Гк рф ч 2 ст 20: ГК РФ Статья 20. Место жительства гражданина / КонсультантПлюс

0Доннарумма

Кто лучшие полузащитники в режиме карьеры в FIFA 21?

И снова лучший талант стоит целое состояние. В данном случае — Jadon Sancho . Мы уверены, что «Манчестер Юнайтед» ненавидит эту цену в 105,5 миллионов евро, но для наших намерений и целей молодой игрок «Реала» Такухиро Накаи справляется со своей задачей. Японский игрок повысится с 62 до 86.

Кто лучшие атакующие в режиме карьеры FIFA 21?

Килиан Мбаппе не прошел квалификацию из-за его и без того высокого стартового общего рейтинга, что позволяет Эрлингу Хааланду и Жоао Феликсу возглавить список. Излишне говорить, что оба они довольно дорогие. Дэйн Скарлетт , наш 26-точечный скалолаз, не таков, поэтому вам следует попытаться увести его от шпор на раннем этапе.

0

Итак, вот они, лучших талантов в FIFA 21 . За этими игроками будущее вашей тренерской карьеры. Как всегда, не забудьте гарантировать игрокам достаточно игрового времени, чтобы они могли полностью раскрыть свой потенциал. Мы также можем порекомендовать кредитную систему в FIFA 21, которая наконец-то работает нормально. В других клубах таланты могут получить необходимый опыт, прежде чем они станут вашими постоянными клиентами.

Подробнее:

Вам нужен лучший контент FIFA ? Будь то FUT , Career Mode , News , Tips & Tricks , FIFA 22 , SBCs или eSports — с MyEarlyGame вы всегда на шаг впереди.

Rhyme Time | Учебная программа EL

A.Rhyme Time

• (Предлагаемая переходная песня, спетая на мелодию «Frère Jacques»):

«Теперь время рифм, теперь время рифм. Слушайте звуки, слышите звуки. Слушайте образец, слушайте образец. В конце, в конце ».

• Учебная практика Begin the Rhyme Time:

1. Учитель говорит: «Сегодня мы снова собираемся исследовать некоторые звуки в словах в стихотворении, но прежде чем мы это сделаем, мы собираемся сыграть в игру. .Вот как это происходит: я говорю слово, а затем указываю на объект. Вы произносите название объекта, а затем мы выясняем, рифмуются ли эти два слова или нет ».

2. Учитель произносит слово «пчела», затем касается своего колена и говорит: «/ п /…», а ученики говорят: «колено».

3. Учитель предлагает ученикам сказать оба слова.

4. Учитель спрашивает:

«Рифмуются ли эти слова?» (да)

«Откуда ты знаешь?» (звучит так же в конце)

«Какая часть слова помогает нам узнать, что они рифмуются? Начало или конец? » (конец)

«Какой звук у них обоих в конце?» (/ ē /)

«Вы можете придумать другое слово, которое рифмуется со словом« пчела »и« колено »?» (ответы могут отличаться.)

5. Учитель произносит слово «пчела», затем касается своей стопы и говорит: «Ты говоришь / ф /…»

6. Ученики говорят: «стопа».

7. Учитель предлагает студентам сказать оба слова.

8. Учитель спрашивает:

«Рифмуются ли эти слова?» (нет)

«Откуда вы знаете?» (в конце звучит иначе)

9. Учитель повторяет шаги со следующими парами слов: «высокий» / «стена» и «стул» / «дверь».

10. Учитель говорит: «Давайте посмотрим, сможем ли мы быть сыщиками и найти рифмующиеся слова в нашем стихотворении.

11. Учитель предлагает студентам вместе с ним или с ней прочитать вслух стихотворение .

12. Учитель спрашивает:

«Слышали ли вы рифмующиеся слова?»

«Какие слова рифмуются?»

«Откуда вы знаете, что слова рифмуются?»

13. Учитель предлагает ученикам встать и вместе читать первые две строчки, подпрыгивая, когда они слышат рифмованное слово. Учитель спрашивает:

«На какие слова мы прыгнули?» («день» и «игра»)

«Какая часть слова заставляет их рифмовать? Начало или конец? » (конец)

14.Повторите шаг 13 со следующими двумя строками стихотворения, прыгая на слова «милый» и «тритон», а затем «ручей и взгляд».

15. Повторите шаг 13 с последними тремя строками стихотворения, переходя на «быстро», «последнее» и «прошлое».

16. Учитель говорит: «Давайте теперь прочтем все это стихотворение вслух, чувствуя рифму в наших телах и во рту.

% PDF-1.7 % 9686 0 объект > эндобдж xref 9686 100 0000000016 00000 н. 0000004411 00000 н. 0000004774 00000 н. 0000004811 00000 н. 0000004903 00000 н. 0000004981 00000 п. 0000005071 00000 н. 0000005151 00000 п. 0000005240 00000 н. 0000005273 00000 н. 0000005369 00000 н. 0000005398 00000 п. 0000005537 00000 н. 0000008021 00000 н. 0000008293 00000 п. 0000008464 00000 н. 0000008635 00000 н. 0000008803 00000 н. 0000008974 00000 п. 0000009145 00000 н. 0000009316 00000 п. 0000009486 00000 н. 0000009657 00000 н. 0000009828 00000 п. 0000009999 00000 н. 0000010170 00000 п. 0000010340 00000 п. 0000010510 00000 п. 0000010681 00000 п. 0000010851 00000 п. 0000011021 00000 п. 0000011192 00000 п. 0000011363 00000 п. 0000011534 00000 п. 0000011705 00000 п. 0000011876 00000 п. 0000012047 00000 п. 0000012218 00000 п. 0000012389 00000 п. 0000012560 00000 п. 0000012731 00000 п. 0000012902 00000 н. 0000013072 00000 п. 0000013636 00000 п. 0000013675 00000 п. 0000013790 00000 п. 0000013903 00000 п. 0000014169 00000 п. 0000014777 00000 п. 0000016755 00000 п. 0000017406 00000 п. 0000017672 00000 п. 0000018321 00000 п. 0000018465 00000 п. 0000018494 00000 п. 0000019011 00000 п. 0000019082 00000 п. 0000019144 00000 п. 0000019242 00000 п. 0000019304 00000 п. 0000032523 00000 п. 0000032585 00000 п. 0000032998 00000 н. 0000033060 00000 п. 0000053675 00000 п. 0000053737 00000 п. 0000067103 00000 п. 0000067165 00000 п. 0000067446 00000 п. 0000067508 00000 п. 0000067570 00000 п. 0000067632 00000 п. 0000067694 00000 п. 0000067756 00000 п. 0000067818 00000 п. 0000067880 00000 п. 0000067942 00000 п. 0000068004 00000 п. 0000068066 00000 п. 0000068128 00000 п. 0000068190 00000 п. 0000068252 00000 п. 0000068314 00000 п. 0000068376 00000 п. 0000068438 00000 п. 0000068500 00000 п. 0000068562 00000 п. 0000068624 00000 п. 0000071275 00000 п. 0000071337 00000 п. 0000071399 00000 н. 0000071461 00000 п. 0000073563 00000 п. 0000073604 00000 п. 0000075147 00000 п. 0000077421 00000 п. 0000080567 00000 п. 0000086824 00000 п. 0000004074 00000 н. 0000002348 00000 п. трейлер ] / Назад 4249413 / XRefStm 4074 >> startxref 0 %% EOF 9785 0 объект > поток h ޴ ViPSW> o! P% 1DC ت 4 n- Պ u ۋ «Ժ Ri @ m ݨ k ܭ [v:? zȂm w & wswν

Свободные радикалы, антиоксиданты в болезнях и здоровье

В организме есть несколько механизмов противодействия окислительному стрессу путем выработки антиоксидантов естественным путем. генерируются in situ (эндогенные антиоксиданты) или поступают извне через пищевые продукты (экзогенные антиоксиданты).Роль антиоксидантов состоит в том, чтобы нейтрализовать избыток свободных радикалов, защитить клетки от их токсического воздействия и способствовать профилактике заболеваний.

Классификация антиоксидантов

Эндогенные соединения в клетках можно разделить на ферментные антиоксиданты и неферментативные антиоксиданты.

Основными антиоксидантными ферментами, непосредственно участвующими в нейтрализации ROS и RNS, являются: супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT), глутатионпероксидаза (GPx) и глутатионредуктаза (GRx) (6-12).СОД, первая линия защиты от свободных радикалов, катализирует дисмутацию супероксид-анион-радикала (O ₂ ^{• —} ) в пероксид водорода (H ₂ O ₂ ) путем восстановления. Образовавшийся окислитель (H ₂ O ₂ ) превращается в воду и кислород (O ₂ ) под действием каталазы (CAT) или глутатионпероксидазы (GPx). Фермент селенопротеин GPx удаляет H ₂ O ₂ , используя его для окисления восстановленного глутатиона (GSH) в окисленный глутатион (GSSG).Глутатионредуктаза, фермент флавопротеина, регенерирует GSH из GSSG с НАДФН в качестве источника восстанавливающей силы. Помимо перекиси водорода, GPx также восстанавливает липидные или нелипидные гидропероксиды при окислении глутатиона (GSH) (2, 5-10).

Неферментные антиоксиданты также подразделяются на метаболические антиоксиданты и питательные антиоксиданты. Метаболические антиоксиданты, принадлежащие к эндогенным антиоксидантам, вырабатываются метаболизмом в организме, такие как липоидная кислота, глутатион, L-аригинин, кофермент Q10, мелатонин, мочевая кислота, билирубин, хелатирующие металлы белки, трансферрин и т. Д. (5, 6).В то время как питательные антиоксиданты, принадлежащие к экзогенным антиоксидантам, представляют собой соединения, которые не могут вырабатываться в организме и должны поступать с продуктами питания или добавками, такими как витамин E, витамин C, каротиноиды, микроэлементы металлов (селен, марганец, цинк), флавоноиды, омега-кислоты. 3 и омега-6 жирные кислоты и т. Д.

