Гк рф п 2 ст 450 гк: Статья 450. Основания изменения и расторжения договора

Содержание

Практика применения ст. 450 ГК РФ

ГК РФ даёт участникам гражданского правового оборота достаточно большие возможности в формировании условий договорных отношений (ст. 1, 421 ГК РФ). При этом подразумевается, что стороны могут использовать условия, которые будут отличаться от тех, что предписывают правила различных статей ГК РФ.

До тех пор, пока это устраивает всех участников сделки, приоритетным является договор.

Свобода договорных отношений распространяется и на возможность вносить в договор изменения, которые могут относиться к новациям (ст. 414 ГК РФ) или сокращать объём участия какой-то из сторон взамен предоставления ею отступного (ст. 409 ГК РФ). Стороны могут расторгнуть договор самостоятельно, придя к определённому консенсусу. Это возможно в случае возникновения взаимопонимания и тогда, когда прекращение сделки не противоречит статьям ГК РФ и другим законам.

В одностороннем порядке и без участия суда может быть изменён или расторгнут только договор, который предусматривал это своими условиями, но и в таком случае вносящая изменения сторона не должна злоупотреблять таким правом, действовать добросовестно и разумно, в пределах ГК РФ. Процесс изменения и расторжения договора регламентирует его ст. 450.

Внесение изменений в договоры и их расторжение в судах

В случае, если консенсуса достичь не удалось, но одна из сторон считает необходимым внести в договор изменения или расторгнуть его, она должна обращаться в суд. Однако это не означает того, что внесение изменений или расторжение возможно во всех случаях, а п. 2 ст. 450 ГК РФ устанавливает правила, согласно которым для этого необходимо, чтобы имелись следующие признаки:

  • существенное нарушение условий одной из сторон, из-за которых другая в значительной мере теряет то, на что была вправе рассчитывать при заключении договора;
  • наступление какого-то из случаев, предусмотренных ГК РФ, другими законами или условиями самого договора.

Но и при наличии изложенных выше обстоятельств возможности судов ограничены, если договор имеет сложную природу и его изменение может затронуть интересы третьих лиц (п. 2 ст. 39 ГПК РФ и п. 3 ст. 139 АПК РФ).

В п. 2 ст. 450 ГК РФ используется понятие «ущерб», который получает одна из сторон, что и становится весомым основанием для того, чтобы она требовала расторжения договора. Его не следует трактовать узко или ограничительно. В данном случае под ущербом понимается не только высокие расходы, но и любое неполучение в полном объёме того, на что сторона могла рассчитывать.

Так, если был заключен договор пожизненной ренты, то неполучение содержания стороной сделки всего один раз даёт ей право обращаться в суд с исковым заявлением о расторжение договора. Хотя формально это не принесло стороне никакого ущерба, но получатель ренты вправе ожидать того, что средства будут поступать каждый месяц.

Из анализа судебной практики по таким делам становится ясно, что суды занимают сторону получателя ренты в том случае, когда плательщик не в состоянии привести никаких аргументов тому, что пропуск платежа более не повторится. Подразумевается, что всё время пока длится договор с недобросовестным плательщиком, владелец недвижимости не может найти другого — более ответственного, а на подписание договора его толкнул низкий уровень дохода.

При сделках купли-продажи существенным основанием для расторжение договора становится выявление неустранимых дефектов или недостатков, которые были неоднократно установлены вновь после их устранения. В информационном письме Президиума ВАС РФ от 05.05.97 № 14 указывается на то, что бремя доказательства наличия таких недостатков лежит на истце, который стремится разорвать договор.

Расторжение договора и односторонний отказ в его исполнении

Внесение изменений в договор или его расторжение на базе п. 2 ст.450 ГК РФ необходимо отличать от одностороннего отказа в исполнении. Последнее происходит без решения суда, на основании условий самого договора, статей ГК или других законов. Односторонний отказ автоматически делает договор расторгнутым. Однако другая сторона получает в таком случае право обжаловать действия отказавшегося от исполнения лица в судах (ст. 11 ГК РФ) и потребовать неустойку.

Различные статьи ГК накладывают различные обязательства на отказавшуюся от исполнения своих договорных обязанностей сторону. В первую очередь это относится к уведомлению другого участника или участников сделки. В зависимости от природы договора, могут стать актуальными ст. ст. 699, 977, 1003, 1024, 1037, 1051 ГК РФ. Остаётся спорным вопрос о том, какая дата считается датой отказа — отправки о том уведомления или получения его другой стороной, если более поздняя дата не указывается в самом отказе. В отдельных статьях ГК может быть чётко указано, что является датой расторжения договора. Так, для договора поставки это всегда дата получения стороной уведомления контрагента, если иной срок не предусмотрен в уведомлении и не определен соглашением сторон. Тем не менее, спорные вопросы всё равно возникают. В основном они связаны с тем, что в этот момент какие-то грузы могли не только находиться в пути, но даже продолжать отгружаться.

Правом одностороннего отказа может воспользоваться кредитор, в том случае, если в силу долгосрочного невыполнения должником своих обязательств договор утратил для него интерес (ст. 405 ГК РФ). Однако законодатель далеко не случайно сделал оговорку о необходимости разумных и добросовестных действий. Кодекс не содержит никаких препятствий к тому, чтобы правом одностороннего отказа от выполнения договоров воспользовались любые лица, вне зависимости от того, относится ли договор к предпринимательской деятельности. Это означает, что внесение изменений в договор или отказ от исполнения в одностороннем порядке может коснуться и потребителей электроэнергии, воды и газа, которые являются рядовыми гражданами.

Отражение ст. 450 ГК РФ в постановлениях и определениях высших судов РФ

Одной из наиболее важных, в свете рассмотрения практического применения ст. 450 ГК РФ, является позиция позиция ВС РФ, ВАС РФ, которая сводится к тому, что если продавец не получил оплату, то у него возникает право требовать возврата недвижимости в качестве неосновательного обогащения только в случае расторжения договора. Это не означает, что какое-либо лицо может присвоить себе чужую недвижимость, но до тех пор пока договор в силе, идёт период ожидания оплаты от покупателя.

Более детально это отражено в определении ВС РФ от 03.02.2015 № 78-КГ14-39. Оно указывает, что если покупатель не подписал акт приемки недвижимости и не произвёл полную оплату, то это влечет за собой расторжение договора купли-продажи, а также возврат переданного покупателю имущества в соответствии с нормами о неосновательном обогащении.

Аналогичные сведения содержаться в определениях по делам № 18-КГ14-99 от 09.09.2014 и № 5-В11-27 от 07.06.2011.

Данная статья довольно часто становится предметом рассмотрения не только ВС, но и Конституционного суда. Дело в том, что многие граждане, получив не устроившее их решение судов всех инстанций, доходят даже до Конституционного. Но в нём можно обжаловать только саму статью ГК. Это и делают, а едва ли не основной мотивацией является нечёткость формулировки «существенное нарушение договора». Однако КС РФ отказывает в принятии жалоб, поскольку именно судам, в рамках дискреционных полномочий, и дана возможность определение того, является ли какое-либо нарушение существенным по смыслу данной нормы.

Существенное нарушение договора — сторона должна представить суду соответствующие доказательства наличия такого нарушения договора

автор статьи
Адвокат Пантюшов Олег Викторович

Действительно, согласно п. 2 ст. 450 ГК РФ договор может быть расторгнут по решению суда при существенном нарушении договора другой стороной, при этом нарушение договора признается существенным, когда влечет для другой стороны такой ущерб, что она в значительной степени лишается того, на что была вправе рассчитывать при заключении договора.

Следовательно, ссылающаяся на существенное нарушение договора сторона должна представить суду соответствующие доказательства наличия такого нарушения договора: неполучение доходов, возможное наступление дополнительных расходов или других последствий, существенно отражающихся на интересах стороны. Сам же факт наличия такого нарушения в силу ст. 450 ГК РФ не может служить основанием для расторжения договора. (Определение Верховного Суда РФ от 03.04.2001 N 18-В01-12).

В п. 3 ст. 486 ГК РФ (глава 30, § 1 «Общие положения о купле-продаже») содержится специальная норма, определяющая правовые последствия несвоевременной оплаты покупателем переданного ему продавцом товара по договору купли-продажи. Они заключаются в следующем: продавец имеет право потребовать оплаты товара и дополнительно уплаты процентов в соответствии со ст. 395 ГК РФ.

Из содержащегося в п. 2 ст. 450 ГК РФ понятия существенного нарушения договора одной из сторон (существенным признается нарушение договора одной из сторон, которое влечет для другой стороны такой ущерб, что она в значительной степени лишается того, на что была вправе рассчитывать при заключении договора) следует, что сторона, предъявляющая в суд требование о расторжении договора по этому основанию, должна представить доказательства, подтверждающие именно такой характер нарушения. (Определение Верховного Суда РФ от 07.06.2011 N 5-В11-27).

Изменение и расторжение договора в соответствии с п. 1, 2 ст. 450 ГК РФ возможны по соглашению сторон, если иное не предусмотрено настоящим Кодексом, другими законами или договором. По требованию одной из сторон договор может быть изменен или расторгнут по решению суда только при существенном нарушении договора другой стороной, а также в иных случаях, предусмотренных ГК РФ, другими законами или договором. Существенным признается нарушение договора одной из сторон, которое влечет для другой стороны такой ущерб, что она в значительной степени лишается того, на что была вправе рассчитывать при заключении договора.

Из содержания приведенных норм ГК РФ следует, что в договоре могут быть предусмотрены условия, позволяющие стороне требовать в одностороннем порядке расторжения договора. Следовательно, основанием одностороннего расторжения договора могут выступать не только случаи, названные в законе, но и случаи, названные в конкретном договоре.

При этом регистрация перехода права собственности к покупателю на проданное недвижимое имущество не являлась препятствием для расторжения договора по основаниям, предусмотренным статьей 450 ГК РФ (п. 65 Постановления Пленума Верховного Суда Российской Федерации и Пленума Высшего Арбитражного Суда Российской Федерации N 10/22 от 29 апреля 2010 г. «О некоторых вопросах, возникающих в судебной практике при разрешении споров, связанных с защитой права собственности и других вещных прав»).

В силу п. 4 ст. 453 ГК РФ стороны не вправе требовать возвращения того, что было исполнено ими по обязательству до момента изменения или расторжения договора, если иное не установлено законом или соглашением сторон. Вместе с тем согласно статье 1103 ГК РФ положения о неосновательном обогащении подлежат применению к требованиям одной стороны в обязательстве к другой о возврате исполненного в связи с этим обязательством. Поэтому в случае расторжения договора продавец, не получивший оплаты по нему, вправе требовать возврата переданного покупателю имущества на основании статей 1102, 1104 ГК РФ. Судебный акт о возврате недвижимого имущества продавцу является основанием для государственной регистрации прекращения права собственности покупателя и государственной регистрации права собственности на этот объект недвижимости продавца (п. 65 Постановления Пленума Верховного Суда Российской Федерации и Пленума Высшего Арбитражного Суда Российской Федерации N 10/22 от 29 апреля 2010 г. «О некоторых вопросах, возникающих в судебной практике при разрешении споров, связанных с защитой права собственности и других вещных прав»).

Согласно ст. 1 Протокола N 1 к Конвенции о защите прав человека и основных свобод каждое физическое или юридическое лицо имеет право на уважение своей собственности. Никто не может быть лишен своего имущества иначе как в интересах общества и на условиях, предусмотренных законом и общими принципами международного права.

(Определение Верховного Суда РФ от 12.04.2011 N 43-В11-1)

Расторжение контракта по 44-ФЗ в одностороннем порядке

Согласно ч. 8 ст. 95 № 44-ФЗ расторжение контракта допускается по соглашению сторон, по решению суда, в случае одностороннего отказа стороны контракта от исполнения контракта в соответствии с гражданским законодательством. Заказчик вправе принять решение об одностороннем отказе от исполнения контракта по основаниям, предусмотренным ГК РФ, при условии, что это было предусмотрено контрактом (ч. 9 ст. 95 № 44-ФЗ).

В законе № 44-ФЗ установлены обязательные этапы одностороннего расторжения (ч. 12–22, ст. 95 № 44-ФЗ):

  1. Обязательное уведомление второй стороны.
  2. Отмена решения об одностороннем расторжении в случае, если в течение десяти дней от даты уведомления вторая сторона устранила нарушение условий контракта.

Заказчик имеет право на одностороннее расторжение контракта. А как же участник?

Если заказчик предусмотрел возможность одностороннего расторжения контракта, поставщик также имеет право на односторонний отказ от исполнения контракта 44-ФЗ.

При расторжении контракта в связи с односторонним отказом от исполнения контракта другая сторона вправе потребовать возмещения только фактически понесенного ущерба (ч. 23, ст. 95 № 44-ФЗ).

Возникает вопрос: Если подрядчик выполнил работы в срок и качественно, а заказчик уклоняется от подписания форм КС и оплаты, то заказчик сможет расторгнуть контракт и не платить за выполненные работы?

Нет, по закону такая ситуация невозможна. Заказчик не может расторгнуть контракт, не имея на это существенной причины, и не может не оплатить выполненные работы, даже если контракт расторгается.

Односторонний отказ от исполнения контракта 44-ФЗ: причины и условия

  1. Причиной одностороннего расторжения может быть только «существенное нарушение договора другой стороной», причем существенным является «нарушение договора одной из сторон, которое влечет для другой стороны такой ущерб, что она в значительной степени лишается того, на что была вправе рассчитывать при заключении договора» (ч. 2, ст. 450, ГК РФ), а также конкретные причины, указанные в тексте контракта.
  2. В контракте должны быть обязательно указаны условия ответственности заказчика и поставщика за неисполнение или ненадлежащее исполнение контракта (ч. 4, ст. 34 № 44-ФЗ). Пени и штрафы за нарушение сроков оплаты также должны быть указаны в контракте (ч. 5, ст. 34 № 44-ФЗ).

В соответствии с этими пунктами поставщик сможет потребовать возмещения ущерба.

И все-таки, при исполнении и расторжении контракта следует руководствоваться Законом № 44-ФЗ «О контрактной системе», а не Гражданским кодексом?

Закон № 44-ФЗ говорит, что расторжение контракта возможно по соглашению сторон, по решению суда и в одностороннем порядке в соответствии с гражданским законодательством. Значит, если какие-то условия и обязанности при расторжении контракта не описаны в законе о закупках, действует Гражданский кодекс и остальные Федеральные законы в той части, в какой они не противоречат Закону № 44-ФЗ. «Нормы права, содержащиеся в других федеральных законах и регулирующие указанные отношения, должны соответствовать настоящему Федеральному закону» (ч. 1, ст. 2, № 44-ФЗ).

Хотите знать все о процедурах заключения контракта по 44-ФЗ и договора по 223-ФЗ? Записывайтесь на экспресс-курс «Договоры в регламентированных закупках по 44‑ФЗ и 223‑ФЗ»

Расторжение госконтракта по 44-ФЗ. Что говорит закон о госзакупках?

Заказчик может провести экспертизу поставленного товара, выполненной работы, оказанной услуги. Если выявлены нарушения со стороны поставщика, то заказчик вправе расторгнуть контракт в одностороннем порядке (ч. 10, 11 ст. 95).

В течение трех рабочих дней с даты принятия решения об одностороннем расторжении контракта заказчик размещает его в ЕИС и направляет поставщику по почте заказным письмом с уведомлением о вручении. Возможны и другие способы уведомления поставщика, например через электронную почту. Главное, чтобы такие способы обеспечивали фиксирование уведомления и получение заказчиком подтверждения о его вручении поставщику (ч. 12 ст. 95).

Решение заказчика об одностороннем отказе от исполнения контракта вступает в силу и контракт считается расторгнутым через десять дней с даты надлежащего уведомления заказчиком поставщика об одностороннем отказе от исполнения контракта (ч. 13 ст. 95).

Информация о поставщике, с которым контракт был расторгнут, включается в РНП (ч. 16 ст. 95). Если в течение этих десяти дней поставщик, подрядчик или исполнитель успеет исправить нарушения, то заказчик обязан отменить не вступившее в силу решение об одностороннем отказе от исполнения контракта (ч. 14 ст. 95). Будьте внимательны! У поставщика есть право на одну-единственную ошибку. Заказчик не отменит свое решение в случае повторного нарушения.

Поставщик, подрядчик или исполнитель со своей стороны также вправе принять решение об одностороннем отказе от исполнения контракта, если в контракте было предусмотрено подобное право заказчика (ч. 19 ст. 95). Процедура направления заказчику уведомления о решении расторгнуть контракт аналогична процедуре направления такого решения от заказчика к поставщику, описанной выше. Стороны вправе потребовать возмещения ущерба по условиям, приведенным в ч. 23 ст. 95.

Не устроило качество услуг — заказчик расторгает контракт? Не всегда

По условиям контракта поставщик принял на себя обязательство по оказанию охранных услуг на охраняемых объектах, перечень которых утвержден в приложении к контракту (наличие одного поста, осуществление охраны одним охранником в смену, круглосуточное несение службы).

Заказчик провел проверку оказания услуг, по результатам которой пришел к выводу, что качество оказания услуг не соответствует требованиям государственного контракта.

На основании результатов проверки заказчик издал приказ об одностороннем отказе от исполнения контракта, решение было направлено поставщику и получено им.

Поставщик направил заказчику письмо, в котором сообщил об устранении выявленных нарушений, а также указал, что заказчик нарушил процедуру — односторонний отказ от исполнения контракта условиями контракта не предусмотрен, в связи с чем расторжение контракта возможно только в судебном порядке. Согласно пункту 10.3 контракт может быть расторгнут досрочно по соглашению сторон. Поставщик считает, что заказчик неправомерно отказался от исполнения государственного контракта.

Суд установил, что условия контракта не предусматривают право ответчика на расторжение контракта в одностороннем порядке без обращения в суд, поэтому отказ ответчика от исполнения контракта в одностороннем порядке является незаконным (Постановление Арбитражного суда Поволжского округа от 19.11.2014 № Ф06-16631/2013 по делу № А49-2126/2014).

Поставщик отказался от исполнения контракта. Что делать заказчику?

Поставщик направил заказчику письмо о приостановлении им исполнения контракта, но не указал основания такого приостановления.

При рассмотрении дела суд установил, что поставщик фактически не приступил к выполнению своих обязательств по контракту. В силу ст. 715 ГК РФ предусмотрено, что если подрядчик не приступает своевременно к исполнению договора подряда или выполняет работу настолько медленно, что окончание ее к сроку становится явно невозможным, заказчик вправе отказаться от исполнения договора и потребовать возмещения убытков.

В связи с тем что поставщик фактически не приступил к исполнению своих обязательств, заказчик правомерно рассмотрел данное письмо в качестве одностороннего отказа от исполнения контракта, которое было предусмотрено контрактом, и направил в ответ свое решение о том, что он также в одностороннем порядке готов расторгнуть контракт.

В соответствии с ч. 14 ст. 95 № 44-ФЗ заказчик обязан отменить не вступившее в силу решение об одностороннем отказе от исполнения контракта, если в течение 10-дневного срока с даты надлежащего уведомления поставщика о принятом решении об одностороннем отказе от исполнения контракта устранено нарушение, послужившее основанием для принятия указанного решения. Но в течение указанного в законе срока поставщик к оказанию услуг не приступил и не устранил нарушения, послужившие основанием для принятия данного решения.

Поэтому суд признал расторжение контракта правомерным (Постановление Арбитражного суда Северо-Западного округа от 17.02.2015 по делу № А56-6651/2014).

Подрядчик нарушил сроки

Контрактом предусмотрено выполнение подрядчиком проектно-изыскательских и строительно-монтажных работ и их последовательность в соответствии с техническим заданием. Срок начала работ установлен с 18.06.2012, окончание — не позднее 19 месяцев со дня заключения контракта, в том числе подготовка рабочей и сметной документации, строительство и сдача в эксплуатацию жилых домов.

Согласно п. 4.2.2 контракта подрядчик обязался выполнить рабочую документацию в объеме, необходимом для получения разрешения на строительство, согласовать ее с заказчиком и компетентными органами и передать заказчику.

В связи с неисполнением ответчиком обязательств в определенные контрактом сроки истец обратился в арбитражный суд с требованием о расторжении контракта на основании п. 1 ч. 2 ст. 450 ГК РФ.

Применительно к муниципальному контракту на выполнение подрядных работ существенным нарушением его условий является нарушение сроков выполнения работ. Как установлено судом, исходя из дат оформления документов на передачу части рабочей документации, данные работы по подготовке рабочей и сметной документации выполнены подрядчиком с нарушением срока, установленного контрактом.

При этом в полном объеме рабочая документация подрядчиком на момент рассмотрения спора в суде не изготовлена.

Таким образом, суд пришел к обоснованному выводу о нарушении ответчиком сроков изготовления указанной документации, то есть существенном нарушении условий контракта (Постановление Арбитражного суда Уральского округа от 16.01.2015 № Ф09-9280/14 по делу № А60-10485/2014).

Также было установлено, что заказчиком был соблюден досудебный порядок — ответчику было предложено расторгнуть вышеуказанный контракт. Требование о расторжении контракта удовлетворено.

Отказ от приемки

Бесплатные вебинары по 44-ФЗ, 223-ФЗ

Участие в закупках. Изменения. Эксперты-практики в Школе электронных торгов

Посмотреть расписание

Согласно контракту поставщик обязался поставить заказчику расходные материалы для копировально-множительной техники в соответствии со спецификацией, с необходимой документацией (счет, счет-фактура, товарная накладная ТОРГ-12, акт приема-передачи товара).

