисосудистые радиочастотные приемники, сигнал которых может быть передан на внешние поверхностные катушки (25). Эта активная стратегия визуализации инструмента направлена на (1) обеспечение надежной и надежной высококонтрастной визуализации части инструмента, большей, чем просто наконечник; (2) избегайте соединения электропроводящих проводов, чтобы избежать радиочастотного нагрева; и (3) избегайте затруднений при работе с инструментом, исключив любые механические соединения (электрический провод или лазерное волокно). Эта концепция была проверена на многочисленных сосудистых манипуляциях, проведенных на пяти свиньях.В этих вмешательствах беспроводные активные катетеры направлялись в режиме реального времени в несколько различных артериальных сегментов. Селективная МРА с временным разрешением и контрастным усилением (CE) (26-29) была выполнена в каждом выбранном месте для проверки положения катетера.

ТЕОРИЯ

Основным принципом усиления сигнала для беспроводной визуализации активного катетера является индуктивная связь сигнала между РЧ-катушками, настроенными на одну и ту же резонансную частоту.Можно различать два режима: (1) В режиме РЧ-передачи катушки тела импульсы возбуждения с малым углом переворота быстрой последовательности изображений умножаются внутри и в непосредственной близости от РЧ-катушки с резонансным катетером, что приводит к локальному увеличению эффективных углов поворота. Фон будет давать относительно слабый сигнал при этих малых углах возбуждения, что приводит к положительному контрасту между катетерной катушкой и фоном. (2) В режиме приема РЧ резонансная катетерная катушка улавливает МР-сигнал в непосредственной близости от нее, в результате чего создается вектор поля B ₁, который может быть индуктивно связан с вектором поля поверхностной РЧ катушки.Система катушек радиоприемника, состоящая из катетерной катушки и поверхностной катушки, таким образом, действует как локальный усилитель сигнала в глубоких областях (рис. 1). Этот эффект дополнительно увеличивает контраст между катетером и фоном. Индуктивная связь между (1) радиочастотной катушкой тела и радиочастотной катушкой катетера в режиме передачи и (2) катетерной радиочастотной катушкой и радиочастотной катушкой поверхности приема сигнала, соответственно, сильно зависит от ориентации катушек относительно друг друга.

Схема передачи беспроводного сигнала между двумя РЧ катушками и ее применение для беспроводной визуализации активного катетера.( a ) Поверхностная катушка петли, подключенная к РЧ-приемнику сканера. ( b ) Дистальный конец катетера, снабженный катушкой с замкнутым контуром, настроенной на резонанс с конденсатором. В режиме РЧ-передачи катушки для тела (не показана) резонансная катетерная катушка локально увеличивает угол переворота возбуждения. В режиме приема РЧ резонансная катетерная катушка улавливает МР-сигнал в непосредственной близости от нее, в результате чего создается вектор поля B ₁, который может быть индуктивно связан с вектором поля поверхностной катушки контура (а).

МЕТОДЫ

Дизайн катетера

Катетер 6F был разработан, чтобы содержать саморезонансный радиочастотный резонатор на дистальном кончике инструмента, чтобы обеспечить беспроводную визуализацию активного инструмента (рис. 1). Резонатор состоял из продольной одноконтурной катушки (длина 120 мм, ширина 1,7 мм), изготовленной из медного провода с покрытием диаметром 0,1 мм, который был настроен с помощью керамического чип-конденсатора емкостью 39 пФ (ATC American Technical Ceramics, Huntington Station , NY) в нагруженных условиях до резонансной частоты ω ₀ от 1.Система 5-Т (рис. 2а). Катетер был покрыт тонкой термоусадочной трубкой медицинского назначения (Tyco Electronics, Harrisburg, PA), чтобы гарантировать биосовместимость и обеспечить электрическую изоляцию, чтобы избежать значительного ухудшения добротности Q катушки в нагруженном состоянии. Толщина стенки трубки после термоусадки находилась в диапазоне 150 мкм и, как было обнаружено, обеспечивала хорошие рабочие характеристики. Резонансная частота катетера определялась с помощью сетевого анализатора (8712 Hewlett-Packard, Palo Alto, CA).

( a ) Фотография дистального конца катетера 6F со встроенной саморезонансной радиочастотной цепью и ( b ) соответствующие характеристики сигнала на изображении TrueFISP «высокого разрешения». Для МРТ (b) катетер был погружен в фантом из бутылки NaCL объемом 3 литра. Для получения изображения использовалась декартова последовательность TrueFISP с небольшим углом поворота (TR / TE 3,86 / 1,93 мс, FOV 200 × 200 мм, матрица = 256 × 256, срез = 4 мм, поворот = 5 °, время = 0.9 сек). Показан участок изображения размером 150 × 90 мм. (b) Несмотря на небольшой угол переворота возбуждения, дистальный конец катетера отображается с высоким и однородным сигналом и, следовательно, с высоким контрастом по сравнению с фоном. Профиль сигнала МРТ точно соответствует форме катетера до самого кончика инструмента. Стрелки на (a) и (b) показывают положение настраивающего конденсатора. Стрелками показан дистальный конец катетера, где на (b) отверстие катетера, заполненного NaCL, может быть изображено с превосходной детализацией.

Фантомные эксперименты

Сканирование выполнялось на системе 1.5-T Sonata (Siemens Medical Solutions, Эрланген, Германия), оснащенной градиентной системой с амплитудой 40 мТл / м и скоростью нарастания 200 мТл / м / мсек. Радиочастотная катушка тела служила передатчиком. Вокруг отдельных фантомов сигнал катетера принимался четырехканальной системой катушки с фазированной решеткой: два элемента (каждый элемент с круговой поляризацией; 40 × 14 см) поверхностной ВЧ катушки с фазированной решеткой были встроены в стол сканера (Siemens Spine Array ).Вторую двухэлементную (каждый элемент с круговой поляризацией; 40 × 14 см) поверхностную РЧ-катушку с фазированной решеткой (Siemens Body Array Flex) помещали поверх отдельных фантомов. Расстояние между двумя наборами поверхностных катушек составляло приблизительно 20 см, причем катетерная катушка располагалась в центре между поверхностными катушками.

Характеристики сигнала катетера катетера 6F на изображениях с высоким разрешением в стационарном режиме без прецессии (TrueFISP) определялись с дистальным концом катетера, погруженным в фантом из 3-литрового флакона, заполненный 0.9% раствор NaCl. Для получения изображения использовалась последовательность TrueFISP с декартовой траекторией с ориентацией корональной плоскости и малым углом переворота возбуждения. Параметры изображения: TR / TE 3,86 / 1,93 мс, FOV 200 × 200 мм, матрица = 256 × 256, срез = 4 мм, флип = 5 °, время = 0,9 с. Связь сигналов между катетерной катушкой RF и поверхностными катушками RF оценивалась качественно и количественно в зависимости от положения и ориентации катетера в отношении B ₀ и поверхностных катушек.Катетерная РЧ-катушка внутри фантома NaCl была отрегулирована для различных ориентаций относительно B ₀, включая ее поворот на 45 и 90 ° вокруг своей оси, когда продольная ось катетера была параллельна, 45 ° и перпендикулярна B ₀ (рис. 3). Измерения сигнала выполнялись на изображениях корональной зоны для определения отношения сигнал / шум (SNR) катетерной ВЧ-катушки для различных положений катетера. Прямоугольные области интереса (ROI) помещали в центр усиления сигнала катетерной катушки.Шум определялся как стандартное отклонение сигнала в воздухе. Определение шума проводилось в областях интереса, размещенных на краю поля зрения, где не было сигнала от фантома NaCl. Эти области интереса были одинакового размера и располагались в одинаковых позициях на всех изображениях.

Схема исследования фантома для качественной оценки связи сигналов между катетерной катушкой RF и поверхностными катушками RF для различных ориентаций катетера. На рисунках в левом столбце показаны различные положения РЧ катушки фантома и катетера относительно поля сканера B ₀ (положение (1) = продольная ось катетера, параллельная B ₀, положение ( 2) = угол 45 ° между продольной осью катетера и B ₀, положение (3) = угол 90 °).Чертежи в первом ряду показывают в направлении поперечного сечения (AA) ориентацию плоскости катушки по отношению к поверхностным РЧ катушкам (ориентация ( a ) = плоскость катетерной катушки, параллельная плоскости поверхностных катушек и Катетер ( b ), скрученный вдоль продольной оси на 45 ° и ( c ) на 90 °. Цифры на отдельных изображениях показывают значения отношения сигнал / шум катетера RF катетера, измеренные для всех полученных перестановок. Параметры изображения были идентичны параметрам на рис. 2b .Положение (1a) привело к максимальной связи сигнала с поверхностными РЧ катушками и, таким образом, наивысшему SNR, равному 199. Минимальная связь сигнала и, таким образом, самое низкое значение SNR, равное 24, было достигнуто в позиции (3c). Обратите внимание, что все другие варианты привели к общему высокому SNR и, следовательно, отличной визуализации катетера. Окно изображения и уровень оставались постоянными для целей сравнения.

Второй фантом был разработан для проведения экспериментов in vitro для определения соответствующих параметров визуализации TrueFISP в реальном времени для МРТ-навигации как для стационарных катетеров, так и во время движения катетера, а также для оценки характеристик сигнала катетера с помощью визуализации в реальном времени.Фантом из оргстекла состоял из желоба размером 320 × 520 × 130 мм (ширина × длина × высота), содержащего силиконовые трубки (внутренний / внешний диаметр = 7 и 9 мм), которые были соединены с соединителем × для образования разветвления. Фантомный желоб и силиконовые трубки были заполнены физиологическим (0,9%) раствором NaCl. Характеристики сигнала изображения в реальном времени катетера катетера 6F определялись в фантоме NaCl путем систематического увеличения угла переворота возбуждения для каждого нового набора изображений.Параметры декартовой визуализации TrueFISP для этого эксперимента были TR / TE = 4,3 / 2,15 мс, FOV = 300 × 300 мм, матрица = 256 × 128, срез = 5 мм, полоса пропускания = 558 Гц / пиксель, время = 0,5 секунды. Угол поворота изменялся от 1 до 20 ° с шагом 1 °, от 20 до 40 ° с шагом 2 ° и от 40 до 90 ° с шагом 5 °. Измерения проводились на изображениях короны для определения интенсивности сигнала (SI), отношения сигнал / шум и отношения контраст / шум (CNR) в интересующих областях, расположенных над областью усиления сигнала катетерной катушки.Определение SI также проводилось в областях интереса идентичного размера, помещенных в NaCl за пределами кремниевых трубок, представляя фоновый сигнал, принимаемый только поверхностными катушками. Эти области интереса были размещены вдали от катетера, чтобы исключить любые помехи сигнала. Определение шума проводилось, как описано выше.

Методы визуализации в реальном времени

Для позиционирования катетера под контролем МРТ во время экспериментов с фантомом in vitro и свиней in vivo использовались две последовательности TrueFISP в реальном времени с декартовой траекторией или траекторией проекционной реконструкции (PR).Параметры изображения в декартовом формате TrueFISP: TR / TE = 2,96 / 1,48 мс, FOV = 400 × 400 мм, матрица = 192 × 144, срез = 12 мм, полоса пропускания = 1532 Гц / пиксель, переворот = 20 °, время = 0,43 с / кадр. . Эти параметры дали частоту кадров 2,3 изображения / сек. Разделение эхо было использовано для улучшения временного разрешения до 4 кадров в секунду. В этом методе центральные k -строк и поочередно нижняя или верхняя часть k -пространства заново захватываются для каждого кадра. Остальные строки (верхняя или нижняя часть пространства k ) используются совместно с предыдущим кадром (30).Реконструкция проекции Параметры изображения TrueFISP: TR / TE = 3,3 / 1,7 мс, FOV = 400 × 400 мм, матрица = 192 × 192 (разрешение считывания ( N _r) = 192), срез = 12 мм, полоса пропускания = 1040 Гц / пиксель, переворот = 20 °, количество проекций ( N _p) = 48, время = 0,16 сек / кадр. Эти параметры дали частоту кадров 6 изображений в секунду. Уменьшение количества проекций до N _p = 32 при времени визуализации 0,11 с / кадр привело к увеличению частоты кадров до 9 изображений / с.

Как декартовы, так и PR-интерактивные последовательности TrueFISP в реальном времени позволяли интерактивно изменять положение и ориентацию срезов с помощью графического пользовательского интерфейса на консоли оператора системы МРТ, которая в настоящее время находится в стадии разработки (Siemens Medical Solutions ). Все остальные параметры изображения декартовой последовательности были зафиксированы во время сканирования. Для последовательности PR TrueFISP количество проекций на кадр и, следовательно, временное разрешение также можно изменять во время сканирования.Для изменения других параметров визуализации, таких как толщина среза, угол поворота возбуждения и пространственное разрешение, сканирование должно было быть приостановлено в текущей настройке. Полученные в результате изображения в реальном времени, отображаемые в окне изображений в реальном времени на консоли оператора, подавались на видеопроектор в помещении с радиочастотным экраном, который отображал изображения на 56-дюймовую диагональ (120 × 80 см). высококонтрастный мобильный экран обратной проекции (MRIscreen; MR-Innovation GmbH, Эссен, Германия) рядом со сканером.

Эксперименты in vivo

Эксперименты in vivo проводились на полностью анестезированных домашних свиньях ( n = 5) массой от 80 до 125 кг.Эксперименты проводились в соответствии со всеми правилами, установленными институциональными и правительственными агентствами. Животных помещали головой вперед в положении лежа на спине внутри сканера. Размещение РЧ-катушки на поверхности было таким же, как описано выше для экспериментов с фантомом, с той модификацией, что четыре катушечных элемента катушки массива позвоночника были активированы для передачи сигнала о задней анатомии свиньи. Вторую группу корпусов с двумя дополнительными катушечными элементами размещали перед скребком.Это привело к созданию массива поверхностных катушек из восьми элементов, который обеспечил расширенное анатомическое покрытие в продольном направлении. За 2 ч до вмешательства животным вводили гепарин 5000 МЕ. Животных анестезировали согласно протоколу, более подробно описанному Quick et al. (12).

Оболочка интродьюсера 8F была вставлена в правую подвздошную артерию через артериальный разрез. Резонансный катетер вводили через оболочку интродьюсера и проводили через сосудистую сеть с использованием изображения TrueFISP с декартовой и проекционной реконструкцией в реальном времени, как описано выше.Впоследствии были получены селективные ангиограммы 3D CE с временным разрешением, как описано ниже. Были получены селективные ангиограммы брюшной аорты, почечных артерий, печеночной артерии и чревного ствола с верхней брыжеечной артерией (ВМА). После экспериментов животных умерщвляли болюсной инъекцией пентобарбитала 80 мг / кг.

Селективная МР-ангиография

Парамагнитный контраст вводился внутриартериально в виде болюса через активный катетер для получения МР-ангиограмм выбранных сосудистых территорий и подтверждения положения кончика катетера.Инжектор контраста с компьютерным управлением (Spectris, Medrad Inc., Индианола, Пенсильвания) был запрограммирован на введение 20 мл разбавленного парамагнитного контраста (Magnevist, Schering, Берлин, Германия). Четыре миллилитра 0,5 ммоль / л агента были разбавлены 1: 4 16 мл 0,9% NaCl для достижения болюса контрастного вещества 20 мл. В зависимости от сосудистой территории скорость потока для селективной МРА с временным разрешением варьировалась от 2 до 5 мл / сек при времени инъекции от 10 до 4 секунд. Введение контраста было начато одновременно со сбором данных.

Для получения ангиограммы последовательность 3D испорченного градиентного эхо (FLASH) была изменена для оптимизации временного разрешения. Параметры изображения: TR / TE 1,7 / 0,6 мс, переворот 25 °, FOV 360 × 292 см, матрица 256 × 104, пластина 40 мм, 6 полученных срезов были интерполированы на 10 срезов, полоса пропускания 1220 Гц / пиксель. Для реконструкции изображения использовалась стандартная реконструкция продукта Siemens. Восемьдесят процентов частичных изображений Фурье было выполнено в обоих направлениях фазового кодирования.Учитывая, что время сбора данных составляет 0,68 секунды для каждого набора 3D-данных, за 27 секунд было получено 40 наборов 3D-данных. Для улучшения видимости малых сосудов изображения были интерполированы с нулевым заполнением до плоской матрицы 512 × 512. Введение контраста было начато одновременно со сбором данных.

Для получения выборочных 3D CE MR ангиограмм с высоким разрешением последовательность 3D FLASH была изменена, чтобы обеспечить более высокое пространственное разрешение за счет временного разрешения.Параметры изображения: TR / TE 2,1 / 1,0 мс, переворот 25 °, поле зрения 230 × 230 см, матрица 256 × 180, пластина 80 мм, 24 полученных среза были интерполированы на 40 срезов, 80% частичный Фурье в обоих направлениях фазового кодирования, полоса пропускания 1395 Гц / пиксель. Пять наборов данных 3D MRA были получены в течение 30 секунд. Изображения были интерполированы в плоскую матрицу 512 × 512. Введение контраста началось одновременно с получением данных и продолжалось в течение 6 секунд, чтобы гарантировать усиление артериального контраста в первой фазе.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дизайн катетера

Резонансная частота ω ₀ ВЧ резонатора, установленного на катетере, погруженного в 0.9% NaCl составляет ω ₀ = 63,87 МГц. Добротность Q ненагруженного змеевика в воздухе 56 снизилась лишь незначительно до 52 при нагрузке NaCl, что указывает на то, что электрическая изоляция термоусадочной трубки успешно ограничивает влияние нагрузки на ткань и связанную с ней деградацию Q . . Изгиб катетера не привел ни к деградации Q , ни к соответствующему сдвигу резонансной частоты.