Антиоксидантный процесс

Когда антиоксидант разрушает свободный радикал, сам этот антиоксидант окисляется. Поэтому в организме необходимо постоянно восстанавливать антиоксидантные ресурсы.Таким образом, в то время как в одной конкретной системе антиоксидант эффективен против свободных радикалов, в других системах тот же антиоксидант может стать неэффективным. Кроме того, в определенных обстоятельствах антиоксидант может даже действовать как прооксидант, например он может генерировать токсичные АФК / РНС (10). Антиоксидантный процесс может действовать одним из двух способов: разрыв цепи или предотвращение. Для разрыва цепи, когда радикал высвобождает или крадет электрон, образуется второй радикал. Последний оказывает такое же действие на другую молекулу и продолжается до тех пор, пока либо образовавшийся свободный радикал не стабилизируется антиоксидантом, разрывающим цепь (витамин C, E, каротиноиды и т. Д.), Либо он просто не распадется на безвредный продукт.Классический пример такой цепной реакции — перекисное окисление липидов. В профилактических целях антиоксидантный фермент, такой как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза, может предотвращать окисление за счет снижения скорости инициирования цепи, например, либо путем удаления инициирующих свободных радикалов, либо путем стабилизации радикалов переходных металлов, таких как медь и железо (10).

Питательные антиоксиданты

Антиоксиданты из нашего рациона играют важную роль в помощи эндогенным антиоксидантам в нейтрализации окислительного стресса.Дефицит питательных антиоксидантов — одна из причин многочисленных хронических и дегенеративных патологий. Каждое питательное вещество уникально с точки зрения его структуры и антиоксидантной функции (6, 38).

Витамин E. Витамин E — жирорастворимый витамин с высокой антиоксидантной активностью. Витамин E представляет собой хиральное соединение с восемью стереоизомерами: α, β, γ, δ токоферол и α, β, γ, δ токотриенол. Только альфа-токоферол является наиболее биологически активной формой у человека. Исследования как на животных, так и на людях показывают, что природный правовращающий d-α-токоферол почти в два раза эффективнее синтетического рацемического dl-α-токоферола (39).Поскольку α-токоферол является жирорастворимым, он защищает клеточные мембраны от повреждения свободными радикалами. Его антиоксидантная функция в основном заключается в защите от перекисного окисления липидов. Витамин Е был предложен для профилактики рака толстой кишки, простаты и груди, некоторых сердечно-сосудистых заболеваний, ишемии, катаракты, артрита и некоторых неврологических расстройств. (40). Однако недавнее исследование показало, что ежедневные дозы альфа-токоферола 400 МЕ или более могут увеличить риск смерти, и их следует избегать.Напротив, нет повышенного риска смерти при дозе 200 МЕ в день или меньше, и даже может быть некоторая польза (41). Хотя это вызывает споры, к использованию длительного приема витамина Е в высоких дозах следует подходить с осторожностью, пока не появятся дополнительные доказательства его безопасности. Диетические источники витамина Е — растительные масла, масло зародышей пшеницы, цельнозерновые, орехи, злаки, фрукты, яйца, птица, мясо (6, 40). Приготовление и хранение могут разрушить природный d-α-токоферол в пищевых продуктах (40).

Витамин C. Витамин C, также известный как аскорбиновая кислота, представляет собой водорастворимый витамин. Он необходим для биосинтеза коллагена, карнитина и нейромедиаторов (42). Польза для здоровья витамина С — антиоксидант, антиатерогенность, антиканцерогенность, иммуномодулятор. Положительный эффект витамина С заключается в снижении заболеваемости раком желудка и предотвращении рака легких и колоректального рака. Витамин C действует синергетически с витамином E, подавляя свободные радикалы, а также восстанавливает восстановленную форму витамина E.Однако потребление высоких доз витамина С (2000 мг или более в день) было предметом дискуссий из-за его возможных прооксидантных или канцерогенных свойств (42-43). Природные источники витамина С — кислые фрукты, зеленые овощи, помидоры. Аскорбиновая кислота — лабильная молекула, поэтому она может теряться во время приготовления (43).

Бета-каротин, Бета-каротин является жирорастворимым членом каротиноидов, которые считаются провитаминами, поскольку они могут превращаться в активный витамин А.Бета-каротин превращается в ретинол, необходимый для зрения. Это сильный антиоксидант и лучший гаситель синглетного кислорода. Однако добавление бета-каротина в дозах 20 мг в день в течение 5-8 лет было связано с повышенным риском рака легких и простаты и повышением общей смертности курильщиков сигарет (44). Бета-каротин в дозе 20–30 мг в день у курильщиков также может увеличить смертность от сердечно-сосудистых заболеваний на 12–26% (44). Эти побочные эффекты не наблюдаются у людей, употребляющих продукты с высоким содержанием бета-каротина.Бета-каротин присутствует во многих фруктах, зернах, масле и овощах (морковь, зеленые растения, кабачки, шпинат) (6).

Ликопин. Ликопин, каротиноид, обладает антиоксидантными и антипролиферативными свойствами на животных и исследований in vitro, исследований на линиях клеток груди, простаты и легких, хотя противораковая активность у людей остается спорной (6, 45, 46). Было обнаружено, что ликопин оказывает очень сильное защитное действие, особенно при раке простаты (46). Несколько проспективных когортных исследований обнаружили связь между высоким потреблением ликопина и снижением заболеваемости раком простаты, хотя не все исследования дали согласованные результаты (45).Основным диетическим источником ликопина являются помидоры, причем ликопин в приготовленных помидорах, томатном соке и томатном соусе более биодоступен, чем в сырых помидорах (38).

Селен (Se). Se — это микроэлемент, содержащийся в почве, воде, овощах (чеснок, лук, зерна, орехи, соя), морепродуктах, мясе, печени, дрожжах (6). Он образует активный центр нескольких антиоксидантных ферментов, включая глутатионпероксидазу. В низких дозах Se имеет антиоксидантное, антиканцерогенное действие и иммуномодулятор (47).Селен также необходим для функции щитовидной железы (48). Превышение допустимого верхнего уровня потребления 400 мкг Se / день может привести к селенозу, который представляет собой отравление селеном, характеризующееся желудочно-кишечными расстройствами, выпадением волос и ногтей, циррозом, отеком легких и смертью (48). Дефицит селена может возникать у пациентов, получающих полное парентеральное питание (ПП), и у пациентов с желудочно-кишечными расстройствами. В некоторых районах Китая с бедной Se почвой у людей развилась смертельная кардиомиопатия, называемая болезнью Кешана, которую вылечили с помощью добавки Se (48).Роль Se в профилактике рака была предметом недавних исследований и дискуссий. Результаты клинических и когортных исследований по профилактике рака, особенно рака легких, толстой кишки и простаты, неоднозначны (10, 48).

Флавоноиды. Флавоноиды — это полифенольные соединения, которые присутствуют в большинстве растений. В соответствии с химической структурой более 4000 флавоноидов были идентифицированы и классифицированы на флаванолы, флаваноны, флавоны, изофлавоны, катехины, антоцианы, проантоцианидины.Благоприятное воздействие флавоноидов на здоровье человека в основном связано с их мощной антиоксидантной активностью (49). Сообщалось, что они предотвращают или замедляют развитие ряда хронических и дегенеративных заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, артрит, старение, катаракта, потеря памяти, инсульт, болезнь Альцгеймера, воспаление, инфекция. Каждое растение содержит уникальную комбинацию флавоноидов, поэтому разные травы, богатые этими веществами, по-разному влияют на организм (50). Основные природные источники флавоноидов включают зеленый чай, виноград (красное вино), яблоко, какао (шоколад), гинкго билоба, сою, куркуму, ягоды, лук, брокколи и т. Д.

Например, зеленый чай является богатым источником флавоноидов, особенно флавонолов (катехинов) и кверцетина. Уровень катехинов в зеленом чае в 4-6 раз больше, чем в черном чае. Многие преимущества зеленого чая для здоровья заключаются в его антиоксидантной, антиканцерогенной, антигиперхолестеринемической, антибактериальной (кариес зубов) и противовоспалительной активности (51).

Омега-3 и омега-6 жирные кислоты. Это незаменимые длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, потому что человеческий организм не может их синтезировать.Следовательно, их получают только с пищей. Омега-3 жирные кислоты содержатся в жирной рыбе (лосось, тунец, палтус, сардины, минтай), криле, водорослях, грецких орехах, ореховом масле и льняном семени. Однако некоторых крупных рыб, таких как кафельник, акула, рыба-меч, следует избегать из-за высокого содержания в них ртути (52). Существует три основных диетических типа омега-3 жирных кислот: эйкозапентаеновая кислота (EPA), докозагексаеновая кислота (DHA) и альфа-линоленовая кислота (ALA). ЭПК и ДГК в изобилии содержатся в рыбе и напрямую используются организмом; в то время как АЛК содержится в орехах и должна быть преобразована организмом в ДГК и ЭПК.Пищевые источники жирных кислот омега-6 (линолевая кислота) включают растительные масла, орехи, злаки, яйца, мясо птицы. Важно поддерживать соответствующий баланс омега-3 и омега-6 в рационе, поскольку эти два вещества работают вместе для укрепления здоровья (52, 53). Жирные кислоты омега-3 помогают уменьшить воспаление, а большинство жирных кислот омега-6 способствуют воспалению. Несоответствующий баланс этих незаменимых жирных кислот способствует развитию болезней, а правильный баланс помогает поддерживать и даже улучшать здоровье.Здоровая диета должна содержать примерно в 2-4 раза больше омега-6, чем омега-3. В американской диете омега-6 в 14-25 раз больше, чем омега-3, что объясняет рост воспалительных заболеваний в США (52). Омега-3 уменьшают воспаление и предотвращают хронические заболевания, такие как болезни сердца, инсульт, потеря памяти, депрессия, артрит, катаракта, рак. Омега-6 улучшают диабетическую невропатию, экзему, псориаз, остеопороз и помогают в лечении рака (38, 52, 53).