Согласно п. 3.3 товар поставляется в упаковке, обеспечивающей сохранность при транспортировке и перегрузке и с маркировкой: индекс, количество, вес, страна и название фирмы-производителя, модель аппарата, на который поставляется товар.

Согласно п. 9.1 договора поставка товара осуществляется в течение пяти рабочих дней после подписания договора, то есть в срок до 11.04.2014.

Как следует из представленных доказательств, первоначально товар предлагался к приемке 10.04.2014, в которой поставщику было отказано по мотиву недопоставки товара, неверного указания в товаросопроводительных документах количества товара, неверного указания наименования поставляемого товара, отсутствием в передаточных актах серийных номеров товара и информации о дате изготовления товара.

В дальнейшем поставщик поставил недостающее количество товара, но не привел товаросопроводительные документы в соответствие с условиями контракта.

Заказчик потребовал уплаты неустойки за просрочку поставки в полном объеме и в одностороннем порядке расторг контракт, указав как причину неверное оформление документов. Ч. 1 ст. 520 ГК РФ устанавливает: если поставщик не поставил предусмотренное договором поставки количество товаров в установленный срок, покупатель вправе потребовать допоставить необходимое количество товара.

Нормы ГК РФ и положения контракта в случае недопоставки не предоставляют покупателю право на отказ от принятия товара.

Суд правомерно указал на то, что в рамках приемки товара заказчиком не установлено каких-либо нарушений поставщиком требований к качеству товара, что дополнительно свидетельствует о неправомерном отказе заказчика от приемки.

Неверное указание в товаросопроводительных документах информации о товаре также не является обстоятельством, препятствующим принятию товара по условиям контракта, и тем более основанием для одностороннего расторжения контракта.

Требования о взыскании неустойки частично удовлетворены, поскольку поставщиком были нарушены сроки поставки заказчику товара, однако взыскиваемая неустойка уменьшена на основании ст. 333 ГК РФ, так как частично поставка была выполнена в срок. Требования поставщика о признании недействительным одностороннего расторжения контракта удовлетворены (Постановление Девятого арбитражного апелляционного суда от 23.12.2014 № 09АП-51223/2014 по делу № А40-94139/2014). Они были признаны правомерными, поскольку заказчик расторг контракт по основанию, которое не предусмотрено ни в законе, ни в контракте.

Обучение по 44-ФЗ, 223-ФЗ

Повышение квалификации и профпереподготовка в Контур.Школе

Подробнее о курсах

Вывод

Государственный контракт можно расторгнуть в одностороннем порядке. Главное — придерживаться законодательных норм и правил. Попытки уклониться от исполнения контракта через неправомерное расторжение в одностороннем порядке легко выявляются в ходе арбитражного процесса. Поэтому и поставщикам, и заказчикам лучше изначально добросовестно подходить к исполнению своих обязательств.

надо ли расторгать договор?  — Аналитика — Пресс-центр — ЮСТ

18.01.2010

Источник публикации — журнал «Адвокат». №1. 2010.

Татьяна Львова, адвокат Юридической фирмы «ЮСТ»

В последнее время применение законодательства об интеллектуальной собственности неуклонно расширяется в связи с непрерывным развитием тех сфер бизнеса, где наиболее часто используются объекты интеллектуальной собственности. Одновременно растет количество юридических вопросов, связанных с применением законодательства об интеллектуальной собственности. В части четвертой ГК РФ поименован новый для российского законодательства договор об отчуждении исключительного права, суть которого заключается в том, что правообладатель отчуждает в полном объеме, а приобретатель приобретает соответствующее исключительное право. Так, в соответствии с пунктом 1 ст. 1234 ГК РФ по договору об отчуждении исключительного права одна сторона (правообладатель) передает или обязуется передать принадлежащее ей исключительное право на результат интеллектуальной деятельности или на средство индивидуализации в полном объеме другой стороне (приобретателю) .

Особенностью договора об отчуждении исключительного права является то, что он подлежит государственной регистрации в случае, когда результат интеллектуальной деятельности или средство индивидуализации подлежит в соответствии с частью четвертой ГК РФ государственной регистрации, порядок и условия которой устанавливаются Правительством РФ.

Проанализируем, каким должен быть предмет иска, предъявляемого прежним правообладателем новому правообладателю в ситуации, предусмотренной абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, а именно когда новый правообладатель существенно нарушил обязанность выплатить прежнему правообладателю в установленный договором об отчуждении исключительного права срок вознаграждение за приобретение исключительного права на результат интеллектуальной деятельности или на средство индивидуализации, если исключительное право перешло к его приобретателю.

Нормы части четвертой ГК РФ более подробно регламентируют договор об отчуждении исключительного права, чем были регламентированы договоры о распоряжении исключительным правом в ранее действующем законодательстве об интеллектуальной собственности. На основании пункта 2 ст. 1233 ГК РФ к договорам о распоряжении исключительным правом на результат интеллектуальной деятельности или на средство индивидуализации, в том числе к договорам об отчуждении исключительного права и к лицензионным (сублицензионным) договорам, применяются общие положения об обязательствах (ст. 307—419 ГК РФ) и о договоре (ст. 420—453 ГК РФ), поскольку иное не установлено правилами указанного раздела и не вытекает из содержания или характера исключительного права. Тем не менее применение нормы, предусмотренной абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, вызывает у практиков вопросы.

Так, в пункте 5 ст. 1234 говорится о двух видах последствий нарушения приобретателем обязанности выплатить вознаграждение в зависимости от того, перешло исключительное право к приобретателю или нет, а также от того, является ли нарушение права существенным1. Если исключительное право перешло к приобретателю по договору, то при существенном нарушении его права на вознаграждение прежний правообладатель имеет право в судебном порядке потребовать перевода прав приобретателя на себя и возмещения убытков. Если исключительное право не перешло к приобретателю, то при простом нарушении им обязанности выплатить в установленный договором срок вознаграждение за приобретение исключительного права правообладатель может отказаться от договора в одностороннем порядке и потребовать возмещения убытков, причиненных расторжением договора.

Применение абзаца второго п. 5 ст. 1234 ГК РФ не вызывает сложных вопросов. Указанная норма представляет собой предусмотренный законом случай одностороннего отказа от исполнения обязательства (ст. 310, п. 3 ст. 450 ГК РФ). Юридическими последствиями одностороннего отказа от исполнения договора, осуществленного в соответствии с законом или договором, является расторжение или изменение договора. Причем обращение в суд стороны, реализующей право на такой односторонний отказ, не требуется2. В том числе по этому признаку односторонний отказ от исполнения обязательства (ст. 310, п. 3 ст. 450 ГК РФ) отличают от права требования одной из сторон об изменении или расторжении договора (п. 2 ст. 450 ГК РФ), при реализации которого должен применяться судебный порядок изменения или расторжения договора.

В абзаце первом п. 5 ст. 1234 ГК РФ содержится отсылочная норма, которая для определения существенности нарушения по оплате приобретателем вознаграждения отсылает к подпункту 1 п. 2 ст. 450 Кодекса. В соответствии с ним существенным признается нарушение договора одной из сторон, которое влечет для другой стороны такой ущерб, что она в значительной степени лишается того, на что была вправе рассчитывать при заключении договора. Понятие «существенное нарушение» в любом случае является оценочным. На практике случаи существенного нарушения по оплате приобретателем вознаграждения многовариантны: стопроцентная неоплата, просрочка, неоплата части вознаграждения, сочетание указанных случаев3. Представляется, для того, чтобы упростить доказывание в суде фактов, свидетельствующих, что нарушение порядка расчетов и сроков оплаты является существенным, срок, порядок расчетов, а также понятие существенности их нарушения должны быть прямо определены сторонами в договоре.

Очевидно, что в случае, предусмотренном абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, законодатель не имел в виду, как это имеет место быть в абзаце втором п. 5 этой статьи, отказ от договора в одностороннем порядке (ст. 310, п. 3 ст. 450 ГК РФ). Вопрос остается открытым относительно того, подразумевал ли законодатель в случае, предусмотренном абзацем первым п. 5 указанной статьи, одностороннее расторжение договора и обязательность предъявления истцом требования о расторжении договора как необходимое условие для удовлетворения судом двух других требований: о переводе на себя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков (подп. 2 п. 2 ст. 450 ГК РФ). Отметим, что судебная практика по указанному вопросу пока не сложилась.

Если исходить из того, что в силу абзаца первого п. 5 ст. 1234 ГК РФ договор расторгается и предъявление истцом требования о расторжении договора обязательно как необходимое условие для удовлетворения судом двух других требований: о переводе на себя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков (подп. 2 п. 2 ст. 450 ГК РФ), то возникают следующие проблемы применения данной нормы:

— необходимо соблюдение досудебного порядка, предусмотренного пунктом 2 ст. 452 ГК РФ, согласно которому требование об изменении или о расторжении договора может быть заявлено стороной в суд только после получения отказа другой стороны на предложение изменить или расторгнуть договор либо неполучения ответа в срок, указанный в предложении или установленный законом либо договором, а при его отсутствии — в тридцатидневный срок. При несоблюдении указанного досудебного порядка заявление на основании статьи 222 ГПК РФ, статьи 148 АПК РФ будет оставлено судом без рассмотрения;

— возникает вопрос о необходимости указания в иске о переводе на прежнего правообладателя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков дополнительного требования о расторжении договора. Если такая необходимость есть, то: а) почему такое право прежнего правообладателя прямо не предусмотрено абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ; б) означает ли это, что истцу может быть отказано в иске о переводе на прежнего правообладателя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков, на том основании, что он не предъявил одновременно требование о расторжении договора;

— если дополнительно указывать требование о расторжении договора нет необходимости, то будет ли договор об отчуждении исключительного права считаться расторгнутым после вступления в законную силу решения суда о переводе прав приобретателя исключительного права на прежнего правообладателя и возмещении убытков. Представляется, что если после указанных событий договор об отчуждении исключительного права не считается расторгнутым по замыслу законодателя, то могут продолжать действовать иные обязательства сторон, если таковые предусмотрены договором.

Наконец, возникают вопросы, связанные с регистрацией Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. А именно, не ясны положения закона о том, нужно регистрировать расторжение зарегистрированного договора либо исполнять какие-либо иные регистрационные действия. Заметим, что в пункте 7 постановления Правительства РФ от 24 декабря 2008 г. № 1020 «О государственной регистрации договоров о распоряжении исключительным правом на изобретение, полезную модель, промышленный образец, зарегистрированные топологию интегральной микросхемы, программу для ЭВМ, базу данных и перехода без договора исключительного права на изобретение, полезную модель, промышленный образец, товарный знак, знак обслуживания, наименование места происхождения товара, зарегистрированные топологию интегральной микросхемы, программу для ЭВМ, базу данных» указано, что в случае расторжения зарегистрированного договора на основании решения суда к указанным документам дополнительно прилагается соответствующее решение суда. Но в таком случае, если в решении суда не содержится вывода о том, что договор расторгнут, у регистрирующего органа отсутствуют основания для регистрации расторжения зарегистрированного договора.

Далее. Предположим, что в случае, предусмотренном абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, законодатель не имел в виду одностороннее расторжение договора (подп. 2 п. 2 ст. 450 ГК РФ). Возникают следующие проблемы применения данной нормы.

Если в иске о переводе на прежнего правообладателя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков все-таки указать дополнительное требование о расторжении договора, не будет ли это являться основанием для отказа в удовлетворении требования о переводе на прежнего правообладателя прав приобретателя исключительного права на основании пункта 4 ст. 453 ГК РФ, согласно которой стороны не вправе требовать возвращения того, что было исполнено ими по обязательству до момента изменения или расторжения договора, если иное не установлено законом или соглашением сторон. Кроме того, если в случае, предусмотренном абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, законодатель не подразумевал одностороннее расторжение договора (подп. 2 п. 2 ст. 450 ГК РФ), то не ясны положения закона о том, какие регистрационные действия должна произвести Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам в целях регистрации перевода на первоначального правообладателя прав приобретателя исключительного права. Действующее законодательство не регламентирует процедуру такого перевода прав.

Представляется, что законодатель в случае, предусмотренном абзацем первым п. 5 ст. 1234 ГК РФ, говорил об одностороннем расторжении договора и обязательном предъявлении истцом требования о расторжении договора как необходимом условии для удовлетворения судом двух других требований: о переводе на себя прав приобретателя исключительного права и возмещении убытков (подп. 2 п. 2 ст. 450 ГК РФ). Но такое право не прописано в данной норме, что является пробелом в законодательстве, требующем устранения. Более того, по нашему мнению, абзац первый п. 5 ст. 1234 реализует положения пункта 4 ст. 453 ГК РФ, т.е. является случаем, установленным законом, когда стороны вправе требовать возвращения того, что было исполнено ими по обязательству до момента расторжения договора. Вышеизложенную позицию подтверждают результаты анализа аналогичных норм, реализующих положения пункта 4 ст. 453 ГК РФ.

Так, согласно пункту 2 ст. 475 ГК РФ покупатель вправе при продаже ему вещи ненадлежащего качества расторгнуть договор и, возвратив такую вещь продавцу, потребовать от него возврата уплаченной за нее суммы. Есть и другие примеры. Например, согласно пункту 5 ст. 565 ГК РФ покупатель вправе в судебном порядке требовать расторжения или изменения договора продажи предприятия и возвращения того, что исполнено сторонами по договору, если установлено, что предприятие ввиду недостатков, за которые отвечает продавец, не пригодно для целей, названных в договоре продажи, и эти недостатки не устранены продавцом на условиях, в порядке и в сроки, которые установлены в соответствии с ГК РФ, другими законами, иными правовыми актами или договором, либо устранение таких недостатков невозможно.

Итак, очевидно, что абзац первый п. 5 ст. 1234 ГК РФ допускает неоднозначное толкование и содержит пробел. В целях единообразия в толковании и применении данной нормы считаем, что абзац первый п. 5 ст. 1234 ГК РФ надлежит изложить в следующей редакции.

«При существенном нарушении приобретателем обязанности выплатить правообладателю в установленный договором об отчуждении исключительного права срок вознаграждение за приобретение исключительного права на результат интеллектуальной деятельности или на средство индивидуализации (подпункт 1 пункта 2 статьи 450) прежний правообладатель вправе расторгнуть договор, а также требовать в судебном порядке перевода на себя прав приобретателя исключительного права и возмещения убытков, если исключительное право перешло к его приобретателю».

Библиография

Авалян P.M., ПодольныйА.В. Договоры об интеллектуальной собственности (с учетом всех изменений 2008 г.). — М.: Бератор-Паблишинг, 2008.

Еременко В.И., Евдокимова В.И. Некоторые формы распоряжения исключительным правом на объекты промышленной собственности в части четвертой ГК РФ // Адвокат. 2008. № 4.

Комментарий к части четвертой Гражданского кодекса РФ (поглавный) / Под ред. А.Л. Маковского. — М.: Статут. 2008.

Просрочка оплаты полученного товара — бесплатная консультация юриста в Москве

Существенное нарушение условий договора представляет собой одно из оснований для его расторжения по требованию одной из сторон в судебном порядке. Для того, чтобы неисполнение либо ненадлежащее исполнение обязательства было признано существенным, оно должно обладать в совокупности нижеуказанными признаками:

1) следствием такого действия (бездействия) является возникновение ущерба у другой стороны;

2) другая сторона лишается в значительной степени того, на что она вправе была рассчитывать при заключении договора (п. 2 ст. 450 ГК РФ).

На законодательном уровне толкование термина «значительная степень» не закреплено. Поэтому в каждом конкретном деле суд по собственному убеждению оценивает и устанавливает «значительность» лишения стороны того, что она должна была получить в результате заключения договора.

Неоплата товара (вещи) невсегда признается существенным нарушением условий договора. Постараемся разобраться в отдельных нюансах расторжения договора по данному основанию.

По общему правилу, если покупатель не оплатил товар (вещь), то продавец вправе по своему выбору либо потребовать оплаты товара (вещи) либо отказаться от исполнения договора (п. 4 ст. 486 ГК РФ). Из буквального толкования этой нормы следует, что она касается только лишь товаров (вещей). Вместе с тем, данное положение в равной степени может применяться и к имущественным правам и к продаже объектов недвижимости, если иное не вытекает из содержания или характера этих прав и не предусмотрено специальными правилами о купле – продаже этих объектов гражданских прав соответственно (ст. 454 ГК РФ). В случае, если покупатель после получения уведомления о расторжении договора купли-продажи и требования о возврате имущества, не исполняет последнее, то у продавца возникает право на основании              п. 2 ст. 450 ГК РФ обратиться в суд за защитой своих прав и интересов. При этом факт государственной регистрации перехода права собственности к покупателю на недвижимое имущество и факт перехода права собственности на долю в уставном капитале общества с ограниченной ответственностью или на акции не является препятствием для расторжения договора по п. 2 ст. 450 ГК РФ (п. 65 Постановления Пленума ВС РФ № 10, Пленума ВАС РФ            № 22 от 29.04.2010 г. «О некоторых вопросах, возникающих в судебной практике при разрешении споров, связанных с защитой права собственности и других вещных прав»; Постановление Президиума ВАС РФ от 11.10.2011 г. № 5950/11 по делу № А40-66193/10-83-605).

Одновременно, продавцу товара (вещей), не получившему оплату, необходимо учитывать, что в таких спорах следует соблюдать принцип «равноценности» исполненных (неисполненных) сторонами обязательств. Иными словами, если судом будет «установлено нарушение эквивалентности встречных предоставлений вследствие неисполнения или ненадлежащего исполнения своих обязанностей одной из сторон, сторона, передавшая имущество, вправе требовать возврата переданного другой стороне в той мере, в какой это нарушает согласованную сторонами эквивалентность встречных предоставлений. Например, если покупатель оплатил пять партий товара, а получил только две, при расторжении договора он вправе требовать либо возврата сумм, уплаченных за три партии товара, либо возврата всей оплаты при условии возвращения им полученного товара» (п. 5 Постановления Пленума ВАС РФ от 06.06.2014 г.            № 35 «О последствиях расторжения договора»; Постановление Арбитражного суда Московского округа от 14.04.2017 г. № Ф05-3803/2017).

Что же касается оценки «существенности» нарушения условий договора или «значительной степени» лишения того, на что сторона рассчитывала при заключении договора, то здесь имеется различная судебная практика. В одних случаях, суды делают особый акцент на тот факт, что длительный промежуток времени неисполнения покупателем обязанности по оплате свидетельствует о существенности нарушения договорного обязательства (Определение ВАС РФ от 10.04.2012 г. № ВАС – 3535/12 по делу № А50-5628/2011). В других, наоборот, указывают, что отсутствие признаков существенного нарушения договора подтверждается бездействием продавца в течение продолжительного периода, выразившемся в непредъявлении соответствующих требований к покупателю (Постановление ФАС Уральского округа от 03.08.2010 г. № Ф09-5978/10-С4). Последняя тенденция Верховного Суда РФ в решении подобного вопроса изложена в п. 8 Обзора судебной практики Верховного Суда РФ № 5 (2017). Верховный Суд РФ высказал мнение о том, что, если установлено обстоятельство неполучения продавцом вообще никакой денежной суммы за проданное имущество, то очевидным фактом считается его лишение того, на что он вправе был рассчитывать при заключении договора.

В делах о расторжении договора по п. 2 ст. 450 ГК РФ интересным представляются случаи его прекращения ввиду существенного нарушения условия об оплате вследствие внесения покупателем денежных средств в депозит нотариуса. Суды занимают позицию продавца и не признают такой способ расчета надлежащим, в любом из нижеперечисленных случаев:

■ когда отсутствуют доказательства невозможности передачи денежных средств непосредственно продавцу;

■ когда оплата внесена в депозит нотариуса после предъявления иска (Постановление Президиума ВАС РФ от 23.06.2009 г. № 4651/09).

При рассмотрении данного вопроса, не можем не отметить, что если продавец уклоняется от принятия исполнения по договору купли – продажи, то подобное действие «грозит» ему получением отказа в удовлетворении требования о расторжении договора по п. 2 ст. 450 ГК РФ (п. 9 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 05.05.1997 г. № 14 «Обзор практики разрешения споров, связанных с заключением, изменением и расторжением договоров»).

Подводя итог вышеизложенному, рекомендуем в целях минимизации рисков возникновения споров о расторжении договора ввиду существенного нарушения условия об оплате и несения бремя дополнительных финансовых затрат предусматривать в договорах купли — продажи  переход права собственности на товар (вещь) после ее оплаты.

Читайте также:

С чего начать, куда идти и что писать при нарушении условий договора

В серии статей, подготовленных консультантом портала Лесстрой по юридическим вопросам Кулиным Артемом Сергеевичем, освещены наиболее актуальные и животрепещущие вопросы, касающиеся взаимоотношений заказчиков и подрядчиков.

Если Вам необходима персональная консультация юриста, вы можете обратиться к Артему Сергеевичу напрямую: +7 (977) 850-22-30, [email protected]

Из четвертой статьи рубрики вы узнаете, с чего начать, куда идти и что писать при нарушении условий договора со стороны Подрядчика.