Фантомные эксперименты

Изображения TrueFISP с высоким разрешением, полученные с катетером, погруженным в фантом из 3-литровой бутылки, заполненный 0.9% раствор NaCl показал высокий и однородный сигнал вдоль активного дистального конца инструмента до самого кончика инструмента (рис. 2b). Кривизна была видна на длине 120 мм. Малый угол поворота возбуждения, составляющий всего 5 °, уже обеспечил надежный инструментальный сигнал с высоким контрастом между инструментом и фоном. Профиль сигнала МРТ соответствовал форме катетера, вплоть до кончика инструмента. На дистальном конце катетера отверстие катетера, заполненного NaCl, можно было изобразить с превосходной детализацией (рис.2б).

Выравнивание длинной оси катетера параллельно полю сканера B ₀ и размещение плоскости РЧ катушки с одноконтурным катетером в коронарной плоскости (положение 1a на рис. 3) привело к максимальной связи сигнала к поверхностным катушкам RF и, следовательно, к самому высокому SNR, равному 199. Скручивание катетера на 45 и 90 ° вдоль его продольной оси привело к прогрессивному снижению сцепления, но по-прежнему высоким значениям SNR 175 и 139 соответственно (позиции 1b и 1c на рис.3). Выравнивание катетера и фантома под углом 45 ° к направлению поля B ₀ и впоследствии перпендикулярно направлению B ₀ также привело к уменьшению сцепления, но по-прежнему высоким значениям SNR 152 и 122, соответственно (позиции 2а и 3а на рис. 3). Как и ожидалось, минимальная связь сигнала и, следовательно, самое низкое значение SNR 24 было достигнуто, когда длинная ось катетера была ориентирована перпендикулярно к B ₀, а плоскость катетера RF катетера была в осевой плоскости (положение 3c на рис.3). В этой ориентации связь между катетером катетера и полем резонатора передающего тела и РЧ-катушками принимающей поверхности сводится к минимуму.

С активным катетером, введенным в фантом трубки, визуализация TrueFISP в реальном времени с небольшими углами поворота возбуждения около 2–5 ° уже привела к сильному усилению сигнала и, таким образом, к хорошей видимости инструмента (рис. 4). Максимальный инструментальный сигнал (рис. 5а), а также CNR от инструмента к фону (CNR ≈ 150–200) (рис.5б) достигается при углах переворота в диапазоне 10–20 °. Угол поворота 35 ° привел к идентичной интенсивности сигнала от прибора и фона (рис. 5а). Следовательно, CNR здесь был равен 0 (рис. 5b). Даже более высокие углы поворота приводили к прогрессивно отрицательному CNR, т.е. инструмент был изображен темнее, чем окружающий NaCl (рис. 4, 5a и 5b).

Оценка контраста инструмента и фона в фантоме NaCl.Изображения TrueFISP, полученные с индуктивно связанным катетером (см. Рис. 2а), введенным в бифуркацию силиконовых трубок фантома желоба. Визуализация выполнялась с помощью двумерной декартовой последовательности TrueFISP с использованием следующих параметров: TR / TE 4,3 / 2,15 мс, FOV 300 × 300 мм, матрица 256 × 128, срез 5 мм, время 550 мс / изображение. Репрезентативно показаны изображения, полученные с возбуждением угла поворота 1 ° ( a ), 18 ° ( b ), 34 ° ( c ), 50 ° ( d ) и 90 ° ( e ). (Участки изображения размером 300 × 185 мм).Возбуждение с углом переворота 1 ° (а) привело к визуализации дистального конца катетера вокруг индуктивно связанной РЧ катушки. Увеличение угла поворота до низких значений, около 18 ° (b), обеспечило усиление сигнала прибора, в то время как фоновый сигнал оставался низким, что привело к высокому контрасту прибора и фона. Промежуточные углы поворота (около 34 ° (c)) привели к снижению видимости прибора по мере увеличения фонового сигнала. Дальнейшее увеличение до углов поворота около 50 ° (d) привело к дальнейшему увеличению фонового сигнала.Высокие углы поворота (90 ° (e)) максимизировали фоновый сигнал, в то время как инструментальный сигнал был минимизирован. Окно изображения и уровень оставались постоянными для целей сравнения.

Систематическое исследование инструментального и фонового сигнала (в условных единицах) в зависимости от угла переворота возбуждения. ( a ) Сигнал прибора (черная сплошная линия) и фоновый (серая пунктирная линия) сигнал, измеренный в установке фантома NaCl на рис.4. При заданных параметрах визуализации TrueFISP наивысшая интенсивность сигнала прибора была достигнута при угле переворота возбуждения 18 °. Дальнейшее увеличение угла поворота привело к уменьшению инструментального сигнала и увеличению фонового сигнала с идентичными SI на 36 °. Углы поворота выше 36 ° приводили к усилению отрицательного контраста инструмента по отношению к фону, то есть инструмент казался темнее фона. Большой угол поворота 90 ° максимально увеличил контраст негативного инструмента по отношению к фону. ( b ) Контрастность шума (CNR), определенная двумя графиками SI на (a) и нормализованная относительно фонового шума.График подтверждает максимальное значение CNR между прибором и фоном, равное 200 при угле поворота 12 °, значение CNR 0 при угле поворота 35 ° и минимальное значение CNR -80 при углах поворота в диапазоне от 60 до 90 °. Слегка волнистый вид кривой CNR отражает влияние фонового шума.

Методы визуализации в реальном времени

При прямом визуальном сравнении последовательность PR TrueFISP показала меньше артефактов пульсации по сравнению с декартовой последовательностью TrueFISP, что привело к лучшей визуализации катетера и сосудистой сети.Кроме того, при сохранении разрешения изображения PR с 6 кадрами в секунду позволил получить лучшее временное разрешение, чем декартово TrueFISP, который обеспечил частоту кадров всего 4 кадра в секунду с разделением эхо в текущей настройке. Кроме того, поле обзора последовательности PR может быть уменьшено с 400 × 400 мм до 240 × 240 мм без появления наложения изображений, что значительно улучшает пространственное разрешение. Даже с уменьшенным FOV при частоте кадров 9 кадров в секунду CNR от инструмента к фону был высоким, и ни фон, ни SNR инструмента не были ограничивающим фактором.Однако формирование изображений PR TrueFISP со скоростью 9 кадров в секунду с 32 проекциями на изображение привело к снижению качества изображения из-за артефактов в виде полос, вызванных недостаточной дискретизацией данных.

Эксперименты in vivo

В экспериментах in vivo присущий контраст последовательности TrueFISP, который изображает кровь с гиперинтенсивным сигналом, позволил визуализировать сосуды без введения контраста. Контраст инструмента и фона можно регулировать, просто изменяя угол поворота возбуждения последовательности изображений (рис.6).

Изменение угла переворота возбуждения и, как следствие, изменение сигнала прибора на фоновый сигнал in vivo. Декартовы изображения TrueFISP в реальном времени были получены с помощью индуктивно связанного катетера в брюшной аорте свиньи. В качестве радиоприемников использовались активный катетер 5F и катушки с поверхностной фазированной решеткой. Параметры изображения TrueFISP: TR / TE 2,96 / 1,48 мс, FOV 400 × 400 мм, матрица 192 × 144, полоса пропускания 1532 Гц / пиксель.Угол поворота изменялся от 1 до 20 ° с шагом 1 °, от 20 до 40 ° с шагом 2 ° и от 40 до 90 ° с шагом 5 °. Углы поворота 1 ° ( a ), 18 ° ( b ), 34 ° ( c ), 50 ° ( d ) и 90 ° ( e ) показаны репрезентативно (300 × 185). миллиметровые участки изображения). Хотя угол поворота в 1 ° уже генерирует значительный инструментальный сигнал (а), морфология фона в этой установке in vivo не дает большого сигнала. Углы поворота от 10 до 20 ° (b) приводят к отличному контрасту инструмента и фона с хорошей визуализацией инструмента и морфологии сосудов.Увеличение угла поворота приводит к лучшему отображению морфологии сосудов с уменьшением видимости инструмента. Окно изображения и уровень оставались постоянными для целей сравнения.

Данные in vitro полностью подтверждаются экспериментами in vivo. И здесь лучший контраст между прибором и фоном был достигнут при углах поворота в диапазоне 10–20 ° (рис. 6). Последовательности TrueFISP в реальном времени позволяли осуществлять активное наведение катетеров с частотой кадров до 6–9 кадров в секунду (рис.7). Несмотря на неблагоприятные положения катетера, которые потенциально могут обеспечить меньшую связь сигнала с внешними радиочастотными катушками, дистальный конец катетера всегда был виден с высоким контрастом во всех выполненных селективных катетеризациях. Как наблюдалось в экспериментах in vitro, скручивание катетера вдоль его продольной оси во время катетеризации сосудов in vivo не приводило к существенному изменению сигнала катетера.

Проведение катетера in vivo в сагиттальной плоскости через брюшную аорту свиньи в чревный ствол.Реконструкция проекции Параметры изображения TrueFISP: TR / TE = 3,3 / 1,7 мс, FOV = 400 × 400 мм, матрица = 192 × 192 ( N _r = 192), срез = 12 мм, полоса пропускания = 1040 Гц / пиксель, flip = 20 °, N _p = 48, 6 кадров / сек. Показаны пять (непоследовательных) кадров из 120. Обратите внимание, что угол поворота 20 ° обеспечивает яркий инструментальный сигнал, в то время как фоновый сигнал остается низким, что обеспечивает высокий контраст между инструментом и фоном. Положение и кривизну дистального конца катетера, включая кончик, всегда можно точно определить.

Селективная МР-ангиография

Выборочная инъекция разбавленного контрастного вещества через активный катетер в сочетании с оптимизированной по времени последовательностью 3D FLASH привела к селективным МРА с временным разрешением брюшной аорты, а также почечных, селезеночных, брыжеечных и печеночных артерий свиней (рис. 8). ). Серия из 40 наборов трехмерных данных, полученных за 27 секунд, позволила детально разделить различные фазы от ранней артериальной до поздней венозной фазы.

( a ) Проекция максимальной интенсивности (MIP) МР-ангиограммы (MRA), полученной в брюшной аорте свиньи после внутривенной инъекции контрастного вещества, дает полное представление о морфологии сосудов. На изображениях ( b ) и ( c ) показаны MIP выборочной МРА с высоким разрешением и контрастом 3D FLASH чревного ствола с временным разрешением чревного ствола с SMA в корональной (b) и в сагиттальной (c) проекциях.Контрастное вещество вводили через кончик беспроводного активного катетера, который ранее был прослежен в чревном стволе, как показано на рис. 7. Дистальный активный конец катетера был окрашен в красный цвет. Обратите внимание на отличную корреляцию между внутривенной MRA на (a) и внутриартериальной MRA на (b) и (c).

Получение данных с помощью последовательности 3D FLASH, оптимизированной для высокого пространственного разрешения, при выборочной инъекции разбавленного контрастного вещества, привело к МР-ангиографии с высоким разрешением выбранных сосудистых территорий, т.е.е. чревный ствол с ВМА (рис. 8). Положение дистального конца инструмента, определенное на изображениях TrueFISP в реальном времени, показало соответствие начальной точке улучшения селективных МРА, тем самым подтверждая положение катетера.

ОБСУЖДЕНИЕ

Предлагаемая стратегия инструментальной визуализации обеспечивает простую, быструю и надежную визуализацию катетера с рядом неотъемлемых преимуществ. В отличие от характеристики сигнала внутрисосудистой дипольной антенны, которая по своей природе слабая на кончике антенны, активная беспроводная визуализация катетеров с саморезонансными одноконтурными катушками позволяет надежно визуализировать кривизну сосудистого инструмента до самого кончика.Кроме того, из-за индуктивной связи сигналов отсутствие проводного подключения затрудняет работу с прибором.

Как было продемонстрировано для других стратегий визуализации, функции визуализации, присущие TrueFISP, также оказались полезными для управления сосудистыми вмешательствами с помощью этой новой стратегии, в частности, ее высокое временное и пространственное разрешение, а также высокая контрастность, обеспечивающая яркость сосудов во всех ориентациях. , даже без введения контрастного вещества.Хотя была достигнута относительно высокая частота кадров, отношение сигнал / шум для анатомических дисплеев и визуализации инструментов никогда не было ограничивающим фактором. Даже более высокая частота кадров кажется возможной без ограничения отношения сигнал / шум, учитывая уникальные характеристики сигнала TrueFISP. По сравнению с декартовой траекторией, в этих экспериментах визуализация PR TrueFISP (31, 32) обеспечивала функции визуализации, полезные для управления сосудистыми вмешательствами: (a) временное разрешение можно легко увеличить, уменьшив количество проекций на кадр при сохранении номинального пространственное разрешение, (б) угол обзора можно уменьшить (увеличить) без наложения изображений, (в) изображения, полученные с помощью PR TrueFISP, по своей природе менее подвержены артефактам пульсации, чем изображения, полученные с помощью декартовой системы TrueFISP, что приводит к превосходному качеству изображения ( 31, 32).Основным недостатком уменьшения количества проекций является увеличение количества артефактов в виде полос, которые, как правило, менее нежелательны, чем сворачивание изображения (31, 32).

В более ранних («традиционных») стратегиях активной интервенционной визуализации визуализация инструмента была достигнута путем оснащения инструмента какой-либо РЧ-антенной, настроенной на резонансную частоту сканера с внешней электроникой и напрямую подключенной к выделенному РЧ-приемнику. Такая стратегия позволяет визуализировать инструмент отдельно с отдельными окнами сигнала, выравниванием и цветовым кодированием, что приводит к гибкой визуализации отдельных инструментов или только анатомии (12, 33).С другой стороны, для этого требуются дополнительные радиочастотные каналы, равные количеству задействованных инструментов, а также (иногда требующая много времени) постобработка изображений. Представленный здесь метод не требует дополнительных радиочастотных каналов, поскольку радиочастотный сигнал от приборов обнаруживается поверхностными катушками. Поскольку контур инструмента является частью изображения, визуализация инструмента не требует дополнительной постобработки и объединения изображений, что существенно упрощает реконструкцию. Однако фактором, ограничивающим скорость, в настоящее время по-прежнему является реконструкция изображения на МРТ-сканере.

Гибкость визуализации в этой стратегии достигается за счет изменения угла поворота возбуждения, который, как было показано, обеспечивает эффективное средство для изменения контраста между инструментом и фоном в широком диапазоне: низкие углы поворота обеспечивают визуализацию только для инструмента, промежуточные углы поворота Обеспечивают одновременное отображение инструмента и анатомии, а большие углы поворота обеспечивают исключительно анатомический дисплей. Измерения интенсивности сигнала (рис. 5а, б) выявили максимум приборного сигнала при углах поворота возбуждения в диапазоне 10–20 °.При загруженной катетерной катушке с коэффициентом Q , равным 52, можно было бы ожидать, что коэффициент усиления угла поворота будет такой же величины (25), в результате чего максимальный инструментальный сигнал появится уже при значительно меньших углах поворота возбуждения (например, переворот 2 °). Это предполагает, что сигнал инструмента должен быть измерен (а) на изображениях тонких срезов, чтобы избежать эффектов частичного объема с (б) областями интереса, которые расположены в центральной области катетерной катушки (то есть однородное ближнее поле катетерной катушки).Однако эксперименты в этом исследовании были сосредоточены на общем контрасте инструмента и фона в изображениях в реальном времени, а не на оценке абсолютного коэффициента усиления сигнала. Таким образом, сигнал инструмента измерялся в изображениях в реальном времени (рис.4) с срезами, которые были толще диаметра катетера, и с областями интереса, которые превышали пространственные ограничения катетера (т.е. неоднородное дальнее поле катетера). Это привело к усреднению сигнала, имитирующему менее эффективные коэффициенты усиления угла поворота.