Наконец, некоторые эндогенные антиоксиданты, такие как L-аргинин, кофермент Q-10, мелатонин, в последнее время используются в качестве добавок для профилактики или лечения некоторых хронических и дегенеративных заболеваний (54-56).Сообщаем, что приведенный здесь список антиоксидантов не является исчерпывающим.

Иммуногенность и эффективность векторной вакцины-кандидата COVID-19 MVA-SARS-2-S в доклинической вакцинации

Значение

Высокоаттенуированный вирус осповакцины MVA лицензирован как вакцина против оспы; в качестве вектора он является компонентом одобренной первичной буст-вакцины на основе аденовируса-MVA против болезни, вызванной вирусом Эбола. Здесь мы представляем результаты тестирования вакцины-кандидата COVID-19 MVA-SARS-2-S, векторной вакцины на основе поксвируса, которая прошла клиническую оценку.При внутримышечном введении MVA-SARS-2-S экспрессирует и безопасно доставляет полноразмерный белок SARS-CoV-2 S, вызывая сбалансированный SARS-CoV-2-специфический клеточный и гуморальный иммунитет и защитную эффективность у вакцинированных мышей. Был получен значительный клинический опыт с векторами MVA с использованием гомологичных и гетерологичных первичных бустеров, включая иммунизацию детей и лиц с ослабленным иммунитетом. Таким образом, MVA-SARS-2-S представляет собой важный ресурс для разработки дополнительных оптимизированных вакцин против COVID-19.

Abstract

Тяжелый острый респираторный синдром (SARS). Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) стал инфекционным агентом, вызывающим пандемию коронавируса 2019 г. (COVID-19) с драматическими последствиями для здоровья людей и экономики во всем мире. Ранее мы прошли клиническую оценку нашей векторной вакцины на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) против коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), который вызывает инфекцию у людей, аналогичную SARS и COVID-19.Здесь мы описываем создание и доклиническую характеристику рекомбинантного MVA, экспрессирующего полноразмерный спайковый (S) белок SARS-CoV-2 (MVA-SARS-2-S). Генетическая стабильность и характеристики роста MVA-SARS-2-S, плюс его высокая экспрессия S-белка в качестве антигена, делают его подходящей вакциной-кандидатом для промышленного производства. Вакцинированные мыши продуцировали S-специфические CD8 ⁺ Т-клетки и сывороточные антитела, связывающиеся с S-белком, которые нейтрализовали SARS-CoV-2. Прайм-буст-вакцинация мышей, защищенных MVA-SARS-2-S, сенсибилизированных аденовирусом человека, экспрессирующим ACE2, от инфекции SARS-CoV-2.MVA-SARS-2-S в настоящее время исследуется в рамках фазы I клинических испытаний в качестве претендента на разработку безопасной и эффективной вакцины против COVID-19.

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), возбудитель коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), впервые появился в конце 2019 г. в Китае (1). SARS-CoV-2 демонстрирует чрезвычайно эффективную передачу от человека к человеку, новый патоген быстро распространился по всему миру и в течение нескольких месяцев вызвал глобальную пандемию, изменив повседневную жизнь миллиардов людей.Летальность от COVID-19 составляет ~ 2–5%, что делает разработку контрмер глобальным приоритетом. Фактически, разработка вакцин-кандидатов COVID-19 продвигается на международном уровне с беспрецедентной скоростью. Примерно через год после первых известных случаев COVID-19 мы можем насчитать> 80 вакцин, специфичных для SARS-CoV-2, в клинических оценках и> 10 вакцин-кандидатов уже в испытаниях фазы III (2–4). Однако у нас все еще отсутствует информация об основных иммунных механизмах, необходимых для защиты от COVID-19.Лучшее понимание типов иммунного ответа, вызванного естественными инфекциями SARS-CoV-2, стало важным компонентом для оценки перспектив различных стратегий вакцинации (5).

Белок шипа (S) SARS-CoV-2 служит наиболее важным антигеном-мишенью для разработки вакцины, основанной на доклинических исследованиях вакцин-кандидатов против SARS-CoV или коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV). Тримерный S-белок представляет собой заметную структуру на поверхности вириона и необходим для проникновения в клетки SARS-CoV-2.Как вирусный слитый белок класса I, он опосредует взаимодействие вируса с клеточным рецептором ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2) и слияние с мембраной клетки-хозяина, что является ключевыми этапами инфицирования. Таким образом, инфекцию можно предотвратить с помощью S-специфических антител, нейтрализующих вирус (6⇓⇓ – 9).

Среди передовых вакцин — новые технологии, такие как вакцины на основе матричной РНК (мРНК) и нереплицирующиеся векторные вакцины на основе аденовируса (10⇓⇓ – 13). Первые сообщения об этих вакцинах, специфичных для SARS-CoV-2-S в клинических исследованиях фазы 1/2, продемонстрировали приемлемую безопасность и многообещающие профили иммуногенности, и к настоящему времени данные крупных клинических испытаний фазы 3 показывают многообещающие уровни защитной эффективности (4, 12+). –14).В декабре 2020 года первые вакцины COVID-19 на основе мРНК получили разрешение на экстренное использование или условную лицензию от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и Европейского агентства по лекарственным средствам (11, 15, 16). К марту 2021 года две вакцины COVID-10 на основе аденовирусного вектора были одобрены регулирующими органами (17, 18). Это хорошая новость, потому что эффективные вакцины обеспечат стратегию изменения динамики передачи SARS-CoV-2. Кроме того, несколько типов вакцины будут полезны для удовлетворения конкретных потребностей различных целевых групп населения.Это включает в себя возможность использования гетерологичных стратегий иммунизации в зависимости от состояния здоровья человека, возможностей повышения и необходимости сбалансированных гуморальных и Th2-направленных клеточных иммунных ответов.

MVA, высокоаттенуированный штамм вируса осповакцины, происходящий в результате селекции роста на культурах тканей куриных эмбрионов, обнаруживает характерный дефект репликации в клетках млекопитающих, но позволяет не нарушать продукцию гетерологичных белков (19). В настоящее время MVA служит платформой передовых вакцин для разработки новых векторных вакцин против инфекционных заболеваний, включая появляющиеся вирусы и рак (20).В ответ на продолжающуюся пандемию платформа векторной вакцины MVA позволяет быстро создавать экспериментальные вакцины, специфичные для SARS-CoV-2 (21). Предыдущая работа нашей лаборатории касалась разработки вакцины-кандидата MVA против MERS с иммунизацией на животных моделях, демонстрирующей безопасность, иммуногенность и защитную эффективность MVA-индуцированного S-антиген-специфического иммунитета MERS-CoV (22–25). Клиническая безопасность и иммуногенность вакцины-кандидата MVA-MERS-S была установлена ​​в ходе первого клинического исследования фазы I на людях, финансируемого Немецким центром исследований инфекций (DZIF) (26).

Здесь мы показываем, что рекомбинантный MVA продуцирует полноразмерный S-белок SARS-CoV-2 в виде N-гликозилированного белка массой от ~ 190 до 200 кДа. Наши исследования подтвердили расщепление зрелого полноразмерного белка S на амино-концевой домен (S1) и концевой карбоксильный домен (S2) размером от 80 до 100 кДа, который прикреплен к мембране. При испытании в качестве вакцины на мышах BALB / c рекомбинантный MVA, экспрессирующий белок S, индуцировал SARS-CoV-2-специфические Т-клетки и антитела и надежно защищал вакцинированных животных от инфекции легких после заражения SARS-CoV-2.

Результаты

Дизайн и создание векторных вирусов-кандидатов MVA.

кДНК, содержащая полную последовательность гена, кодирующего белок SARS-CoV-2-S (SARS-2-S) из изолята вируса Wuhan HU-1 (номер доступа в GenBank MN7.1), была помещена под транскрипционный контроль усиленного синтетический ранний / поздний промотор вируса осповакцины PmH5 (27) в векторной плазмиде pIIIH5red-SARS-2-S MVA, введенный путем гомологичной рекомбинации в сайт делеции III в геноме MVA (рис.1 А ). Клональные рекомбинантные вирусы MVA, экспрессирующие SARS-2-S (MVA-SARS-2-S), были выделены при повторной очистке бляшек с использованием временного совместного производства флуоресцентного маркерного белка mCherry для скрининга красных флуоресцентных клеточных очагов (22, 28). ПЦР-анализ вирусной ДНК подтвердил генетическую целостность рекомбинантных вирусов, продемонстрировав сайт-специфическую вставку последовательностей гетерологичного гена SARS-2-S в геном MVA, а затем надлежащее удаление маркерного гена mCherry из генома конечного рекомбинантного вируса. вирусы (рис.1 В ). Изоляты вируса MVA-SARS-2-S были генетически стабильными и показали ожидаемую MVA-специфическую генетику в отношении характерных делеций и изменений последовательности в геноме MVA ( SI Приложение , рис. S1). Рекомбинантные вирусы эффективно реплицировались в клеточной линии фибробластов куриного эмбриона DF-1, но не в клеточных линиях человека HeLa, A549 или HaCat (фиг. 1 C ).