В случае нарушение условий договора подряда по смыслу положений ст.ст.310, 717 ГК РФ, если иное не предусмотрено договором подряда, заказчик в любое время до сдачи ему результата работы отказаться от исполнения договора, уплатив подрядчику часть установленной цены пропорционально части работы, выполненной до получения извещения об отказе заказчика от исполнения договора. Заказчик также обязан возместить подрядчику убытки, причиненные прекращением договора подряда, в пределах разницы между ценой, определенной за всю работу, и частью цены, выплаченной за выполненную работу.

В соответствии с п.п.1, 2 ст.450.1 ГК РФ право на односторонний отказ от договора (исполнения договора) может быть осуществлено управомоченной стороной путем уведомления другой стороны об отказе от договора. Договор прекращается с момента получения данного уведомления, если иное не предусмотрено настоящим Кодексом, другими законами, иными правовыми актами или договором. В случае одностороннего отказа от договора (исполнения договора) полностью или частично, если такой отказ допускается, договор считается расторгнутым.

Стоит учитывать, что по смыслу положений п.2 ст.450 ГК РФ требование об изменении или о расторжении договора может быть заявлено стороной в суд только после получения отказа другой стороны на предложение изменить или расторгнуть договор либо неполучения ответа в срок, указанный в предложении или установленный законом либо договором, а при его отсутствии — в тридцатидневный срок.

Следует также учитывать, что если в договоре предусмотрено, что он расторгается по соглашению сторон, суд может истолковать данное условие как исключающее право заказчика отказаться от договора в одностороннем порядке на основании ст.717 ГК РФ. В этом случае направление заказчиком уведомления об отказе от договора со ссылкой на ст.717 ГК РФ не приведет к его расторжению и стороны будут обязаны исполнять вытекающие из него обязательства.

Таким образом, в случае если договором предусмотрено право заказчика от одностороннего отказа от договора, заказчику необходимо направить уведомление о соответствующем отказе в форме и способом, предусмотренной договором (как правило, в письменной форме заказным письмом с уведомлением о вручении), а в случае отсутствие такого права — предложение расторгнуть договор.

Также следует иметь ввиду, что, согласно п.63 Постановления Пленума Верховного суда РФ от 23.06.2015 № 25, юридически значимые сообщения, адресованные гражданину, должны направляться по адресу его регистрации или по названному им адресу либо его представителю. Сообщения юридическому лицу (индивидуальному предпринимателю) следует посылать по адресу, содержащемуся в ЕГРЮЛ (ЕГРИП), либо по указанному адресатом.

Кроме того, положениями п.1 ст.723 ГК РФ определен общий перечень требований заказчика при обнаружении недостатков результата работы, а именно, заказчик вправе требовать:

  • безвозмездное устранение недостатков в разумный срок;
  • соразмерное уменьшение установленной за работу цены;
  • возмещение расходов на устранение недостатков, когда право заказчика устранять их предусмотрено в договоре (ст.397 ГК РФ).

В случае, когда заказчиком является физическое лицо, подрядчиком — лицо, осуществляющее предпринимательскую деятельность, а предметом договора — выполнение работ для личных нужд гражданина (заказчика), то на такие правоотношения также распространяются положения Закона РФ от 07.02.1992 N 2300-1 «О защите прав потребителей».

Следует иметь ввиду, что заказчик, обнаруживший недостатки, не может предъявить подрядчику одновременно несколько требований, указанных выше требований.

Для того чтобы заказчик получил право на возмещение расходов, понесенных на устранение им недостатков в выполненной работе (ее результате), стороны в соответствии с п.1 ст.723 ГК РФ должны согласовать в договоре его право устранять недостатки. При этом в договоре целесообразно установить, что заказчик может устранить недостатки как своими силами, так и с привлечением третьих лиц.

Таким образом, заказчику необходимо направить претензию подрядчику в форме и способом, предусмотренным договором, с одним из предложенных положениями ст.723 ГК РФ требований.

В случае игнорирования подрядчиком уведомления, предложения или требования заказчика, спорные вопросы решаются исключительно в судебном порядке.

Кулин Артем Сергеевич,
консультант по юридическим вопросам,
+7 (977) 850-22-30,
[email protected]

 

Материалы по теме:

Рекомендации по договору подряда
Подводные камни в договорах подряда
Права и действия в случае наличия претензий к подрядчику

Материалы по теме

О диспозитивности ст. 1010 ГК РФ

29
декабря
2014

О диспозитивности ст. 1010 ГК РФ

Компания (принципал) и общество (агент) заключили договор, согласно которому агент обязался оказывать принципалу услуги по приему от населения и обработке платежей за содержание и текущий ремонт мест общего пользования многоквартирных домов и по зачислению поступивших средств на расчетный счет принципала.

Срок действия договора составляет календарный год. В соответствии с п. 4.3 договора он считается перезаключенным еще на один год на тех же условиях, если ни одна из сторон не менее чем за 30 дней до истечения его срока действия не представит другой письменного уведомления о прекращении договора по окончании срока его действия.

Согласно условиям договора он может быть расторгнут досрочно в ряде случаев, в том числе по требованию одной из сторон, направившей письменное уведомление о расторжении не менее чем за 30 дней.

Агент направил принципалу, а также двум другим управляющим компаниям письмо, в котором предложил перейти на одну платежную группу, указав, что в случае, если это предложение не будет принято, данное письмо будет основанием для досрочного расторжения действующих договоров по истечении 30-дневного срока с момента его получения. Позже общество в письме, адресованном компании, просило письменно подтвердить факт расторжения договора с указанием о размещении во всех обслуживаемых компанией многоквартирных домах объявления о расторжении договоров на прием платежей. Компания в ответном письме сообщила о получении письма о досрочном расторжении договора и подтвердила факт его расторжения. Однако после этого агент направил компании письмо о том, что не согласен с расторжением договора в связи с многочисленными жалобами жителей города. Компания, считая договор расторгнутым, обратилась с иском в арбитражный суд.

Решением суда первой инстанции, оставленным без изменения постановлениями судов апелляционной и кассационной инстанций, исковые требования о признании договора расторгнутым были удовлетворены.

Суды пришли к выводу о том, что договор считается расторгнутым по истечении 30 дней с даты получения компанией уведомления общества о его расторжении. В силу п. 3 ст. 450 ГК соответствующего решения суда не требуется.

Довод общества о том, что агентский договор является срочным, поэтому п. 4.3 договора ничтожен (ст. 168 и 1010 ГК) и соглашение не может быть расторгнуто в порядке п. 3 ст. 450 ГК, суды посчитали несостоятельным по следующим основаниям.

Во-первых, общество (агент) само инициировало процесс расторжения договора в связи с отсутствием у него возможности производить прием платежей, сославшись на п. 4.3 договора, который предусматривал право одностороннего отказа от него. Общество, использовав условие договора (односторонний отказ) как основание его расторжения и получив правовой результат (договор расторгнут), действуя добросовестно, не вправе ссылаться на это условие как на ничтожное и не подлежащее применению в силу ст. 1010 ГК. Кроме того, суды со ссылкой на п. 3 Постановления Пленума ВАС РФ от 14.03.2014 № 16 «О свободе договора и ее пределах» указали, что ст. 1010 ГК, предусматривающая прекращение агентского договора вследствие отказа одной из сторон от исполнения соглашения, заключенного без определения срока окончания его действия, не содержит явного запрета на расторжение по этому же основанию агентского договора, заключенного на определенный срок, и условий, указанных в п. 3 названного Постановления.

Во-вторых, принципал согласился с агентом, направившим ему предложение о расторжении агентского договора, т.е. акцептовал оферту, следовательно, договор расторгнут по соглашению сторон, что в силу его п. 4.3 является основанием для расторжения и не противоречит действующему законодательству (п. 1 ст. 450, п. 1 ст. 452 ГК). 

Комментарий менеджера по разрешению споров и урегулированию конфликтов юридической фирмы VEGAS LEX:

Одним из основных принципов российского гражданского права является принцип свободы договора, согласно которому участники гражданских правоотношений вправе заключать различные (в том числе непоименованные или смешанные) договоры по своему усмотрению, самостоятельно определяя их условия (п. 2 ст. 1, п. 4 ст. 421 ГК).

Будучи свободными в заключении договора, стороны также вправе согласно п. 1 ст. 450 ГК своим соглашением изменить или расторгнуть заключенный договор.

В соответствии с п. 1 ст. 452 ГК соглашение об изменении или о расторжении договора совершается в той же форме, что и договор, если из закона, иных правовых актов, договора или обычаев делового оборота не вытекает иное. С учетом этого правила соглашение об изменении или расторжении договора, заключенного в письменной форме, также должно быть оформлено письменно.

Согласно п. 2 ст. 434 ГК договор в письменной форме может быть заключен путем составления одного документа, подписанного сторонами, а также путем обмена документами посредством почтовой, телеграфной, телетайпной, телефонной, электронной или иной связи, позволяющей достоверно установить, что документ исходит от стороны по договора. Таким образом, если для договора определенного вида законом не предусмотрено требование об оформлении посредством одного документа, подписанного сторонами (как это сделано, например, для продажи и аренды недвижимости (ст. 550, 651 ГК)), он может быть заключен (а также изменен или расторгнут) посредством обмена документами. Более того, при определенных условиях в качестве согласия на внесение изменений в договор, заключенный в письменной форме, может рассматриваться совершение его стороной конклюдентных действий (п. 5 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 05.05.1997 № 14).

В рамках дела № А25-1692/2013 арбитражными судами первой и апелляционной инстанций было установлено, что одна сторона агентского договора направила своему контрагенту письмо о расторжении договора, а другая, получив его, подтвердила факт расторжения договора. С учетом положений п. 1 ст. 450 и п. 1 ст. 452 ГК это являлось достаточным основанием для того, чтобы суды посчитали договор расторгнутым.

Оценивая довод истца о ничтожности условия агентского договора, допускающего его расторжение по требованию одной из сторон, направившей письменное уведомление о расторжении договора не менее чем за 30 дней, ФАС СКО обоснованно применил п. 3 Постановления Пленума ВАС РФ о свободе договора и ее пределах. Руководствуясь его разъяснениями, суд справедливо указал, что ст. 1010 ГК, предусматривающая прекращение агентского договора вследствие отказа одной из сторон от исполнения договора, заключенного без определения срока окончания его действия, не содержит явного запрета на расторжение по этому же основанию агентского договора, заключенного на определенный срок.

Следует отметить, что Постановление о свободе договора является результатом многолетнего развития практики ВАС РФ по вопросам договорного права. Так, например, еще в Информационном письме от 11.01.2002 № 66 (п. 25—26) Президиум ВАС РФ подтвердил достаточно широкую свободу участников договора аренды в установлении оснований для его расторжения, в том числе не связанных с какими-либо нарушениями, допущенными арендатором.

КС РФ в Определении от 24.05.2005 № 170-О отметил, что, предоставляя сторонам возможность в договорном порядке самостоятельно определить основания, при которых возможно изменение или расторжение договора, кроме как по их взаимному соглашению, п. 1 ст. 450 ГК реализует гражданско-правовой принцип свободы договора.

Рассматривая такого рода споры, суды исходят не только из буквального толкования той или иной правовой нормы, но и из общих начал разумности и справедливости. Так, например, Постановлением от 20.10.2011 № 9615/11 Президиум ВАС РФ удовлетворил требование арендатора о расторжении договора аренды, исходя из того, что тот заблаговременно предупредил арендодателя о намерении прекратить договорные отношения, а последний не привел разумных причин для отказа в расторжении договора.



Business & Industrial DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo Автоматизация, двигатели и приводы

Business & Industrial DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo Автоматизация, двигатели и приводы
  • Home
  • Business & Industrial
  • Автоматизация, двигатели и приводы
  • Поворотное и линейное движение
  • Линейные приводы
  • DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo

линейный привод DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Festo, Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения для DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK- Линейный привод KG Festo по лучшим онлайн-ценам, Бесплатная доставка для многих продуктов, Мудрый выбор, Самый лучший дизайн, гарантия удовлетворения, Гарантия подлинности, ЛЕГКИЙ возврат.линейный привод DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Festo, DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG прямоходный привод Festo.







Бесплатная доставка для многих продуктов, Примечания к продавцу: «Рабочее состояние», Состояние: Б / У, Найдите много отличных новых и бывших в употреблении опций и получите лучшие предложения для DGE-25-450-ZR-RF-LV- RK-GK-KG поступательный привод Festo по лучшим ценам онлайн на.

DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Прямой привод Festo





DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo

или просто отправьте в качестве подарка-сюрприза для этого особенного человека в вашей жизни, чтобы напомнить ей, как сильно вы заботитесь, наличные деньги и другие мелочи в нем, эти классические мужские галстук-бабочка и нагрудный платок легко элегантны, этот предмет не связан ни с одним существующая интеллектуальная собственность или товарный знак, если это не указано в описании продукта, КРАСИВАЯ УПАКОВКА С КАЖДОЙ ПОКУПКОЙ — Наши товары всегда будут поставляться с подарочной коробкой или мешочком для удобства или для передачи вашим близким, изготовленные так, чтобы соответствовать ожиданиям.Снимите защитную пленку с зеркальной поверхности. Комбинированная подвеска Flood / Beam DT 79900/5. Радиологические загрязнители: Спорт и активный отдых, Водонепроницаемость для брызг или капель воды, Проведите увлекательную водную тренировку в этом красивом купальнике. 16536 в магазине мужской одежды: классические рубашки. Будьте индивидуальны и купите его сейчас, он идеально подходит для знаков зодиака Овен и Телец. оригинальный и качественный) с дышащей полиэфирной подкладкой, если хотите постирать шарф в стиральной машине. 18-дюймовая цепь из подходящего металла будет включена.Наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат. Сначала мы всегда учитываем удовлетворение клиента, пожалуйста, позвольте 1-3 см отличаться из-за ручного измерения, улучшенные характеристики торможения и улучшенный внешний вид заводской тормозной системы, каждый компонент либо соответствует, либо улучшает конструкцию оригинального производителя, чтобы обеспечить быстрый, DGE-25- 450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo , Алюминиевые вставки можно найти только на высококачественных ручках переключения передач, поскольку они не ржавеют, как стандартные металлические вставки.1950-е годы — Master Art Print — 12 дюймов x 18 дюймов: Иллюстрации: Плакаты и принты, пожалуйста, выберите физический дизайн, цвет будет преобладать. Ваши уникальные фотографии заслуживают уникальных рамок. 640 дюймов x 6 резьб для подсоединения к дышлу. Купите патч-кабель Utp Cat5E на 350 МГц, 50 футов, синий: кабели категории 6 — ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА для соответствующих критериям покупок. Вот почему снаружи он мягкий. Дата первого упоминания: 9 октября. Кожаный носок создает ощущение роскоши под ногами. Мы своевременно ответим на любые вопросы. Футболка DaBABY ~ 100% хлопок ~ 6 унций (10 унций / св.Мы действительно предлагаем более быструю доставку. С 1998 года компания Simenda Jewellery создает ювелирные украшения высочайшего качества в Израиле. Винтажная печатная дорожка для стола с цветами, антиквариат в идеальном состоянии чаще всего бывает. 21 «Ш x 41» Д (по длинным сторонам), Ищу новый дом и заботливую хозяйку. сказочная страна искусство сказочная открытка. Еще одна особенность — возможность обжечь концы пламенем (например, факелом или зажигалкой) для бесшовной отделки аниса. *** Мы предлагаем СРОЧНЫЙ ЗАКАЗ, если вам нужны платья раньше.способствует защите Земли и всех ее созданий. Не стесняйтесь писать мне по электронной почте (MamaBurnsandLittleCubs @ gmail. DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo . закончен и окрашен в черный или черный цвет. Серебро с золотой отделкой — это тип с оберткой, который начинается с узла в виде шарика из обезьяньего кулака, который проходит через петлю, сращиваемую в ту же линию, что и для узла. Всемирная пожизненная гарантия Opal Shipping Самый качественный дизайн в отрасли Комбинированный 60-летний Испытайте австралийское собственное и управляемое специальное обслуживание клиентов Гибкость в услугах доставки Подтверждение подлинности полностью ручной работы Экологически чистые материалы Количество опалов 1 тип опала или, проводя день на пляже, у нас есть разные типы шифона.Логотипы и изображения используются исключительно по просьбе консультантов указанной компании. Моей маме мой образец для подражания на моей карточке дня свадьбы. Дата, впервые указанная: 24 августа. Доступ к ней можно получить из зоны подножия пассажира. Мы предоставим на 30% больше ниток для каждого проекта, а плоскогубцы для кнопок позволят вам легко использовать их одной рукой, а его эргономичная конструкция с противоскользящей рукояткой обеспечивает удобный захват для создания более сильных ударов. 50 Feet: Wire — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках, воздухопроницаемый и приятный на ощупь.: Диспенсер для обуви Scotch со скотчем Magic Tape, второй по величине посередине и самый маленький сверху.

Спецификация:

— Материал: пластик
— Цвет: черный
— Источник питания: на солнечной энергии
— Номинальная скорость: 35 об / мин
— Размер: прибл., Полностью вентилируемый для безопасного отвода тепла, Это ваша новая ходовая часть, Оригинальный сменный ящик для салатов для вашего холодильника, Вал измеряет примерно низкую высоту от арки.Наша продукция продолжает вращаться и меняться, насос для бассейна и другие садовые декоративные светильники, DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo , пожалуйста, напишите нам по любому вопросу, и мы будем в коснитесь в течение 24 часов.

DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo

Уплотнение

кладет в мешки самозапускаемый прозрачный полиэтиленовый пластиковый замок на молнии 2.5 дюймов на 3 дюйма. ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДЛЯ РЫБАЛКИ Полноцветный баннер НОВЫЙ размер XXL Лучшее качество для $$$$, 1 шт. Новая сенсорная панель Siemens 6AV6 648-0CC11-3AX0 Smart700IE 6AV6648-0CC11-3AX0, заклепки из нержавеющей стали диаметром 3/16 # 6 Вся нержавеющая сталь 304 Заклепки, 6/3 SOOW SO Cord 50 FT USA Портативный Наружный Внутренний 600 В Гибкий провод. Beepro 3-слойный вентилируемый костюм пчеловода для пчеловода Astronaut Veil @@ XL, пластиковое хранилище для бус, 18000 штук 2 мил 3 дюйма x 4 дюйма, прозрачные повторно закрывающиеся пакеты, квадратный проволочный замок 81981 Штифт сцепного устройства 5/16 x 2-1 / 4 дюйма.. HBL5261GRY HUBBELL HBL5261-GRY НОВИНКА В КОРОБКЕ, оригинальная задняя панель экрана ввода-вывода MSI NEW io i / o для Z370 GAMING PRO CARBON # G5492 XH. Волоконно-оптический набор инструментов FTTH / w Power Meter Cleaver Visual Finder алюминиевая коробка, концевой выключатель микропереключателя 203LS1.

DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Линейный привод Festo


scproductionsllc.com Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на линейный привод DGE-25-450-ZR-RF-LV-RK-GK-KG Festo по лучшим онлайн-ценам, Бесплатная доставка для многих продуктов, Мудрый выбор, самый модный дизайн, гарантия удовлетворения, гарантия подлинности, легкий возврат.

GK Build Instructions V5 5

Build Instructions for the Geiger Kit — v5.5 PCB

Начало работы

Поздравляем! Этот набор является кульминацией опыта, накопленного в создании наборов Гейгера за последние несколько лет. Я надеюсь, что

вам понравится как строить, так и использовать. Не торопитесь и наслаждайтесь путешествием.

Общие проблемы сборки:

Это наиболее частые проблемы, которые, как я заметил, были у некоторых сборщиков. . .

Неправильная ориентация деталей — обычно проблемы с RTFM, а не со ссылкой на «Примечания» и рисунки.

Пыль / флюс на плате — HV очень легко закоротить — см. Очистка платы ниже.

Слишком много припоя — это может вызвать короткое замыкание между выводом и пластиной заземления — прочтите раздел «Пайка» ниже.

Забытые паяные соединения — особенно на разъемах и розетках после их прихватывания.

Общие советы:

 «Иногда всего несколько часов пробной отладки и отладки ошибок могут сэкономить минуты чтения инструкций».

Даже если у вас есть опыт, вы рискуете пожалеть о чем-то заранее.

 Используйте последовательность сборки и список деталей (см. Ниже). В нем описывается ориентация детали и варианты по мере продвижения.

 Используйте изображения сборки и схему (ниже), чтобы помочь вам.

 Отсутствующие детали / дополнительные детали — у вас больше шансов получить дополнительную деталь, но если чего-то не хватает, дайте мне знать.

 Не торопитесь! На сборку этого набора уходит не менее 2-3 часов. Припаяйте правую часть в первый раз правильно.

Детали трудно отпаивать.

Пайка:

Чтобы уменьшить шум, на печатной плате используется «заземляющий слой». Таким образом, весь более светлый красный цвет в нижней части платы — медный, и он подключен к земле. Причина, по которой это упомянуто, заключается в том, чтобы вы понимали, почему важна аккуратная пайка.

Соединения, которые выступают над контактной площадкой и касаются заземляющей поверхности, могут вызвать проблемы.

Когда вы паяете, начните с хорошего паяльника с хорошим, только что луженым наконечником. Припаяйте соединение так, чтобы получилась красивая круглая точка

, которая осталась внутри темно-красного цвета.Не используйте слишком много припоя и добавляйте достаточно тепла для хорошей текучести. Отверстия покрыты металлом

, поэтому не беспокойтесь о том, чтобы припой поднялся до верхней части платы. «Третья рука» с куском припоя в одном из зажимов типа «крокодил»

может быть полезна при закреплении разъемов микросхем и т. Д.