Хотя характеристики связи сигналов конструкции с одноконтурной катушкой зависят от ориентации катетера относительно основного магнитного поля B ₀, до поля B ₁ передающей катушки тела, и для поля B ₁ радиочастотных катушек принимающей поверхности (рис. 3), эти проблемы не имели каких-либо практических последствий для проведенных здесь вмешательств in vivo, в которых визуализация всегда была надежной.Основная часть катетера почти всегда была выровнена параллельно B ₀. Даже если катетер вращается вдоль его продольной оси, поле катетера катетера B ₁ соединяется с одним компонентом поля B ₁ поверхностной приемной катушки RF, что приводит к устойчивому сигналу прибора (рис. . 3). Возможны и другие конструкции катетерной катушки, которые по своей природе обеспечивают меньшую зависимость от ориентации по сравнению с конструкцией с одноконтурной катушкой.Моделирование профилей сигналов различных катушек, подходящих для визуализации активного инструмента, показало (34), что, как правило, увеличение количества проводников в такой конструкции катушки приводит к меньшей глубине проникновения сигнала за пределы инструмента и, таким образом, обеспечивает более четкие контуры инструмента. . Спирально намотанная соленоидная катушка с шагом 45 °, например, дополнительно показала наименьшую зависимость от ориентации в этом исследовании и, таким образом, была предпочтительна для активного профилирования МРТ инструмента, где предусматривался острый профиль инструмента (34).Однако в настоящем исследовании важной характеристикой сигнала катетерной катушки является обеспечение чувствительности сигнала к внешней стороне катушки. Это предварительное условие для обеспечения хорошей связи сигнала с РЧ-катушками с внешней поверхностью, которые улавливают локально усиленный РЧ-сигнал катетерной катушки. На этом фоне предлагаемая конструкция одноконтурной катушки представляет собой простую конструкцию, которая обеспечивает хорошее и надежное соединение с внешними катушками, что может быть подтверждено в настоящих экспериментах.Другая геометрия РЧ-катушки, потенциально подходящая для беспроводной визуализации активного катетера, которая, вероятно, будет сочетать еще меньшую зависимость от ориентации с высокой однородностью сигнала и хорошими характеристиками связи с внешними катушками, — это квадратурная конструкция, в которой используются две ортогонально расположенные и индивидуально настроенные одноконтурные катушки, как это было ранее. предложено в другом исследовании (35).

Основной проблемой при интервенционной МРТ является возможность локального увеличения РЧ SAR вблизи интервенционных инструментов.Локальное электрическое поле может быть усилено, особенно если инструменты состоят из длинных проводящих структур. Техника, предложенная в этом исследовании, включает резонансную радиочастотную цепь, которая по беспроводной связи передает свой сигнал на внешние радиочастотные катушки, тем самым устраняя основной источник нагрева прибора. Следовательно, единственным потенциальным источником радиочастотного нагрева становится сама резонансная радиочастотная цепь через связь магнитного поля (если катушка достаточно короткая). К сожалению, катушку нельзя активно разъединить без повторного подключения к сканеру, которое могло бы стать либо источником нагрева (электрическое соединение), либо препятствием для работы с прибором (оптическое соединение).Чтобы предотвратить взаимодействие радиочастотного магнитного поля и, следовательно, потенциальный радиочастотный нагрев, дополнительная интеграция миниатюрных скрещенных диодов в радиочастотную цепь обеспечит пассивную отстройку схемы, как только определенное пороговое значение радиочастотной мощности будет превышено во время сканирования (36). Хотя это и не исследовалось явно, пассивная развязка будет методом выбора для контроля и ограничения ВЧ связи и связанного с ней ВЧ нагрева в представленной конструкции катетера. Однако влияние скрещенных диодов на эффективность связи с передающей катушкой тела еще предстоит исследовать.

Длина одноконтурной РЧ-катушки и, следовательно, видимой части инструментов в текущих экспериментах была ограничена 120 мм. Более длинные катушки потенциально могут обеспечить визуализацию более длинных частей инструмента; однако они подразумевают риск установки резонансной длины, эффективной для связи поля E , основного источника резонансного высокочастотного нагрева (14). Предыдущие исследования показали, что сохранение длинных, проводящих, тонких структур короче 18–20 см на 1.5 T значительно снижает жесткость связи поля E (37). Если желательна визуализация более длинных частей инструмента, вплоть до визуализации всего инструмента, предлагается конструкция с использованием нескольких индивидуально настроенных и разделенных катушек вдоль стержня катетера.

В настоящем исследовании катетер был модифицирован с использованием предлагаемой техники визуализации для выполнения простых сосудистых вмешательств. Более сложные вмешательства требуют одновременного использования катетера и проволочного проводника.Создание направляющего провода с саморезонансным контуром требует дальнейшей миниатюризации используемых резонансных структур. При наличии достаточно миниатюрных компонентов (катушки, конденсаторов и скрещенных диодов), которые уже доступны, считается, что интеграция компонентов в обычный направляющий провод диаметром 0,89 мм возможна. Уменьшенный диаметр инструмента и, следовательно, уменьшенная эффективная площадь катушки одноконтурной катушки, однако, по своей природе будет генерировать меньше сигнала в направлении снаружи инструмента.Будет ли предложенный метод таким образом перенесен на конструкцию проволочного проводника и по-прежнему ли обеспечивать достаточный сигнал для выполнения сложных сосудистых вмешательств in vivo с надежной инструментальной визуализацией, еще предстоит исследовать.

Из-за отсутствия всех проводных соединений между инструментами и системой MR в стратегии визуализации, представленной в этом исследовании, отдельная позиционная обратная связь по инструменту, доступная с отслеживанием наконечника (4, 40, 41), не может быть возвращена в систему. сканер, позволяющий управлять плоскостью изображения с помощью инструмента.Чтобы достичь этого, необходимо рассмотреть методы отслеживания инструментов на основе изображений (42).

Наконец, возникает философский вопрос, следует ли считать предложенную технику активной или пассивной техникой визуализации инструментов. Аргументы в пользу активного метода заключаются в том, что задействованы электронные компоненты (РЧ-катушка, конденсаторы, диоды), а РЧ катетер настроен на частоту Лармора и локально усиливает угол переворота возбуждения, что приводит к высокому сигналу, который создает положительный контраст прибора. .Однако этот метод не обеспечивает позиционную обратную связь со сканером и не может быть «активно» отстроен. По указанным причинам мы решили обозначить этот метод как «активный беспроводной».

ВЫВОДЫ

Индуктивная связь удлиненной резонансной структуры обеспечивает высококонтрастную визуализацию как кончика инструмента, так и кривизны дистального сегмента тела катетера. Включение нескольких резонансных структур может обеспечить визуализацию даже более длинных сегментов катетера.Важно отметить, что этот метод устраняет необходимость в механическом соединении между катетером и МРТ-сканером, тем самым упрощая работу с инструментом. Наконец, на контраст между инструментом и фоном можно повлиять, регулируя угол поворота навигационной последовательности. Эти характеристики делают метод визуализации беспроводного активного катетера привлекательным новым дополнением к палитре доступных стратегий визуализации для вмешательств под МРТ.

Благодарности

Авторы благодарят Dr.Питер Шпейер, доктор философии, Siemens Medical Solutions, Эрланген, Германия, за поддержку интерактивных протоколов визуализации в реальном времени «Текущая работа».

Опыт использования отделения неотложной помощи среди лиц с историей неблагоприятного детского опыта | BMC Health Services Research

Информированная помощь при травмах и насилии как подход к оказанию помощи в контексте ACEs как детерминант здоровья

ACEs являются известным детерминантом здоровья взрослого человека.Хотя ОАП распространены среди населения в целом [6], мы предполагаем, что они являются основным детерминантом здоровья практически для всех групп, стремящихся к справедливости [17,18,19,20,21,22,23], которые задокументировали проблемы, связанные с взаимодействием с системы медицинской и неотложной помощи [12, 13, 24,25,26,27]. Существует также связь между АПФ и хроническими болевыми синдромами или проблемами психического здоровья [6], обе области, которые в нашем исследовании были выделены как возможности для улучшения ухода за пациентами. Хотя текущая практика кажется приемлемой для многих пациентов с высоким уровнем АПФ, остается подгруппа особо уязвимых пациентов, которым требуются дополнительные навыки для оказания доступной и приемлемой помощи.Мы предлагаем, чтобы основной набор расширенных знаний и компетенций со стороны поставщиков медицинских услуг, сформулированных в структуре TVIC, можно было использовать в ED для улучшения качества обслуживания пациентов.

TVIC может быть предоставлено отдельным лицом или на уровне организации, причем последний предпочтительнее, поскольку он включает всех практиков и персонал, а также организацию физического пространства и политики. Предоставление TVIC по сути не требует больше времени или денег, но требует обучения, последовательности, целенаправленности и осведомленности со стороны поставщиков услуг и руководства организации, а также творческого подхода для реструктуризации новых подходов к политике и оказанию помощи.Появляются исследования, изучающие эффективность этого подхода к изменению результатов в отношении здоровья [16], а также его использование в первичной медико-санитарной помощи [16, 28, 29], в психиатрических стационарах [30], отделениях неотложной помощи [31] и немедицинских учреждениях. [32,33,34,35]. Литература предполагает, что использование услуг может быть сокращено [15, 29], повышен комфорт пациентов и их уверенность в медицинском обслуживании [16], повышена уверенность пациентов в предотвращении и решении их собственных проблем со здоровьем [16], а также улучшены результаты для здоровья (например, депрессивные и Симптомы посттравматического стрессового расстройства, хроническая боль и качество жизни) [16], когда потребности людей с высокими показателями АПФ и другими прошлыми и текущими травмами удовлетворяются с помощью подхода, основанного на информации о травмах (рис.1).

Рис. 1

Пять компонентов подхода к информированной помощи при травмах и насилии

Клинические последствия и рекомендации

Наши результаты показывают, что навыки сострадания и общения на уровне практикующего адекватны при взаимодействии со стабильными пациентами с высоким историческим бременем травм, которые не страдают психическим здоровьем или болезненными кризисами и не обладают другими характеристиками, повышающими риск стигмы (бедность, принадлежность к группе меньшинств, употребление психоактивных веществ и т. д.).Учитывая то, что мы знаем о более высоком бремени болезней и более частом обращении за медицинской помощью среди людей с высокими показателями АПФ [6], это положительно. Многие участники рассказали об опыте в соответствии с принципами TVIC: они чувствовали себя услышанными, они чувствовали себя в безопасности, они чувствовали, что их потребности, включая потребность в общении и понимании, были удовлетворены.

Тем не менее, наши результаты также указывают на области для улучшения, чтобы лучше удовлетворить потребности пациентов с высоким уровнем АПФ и большей дисрегуляцией или эмоциональной нестабильностью [7], состояниями психического здоровья, употреблением психоактивных веществ или болевыми расстройствами или другим опытом стигмы.Наши результаты также предполагают, что принципы TVIC могут быть полезны для изменения определенных аспектов оказания помощи, поскольку участники выявляли пробелы в услугах, которые можно было бы исправить с помощью подхода TVIC. Имея это в виду, мы предлагаем следующее:

Во-первых, хотя мы понимаем, что это выходит за рамки компетенции ED, мы считаем, что улучшение своевременного доступа к первичной медико-санитарной помощи снизит частоту использования ED среди пациентов, которые считают доступ своим основная причина представления ЭД.Люди с тяжелым бременем травм часто плохо переносят стресс [7], и ожидание посещения семейного врача в течение 24 или 48 часов может показаться небезопасной или недопустимой задержкой для человека, который испытывает симптомы как потенциально опасные для жизни, что приводит к к увеличению использования несрочной ЭД. Обеспечение того, чтобы пациенты могли связаться со своей бригадой семейных врачей по вечерам и в выходные, по телефону или лично, а также возможность записи на прием в тот же день, может повысить вероятность того, что некоторые пациенты либо вообще не явятся к специалисту в области здравоохранения, либо они будет обращаться в первичную медико-санитарную помощь, а не в отделение неотложной помощи, что повысит непрерывность оказания помощи и снизит более дорогостоящее использование отделения неотложной помощи.

Во-вторых, мы предлагаем, чтобы весь персонал ED, от руководства до врачей и медсестер по сортировке до регистрационного и обслуживающего персонала, получил поддержку в обучении принципам TVIC. Было продемонстрировано, что TVIC влияет на показатели здоровья в первичной медико-санитарной помощи, и в настоящее время проводится работа по изучению этого в контексте ED [16, 36]. Повышение осведомленности всех членов команды о распространенности АПФ и травм, а также о влиянии, которое АПФ могут оказывать на состояние пациента, психическое здоровье, механизмы выживания и межличностные взаимодействия, может улучшить опыт как поставщика, так и пациента, уменьшив количество негативных контактов.Небольшие жесты, такие как предоставление пациентам информации о том, как долго они могут ожидать ожидания определенных аспектов лечения их неотложной помощи, проверка их через регулярные промежутки времени, внимание к влиянию соседних пациентов, предоставление печатной информации или информации о том, кому они, скорее всего, окажут помощь. посмотрите, когда и в каком порядке, все это может помочь снизить уровень тревожности или уязвимости пациентов. Помогая персоналу изменить свое отношение к пациентам, размышляя о том, «что с вами случилось?» вместо «что с вами не так?» может помочь развить сочувствие, особенно к пациентам, чьи проблемы выходят за рамки традиционных, «законных» срочных медицинских жалоб.

В-третьих, мы предлагаем внедрение расширенных планов ухода и координации помощи, объединяющих принципы TVIC для частых пользователей ЭД, особенно из групп, стремящихся к равенству, которые с большей вероятностью столкнутся со стигмой или опасаются стигмы на основании предыдущего опыта. Это будет включать в себя сосредоточение внимания на возросшей потребности некоторых пациентов в понимании и заверении, чтобы повысить их чувство безопасности и автономии и снизить вероятность неуместного или ненужного возвращения к лечению.Он также будет включать предоставление информации о том, как управлять не опасными для жизни состояниями (дома или при обращении к врачу первичной медико-санитарной помощи), включая разумное время ожидания приема на прием и серьезные симптомы, требующие возвращения в отделение неотложной помощи, тем самым давая пациентам возможность управлять своим здоровьем. Вовлечение социальных работников на ранних этапах планирования ухода за особо активными пользователями может также помочь в решении основных проблем психического здоровья или социальных проблем, которые могут стимулировать использование ЭД. Имеются некоторые данные, подтверждающие эффективность ведения случаев в снижении стоимости и частоты использования ЭД среди активных пользователей [37, 38].

Наконец, мы предлагаем изучить связанные с работой нагрузки, с которыми сталкиваются сотрудники отдела регистрации и сортировки в ED. Поддержка персонала в этих сложных ролях может включать сокращение продолжительности смены сортировки или регистрации, увеличение штата в часы пик, добавление дополнительного вспомогательного персонала, которому могут быть делегированы некоторые задачи, или добавление врача для сортировки, который может ускорить оказание помощи, заказав лаборатории или визуализацию заранее, или иногда направляя пациентов в более подходящие службы (Таблица 3).

Таблица 3 Ключевые моменты для служб экстренной помощи

Сильные стороны и ограничения

Наше исследование имеет ограничения, связанные с методологией выборки более крупного количественного исследования ED, что привело к привлечению участников, которые были сравнительно более стабильными с медицинской точки зрения и / или эмоционально. Вместо того, чтобы раздавать опросы всем подходящим кандидатам в соответствии с протоколом исследования, некоторые регистраторы избегали раздавать опросы пациентам, которые, казалось, были особенно физически или эмоционально обеспокоены.Поскольку текущая качественная выборка была получена из этой более крупной количественной выборки, было внесено смещение в сторону медицинской и эмоциональной стабильности во время презентации. Учитывая озабоченность по поводу ухода, которая была подчеркнута даже среди более стабильных пациентов, которые в конечном итоге были включены в исследование, наши результаты, вероятно, недостаточно отражают некоторые из проблем, с которыми сталкиваются наиболее уязвимые (и, следовательно, наиболее эмоционально дисрегулируемые) пациенты, когда они обращаются за помощью в отделение неотложной помощи. Эта гипотеза также согласуется с литературой об опыте оказания медицинской помощи среди особо стигматизированных групп [39, 40].

Новый активатор глюкокиназы модулирует функцию островков поджелудочной железы и гепатоцитов | Эндокринология

Абстракция

Глюкозочувствительный фермент глюкокиназа (GK) играет ключевую роль в метаболизме глюкозы. Мы сообщаем здесь об эффектах нового активатора глюкокиназы, LY2121260. Активатор усиливал активность GK за счет связывания с аллостерическим сайтом, расположенным в шарнирной области фермента. LY2121260 стимулировал секрецию инсулина глюкозозависимым образом в β-клетках поджелудочной железы и увеличивал использование глюкозы в гепатоцитах крысы.Кроме того, инкубация β-клеток с активатором GK приводила к увеличению уровней белка GK, предполагая, что усиление секреции инсулина при хроническом лечении активатором GK может быть связано не только с изменением кинетики фермента, но и с повышенным уровнем фермента. Животные, получавшие LY2121260, показали улучшенную толерантность к глюкозе после перорального введения глюкозы. Эти результаты подтверждают концепцию, что активаторы GK представляют собой новый класс соединений, которые увеличивают как секрецию инсулина, так и использование глюкозы в печени, и при этом могут оказаться эффективными агентами для контроля уровня глюкозы в крови у пациентов с диабетом 2 типа.

ГЛЮКОКИНАЗА (GK), ЧЛЕН семейства гексокиназ, катализирует первую стадию гликолиза — фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата. Это уникальная гексокиназа, поскольку она имеет низкое сродство к глюкозе, демонстрирует кинетику, отличную от Михаэлиса-Ментен (коэффициент Хилла составляет около 1,5), и не проявляет ингибирования продуктом реакции, глюкозо-6-фосфатом (1). Эти особенности делают GK идеальным датчиком физиологических изменений уровня глюкозы в крови, преобразуя их в изменения метаболического статуса клетки.