Конструкция и вирусологическая характеристика MVA-SARS-2-S. ( A ) Схематическая диаграмма генома MVA с основными сайтами делеции с I по VI.Сайт делеции III служил для вставки последовательности гена SARS-CoV-2 S (SARS-2-S). SARS-2-S контролировался вирус-специфическим промотором PmH5 и вставлялся посредством гомологичной рекомбинации между последовательностями ДНК MVA (фланк-1 и фланк-2), прилегающими к сайту делеции III в геноме MVA, и копиями, клонированными в плазмиде вектора MVA pIIIH5red. -САРС-2-С. Экспрессию красного флуоресцентного маркерного белка mCherry использовали во время очистки бляшек. Повторение коротких последовательностей ДНК, происходящих из фланка-1 (del), служило для удаления маркерного гена путем внутригеномной гомологичной рекомбинации (делеция маркерного гена).( B ) Генетическая целостность MVA-SARS-2-S (MVA-S). ПЦР-анализ вирусной ДНК с сайт-специфическими олигонуклеотидными праймерами делеции III подтвердил вставку последовательности SARS-2-S и внутригеномную делецию маркерного гена mCherry. ПЦР амплифицировал характерный ДНК-продукт размером 4,8 т.п.н. из геномной ДНК MVA-S по сравнению с ДНК векторной плазмиды (pIII-S). Ожидаемый фрагмент ДНК размером 0,762 т.п.н. был получен из нерекомбинантной ДНК MVA. ( C ) Многостадийный анализ роста рекомбинантного MVA-SARS-2-S (MVA-S) и нерекомбинантного MVA (MVA).Различия в росте вируса определяли по площади под кривой (AUC) перед анализом с помощью однофакторного теста ANOVA. Планки погрешностей показывают межквартильный диапазон (IQR) от медианы. Звездочки обозначают статистически значимые различия между группами: нс, несущественно; **** П <0,0001.

Характеристика белка SARS-CoV-2 S, экспрессируемого рекомбинантным MVA.

Для определения характера экспрессии рекомбинантного белка SARS-CoV-2 S мы окрашивали клетки Vero, инфицированные MVA-SARS-2-S, HA-tag- или S-специфическими моноклональными антителами и анализировали их с помощью флуоресцентной микроскопии.Мышиное моноклональное антитело, направленное против 9-аминокислотной НА-метки на С-конце рекомбинантного белка SARS-2-S, выявило высокоспецифичное окрашивание в проницаемых клетках, соответствующее ожидаемой внутриклеточной локализации С-конца S-белка. Специфичное для SARS-CoV-1-S моноклональное антитело, демонстрирующее перекрестную реактивность с SARS-CoV-2 (29) при распознавании эпитопа во внешнем домене белка SARS-CoV-2-S, также позволяло специфическое окрашивание непроницаемых MVA-SARS-2-S-инфицированные клетки Vero, что позволяет предположить, что белок SARS-2-S легко перемещался на плазматическую мембрану (рис.2 А ).

Синтез полноразмерного гликопротеина S в клетках, инфицированных MVA-SARS-2-S (MVA-S). ( A ) Проницаемые или непроницаемые инфицированные клетки зондировали моноклональными антителами, направленными против HA-метки или белка S SARS-CoV (SARS-1-S). Поликлональные козьи антимышиные антитела служили для S-специфического флуоресцентного окрашивания (красный). Ядра клеток контрастировали с DAPI (синий). ( B ) Куриные эмбриональные фибробласты (CEF) и клетки Vero инфицировали с множественностью инфекции (MOI), равной 10, и собирали через 24 часа после инфицирования (hpi).( C и D ) Клетки Vero инфицировали MVA-SARS-2-S (MVA-S) при MOI 10 и собирали в указанные моменты времени. PNGase F использовали для дегликозилирования (MVA-Sd). Полипептиды в клеточных лизатах разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали с помощью моноклонального антитела против HA-метки (1: 8000) ( B и C ) или с сывороткой человека (1: 200) ( D ). Лизаты из неинфицированных (Mock) или нерекомбинантных MVA-инфицированных (MVA) клеток использовали в качестве контролей.

Для более подробного изучения продуцируемого MVA рекомбинантного белка S мы приготовили общие лизаты из инфицированных MVA-SARS-2-S куриных эмбриональных фибробластов (CEF) или клеток Vero для разделения с помощью SDS-PAGE и последующего иммуноблот-анализа (рис. .2). Моноклональное антитело мыши, направленное против НА-метки на С-конце рекомбинантного белка SARS-2-S, выявило две заметные белковые полосы, которые мигрировали с молекулярными массами ~ 190 и 90-100 кДа (рис. 2 B ). Поскольку в SDS-PAGE обнаруженные белковые полосы мигрировали с молекулярными массами, значительно превышающими 145 кДа, предсказанные для полноразмерного белка SARS-CoV-2-S на основе его аминокислотной последовательности, мы предположили, что белки могут быть гликозилированы. Действительно, NetNGlyc 1.0 серверный анализ показал присутствие по крайней мере 17 сайтов N-гликозилирования для ко- и посттрансляционных модификаций. Обработка клеточных лизатов пептид-N-гликозидазой F (PNGase F), которая удаляет все N-связанные олигосахаридные цепи из гликопротеинов, снижает молекулярные массы полос рекомбинантного белка S с 190 до 145 кДа и с 90 до 100 до 65 кДа. кДа, что соответствует ожидаемым размерам немодифицированного SARS-CoV-2 S и продукта расщепления S2, соответственно (рис. 2 C ).

Интересно, что полоса белка, соответствующая продукту расщепления S2, была более заметной в лизатах из инфицированных MVA-SARS-2-S клеток CEF, тогда как лизаты из инфицированных MVA-SARS-2-S клеток Vero содержали больше длины белка, что указывает на специфические для клетки-хозяина различия в протеолитическом расщеплении S-белка (рис.2 В ). Важно отметить, что обе изоформы были обнаружены уже через 2 часа после инфицирования (hpi), что указывает на правильную раннюю транскрипцию с синтетического промотора MVA PmH5, и их количество увеличивалось до 24 hpi, что согласуется со сроками обильного позднего синтеза белка вируса осповакцины (рис. 2 С ). Более того, антитела от пациента с COVID-19, госпитализированного с пневмонией, также выявили белковые полосы, соответствующие молекулярным массам полноразмерных полипептидов S и S2 (рис.2 D ).

MVA-SARS-2-S-индуцированные ответы антител у мышей.

Чтобы оценить, индуцирует ли MVA-SARS-2-S антитела, специфичные для SARS-CoV-2, мы вакцинировали мышей BALB / c низкой дозой (LD) или высокой дозой (HD) MVA-SARS-2-S ( 10 ⁷ или 10 ⁸ бляшкообразующих единиц [БОЕ], соответственно) при внутримышечном (в / м) введении и схемах иммунизации прайм-буст с интервалом 3 недели (рис. 3 и SI Приложение , рис. S2 А ). На 18 день после первичной инокуляции мы обнаружили связывание сывороточных антител IgG с цельным рекомбинантным белком SARS-CoV-2 S в сыворотках трех из восьми вакцинированных LD и четырех из шести животных, вакцинированных HD, с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). ) (Рис.3 А ). После повторной иммунизации на 21 день у всех вакцинированных животных наблюдались высокие уровни S-связывающих сывороточных антител IgG со средними титрами 1: 900 для группы вакцинации LD и 1: 1,257 для группы HD (фиг. 3 A ). Важно отметить, что сыворотка вакцинированных мышей также содержала антитела, связывающиеся с доменом связывания рецептора S-белка (RBD). Уже на 18 день после примирования RBD-связывающие антитела были обнаружены у 33% мышей в группе, получавшей дозу LD (две из шести мышей; среднее значение OD, 0.35) и 50% мышей, получавших иммунизацию HD (три из шести; средняя OD 0,63). Повторные вакцинации повышали уровни RBD-специфических антител у 87,5% серопозитивных мышей в группе доз 10 ⁷ (семь из восьми; средняя OD 1,81) и у 100% животных, вакцинированных 10 ⁸ PFU MVA-SARS. -2-S (восемь из восьми; средний OD 2,92) (рис. 3 B ). Поскольку нейтрализация живого вируса является золотым стандартом для серологического анализа коронавируса, мы затем оценили сыворотку мышей в двух различных анализах на нейтрализацию SARS-CoV-2, тест нейтрализации уменьшения бляшек 50 (PRNT ₅₀ ) (30) и полный вирус. проба нейтрализации (ВНТ ₁₀₀ ) (8) (рис.3 C и D ). На 18 день после первичной иммунизации PRNT ₅₀ выявил низкие количества нейтрализующих антител SARS-CoV-2 в 50–80% сывороток вакцинированных животных (титры PRNT ₅₀ 20–40 для обеих дозированных групп). После повторной вакцинации мы обнаружили нейтрализующую активность во всех сыворотках мышей, вакцинированных MVA-SARS-2-S, со средними титрами PRNT ₅₀ 117 (LD) и 600 (HD) (рис. 3 C ). Используя анализ VNT ₁₀₀ , мы обнаружили нейтрализующую активность в 79% всех сывороток после бустерной иммунизации MVA-SARS-2-S со средними обратными титрами 19.8 (четыре из шести серопозитивных мышей, группа LD) и 105,8 (семь из восьми мышей, группа HD) (фиг. 3 D ). Мы получили аналогичные результаты при тестировании сывороток в недавно созданном высокопроизводительном тесте нейтрализации суррогатного вируса для SARS-CoV-2 (sVNT) (31). После повторной иммунизации на 21 день мы обнаружили уровни суррогатных нейтрализующих антител со средними титрами 400 (четыре из шести серопозитивных мышей, LD) и 840 (шесть из шести, HD) (рис. 3 E и SI Приложение ). , Рис.S3 A – C ). В целом, эти результаты показывают, что протоколы первичной иммунизации как LD, так и HD вызывают устойчивый гуморальный ответ против SARS-CoV-2-S и приводят к образованию нейтрализующих антител против SARS-CoV-2-S.