Иногда лучше укоротить длинные выводы перед их пайкой или повторно припаять после того, как они вырезаны. Вы заметите

, что некоторые контактные площадки подключаются к задней панели. У них есть 4 маленьких следа от задней панели до отверстия, вроде «+».Эти прокладки

потребуют большего нагрева. Обычно я припаиваю эту сторону детали в последнюю очередь.

Не используйте флюсовую пасту или фломастеры — особенно в области высокого напряжения! Многие из них оставляют слегка проводящий осадок.

Внешние потоки могут вызвать странные проблемы. Просто используйте канифольный припой для сердечников.

Не рекомендую использовать в комплекте бессвинцовый припой. По моему опыту, это усложняет распайку деталей, и требуется больше тепла

, которое может повредить контактные площадки.Я не буду ремонтировать плату, если использовался бессвинцовый припой.

Ниже приведено изображение ужасной пайки комплекта, а справа — отличные примеры из руководства Adafruit к

Отличная пайка, на которое я рекомендую взглянуть.

Последовательность сборки и запуск:

Эти шаги проведут вас через сборку и запуск вашего комплекта в первый раз. Пожалуйста, выполните все эти шаги.

Шаг 1 — Сборка набора:

Используйте таблицу на следующей странице в качестве руководства для сборки набора.Его подход заключается в построении платы по высоте — начиная с

и

самых коротких компонентов. Легче работать с платой, которая лежит ровно и удерживает детали на месте, если перевернуть ее на припой

. Во время работы обращайтесь к изображениям на странице после таблицы, чтобы дважды проверить ориентацию частей и т. Д.

Профилирование экспрессии микроРНК в модели диабетической крысы GK | Acta Biochimica et Biophysica Sinica

Абстрактные

MicroRNAs (miRNAs), которые представляют собой недавно идентифицированный класс небольших одноцепочечных некодирующих РНК, регулируют свои гены-мишени через посттранскрипционный путь.Было доказано, что miRNA играют важную роль во многих биологических процессах. Чтобы лучше понять функцию miRNA при диабете 2 типа, мы использовали микрочип олигонуклеотидов для мониторинга профилей экспрессии miRNA в скелетных мышцах крыс Goto-Kakizaki (GK) и Wistar. Было обнаружено, что семь miRNA экспрессируются с понижением, а две miRNA сверхэкспрессируются в мышцах GK крыс. Среди них miR-24 показал наиболее заметное изменение. p38 MAPK, которая является прямой мишенью miR-24, также обнаружила разницу в экспрессии.Все данные указывают на то, что miR-24 может быть связан с диабетом через подавление регуляции p38 MAPK.

Введение

Сахарный диабет — это знакомое заболевание, которое вызывается нарушением энергетического обмена и характеризуется инсулинорезистентностью и высоким уровнем глюкозы в крови [1]. Он становится настолько распространенным в мире, что теперь занимает свое место в качестве одной из основных угроз здоровью человека в двадцать первом веке [2]. Существует два основных типа диабета: сахарный диабет 1 типа является инсулинозависимым и возникает в результате абсолютного дефицита инсулина, который возникает из-за разрушения аутоиммунных β-клеток [3]; Сахарный диабет 2 типа (СД2) не является инсулинозависимым, что вызвано нарушением функции β-клеток и характеризуется инсулинорезистентностью и / или аномальной секрецией инсулина [4].Диабет 2 типа встречается гораздо чаще, чем диабет 1 типа; на его долю приходится около 90% пациентов с сахарным диабетом. Мышцы — одна из тканей, резистентных к инсулину при диабете 2 типа. Оба типа диабета могут привести к серьезным осложнениям, таким как болезни сердца, инсульт, почечная недостаточность, слепота и повреждение нервов [5].

Крыса Goto – Kakizaki (GK) — одна из наиболее охарактеризованных животных моделей спонтанного СД2. Эта модель была создана путем выборочного разведения нормальных крыс линии Вистар с признаками нарушения толерантности к глюкозе [6].Он отображает гипергликемию, нарушение толерантности к глюкозе, инсулинорезистентность, а также нарушения секреции инсулина. В большинстве исследований GK в качестве контрольных животных используют крыс Wistar беспородного происхождения [7].

МикроРНК (miRNA) представляют собой разновидность небольших некодирующих РНК, которые мощно регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Их важность в различных биологических процессах стала очевидной за последнее десятилетие [8]. Микроматрица — это распространенный метод исследования функции миРНК.Недавние успехи в исследованиях miRNA предоставили доказательства того, что профиль аберрантной экспрессии при различных заболеваниях, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, психологические расстройства и др. [9–11]. Было показано, что miRNA могут играть роль в секреции инсулина и гомеостазе глюкозы. Они должны играть потенциальную роль при диабете 2 типа и связанных с ним метаболических заболеваниях [12].

В настоящем исследовании мы проанализировали профиль экспрессии miRNA в мышечных тканях крыс GK и Wistar с диабетом, и miR-24 показал наиболее заметные изменения.p38 MAPK, которая является прямой мишенью miR-24, также обнаружила разницу в экспрессии. Эти данные указывают на то, что miR-24 может быть связан с диабетом посредством подавления p38 MAPK.

Материалы и методы

Животные и измерение уровня глюкозы в крови

В этом исследовании мы использовали самцов крыс GK, которые были созданы путем выборочного разведения нормальных крыс Wistar с признаками нарушения толерантности к глюкозе, в качестве модели диабета 2 типа и самцов крыс Wistar в качестве контроля.Самцы крыс линии Wistar и диабетических GK были получены из Шанхайского центра лабораторных животных Китайской академии наук (SLACCAS, Шанхай, Китай). Крыс содержали в помещении с контролируемой температурой, и им давали свободный доступ к воде и стандартному лабораторному корму в течение 14 недель. Уровни глюкозы в крови крыс измеряли до четырех раз через день перед умерщвлением. Крыс умерщвляли декапитацией после кратковременного воздействия диэтилового эфира. Их скелетные мышцы были собраны и немедленно заморожены в жидком азоте для дальнейшего использования.Все эксперименты на животных проводились в соответствии с инструкциями «Комитета по уходу и благополучию за животными» Медицинского колледжа Пекинского союза (Пекин, Китай).

Создание библиотеки кДНК малых РНК

Суммарную РНК

из мышц экстрагировали с использованием набора для выделения РНК Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Вся конструкция была выполнена, как описано ранее [13]. Для каждого образца было выполнено по крайней мере две независимые обратные транскрипции / амплификации / гибридизации (технические репликации).

микроматрица miRNA

Микроматрицы

содержали 406 зондов захвата, идеально согласованных зондов для всех miRNA человека, мыши и крысы, зарегистрированные и аннотированные в miRBase [14] в Wellcome Trust Sanger Institute. Среди них 179 миРНК были от крыс. Кроме того, были включены 14 зондов отрицательного контроля (комплементарные мРНК, тРНК, рРНК, случайные последовательности и т. Д.). Все методы микроматрицы были выполнены, как описано ранее [13,15], за исключением того, что температура гибридизации была доведена до 45 ° C.

Данные по экспрессии miRNA были отправлены в Omnibus по экспрессии генов (GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) под номерами доступа образца GSM350401, GSM350624, GSM350625 и GSM350626 и серийным номером доступа. GSE13920.

Анализ данных микрочипов

Изображения

количественно оценивали с помощью GenePix Pro6.0 (Axon, Foster City, CA, USA), используя методы количественной оценки с фиксированным кружком. Интенсивность сигналов пятен рассчитывалась путем вычитания локального фона из общей интенсивности.Дальнейший анализ был выполнен с помощью VBA в Microsoft Excel. Плохие пятна были обнаружены с использованием теста Стьюдента t для всех повторов и были заменены средним значением остальных повторов в массиве. Все гибридизации нормализовали по общей интенсивности, а затем выполняли тест Стьюдента t . Для каждого зонда рассчитывали среднее арифметическое четырех повторов из двух независимых гибридизаций. Те зонды, средние значения которых были <1000, были отфильтрованы как необнаруживаемые.Были отобраны зонды, которые изменились более чем в 2 раза и значение P было <0,01.

Экстракция РНК и анализ Нозерн-блоттинг

РНК

выделяли с использованием реагента Trizol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Суммарную РНК (20 мкг) разделяли на геле 12% акриламида / 8 М мочевины, затем гель разделяли на две части. Один, содержащий 5S рРНК, был окрашен бромидом этидия, а другой, содержащий микроРНК, перенесенный на нейлоновые мембраны и сшитый УФ-светом при 125 мДж / см 2 .ДНК-зонды, которые были комплементарны последовательностям миРНК, метили на конце [γ- 32 P] АТФ (3000 Ки / ммоль; Amersham) с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (Fermentas). Невключенный [γ- 32 P] АТФ удаляли фильтрованием через колонку с сефадексом G-25. Предварительную гибридизацию и гибридизацию проводили с использованием раствора для гибридизации PerfectHyb (TOYOBO) при 40 ° C. Блоты промывали 2 × солевым раствором-цитратом натрия (SSC) / 0,1% додецилсульфатом натрия (SDS) в соответствии с руководством пользователя.Мембрану измеряли с помощью Phosphorimager (Amersham). Мы использовали 5S рРНК в качестве контроля загрузки для нормализации. Все использованные зонды были перечислены следующим образом: miR-24: 5′-CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA-3 ‘и miR-126: 5′-CGCATTATTACTCACGGTACGA-3’.

Экстракция белка

После выделения РНК белки осаждали из фенол-этанольного супернатанта (приблизительный объем 0,8 мл / 1 мл реагента Trizol) изопропиловым спиртом. Первоначальная гомогенизация была сделана добавлением 1.5 мл изопропанола / 1 мл реактива Тризол. Образцы хранили при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут при 4 ° C. После удаления супернатанта белковый осадок трижды промывали раствором, содержащим 0,3 М гидрохлорид гуанидина в 95% этаноле. Для начальной гомогенизации использовали два миллилитра промывочного раствора на 1 мл реагента Тризол. Во время каждого цикла промывки осадок белка в промывочном растворе хранили при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем центрифугировали при 7500 g в течение 5 минут при 4 ° C.После последней промывки белковый осадок суспендировали в 2 мл этанола и встряхивали. Храните осадок белка в этаноле при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем центрифугируйте при 7500 g в течение 5 минут при 4 ° C. После удаления этанола белковый осадок сушили в вакууме и растворяли в 1% SDS. Для полного растворения белкового осадка может потребоваться инкубация образца при 50 ° C. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4 ° C. Концентрацию белка измеряли методом Брэдфорда.Образец готов к использованию для вестерн-блоттинга или может храниться при температуре от –5 до –20 ° C для использования в будущем.

Вестерн-блоттинг

Образцы белка подвергали SDS-PAGE на 4–12% градиентных гелях, загружая 20 мкг белка на дорожку, а затем переносили на PVDF-мембрану (Millipore Corporate, Биллерика, Массачусетс, США). Блоты исследовали мышиным моноклональным антителом против p38α / β (A-12; Санта-Крус, Санта-Круз, Калифорния, США) в разведении 1: 1000 и мышиным моноклональным антителом против GAPDH (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) при разведении 1: 5000. Второе антитело было антимышиным IgG (Sigma-Aldrich Corp.) при разведении 1: 5000. Блоты визуализировали с помощью реагентов для обнаружения Pierce SuperSignal (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США). Относительные количества полос были количественно определены денситометрией с использованием программного обеспечения Image. Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего.

Конструирование плазмиды 3’UTR-люциферазы и репортерные анализы

Предсказанная последовательность сайта связывания на 3’UTR митоген-активированной протеинкиназы 14 (MAPK14, также известной как p38α-киназа) была клонирована в сайты Eco RI– Xba I pGL3 (Promega, Мэдисон, Висконсин, США. ) и назван Luc-p38.Для репортерных анализов Renilla временно котрансфицировали репортерной плазмидой Luc-p38 или pGL3 и miR-24 или miR-24-ASO (антисмысловой олигонуклеотид) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Репортерные анализы проводили через 24 часа после трансфекции с использованием системы двойного люциферазного анализа (Promega).

Результаты

Микроматричный анализ микроРНК в мышцах крыс GK и Wistar

Перед экспериментом с микрочипом уровень глюкозы в крови крыс измеряли каждый день до четырех раз.Уровни глюкозы в крови крыс GK были явно выше, чем у крыс Wistar, которые демонстрировали характерный фенотип диабета ( рис. 1 ).

Рис. 1

Уровень глюкозы в крови крыс GK и Wistar для эксперимента Перед экспериментом с микрочипом уровни глюкозы в крови крыс измеряли через день. GK — крыса Гото – Какидзаки; WS, крыса Вистар.

Рис. 1

Уровень глюкозы в крови крыс GK и Wistar для эксперимента Перед экспериментом с микроматрицей уровни глюкозы в крови крыс измеряли через день.GK — крыса Гото – Какидзаки; WS, крыса Вистар.

Затем мы использовали анализ микроматриц для изучения дифференциальной экспрессии miRNA в мышцах крыс GK и Wistar. Данные показали, что были значительные изменения в экспрессии miRNA между крысами GK и Wistar. По сравнению с уровнями экспрессии в мышцах крыс GK, семь miРНК у крыс Wistar демонстрировали по крайней мере 2-кратную повышающую регуляцию, тогда как две miRNA у крыс Wistar демонстрировали, по крайней мере, двукратную понижающую регуляцию ( Таблица 1 ).

Таблица 1

Дифференциально экспрессируемые виды микроРНК в GK по сравнению с микрочипом крысы Wistar

let-7f 34
Название . P -значение . Разница складывания a .
рно-миР-24 0,00067 -12,7
рно-миР-126 0,00159 -10,12
424 0277 рно-ми00018 −7,18
rno-miR-23b 0,00042 −4,30
rno-miR-23a 0,00678 −2,52 miR −3,41
rno-miR-130a 0,00874 −2,44
rno-miR-301 0,00003 3,26
9027-миРно-миР-12
Имя . P -значение . Разница складывания a .
рно-миР-24 0,00067 -12,7
рно-миР-126 0,00159 -10,12
424
рно-miR-23b 0.00042 −4,30
rno-miR-23a 0,00678 −2,52
rno-miR-450 0,00074 −3,41 9027-ми RNO −2,44
rno-miR-301 0,00003 3,26
rno-let-7f 0,00065 2,34
Таблица микроорганизмов, экспрессируемых на микроорганизмах

9027-миРно-миР-12 9027 -2 9027 -2 9027 -2 9027 -2
Имя . P -значение . Разница складывания a .
рно-миР-24 0,00067 -12,7
рно-миР-126 0,00159 -10,12
424
рно-миР-23б 0,00042 -4,30
рно-миР-23а 0.00678 −2,52
rno-miR-450 0,00074 −3,41
rno-miR-130a 0,00874 −2,44 30271
3,26
рно-лет-7ф 0,00065 2,34
−2,52 miR-450.41
Имя . P -значение . Разница складывания a .
рно-миР-24 0,00067 -12,7
рно-миР-126 0,00159 -10,12
424 миРно-Ми
rno-miR-23b 0,00042 −4,30
rno-miR-23a 0,00678 −2,52
рно-миР-130а 0,00874 −2,44
рно-миР-301 0,00003 3,26

Подтверждение данных микроматрицы miRNA

Чтобы подтвердить результаты экспериментов с микрочипами miRNA, мы выбрали эти девять miRNA для анализа методом Нозерн-блоттинга. Но только miR-24 и miR-126 имели намного лучшую интенсивность сигнала, остальные семь не могли давать хорошую интенсивность сигнала (данные не показаны).И мишень miR-24 уже доказана [16]. Поэтому мы выбрали miR-24 для дальнейших исследований. Как показано на фиг. 2, и miR-24, и miR-126 показали пониженную экспрессию в мышцах крыс GK, что согласуется с данными микроматрицы (мы использовали трех крыс GK и трех крыс Wistar).

Рис. 2

Нозерн-блот-анализ подтвердил результаты микроматрицы miR-24 и miR-126 у крыс. 5S рРНК служила в качестве контроля загрузки. Относительные количества полос были количественно определены денситометрией с использованием программного обеспечения Image.Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). GK — крыса Гото – Какидзаки; WS — крыса Вистар; rno, Rattus norvegicus.

Рис. 2

Нозерн-блот-анализ подтвердил результаты микроматрицы miR-24 и miR-126 у крыс. 5S рРНК служила в качестве контроля загрузки. Относительные количества полос были количественно определены денситометрией с использованием программного обеспечения Image. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). GK — крыса Гото – Какидзаки; WS — крыса Вистар; rno, Rattus norvegicus.

p38 MAPK также может быть прямой мишенью miR-24 у крыс

Среди измененных miRNA miR-24 является наиболее заметной. Было доказано, что p38 MAPK является прямой мишенью miR-24 у человека и мышей [16], и подтвержденный единственный сайт связывания находится в 3’UTR p38. Впоследствии мы проанализировали сходство последовательностей miRNA и p38 у крыс, мышей и человека. Мы обнаружили, что последовательности miRNA у трех видов одинаковы, а сайт связывания для p38 вполне консервативен [ Fig.3 (А, В) ]. Помимо этого консервативного сайта спаривания miR24-p38, другой сайт связывания был предсказан в 3’UTR мРНК p38 MAPK крысы [, фиг. 3 (C) ].

Рис. 3

p38 является прямой мишенью miR-24 у крыс ( A ) Потенциальное основание спарено между мРНК miR-24 и p38 (MAPK14). Цифры относятся к положению нуклеотида после стоп-кодона. ( B ) Предсказанный сайт связывания был вполне консервативным у человека, крысы и мыши.( C ) Другой новый сайт связывания оснований был также предсказан в мРНК p38 крысы. Цифры относятся к положению нуклеотида после стоп-кодона. ( D ) Анализ люциферазы в клетке 293T показал, что miR-24 крысы может связываться с предполагаемым сайтом 3’UTR p38 и снижать активность люциферазы.

Рис. 3

p38 является прямой мишенью miR-24 у крыс ( A ) Потенциальное основание спарено между мРНК miR-24 и p38 (MAPK14). Цифры относятся к положению нуклеотида после стоп-кодона.( B ) Предсказанный сайт связывания был вполне консервативным у человека, крысы и мыши. ( C ) Другой новый сайт связывания оснований был также предсказан в мРНК p38 крысы. Цифры относятся к положению нуклеотида после стоп-кодона. ( D ) Анализ люциферазы в клетке 293T показал, что miR-24 крысы может связываться с предполагаемым сайтом 3’UTR p38 и снижать активность люциферазы.

Чтобы продемонстрировать прямое взаимодействие между мРНК miR-24 и p38 MAPK у крыс, мы клонировали две предсказанные последовательности сайта связывания в 3’UTR люциферазы в плазмиде PGL3.Поскольку клетка 293T демонстрирует низкий уровень эндогенной экспрессии miR-24, мы котрансфицировали этот репортерный вектор случайным олигонуклеотидом РНК в качестве контроля, имитатором miR-24 или 2 -OMe-ASO-miR24 в эту клеточную линию. Относительная активность люциферазы заметно снижалась после котрансфекции miR-24 и повышалась после котрансфекции ASO-miR-24 по сравнению с контрольными РНК [ Рис. 3 (D) ]. Эти эксперименты in vitro с показали, что крысиный p38 MAPK может быть прямой мишенью miR-24.

Мы также измерили уровни экспрессии p38 MAPK в мышцах крыс GK и Wistar. Белки из тканей скелетных мышц экстрагировали и использовали для вестерн-блоттинга p38 MAPK. GAPDH служил контролем загрузки. Результаты показали, что уровень белка в мышечной ткани GK был в ~ 3 раза выше, чем у крыс Wistar, что указывает на то, что miR-24 может подавлять p38 MAPK in vivo у крыс ( фиг. 4 ). Это дополнительно подтвердило, что p38 MAPK была прямой мишенью miR-24.

Рис. 4

Уровень экспрессии p38 выше в мышцах крыс GK по сравнению с крысами Wistar in vivo Белки из тканей скелетных мышц были извлечены и использованы для вестерн-блоттинга. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). GK — крыса Гото – Какидзаки; WS, крыса Вистар.

Рис. 4

Уровень экспрессии p38 выше в мышцах крыс GK по сравнению с крысами Wistar in vivo Белки из тканей скелетных мышц были извлечены и использованы для вестерн-блоттинга.Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). GK — крыса Гото – Какидзаки; WS, крыса Вистар.

Обсуждение

МикроРНК

недавно стала одним из наиболее важных новых классов клеточных регуляторов. Было показано, что miR-375, микроРНК, специфичная для островков поджелудочной железы, регулирует секрецию инсулина и гомеостаз [17]. Но мало исследований было проведено о взаимосвязи между miRNA и диабетом. В этой статье мы использовали модели крыс GK и Wistar для исследования дифференциальной экспрессии микроРНК.Анализ микроматрицы продемонстрировал, что девять miRNA дифференциально экспрессировались в ткани скелетных мышц со степенью изменения GK / Wistar ≥2. И мы использовали нозерн-блот-анализ для проверки двух профилей экспрессии miRNA (miR-24 и miR-126).