GK имеет ограниченное распределение в тканях и экспрессируется преимущественно в метаболически активных тканях: головном мозге, кишечнике, печени и поджелудочной железе. Роль GK в поджелудочной железе и печени хорошо изучена. В β-клетках поджелудочной железы GK является ферментом, ограничивающим скорость метаболизма глюкозы, и определяет скорость индуцированной глюкозой секреции инсулина (1, 2). В печени активность ГК определяет скорость использования глюкозы и синтеза гликогена (3). Эти роли делают GK критически важным игроком в регуляции уровня глюкозы в крови.Активация фермента на постпрандиальном уровне глюкозы вызывает повышение секреции инсулина поджелудочной железой, а также стимуляцию поглощения глюкозы и синтеза гликогена в печени, сочетание которых приводит к увеличению утилизации глюкозы и возвращению сахара в крови к базальному уровню. .

Значение GK в контроле уровня глюкозы в крови подчеркивается данными, полученными на животных моделях, в которых активность GK модулировалась, а также у людей, обладающих мутациями GK. GK-дефицитные мыши умирают рано после рождения из-за тяжелого диабета (4, 5).У мышей с нокаутом β-клеток поджелудочной железы или печеночно-специфическим GK также наблюдается гипергликемия, причем тяжесть фенотипа более выражена при нокауте β-клеток (5). С другой стороны, сверхэкспрессия GK приводит к снижению базального уровня глюкозы в крови и устойчивости к развитию диабета, индуцированного высоким содержанием жиров (6, 7). На сегодняшний день у людей зарегистрировано более 150 мутаций, встречающихся в природе в GK (8). Было показано, что мутации в одном аллеле гена GK, которые нарушают функцию фермента, вызывают диабет зрелости 2 типа у молодых (MODY2) (9), тогда как инактивирующие мутации в обоих аллелях GK вызывают стойкий неонатальный диабет (10).Кроме того, мутации GK, повышающие активность фермента, вызывают гиперинсулинемическую гипогликемию (11).

Недавно были обнаружены небольшие молекулы, которые активируют GK посредством связывания с аллостерическим сайтом на ферменте (12–14). Благодаря своей способности усиливать активность GK, такие так называемые активаторы GK обещают стать новым и эффективным средством лечения диабета 2 типа. Здесь мы описываем эффекты нового активатора GK в β-клетках поджелудочной железы и гепатоцитах.

Материалы и методы

Ферментативный анализ глюкокиназы

Ферментативный анализ GK с использованием очищенного рекомбинантного GK островков человека был использован для оценки эффектов потенциальных низкомолекулярных активаторов.В анализе GK катализирует фосфорилирование глюкозы в присутствии АТФ. Продукт этой реакции, глюкозо-6-фосфат, затем окисляется избытком глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы с образованием глюконат-6-фосфата с одновременным восстановлением никотинамидадениндинуклеотида (15). Производство пониженного никотинамидадениндинуклеотида приводит к увеличению флуоресценции, которая используется для мониторинга активности GK. Островковые GK человека экспрессировались в Escherichia coli в виде (His) ₆-меченного слитого белка и очищались с помощью металлохелатной аффинной хроматографии (16).Анализ проводили в 96-луночных планшетах в конечном инкубационном объеме 100 мкл. Инкубационная смесь состояла из (в миллимолях) 50 HEPES, 100 KCl, 5 MgCl ₂, 5 дитиотреитола (DTT), 10 Mg-ATP, 1 никотинамидадениндинуклеотид (pH 7,4), 4 ед. / Мл глюкозо-6-фосфата. дегидрогеназа, 100 нг / мл ГК и глюкоза в различных концентрациях.

Кристаллическая структура ГК

GK человека экспрессируется в виде слитого белка глутатион-S-трансфераза в E.coli и очищают аффинной хроматографией с последующим перевариванием фактора Ха для удаления глутатион-S-трансферазы и заключительной гель-фильтрационной хроматографией. Соединение LY2121260 добавляли к раствору белка GK (12 мг / мл), содержащему 20 мМ HEPES (pH 7,6), 50 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 50 мМ глюкозы и 1-2 мМ DTT перед кристаллизацией. Кристаллы выращивали при 4 ° C методом висящей капли в условиях резервуара 0,1 м цитрата натрия (pH 5,4), 20% полиэтиленгликоля 3350 и 0,2 м NH ₄ I.Кристаллы относятся к пространственной группе P4 (1) 2 (1) 2 с параметрами элементарной ячейки a = 70,43 Å, b = 70,43 Å, c = 188,75 Å. Дифракционные данные (разрешение 2,0 Å, Rmerge = 0,124, полнота 96,5%) были собраны с использованием генератора Rigaku RU300 и детектора R-AXIS IV (Rigaku / MSC, Inc., The Woodlands, TX). Дифракционные данные обрабатывали с помощью HKL2000 (HKL Research, Inc., Шарлоттсвилль, Вирджиния). Кристаллическая структура была определена методом молекулярного замещения (больше из CCP4 Suite) (17) с использованием координат из ранее определенного комплекса GK (Wang, Y., неопубликованные результаты), который был определен путем молекулярного замещения с помощью программы CNX2000 (Accelrys, Inc., Сан-Диего, Калифорния) с использованием структуры гексокиназы I мозга человека 1HKB (18) в качестве модели поиска. Пакет программ QUANTA 2000 (Accelrys) использовался для построения модели, а уточнение проводилось с помощью программы CNX2000.

Получение и культивирование β-клеток поджелудочной железы

островков поджелудочной железы крыс выделяли от самцов крыс Wistar (250–300 г, Charles River Laboratories, Зульцфельд, Германия), как описано ранее (19).Островки инкубировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 10% (об. / Об.) Инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.

Клетки INS-1E культивировали в RPMI 1640 с добавлением 5% (об. / Об.) Термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 МЕ / мл. пенициллин и 100 мкг / мл стрептомицина, как описано (20).

Анализ секреции инсулина

Секрецию инсулина островками поджелудочной железы крысы проводили, как описано ранее (19).Для измерения секреции инсулина в клетках INS-1E клетки помещали в 96-луночный планшет при плотности 20000 клеток / лунку и культивировали в течение 2 дней. Клетки предварительно инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут в сбалансированном солевом растворе Эрла, содержащем 0,1% BSA и не содержавшем глюкозы. После преинкубации клетки культивировали в течение 1 ч в том же буфере, содержащем 5 мМ глюкозы и разные концентрации тестируемой молекулы. Концентрацию инсулина в собранном супернатанте измеряли с помощью ELISA с использованием антител к инсулину крысы (Linco Research, St.Чарльз, Миссури).

Выделение и культивирование гепатоцитов

Гепатоциты выделяли от голодавших в течение ночи крыс-самцов линии Wistar с помощью двухэтапной перфузии печени in situ . Крыс анестезировали пентобарбиталом в дозе 60 мг / кг. Канюлировали воротную вену печени, и на первом этапе перфузии печень промывали средой для перфузии печени со скоростью 30 мл / мин (Invitrogen) в течение 6 минут. На втором этапе печень переваривали путем перфузии средой для перфузии печени с добавлением 5 мМ NaCl, 5 мМ CaCl ₂ и 23.3 мг / л Liberase Blendzyme 3 (Roche Diagnostics, Мангейм, Германия) со скоростью 15 мл / мин в течение примерно 9 мин. Затем печень рассекали и переносили в чашку, содержащую 15 мл среды Williams E (Invitrogen) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 11 мМ глюкозы. Капсула печени была разрушена, и клетки рассеялись. Поврежденные гепатоциты удаляли центрифугированием в градиенте Percoll (Amersham Biosciences, Фрайбург, Германия).Плотность клеток доводили до 4 × 10 ⁵ клеток / мл, и 1 × 10 ⁵ клеток / см ² позволяли прикрепиться к покрытым коллагеном планшетам для культивирования клеток (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Поглощение 2-дезокси-d- [

Клетки промывали и подвергали голоданию в течение 30 мин полной средой Williams E, содержащей 2 мМ глюкозы, а затем инкубировали в той же среде с 5 мМ глюкозы и 5,6 мкКи / мл 2-дезокси-d- [³ H] глюкозы ( Amersham Biosciences) в течение 15 мин с тестируемым соединением или без него.Затем клетки дважды промывали ледяным PBS, содержащим 20 мМ глюкозы, и лизировали 1 м NaOH. Для определения радиоактивности лизатов использовали жидкостную сцинтилляцию.

Экспрессия белка GK

INS-1E культивировали в отсутствие или в присутствии активатора GK в течение 32 ч в культуральной среде, содержащей 3 или 15 мМ глюкозы. После инкубации клетки лизировали в буфере M-Per (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы (Roche Diagnostics).Лизат центрифугировали при 1000 × g в течение 10 мин; супернатант собирали и измеряли концентрацию белка. Двадцать микрограммов белка из каждого образца наносили на SDS-PAGE. Белки разделяли и переносили на поливинилдифторидную мембрану для иммуноблоттинга с антителом против GK (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Калифорния). Мембраны также зондировали антителом против актина (Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури), чтобы продемонстрировать равную загрузку белка для образцов.Система визуализации VersaDoc 3000 (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния) использовалась для захвата и анализа усиленного хемилюминесцентного сигнала.

Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT)

OGTT выполняли на здоровых находившихся в сознании крысах-самцах Wistar (250–300 г, Harlan, Horst, Нидерланды). Перед проведением теста крыс не кормили в течение ночи. Тестируемое соединение вводили перорально (состав: 90% воды, 10 гуммиарабиков, 0,1% пеногасителя 1510) с последующим пероральным введением глюкозы через 2 часа (2 г / кг).Образцы крови собирали с кончика хвоста непосредственно перед и после введения глюкозы (0, 15, 30, 60, 90, 120 мин) и определяли концентрации глюкозы в плазме.

Статистический анализ

Результаты представлены как средние значения ± sem для указанного количества экспериментов. Статистическую значимость оценивали с использованием теста Стьюдента t для парных данных или теста Даннета для множественных сравнений. Аппроксимация кривой была выполнена с помощью SigmaPlot 2000 (версия 6; Systat Software Inc., Ричмонд, Калифорния).

Результаты

В поисках активаторов GK мы идентифицировали новое энантиочистое соединение, тиазол-2-иламид 2- (S) -циклогексил-1- (R) — (4-метансульфонилфенил) циклопропанкарбоновой кислоты (LY2121260; рис. 1A, вставка ), что увеличивает активность ГК. Соединение изменяло как сродство фермента к глюкозе, так и скорость реакции (рис. 1А). LY2121260 (10 мкм) увеличивал максимальную скорость на 40% и уменьшал концентрацию глюкозного лиганда, необходимую для полумаксимальной активности: контроль, 6.8 ± 0,5 мм; LY2121260, 0,4 ± 0,1 мм. Было обнаружено, что субмикромолярные концентрации соединения активируют GK в присутствии как 2 мм глюкозы, так и 10 мм глюкозы (рис. 1B, при уровне глюкозы 2 мм, EC ₅₀ = 0,73 ± 0,04 мкм; глюкоза 10 мм, EC ₅₀ = 0,14 ± 0,01 мкм). Было обнаружено, что такая активация активности фермента уникальна для GK, поскольку LY2121260 в концентрациях до 100 мкМ не влиял на активность гексокиназы I человека в ферментативном анализе, аналогичном анализу активности GK (данные не показаны).Интересно, что противоположный энантиомер LY2121260 показал умеренную активацию GK (при 10 мМ глюкозы EC ₅₀ = 14,6 ± 0,5 мкм, данные не показаны), демонстрируя, что активатор подвергается стереоспецифическому взаимодействию с ферментом.

Рис. 1.

Активация GK с LY2121260. A, активность GK островков человека при различных концентрациях глюкозы в отсутствие (•) и в присутствии (○) 10 мкМ LY2121260. На вставке показана химическая структура LY2121260.B: кривые доза-ответ для активации островковых GK человека с помощью LY2121260 при 2 (○) и 10 (•) мм глюкозы. Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение шести экспериментов.

Рис. 1.

Активация GK с LY2121260. A, активность GK островков человека при различных концентрациях глюкозы в отсутствие (•) и в присутствии (○) 10 мкМ LY2121260. На вставке показана химическая структура LY2121260. B: кривые доза-ответ для активации островковых GK человека LY2121260 при 2 (○) и 10 (•) мм глюкозы. Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение шести экспериментов.

Чтобы лучше понять природу взаимодействия между LY2121260 и GK, сокристаллы LY2121260 и изоформы GK островков человека были выращены в присутствии глюкозы, и была получена кристаллическая структура полученного третичного комплекса. Было обнаружено, что активатор заложен в глубокий карман в шарнирной области фермента, удаленной от активного центра, способом, напоминающим способ, описанный для других низкомолекулярных активаторов GK, что позволяет предположить, что он активирует фермент аналогично этим соединениям. (12, 14) (рис.2А). Водород основной цепи и карбонильный кислород Arg63 закрепляют тиазольный азот и амид NH активатора, соответственно, водородными связями (рис. 2В). Сложный циклогексильный фрагмент встроен в липофильную среду, созданную V62, M210, M235 и Y214, но также имеет доступную для растворителя область в направлении E221. Недавно был охарактеризован ряд естественных или искусственных мутаций, активирующих GK: V62M, T65I, W99R, Y214C, V455M, A456V (11, 21). Интересно, что эти активирующие GK мутации расположены в непосредственной близости от сайта связывания активатора GK.

Рис. 2.

Кристаллическая структура островка человека GK. A, рисунок на ленте структуры GK в комплексе с глюкозой и LY2121260 (модели с шариками и клюшками). B. Структура сайта связывания активатора.

Рис. 2.

В β-клетках поджелудочной железы активация GK приводит к увеличению использования глюкозы и, в конечном итоге, к стимуляции секреции инсулина (1).Инкубация островков поджелудочной железы крысы с различными концентрациями LY2121260 вызвала дозозависимое увеличение секреции инсулина при уровне глюкозы 10 мМ (фиг. 3А). Глюкозозависимость эффектов 1 мкМ LY2121260 на секрецию инсулина была дополнительно изучена (фиг. 3B). Было обнаружено, что активатор стимулирует секрецию инсулина при промежуточных концентрациях глюкозы 4 и 8 мМ. Максимальная стимуляция секреции инсулина (4-кратная) наблюдалась при 8 мМ глюкозы. При более низких (2 мм) и более высоких (14 и 20 мм) концентрациях глюкозы соединение существенно не изменяет количество секретируемого инсулина.Помимо первичных β-клеток, активатор GK стимулировал секрецию инсулина в клетках инсулиномы. В клетках INS-1E при 5 мМ глюкозы LY2121260 вызывал 2-кратное увеличение секреции инсулина (EC ₅₀ = 0,11 ± 0,02 мкм, n = 4, данные не показаны).

Рис. 3.

Эффекты LY2121260 на секрецию инсулина в изолированных островках поджелудочной железы крысы. A, кривые доза-ответ для эффекта LY2121260 на секрецию инсулина при 2 (•) и 10 (○) мм глюкозы. B: Увеличение секреции инсулина при различных концентрациях глюкозы в отсутствие (•) и в присутствии (○) 1 мкм LY2121260.Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение шести экспериментов. *, P <0,05 и **, P <0,01 по сравнению с секрецией инсулина без активатора GK и при соответствующей концентрации глюкозы.

Рис. 3.

Влияние LY2121260 на секрецию инсулина изолированными островками поджелудочной железы крысы. A, кривые доза-ответ для эффекта LY2121260 на секрецию инсулина при 2 (•) и 10 (○) мм глюкозы. B: Увеличение секреции инсулина при различных концентрациях глюкозы в отсутствие (•) и в присутствии (○) 1 мкм LY2121260.Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение шести экспериментов. *, P <0,05 и **, P <0,01 по сравнению с секрецией инсулина без активатора GK и при соответствующей концентрации глюкозы.

В β-клетках поджелудочной железы уровни белка GK регулируются глюкозой на посттранскрипционном уровне (22). Было высказано предположение, что глюкоза стабилизирует GK за счет индукции больших конформационных изменений в ферменте, что приводит к увеличению уровня белка (1). Мы исследовали влияние LY2121260 на уровни белка GK в клетках INS-1E.В отсутствие активатора 32-часовое культивирование клеток INS-1E при 15 мМ глюкозы приводило к почти 3-кратному увеличению уровней белка GK по сравнению с уровнями GK в клетках, культивируемых при 3 мм глюкозы (рис. 4). В присутствии 3 мМ глюкозы 1 мкМ LY2121260 индуцировал 2-кратное увеличение уровней белка GK. При 15 мМ глюкозы включение активатора в среду инкубации приводило к небольшому увеличению уровней белка GK.

Рис. 4.

GK в клетках INS-1E, культивируемых в течение 32 часов при 3 или 15 мМ глюкозы в отсутствие или в присутствии 1 мкМ LY2121260.Экспрессию белка GK анализировали с помощью иммуноблоттинга. Актин использовали в качестве контроля, чтобы продемонстрировать одинаковую загрузку белка в разных образцах. Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение четырех экспериментов. *, P <0,05 и **, P <0,01 по сравнению с уровнями белка при 3 мм глюкозы.

Рис. 4.

GK в клетках INS-1E, культивируемых в течение 32 часов при 3 или 15 мМ глюкозы в отсутствие или в присутствии 1 мкМ LY2121260. Экспрессию белка GK анализировали с помощью иммуноблоттинга.Актин использовали в качестве контроля, чтобы продемонстрировать одинаковую загрузку белка в разных образцах. Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение четырех экспериментов. *, P <0,05 и **, P <0,01 по сравнению с уровнями белка при 3 мм глюкозы.

Помимо своей роли в β-клетках поджелудочной железы, GK играет важную роль в контроле метаболизма глюкозы в печени. Активность ГК печени определяет скорость использования глюкозы и синтеза гликогена (3, 5). Чтобы определить влияние активатора GK на использование глюкозы в печени, мы измерили захват 2-дезокси-d- [³ H] глюкозы в первичных гепатоцитах крысы в присутствии и в отсутствие активатора (рис.5). LY2121260 увеличивал захват 2-дезокси-d- [³ H] глюкозы гепатоцитами крысы на 140% (EC ₅₀ = 1,7 ± 0,4 мкм).

Рис. 5.

Стимуляция захвата 2-дезокси-d- [³ H] глюкозы с помощью LY2121260 в культивируемых гепатоцитах крыс в присутствии 5 мМ глюкозы. Результаты представляют собой среднее ± среднеквадратичное значение пяти наблюдений. *, P <0,05, **, P <0,01 и **, P <0,001 по сравнению с поглощением глюкозы без активатора.

Рис. 5.

Способность активатора GK модулировать уровень глюкозы в крови in vivo изучалась в OGTT на здоровых крысах Wistar.LY2121260 (3–50 мг / кг) вводили голодным в течение ночи крысам за 2 часа до перорального введения глюкозы (фиг. 6A). Обработка активатором приводила к дозозависимому снижению уровня глюкозы в крови натощак перед введением глюкозы. При максимальной изученной дозе активатор снижал концентрацию глюкозы в крови с 97 до 75 мг / дл ( P <0,05). После введения глюкозы уровень глюкозы в крови быстро повысился. Однако у животных, получавших LY2121260, повышение уровня глюкозы в крови снижалось дозозависимо (рис.6А). Обработка 50 мг / кг LY2121260 привела к снижению воздействия глюкозы на 28% по сравнению с контролем, как измерено по площади под кривой для глюкозы (AUC глюкозы) (фиг. 6B).

Рис. 6.

Влияние LY2121260 на уровни глюкозы в крови при OGTT крыс. A, OGTT у самцов крыс Wistar в сознании, которым вводили пероральные дозы носителя (•) или 3 (), 10 (▪), 30 (♦) и 50 () мг / кг LY2121260. Соединение вводили за 120 мин до введения 2 г / кг глюкозы.B. Изменения AUC глюкозы в OGTT при различных дозах LY2121260. AUC глюкозы для носителя составляет 100%. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное значение для шести животных в группе. *, P <0,05, **, P <0,01 и ***, P <0,001 по сравнению с AUC глюкозы для группы носителя.

Рис. 6.

Влияние LY2121260 на уровни глюкозы в крови при OGTT крыс. A, OGTT у самцов крыс Wistar в сознании, которым вводили пероральные дозы носителя (•) или 3 (), 10 (▪), 30 (♦) и 50 () мг / кг LY2121260.Соединение вводили за 120 мин до введения 2 г / кг глюкозы. B. Изменения AUC глюкозы в OGTT при различных дозах LY2121260. AUC глюкозы для носителя составляет 100%. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное значение для шести животных в группе. *, P <0,05, **, P <0,01 и ***, P <0,001 по сравнению с AUC глюкозы для группы носителя.

Обсуждение

Уровни глюкозы в крови жестко регулируются в организме с помощью множества механизмов, и ряд тканей оснащен сенсорными системами, которые позволяют им обнаруживать и реагировать на изменения между уровнями глюкозы натощак и с пищей.Было продемонстрировано, что GK является основным чувствительным к глюкозе ферментом в ряде метаболически чувствительных органов: головном мозге, печени, кишечнике и поджелудочной железе (23). У пациентов с сахарным диабетом 2 типа контроль гомеостаза глюкозы сильно нарушен, что приводит к гипергликемии. И в печени, и в поджелудочной железе, страдающих диабетом, чувствительность к глюкозе снижена. Секреция инсулина диабетическими островками поджелудочной железы в ответ на высокий уровень глюкозы серьезно нарушена, тогда как реакция на другие стимулы может сохраняться (24, 25).В печени способность высокого уровня глюкозы подавлять выработку глюкозы в печени у пациентов с диабетом снижена (26). Благодаря своей важной роли в контроле как индуцированной глюкозой секреции инсулина, так и продукции глюкозы в печени (1, 27), GK является привлекательной мишенью для лечения диабета 2 типа, и предполагается, что агенты, повышающие активность фермента, должны улучшать глюкозу. контроль в болезненном состоянии.

Недавно появились сообщения об открытии и разработке низкомолекулярных активаторов GK (12–14).Активаторы стимулируют активность GK через связывание с аллостерическим участком фермента и, как было показано, снижают уровни глюкозы в плазме у здоровых и больных диабетом животных за счет стимуляции секреции инсулина и метаболизма глюкозы в печени. Мы демонстрируем здесь, что новый активатор GK LY2121260 способствует секреции инсулина в островках поджелудочной железы и стимулирует использование глюкозы в гепатоцитах, тем самым снижая уровень глюкозы в крови in vivo после перорального введения глюкозы у здоровых крыс Wistar.

Новый активатор GK LY2121260 увеличивает как сродство фермента к глюкозе, так и максимальную скорость реакции, катализируемой ферментом. Активатор GK вызывал значительное снижение концентрации лиганда, необходимой для полумаксимальной активности глюкозы, что приводит к сдвигу заданного значения для использования глюкозы и секреции инсулина. В присутствии активатора использование глюкозы в печени, а также секреция инсулина в поджелудочной железе могут запускаться при более низких, чем обычно, концентрациях глюкозы, что потенциально может привести к гипогликемии.Фактически, лечение здоровых крыс линии Wistar LY2121260 привело к снижению уровня глюкозы в крови натощак, предположительно за счет увеличения использования глюкозы и повышенной секреции инсулина. С другой стороны, активатор в 5 раз более эффективен в ферментативном анализе при 10 мм глюкозы, чем при 2 мм глюкозы. Эта зависимость активности активатора от уровней глюкозы предполагает, что должна быть возможность найти оптимальные дозы активатора, при которых активация происходит предпочтительно при повышенных уровнях глюкозы. Однако следует проявлять большую осторожность при разработке активаторов GK, лишенных эффекта гипогликемии.

В β-клетках поджелудочной железы GK является ферментом, ограничивающим скорость гликолиза и, следовательно, индуцированной глюкозой секреции инсулина (1). Для стимуляции секреции инсулина активатором GK требовалось определенное количество глюкозы, присутствующей в среде инкубации. При субфизиологической концентрации глюкозы (2 мкМ) активатор существенно не влиял на секрецию инсулина при концентрациях до 3 мкМ. Однако при 4 мм глюкозы LY2121260 вызывал значительное увеличение секреции инсулина. Активатор был более эффективен в стимуляции секреции инсулина при промежуточных концентрациях глюкозы (8-10 мм), сдвигая кривую доза-ответ для глюкозы влево, не влияя на максимальное увеличение индуцированной глюкозой секреции инсулина.Тот факт, что активатор не увеличивает секрецию инсулина, стимулированную 20 мМ глюкозы, согласуется с наблюдением, что при высоких концентрациях глюкозы другие метаболические ферменты ниже GK становятся ограничивающими скорость и секреция инсулина больше не соответствует активности GK (2, 28).

GK точно регулируется, чтобы адаптироваться к изменениям потока глюкозы при различных метаболических состояниях. В то время как экспрессия печеночных GK регулируется главным образом инсулином и глюкагоном на уровне транскрипции генов (29), экспрессия GK поджелудочной железы в основном регулируется на посттранскрипционном уровне глюкозой (22, 30).Когда глюкоза связывается с GK, она вызывает большие конформационные изменения фермента. Кроме того, было продемонстрировано, что связанная с глюкозой форма GK более устойчива, чем апо-фермент, к окислению и деградации (1, 16). Мы наблюдали увеличение уровня белка GK в β-клетках, культивируемых при повышенных концентрациях глюкозы. Интересно, что в β-клетках, культивируемых при низком уровне глюкозы в присутствии LY2121260, уровни белка GK также были увеличены, что означает, что связывание активатора поддерживает фермент в более стабильной форме, возможно, за счет сохранения его в конформации, связанной с глюкозой (14 ).Таким образом, увеличение активности GK в результате хронического введения активатора GK в β-клетки, вероятно, является результатом не только измененной кинетики фермента, но также и увеличения количества фермента.

Таким образом, мы открыли новый низкомолекулярный активатор GK, 2- (S) -циклогексил-1- (R) — (4-метансульфонилфенил) циклопропанкарбоновой кислоты тиазол-2-иламид (LY2121260), который активирует GK таким же образом, как и другие низкомолекулярные активаторы, о которых недавно сообщалось (12–14). Мы продемонстрировали, что LY2121260 усиливает активность GK глюкозозависимым образом in vitro ; усиливает секрецию инсулина как изолированными островками поджелудочной железы, так и клетками INS-1E; и увеличивает использование глюкозы в гепатоцитах крыс.Кроме того, мы установили, что инкубация β-клеток с активатором GK приводит к повышенным уровням белка GK, предполагая, что усиление секреции инсулина β-клетками во время хронического лечения активатором GK происходит не только из-за повышенной ферментативной активности, но также и к повышенному уровню белка. Эти результаты, вместе взятые, подтверждают концепцию, что активаторы GK представляют собой новый класс соединений, которые увеличивают как секрецию инсулина, так и использование глюкозы в печени, и при этом могут оказаться эффективными агентами для контроля уровня глюкозы в крови у пациентов с диабетом 2 типа.

Благодарности

Мы благодарим Джину Тиллманн, Дагмар Фолк, Дирка Веземанна, Хенрика Бенджеса и Кристину Шмидт за отличную техническую помощь.

Сокращения

AUC глюкозы,
Площадь под кривой ответа глюкозы;
DTT,
GK,
OGTT,
пероральный тест на толерантность к глюкозе.

Список литературы

Matschinsky

1996

Banting Lecture 1995: урок метаболической регуляции, вдохновленный парадигмой глюкокиназного сенсора глюкозы.

Диабет

223

241

Лианг

Najafi

Smith

Zimmer

Tal

Matschinsky

1992

Согласованная глюкозная индукция глюкокиназы, использование глюкозы и стимулированное глюкозой высвобождение инсулина в островках поджелудочной железы, поддерживаемое в органной культуре.

Диабет

792

806

Ферре

Riu

Bosch

9000

FASEB J

1213

1218

Grupe

Hultgren

Ryan

000 B

0003,

000 M

Stewart

1995

Трансгенные нокауты выявляют критическую потребность в глюкокиназе β-клеток поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы.

Ячейка

Postic

Shiota

Niswender

Jetton

Moates

Shelton

Lindner

Cherrington

Magnuson

в качестве глюкозы для гомогенизации определялись двойные роли глюкозы 1999 г. нокаутом гена, специфичного к β-клеткам печени и поджелудочной железы, с использованием Cre-рекомбиназы.

J Biol Chem

274

305

315

Niswender

Postic

Jetton

Efrat

Magnuson

1997

Клеточно-специфическая экспрессия и регуляция трансгена локуса гена глюкокиназы.

J Biol Chem

272

22564

22569

Shiota

Postic

Fujimoto

ton

Pan

Grimsby

Grippo

Magnuson

Cherrington

Диабет

622

629

Мачинский

2002

Регулирование β-клеточной глюкокиназы поджелудочной железы: от основ до терапии

Диабет

S394

S404

Froguel

Zouali

Vionnet

Sun

Lesage

Stoffel

Takeda

Passa

ck 9000S

000

Bell

Cohen

1993

Семейная гипергликемия, вызванная мутациями глюкокиназы.Определение подтипа сахарного диабета.

N Engl J Med

328

697

702

Njolstad

Sagen

Bjorkhaug

Bakry

Sarici

Alpay

Molnes

Molven 9000 Sov3

2003

Постоянный неонатальный диабет, вызванный дефицитом глюкокиназы: врожденная ошибка пути передачи сигналов глюкоза-инсулин.

Диабет

2854

2860

Глойн

Нордам

Виллемсен

Ellard

Кэмпбелл

Midgley

Shiota

Buettger

Magnuson

000

Matsch2

2003

Анализ биохимических и генетических основ активации глюкокиназы в результате естественных мутаций гипогликемии.

Диабет

2433

2440

Гримсби

Сарабу

Corbett

FT Haynes

Coffey

Guertin

Hilliard

Kester

Mahaney

000 L0003

Spence

Tengi

Magnuson

Chu

Dvorozniak

2003

Аллостерические активаторы глюкокиназы: потенциальная роль в терапии диабета.

Science

301

370

373

Brocklehurst

Payne

Davies

Wightman

Aiston

Waddell

Leighton

Coghlan

000

0002 Agilent метаболизм глюкозы в гепатоцитах с помощью новых низкомолекулярных активаторов глюкокиназы.

Диабет

535

541

Камата

Мицуя

Нишимура

000 Yiki

000 E2000

2004

Структурные основы аллостерической регуляции мономерного аллостерического фермента глюкокиназы человека.

Структура

429

438

Davidson

Arion

1987

Факторы, лежащие в основе существенного недооценки физиологической активности глюкокинезии в печени: более высокая клеточная активность.

Arch Biochem Biophys

253

156

167

Tidge

Krug

Lenzen

, активность глюкозы

человека реагентами SH отражает посттрансляционную регуляцию активности ферментов.

Biochim Biophys Acta

1337

175

190

1994

Проект совместных вычислений, номер 4

Набор CCP4: программы для кристаллографии белков

Acta Crystallogr

D50

760

763

Алешин

Zeng

Bourenkov

Honzatko

1998

Механизм регуляции гексокиназы: новое понимание кристаллической структуры рекомбинантной гексокиназы мозга человека в комплексе с глюкозой и глюкозо-6-фосфатом.

Структура

Ефанов

Швейное дело

Боквист

000

Gromiverada2 Активация X-рецептора стимулирует секрецию инсулина за счет модуляции метаболизма глюкозы и липидов в β-клетках поджелудочной железы

Диабет

S75

S78

Merglen

Theander

Rubi

Maechler

2004

Чувствительность к глюкозе и связь метаболизма-секреции изучались в ходе двухлетнего непрерывного культивирования клеток инсулиномы INS-1E.

Эндокринология

145

667

678

Глойн

Odili

Zelent

den Buet

Steele

Stride

Shiota

Magnuson

Lorini

000

Kwagh

van Schaftingen

Veiga-da-Cunha

Barbetti

Dunten 9000 Han3

Grimsby

Taub

Ellard

Hattersley

Коврики chinsky

2005

Анализ структуры и регуляции глюкокиназы в результате новой мутации (V62M), которая вызывает диабет у молодых людей в зрелом возрасте.

J Biol Chem

280

14105

14113

Bedoya

Matschinsky

Shimizu

TI Appel

1986

Дифференциальная регуляция активности глюкокиназы в островках поджелудочной железы и печени крысы.

J Biol Chem

261

10760

10764

Schuit

Huypens

Heimberg

000

Чувствительность к глюкозе в β-клетках поджелудочной железы: модель для изучения других регулируемых глюкозой клеток в кишечнике, поджелудочной железе и гипоталамусе.

Диабет

Ward

Beard

Halter

Adv Exp Med Biol

189

137

158

Абдель-Халим

Guenifi

Хан

Berggren

Ostenson

Efendic

1996

Нарушение связи сигнала глюкозы с экзоцитотическим механизмом у диабетических крыс GKAMP: дефект устраняется за счет устранения дефекта.

Диабет

934

940

Mevorach

Giacca

Aharon

Hawkins

Россетти

1998

Регулирование выработки эндогенной глюкозы глюкозой как таковой нарушается при сахарном диабете 2 типа.

J Clin Invest

102

744

753

Hawkins

Gabriely

Wozniak

Vilmo

Rossetti

2002

Фруктоза улучшает способность гипергликемии как таковую регулировать выработку глюкозы при диабете 2 типа.

Диабет

606

614

Ван

Iynedjian

1997

Модуляция глюкозо-гиперчувствительности инсулинорезистентных клеток к глюкозе.

Proc Natl Acad Sci USA

4372

4377

Iynedjian

Jotterand

Nouspikel

000

000 Aspikel

1989

Индукция транскрипции гена глюкокиназы инсулином в культивируемых клетках печени и ее репрессия системой глюкагон-цАМФ.

J Biol Chem

264

21824

21829

Chen

Bumbalo

Leahy

Каталитическая активность JL 9000 изолированные островки от гиперинсулинемических крыс.

Диабет

684

689

научных статей, журналов, авторов, подписчиков, издателей

Как крупный международный издатель академических и исследовательских журналов Science Alert издает и разрабатывает названия в партнерстве с самыми престижные научные общества и издатели.Наша цель заключается в том, чтобы максимально широко использовать качественные исследования зрительская аудитория.

Мы прилагаем все усилия, чтобы поддержать исследователей которые публикуют в наших журналах. Есть масса информации здесь, чтобы помочь вам публиковаться вместе с нами, а также ценные услуги для авторов, которые уже публиковались у нас.

2021 цены уже доступны. Ты может получить личную / институциональную подписку перечисленных журналы прямо из Science Alert. В качестве альтернативы вы возможно, пожелает связаться с выбранным вами агентством по подписке. Направляйте заказы, платежи и запросы в службу поддержки. в службу поддержки клиентов журнала в Science Alert.

Science Alert гордится своей тесные и прозрачные отношения с обществом. В качестве некоммерческий издатель, мы стремимся к самым широким возможное распространение публикуемых нами материалов и на предоставление услуг высочайшего качества нашим издательские партнеры.

Здесь вы найдете ответы на наиболее часто задаваемые вопросы (FAQ), которые мы получили по электронной почте или через контактную форму в Интернете.В зависимости от характера вопросов мы разделили часто задаваемые вопросы на разные категории.

Азиатский индекс научного цитирования (ASCI) стремится предоставить авторитетный, надежный и значимая информация по освещению наиболее важных и влиятельные журналы для удовлетворения потребностей мировых научное сообщество.База данных ASCI также предоставляет ссылку к полнотекстовым статьям до более чем 25000 записей с ссылка на цитированные ссылки.

Дифференциальный диагноз отравления пауком Редбэк диагностирует

Автор

Натан Райзман, доктор медицины Доцент кафедры неотложной медицины, Медицинский центр SUNY Downstate

Раскрытие информации: раскрытие не подлежит.

Соавтор (ы)

Сейдж Винер, доктор медицины Доцент кафедры неотложной медицины, Медицинский центр Нижнего штата Нью-Йорка; Директор медицинской токсикологии, отделение неотложной медицины, Госпитальный центр округа Кингс

Сейдж Винер, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии клинической токсикологии, Американской академии неотложной медицины, Американского колледжа медицинской токсикологии, Общества Academic Emergency Medicine

Раскрытие информации: нечего раскрывать.

Специальная редакционная коллегия

John T. VanDeVoort, PharmD Региональный директор по фармацевтике, больницам Sacred Heart и St Joseph

John T. VanDeVoort, PharmD является членом следующих медицинских обществ: Американское общество фармацевтов систем здравоохранения

Раскрытие информации: раскрывать нечего.

Мэтью М. Райс, доктор медицины, доктор медицинских наук, FACEP Старший вице-президент, главный врач отделения скорой помощи Северо-Западного отделения TeamHealth; Ассистент клинического профессора медицины Школы медицины Вашингтонского университета Ожидает утверждения

Мэтью М. Райс, доктор медицины, доктор медицинских наук, FACEP является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа врачей скорой помощи, Американской медицинской ассоциации, Национальной ассоциации врачей скорой помощи, Общество академической неотложной медицины, Медицинская ассоциация штата Вашингтон

Раскрытие информации: нечего раскрывать.

Главный редактор

Джо Алкок, доктор медицины, магистр медицины Доцент кафедры неотложной медицины, Центр медицинских наук Университета Нью-Мексико

Джо Алкок, доктор медицины, магистр медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия экстренной медицины

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Дополнительные участники

Роберт Л. Норрис, доктор медицины Почетный профессор отделения неотложной медицины, Медицинский центр Стэнфордского университета

Роберт Л. Норрис, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж врачей неотложной помощи, Медицинское общество дикой природы

Раскрытие информации: ничего расскрыть.

Благодарности

Авторы и редакторы Medscape Reference выражают признательность предыдущим авторам, Александру Рафаилову, доктору медицины, и Марку А. Сильвербергу, доктору медицины, за их вклад в разработку и написание этой статьи.

Механизм эпителиально-мезенхимального перехода и устойчивости к аноикису при раке молочной железы, запускаемый цинковыми каналами ZIP6 и STAT3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3) | Биохимический журнал

Гены, участвующие в нормальных процессах развития, привлекают внимание как медиаторы опухолевой прогрессии, поскольку они способствуют миграции опухолевых клеток.EMT (эпителиально-мезенхимальный переход), существенная часть эмбрионального развития, ремоделирования тканей и заживления ран, имеет решающее значение для метастазирования опухоли. Ранее транспортер цинка ZIP6 [SLC39A6; семейство носителей растворенного вещества 39 (транспортер цинка), член 6; также известный как LIV-1) был связан с EMT в гаструляции рыбок данио через механизм STAT3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3), что привело к ядерной локализации фактора транскрипции Snail. В настоящем исследовании мы показываем, что переносчик цинка ZIP6 транскрипционно индуцируется с помощью STAT3 и является беспрецедентным среди переносчиков цинка, и активируется N-концевым расщеплением, которое запускает локализацию плазматической мембраны ZIP6 и приток цинка.Этот приток цинка инактивирует GSK-3β (киназа гликогенсинтазы 3β), косвенно или напрямую через Akt или GSK-3β соответственно, что приводит к активации Snail, который остается в ядре и действует как репрессор транскрипции E-кадгерина (эпителиальный кадгерин). ), CDh2, вызывая округление и отслоение клеток. Это отразилось на трансфицированных ZIP6 клетках, которые подверглись EMT, отсоединились от монослоев и проявили устойчивость к аноикис за счет их способности продолжать пролиферировать даже после отсоединения.Наши результаты указывают на причинную роль ZIP6 в подвижности и миграции клеток, обеспечивая ZIP6 в качестве новой мишени для прогнозирования клинического распространения рака, а также предполагая ZIP6-зависимый механизм метастазирования опухолей.

Гены, участвующие в нормальных процессах развития, привлекают внимание как медиаторы опухолевой прогрессии, поскольку они способствуют миграции и инвазии эпителиальных опухолевых клеток. EMT (эпителиально-мезенхимальный переход), существенная часть эмбрионального развития, ремоделирования тканей и заживления ран, имеет решающее значение для метастазирования опухоли [1].Во время EMT происходит потеря клеточной адгезии, ремоделируется цитоскелет и экспрессируются мезенхимальные индикативные гены, позволяющие клеткам мигрировать и отделяться.

Цинк необходим для жизни с дефицитом цинка, вызывающим задержку роста и серьезные нарушения обмена веществ [2]. Помимо традиционных долгосрочных транскрипционных эффектов цинка, предыдущие данные показывают, что цинк может вести себя как вторичный мессенджер [3], что проявляется в высвобождении цинка из внутриклеточных запасов в течение нескольких минут после внеклеточного стимула [4], расширяя его роль в передаче сигналов в клетке. что сравнимо с кальцием.Цинковый канал ZIP6 [SLC39A6; семейство носителей растворенного вещества 39 (транспортер цинка), член 6; также называемый LIV-1] является членом семейства ZIP (Zrt- и Irt-подобных белков; теперь называемых SLC39A) переносчиков цинка, которые проникают в клетку [5] и играют важную роль во внутриклеточном гомеостазе цинка. Семейство транспортеров цинка SLC39A теперь считается каналами, поскольку прокариотический гомолог этого семейства, ZIPB, перемещает цинк ненасыщаемым образом, что указывает на то, что транспортеры ZIP могут функционировать как ионные каналы Zn ²⁺, транспортируя цинк вниз по градиенту концентрации. [6].Более того, недавно было показано, что точный механизм открытия ворот канала ZIP7 регулируется фосфорилированием с помощью протеинкиназы CK2 [4]. Это семейство одного подсемейства транспортеров цинка SLC39A, названного подсемейством LIV-1 и определяемого высококонсервативным новым потенциальным мотивом металлопротеиназы [7], включает девять человеческих членов, многие из которых все чаще участвуют в различных болезненных состояниях [ 8]. ZIP6, первый член семейства LIV-1, который будет описан, связан с ER (рецептор эстрогена) -позитивным раком молочной железы [9], распространением лимфатических узлов [10] и является маркером ER-положительного (Luminal A) рака [11 , 12].База данных клинических образцов Oncomine значительно помещает ZIP6 в первые 10% генов, сверхэкспрессируемых при ER- и лимфатических узлах-положительных раках молочной железы, взаимосвязь, подтвержденная в 14 отдельных клинических исследованиях. Важно отметить, что с помощью антител против ZIP6 мы подтвердили это на клеточных линиях и клиническом материале [8].

ZIP6, как известно, участвует в EMT и миграции клеток во время раннего эмбрионального развития [13] в механизме, включающем факторы транскрипции STAT3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3) и Snail.Во время гаструляции у рыбок данио STAT3 трансактивирует экспрессию Zip6, что способствует ядерной локализации Snail и приводит к репрессии экспрессии cdh2 [E-cadherin (эпителиальный кадгерин)] и увеличению миграции клеток [13]. И STAT3, и Snail доказали свою роль в метастазировании рака [14]. Кроме того, в небольшой серии клинических проявлений рака груди [8] ZIP6 был связан с прогностическими индикаторами развития рака и продемонстрировал значительную корреляцию между экспрессией STAT3 и ZIP6 ( P <0.007), предполагая механистическую связь между гаструляцией рыбок данио и распространением рака груди. Дальнейшие доказательства участия ZIP6 в Snail были предоставлены наблюдением, что siRNA для ZIP6 снижает инвазию клеток HeLa посредством пути Snail [15]. Взятые вместе, эти находки подтверждают, что ZIP6 может формировать связь между раком и нормальным развитием [16], где метастатические клетки рака молочной железы реактивируют ZIP6-зависимую программу EMT, важную для ранних эмбрионов.

STAT3 также был связан с EMT [17], постоянно активируется при многих злокачественных новообразованиях человека, имеет четко определенную связь с прогрессированием рака груди [18] и необходим для выживания культивируемых опухолевых клеток [14,19,20].Фосфорилирование тирозином STAT3 по Tyr ⁷⁰⁵ запускает его димеризацию и транслокацию в ядро, где он активирует гены, участвующие в пролиферации клеток, апоптозе, ангиогенезе, клеточной инвазии, метастазировании и иммунной функции [21].

Фактор транскрипции Улитка играет важную роль в EMT, предотвращая экспрессию генов эпителиальных признаков, таких как E-кадгерин, и стимулируя транскрипцию мезенхимальных генов признаков, таких как виментин [22], вызывая потерю адгезии и позволяя перемещаться к новому сайту, отражая метастаз. при раке.GSK-3β (киназа гликогенсинтазы 3β) дезактивирует Snail путем фосфорилирования, способствуя ядерному экспорту и праймируя его для убиквитинирования β-TrCP (β-трансдуцирующий белок, содержащий повторы; также известный как BTRC) и последующей деградации [23]. Переносчик цинка ZIP6 важен для ядерной локализации Snail [13], предполагая, что он играет важную роль в EMT, что может проявляться опосредованным ZIP6 притоком цинка и последующим опосредованным цинком ингибированием GSK-3β [24,25].

В настоящем исследовании мы показываем, что, беспрецедентно среди других переносчиков цинка, ZIP6 экспрессируется как про-протеин и расщепляется на N-конце перед перемещением на плазматическую мембрану.Кроме того, клетки, экспрессирующие ZIP6, расположенный на плазматической мембране, подвергаются EMT и отделяются от монослоев как высокопролиферирующие клетки. Как и у эмбрионов рыбок данио, этот процесс управляется STAT3 и включает активацию Snail, что ведет к потере клеточной адгезии за счет подавления E-кадгерина, опосредованного Snail. Мы предоставляем доказательства механизма, при котором индуцированный ZIP6 приток цинка инактивирует GSK-3β, позволяя нефосфорилированной Snail в ядре подавлять гены адгезии, такие как E-кадгерин, вызывая потерю клеточной адгезии.Этот механизм объясняет потерю клеточной адгезии в ZIP6-положительных клетках и обеспечивает значительный прогресс в нашем понимании как нормальных клеточных процессов, таких как эмбриональное развитие, так и болезненных состояний, таких как рак.

Были получены собственные антитела против ZIP6: антикроличьи поликлональные антитела против пептида HHDHDHHSDHEHHSD (остатки 93–107 на N-конце), названные ZIP6-M, и моноклональные антитела против мыши против пептида VSEPRKGFMYSRNTNEN (остатки 238–254 на остатках 238–254 на N-конце). N-конец), названный ZIP6-Y (см. рисунок 3D).Кроличьи антитела против ZIP6-SC (E-20) против остатков 500–550 на цитоплазматической петле между TM (трансмембранным) 3 и TM4, кроличьи анти- (STAT3 Ser ⁷²⁷) (SC-8001-R), кроличьи антитела — (STAT3 Tyr ⁷⁰⁵) (SC-7993-R), кроличий анти- (активированный GSK-3α / β Tyr ²⁷⁹ / Tyr ²¹⁶) (SC-11758-R) и кроличий анти-E-кадгерин (H-108) антитела были от Santa Cruz Biotechnology, а кроличьи антитела против Snail были от Abgent. Кроличьи антитела против STATIP1 (STAT3-взаимодействующий белок 1) (ab154643) были от Abcam, мышиные антитела против V5 были от Invitrogen, а кроличьи антитела против V5 были от Bethyl Laboratories.Использовали 200 мкМ проницаемого для клеток пептида STAT3 (573096) от Calbiochem, 1 нМ эстрогена (E2; эстрадиол) от Sigma-Aldrich и 1 мкМ гефитиниба (Iressa, ZD1839), подаренного AstraZeneca Pharmaceuticals, 10 нг / мл EGF. (эпидермальный фактор роста), TGF (трансформирующий фактор роста), 100 нМ ТАМ (4-гидрокситамоксифен) и 100 нМ FAS (фулвестрант).

Рисунок 1

ZIP6 требуется STAT3

Флуоресцентная микроскопия ( A ) или FACS-анализ ( B ) клеток MCF-7, обработанных EGF и / или ингибитором STAT3 (STI) в течение 24 часов и исследованных с помощью ZIP6 -Y антитело.Наблюдаемое увеличение ZIP6 при обработке EGF предотвращается ингибитором STAT3. Результаты FACS показывают среднее значение флуоресценции ± стандартное отклонение. за три эксперимента. Статистическая значимость EGF по сравнению с контролем P <0,001 обозначена звездочками (***). ( C ) Трансфекцию миРНК клеток MCF-7 липидным контролем (CON), миРНК ламина (LAM), миРНК STAT3 или миРНК ZIP6 в течение 72 часов тестировали на экспрессию STAT3 и ZIP6. Результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. для шести экспериментов, выраженных в процентах от контроля.siRNA для ZIP6 увеличивает экспрессию STAT3. ( D ) трансфицированные siRNA клетки MCF-7 на покровных стеклах в течение 72 часов фиксировали и окрашивали на STAT3 pSer ⁷²⁷ (pSTAT3 ^S727), конъюгированный с Alexa Fluor® 594. pSTAT3 ^S727 был восстановлен при обработке siRNA для STAT3 и увеличивается при обработке siRNA для ZIP6.

Рисунок 1

ZIP6 требуется STAT3

Флуоресцентная микроскопия ( A ) или FACS-анализ ( B ) клеток MCF-7, обработанных EGF и / или ингибитором STAT3 (STI) в течение 24 часов и зондированных с помощью ZIP6-Y антитело.Наблюдаемое увеличение ZIP6 при обработке EGF предотвращается ингибитором STAT3. Результаты FACS показывают среднее значение флуоресценции ± стандартное отклонение. за три эксперимента. Статистическая значимость EGF по сравнению с контролем P <0,001 обозначена звездочками (***). ( C ) Трансфекцию миРНК клеток MCF-7 липидным контролем (CON), миРНК ламина (LAM), миРНК STAT3 или миРНК ZIP6 в течение 72 часов тестировали на экспрессию STAT3 и ZIP6. Результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. для шести экспериментов, выраженных в процентах от контроля.siRNA для ZIP6 увеличивает экспрессию STAT3. ( D ) трансфицированные siRNA клетки MCF-7 на покровных стеклах в течение 72 часов фиксировали и окрашивали на STAT3 pSer ⁷²⁷ (pSTAT3 ^S727), конъюгированный с Alexa Fluor® 594. pSTAT3 ^S727 был восстановлен при обработке siRNA для STAT3 и увеличивается при обработке siRNA для ZIP6.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между экспрессией генов ZIP6 и STAT3 мы использовали siRNA для ZIP6 или STAT3, чтобы подавить экспрессию соответствующих генов, и протестировали влияние на экспрессию другого гена.Эти результаты представляют собой среднее значение шести экспериментов, выраженное как процент контроля ± стандартное отклонение. Мы наблюдали значительное снижение экспрессии гена ZIP6 в присутствии миРНК ZIP6, демонстрируя эффективность лечения, но отсутствие изменений в экспрессии ZIP6 в присутствии миРНК для STAT3, предполагая, что конститутивная экспрессия ZIP6 не требует STAT3 (рис. 1С). . Однако мы действительно наблюдали значительное увеличение мРНК STAT3 в присутствии миРНК ZIP6, предполагая, что ZIP6 может играть роль в подавлении экспрессии мРНК STAT3, что также было очевидно на уровне белка (рис. 1D).Клетки, обработанные миРНК для ZIP6 в течение 72 часов, демонстрируют повышенную интенсивность окрашивания фосфорилированного STAT3.

Создание антител против ZIP6 показало, что ZIP6, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме, является про-белком. Наше моноклональное антитело против N-концевого эпитопа ZIP6 (M, остатки 93–107, рис. 3A, подчеркнуто красным) окрашивает только ZIP6 эндоплазматического ретикулума, а не ZIP6 плазматической мембраны, что подтверждается антителом против V5 (рис. 3B) в пермеабилизированных клетках. , подтверждая, что этот участок ZIP6 не присутствует на плазматической мембране, возможно, из-за протеолитического расщепления.Второе антитело подтвердило этот вывод (Y, остатки 238–254, фиг. 3A, подчеркнуто зеленым цветом) с эпитопом ниже по течению, окрашивая плазматическую мембрану ZIP6 (фиг. 3C) в непроницаемых клетках. Ранее мы наблюдали потенциальный сайт PEST (остатки 210–223, рис. 3A, синий курсив) и потенциальный сигнал деградации убиквитина (остатки SSSTPPSV 213–220) между этими двумя эпитопами антител [29], что позволяет предположить расположение N-концевого расщепления. . Сайты как PEST, так и убиквитина могут гарантировать период полужизни белка менее 1 часа [32] и, что интересно, эти сайты хорошо законсервированы в последовательностях ZIP6 млекопитающих (рисунок 3D), что указывает на эволюционно консервативную функцию.

Фигура 3

ZIP6 представляет собой про-протеин и расщепляется на N-конце перед перемещением на плазматическую мембрану

( A ) 320 N-концевых остатков последовательности ZIP6, показывающих положение эпитопов антител. Остатки 93–107 представляют собой антитело ZIP6-M (подчеркнуто красным), антитело к остаткам 140–155 (красный цвет) окрашивает эндоплазматический ретикулум ZIP6 [41], антитело ZIP6-Y против остатков 238–254 и эквивалент мышиного эквивалента окрашивает плазматическую мембрану ZIP6 у мыши. мозг [49].Остатки 210–222 (синий курсив) обозначают строго предсказанный сайт протеолитического расщепления PEST [29]. Клетки, трансфицированные ZIP6, зондировали антителом против V5, конъюгированным с Alexa Fluor® 594, и антителами ZIP6-M ( B ) или ZIP6-Y ( C ), конъюгированными с Alexa Fluor® 488. Антитело ZIP6-M не распознает ZIP6, расположенный на плазматической мембране, в проницаемых клетках ( B ), тогда как ZIP6-Y находится в непроницаемых клетках ( C ). ( D ) Сохранение потенциального сайта PEST в последовательностях ZIP6 млекопитающих.( E ) Различные антитела к ZIP6 генерируют полосы с разными молекулярными массами. Полноразмерный ZIP6 составляет 103 кДа, отщепленный N-концевой фрагмент составляет 35 кДа, а ZIP6 после расщепления составляет 68 кДа. Эти образцы обрабатывали на одном и том же блоте, который разрезали для зондирования различными антителами. ( F ) Клетки MCF-7, обработанные 0, 10 или 20 единицами PNGaseF в течение 3 часов при 37 ° C и зондированные антителом ZIP6 SC, показывают уменьшение размера полосы 68 кДа, соответствующей двум гликозилированным боковым цепям. Молекулярные массы указаны в кДа.КОН, контроль.

Фигура 3

ZIP6 представляет собой про-протеин и расщепляется на N-конце перед перемещением на плазматическую мембрану

( A ) 320 N-концевых остатков последовательности ZIP6, показывающих положение эпитопов антител. Остатки 93–107 представляют собой антитело ZIP6-M (подчеркнуто красным), антитело к остаткам 140–155 (красный цвет) окрашивает эндоплазматический ретикулум ZIP6 [41], антитело ZIP6-Y против остатков 238–254 и эквивалент мышиного эквивалента окрашивает плазматическую мембрану ZIP6 у мыши. мозг [49]. Остатки 210–222 (синий курсив) обозначают строго предсказанный сайт протеолитического расщепления PEST [29].Клетки, трансфицированные ZIP6, зондировали антителом против V5, конъюгированным с Alexa Fluor® 594, и антителами ZIP6-M ( B ) или ZIP6-Y ( C ), конъюгированными с Alexa Fluor® 488. Антитело ZIP6-M не распознает ZIP6, расположенный на плазматической мембране, в проницаемых клетках ( B ), тогда как ZIP6-Y находится в непроницаемых клетках ( C ). ( D ) Сохранение потенциального сайта PEST в последовательностях ZIP6 млекопитающих. ( E ) Различные антитела к ZIP6 генерируют полосы с разными молекулярными массами.Полноразмерный ZIP6 составляет 103 кДа, отщепленный N-концевой фрагмент составляет 35 кДа, а ZIP6 после расщепления составляет 68 кДа. Эти образцы обрабатывали на одном и том же блоте, который разрезали для зондирования различными антителами. ( F ) Клетки MCF-7, обработанные 0, 10 или 20 единицами PNGaseF в течение 3 часов при 37 ° C и зондированные антителом ZIP6 SC, показывают уменьшение размера полосы 68 кДа, соответствующей двум гликозилированным боковым цепям. Молекулярные массы указаны в кДа. КОН, контроль.

N-концевое протеолитическое расщепление ZIP6 могло бы объяснить различные полосы ZIP6, полученные с помощью вестерн-блоттинга с использованием трех антител против ZIP6 (рис. 3E).Мы получили полосы 103 кДа и 35 кДа с антителом ZIP6-M (около N-конца), 103 кДа и 68 кДа с антителом ZIP6-Y (дальний N-конец) и антителом SC (цитоплазматическая петля между TM3 и TM4), как а также полосы с более высокой молекулярной массой с SC. Предполагается, что полноразмерный негликозилированный ZIP6 составляет 85 кДа и дает полосу 103 кДа, что соответствует гликозилированию [29]. При расщеплении эта полоса будет уменьшена до 68 кДа, оставив N-концевой фрагмент размером 35 кДа. Кроме того, эта полоса 68 кДа снижается на 15 кДа в два этапа обработкой PNGaseF (фиг. 3F), что позволяет предположить наличие двух боковых цепей гликозилирования в этой части молекулы.

Рисунок 5

Обогащение ZIP6 неприлипающими клетками

( A ) Клетки CHO или MCF-7, трансфицированные липидным контролем, ZIP6, ZIP7 или β-галактозидазой (LacZ), визуализировали через 16 часов после трансфекции и клетки, трансфицированные ZIP6 имел либо отдельные скопления живых клеток (CHO), либо отдельные круглые клетки (MCF-7). В неприлипающих клетках MCF-7, выращенных в течение ночи на новых покровных стеклах в течение 24 часов (повторно прикрепленных), было больше клеток из чашек, трансфицированных ZIP6.( B ) Прилипшие (серые) и неприлипающие (черные) клетки MCF-7, обработанные в течение 7 дней эстрогеном (E2), EGF, TGF, TAM или FAS (Faslodex®), были собраны и исследованы на ZIP6, конъюгированный с Alexa. Fluor® 488 и проанализировано FACS. Результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. для трех экспериментов и продемонстрировать обогащение ZIP6 в неприлипающих клетках. Статистическая значимость для соответствующего контроля (CON) указана над столбиками гистограммы как * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0.001. Сравнение приверженности и несоблюдения для каждого лечения также указано выше.

Рисунок 5

Обогащение ZIP6 неприлипающими клетками

( A ) Клетки CHO или MCF-7, трансфицированные липидным контролем, ZIP6, ZIP7 или β-галактозидазой (LacZ), визуализировали через 16 часов после трансфекции и трансфицировали клетки с ZIP6 имели либо отдельные скопления живых клеток (CHO), либо отдельные круглые клетки (MCF-7). В неприлипающих клетках MCF-7, выращенных в течение ночи на новых покровных стеклах в течение 24 часов (повторно прикрепленных), было больше клеток из чашек, трансфицированных ZIP6.( B ) Прилипшие (серые) и неприлипающие (черные) клетки MCF-7, обработанные в течение 7 дней эстрогеном (E2), EGF, TGF, TAM или FAS (Faslodex®), были собраны и исследованы на ZIP6, конъюгированный с Alexa. Fluor® 488 и проанализировано FACS. Результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. для трех экспериментов и продемонстрировать обогащение ZIP6 в неприлипающих клетках. Статистическая значимость для соответствующего контроля (CON) указана над столбиками гистограммы как * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0.001. Сравнение приверженности и несоблюдения для каждого лечения также указано выше.

MCF-7, обработанные в течение 24 ч агентами для стимуляции или ингибирования экспрессии ZIP6, собирали отдельно как прилипшие или неприлипающие популяции и исследовали на содержание ZIP6 с помощью анализа FACS. Результаты демонстрируют (рис. 5B) увеличение ZIP6 в прикрепленных клетках (серый цвет), обработанных эстрогеном (E2) и TGF, по сравнению с контролем, и в неприлипающих клетках (черный), обработанных E2, EGF и TGF, сопровождающееся уменьшением, когда обработанные антиэстрогенами FAS (Faslodex®) или ТАМ, что согласуется с ZIP6, который является регулируемым геном E2.В совокупности эти результаты подтверждают, что ZIP6 способствует отслоению клеток и обогащен неприлипающимися клетками, что согласуется с ролью ZIP6 в контроле EMT.

Zip6, как было показано ранее, важен для EMT и клеточно-автономных движений клеток организаторов гаструлы у рыбок данио [13]. В настоящем исследовании мы демонстрируем, что роль ZIP6 в контроле EMT сохраняется у рыб и человека, и раскрываем детали задействованного сигнального пути Zn ²⁺.Человеческий ZIP6 транскрипционно индуцируется пролиферативными факторами, такими как STAT3 и E2, и, по-видимому, активируется посредством протеолитического N-концевого расщепления, прежде чем попасть на плазматическую мембрану, где он опосредует приток Zn ²⁺ (Рисунок 7). Этот приток цинка запускает фосфорилирование GSK-3β либо напрямую [25], либо косвенно через Akt, который имеет GSK-3β в качестве мишени и фосфорилируется в ответ на цинк [33]. Инактивация GSK-3β посредством фосфорилирования делает его неспособным фосфорилировать Snail, который остается в ядре, где он действует как репрессор транскрипции гена E-кадгерина, CDh2 .Хотя это биологический процесс, имеющий решающее значение во время развития [13], он захватывается раковыми клетками, позволяя им метастазировать и проникать в ткани. Внеклеточный цинк может увеличивать пролиферацию и выживаемость клеток [34] за счет захвата рецептором, чувствительным к цинку, GPR39 (G-белок-связанный рецептор 39) [35], что приводит к активации Akt. Взаимодействует ли это каким-либо образом с ZIP6 на плазматической мембране, пока не установлено.

Рисунок 7

Схематическая иллюстрация предлагаемого сигнального пути ZIP6

Предлагаемый сигнальный путь, связывающий цинковый канал ZIP6 с потерей сцепления посредством опосредованной Snail репрессии E-кадгерина (CDh2).N-конец ZIP6, расположенный на эндоплазматическом ретикулуме (ER), протеолитически расщепляется, запуская транслокацию в плазматическую мембрану (PM), облегчая приток цинка. Цинк, попадая в клетку, либо активирует Akt, который ингибирует GSK-3β, либо непосредственно ингибирует GSK-3β. Неактивный GSK-3β может влиять на ряд сигнальных путей и не может фосфорилировать и дезактивировать Snail за счет β-TrCP-опосредованной деградации пути убиквитин-специфической пептидазы (USP) в цитозоле (CY), повышая уровень ядер (NC ) Улитка и подавление экспрессии E-кадгерина (CDh2).EGFR, рецептор EGF; MAPK, митоген-активированная протеинкиназа.

Рисунок 7

Схематическое изображение предлагаемого сигнального пути ZIP6

Предлагаемый сигнальный путь, связывающий цинковый канал ZIP6 с потерей адгезии через Snail-опосредованную репрессию E-кадгерина (CDh2). N-конец ZIP6, расположенный на эндоплазматическом ретикулуме (ER), протеолитически расщепляется, запуская транслокацию в плазматическую мембрану (PM), облегчая приток цинка. Цинк, попадая в клетку, либо активирует Akt, который ингибирует GSK-3β, либо непосредственно ингибирует GSK-3β.Неактивный GSK-3β может влиять на ряд сигнальных путей и не может фосфорилировать и дезактивировать Snail за счет β-TrCP-опосредованной деградации пути убиквитин-специфической пептидазы (USP) в цитозоле (CY), повышая уровень ядер (NC ) Улитка и подавление экспрессии E-кадгерина (CDh2). EGFR, рецептор EGF; MAPK, митоген-активированная протеинкиназа.

Способность ZIP6 стимулировать миграцию клеток рака молочной железы была связана с увеличением популяции неприлипающих клеток, которые были обогащены ZIP6, все еще оставались жизнеспособными и активно размножались.Кроме того, когда экспрессия эндогенного ZIP6 стимулировалась E2, EGF или TGFα, наблюдаемое увеличение ZIP6 происходило преимущественно в отделившихся клетках. Интересно, что трансфекция клеток с помощью ZIP7 или ZIP14 не вызывала отслоения клеток, и это может объяснить, почему мы ранее сообщали о более низкой эффективности трансфекции (в прикрепленных клетках) для ZIP6, чем для ZIP7 и ZIP14 [28,30]. Уменьшение времени между трансфекцией и сбором до 16 часов увеличило количество ZIP6-положительных клеток, полученных путем сбора перед отслоением.В этом контексте примечательно, что действия ZIP6 на миграцию опухолевых клеток можно имитировать, подвергая клетки, экспрессирующие эндогенный ZIP6, экзогенному цинку [27]. Эти данные также объясняют очевидный противоречивый результат, показывающий параллельные уровни ZIP6 и E-cadherin [36]. Однако в ходе этого исследования клетки трансфицировались в течение 48 часов — времени, когда наши данные предполагают, что ZIP6-положительные клетки оторвались. Кроме того, используемое антитело находилось в том же месте, что и антитело ZIP6-M, и наши данные предполагают, что оно не распознает ZIP6, расположенный на плазматической мембране.

В настоящем исследовании мы расширили наши и другие наблюдения, чтобы подтвердить взаимосвязь между белками ZIP6 и STAT3, предполагая, что STAT3 / ZIP6-опосредованный механизм округления и отслоения клеток объясняет наблюдаемое присутствие ZIP6 в опухолях, которые распространяются на лимфатические узлы. [10]. Эта ассоциация транспортеров цинка с STAT3 не является беспрецедентной, поскольку ZIP14 регулируется IL-6 (интерлейкин 6) и передачей сигналов STAT3 [37], а ZIP4 активирует транскрипцию STAT3 при раке поджелудочной железы [38].Кроме того, мы наблюдали положительную корреляцию в серии исследований рака груди [8] между STAT3 и ZIP6 ( P = 0,007), соглашаясь с известной ассоциацией STAT3 с прогрессированием рака груди [14]. Один неожиданный результат с использованием siRNA для удаления STAT3 или ZIP6 был получен, когда удаление ZIP6 увеличивало экспрессию STAT3, предполагая, что ZIP6 модулирует экспрессию STAT3.

Мы сделали новое наблюдение, что ZIP6 модифицируется N-концевым расщеплением перед перемещением на плазматическую мембрану, что мы проверили экспериментально с использованием наших уникальных антител ZIP6 против N-концевых эпитопов, разделенных потенциальным сайтом протеолитического расщепления PEST [39].Последовательность PEST обычно ассоциируется с белками с коротким периодом полураспада [32]. ZIP10, ближайший аналог ZIP6 и единственный другой член семейства LIV-1 с сайтом PEST, также был связан с инвазивным раком груди [40], но обрабатывается ли ZIP10 аналогичным образом, неизвестно.

Это N-концевое расщепление ZIP6 также объясняет некоторые явно противоречивые опубликованные данные. Уровни экспрессии ZIP6 были связаны с хорошим исходом для пациентов с раком молочной железы, однако эпитоп антитела ZIP6 (остатки 140–155), по прогнозам, распознает ZIP6, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме [41].Белок «эрмелин» мыши эквивалентен мышиному ZIP6, но в нем отсутствуют N-концевые 245 остатков, эквивалентный стартовый сайт в человеческой последовательности отмечен на фиг. 3 (A), который расположен заметно ниже эпитопа антитела ZIP6-Y. . Остальная часть N-концевой последовательности видна на расстоянии одной рамки считывания, что указывает на альтернативную изоформу или возможную ошибку секвенирования. Однако эрмелин был клонирован и экспрессирован, и было обнаружено, что он располагается в эндоплазматическом ретикулуме, а не на плазматической мембране [42], что позволяет предположить, что N-концевое расщепление важно для перемещения ZIP6 на плазматическую мембрану, поскольку оно может отображать важный сигнал для транспортировки. к плазматической мембране.Более того, сайт PEST, обнаруженный на N-конце ZIP6, хорошо консервативен у разных видов (рис. 3D), что указывает на потенциальное участие в перемещении белка. Однако существует 16 предсказанных сайтов расщепления между остатками 156 и 237, которые, как предполагается, в основном расщепляются субтилизин-подобной про-протеин конвертазой [43], N-аргинин двухосновной конвертазой [44] или общими двухосновными мотивами, используемыми в качестве сигналов протеолиза [ 45]. Точный сайт расщепления еще предстоит открыть. На сегодняшний день продемонстрировано, что некоторые переносчики цинка протеолитически модифицированы.Это ZIP4 [46] и ZIP10 [47], и эта модификация произошла внеклеточно.

Мы демонстрируем снижение стимулированного EGF белка ZIP6 с помощью ингибитора STAT3 (рис. 1А). Ген ZIP6 человека, присутствующий на отрицательной цепи хромосомы 18, отделен всего 0,8 т.п.н. нетранскрибированной ДНК от гена, кодирующего ELP2 (псевдоним STATIP1) на положительной цепи. Поскольку ELP2 может регулировать STAT3 как каркасный белок, контролирующий лиганд-зависимую активацию STAT3 [48] и предпочтительно связывать нефосфорилированный STAT3 [48], он может обеспечивать механизм для смягчения ZIP6.Фактически, короткая 5′-последовательность между кодирующими областями ZIP6 и ELP2 имеет семь предполагаемых сайтов связывания STAT3, и один из них, расположенный в 5’UTR ZIP6 , присутствует у человека, мыши и данио, предполагая, что STAT3 управляет экспрессией ZIP6, и, вероятно, также ELP2. Интересно, что мы наблюдали увеличение STAT3 pTyr ⁷⁰⁵ и отсутствие STAT3 pSer ⁷²⁷ в ZIP6-положительных клетках, последнее может указывать на связывание ELP2 с нефосфорилированным STAT3 [48].Однако за экзоном 1 размером 205 п.н. в части 5’UTR следует длинный интрон (2 т.п.н.), и трансляция начинается с 10 п.н. в экзон 2. Поскольку ELP2 инактивирует STAT3, связываясь с ним [48], мы предполагаем, что STAT3 может связываются с областью 682 п.н. и управляют экспрессией обоих генов.

Таким образом, мы расширили предыдущие знания о роли гена ZIP6 в гаструляции рыбок данио, регуляции эстрогеном и STAT3 и ассоциации с раком груди, который распространяется на лимфатические узлы.В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что белок ZIP6 является причиной способности человеческих клеток собираться, отделяться и мигрировать, демонстрируя устойчивость к аноики, первому шагу в процессе метастазирования, благодаря их способности оставаться живыми и продолжать свое существование. прогрессирование клеточного цикла. Это отщепление клеток зависит от движения ZIP6 к плазматической мембране как прямого результата N-концевого расщепления и последующего притока цинка, который приводит в движение приток цинка / ингибирование GSK-3β / активацию улитки / путь потери E-кадгерина, что приводит к округлению клеток. и непривязанность.Эти результаты вместе предполагают, что переносчик цинка ZIP6 может не только играть важную причинную роль в миграции клеток, но также быть жизнеспособным индикатором опухолей, способных распространяться.

Стивен Хискокс и Маргарет Экленд собрали, обработали и интерпретировали данные; Питер Килле интерпретировал данные, представил схематические диаграммы и написал статью; Кристер Хогстранд интерпретировал данные, провел анализ генома и написал статью; и Кэтрин Тейлор задумала и разработала исследование, собрала, собрала и интерпретировала данные и написала статью.

Авторы выражают признательность Группе молекулярной фармакологии рака молочной железы за помощь в этом исследовании и отличную техническую помощь Кэтрин Смарт, Петры Вичовой, Марен Мейер, Майры Маас и Вероники Хельцлвиммер. Мы также благодарим Криса Смита за иммуноцитохимию и Анастасию Адрахатас за сбор данных в этом исследовании.

Наблюдательные свидетельства увлажнения самой нижней стратосферы посредством изэнтропического перемешивания через субтропическую струю

Añel, J.A., Antuña, J.C., De La Torre, L., Castanheira, J.M., и Гимено, Л .: Климатологические особенности глобальных явлений множественной тропопаузы, J. Geophys. Res.-Atmos., 113, D7, https://doi.org/10.1029/2007JD009697, 2008.

Banerjee, A., Chiodo, G., Previdi, M., Ponater, M., Conley, AJ, а также Полвани, Л. М .: Водяной пар в стратосфере: важная обратная связь с климатом. Клим. Dynam., 53, 1697–1710, https://doi.org/10.1007/s00382-019-04721-4, 2019.

Чен, П .: Изэнтропический кросс-тропопаузаный массообмен в экстратропиках, J.Geophys. Res., 100, 16661–16673, https://doi.org/10.1029/95jd01264, 1995.

де Форстер, П. М. Ф. и Шайн, К. П.: Стратосферный водяной пар изменяется по мере того, как возможный вклад в наблюдаемое охлаждение стратосферы, Geophys. Res. Lett., 26, 3309–3312, https://doi.org/10.1029/1999GL010487, 1999.

де Форстер, П. М. Ф. и Шайн, К. П.: Оценка воздействия на климат тренды стратосферного водяного пара, Geophys. Res. Lett., 29, 10-1–10-4, https://doi.org/10.1029/2001gl013909, 2002 г.

Десслер, А. Э., Хинца, Э. Дж., Вайншток, Э. М., Андерсон, Дж. Г. и Чан, К.Р .: Механизмы управления водяным паром. в нижней стратосфере: «Повесть о двух стратосферах», J. Geophys. Res.-Atmos., 100, 23167–23172, https://doi.org/10.1029/95JD02455, 1995.

Dessler, A. E., Schoeberl, M. R., Wang, T., Davis, S. M., and Rosenlof, K. H .: Стратосферная обратная связь водяного пара, P. Natl. Акад. Sci. США, 110, 18087–19091, https://doi.org/10.1073/pnas.1310344110, 2013.

Геттельман, А., Хегглин, М. И., Сон, С. В., Ким, Дж., Фудзивара, М., Бирнер, Т., Кремсер, С., Рекс, М., Аньель, Дж. А., Акиёши, Х., Остин, Дж., Бекки, С., Брезике, П., Брюл, К., Бутчарт, Н., Чипперфилд, М., Дамерис, М., Домсе, С., Гарни, Х., Хардиман, С. К., Йокель, П., Киннисон, Д. Э., Ламарк, Дж. Ф., Манчини, Э., Маршан, М., Мишу, М., Моргенштерн, О., Поусон, С., Питари, Дж., Пламмер, Д., Пайл, Дж. А., Розанов, Э., Сцинокка, Дж., Шеперд, Т. Г., Шибата, К., Смейл, Д., Тейссдре, Х., и Тиан, В.: Мультимодельная оценка верхней тропосферы и нижней стратосферы: Тропики и мировые тренды, Дж.Geophys. Рес.-Атмос., 115, д.3, https://doi.org/10.1029/2009JD013638, 2010.

Хинца, Э. Дж., Беринг, К. А., Вайншток, Э. М., Андерсон, Дж. Г., Гэри, Б. L., Pfister, L., Daube, B.C., Wofsy, S.C., Loewenstein, M., Podolske, J. Р., Маргитан, Дж. Дж., И Буй, Т. П .: перенос тропосферы в стратосферу в самая нижняя стратосфера по измерениям H ₂ O, CO ₂, N ₂ O и O ₃, Geophys. Res. Lett., 25, 2655–2658, https://doi.org/10.1029 / 98GL01797, 1998.

Холтон, Дж. Р., Хейнс, П. Х., Макинтайр, М. Э., Дуглас, А. Р., Руд, Р. Б., и Пфистер, Л.: Обмен стратосферой и тропосферой, Rev. Geophys., 108, D12, https://doi.org/10.1029/95RG02097, 1995.

Хомейер, К. Р., Боуман, К. П., Пан, Л. Л., Атлас, Э. Л., Гао, Р. С. и Кампос, Т. Л .: Динамические и химические характеристики тропосферы. вторжения, наблюдавшиеся во время START08, J. Geophys. Рес.-Атмос., 116, д.6, https://doi.org/10.1029/2010JD015098, 2011 г.

Хосрави, Ф., Лоссов, С., Стиллер, Г. П., Розенлоф, К. Х., Урбан, Дж., Берроуз, Дж. П., Дамадео, Р. П., Эрикссон, П., Гарсиа-Комас, М., Гилле, Дж. К., Касаи, Ю., Кифер, М., Недолуха, Г. Э., Ноэль, С., Располлини, П., Рид, В. Г., Розанов, А., Сиорис, К. Э., Уокер, К. А., и Вейгель, К. Оценка водяного пара SPARC II: сравнение стратосферного и нижнего Временные ряды водяного пара в мезосфере, наблюдаемые со спутников Atmos. Измер. Tech., 11, 4435–4463, https://doi.org/10.5194/amt-11-4435-2018, 2018.

Клей Д., Рассел Дж. М. и Филлипс Д.: оценка SPARC верхних слоев тропосферы и стратосферный водяной пар, WCRP 113, World Meteorol. Орган., WMO / TD — № 143, Отчет SPARC № 2, Женева, Швейцария, 2000.

Кунц, А., Конопка, П., Мюллер, Р., и Пан, Л.Л .: Динамическая тропопауза. на основе изоэнтропических градиентов потенциальной завихренности, J. Geophys. Res., 116, D01110, https://doi.org/10.1029/2010JD014343, 2011a.

Кунц, А., Пан, Л. Л., Конопка, П., Киннисон, Д. Э., и Тилмес, С.: Химический и динамический разрыв во внетропической тропопаузе на основе START08 и анализ WACCM, J. Geophys. Рес.-Атмос., 116, д.24, https://doi.org/10.1029/2011JD016686, 2011b.

Langille, J. A., Solheim, B., Bourassa, A., Degenstein, D., Brown, S., and Шеперд, Г.Г .: Измерение водяного пара с использованием изображения с расширенным полем зрения. пространственный гетеродинный спектрометр, Прил. Opt., 26, 4297–4308, https://doi.org/10.1364/AO.56.004297, 2017.

Langille, J. A., Letros, D., Zawada, D., Бурасса, А., Дегенштейн, Д., и Сольхейм, Б.: Пространственный Гетеродинные наблюдения водяного пара (SHOW) в верхней тропосфере и нижняя стратосфера с высотного самолета: моделирование и чувствительность анализ, J. Quant. Spectrosc. Ра., 209, 137–149, г. https://doi.org/10.1016/j.jqsrt.2018.01.026, 2018.

Лангиль, Дж., Летрос, Д., Бурасса, А., Сольхейм, Б., Дегенштейн, Д., Дюпон, Ф., Завада Д. и Ллойд Н. Д.: Пространственный гетеродинные наблюдения за водой (SHOW) с высотного самолета: характеристика, производительность и первые результаты, Atmos.Измер. Тех., 12, корп. 431–455, https://doi.org/10.5194/amt-12-431-2019, 2019.

Ливси, Н. Дж., Рид, В. Г., Вагнер, П. А., Фройдево, Л., Ламберт, А., Мэнни, Г. Л., Валле, Л. Ф. М., Памфри, Х.С., Санти, М.Л., Шварц, М.Дж., Ван, С., Фуллер, Р.А., Ярно, Р. Ф., Кносп, Б. В., Мартинес, Э. и Лэй, Р. Р.: Система наблюдения за Землей (EOS) Aura Microwave Limb Sounder (MLS) версии 4.2 × качество данных уровня 2 и описание документа, 2018.

Недолуха, Г. Э., Кифер, М., Лоссов, С., Гомес, Р.М., Кемпфер, Н., Лайнер, М., Форкман, П., Кристенсен, О.М., О, Дж. Дж., Хартог, П., Андерсон, Дж., Брамштедт, К., Динелли, Б.М., Гарсия-Комас , M., Hervig, M., Murtagh, D., Raspollini, P., Read, WG, Rosenlof, K., Stiller, GP, and Walker, KA: Оценка водяного пара SPARC II: сравнение спутниковых и наземных данных. на основе микроволновых измерений, Атмос. Chem. Phys., 17, 14543–14558, https://doi.org/10.5194/acp-17-14543-2017, 2017.

Pan, L., Solomon, S., Randel, W., Ламарк, Дж. Ф., Гесс, П., Гилле, Дж., Chiou, E. W., и McCormick, M.P .: асимметрии полушария и сезонные вариации самого нижнего стратосферного водяного пара и озона, производных по данным SAGE II, J. Geophys. Res.-Atmos., 102, 28177–28184, https://doi.org/10.1029/97jd02778, 1997.

Pan, LL, Randel, WJ, Gille, JC, Hall, WD, Nardi, B., Massie , С., Юдин В., Хосрави Р., Конопка П., Тарасик Д .: Тропосфера. вторжения, связанные с вторичной тропопаузой, J.Geophys. Res., 114, D10302, https://doi.org/10.1029/2008JD011374, 2009.

Рандел, В. Дж., Зайдель, Д. Дж., И Пан, Л. Л.: Характеристики наблюдений двойных тропопаузов, J. Geophys. Res.-Atmos., 112, D7, https://doi.org/10.1029/2006JD007904, 2007.

Рэй, Э.А., Мур, Ф.Л., Элкинс, Дж. У., Даттон, Г. С., Фэи, Д. У., Фемель, Х., Олтманс, С. Дж., И Розенлоф, К. Х .: Перенос в Самая низкая стратосфера северного полушария, обнаруженная с помощью наземного индикатора измерения, Дж.Geophys. Res.-Atmos., 104, 26565–26580, https://doi.org/10.1029/1999JD3, 1999.

Riese, M., Ploeger, F., Rap, A., Vogel, B., Konopka, П., Дамерис М. и Форстер, П .: Влияние неопределенностей в атмосферном перемешивании на моделируемую UTLS состав и связанные с ним радиационные эффекты, J. Geophys. Res.-Atmos., 117, D16, https://doi.org/10.1029/2012JD017751, 2012.

Шварц, М. Дж., Мэнни, Г. Л., Хегглин, М. И., Ливси, Н. Дж., Санти, М. Л. и Даффер В. Х .: Климатология и изменчивость газовых примесей во внетропических регионах двойной тропопаузы от Измерения MLS, HIRDLS и ACE-FTS, J.Geophys. Res., 120, 843–867, https://doi.org/10.1002/2014JD021964, 2015.

Скотт, Р. К. и Каммас, Дж. П .: Разрушение и перемешивание волн в субтропической зоне.

Ст. 455 ГК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

Комментарий к Ст. 455 ГК РФ

Статья 455 ГК РФ с комментариями — Условие договора о товаре

Комментарий к статье 455 Гражданского Кодекса РФ

Статья 455. ГК РФ, часть 2 в последней редакции 2020 года

Статья 455 ГК РФ и комментарии к ней

Обязательные признаки договора поставки

Стороны договора

Товар покупается для личных целей

Как быть, если продавец действует по доверенности

Продажа бывшего в употреблении имущества

Комментарий к статье 455 ГК РФ

Условие о сроке передачи товара

Порядок оплаты

Нюансы сделки с ранее приватизированным помещением

Трактовка термина

Нюансы сделки в случае, если квартира досталась продавцу по наследству

Прекращения права собственности — cт 235 ГК РФ: Когда прекращается право собственности на недвижимость

Понятие «прекращение права собственности»

Основания добровольного прекращения права собственности

Отчуждение собственником имущества

Переход права собственности по наследству

Добровольный отказ собственника от прав

Прекращение деятельности юридического лица

Основания принудительного изъятия имущества

Обращение взыскания на имущество по обязательствам

Отчуждение имущества, которое в силу закона не может принадлежать данному лицу

Отчуждение недвижимого имущества в связи с изъятием участка

Реквизиция

Конфискация

Утрата возможности пользования, распоряжения и владения имуществом вследствии объективных причин

В чью пользу отчуждается имущество

Что делать при несогласии с прекращением права собственности

Проверить информацию по объекту на публичной карте

Видео: Когда и почему прекращается право собственности

Интервенционная магнитно-резонансная ангиография без привязки: Визуализация беспроводного активного катетера — Quick — 2005 — Магнитный резонанс в медицине

ТЕОРИЯ

МЕТОДЫ

Дизайн катетера

Фантомные эксперименты

Методы визуализации в реальном времени

Эксперименты in vivo

Селективная МР-ангиография

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дизайн катетера

Фантомные эксперименты

Методы визуализации в реальном времени

Эксперименты in vivo

Селективная МР-ангиография

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Благодарности

Опыт использования отделения неотложной помощи среди лиц с историей неблагоприятного детского опыта | BMC Health Services Research

Информированная помощь при травмах и насилии как подход к оказанию помощи в контексте ACEs как детерминант здоровья

Клинические последствия и рекомендации

Сильные стороны и ограничения

Новый активатор глюкокиназы модулирует функцию островков поджелудочной железы и гепатоцитов | Эндокринология

Абстракция

Материалы и методы

Ферментативный анализ глюкокиназы

Кристаллическая структура ГК

Получение и культивирование β-клеток поджелудочной железы

Анализ секреции инсулина

Выделение и культивирование гепатоцитов

Поглощение 2-дезокси-d- [

Экспрессия белка GK

Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT)

Статистический анализ

Результаты

Обсуждение

Благодарности

Сокращения

Список литературы

научных статей, журналов, авторов, подписчиков, издателей

Дифференциальный диагноз отравления пауком Редбэк диагностирует

Наблюдательные свидетельства увлажнения самой нижней стратосферы посредством изэнтропического перемешивания через субтропическую струю

Оставить комментарий Отменить ответ