Антиген-специфический гуморальный иммунитет, индуцированный MVA-SARS-2-S (MVA-S). Мыши BALB / c были внутримышечно. вакцинировали в режиме первичной бустерной вакцинации (интервал 21 день) 10 ⁷ или 10 ⁸ БОЕ MVA-S. Мыши, инокулированные физиологическим раствором (PBS), служили контролем.Сыворотки собирали через 18 дней после первой иммунизации (первичная иммунизация n = 7-8) и через 14 дней после второй иммунизации (первичная бустерная n = 6-8). ( A и B ) Сыворотки анализировали на S-специфические IgG с помощью ELISA и ( C — E ) нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с помощью анализа уменьшения бляшек (PRNT ₅₀ ), нейтрализации вирусов ( VNT ₁₀₀ ) или тест нейтрализации суррогатного вируса (sVNT).

MVA-SARS-2-S индуцированные Т-клеточные ответы у мышей.

Чтобы оценить активацию SARS-CoV-2-специфического клеточного иммунитета, мы отслеживали S-специфические CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки у мышей BALB / c, вакцинированных LD или HD MVA-SARS-2-S в схемах первичной иммунизации и первичной бустерной иммунизации с использованием 3-недельных интервалов ( SI Приложение , рис. S2 A ). Чтобы оценить S-антиген-специфические клеточные ответы с помощью ELISPOT интерферона-γ (IFN-γ), мы выделили спленоциты на 8-й день после первичной иммунизации MVA-SARS-2-S или первичной иммунизации и использовали стимуляцию S-специфическим пептидом для активации в vitro культура.Поскольку информация об антигенной специфичности Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2, ограничена, мы проверили базу данных иммунных эпитопов (IEDB), чтобы выбрать предполагаемые S-специфические пептидные эпитопы, совместимые с активацией Т-клеток CD8 ⁺ или CD4 ⁺ ( SI Приложение , таблицы S2 и S3). При тестировании пулов предсказанных пептидов со спленоцитами мышей BALB / c, иммунизированных 10 ⁸ БОЕ MVA-SARS-2-S, мы обнаружили ответы выше фона в нескольких пулах пептидов и идентифицировали иммунодоминантный SARS-CoV-2 S h3 -K ^d эпитоп S _269–278 (GYLQPRTFL; N-концевой домен S1, SI Приложение , рис.S4). Чтобы оценить первичную активацию Т-клеток CD8 ⁺ , специфичных для эпитопа SARS-2-S, мы однократно инокулировали мышей BALB / c LD или HD MVA-SARS-2 и проанализировали спленоциты на 8-й день после вакцинации. Одноместный и.м. иммунизация MVA-SARS-2-S уже индуцировала S _269–278 -эпитоп-специфически активированных CD8 ⁺ Т-клеток со средним числом 341 IFN-γ пятнообразующих клеток (SFC) в 10 ⁶ спленоцитах для LD и 275 SFC для HD по сравнению с контрольными мышами, иммунизированными нерекомбинантным MVA (SFC не обнаруживаются) (рис.4 А ). Данные ферментно-связанного иммунного спота (ELISPOT) хорошо согласуются с анализом клеточной сортировки по флуоресценции (FACS) Т-клеток, окрашенных на внутриклеточный IFN-γ, где мы также обнаружили более высокие частоты (в среднем 0,32–0,36%) и более высокие абсолютные количества IFN -γ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток в спленоцитах вакцинированных животных по сравнению с контрольными мышами (фиг. 4 B ). Значительное количество активированных Т-клеток IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ также коэкспрессируют TNF-α (среднее значение 0.22% и 0,27% от общего количества CD8 ⁺ Т-клеток) (фиг.4 C ). Следует отметить, что у мышей, иммунизированных LD или HD MVA-SARS-2-S, было обнаружено аналогичное количество SARS-2-S-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток.

Активация S-специфических CD8 ⁺ Т-клеток после иммунизации с помощью прайм-буста MVA-SARS-2-S. Группы мышей BALB / c были внутримышечно. иммунизировали дважды 10 ⁷ или 10 ⁸ БОЕ MVA-SARS-2-S (MVA-S). Мыши, иммунизированные ложной иммунизацией (PBS), были отрицательным контролем. ( A — C ) Спленоциты ( n = 6) собирали и получали на 8 день после прайма или ( D — F ) бустер-иммунизации на 21 день ( n = 4).Спленоциты стимулировали ограниченным по h3-K ^d пептидом S _268–276 (S1; GYLQPRTFL) и тестировали с помощью анализа ELISPOT IFN-γ и анализа IFN-γ / TNF-α ICS плюс FACS. ( A и D ) IFN-γ SFC, измеренные с помощью анализа ELISPOT. ( B и E ) Т-клетки CD8 ⁺ , продуцирующие IFN-γ, измеренные с помощью анализа FACS. Графики показывают частоту и абсолютное количество IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток. ( C и F ) Т-клетки CD8 ⁺ , продуцирующие IFN-γ и TNF-α, измеренные с помощью анализа FACS.Графики показывают частоту и абсолютное количество IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного теста Тьюки. Звездочки представляют собой статистически значимые различия между двумя группами: * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

Бустерная иммунизация на 21 день дополнительно увеличила количество S-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в ответ на вакцинацию MVA-SARS-2-S.На 8 день после иммунизации анализ ELISPOT выявил среднее значение 1020 IFN-γ SFC у мышей, вакцинированных LD, и 1159 IFN-γ SFC у животных, получавших HD MVA-SARS-2-S (фиг. 4 D ). Внутриклеточный FACS-анализ выявил частоты 0,62% или 0,60% и абсолютные числа 40 873 или 49 553 IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток для мышей, иммунизированных LD или HD MVA-SARS-2-S (рис. 4 E ). Мы снова подтвердили, что большинство (~ 75%) Т-клеток IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ также экспрессируют TNF-α (рис.4 F ). Спектральная проточная цитометрия субпопуляций Т-клеток выявила высокие уровни CD8 ⁺ эффекторных Т-клеток памяти, снижение количества наивных Т-клеток CD4 ⁺ и сбалансированные популяции Т-хелперных клеток в спленоцитах из MVA-SARS-2-S или нерекомбинантных Животные, иммунизированные MVA ( SI Приложение , рис. S8 A – E ). MVA-специфический иммунодоминант CD8 ⁺ Т-клеточная детерминанта F2 _26–34 [SPGAAGYDL (32)] служил в качестве контрольного пептида для обнаружения и сравнительного анализа MVA-вектор-специфичных Т-клеток CD8 ⁺ в BALB / c. мышей ( SI Приложение , рис.S5 A – C и S6 A – C ). Кроме того, мы использовали пептиды, производные от S-белка, с предсказанной способностью связываться с MHC II, чтобы отслеживать присутствие активированных CD4 ⁺ Т-клеток. Используя три различных пептидных пула ( SI, приложение , таблица S3), мы подтвердили присутствие спайк-специфичных CD4 ⁺ Т-клеток в селезенке мышей, иммунизированных схемами прайм-буста LD и HD ( SI, приложение , рис. . S9).

Защитная способность MVA-SARS-2-S при вызове SARS-CoV-2.

Для моделирования продуктивной инфекции SARS-CoV-2 мы использовали мышиную модель, основанную на аденовирусной трансдукции, аналогичную недавно описанной (33, 34). Мы интратрахеально трансдуцировали вакцинированных MVA-SARS-2-S мышей BALB / c 5 × 10 ⁸ БОЕ аденовирусного вектора, кодирующего как рецептор ACE2 человека, так и маркерный белок mCherry (ViraQuest) примерно через 2 недели после первичной иммунизации. иммунизация. Через три дня животных инфицировали 1,5 × 10 ⁴ инфекционной дозой для культуры ткани 50 (TCID ₅₀ ) SARS-CoV-2 (изолят BavPat1 / 2020, изолят European Virus Archive Global # 026V-03883).Ежедневно контролировали массу тела, спонтанное поведение и общее состояние мышей и суммировали их в клинической шкале. Никаких клинических отклонений не наблюдалось ( SI Приложение , рис. S10 A и B ). Через четыре дня после заражения животных умерщвляли, брали образцы крови и собирали легкие для измерения вирусной нагрузки. Существенные нагрузки вирусной РНК были обнаружены у иммунизированных контрольных мышей. Напротив, легочная ткань как LD, так и HD животных, иммунизированных MVA-SARS-2-S, содержала значительно более низкие уровни РНК SARS-CoV-2 (<100 геномных эквивалентов / нг общей РНК; рис.5 А ). Уровни трансдукции аденовирусным вектором в тканях легких анализировали с помощью анализа RT-PCR в реальном времени для подтверждения сопоставимых количеств РНК mCherry ( SI Приложение , фиг. S10 C ). Кроме того, мы обнаружили> 1000 TCID ₅₀ / мл инфекционного SARS-CoV-2 в легких контрольных мышей, но не в легких иммунизированных мышей, что указывает на эффективное ингибирование репликации SARS-CoV-2 иммунным иммунитетом. ответы (рис. 5 B ). В соответствии с этими данными, только сыворотка от вакцинированных MVA-SARS-2-S животных (10 из 11) содержала нейтрализующие циркулирующие антитела против SARS-CoV-2 (рис.5 С ). Гистопатологию легких оценивали после окрашивания гематоксилин-эозином (HE). В легких контрольных мышей, вакцинированных PBS, мы наблюдали интерстициальную пневмонию с множественными, частично слившимися очагами с преимущественно лимфогистиоцитарными инфильтратами в альвеолярном интерстиции с акцентом на перибронхиолярную и периваскулярную области. Тем не менее, в вакцинированных группах не наблюдалось резкого уменьшения поражения легких по степени тяжести и распространенности. В легких вакцинированных мышей наблюдалась умеренная гиперплазия лимфатической ткани, ассоциированной с бронхами, и мягкие манжеты лимфоцитов вокруг кровеносных сосудов.Однако гибридизация in situ выявила явное снижение РНК SARS-CoV-2 в легких обеих вакцинированных групп, характеризуемое уменьшенным или отсутствующим красным окрашиванием для РНК SARS-CoV-2, что согласуется с результатами ОТ-ПЦР. Напротив, препараты легких животных, вакцинированных PBS, показали обширное красное окрашивание, особенно в сильно пораженных областях (фиг. 5 D ).