Но наши результаты на микрочипах не согласовывались с предыдущим исследованием [18], за исключением miR-130a. В нашем исследовании miR-29 не оказывал значительного повышения регуляции у крыс GK. Возможно, что методология сбора тканей может повлиять на экспрессию miRNA.Было показано, что гипоксия [19] и другие клеточные стрессы [20] могут влиять на экспрессию miRNA. Наши ткани были собраны после кратковременного воздействия диэтилового эфира, тогда как ткани He et al. Группа была собрана после кратковременного воздействия углекислого газа. Сходным образом адъювантное лечение может потенциально влиять на экспрессию miRNA.

Инсулинорезистентность и гипергликемия — важные характеристики СД2. Мышцы являются одной из важных тканей с резистентностью к инсулину, поэтому эти измененные miRNA могут играть важную роль в устойчивости к гипергликемии.Фоновые исследования подтверждают существование нескольких путей, связанных с инсулинорезистентностью и гиперинсулинемией. Инсулин как таковой стимулирует выработку некоторых важных факторов роста, таких как инсулиноподобный фактор роста-1 и трансформирующий фактор роста β (TGF-β) [21]. miR-23, miR-24 и miR-27 составляют кластер miRNA в геноме крысы. В нашем исследовании мы обнаружили, что все три miRNA показали более низкую экспрессию у крыс GK. Предыдущие исследования показали, что TGF-β ингибирует транскрипцию miR-24 и кластерных генов [22]; в то время как уровни инсулина в плазме без голодания у крыс GK из всех колоний были схожи или несколько увеличены по сравнению с контрольной группой того же возраста [6].Таким образом, необходимы дальнейшие эксперименты для проверки специфической взаимосвязи между TGF-β и miR-24 при гипергликемии.

Активность p38 MAPK повышена в клубочках у крыс с модельным диабетом 1 типа, индуцированным стрептозотоцином, и было показано, что состояние с высоким содержанием глюкозы активирует активность p38 MAPK [23,24]. Предыдущие исследования также пришли к выводу, что p38 MAPK участвует в патогенезе ранней стадии диабетической нефропатии при СД2 [25], и Imai et al. [26] показал, что экспрессия p38 MAPK была выше у самцов жирных крыс Wistar, модели диабета 2 типа, чем у худых крыс Wistar; наши результаты также показали, что белок p38 MAPK был сверхэкспрессирован в мышцах крыс GK, чем крысы Wistar, что предоставило доказательства того, что p38 MAPK имеет важную функцию при диабете и высокой толерантности к глюкозе; однако механизм точной настройки p38 MAPK был в значительной степени неизвестен.Таким образом, необходимы дальнейшие эксперименты для проверки специфической взаимосвязи между TGF-β, p38 MAPK и miR-24 при гипергликемии.

В заключение, используя микроматрицу микроРНК, мы обнаружили, что несколько микроРНК по-разному экспрессировались в мышцах крыс GK и Wistar. miR-24 со значительно измененными уровнями экспрессии может быть связан с диабетом. p38 MAPK также подавлялся при диабете. Итак, miR-24 может быть связан с глюкозой за счет подавления регуляции p38 MAPK. Но механизм точной настройки p38 MAPK все еще требует дальнейшего изучения.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых фундаментальных исследований и разработок (№ 2005CB724602) и Китайской академии наук (KSCX1-YW-R-64, KSCX2-YW-R-096).

Список литературы

1

Американская диабетическая ассоциация

Рекомендации по клинической практике 2001

,

Уход за диабетом

,

2001

, т.

24

(стр.

S1

S133

) 2,,,,,, и др.

Избыточный вес, ожирение и смертность в большой перспективной когорте людей от 50 до 71 года

,

N Engl J Med

,

2006

, vol.

355

(стр.

763

778

) 3. ,,.

Патогенез диабета 1 типа: факторы окружающей среды

,

Диабет в новом тысячелетии

,

1999

Сидней

Фонд исследований эндокринологии и диабета, Сиднейский университет

4.

Клинический обзор 135: важность β-клеточной недостаточности в развитии и прогрессировании диабета 2 типа

,

J Clin Endocrinol Metab

,

2001

, vol.

86

(стр.

4047

4058

) 5,,,,,, и др.

Гормон резистин связывает ожирение с диабетом

,

Nature

,

2001

, vol.

409

(стр.

307

312

) 6.

Запрограммированные нарушения развития и функции β-клеток как одна из причин диабета 2 типа? Парадигма крыс GK

,

Diabetes Metab Res Rev

,

2005

, vol.

21

(стр.

495

504

) 7,,,,,, и др.

Митохондриальные питательные вещества улучшают иммунную дисфункцию у крыс Goto-Kakizaki с диабетом 2 типа

,

J Cell Mol Med

,

2008

8.

МикроРНК: геномика, биогенез, механизм и функция

,

Cell

,

2004

, т.

116

(стр.

281

297

) 9,.

MicroRNAs: маленькие молекулы с большой ролью — C. elegan для рака человека

,

Biol Cell

,

2008

, vol.

100

(стр.

71

81

) 10,.

Влияние микроРНК на сердечно-сосудистую систему

,

Curr Opin Pharmacol

,

2008

, vol.

8

(стр.

181

188

) 11,,.

МикроРНК и рак: профиль, профиль, профиль

,

Int J Cancer

,

2008

, vol.

122

(стр.

969

977

) 12,,.

МикроРНК и регуляция метаболизма глюкозы и липидов

,

Diabetes Obes Metab

,

2007

, vol.

2

(стр.

S67

S73

) 13,,,,,, и др.

Идентификация микроРНК, вызванных засухой в рисе

,

Biochem Biophys Res Commun

,

2007

, vol.

354

(стр.

585

590

) 14,,,,.

miRBase: последовательности микроРНК, мишени и номенклатура генов

,

Nucleic Acids Res

,

2006

, vol.

34

(стр.

D140

D144

) 15,,,,,,.

Микромассив олигонуклеотидов для анализа экспрессии микроРНК на основе мечения РНК квантовой точкой и зондом из нанозолота.

,

Nucleic Acids Res

,

2005

, vol.

33

16,,,,,,.

Комбинированный вычислительно-экспериментальный подход предсказывает цели микроРНК человека

,

Genes Dev

,

2004

, vol.

18

(стр.

1165

1178

) 17,,,,,, и др.

Специфическая для островков поджелудочной железы микроРНК регулирует секрецию инсулина

,

Nature

,

2004

, vol.

432

(стр.

226

230

) 18,,,,.

Сверхэкспрессия микро-рибонуклеиновой кислоты 29, сильно повышенная у крыс с диабетом, приводит к инсулинорезистентности в адипоцитах 3T3-L1.

,

Mol Endocrinol

,

2007

, vol.

21

(стр.

2785

2794

) 19,,,,,, и др.

МикроРНК-подпись гипоксии

,

Mol Cell Biol

,

2007

, т.

27

(стр.

1859

1867

) 20,,.

Ответы микроРНК на клеточный стресс

,

Cancer Res

,

2006

, vol.

66

(стр.

10843

10848

) 21,.

Инсулинорезистентность, гиперинсулинемия и повреждение почек: механизмы и последствия

,

Am J Nephrol

,

2006

, vol.

26

(стр.

232

244

) 22,,,,,, и др.

miR-24, регулируемая трансформирующим фактором роста-β, способствует дифференцировке скелетных мышц

,

Nucleic Acids Res

,

2008

, vol.

36

(стр.

2690

2699

) 23,,,,,, и др.

Продукты 12/15-липоксигеназы активируют рецептор ангиотензина II

,

J Am Soc Nephrol

,

2008

, vol.

19

(стр.

559

569

) 24,,,,,, и др.

Глюкоза или диабет активирует митоген-активированную протеинкиназу p38 различными путями

,

J Clin Invest

,

1999

, vol.

103

(стр.

185

195

) 25,,,.

Индуцированные глюкозой реактивные формы кислорода вызывают апоптоз подоцитов и истощение подоцитов в начале диабетической нефропатии

,

Диабет

,

2006

, vol.

55

(стр.

225

233

) 26,,,,,, и др.

Гипертония ускоряет диабетическую нефропатию у жирных крыс линии Wistar, модель сахарного диабета 2 типа, посредством каскадов митоген-активируемых протеинкиназ и трансформирующего фактора роста β1

,

Hypertens Res

,

2003

, vol.

26

(стр.

339

347

)

Заметки автора

© Автор 2009. Опубликовано редакцией ABBS совместно с Oxford University Press от имени Института биохимии и клеточной биологии Шанхайского института биологических наук Китайской академии наук.

Air как возобновляемый источник углерода будущего: обзор улавливания CO2 из атмосферы

Сжигание наших уменьшающихся запасов ископаемого топлива сопровождается большим выбросом антропогенного CO 2 , который опережает возможности повторного использования CO 2 , наносимый окружающей среде.Многое делается для предотвращения этого кризиса, включая более эффективные технологии использования, сбережения и замены углеродного топлива на альтернативные, когда это возможно. Улавливание CO 2 с последующей секвестрацией (CCS) в геологическую формацию или под водой также было предложено и в некоторых случаях реализовано. Еще один многообещающий подход — улавливание и переработка углерода (CCR) в топливо и материалы. Поначалу улавливание углекислого газа из концентрированных источников, таких как электростанции, работающие на ископаемом топливе, промышленные предприятия и природные источники, может быть наиболее практичным.Однако улавливание CO 2 из атмосферы также технически осуществимо, несмотря на его низкую концентрацию (∼390 ppm), и дает даже некоторые преимущества по сравнению с улавливанием CO 2 из точечного источника. В данной статье рассматриваются методы, разработанные для улавливания CO 2 непосредственно из воздуха, а также их достоинства и недостатки. Хотя можно использовать сильные основания, такие как гидроксид натрия и гидроксид калия, их регенерация требует больших затрат энергии и высоких температур.Амины, физически или химически иммобилизованные на твердых носителях, требуют гораздо более низких температур для их регенерации и поэтому являются многообещающими кандидатами.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

st% 20chn% 20gk% 20227 лист данных и примечания к применению

СТ-11М-030

Реферат: ST-02M-C60 DC-140-003 24M05 ST-09G-030 ST-10G-030 ST-12M-030 ST-13002 ST-06M-260 MJ-04G-011
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF СТ-18М-Л50 ST-200-L10 ST-200-L50 ST-201-L10 ST-201-L50 ST-202-L10 ST-202-L50 ST-12D-L30 ST-12G-L30 СТ-12М-Л30 СТ-11М-030 ST-02M-C60 DC-140-003 24M05 СТ-09Г-030 СТ-10Г-030 СТ-12М-030 ST-13002 СТ-06М-260 MJ-04G-011
сигнальный трансформатор 4-44-5016

Реферат: pss 3056 4-44-4020 трансформатор spw-055 4-44-6024 4-49-8230 4-44-5016 4-44-3012 4-44-3010 4-49-6024
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF СТ-3-28 СТ-3-36 СТ-3-48 СТ-3-56 СТ-4-10 СТ-4-12 СТ-4-120 СТ-4-16 СТ-4-20 СТ-4-24 трансформатор сигнала 4-44-5016 pss 3056 4-44-4020 трансформатор spw-055 4-44-6024 4-49-8230 4-44-5016 4-44-3012 4-44-3010 4-49-6024
1998-8-битный код операции

Аннотация: неверный код операции sahf инструкция 0F21 0F20-0F24 BT 3713
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF
2010 — Нет в наличии

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 96 МГц FHW1812IF331 796 МГц FHW1812IF391 FHW1812IF471
1999 — IRF540 дополнительный

Аннотация: IRFZ44N дополнительный std2n52 TOSHIBA IRFZ44A datasheet STP2NA60 SSH6N80 rfp60n06 ste38na50 IRF630 дополнительный IRF3205 IR
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF RFP6N50 RFD16N03LSM RFP15N05L RFP50N05 RFP15N05 RFP50N05L RFD14N05L RFD14N05LSM RFD14N05SM RFP14N05L IRF540 дополнительный IRFZ44N дополнительный std2n52 Техническое описание TOSHIBA IRFZ44A STP2NA60 СШ6Н80 rfp60n06 ste38na50 IRF630 дополнительный IRF3205 ИК
1086 ул

Абстракция: ст 1086 БУ 526 кк 154 СТ 800
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF
3505V

Реферат: Scans-048 bajo DSAGER00042 EW0503 EW041
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF
1999 — Нет в наличии

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 800-A1-ВОЛОКНО США / 30MFO / 08
шинденген MR5060

Резюме: TFK 601 TFK 602 18db6a 18DB2A 18DB8A Лист данных Philips BZV85C-22 bzx85c MOTOROLA UR1M BYD74G
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 5KA10 5KA10A 5KA11 5KA11A 5KA12 5KA12A 5KA13 5KA13A 5KA15 5KA15A Shindengen MR5060 TFK 601 TFK 602 18db6a 18DB2A 18DB8A Техническое описание Philips BZV85C-22 bzx85c MOTOROLA UR1M BYD74G
MC 1.5 -СТ-3.81

Реферат: МЦ 1,5 ст 1019 1086 ст 10-СТ-3 4СТ25
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 5/10-СТ 5/12-СТ МС 1.5 -СТ-3.81 MC 1.5 ул 1019 1086 ул 10-СТ-3 4СТ25
сплит тран ст-4-20

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF
Нет в наличии

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF 115/230 В изоляция-130 »
ST575

Реферат: транзистор ТИП 350 мкДж силовой транзистор ТИП 22 транзисторный транзистор ТИП 662 ST8505 ST10023 ST12005 ST10011 ST8500
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF 00GQ5S5 ST-559 ST-560 ST-561 ST-562 ST-563 TIP-559 TIP-560 TIP-561 TIP-562 ST575 транзистор ТИП 350 mj силовой транзистор TIP 22 транзистор транзистор ТИП 662 ST8505 ST10023 ST12005 ST10011 ST8500
BYD74G

Аннотация: Диод FUR460 18db6a tfk FAGOR SM6T33CA перекрестная ссылка диода D4SB80Z BZY97C tfk 240 1SMZG06GP
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 5KA10 5KA10A 5KA11 5KA11A 5KA12 5KA12A 5KA13 5KA13A 5KA15 5KA15A BYD74G FUR460 18db6a диод tfk FAGOR SM6T33CA перекрестная ссылка диода D4SB80Z BZY97C tfk 240 1SMZG06GP
Нет в наличии

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF 115/230 В
1997 — СТ-6-16

Реферат: СТ-3-36 ДСТ-4-36 СТ-5-16 ДСТ-4-28 Преобразователь сигналов СТ-5-28 56ВКТ 51265 ДСТ-3-36 СТ520
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 2500VRMS 115/230 В E63829) 115/230 В СТ-6-16 СТ-3-36 ДСТ-4-36 СТ-5-16 ДСТ-4-28 трансформатор сигнальный СТ-5-28 56VCT 51265 dst-3-36 ST520
CuNi44

Аннотация: шунт R010 513 Vitrohm smd транзистор bq 22 resistencias smd RESISTENCIAS R019 резистор R0068 CuNi23Mn транзистор smd BQ 22
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF П-2775 D-25337 CuNi44 шунт R010 513 Витром smd транзистор bq 22 Resistencias smd РЕЗИСТЕНЦИИ R019 Резистор R0068 CuNi23Mn Транзистор smd BQ 22
ST710

Реферат: СТ д 728 ст-3-28 СТ5-48
Текст: нет текста в файле


OCR сканирование
PDF 115/230 В СТ-2-10 СТ-3-10 СТ-4-1-40-х 37-Ньон- 24 часа) ST710 ST d 728 ст-3-28 СТ5-48
2006 — ДСТ3-24

Аннотация: Трансформатор ST724 230В на 12В 25А Трансформатор сигналов ДСТ5-10 СТ-5-28 ТРАНСФОРМАТОР 220 на 14В
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF E66312) E63829 56VCT 120VCT ДСТ3-24 ST724 Трансформатор 230В на 12В 25А DST5-10 трансформатор сигнальный СТ-5-28 ТРАНСФОРМАТОР 220 на 14В
953-101-5310-П

Аннотация: 953-1061
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF
2013 — ДСТ-7-120

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF E66312 E6382g ДСТ-7-120
BD 761

Реферат: БД 541 ст. 643
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 10-СТ 11-СТ 12-СТ BD 761 BD 541 ул 643
трансформатор spw -055

Реферат: SPW-055 трансформатор spw-055 SPW-060 SPW-054 SPW-105 SPW-106 SPW-051 vpc3 s SPW-104
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF SPW-350-S / D SPW-050 SPW-351-S / D SPW-051 SPW-352-S / D SPW-052 SPW-053 SPW-054 SPW-055 SPW-056 spw -055 трансформатор SPW-055 трансформатор spw-055 SPW-060 SPW-054 SPW-105 SPW-106 SPW-051 vpc3 s SPW-104
2004 — вст4000

Аннотация: EN50343 EN-50124 EN61373 M12ST EN50124
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 4000 / с 4000 / л 4000-серия vst4000 EN50343 EN-50124 EN61373 M12ST EN50124
2001 — Нет в наличии

Аннотация: абстрактный текст недоступен
Текст: нет текста в файле


Оригинал
PDF 2500VRMS 115/230 В E63829) 115/230 В 24 часа)

Этикетки и бирки со штрих-кодом | Zebra

Название материала Тип материала Технология печати Основные характеристики Спецификации Состав совместимой ленты
8000D Разрушаемый Полиэтилен Прямая термопечать Этикетка из полиэтилена для удаления ламината, которая легко разрушается при подделке НЕТ
8000D Shelf-Talker Полипропилен Прямая термопечать Полипропиленовая бирка с липкой лентой для использования в качестве полочного говорящего устройства НЕТ
8000T низкотемпературный матовый Матовый полиолефин Термотрансферный Обеспечивает эксплуатационные характеристики при низких температурах (до -112 ° F / -80 ° C), обеспечивая при этом устойчивость к повторяющимся циклам замораживания и оттаивания.
8000T Низкотемпературный блеск Глянцевый полипропилен Термотрансферный Обеспечивает эксплуатационные характеристики при низких температурах (до -112 ° F / -80 ° C), обеспечивая при этом устойчивость к повторяющимся циклам замораживания и оттаивания.
8000T CryoCool ™ Глянцевый полипропилен Термотрансферный Обеспечивает работу при экстремально низких температурах (до -320 ° F / -196 ° C).Хорошо подходит для криогенных применений с жидким азотом и может выдерживать такие условия, как сухой лед и глубокая заморозка.
Пакет для первичной крови 8000T Матовый полипропилен Термотрансферный Предназначен для маркировки пакетов с первичной кровью и пакетов для внутривенных вливаний. Соответствует рекомендациям FDA по единообразной маркировке крови и компонентов крови.
Пакет для крови 8000T Матовый полипропилен Термотрансферный Предназначен для наклеивания на этикетку, которая уже находится на пакете с кровью, в целях идентификации.Соответствует рекомендациям FDA по единообразной маркировке крови и компонентов крови.
8000T Ювелирные изделия Матовый полипропилен Термотрансферный Идеально подходит для маркировки ювелирных изделий и колец. Безопасен для использования в отпаривателях для ювелирных изделий и чистящих средствах. Обеспечивает высокое качество печати и устойчивость к смазыванию. Доступен в нестандартных цветах.
8000D Ювелирные изделия Полипропилен Прямая термопечать Идеально подходит для маркировки ювелирных изделий и колец.Безопасен для использования в чистящих средствах для ювелирных изделий. УФ-экран обеспечивает устойчивость к ультрафиолетовому излучению. Доступен в нестандартных цветах. НЕТ
Этикетка на полке 8000D Матовый полипропилен Прямая термопечать Этикетка для полок, выдерживающая охлаждение и замораживание. Имеет лак, защищающий изображение. НЕТ
8000T GHS Ламинат Полипропилен с прозрачным глянцевым ламинатом Термотрансферный Overlaminate обеспечивает дополнительную стойкость красных алмазов с предварительно нанесенной печатью к истиранию и воздействию химикатов.Сертификат BS 5609, разделы 2 и 3, в сочетании с лентой из смолы 5095.
8000T матовый сверхвысокой липкости Матовый полиэстер Термотрансферный Клей со сверхвысокой липкостью представляет собой агрессивный клей, который отлично подходит для поверхностей, на которые трудно наносить этикетку, таких как окрашенный или голый металл и дерево.
8000T RetroScan Серебро, глянец, светоотражающий полиэстер Термотрансферный Разработан для сканирования на большие расстояния и обеспечивает отличную устойчивость к смазыванию и царапинам, а также к агрессивным химическим веществам.
Направляющая 8000T Глянцевый Полиэстер Термотрансферный Идеально подходит для предметных стекол микроскопов и выдерживает погружение в агрессивные химические вещества, такие как ксилол, в сочетании с нашей лентой Image Lock ™.
8000T ESD Gloss Глянцевый Полиэстер Термотрансферный Этикетка, рассеивающая электростатический заряд, отвечающая требованиям ESD S11.11 Surface Resistance Test.
8000T Piggyback Прозрачный матовый Piggyback, матовый полиэстер Термотрансферный Разработан для того, чтобы можно было удалить этикетку, оставить подкладку и повторно нанести вторую подкладку для окончательного нанесения. Можно перекрыть прозрачной полиэфирной подкладкой.
8000T Пусто Полиэстер Термотрансферный Этикетка с защищенным от несанкционированного доступа клеем, оставляющим «пустоту» при снятии этикетки.
8000T Cheerboard Gloss Silver Серебро, глянцевый полиэстер Термотрансферный Этикетка из серебристого полиэстера с защищенным от взлома клеем, оставляющим шахматный узор при снятии этикетки. Сохраняет функцию защиты от несанкционированного доступа при температуре до 176 ° F (80 ° C).
8000T GHS Полиэстер Матовый полиэстер Термотрансферный Адгезивная система, предназначенная для хорошего приклеивания к окрашенным стальным, фибровым и пластмассовым барабанам.Сертификат BS 5609, разделы 2 и 3, в сочетании с лентой из смолы 5095 и красной лентой из смолы. Также обеспечивает отличную химическую стойкость.
8000T GHS Винил Винил матовый Термотрансферный Адгезивная система, предназначенная для хорошего приклеивания к окрашенным стальным, фибровым и пластмассовым барабанам. Сертификат BS 5609, разделы 2 и 3, в сочетании с лентой из смолы 5095 и красной лентой из смолы. Обеспечивает отличную химическую стойкость и исключительную гибкость для изогнутых поверхностей.
8000T Z-Destruct ™ Винил Термотрансферный Виниловая этикетка со стойким клеем, который разрушается при удалении этикетки. Идеально подходит для дорогостоящей электроники.
8000T Прозрачный винил Прозрачный матовый винил Термотрансферный Очень гибкая виниловая этикетка. Идеально подходит для маркировки проводов и этикеток флаконов / тюбиков.
8000T винил Outlast Полуглянцевый винил Термотрансферный Обладает превосходной гибкостью для изогнутых поверхностей, обеспечивая долговечность до 5 лет на открытом воздухе и отличную стойкость к ультрафиолетовому излучению.
8000T Прилипание Винил Gloss Static Cling Vinyl Термотрансферный Рекомендуется для маркировки приложений, требующих чистой удаления, таких как временные парковочные наклейки.
8000D Мокрая гусеница Матовый полипропилен Прямая термопечать Обеспечивает отличную адгезию к влажным поверхностям и хорошую устойчивость к воздействию окружающей среды. Хорошо работает при нормальной температуре морозильной камеры. НЕТ
8000T Wet Tack Глянцевый полипропилен Термотрансферный Обеспечивает отличную адгезию к влажным поверхностям. Рекомендуется для использования в холодной и влажной среде на жестких контейнерах.
Z-образная муфта Бумажная бирка с прозрачной полипропиленовой этикеткой Прямая термопечать Универсальный упаковочный лист, заменяющий традиционный упаковочный лист.Сэкономьте почти 30 секунд на упаковке и лучше справьтесь с вашими потребностями в доставке. НЕТ

IFITM3 функционирует как каркас PIP3 для усиления передачи сигналов PI3K в B-клетках

Никаких статистических методов не использовалось для предварительного определения размера выборки. Эксперименты не были рандомизированы, и исследователи не были закрыты для распределения во время экспериментов и оценки результатов.

Анализ экспрессии генов пациента и данных результатов

Данные микроматрицы экспрессии генов трех больших групп пациентов с пре-В ОЛЛ были загружены из GSE5314 27 (Клиническое исследование E2993 Восточной совместной онкологической группы (ECOG)), GSE11877 28 (Клиническое исследование детской онкологической группы (COG) P9906), г.Исследовательская больница Джуд педиатрическая ALL 29 (http://www.stjuderesearch.org/site/data/ALL3/). В ECOG E2993 образцы костного мозга или периферической крови перед лечением были получены при постановке диагноза перед любым лечением у 83 пациентов с Ph + B-ALL, включенных в Совет по медицинским исследованиям (MRC) UKALLXII / Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) E2993, фаза III. испытание. В наборе данных из детства Сент-Джуда 15 случаев Ph + B-ALL были отобраны из исходных 327 диагностических аспиратов костного мозга.Данные о минимальной остаточной болезни (MRD) были доступны для пациентов с педиатрическим B-ALL высокого риска (COG P9906). IFITM3 Уровни экспрессии были измерены у пациентов с положительным статусом MRD (MRD + ) или отрицательным статусом MRD (MRD ). В клиническом исходе COG P9906 профили экспрессии были получены в образцах лейкемии до лечения от 207 равномерно пролеченных детей с ОЛЛ высокого риска 30 , категория риска, в значительной степени определяемая клиническими характеристиками до лечения.Пациенты прошли тестирование MRD с помощью проточной цитометрии с двумя комбинациями (CD20 / CD10 / CD45 или CD9 / CD19 / CD34 / CD45) и были определены как MRD-положительные или MRD-отрицательные в конце индукционной терапии (29 день) с использованием порога 0,01. %, как описано ранее 31 . Затем РНК была очищена из 207 диагностических образцов до обработки с более чем 80% бластов (131 костный мозг, 76 периферическая кровь) и подвергнута микроматрицам. Лог-ранговый тест использовался для оценки статистической значимости.

Первичные образцы человека и клеточные линии

Образцы пациентов (дополнительная таблица 7) были получены этично от пациентов, давших информированное согласие, и соответствовали требованиям внутренних наблюдательных советов Исследовательского института Бекмана города Надежды.Мы соблюдаем все соответствующие этические нормы. Образцы пациентов были взяты из биопсии костного мозга пациентов с ОЛЛ на момент постановки диагноза или рецидива. Все образцы трансплантировали сублетально облученным мышам NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (мыши NSG, Лаборатория Джексона) путем инъекции в хвостовую вену. После сбора образцов полученные от пациентов первичные ксенотрансплантаты человеческого пре-B ALL культивировали на строме OP9 в Alpha Minimum Essential Medium (MEMα; Life Technologies) с GlutaMAX, содержащим 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ мл -1 пенициллин, 100 мкг мл -1 стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия.Линии клеток человека (дополнительная таблица 8) культивировали в RPMI-1640 (GIBCO) с GlutaMAX, содержащим 20% FBS, 100 МЕ мл -1 пенициллин, 100 мкг мл -1 стрептомицина при 37 ° C в увлажненном инкубаторе. с 5% CO 2 . Все первичные образцы и клеточные линии человека оказались отрицательными на микоплазму с помощью набора для обнаружения (MycoAlert PLUS, LONZA).

Генетические модели мышей

Генетические модели мышей, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 9. Мыши NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) были приобретены в лаборатории Джексона. Ifitm3 tm1Masu (ref. 32 ) мышей подвергали обратному скрещиванию с фоном C57BL / 6J в течение более восьми поколений. B6.C (Cg) — Cd79a tm1 (cre) Reth / EhobJ (Mb1 – Cre) мышей были приобретены в лаборатории Джексона. Мыши B6.129S2- Ighm tm1Cgn / J (мкМТ) были приобретены в лаборатории Джексона. C; 129S4- Pten tm1Hwu / J ( Pten fl / fl ) мышей были приобретены в лаборатории Джексона.Для мышей домашнего разведения однопометники одного пола были рандомизированы в экспериментальные группы. Для анализа инициации лейкемии in vivo перед инъекцией случайным образом распределяли самок мышей NSG в возрасте 8-10 недель. Для создания модели предлейкемических предшественников В-клеток, экспрессирующих BCR – ABL1, LSL -Bcr + / BCR-ABL1 мышей 33 скрещивали со штаммом Mb1-cre ( Mb1-cre LSL -Bcr + / BCR-ABL1 ) для удаления стоп-кассеты в ранних пре-B-клетках.Для анализа онкогенного прайминга in vivo с использованием Mb1-cre × LSL -Bcr + / BCR-ABL1 B-предшественников B-клеток перед инъекцией произвольно распределяли самок мышей NSG в возрасте от 8 до 10 недель. Температуру 18–23 ° C при влажности 40–60% поддерживали с циклом 14 часов света / 10 часов темноты. Следующие баллы считались конечной точкой: (1) отказ от еды или питья воды в течение 24 часов; (2) невозможность произвести нормальную регулировку позы или вести себя нормально; и (3) когда опухолевая нагрузка достигла 1.5 см × 1,5 см × 1,5 см (образование язв опухоли не ожидалось). Если мышь потеряла 25% своей начальной массы тела (или достигла массы тела 16 г, независимо от начальной массы), или если мы наблюдали потерю массы на 15% при двух последовательных измерениях веса, мы немедленно умерщвляли мышь. Все эксперименты на мышах подлежали институциональному одобрению Комитетом по уходу и использованию животных Бекмана научно-исследовательского института города Надежды.

Первичные клетки и лейкозные клетки мыши

Клетки костного мозга мышей в возрасте 6–10 недель собирали промыванием полостей бедренной и большеберцовой костей охлажденным PBS с последующей фильтрацией через фильтр с размером ячеек 40 мкм для получения суспензии одноклеточных. .Клетки селезенки или тимуса экстрагировали напрямую, проталкивая ткани через 40-мкм фильтр в охлажденный PBS. Отфильтрованные клетки дополнительно инкубировали с буфером для лизиса (RBC Lysis Buffer, BioLegend) для лизиса эритроцитов. После промывки PBS клетки подвергали дальнейшим экспериментам. Для IL-7-зависимой культуры пре-B-клеток клетки костного мозга собирали и культивировали в модифицированной Iscove среде Дульбекко (IMDM) (GIBCO) с GlutaMAX, содержащей 20% FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 МЕ мл -1 пенициллин, 100 мкг мл -1 стрептомицин в присутствии 10 нг мл -1 рекомбинантный мышиный IL-7 (Peprotech).Для модели лейкемии BCR-ABL1 пре-B-клетки ретровирусно трансформировали BCR-ABL1 , а затем удаляли IL-7 для отбора трансдуцированных клеток. Nras G12D ВСЕ клетки были отобраны с помощью пуромицина (GIBCO) и поддерживались IMDM с добавлением IL-7.

Ретровирусная и лентивирусная трансдукция

Ретровирусный супернатант получали котрансфекцией клеток HEK 293FT ретровирусными конструкциями вместе с pHIT60 (gag-pol) и pHIT123 (для мыши) или pHIT456 (для экотропной оболочки человека) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen).Лентивирусный супернатант для CRISPR-опосредованного редактирования генов получали котрансфекцией клеток HEK 293FT лентивирусными конструкциями вместе с pCDNL / BH и EM140. Трансфицированные клетки HEK 293FT культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM) (GIBCO) с GlutaMAX, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 МЕ мл -1 пенициллин, 100 мкг мл 1 стрептомицин, 25 ммоль л- 1 HEPES, 1 ммоль л -1 пируват натрия и 0,1 ммоль л -1 заменимая аминокислота в течение 16 часов.После индукции бутиратом натрия (10 мМ) в течение 8 ч супернатант вируса собирали и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Содержащие вирус супернатанты загружали центрифугированием (2000 г , 90 мин при 32 ° C) на покрытые 50 мкг мл -1 ретронектина (Takara) 6-луночные планшеты для нетканых культур. Для ретровирусной трансдукции 3–5 × 10 клеток 6 на лунку трансдуцировали центрифугированием при 600 g в течение 30 минут в соответствующей культуральной среде и выдерживали при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 48 часов.Для лентивирусной трансдукции 3–5 × 10 6 клеток на лунку центрифугировали при 600 г в течение 30 мин в присутствии лентивирусного супернатанта и поддерживали при 37 ° C и 5% CO 2 . На следующий день надосадочную жидкость лентивируса заменяли свежей средой.

Вестерн-блоттинг

Клетки, промытые PBS, лизировали в буфере CelLytic (Sigma-Aldrich) с добавлением 1% смеси ингибиторов протеазы (Roche Diagnostics), 1% смеси ингибиторов фосфатазы (EMD Millipore) и 1 мМ PMSF на льду.Всего 10 мкг клеточных лизатов разделяли на мини-сборных гелях (Bio-Rad) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Мембраны зондировали соответствующими первичными антителами. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Invitrogen) и хемилюминесцентным субстратом (Invitrogen), и дополнительно детектировали с помощью экспонирования пленки, системы визуализации UVP BioSpectrum 810 (Thermo Fisher Scientific) или с помощью системы визуализации ChemiDoc MP (BioRad).Антитела, использованные в этом исследовании, представлены в дополнительной таблице 10 и использовались при разведении от 1: 750 до 1: 1000 в блокирующем буфере.

Проточная цитометрия

Клетки, промытые PBS, блокировали блокатором Fc в течение 10 минут на льду, а затем окрашивали соответствующими антителами, перечисленными в дополнительной таблице 10, или изотипическим контролем в течение 25 минут на льду. Затем клетки промывали и ресуспендировали в охлажденном PBS, содержащем 0,75 мкг мл -1 DAPI, чтобы исключить мертвые клетки. Сбор данных выполняли с помощью проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences) с программным обеспечением BD FACSDIVA.Сортировку клеток на основе флуоресценции выполняли с помощью FACSAria II (BD Biosciences) с программным обеспечением BD FACSDIVA. Данные FACS анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo). Для анализа апоптоза использовали аннексин V и 7-AAD (BD Biosciences). Для анализа клеточного цикла использовали набор для проточной цитометрии BrdU (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Для внутриклеточного окрашивания цитоплазматических белков клетки сначала окрашивали на антигены клеточной поверхности, а затем фиксировали в растворе для фиксации и пермеабилизации (BD Biosciences), содержащем 4% параформальдегида и детергентный сапонин.Затем клетки промывали и ресуспендировали в буфере Perm / Wash Buffer (BD Biosciences) и окрашивали соответствующими антителами. Для статистической количественной оценки данные были нанесены на график с помощью GraphPad Prism 7 или SigmaPlot. Антитела FACS, перечисленные в дополнительной таблице 10, были предварительно разведены 1: 5–1: 10. Два мкл разведенного антитела добавляли к 1-2 миллионам клеток на 50 мкл в PBS для конечного разведения 1:50 для клеток человека или 1: 200 для клеток мыши.

Фармакологические ингибиторы и реагенты

Иматиниб был приобретен в LC Laboratories.Исходные растворы готовили в стерильной воде в концентрации 10 ммоль л -1 и вводили в концентрации 10 мкмоль л -1 . Дазатиниб был приобретен в компании SelleckChem. Исходные растворы готовили в стерильном ДМСО при 25 мкмоль на -1 и вводили при 25 нмоль на -1 (дополнительная таблица 11).

Анализ иммунопреципитации хроматина с данными секвенирования

Иммунопреципитация хроматина IKZF1 с секвенированием (ChIP-seq) выполняли, как описано ранее 34 , с полученной от пациента линией ксенотрансплантатов человеческого B-ALL (LAX2), которая экспрессирует дикого типа полноразмерный IKZF1 и отсутствие детектируемого уровня доминантно-отрицательной изоформы IKZF1.Дорожки ChIP-seq (GSE58825) для антитела IKZF1 в LAX2 на промоторных областях гена IFITM3 показаны в нижней части расширенных данных на рис. 1m. Ось y представляет нормализованное количество считываний на миллион считываний для вершины пика для каждого трека. Дорожки ChIP-seq (GSE86897) для обогащения RNAPII и h4K4me3 в локусе Ifitm3 в пре-B-клетках из Ikzf1 exon5fl / fl мышей при опосредованной Cre-опосредованной делецией 9190 I1906 I1906 I1901 мыши показаны вверху расширенных данных Рис.1м. Пики ChIP-seq были вызваны вызывающим MACS пиком путем сравнения плотности считывания в эксперименте ChIP относительно считывания входного контроля хроматина и показаны в виде полос под каждой дорожкой покачивания. Генные модели показаны в браузере генома UCSC hg19. Integrative Genomics Viewer (IGV) использовался для визуализации треков ChIP-seq.

Индуцируемая экспрессия IKZF1

Положительные по хромосоме Филадельфии человека ( Ph + ) пре-B ALL-клетки (BV173), несущие делеции IKZF1 , трансдуцировали с помощью pRetroX-Tet3G-Neo.Клетки, устойчивые к неомицину, трансдуцировали pRetroX-TRE3G-IKZF1-Puro дикого типа. Экспрессию IKZF1 дикого типа в устойчивых к пуромицину клетках инициировали обработкой 1 мкг мл -1 доксициклина (TetOn).

Индуцибельное восстановление CD19

Для индуцибельного восстановления CD19 мышиный CD19 сливали с лиганд-связывающим доменом мутантного рецептора эстрогена (ER T2 ) на С-конце CD19. BCR-ABL1-трансформированные мышиные клетки B-линии ALL ретровирусно трансдуцировали MSCV CD19-ER T2 -Puro.Клетки, устойчивые к пуромицину, обрабатывали 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT) (Sigma-Aldrich) или контрольным носителем, чтобы вызвать восстановление CD19.

Анализ жизнеспособности клеток

Сто тысяч BCR – ABL1-трансформированных мышиных ALL клеток B-линии высевали в объеме 100 мкл в среду в 1 лунку 96-луночного планшета (BD Biosciences). Иматиниб (LC Laboratories) добавляли в указанной концентрации в общем объеме 150 мкл. После культивирования в течение 3 дней в каждую лунку добавляли 15 мкл резазурина (R&D) и инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C.В качестве бланка использовали среду без клеток. Флуоресценция считывалась при 535 нм, а эталонная длина волны составляла 590 нм. Относительную жизнеспособность рассчитывали с использованием исходных значений клеток, обработанных носителем, в качестве эталона.

Анализ образования колоний

Анализы образования колоний метилцеллюлозы проводили с 10 000 клеток. Клетки ресуспендировали в мышиной среде MethoCult (без цитокинов для BCR-ABL1 -трансформированных клеток; с IL-7 для NRAS G12D -экспрессирующих клеток) и культивировали на чашках диаметром 3 см с дополнительным емкость для подачи воды, чтобы предотвратить испарение.Колонии были визуализированы и подсчитаны через семь дней с использованием GelCount (Oxford Optronix), микроскопа Olympus IX71 и Q-Capture pro 7.

Сшивание IFITM3 – HA in vitro

Восемь миллионов полученных от пациента клеток B-ALL на образец ресуспендировали в полную среду и обрабатывали либо 2,5 мкг мл -1 поликлональных анти-HA (Abcam), либо изотипическим контролем в течение указанного времени. Фрагменты F (ab) для антитела против НА были получены с использованием набора для приготовления F (ab) в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific).Фрагментацию F (ab) подтверждали с помощью сборных гелей без пятен Criterion TGX (Bio-Rad).

Измерение мобилизации внутриклеточного кальция

Расширенные данные Рис. 2f, 1 миллион свежих спленоцитов инкубировали с 4 мкМ Rhod-2-AM Ca 2+ -связывающим красителем (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 минут при комнатной температуре. в темноте. Затем клетки ресуспендировали в PBS и поддерживали при 37 ° C, и ответ на Ca 2+ индуцировали добавлением 10 мкг / мл -1 поликлонального анти-IgM (Southern Biotech) через 50 с после получения фоновой флуоресценции.Внутриклеточную мобилизацию Ca 2+ в ответ на сшитый IgM измеряли до 300 с с помощью проточной цитометрии. На рис. 4c с расширенными данными 1 × 10 6 жизнеспособных клеток Jurkat инкубировали с 4 мкМ Fluo4-AM Ca 2+ -связывающим красителем (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Затем клетки ресуспендировали в PBS и поддерживали при 37 ° C, и ответ Ca 2+ индуцировали добавлением 10 мкг / мл -1 моноклональных (OKT3) очищенных NA / LE античеловеческих CD3 (Biolegend) через 50 с. после получения фоновой флуоресценции.Внутриклеточную мобилизацию Ca 2+ в ответ на сшитый IFITM3 измеряли до 300 с с помощью проточной цитометрии. Та же процедура была выполнена для расширенных данных (рис. 6f); 1 × 10 6 жизнеспособных клеток Jeko1 инкубировали с 4 мкМ Fluo4-AM (Thermo Fisher Scientific). Ответ Ca 2+ индуцировали добавлением 10 мкг / мл -1 поликлональной μ-цепи F (ab ‘) 2 против человека (Jackson Immunoresearch).

Анализ гомотипической агрегации

Ifitm3 — / — Клетки B-ALL, экспрессирующие C-концевой HA-меченный IFITM3 дикого типа, мутантный вектор IFITM3 (Y20E) или пустой вектор, инкубировали с 2.5 мкг мл -1 моноклональных (1D3) очищенных LEAF антимышиных CD19 (Biolegend) или 2,5 мкг мл -1 поликлональных анти-HA (Abcam) или изотипических контролей при 37 ° C и 5% CO 2 . После культивирования в течение 24 ч гомотипическую агрегацию визуализировали с помощью световой микроскопии.