Защитная способность иммунизации MVA-SARS-2-S против инфекции SARS-CoV-2 у мышей BALB / c, трансдуцированных человеческим ACE2 (hACE2).Группы мышей BALB / c ( n = 4–6) были внутримышечно. иммунизировали дважды 10 ⁷ или 10 ⁸ БОЕ MVA-SARS-2-S (MVA-S) в течение 21 дня. Мыши, иммунизированные ложной иммунизацией (PBS), служили контролем. Примерно через 2 недели после последней иммунизации мышей сенсибилизировали аденовирусом, экспрессирующим hACE2 и mCherry, и инфицировали SARS-CoV-2 через 3 дня после трансдукции. Через четыре дня после заражения животных умерщвляли и отбирали образцы для дальнейшего анализа. ( A ) Ткани легких собирали для определения копий гРНК SARS-CoV-2, ( B ) количеств инфекционного SARS-CoV-2 по TCID ₅₀ / мл и ( D ) гистопатологии легких.( C ) Сыворотки тестировали на нейтрализующие антитела против SARS-CoV-2 путем нейтрализации вируса (VNT ₁₀₀ ). ( D ) Фиксированную ткань окрашивали гематоксилином и эозином (HE) или зондами in situ. Изображения показывают среднее (10 ×) и большое (40 ×) увеличение; изображения представляют n = 4–6 на группу. Статистическая оценка была выполнена с помощью GraphPad Prism для Windows. Статистическая значимость различий между группами указана следующим образом: *** P <0.001.

Обсуждение

Здесь мы сообщаем, что вакцина-кандидат от COVID-19 MVA-SARS-2-S совместима с клиническим использованием и промышленным производством. Основываясь на обширном предыдущем опыте разработки вакцины-кандидата против MERS (22⇓ – 24, 26), мы выбрали полноразмерный белок SARS-CoV-2 S для доставки рекомбинантным MVA. Векторный вирус эффективно реплицировался в клетках DF-1, клеточном субстрате для оптимизированного производственного процесса, и MVA-SARS-2-S стабильно продуцирует S-белковый антиген после серийных амплификаций при низкой множественности инфекции.

Подобно нашему опыту, полученному с MVA-MERS-S, экспрессия гена SARS-CoV-2 S рекомбинантным MVA привела к образованию гликопротеина с молекулярной массой около 190 кДа. Обработка гликозидазой для удаления всех N-связанных углеводов давала полипептид 145 кДа, что близко соответствовало молекулярной массе, предсказанной на основе нуклеотидной последовательности S-гена. Кроме того, мы наблюдали протеолитическое расщепление полноразмерного полипептида SARS-CoV-2 S на S1 и S2, по-видимому, с различной эффективностью протеолитического процессинга в зависимости от используемого клеточного субстрата.Этот вывод согласуется с предыдущими сообщениями, предполагающими комплексную активацию белков S бета-коронавируса, включая участие нескольких событий расщепления и нескольких протеаз хозяина (35, 36). Подобно нашим результатам с кодируемым MVA белком S MERS-CoV, SARS-CoV-2-S-специфическое обнаружение с помощью иммунофлуоресценции включало сильное поверхностное окрашивание клеток, инфицированных MVA-SARS-2-S. Мы пришли к выводу, что рекомбинантный белок SARS-CoV-2 S транспортируется через аппарат Гольджи и экспрессируется на поверхности клетки, как показано ранее для функционального белка S, продуцируемого из векторов экспрессии плазмид (7, 37, 38).

Поскольку биохимическая характеристика MVA-экспрессируемого S предполагала продукцию зрелого и правильно свернутого спайкового антигена, мы исследовали, вызывает ли MVA-SARS-2-S S-специфические иммунные ответы. В экспериментальных экспериментах по проверке принципа действия у мышей, которым дважды вводили вакцину MVA-SARS-2-S дважды внутримышечно, развивались циркулирующие S-специфические антитела, которые нейтрализовали инфекции SARS-CoV-2 в культуре клеток и повышали уровень SARS-CoV-2-S. –Специфические CD8 ⁺ Т-клетки. MVA-SARS-2-S вызывал уровни вирус-нейтрализующих антител у мышей BALB / c, которые были сопоставимы с уровнями, индуцированными вакцинацией ChAdOx1 nCoV-19 или MVA-MERS-S (23, 39), и данными доклинических исследований на нечеловеческих приматах. и хомяки указывают на то, что индуцированные вакциной нейтрализующие антитела против SARS-CoV-2 коррелируют с защитой от легочной инфекции и клинических заболеваний (40–42).Гуморальные иммунные ответы, вызванные MVA-SARS-2-S, измеряли с помощью ELISA, двух различных анализов нейтрализации SARS-CoV-2 и анализа суррогатной нейтрализации; все результаты указывают на явное преимущество бустерной иммунизации. Эти данные согласуются с результатами клинических испытаний фазы 1 нашей вакцины-кандидата MVA-MERS-S, которые подтверждают гуморальную иммуногенность с использованием гомологичной первичной буст-вакцинации (26). Для нейтрализующих антител SARS-CoV-2 мы обнаружили сильную корреляцию между результатами, полученными при нейтрализации аутентичного вируса (PRNT ₅₀ , VNT ₁₀₀ ), и данными нейтрализации суррогатного вируса (sVNT) с использованием высокопроизводительного и BSL- 2/3-щадящий тест.Эти данные подтверждают результаты недавнего исследования, сравнивающего этот высокопроизводительный анализ sVNT с анализом нейтрализации псевдотипированного вируса, основанным на вирусе везикулярного стоматита, несущем белок SARS-CoV-2 S (31).

И.М. иммунизация мышей BALB / c низкими и высокими дозами MVA-SARS-2-S индуцировала устойчивые и почти равные количества SARS-S-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток при первичной и первичной буст-вакцинации. Среднее количество S-специфических Т-клеток было сравнимо со средним количеством Т-клеток, специфичных для вектора MVA, что подчеркивает сильную иммуногенность MVA-SARS-2-S в отношении индукции S-специфичного Т-клеточного ответа CD8 ⁺ .Недавние данные показали, что активация сильного ответа клеток Th2 была связана с менее тяжелыми случаями COVID-19, тогда как ответы клеток Th3 были связаны с более тяжелым заболеванием легких у людей (43). Таким образом, вакцины-кандидаты от COVID-19 должны предпочтительно активировать фенотип, подобный клеткам Th2. Наша первичная буст-вакцинация MVA-SARS-2-S не нарушала сбалансированные популяции Т-хелперных клеток, наблюдаемые у мышей BALB / c с помощью спектральной проточной цитометрии. Следует отметить, что два дополнительных исследования также продемонстрировали индукцию иммунных ответов преимущественно Th2-типа у мышей, иммунизированных векторными вакцинами MVA, кодирующими антигены SARS-CoV-2 S (44, 45).Важность индуцированных вакциной Т-клеточных ответов иллюстрируется исследованиями, не только отслеживающими адаптивный иммунитет к SARS-CoV-2 у пациентов, но также демонстрирующими, что сильные SARS-CoV-2-специфичные CD4 ⁺ или CD8 ⁺ T клеточные реакции связаны с низкой тяжестью заболевания у людей с COVID-19 (5). Следует отметить, что вакцинация MVA-SARS-2-S активировала большое количество CD8 ⁺ Т-клеток, секретирующих как IFN-γ, так и TNF-α. Ранее в контексте ВИЧ-инфекции было показано, что эта подгруппа бифункциональных Т-клеток CD8 ⁺ сильнее связана с цитотоксической активностью по сравнению с Т-клетками CD8 ⁺ , секретирующими только ИФН-γ (46).Недавние исследования также продемонстрировали изобилие полифункциональных Т-лимфоцитов CD8 ⁺ у инфицированных SARS-CoV-2 людей с бессимптомным или легким течением заболевания COVID-19 (47).

В модели инфекции легких SARS-CoV-2 у мышей все вакцинированные мыши BALB / c демонстрировали слабую репликацию SARS-CoV-2 или ее отсутствие, независимо от того, были ли низкодозированные или высокие дозы MVA-SARS-2-S. используется для вакцинации. Особенно обнадеживающим было полное отсутствие обнаруживаемого инфекционного вируса в легких иммунизированных животных.Примечательно, что мы не обнаружили доказательств потенциального усиления инфекции SARS-CoV-2 посредством индукции S-антиген-специфических антител, что подтверждает наши данные с помощью MVA-MERS-S о том, что S-гликопротеин является важным и безопасным вакцинным антигеном (23, 24 ). Эти результаты вместе с данными мониторинга заболеваний и патологии при иммунизации ( SI Приложение , рис. S2 B и C ) предоставили ценные доказательства доклинической безопасности MVA-SARS-2-S.

В целом, векторная вакцина MVA-SARS-2-S заслуживает дальнейшего развития, и представленные здесь результаты предоставили информацию для начала фазы 1 клинических испытаний 30 сентября 2020 года.Чтобы противодействовать пандемии SARS-CoV-2, вакцины-кандидаты быстро исследуются в беспрецедентном количестве, и первые вакцины-лидеры получили экстренное лицензирование в Европе и США в 2020 году (48). Однако при продвижении вакцинации против COVID-19 предстоит еще многому научиться. Мы ожидаем, что оптимизированный защитный иммунитет к COVD-19 потребует подходов к вакцинам, которые скоординированно выявляют антивирусные SARS-CoV-2-специфические CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки вместе с вирусонейтрализующими антителами в различных группах населения, включая дети, пожилые люди и лица с сопутствующими заболеваниями.

Материалы и методы

Подробные процедуры и источники реагентов описаны в Приложении SI .

Генерация рекомбинантных вирусов.

Кодирующая последовательность полноразмерного белка SARS-CoV-2 S была модифицирована in silico путем введения молчащих мутаций для удаления серий гуанинов или цитозинов и сигналов терминации ранней транскрипции, специфичной для вируса осповакцины, и добавления C -концевая последовательность HA-метки, кодирующая девять аминокислот (YPYDVPDYA, аминокислоты 98–106 из вируса гриппа).КДНК получали путем синтеза ДНК и клонировали в плазмиду для переноса MVA pIIIH5red под транскрипционным контролем синтетического раннего / позднего промотора вируса осповакцины PmH5. Векторные вирусы MVA были получены в соответствии с установленными протоколами разработки вакцин, как описано в предыдущих исследованиях (22). MVA (клональный изолят MVA-F6-sfMR) выращивали на CEF в бессывороточных условиях и служили в качестве нерекомбинантного остова вируса для конструирования векторных вирусов MVA, экспрессирующих последовательности гена SARS-CoV-2 S.Для получения вакцинных препаратов рекомбинантный MVA-SARS-2-S амплифицировали на монослоях клеток CEF или DF-1, очищали ультрацентрифугированием через сахарозу и восстанавливали до исходных препаратов с высоким титром. Для определения вирусных титров подсчитывали БОЕ (28).

Для использования сыворотки пациентов одобрение полного протокола исследования было получено от этического комитета медицинского факультета Мюнхенского университета Людвига-Максимилиана (LMU Munich) (голосование 20-225 KB) в соответствии с руководящими принципами Декларации Хельсинки.Все пациенты дали письменное информированное согласие, и данные были использованы в анонимной форме.

Эксперименты по вакцинации мышей.

Мышей BALB / c были приобретены в Charles River Laboratories и содержались в определенных условиях, свободных от патогенов. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими и национальными правилами проведения экспериментов на животных (Европейская директива 2010/63 / EU; Законы о защите животных в Германии). Иммунизацию проводили с использованием внутримышечных аппликаций с 10 ⁷ или 10 ⁸ БОЕ рекомбинантным MVA-SARS-2-S, нерекомбинантным MVA или PBS (имитация) в четырехглавую мышцу левой задней ноги.Кровь собирали на 0, 18 или 35 день. Свернувшуюся кровь центрифугировали при 1300 × g в течение 5 минут для отделения сыворотки.

Трансдукция вакцинированных мышей Ad_ACE2-mCherry и заражение SARS-CoV-2.

Вакцинированным мышам проводили интратрахеальную инокуляцию 5 × 10 ⁸ БОЕ аденовируса-ACE2-mCherry под анестезией кетамином / ксилазином. Через три дня после трансдукции мышей инфицировали интраназальным путем 1,5 × 10 ⁴ инфекционной дозой культуры ткани 50 (TCID ₅₀ ) SARS-CoV-2 (изолят BavPat1 / 2020, European Virus Archive Global # 026V-03883) .Мышей умерщвляли через 4 дня после инфицирования, и образцы сыворотки, а также легочной ткани анализировали на вирусную нагрузку.

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени для определения SARS-CoV-2 или РНК mCherry.

Образцы тканей иммунизированных и зараженных мышей вырезали из долей левого легкого и гомогенизировали в 1 мл среды Игла, модифицированной Дульбекко. Титры SARS-CoV-2 в супернатантах (в TCID ₅₀ на миллилитр) определяли на клетках VeroE6. Выделение РНК проводили с помощью мини-набора RNeasy.Количество РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-100. Суммарную РНК подвергали обратной транскрипции и количественно определяли с помощью ПЦР в реальном времени с использованием набора OneStep RT-PCR. Кроме того, для каждого образца ткани от трансдуцированных и инфицированных мышей доказательство успешной трансдукции ACE2 определялось с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени для мРНК mCherry с помощью набора OneStep RT-PCR. Количественную оценку выполняли с использованием стандартной кривой, основанной на 10-кратных серийных разведениях соответствующей контрольной РНК в диапазоне от 10 ² до 10 ⁵ копий.

Гистопатологическое исследование легочной ткани.

Легкие собирали на 4 день после заражения SARS-CoV-2 и обрабатывали для гистологического анализа. Вкратце, ткань фиксировали в формалине и заливали парафином. Срезы размером четыре микрометра были вырезаны с помощью микротома и окрашены HE. Чтобы исследовать присутствие вирусной РНК в легочной ткани путем гибридизации in situ, был гибридизирован РНК-специфический зонд, направленный против гена S SARS-CoV-2. После этого выполняли усиление сигнала и использовали зонды, меченные щелочной фосфатазой, в сочетании с субстратом Fast Red, позволяющим детектировать сигнал.

ELISA на антиген-специфические IgG.

Для анализа титров сывороточного IgG, специфичного для SARS-2-S, 96-луночные планшеты для ELISA с плоским дном покрывали 50 нг / лунку рекомбинантного S-белка. Сыворотку мышей серийно разводили в PBS / BSA. Затем планшеты инкубировали, промывали и зондировали с помощью козьего антимышиного IgG HRP, разведенного в PBS / BSA, и проявляли с 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидином (TMB) в качестве хромогенного субстрата. Поглощение каждого образца сыворотки измеряли при 450 нм с эталонной длиной волны 620 нм.Данные ELISA нормализовали с использованием положительного контроля. Пороговое значение для положительных образцов сыворотки мышей определяли путем вычисления среднего из нормированных значений OD 450-нм сывороток контрольной группы PBS плюс 6 SD (среднее + 6SD).

RBD-Specific IgG ELISA.

RBD-специфические сывороточные титры IgG измеряли, как описано ранее (30). После блокирования разведения сыворотки (разведенные 1: 100) инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Антиген-специфические антитела выявляли с использованием меченных пероксидазой кроличьих антимышиных IgG и TMB в качестве субстрата.Поглощение измеряли при 450 нм. Порог был установлен на OD 0,5.

свНТ.

Чтобы проверить наличие нейтрализующих сывороточных антител против SARS-CoV-2-S, мы использовали тест нейтрализации суррогатного вируса, как описано ранее, с небольшими изменениями (31). Вкратце, SARS-CoV-2 S RBD предварительно инкубировали с инактивированными нагреванием тестовыми сыворотками. После этого смеси SARS-CoV-2 S RBD-сыворотка загружали на 96-луночные планшеты, покрытые ACE2 [произведенным в компании, как описано Bošnjak et al. (31)], блокировали и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C.После промывки планшеты инкубировали с конъюгированным с HRP антителом против His-tag и проявляли путем добавления TMB. Значения оптической плотности, измеренные при 450 и 570 нм, использовали для расчета процента ингибирования после вычитания фоновых значений в виде ингибирования (%) = (1 — значение OD образца / Среднее значение OD SARS-CoV-2 S RBD) × 100. Чтобы Для устранения фоновых эффектов средний процент ингибирования в неспецифической мышиной сыворотке (Invitrogen) вычитали из значений образцов, а титры нейтрализующих антител против SARS-CoV2-S определяли как разведение сыворотки, которое все еще имело снижение связывания> среднего + 2 SD значений из сыворотки мышей, получавших носитель.

PRNT

Способность нейтрализовать SARS-CoV-2 (немецкий изолят; GISAID ID EPI_ISL 406862; European Virus Archive Global # 026V-03883) тестировали, как описано ранее (30). Мы дважды серийно разводили инактивированные нагреванием образцы сыворотки в среде Игла, модифицированной Дульбекко, начиная с разведения 1:10 в 50 мкл. Затем мы добавили 50 мкл суспензии вируса (400 БОЕ) в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа перед нанесением смесей на клетки VeroE6. После инкубации в течение 1 ч отмывали клетки с добавкой среды и инкубировали их в течение 8 ч.После инкубации мы фиксировали клетки 4% формальдегидом / PBS и окрашивали клетки поликлональным кроличьим антителом против SARS-CoV и вторичным меченным пероксидазой козьим антителом против кроличьего IgG. Мы разработали сигнал, используя осадок, образующий субстрат TMB, и подсчитали количество инфицированных клеток на лунку с помощью анализатора изображений ImmunoSpot. Титр нейтрализации сыворотки является обратной величиной самого высокого разведения, приводящего к снижению инфекции> 50% (PRNT ₅₀ ). Мы считали титр> 20 положительным.

SARS-CoV-2 VNT

Нейтрализующая активность мышиных сывороточных антител была исследована на основе ранее опубликованного протокола (8). Образцы серийно разводили в 96-луночных планшетах, начиная с разведения сыворотки 1:16. Образцы инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C вместе со 100 50% инфекционными дозами тканевых культур (TCID ₅₀ ) SARS-CoV-2 (изолят BavPat1 / 2020, European Virus Archive Global # 026V-03883). Цитопатические эффекты (ЦПЭ) на клетки VeroE6 анализировали через 4 дня после заражения.Нейтрализация определялась как отсутствие CPE по сравнению с контрольными вирусами. Для каждого теста положительный контроль (нейтрализующая плазма пациента с COVID-19) использовался в дубликатах в качестве стандарта нейтрализации между исследованиями. Этическое одобрение было предоставлено этическим комитетом медицинского факультета LMU в Мюнхене (голосование 20-225 КБ) в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации.

Прогнозирование и создание синтетических пептидов SARS-2-S.

Белок SARS-CoV-2 S (идентификационный номер Национального центра биотехнологии: QHD43416.1; Идентификатор Uniprot: P0DTC2 [SPIKE_SARS2]) служил для предсказания эпитопа, а вероятные детерминанты Т-клеток CD8 ⁺ и CD4 ⁺ были исследованы с помощью базы данных и анализа иммунных эпитопов (IEDB) (https://www.iedb.org /). Для идентификации потенциальных детерминант Т-клеток CD8 ⁺ использовали инструменты MHC-I Binding Prediction и MHC-I Processing Prediction (49). Чтобы подтвердить, что пептиды являются потенциальными связывающими агентами аллелей MHC класса I h3-K ^d , h3-D ^d и h3-L ^d , их дополнительно проверяли на связывание MHC I с использованием сервера RankPep (50).Пептиды, которые, как было установлено, связываются с любым из вышеуказанных аллелей, были отобраны для синтеза и тестирования. Все пептиды растворяли в PBS или ДМСО, разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C.

Анализ клеточного ответа с помощью ELISPOT.

На 8-й и 14-й дни после первичной или первичной буст-вакцинации были подготовлены спленоциты, и иммуноферментный анализ (ELISPOT) служил для измерения клеток, продуцирующих IFN-γ. Спленоциты высевали в 96-луночные планшеты и стимулировали пептидами. Нестимулированные клетки и клетки, стимулированные форболмиристатацетатом / иономицином или пептидом вируса коровьей оспы SPGAAGYD [F2 _26–34 (32)], служили контролем.После инкубации планшеты окрашивали, а пятна подсчитывали и анализировали с использованием автоматического устройства для чтения планшетов ELISPOT.

Анализ Т-клеток методом окрашивания внутриклеточных цитокинов.

Для окрашивания внутриклеточных цитокинов (ICS) клетки стимулировали пептидом S _269–278 или пептидом вируса коровьей оспы F2 _26–34 в течение 2 часов. Затем добавляли брефельдин А и дополнительно стимулировали клетки в течение 4 часов. После стимуляции клетки окрашивали анти-CD3-PE, анти-CD4 Brilliant Violet 421, анти-CD8α Alexa Fluor 488 и очищенным CD16 / CD32.Затем клетки промывали, фиксировали, пермеабилизировали промывочным буфером Perm Wash и внутриклеточно окрашивали анти-IFN-γ плюс анти-TNF-α. Данные были получены с помощью проточного цитометра MACSQuant и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo.

Доступность данных

Все данные исследования включены в статью SI и приложение .

Благодарности

Мы благодарим Патрицию Бонерт, Урсулу Клостермайер, Йоханнеса Деринга и Акселя Гросса за экспертную помощь в исследованиях на животных. Мы благодарим Нико Беккер, Астрид Хервиг и Леннарта Кемпера за помощь в подготовке и тестировании образцов BSL3.Эта работа была поддержана Немецким центром инфекционных исследований (проекты TTU 01.921 — GS и SB; TTU 01.712 — GS), Федеральным министерством образования и исследований (BMBF) (01KX2026 для GS и SB; BMBF 01KI20702 для GS и SB; ZOOVAC 01KI1718, RAPID 01KI1723G для AV; «NaFoUniMedCovid19» FKZ: 01KX2021, проект «B-FAST» для РФ и СБ). Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Немецкий исследовательский фонд) Стратегия совершенства EXC 2155 «RESIST» (проект ID328, R.F.), DFG Grant SFB900-B1 (номер проекта 158989968, R.F.), а также на средства земли Нижняя Саксония (14-76103-184 CORONA-11/20 по R.F.).

Сноски

• Авторы: Г.С. и А.В. спланированное исследование; A.T., J.H.S., C.R., G.K., L.L., N.L., S.J., A.F., G.S. и A.V. проведенное исследование; N.M.O., B.B., I.S., I.O., S.H., L.S., J.S., A.W., M.G.S., M.K., W.G., M.S., C.-M.W., R.F. и B.L.H. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.T., J.H.S., C.R., A.K., G.K., N.M.A.O., B.B., I.O., K.B., E.D., R.F., B.L.H., S.B., Г.С., А.В. проанализированные данные; и A.T., J.H.S., C.R., A.K., S.B., G.S. и A.V. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2026207118/-/DCSupplemental.

• Copyright © 2021 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Публикации | Оценочный центр Brown School

Cabrera-Nguyen EP, Cavazos-Rehg P, Krauss M , Kim Y, Emery S (2016).Осведомленность и использование растворимых табачных изделий в США. Исследования никотина и табака . 18 (5): 857-63. DOI: 10.1093 / NTR / NTV212.

Cabrera-Nguyen EP, Cavazos-Rehg P, Krauss M , Bierut LJ, Moreno MA (2016). Воздействие на молодых людей контента, связанного с алкоголем и марихуаной, в Twitter. Журнал исследований алкоголя и наркотиков. 77 (2): 349-53.

Кейд В.Т., Хури Н., Нельсон С., Шеклфорд А., Семенкович К., Краусс М.Дж. , Арбелаес А.М. (2016).Гипогликемия во время упражнений средней интенсивности снижает противорегулирующие реакции на последующую гипогликемию. Физиологические отчеты. 4 (17). pii: e12848. DOI: 10.14814 / phy2.12848.

Cavazos-Rehg PA, Krauss MJ , Sowles SJ, Spitznagel EL, Grucza R, Chaloupka FJ, Bierut LJ (2016). Множественные уровни влияния, влияющие на употребление табака молодежью. Наука о регулировании табака. 2 (2): 106-122. DOI: 10.18001 / TRS.2.2.2.

Cavazos-Rehg PA, Sowles SJ, Krauss MJ , Agbonavbare V, Grucza R, Bierut L (2016).Контент-анализ твитов о сильнодействующей марихуане. Наркотическая и алкогольная зависимость . 166: 100-8. DOI: 10.1016 / j.drugalcdep.2016.06.034.

Cavazos-Rehg PA, Krauss MJ , Sowles SJ, Bierut LJ (2016). Сообщения, связанные с марихуаной, в Instagram. Наука о профилактике . 17 (6): 710-20. DOI: 10.1007 / s11121-016-0669-9.

Cavazos-Rehg PA, Krauss MJ , Sowles S, Connolly S, Rosas C, Bharadwaj M, Bierut LJ (2016). Контент-анализ твитов, связанных с депрессией. Компьютеры в поведении человека . 54: 351-357.

Cavazos-Rehg PA, Housten AJ, Krauss MJ , Sowles SJ, Spitznagel EL, Chaloupka FJ, Grucza R, Johnston LD, O’Malley PM, Bierut LJ (2016). Избранные государственные политики и ассоциации с поведением, связанным с употреблением алкоголя и рискованным поведением при вождении среди молодежи: результаты мониторинга будущего исследования. Алкоголизм: клинические и экспериментальные исследования . 40 (5): 1030-6. DOI: 10.1111 / acer.13041.

Grucza RA, Agrawal A, Krauss MJ , Bongu J, Plunk AD, Cavazos-Rehg PA, Bierut LJ (2016).Снижение распространенности расстройств, связанных с употреблением марихуаны, среди подростков в Соединенных Штатах, с 2002 по 2013 год. Журнал Американской академии детской и подростковой психиатрии . 55 (6): 487-494.e6. DOI: 10.1016 / j.jaac.2016.04.00.

Grucza RA, Agrawal A, Krauss MJ , Cavazos-Rehg PA, Bierut LJ (2016). Последние тенденции в распространенности употребления марихуаны и связанных с ней расстройств в Соединенных Штатах. JAMA Psychiatry . 73 (3): 300-1. DOI: 10.1001 / jamapsychiatry.2015.3111.

Plunk AD, Krauss MJ , Syed-Mohammed H, Hur M, Cavzos-Rehg PA, Bierut LJ, Grucza RA (2016). Влияние минимального возраста употребления алкоголя на смертность от хронических заболеваний, связанных с алкоголем. Алкоголизм: клинические и экспериментальные исследования . 40 (8): 1761-8. DOI: 10.1111 / acer.13123.

Sowles SJ, Krauss MJ , Connolly S, Cavazos-Rehg PA (2016). Контент-анализ вейп-рекламы в Твиттере, ноябрь 2014 г. Предотвращение хронических заболеваний. 13: E139. DOI: 10.5888 / pcd13.160274.

Weaver NL, Weaver TL, Nicks SE, Jupka KA, Sallee H, Jacobsen H , Henley W и Jaques M. (2016). Разработка адаптированных позитивных родительских сообщений для программы коммуникации на базе клиники. Ребенок: уход, здоровье и развитие, doi: 10.1111 / cch.12418.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.