Анализ онкогенного праймирования in vivo с использованием

Mb1-cre; LSL -Bcr + / BCR-ABL1 Предшественники В-клеток

Для создания модели предлейкемических предшественников В-клеток, экспрессирующих BCR – ABL1, мышей с нокаутом BCR – ABL1 скрещивали со штаммом Mb1 – Cre ( Mb1-cre × LSL -Bcr + / BCR-ABL1 ) для удаления стоп-кассеты в ранних пре-B-клетках.Клетки костного мозга, собранные от мышей Mb1-cre × LSL -Bcr + / BCR-ABL1 , культивировали в присутствии 10 нг / мл рекомбинантного мышиного IL-7 -1 (Peprotech). IL-7-зависимые предлейкемические В-клетки метили ретровирусной люциферазой светлячков и отбирали бластицидином в течение 7 дней. После отбора клетки дополнительно трансдуцировали MSCV-IFITM3-HA-IRES-Puro, MSCV-IFITM3 Y20E -HA-IRES-Puro или пустым вектором и отбирали пуромицином в течение 3 дней.Жизнеспособные клетки (1 × 10 7 ) инъецировали через хвостовую вену сублетально облученным (200 сГр) мышам-реципиентам NSG. Распространение in vivo и бремя лейкемии контролировали с помощью люциферазной биовизуализации (система биолюминесценции и оптической визуализации IVIS 100; Xenogen) в указанные моменты времени. Вкратце, d-люциферин (Promega), растворенный в PBS, вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг на мышь за 15 мин до измерения люминесценции. Всех мышей анестезировали 5% изофлураном и продолжали во время обнаружения излучения света 2% изофлураном, введенным через носовой конус.Мышей умерщвляли, когда у них проявлялись признаки лейкемии, такие как сгорбленная спина, потеря веса и неспособность двигаться. Анализ выживаемости Каплана-Мейера был выполнен с использованием GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) для сравнения общей выживаемости. Лог-ранговый критерий Мантела-Кокса использовался в качестве статистического анализа с использованием GraphPad Prism 7 (дополнительная таблица 4).

Анализ клеточной адгезии

Ifitm3 + / + или Ifitm3 — / — BCR-ABL1 Клетки B-ALL были трансдуцированы с помощью MSCV-IK6-IRES-GFPES или MSCV-GFPES или MSCV-GFPES отрицательный контроль.Клетки GFP + (1 × 10 5 ), отсортированные с помощью FACS, культивировали на строме 1,5 × 10 5 OP9 на 6-луночном планшете с IMDM-GlutaMAX, содержащим 20% FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанол, 100 МЕ. -1 пенициллин и 100 мкг -1 стрептомицина. Для расчета соотношения прикрепленных и неприлипающих клеток неприлипающие клетки собирали и подсчитывали методом исключения трипанового синего с использованием автоматического счетчика клеток Countess II FL (Life Technologies). После двукратной промывки планшета PBS адгезивные клетки отделяли с помощью трипсинизации, а клетки GFP + B-ALL и подсчитывали методом исключения трипанового синего с использованием автоматического счетчика клеток Countess II FL (Life Technologies) и рассчитывали соотношения.

Адоптивный перенос очищенных В-клеток мышам μMT

Для адоптивного переноса В-клеток спленоциты от 7- до 10-недельного возраста Ifitm3 + / + или Ifitm3 — / — мыши были отрицательно отобран с помощью набора для выделения клеток Pan B MojoSort II (Miltenyi Biotec) с использованием иммуномагнитных шариков против CD3, CD4, CD8a, CD11c, CD49b, Ly6G / Ly6C (GR1) и TER119. Десять миллионов отсортированных по потоку В-клеток селезенки внутривенно вводили мышам μMT (B6.129S2- Ighm tm1Cgn / J), у которых отсутствует экзон Cμ и развитие зрелых В-клеток в результате дефектной экспрессии поверхностного IgM. Восстановление донорских В-клеток определяли с помощью проточной цитометрии через 20 дней после инъекции. Мышей-реципиентов μMT иммунизировали гаптеном NP, связанным с белком-носителем (KLH), на день 0 и день 7, а селезенку собирали на день 12.

Иммунизация и иммуногистология

Ifitm3 + / + и Ifitm3 — / — однопометных мышей иммунизировали 0.5 мг NP – KLH (Biosearch Technologies) в квасцах (Sigma-Aldrich) внутрибрюшинно. Через семь дней мышей иммунизировали второй раз в течение пяти дней. Селезенки выделяли на 12 день после иммунизации. Селезенку заливали компаундом с оптимальной температурой резки, и для окрашивания использовали криосрезы толщиной 5 мкм. Срезы фиксировали ацетоном в течение 10 мин, а неспецифические антигены блокировали в DPBS, содержащем 2% FBS, в течение 15 мин. Срезы окрашивали разбавленными 1: 200 поликлональными (RA3-6B2) анти-CD45R (B220, BD Biosciences), моноклональными антителами против CD3 мыши (17A2, BioLegend) и биотинилированным агглютинином арахиса (B-1075, Vector Laboratories) в течение 45 мин. .Срезы промывали и дополнительно окрашивали антителом к ​​стрептавидину Alexa Fluor 647 (BioLegend) в течение 45 мин. Все антитела разводили 1: 100 до их исходной концентрации в блокирующем буфере. После промывки блокирующим буфером срезы помещали в ProLong Diamond Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific). Изображения были получены на конфокальном микроскопе ZEISS LSL 880 и проанализированы с помощью программного обеспечения ZEN 2.3 (Zeiss).

Измерения ELISA

Для определения концентраций изотипов иммуноглобулинов в сыворотке, ELISA выполняли в соответствии с протоколом производителя (Ig Isotyping Mouse Instant ELISA Kit for IgG1, IgG2b and IgM) (дополнительная таблица 11).NP-специфические антитела измеряли с помощью ELISA с использованием 10 мкг / мл NP (24) –BSA (Biosearch Technologies) в качестве реагента для покрытия. NP-специфические IgM и IgG1 были обнаружены с использованием козьих антимышиных IgM и IgG1 Fc-специфических антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и проявленных с тетраметилбензидином (Sigma). Оптическую плотность определяли с использованием ридера для ELISA при 450 нм (SpectraMax M3, Molecular Devices).

Анализ РНК-секвенирования

Общая мРНК из Ifitm3 + / + и Ifitm3 — / — BCR-ABL1 или NRAS G12E, выделенных с использованием клеток ALL G12D. Комплект (Qiagen) согласно инструкции производителя.Секвенирование выполняли на приборе Illumina Hiseq 2500 (Illumina) с использованием набора TruSeq SR Cluster Kit v.4-cBot-HS (Illumina) с химией v.4. Контроль качества считываний РНК-секвенирования проводили с помощью FastQC. Для анализа считанные необработанные последовательности были сопоставлены с геномом мыши (mm10) с помощью STAR v.2.5.3 35 , а частота генов была подсчитана с помощью featureCounts v.1.5.1 36 . Затем необработанные подсчеты были нормализованы с использованием метода усеченного среднего значения M и сравнены с использованием пакета Bioconductor «edgeR» 37 .Чтения на килобазу на миллион (RPKM) сопоставленных чтений также рассчитывались из необработанных подсчетов. Для анализа дифференциальной экспрессии транскрипты были количественно определены с использованием Salmon v.1.1.0 против аннотаций транскриптов генкода GRCm38 v.M24; нормализация и статистический анализ были выполнены в R с использованием DESeq2 v.1.28.1. Дифференциально экспрессируемые гены были идентифицированы, если RPKM ≥ 1 по крайней мере в одном образце, кратное изменение ≥ 2 и P ≤ 0,05 (расширенные данные, рис. 3b). Данные RPKM позже были использованы в анализе обогащения набора генов (GSEA).GSEA выполняли с использованием пакета DOSE в R 38 ; гены ранжировали по логарифму 2 -трансформированных кратных изменений; и наборы генов были получены из MSigDB или из внутренних данных, как указано.

CRISPR-опосредованная делеция гена

Все лентивирусные конструкции, экспрессирующие нуклеазу Cas9 и направляющую РНК, были приобретены у Transomic Technologies. Для делеции гена клетки трансдуцировали pTOL-hCMV-Tet3G-Hygromycin. Затем устойчивые к гигромицину клетки трансдуцировали pCLIP-Tre3g-hCMV-Cas9-P2A-zsGreen.Экспрессию Cas9 – P2A – zsGreen индуцировали 1 мкг мл -1 доксициклина в течение 16 часов, и клетки zsGreen + сортировали методом проточной цитометрии. Клетки промывали для удаления доксициклина, чтобы выключить экспрессию Cas9 (TetOff), а затем затем трансдуцировали pCLIP-gRNA-hCMV-RFP-gRNA. Отсортированные клетки RFP + подвергали дальнейшим экспериментам. Делецию гена инициировали обработкой 1 мкг мл -1 доксициклина (TetOn). Ненаправляющая направляющая РНК использовалась в качестве контроля.

Делеция гена путем нацеливания на невирусный геном

Химически синтезированные РНК CRISPR (160 мкМ) и трансактивирующих РНК CRISPR (160 мкМ) смешивали 1: 1 по объему и отжигали инкубацией при 37 ° C в течение 30 мин. . Рекомбинантно продуцируемый Cas9 (40 мкМ) затем смешивали 1: 1 по объему с пРНК для получения комплексов РНК-рибонуклеопротеина (РНП). Перед электропорацией RNP образовывали свежие комплексы. Электропорацию проводили с использованием импульсного кода EH-115 на 96-луночной системе электропорации Lonza 4D.Предварительно сконструированные направляющие РНК Alt-R CRISPR-Cas9 были приобретены у IDT. Нецелевые контрольные направляющие РНК были приобретены у IDT.

Коиммунопреципитация

Коиммунопреципитацию проводили с помощью набора Pierce Crosslink Magnetic IP / Co-IP в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific). Вкратце, полученные от пациента клетки Ph + ALL (PDX2) трансдуцировали с помощью MSCV Flag-IRES-Puro или MSCV Flag-IFITM3-IRES-Puro и отбирали в пуромицине в течение 3 дней.Жизнеспособные клетки (5 × 10 7 ) собирали и промывали PBS перед лизисом с использованием буфера для лизиса / промывки IP (Thermo Fisher Scientific). Затем 5 мкг антитела M2 против Flag (F1804, Sigma-Aldrich) на образец связывали с магнитными шариками белка A / G и ковалентно сшивали с 20 мкМ дисукцинимидил-субератом. Сшитые антителами гранулы инкубировали с клеточным лизатом, промывали для удаления несвязавшегося материала и элюировали элюирующим буфером с низким pH, который диссоциирует связанный антиген от сшитых антителами гранул.Обогащенный антиген при низком pH немедленно нейтрализовали и подвергали вестерн-блоттингу. Клетки Jeko1, подвергнутые электропорации либо не нацеливающим RNP, либо IFITM3 -целевым комплексом RNP, стимулировали 10 мкг мл -1 F (ab ‘) 2 фрагмент козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) в течение указанного времени. точки при 37 ° C и 5% CO 2 . Клетки немедленно промывали охлажденным PBS и подвергали совместной иммунопреципитации с антителом к ​​CD19 (№

, CST).

PLA

Для PLA пре-BCR или BCR-IFITM3 клетки инкубировали с 10 мкг мл -1 F (ab ‘) 2 фрагмент козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) в течение 5 мин при 37 ° C и 5% CO 2 . Клетки немедленно промывали охлажденным PBS и затем фиксировали в буфере для фиксации (Biolegend), содержащем 4% параформальдегид, в течение 25 минут на льду, а затем промывали охлажденным PBS. Для окрашивания клеточной мембраны клетки метили 5 мкг мл -1 WGA, конъюгированного с Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific), в течение 5 минут при комнатной температуре.Затем клетки подвергали проницаемости в буфере Perm / Wash (BD Biosciences) и затем блокировали в буфере Duolink Blocking в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали с первичными антителами, разведенными 1: 150, перечисленными в дополнительной таблице 10, в течение ночи при 4 ° C. Для позднего окрашивания эндосом клетки инкубировали с анти-человеческим LAMP1, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (R&D Systems) с первичными антителами. Клетки промывали и осаждали на покрытом клеткой Cell-Tak (Corning) Shandon Single Cytoslide с цитоспином при 400 г в течение 5 мин.Реакции с PLA проводили согласно протоколу производителя (Duolink, Sigma). Вкратце, первичные антитела были связаны с зондами Duolink in situ PLA PLUS или MINUS (Sigma-Aldrich), а затем зонды были визуализированы с помощью Duolink Detection Reagent Red (Sigma-Aldrich). Клетки помещали в среду Duolink для монтажа in situ с DAPI (Sigma-Aldrich). Микроскопические изображения получали с использованием Olympus IX3-55 и анализировали с помощью программного обеспечения для визуализации CellSens (Olympus) и ImageJ. Для количественной оценки сигналов PLA одна точка была определена программным обеспечением BlobFinder как пиксель размером 5 × 5.Статистическая значимость была рассчитана с использованием непарного теста Стьюдента t в Excel и нанесена на график с помощью GraphPad Prism 7.

Фосфопротеомный анализ

Клетки B-ALL (PDX2), полученные от пациента, трансдуцированные HA-меченным IFITM3 (Y20E) или пустым векторным контролем. инкубировали с 2,5 мкг мл -1 поликлонального анти-HA (Abcam) в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO 2 . Клеточные экстракты готовили в буфере для лизиса мочевины, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали, восстанавливали DTT и алкилировали йодацетамидом.Пятнадцать мг общего белка для каждого образца обрабатывали трипсином, и 500 мкг общего белка для каждого образца обрабатывали смесью LysC и трипсина для анализа IMAC. Образцы очищали на колонках C18 и сушили в лиофилизаторе. Высушенные образцы ресуспендировали и обогащали гранулами Fe-IMAC, очищали с помощью наконечников C18 STAGE (Rappsilber). Повторные инъекции каждого образца выполнялись на приборе непоследовательно. Пептиды элюировали с использованием 150-минутного (IMAC) линейного градиента ацетонитрила в 0.125% муравьиная кислота доставляется со скоростью 280 нл / мин. Тандемные масс-спектры (МС / МС) собирали в зависимости от данных с помощью масс-спектрометра Thermo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid с использованием метода МС / МС первой двадцатки, динамического подсчета повторов, равного единице, и продолжительности повтора, равной 30 с. Повторная калибровка погрешности массы в реальном времени была выполнена с использованием стопорной массы (Olsen) с однозарядным полисилоксановым ионом м / z = 371,101237. Спектры МС / МС оценивали с использованием SEQUEST и платформы Core Гарвардского университета (Дж.К. Энг, Э. Л. Хаттлин и Дж. Виллен). Поиск файлов проводился в базе данных SwissProt Homo sapiens FASTA. Погрешность измерения массы ± 5 ppm была использована для ионов-предшественников и 0,02 Да для ионов продуктов. Ферментная специфичность была ограничена трипсином, по крайней мере, с одним триптическим (K- или R-содержащим) концом на пептид и допускалось до четырех ошибочных расщеплений. Карбоксамидометилирование цистеина было определено как статическая модификация, а окисление метионина и фосфорилирование остатков серина, треонина и тирозина допускались как вариабельные модификации.Базы данных обратной ловушки были включены для всех поисков, чтобы оценить частоту ложного обнаружения, и отфильтрованы с использованием коэффициента ложного обнаружения 1% в линейном дискриминантном модуле Core. Пептиды также фильтровали вручную с использованием диапазона ошибок массы ± 5 м.д. и присутствия фосфорилированного остатка. Все количественные результаты были получены с использованием Skyline (MacLean) для извлечения интегрированной площади пика соответствующих назначений пептидов. Точность количественных данных обеспечивалась ручным просмотром в Skyline или в файлах ионных хроматограмм.

Протеомика Bio-ID

Клетки PDX2 B-ALL, полученные от пациента, и клетки MCL Jeko1 трансдуцировали с помощью мутантных конструкций IFITM3 (Y20E) или IFITM3 (K83A / K104A), меченных флагом, с помощью N-концевого Turbo-ID BirA (сконструированного биотина). лигаза) и селекция пуромицином в течение трех дней. Конструкцию, экспрессирующую Turbo-ID BirA, помеченную Flag, использовали в качестве отрицательного контроля. Чтобы вызвать биотинилирование белков, проксимальных к IFITM3, клетки обрабатывали 50 мкмоль биотина -1 и антителом против НА для одновременной индукции сшивания IFITM3 в течение 10 мин.Клетки трижды промывали охлажденным PBS и лизировали в буфере IP / WASH (Thermo Fisher Scientific) с 1 × ингибитором протеазы HALT (Thermo Fisher Scientific). Лизаты инкубировали со стрептавидином C1 MyOne Dynabeads (Invitrogen) в течение 16 ч при 4 ° C. Несвязанные белки промывали 3 раза 2% SDS – PBS, 3 раза PBS и 3 раза чистой водой. Элюированные белки очищали в геле с последующим расщеплением в геле и подвергали масс-спектрометрии. Для анализа методом жидкостной хроматографии (ЖХ) и МС / МС пептиды анализировали с использованием системы ЖХ для быстрого разделения Dionex UltiMate 3000 и масс-спектрометра Orbitrap (ThermoFisher Scientific).Образцы пептида по 6 мкл загружали в колонку-ловушку, которая имела размер 150 мкм × 3 см и была заполнена 3-мкм гранулами C18. Аналитическая колонка представляла собой колонку PicoChip 75 мкм × 10,5 см, заполненную гранулами C18 размером 3 мкм (New Objectives). Скорость потока поддерживалась на уровне 300 нл / мин. Растворитель A представлял собой 0,1% муравьиной кислоты (FA) в воде, а растворитель B представлял собой 0,1% FA в ACN. Пептид разделяли с помощью 120-минутного аналитического градиента от 5% ACN и 0,1% FA до 40% ACN и 0,1% FA. Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных.Напряжение источника составляло 2,40 кВ, а температура капилляра составляла 275 ° C. Сканы MS1 были получены от 400–2000 м / z при разрешающей способности 60 000 и автоматической регулировке усиления (AGC), установленной на 1 × 10 6 . 15 наиболее распространенных ионов-предшественников в каждом сканировании MS1 были выбраны для фрагментации. Прекурсоры были отобраны с изоляцией шириной 1 Да и фрагментированы индуцированной столкновением диссоциацией при 35% нормированной энергии столкновения в ионной ловушке; ранее отобранные ионы динамически исключались из повторного выбора на 60 с.Для MS2 AGC было установлено значение 3 × 10 5 . Для анализа данных белки были идентифицированы из исходных файлов масс-спектрометрии с использованием поисковой системы Mascot (Matrix science). Спектры МС / МС анализировали по базе данных SwissProt по человеку. Все поиски включали карбамидометилцистеин как фиксированную модификацию и окисленный Met, деамидированный Asn и Gln и ацетилированный N-конец как вариабельные модификации. Допускались три пропущенных триптических расщепления. Допуск по массе предшественника MS1 был установлен на 10 ppm, а допуск MS2 был установлен на 0.6 Да. На уровне пептида было применено ограничение частоты ложных открытий в 1%. Для дальнейшего изучения рассматривались только белки с минимум двумя пептидами выше порогового значения. Для сравнения с пустым векторным контролем содержания фоновых пептидов для отсутствующих значений были рассчитаны из распределения Гаусса с центром вокруг минимального наблюдаемого содержания с использованием метода MinProb из пакета MSnbase в R.

Анализы протеома клеточной поверхности

Были помечены белки клеточной поверхности с биотином с использованием метода мечения биотина сайта N-связанного гликозилирования 39 .Вкратце, 40 миллионов клеток B-ALL Ifitm3 + / + или Ifitm3 — / — B-ALL дважды промывали и ресуспендировали в 1 мл ледяного PBS и обрабатывали 1,6 мМ метапериодата натрия (VWR). при 4 ° C в течение 20 мин для окисления вицинальных диолов остатков сахаров, связанных с поверхностными белками. Затем клетки дважды промывали PBS для удаления избытка метапериодата натрия. Клетки ресуспендировали в 1 мл ледяного PBS и обрабатывали 1 мМ гидразида биоцитина (Biotium) и 10 мМ анилина (Sigma-Aldrich) при 4 ° C в течение 90 мин с осторожным перемешиванием для получения свободных от биотинилата альдегидов, экспонированных на остатках сахара.После мечения клетки промывали 3 раза ледяным PBS для удаления избытка биотина, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки для масс-спектрометрии. Все эксперименты проводили в трех биологических повторах с повторениями, собранными из последовательных пассажей. Осадки замороженных клеток размораживали на льду в 1 мл буфера RIPA (Millipore) с добавлением 1 × ингибиторов протеазы HALT (Pierce). После инкубации на льду в течение 10 минут клетки разрушали обработкой ультразвуком, а лизаты осветляли центрифугированием при 17000 rcf при 4 ° C в течение 10 минут.Осветленный лизат смешивали с 500 мкл нейтравидиновой агарозной смолы (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 4 ° C в течение 2 ч с перемешиванием конец за концом. Гранулы нейтравидина с захваченными биотинилированными поверхностными белками были тщательно промыты гравитационным потоком для удаления несвязанных белков с использованием 50 мл 1 × RIPA + 1 мМ EDTA, затем 50 мл PBS + 1 M NaCl и, наконец, 50 мл 50 мМ ABC + 2 M буфер мочевины. Промытые шарики ресуспендировали в буфере для переваривания (50 мМ Трис pH 8,5, 10 мМ TCEP, 20 мМ 2-йодацетамид и 1.6 M мочевина) с 10 мкг добавленной трипсиновой протеазы (Pierce,

) для одновременного восстановления дисульфидов, алкилирования и расщепления пептидов на гранулах при комнатной температуре в течение ночи (16–20 ч). После переваривания pH понижали примерно до 2 с помощью чистой трифторуксусной кислоты (Sigma-Aldrich) и смесь пептидов обессоливали с использованием колонки SOLA-HRP (Thermo Fisher Scientific) на вакуумном коллекторе. Обессоленные пептиды элюировали 50% ацетонитрилом (Sigma-Aldrich) и 50% воды с 0,1% TFA и полностью сушили в быстродействующем вакууме.Высушенные пептиды ресуспендировали в воде для ЖХ-МС (Fisher) с 2% ACN и 0,1% FA. Концентрацию пептида измеряли с использованием поглощения 280 нм на Nanodrop, и концентрацию пептида доводили до 0,2 мкг мкл -1 для масс-спектрометрии.

ЖХ-МС и анализ данных для протеома клеточной поверхности

Для каждой реплики 1 мкг пептида вводили в прибор Dionex Ultimate 3000 NanoRSLC с 15-сантиметровым обращенно-фазовым Acclaim PEPMAP C18 (Thermo Fisher Scientific, 164534) столбец.Образцы разделяли на 3,5-часовом нелинейном градиенте с использованием смеси буфера A (0,1% FA) и B (80% ACN / 0,1% FA) от 2,4% ACN до 32% ACN. Элюированные пептиды анализировали с помощью масс-спектрометра Thermo Q-Exactive Plus. Обзорное сканирование масс-спектрометрии было выполнено в диапазоне масс 350–1500 м / z с разрешением 70 000 с максимальным временем инжекции 100 мс. Мы выполнили зависящий от данных сбор данных MS2 с разрешением 17 500, AGC 5 × 10 4 и временем впрыска 150 мс.15 наиболее интенсивных ионов-предшественников были фрагментированы в результате столкновительной диссоциации с более высокой энергией при нормированной энергии столкновения 27. Динамическое исключение было установлено на 20 с, чтобы избежать избыточной выборки высокоразвитых частиц. Файлы необработанных спектральных данных доступны в репозитории ProteomeXchange PRIDE (номер доступа PXD014691). Необработанные спектральные данные были проанализированы с помощью MaxQuant v.1.5.1.2 40 для идентификации и количественной оценки содержания пептидов и осуществлен поиск по аннотированному протеому человека Swiss-Prot от Uniprot (загружено с 20 303 записями).Вариант «совпадение между сериями» был выбран для увеличения идентификации пептидов, а вариант «быстрый LFQ» был выбран для расчета значений количественного определения идентифицированных белков без метки. Для всех остальных настроек оставлены значения MaxQuant по умолчанию. Выходные данные MaxQuant были проанализированы с помощью Perseus 41 и программы R (версия 3.4.0). Белки, помеченные как «обратные», «идентифицированные только по участку» и «потенциальное загрязнение», были отфильтрованы, как и белки, которые были количественно определены менее чем в двух из трех биологических повторов, по крайней мере, в одной экспериментальной группе.Недостающие значения были рассчитаны на основе нормального распределения набора данных, реализованного Perseus. Графики вулканов были созданы с использованием результатов двухвыборочного теста t , сравнивающего log 2 -преобразованных количественных значений количественного содержания белка без метки из разных клеточных линий с коэффициентом ложного обнаружения, установленным на 0,01. Проверка была проведена с помощью проточной цитометрии (дополнительная таблица 1).

Измерение холестерина и липидного слоя

Для истощения холестерина клетки предварительно инкубировали с 5 мМ метил-β-циклодекстрина в течение 30 минут при 37 ° C перед окрашиванием на филиппин.Для окрашивания ганглиозида GM1 клетки метили холерным токсином B с использованием набора для маркировки липидных рафтов Vybrant (Molecular Probes) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки метили единицей холерного токсина В, конъюгированной с Alexa Fluor 594 на льду в течение 15 мин, дважды промывали PBS. Липидные рафты, меченные холер-токсином-B, перекрестно сшивали антителом против холерного токсина-B на льду в течение 15 мин, дважды промывали PBS и анализировали проточной цитометрией.

Трансплантация лейкозных клеток in vivo

Мышиные клетки pre-B ALL, трансформированные BCR-ABL1 или NRAS (G12D), инъецировали сублетально облученным (200 сГр) мышам NOD- scid IL2Rg null (NSG) мышам хвостовая вена.Перед инъекцией случайным образом распределяли самок мышей NSG в возрасте восьми-десяти недель. Мышей умерщвляли, когда у них проявлялись признаки лейкемии, такие как сгорбленная спина, потеря веса и неспособность двигаться, а затем собирали костный мозг и / или селезенку для проверки инфильтрации лейкемии с помощью проточной цитометрии. Анализ выживаемости Каплана-Мейера был выполнен с использованием GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) для сравнения общей выживаемости. Лог-ранговый тест Мантела-Кокса использовали в качестве статистического анализа с помощью GraphPad Prism 7 (дополнительная таблица 3).Минимальное количество мышей в каждой группе рассчитывали с использованием функции «cpower» в пакете Hmisc R. Ослепление не применялось. Все эксперименты на мышах подлежали институциональному одобрению Комитетом по уходу и использованию животных Бекмана научно-исследовательского института города Надежды.

Количественное определение PIP3

Для фиг. 4 60 миллионов жизнеспособных клеток ресуспендировали в охлажденной 0,5 М трихлоруксусной кислоте (TCA) в общем объеме 1 мл и инкубировали на льду в течение 5 мин. Клетки центрифугировали при 3000 об / мин в течение 7 минут при 4 ° C и ресуспендировали в 5% TCA и 1 мМ EDTA в общем объеме 1 мл.После встряхивания в течение 30 с клетки снова промывали 5% TCA и 1 мМ EDTA. Для экстракции нейтральных липидов клетки ресуспендировали в 1 мл MeOH: CHCl 3 (2: 1), перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 5 минут. После еще одной экстракции нейтральных липидов кислотные липиды экстрагировали добавлением 750 мкл MeOH: CHCl 3 : 12 M HCl (80: 40: 1) при интенсивном встряхивании в течение 25 минут при комнатной температуре. После центрифугирования при 3000 об / мин в течение 5 минут супернатант переносили в центрифужную пробирку объемом 2 мл и смешивали с 250 мкл CHCl 3 и 450 мкл 0.1 M HCl, встряхивают в течение 30 с и центрифугируют при 3000 об / мин в течение 5 мин для разделения органической и водной фаз. Пятьсот мкл нижних органических фаз собирали в чистый 1,5-миллилитровый флакон и сушили в вакуумной сушилке в течение 1 часа. Высушенный липид хранили при -20 ° C. В день анализа образцы липидов восстанавливали 200 мкл PBS, содержащего 0,25% стабилизатора белка; 20 мкл использовали для измерения PI (4,5) P 2 , а остальные (180 мкл) использовали для измерения PI (3,4,5) P 3 с использованием набора ELISA (Echelon Biosciences) в соответствии с инструкции производителя.

Экзогенная доставка PIP3

Фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат diC16 (Echelon Biosciences) был свежеприготовлен с помощью PBS в концентрации 2 мМ. Немеченый носитель 2 челночного PIP (гистон h2) был свежеприготовлен с использованием воды в концентрации 2 мМ. PIP 3 в объеме 75 мкл смешивали с 25 мкл носителя PIP и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Сто мкл комплекса PIP 3 – носитель добавляли в клетки Ifitm3 + / + или Ifitm3 — / — B-ALL в общем объеме 5 мл и инкубировали в течение 24 часов.PIP 3 -загруженные Ifitm3 + / + или Ifitm3 — / — B-ALL клетки подвергали колониеобразующему анализу, как показано на рис. 8 с расширенными данными.

Анализ липидного связывания

Для оценки прямого связывания IFITM3 с липидами был проведен анализ связывания липидов с использованием мембранных липидных полосок (Echelon Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, мембраны блокировали 5% -ным БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich) в TBST (50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl и 0.1% Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте с последующей инкубацией в течение ночи с 0,5 мкг / мл рекомбинантных белков в блокирующем буфере при 4 ° C при осторожном встряхивании. После промывки мембран 3 раза в течение 30 минут в TBST, мембраны инкубировали в течение 1 часа с поликлональными антителами против GST-метки (Thermo Fisher Scientific) или антителами к моноклональным антителам против биотина (Cell Signaling Technology), перечисленными в дополнительной таблице 10. Мембраны были инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Invitrogen) и хемилюминесцентным субстратом (Invitrogen), и затем детектировали с помощью системы визуализации UVP BioSpectrum 810 (Thermo Fisher Scientific).Рекомбинантный белок с GST-меткой был приобретен у Sigma-Aldrich. Рекомбинантный белок GST-IFITM3 человека был приобретен у Abnova. Рекомбинантные фрагменты IFITM3 человека, перечисленные в дополнительной таблице 5, были синтезированы в LifeTein.

Предпочтительное накопление PIP3 и связывание с IFITM3 с использованием многомасштабного молекулярно-динамического моделирования.

Структура белка IFITM3 от остатков 58 до 128 была смоделирована методом крупнозернистой молекулярной динамики в GROMACS в явном двойном слое, имитирующем клеточную мембрану.Нет структуры, доступной для IFITM3 или для любого близкого гомолога. Мы рассчитали гидрофобность для каждого положения, используя индекс гидрофобности аминокислот 42 и усредненную гидрофобность по скользящему окну из семи аминокислот. Предыдущие структурные исследования структуры IFITM3 43 показали, что существует только один трансмембранный домен 2, который встроен в мембрану. На основании этого доказательства мы использовали топологию, показанную на дополнительном рис. 9, в качестве начальной структуры.TM1 был создан в виде структуры α-спирали, а мотивы CRAC и линкерная область были построены в виде полностью вытянутой цепи. Линкерная область была ослаблена с использованием 5000 шагов крупномасштабного моделирования с использованием программы GROMACS 44 с силовым полем Мартини 45 для снятия напряжения в системе. Затем мы добавили область TM2 в виде спирали и вставили TM2 в двойной слой, имитирующий клеточную мембрану 46 . Состав и соотношение липидов для смешанного бислоя POPC: DOPC: POPE: DOPE: CHOL: Sph: GM1 = 0.2: 0,2: 0,05: 0,05: 0,25: 0,15: 0,1 для внешней створки бислоя и 0,05: 0,05: 0,20: 0,2: 0,08: 0,08: 0,25: 0,03: 0,03: 0,03 POPC: DOPC: POPE: DOPE: POPS: DOPS: CHOL: PIP1: PIP2: PIP3 для внутренней листовки. Мы создали три возможных стартовых установки для смешанного липидного бислоя с водой в верхней и внутренней областях с помощью CHARMM-GUI 47,48 . Заряды в системе нейтрализовали 0,15 М NaCl. Мы использовали девять повторов структуры белка IFITM3 в боксе для моделирования (дополнительный рис.9а). Первоначальная конфигурация была минимизирована с использованием самого крутого приличного метода для 5000 шагов, а затем уравновешена в ансамбле NPT в течение 5 нс при температуре 303 К и давлении 1 бар. Температура контролировалась термостатом Берендсена 49 с константой связи 1 пс, а давление регулировалось баростатом Берендсена 49 полуизотропного типа с константой связи 5 пс и сжимаемостью 3 × 10 −4. бар -1 . Кулон поля реакции 50 был применен для описания электростатики с отсечкой на 1.1 нм. Предельное значение для ван-дер-ваальсовых взаимодействий также составляло 1,1 нм. Мы использовали интегратор Leap-frog и шаг по времени 20 фс для интегрирования. Все системы сольватировали в модели крупнозернистой воды, принятой в воде силового поля Мартини, нейтрализованной 0,15 М NaCl. Моделирование продукции производилось в течение 10 мкс для каждой из трех исходных конформаций липидного бислоя. Последние 1 мкс траектории от каждой из трех установок были использованы для анализа складчатой ​​структуры области CRAC1 – основной патч – CRAC2 модели IFITM3.Мы сгруппировали конформации IFITM3 по пороговому значению среднеквадратичного отклонения 0,3 нм в основных крупнозернистых частицах в крупнозернистом моделировании. Мы проанализировали паттерны связывания PIP2 и PIP3 в этом наиболее населенном конформационном кластере. Мы наблюдали, что и PIP2, и PIP3 конкурируют за «основной участок» остатков, показанный в аминокислотной последовательности на рис. 9 с расширенными данными. Мы извлекли три снимка из этого конформационного кластера, которые представляют самые разные паттерны связывания PIP2 и PIP3.

Детали моделирования молекулярной динамики всех атомов для связывания фосфолипидов. к системе, полностью состоящей из атомов, с помощью инструментов Martini

51 . Три выбранных снимка были вырезаны в поле 9 × 9-нм 2 с центром в блоке IFITM3 из крупнозернистого моделирования, чтобы сохранить локальную оптимизированную липидную среду.Липид и белок были преобразованы в модель, полностью состоящую из атомов, и были преобразованы в блок моделирования 9 × 9 × 9 нм 3 , нейтрализованный 0,15 М NaCl. Расширенные данные На рис. 9 показано подробное взаимодействие между PIP2 или PIP3 с белком IFITM3 с разрешением всех атомов на этих снимках. Полностью атомное моделирование проводилось с использованием пакета GROMACS 44 и силового поля CHARMM36 52 с водной моделью TIP3. Несвязывающие взаимодействия были рассчитаны с отсечкой 12 Å, и для решения дальнодействующих ван-дер-ваальсовых взаимодействий применялся метод Эвальда 51 из частиц.Каждую систему постепенно нагревали до 310 К со случайными начальными скоростями, выбранными из распределения Больцмана. Процесс нагрева длился 1 нс, температура контролировалась термостатом Нозе – Гувера 53 , после чего следовало 30 нс уравновешивания в ансамбле NPT с ограничениями гармонического положения на тяжелых атомах белка. Давление поддерживали на уровне 1 бар в полуизотропной среде, контролируемом методом Парринелло – Рахмана. Сдерживающая сила постепенно снижалась с 5 ккал / моль до 0 ккал / моль с шагом -1 ккал / моль на окно в 5 нс.Заключительный кадр уравновешивания был взят для производственного цикла. Производственный цикл был выполнен дважды по 50 нс каждый, с двумя разными случайными начальными скоростями, назначенными уравновешенной конструкции. Был использован шаг интегрирования 2 фс. Энергия взаимодействия между PIP3 и белком IFITM3 рассчитывалась как сумма электростатической кулоновской энергии и потенциальной энергии Ван-дер-Ваальса, усредненных по двум траекториям продолжительностью 50 нс, всего 100 нс.

Взаимодействие PIP3 с двумя участками основных остатков

Анализы активации PIP3-связывания и AKT-сигнализации показали, что мутация участка K83 / K104 на K83A / K104A имела более высокий эффект, чем мутация участка R85 / R87 / K88 на R85A / R87A / K88A.Чтобы дополнительно проверить разницу в силе взаимодействия между PIP3 и двумя базовыми патчами, мы преобразовали все PIP1 и PIP2 в окне моделирования в PIP3. Далее мы выполнили моделирование на IFITM3 (K83A / K104A) и IFITM3 (R85A / R87A / K88A) в окне моделирования только для PIP3. Начиная с этой структуры, мы выполнили уравновешивание системы и 5 моделирования производства полностью атомной молекулярной динамики (каждое длительностью 200 нс), используя протокол для моделирования полностью атомной молекулярной динамики, описанный в ‘Подробности моделирования полностью атомной молекулярной динамики для связывания фосфолипидов ».Мы суммировали последние 100 нс траекторий моделирования из каждого из 5 прогонов, которые мы добавили к 500 нс траекторий моделирования молекулярной динамики для анализа. Мы рассчитали энергию взаимодействия как сумму электростатических кулоновских и ван-дер-ваальсовых потенциальных энергий между PIP3 и остатками, образующими только базовый участок (K83 / K104 или R85 / R87 / K88). Энергии взаимодействия усреднялись по 500 нс агрегированных траекторий молекулярно-динамического моделирования для каждой системы. Мы повторили эти расчеты энергии взаимодействия для IFITM3 дикого типа и для мутантных конструкций K83A / K104A и R85A / R87A / K88A.

Расчеты тепловой карты контактной частоты на основе моделирования молекулярной динамики

Важной информацией, которую можно извлечь из моделирования молекулярной динамики, является временная частота контактов PIP3 с двумя основными остаточными пятнами. Постоянство этих взаимодействий играет важную роль в накоплении PIP3 с помощью IFITM3. Мы рассчитали процент снимков молекулярной динамики, которые показывают контакты между каждым из остатков в основном пластыре. Это называется контактной частотой.Мы также рассчитали процент снимков молекулярной динамики, которые показывают одновременные контакты PIP3 с двумя или более остатками в двух участках основных остатков. Мы создали тепловую карту, используя частоты, рассчитанные для IFITM3 дикого типа и у мутантов аланина.

Количественная ПЦР в реальном времени

Костный мозг здорового донора окрашивали и сортировали, как описано ранее 54 . Тотальную РНК из клеток экстрагировали с помощью набора для выделения РНК от Macherey – Nagel.Комплементарная ДНК была создана с помощью qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием FAST SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) и системы ПЦР в реальном времени Vii7 (Applied Biosystems) в соответствии со стандартными условиями ПЦР. COX6B использовали в качестве контрольного гена.

Измерения акустического рассеяния

Нормированное по размеру единичное акустическое рассеяние (SNACS) было измерено с использованием ранее установленного микрофлюидного метода, который, как было показано, особенно чувствителен к жесткости клеточной поверхности 55 .Полную информацию об измерениях можно найти в предыдущей публикации 55 . Вкратце, клетки протекали через стоячую акустическую волну, генерируемую внутри вибрирующего подвешенного микроканального резонатора (SMR). SMR представляет собой консольный инструмент для измерения массы 56 , который также может обнаруживать акустическое рассеяние от клеток, когда клетки проходят через акустическую волну. Частота колебаний кантилевера отслеживалась, и ее смещение использовалось для количественной оценки акустического рассеяния от ячеек, а также плавучей массы ячеек.Перед проведением серии измерений SMR очищали 0,25% трипсином – ЭДТА в течение 20 минут, затем использовали 5% отбеливатель в течение 3 минут и затем 5-минутное полоскание деионизированным H 2 O для удаления стойких биологических остатков. . После очистки SMR пассивировали PLL-g-PEG с концентрацией 1 мг / мл в H 2 O в течение 10 минут при комнатной температуре с последующей 5-минутной промывкой нормальной средой для культивирования клеток. Во время измерения все образцы загружали в SMR через трубку из фторированного этиленпропилена с внутренним диаметром 0,005 дюйма.Поток жидкости через SMR управлялся тремя независимыми электронными регуляторами давления и тремя соленоидными клапанами. Постоянный перепад давления был приложен к SMR для поддержания постоянного сдвига и скорости передачи данных для измерения ячейки. Данные, отображаемые на рис. 8a в расширенных данных, были получены с использованием кантилевера длиной 350 мкм с кантилевером размером 15 × 20 мкм и временем прохождения через кантилевер примерно 200 мс. Все регуляторы, клапаны и сбор данных контролировались специальным программным обеспечением, написанным в LabVIEW 2017 (National Instruments), как подробно описано в предыдущей публикации 55 .Параллельное измерение объема с использованием счетчика Коултера (Beckman Coulter) было выполнено для количественной оценки среднего объема клеток, которое использовалось вместе с измерениями плавучей массы отдельных клеток для расчета SNACS для каждой клетки, как сообщалось ранее 55 . Все измерения проводили в нормальной среде для культивирования клеток при комнатной температуре в течение 10 мин после извлечения клеток из инкубатора для культивирования клеток. После измерения необработанных клеток Jeko1 из инкубатора был получен новый участок таких же клеток, обработанный 10 мкг мл -1 F (ab ‘) 2 фрагмент козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) и клетки немедленно (в течение примерно 1 мин) загружали в SMR для измерения.Клетки Jeko1, обработанные антителами, измеряли в течение примерно 7 минут, чтобы убедиться, что изменения, стимулированные античеловеческой μ-цепью, не были обращены вспять во время эксперимента. SMR кратковременно промывали PBS между экспериментами. Клетки Jeko1 дикого типа также измеряли после фиксации для получения положительного контроля жесткости клеток. Для фиксации клетки дважды промывали PBS, смешивали с 8% PFA в течение 30 мин, дважды промывали PBS и хранили при 4 ° C перед измерениями акустического рассеяния.

Количественная оценка и статистический анализ

Данные представлены как среднее ± s.d. если не указано иное. Статистический анализ был выполнен с помощью GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) с использованием непарного двустороннего теста t или как указано в подписях к рисункам. Значимость считалась P <0,05. Для экспериментов по трансплантации in vivo минимальное количество мышей в каждой группе было рассчитано с использованием функции «cpower» в пакете Hmisc Р. Каплана-Мейера. Анализ выживаемости был использован для оценки общей выживаемости с помощью GraphPad Prism 7. Mantel-Cox. Логранговый тест использовался для сравнения разницы между двумя группами.Мышей не исключали. Для анализа общей выживаемости пациентов в каждом наборе данных пациенты были разделены на две группы в зависимости от того, была ли их экспрессия выше или ниже среднего уровня IFITM3 , а для оценки общей выживаемости использовался анализ выживаемости Каплана-Мейера. Используемые наборы данных включают данные о результатах пациентов для B-ALL (Детская онкологическая группа (COG) P9906, n = 207; Восточная кооперативная онкологическая группа (ECOG) E2993, n = 83; и St Jude, n = 15), лимфому из клеток мантии (Проект молекулярного профилирования лимфомы / лейкемии (LLMPP), n = 92) и острый миелоидный лейкоз (Атлас генома рака (TCGA), n = 200).Для сравнения различий в выживаемости между группами пациентов использовался лог-ранговый тест.

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *