Ч 2 ст 452 гк рф: Статья 452. Порядок изменения и расторжения договора

Понятие и общие положения о новации

Новация является одним из предусмотренных главой 26 Гражданского кодекса Российской Федерации способов прекращения обязательств, при котором происходит замена первоначального обязательства на другое новое обязательство с прекращением первоначального обязательства.

Определение понятия новации дано в п. 1 ст. 414 ГК РФ, в соответствии с которым обязательство прекращается новацией — соглашением сторон о замене первоначального обязательства, существовавшего между ними, другим обязательством между теми же лицами, если иное не установлено законом или не вытекает из существа отношений.

Новация распространяется как на договорные, так и внедоговорные обязательства. Например, обязательства, вытекающие из причинения вреда имуществу, неосновательного обогащения, реституционных требований, могут быть новированы в договор займа (пункты 1 и 24 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Заменить можно не только предмет обязательства (например, денежное обязательство на обязательство по передаче имущества), но и его основание (например, обязательство по передаче имущества на обязательство по оказанию услуг). При этом предметом новации могут выступать сразу несколько обязательств, в том числе возникших из разных оснований (п.22 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Соглашением о новации первоначальное обязательство может быть заменено как полностью, так и в части.

Судьба дополнительных обязательств

Кроме основного обязательства, новация по общему правилу прекращает и связанные с ним дополнительные требования (например, пени, неустойку и т.д.) с момента заключения соглашения о новации. Однако, стороны вправе предусмотреть сохранение их в силе (п.25 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Соглашением о новации стороны могут заменить только дополнительное обязательство, не затрагивая основное. Например, если есть основания для выплаты неустойки, можно заменить обязательство о выплате неустойки на заемное обязательство (п.5 информационного письма Президиума ВАС РФ от 21.12.2005 N 103).

Кроме того, если в обеспечение первоначального обязательства было выдано поручительство или предоставлен залог лицом, не являющимся должником по этому обязательству, то в результате новации указанные обеспечения прекращаются. Выданные третьими лицами обеспечения сохраняются, если поручитель или залогодатель прямо выразили согласие на их сохранение, в том числе заранее, до заключения соглашения о новации (п.26 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Отличие новации от изменения условий договора и отступного

При заключении соглашения о новации важно отличать новацию от изменения каких-либо условий договора, а также от такого способа прекращения обязательств, как отступное.

Так, не является новацией соглашение сторон, изменяющее порядок исполнения договора, так как в этом случае первоначальное обязательство не прекращается. Соглашение сторон, изменяющее сроки и порядок расчетов между сторонами, не означает изменения способа исполнения обязательства, поэтому не является новацией (пункты 1, 2 информационного письма Президиума ВАС РФ от 21.12.2005 N 103 «Обзор практики применения арбитражными судами статьи 414 Гражданского кодекса Российской Федерации»).

Также не является новацией и соглашение сторон, уточняющее или определяющее размер долга и (или) срок исполнения обязательства без изменения предмета и основания возникновения обязательства (п.22 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Важно отличать новацию от отступного. Если при новации происходит замена первоначального обязательства на новое обязательство, то при предоставлении отступного нового обязательства не возникает, меняется только предмет исполнения первоначального обязательства, например, вместо уплаты денежных средств должник передает имущество.

То есть, цель отступного — прекращение первоначального обязательства, а цель новации — прекращение первоначального обязательства и возникновение другого.

Кроме того, в отличие от отступного, новация действительна с момента заключения соглашения, то есть первоначальное обязательство прекращается вне зависимости от исполнения нового обязательства. При совершении отступного основное обязательство будет считаться прекратившимся только после фактической передачи имущества или денежных средств (ст. 409 ГК РФ, п. 1 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 21.12.2005 N 102, постановление ФАС Северо-Кавказского округа от 25.09.2001 N Ф08-3041/01).

В случае сомнений, о чем договорились стороны, о новации или об отступном, приоритет отдается соглашению об отступном (п.22 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

Необходимые условия новации

Для прекращения обязательства новацией необходимо наличие следующих условий:

1. Наличие зафиксированного в соглашении о новации намерения сторон установлением нового обязательства прекратить первоначальное обязательство. Новация происходит только тогда, когда действия сторон направлены на то, чтобы обязательство было новировано (п. 2 информационного письма Президиума ВАС РФ от 21 декабря 2005 г. № 103, п.22 Постановления Пленума ВС РФ № 6).

2. Неизменный состав участников, то есть соглашение о новации нельзя заключать между сторонами, не входившими в первоначальное обязательство. Так, в одном из дел суд пришел к выводу, что действие старого договора аренды не прекратилось в связи с заключением нового договора, так как в старом на стороне арендодателя участвовали госорган и госучреждение, а в новом — только госучреждение (Постановление ФАС Волго-Вятского округа от 01.04.2010 по делу № А11-2514/2009).

   Вместе с тем, соглашение о новации может быть заключено кредитором с третьим лицом, если должник перевел на него свой долг. Кредитор вправе в отношении нового должника осуществлять все права по обязательству, в том числе заключить с ним соглашение о новации (ст. 392.1 ГК, постановление Арбитражного суда Западно-Сибирского округа от 19.02.2018 № Ф04-143/2018 по делу № А45-13333/2017).

3. Наличие действительного первоначального обязательства. Недействительность первоначального обязательства автоматически влечет недействительность нового обязательства.
4. Осуществляется именно замена первоначального обязательства новым, а не его изменение, при котором первоначальное обязательство остается в силе.
5. Совершение новации в форме двусторонней сделки, отвечающей требованиям к форме и содержанию.
6. Отсутствие законодательного запрета на совершение новации либо запрет новации не вытекает из существа отношений.

Когда не допускается новация

Законом могут быть установлены случаи, когда новация запрещена. Например, Законом о банкротстве заключение соглашения о новации в рамках конкурсного производства недопустимо (ч. 2 п. 9 ст. 142, п. 31 ст. 189.96 Федерального закона «О несостоятельности (банкротстве)»).

Кроме того, запрет новации может вытекать также из существа отношений (п. 1 ст. 414 ГК РФ).

Необходимо отметить, что в предыдущей редакции, действовавшей до 01.06.2015 г., п. 2 ст. 414 ГК РФ устанавливал, что новация не допускается в отношении обязательств по возмещению вреда, причиненного жизни или здоровью, и по уплате алиментов. В новой редакции это положение исключено и в п. 1 ст. 414 ГК РФ появилось указание на то, что запрет на новацию может вытекать из существа отношений.

Таким образом, в настоящее время закон прямо не запрещает заключить соглашение о новации в отношении обязательства по возмещению вреда, причиненного личности гражданина, а также обязательства по уплате алиментов.

Но, как представляется, законодатель при внесении данных изменений преследовал цель не разрешить новацию требований о возмещении вреда жизни и здоровью и алиментных притязаний, а заменить этот конкретный перечень ограничений общим критерием «существо отношений».

По нашему мнению, учитывая существо отношений, обязательства по возмещению вреда жизни и здоровью и алиментные обязательства не могут быть новированы, поскольку направленны на обеспечение особо значимых и имеющих значительную личную составляющую интересов граждан. Исходя из целей законодательного регулирования соответствующих обязательств возможность их прекращения способом иным, нежели исполнение, в том числе посредством новации, исключается.

Кроме того, принятие противоположной позиции делает бессмысленным запрет зачета соответствующих требований (ст. 411 ГК РФ), создавая «легальный» способ обхода императивных норм законодательства (так, достаточно новировать алиментное обязательство в заемное, а затем погасить последнее зачетом встречного однородного требования).

Соглашение о новации, совершенное в нарушение указанных выше запретов, является ничтожным (п. 75 Постановления Пленума ВС РФ от 23 июня 2015 г. N 25) и не влечет правовых последствий.

Что учесть при оформлении новации

Новация прекращает обязательство только тогда, когда соглашение о замене первоначального обязательства новым обязательством соответствует всем требованиям закона, то есть (п. 3 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 21 декабря 2005 г. N 103):

• заключено в определенной законом форме;
• между сторонами достигнуто соглашение по всем существенным условиям устанавливаемого сторонами обязательства;
• сделка является действительной.

Требования к форме соглашения о новации

Законодательством не установлены требования к форме соглашения о новации, оно может быть оформлено письменно в виде двустороннего документа (договора или соглашения). К соглашению о новации по аналогии применяются нормы Главы 29 ГК РФ о порядке расторжения и внесения изменения в договор (п.1 Постановления Пленума ВС РФ N 6). Соответственно, соглашение о новации должно быть в той же форме, что и договор, предусматривающий основное обязательство (п.1 ст.452 ГК РФ).

Если в отношении первоначального договора и договора, возникающего в результате новации, требования к форме сделки различаются, то к соглашению о новации применяются наиболее строгие правила (п. 28 Постановления Пленума ВС РФ N 6).

Из этого следует, что в случае, когда новируется обязательство, возникшее из зарегистрированного договора, или в отношении нового обязательства предусмотрена государственная регистрация, соглашение о новации также подлежит государственной регистрации. Аналогичный порядок применяется, если сделка требует нотариального заверения.

Требования к содержанию соглашения о новации

Для того, чтобы новация считалась состоявшейся, в соглашении о новации необходимо отразить следующие условия:

1. Существенные условия договора новации.

Договор считается заключенным, если между сторонами в требуемой в подлежащих случаях форме достигнуто соглашение по всем существенным условиям договора.

К таким условиям относятся условия о предмете договора, условия, которые в законе или иных правовых актах определены как существенные или необходимые для договоров данного вида, а также все те условия, относительно которых по заявлению одной из сторон должно быть достигнуто соглашение (п. 1 ст. 432 ГК РФ, п. п. 1, 2 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 25.12.2018 N 49).

Из соглашения о новации должна четко и определенно усматриваться воля сторон на замену существовавшего между ними первоначального обязательства другим обязательством (п. 2 Информационного письма ВАС РФ от 21.12.2005 г. N 103 «Обзор практики применения арбитражными судами статьи 414 Гражданского кодекса Российской Федерации»). В противном случае, если, например в соглашении к договору установить, что сумма оплаты за товар является суммой займа, без отмены встречных обязательств продавца по передаче товара, то это не будет признано новацией (см., например, Постановление Президиума ВАС РФ от 12.02.2013 N 13096/12 по делу N А40-104805/10-29-907).

Таким образом, для признания соглашения о новации заключенным в нем необходимо отразить следующие существенные условия:

• цель новации — условие о прекращении первоначального обязательства установлением нового обязательства;
• указание на первоначальное обязательство — какое обязательство и в каком размере прекращается и его основания;
• указание на новое обязательство — какое обязательство и в каком размере возникает.

2. Существенные условия нового обязательства.

В соглашении о новации должны быть согласованы предмет нового обязательства и иные условия, необходимые для договора соответствующего вида (п.1 ст.432 ГК РФ). Например, если заемное обязательство заменяется обязательством по поставке товаров, то в соответствии с п. 3 ст. 455 ГК РФ в соглашении о новации нужно указать наименование и количество товара (п. 3 Информационного письма Президиума ВАС РФ от 21.12.2005 N 103, п.27 Постановления Пленума ВС РФ N 6).

3. Сведения о включении в состав нового обязательства дополнительных обязательств, которые возникли по прежней сделке (при необходимости).

4. Момент изменения обязательства.

В общем случае моментом изменения обязательства является дата подписания соглашения о новации, но стороны вправе указать особый момент вступления соглашения в силу.

Если соглашение о новации подлежит государственной регистрации, то оно вступит в силу с момента такой регистрации.

Обращаем внимание, что вопрос о том, можно ли заранее включить в текст основного договора условия об автоматической новации, спорный. В судебной практике имеются две противоположные позиции.

Согласно одной из них нельзя включать положение о новации в основной договор сразу при его заключении. Новировать еще не существующее обязательство невозможно. Так, суд указал, что условие договора поставки о замене обязательства, возникающего при неоплате продукции, заемным нельзя рассматривать в качестве соглашения о новации (Постановление ФАС Западно-Сибирского округа от 13 января 2010 г. по делу № А03-6718/2009).

В другом деле суд признал допустимой автоматическую новацию денежного обязательства в заемное. Стороны гражданско-правового договора вправе предусмотреть в нем условие, что неисполненное обязательство по истечении определенного срока автоматически новируется в заемное обязательство без заключения об этом отдельного соглашения (Постановление АС Уральского округа от 19.01.2018 по делу № А07-6453/2017).

На наш взгляд, условие об автоматической новации в основном договоре не противоречит законодательству. Необходимым условием новации является существование на момент ее совершения первоначального обязательства, например, наличие в договоре условия об оплате товара. Включенное в договор обязательство об оплате товара начинает действовать с момента заключения договора, соответственно, требование о существовании первоначального обязательства соблюдается. При этом в законодательстве отсутствуют положения о том, что новация допускается исключительно при наличии наступившего срока исполнения существующего обязательства, в связи с чем наступление или не наступление такого срока не должно иметь правового значения на возможность совершения новации. По нашему мнению, исходя из принципа свободы договора стороны вправе предусмотреть в нем условие о том, что обязательство по оплате одной из сторон по истечении определенного срока, если оно не будет исполнено, автоматически новируется в новое обязательство без заключения об этом отдельного соглашения.

Преимущества новации

Новация выгодна как должнику, так и кредитору. Преимущества новации для должника очевидны, помимо отсрочки выплаты долга он сохраняет репутацию и хорошие деловые отношения с контрагентом. Для кредитора новация имеет следующие преимущества:

1. Должник после заключения соглашения о новации не сможет сослаться на ошибки кредитора по первоначальному обязательству.

Если при исполнении первоначального обязательства были какие-либо недочеты (например, отсутствовали полномочия у лица, подписавшего накладную или отсутствует акт оказанных услуг), должник, решивший не платить по новому обязательству, не сможет в качестве оснований для отказа в оплате ссылаться на недостатки первоначального обязательства в связи с его прекращением.

Кроме того, в случае новации долга в договор займа он не может быть оспорен ввиду отсутствия реальной передачи денежных средств (п.24 Постановления Пленума ВС РФ N 6).

2. Возможность сохранить сумму неустойки.

В соглашение о новации можно включить помимо суммы долга также начисленные пени, штрафы, проценты за пользование чужими денежными средствами.

Поскольку первоначальное обязательство прекращается, начисленные по нему денежные санкции после заключения соглашения о новации перестают быть неустойкой, поскольку трансформируются в новое обязательство должника и не могут быть снижены судом по ст.333 ГК РФ в связи с несоразмерностью последствия нарушения обязательства.

3. На общую сумму долга могут быть начислены проценты.

Стороны вправе новировать сумму задолженности в договор займа, на сумму которого подлежат уплате проценты за пользование займом, если иное не установлено законом или договором (ст.809 ГК РФ, п.24 Постановления Пленума ВС РФ N 6). Они могут быть снижены, только если суд придет к выводу, что в соглашение о новации включили чрезмерно высокий и экономически не обусловленный размер ставки.

4. Продление срока для судебного взыскания задолженности.

Стороны вправе новировать обязательства, по которым истек срок исковой давности. Срок исковой давности по обязательству, возникшему в результате новации, начинает течь заново с момента, определяемого на основании правил об исковой давности (статья 200 ГК РФ) (п.29 Постановления Пленума ВС РФ N 6).

5. Получение задолженности в иной форме без обращения в суд.

Спрашивали — Отвечаем — Официальный сайт города Дудинки

Спрашивали — Отвечаем

В связи с вступлением в силу с 01.01.2017 Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости» (далее — Федеральный закон № 218-ФЗ) отвечаем на наиболее часто задаваемые вопросы.

— Подлежат ли государственной регистрации дополнительные соглашения к договорам, обязательства по которым уже исполнены? В соответствии со статьей 421 Гражданского кодекса Российской Федерации (далее — ГК РФ) граждане и юридические лица свободны в заключении договора; условия договора определяются по усмотрению сторон, кроме случаев, когда содержание соответствующего условия предписано законом или иными правовыми актами. Пунктом 1 статьи 450 ГК РФ установлено, что изменение и расторжение договора возможны по соглашению сторон, если иное не предусмотрено ГК РФ, другими законами или договором. Соглашение об изменении или о расторжении договора совершается в той же форме, что и договор, если из закона, иных правовых актов, договора или обычаев не вытекает иное (ст. 452 ГК РФ). Согласно пункту 1 статьи 408 ГК РФ надлежащее исполнение прекращает обязательство. Таким образом, изменение условий договора возможно, в частности, если обязательства по договору сторонами не исполнены. Так, например, в соответствии с пунктом 1 статьи 12 Федерального закона № 214-ФЗ от 30.12.2004 «Об участии в долевом строительстве многоквартирных домов и иных объектов недвижимости и о внесении изменений в некоторые законодательные акты Российской Федерации» обязательства застройщика считаются исполненными с момента подписания сторонами передаточного акта или иного документа о передаче объекта долевого строительства. Следовательно, изменение условий договора участия в долевом строительстве после государственной регистрации права собственности, на основании дополнительного соглашения не допускается. Также, например, изменение условий договора об отчуждении объекта недвижимости после государственной регистрации перехода права собственности на основании такого договора не допускается. Вместе с тем, исправление технических (грамматических, арифметических) ошибок, дописок и иных подобных изменений путем заключения дополнительного соглашения является возможным.

— Подлежит ли государственной регистрации договор, составленный в простой письменной форме, если для данного договора в настоящее время установлена нотариальная форма? Согласно пункту 1 статьи 422 ГК РФ договор должен соответствовать обязательным для сторон правилам, установленным законом и иными правовыми актами (императивным нормам), действующим в момент его заключения. Таким образом, в силу статьи 422 ГК РФ соответствие договора закону устанавливается, исходя из закона, действующего на момент его заключения, а не на момент подписания сторонами. Как установлено пунктом 1 статьи 425 ГК РФ, договор вступает в силу и становится обязательным для сторон с момента его заключения. При этом в силу статьи 433 ГК РФ договор признается заключенным в момент получения лицом, направившим оферту, ее акцепта. Если в соответствии с законом для заключения договора необходима также передача имущества, договор считается заключенным с момента передачи соответствующего имущества (статья 224 ГК РФ). Следовательно, договор должен соответствовать закону, действующему в момент его заключения, а не на момент его оформления. При этом целенаправленное указание даты договора, до вступления в силу закона, является действием, направленным на обход закона во избежание нотариального удостоверения данного договора (пункт 3 статьи 10 ГК РФ), что свидетельствует о притворности такой сделки.

— В каких случаях истребуется согласие третьего лица для государственной регистрации прав? В соответствии с п. 1 ст. 173.1 ГК РФ сделка, совершенная без согласия третьего лица, органа юридического лица или государственного органа либо органа местного самоуправления, необходимость получения которого предусмотрена законом, является оспоримой, если из закона не следует, что она ничтожна или не влечет правовых последствий для лица, управомоченного давать согласие, при отсутствии такого согласия. Она может быть признана недействительной по иску такого лица или иных лиц, указанных в законе. Следовательно, к ничтожным сделкам, совершаемым без согласия третьего лица, необходимо относить те из них, на ничтожность которых указывает закон. Так, ничтожна сделка, совершенная несовершеннолетним, не достигшим четырнадцати лет (малолетним) (п. 1 ст. 172 ГК РФ). Таким образом, в случае если сделка, совершаемая без согласия третьего лица, законом отнесена к ничтожным, на государственную регистрацию прав, осуществляемую на основании такой следки, должно быть представлено согласие такого лица. В иных случаях, исходя из положений п. 1 ст. 173.1 ГК РФ, сделки, совершаемые без согласия третьего лица, необходимо рассматривать в качестве оспоримых. В соответствии с ч. 5 ст. 38 Федерального закона № 218-ФЗ при осуществлении государственной регистрации сделки или государственной регистрации прав на основании сделки, совершенных без необходимого в силу закона согласия третьего лица, органа юридического лица или государственного органа либо органа местного самоуправления, в случаях, если такие сделки в силу закона не являются ничтожными, необходимо вносить запись в Единый государственный реестр недвижимости (далее — ЕГРН). Такая запись вносится одновременно с внесением записи о государственной регистрации прав. Порядком ведения ЕГРН, утвержденным приказом Минэкономразвития России от 16.12.2015 № 943 (далее — Порядок № 943), предусмотрено, что вышеуказанные сведения не вносятся в отношении нотариально удостоверенных сделок (п. 58). Следует отметить, что Федеральным законом № 218-ФЗ, а также Порядком № 943, не предусмотрена возможность погашения внесенных в ЕГРН сведений об осуществлении государственной регистрации сделки или государственной регистрации прав на основании сделки, совершенных без необходимого в силу закона согласия третьего лица.

— Возможно ли приостановить государственную регистрацию прав по заявлению одной из сторон договора? А прекратить? Федеральный закон № 218-ФЗ не содержит требования о необходимости предоставления совместного заявления сторон договора о приостановлении государственной регистрации прав (за исключением случаев, предусмотренных ч.ч. 4, 5 ст. 30 Федерального закона № 218-ФЗ). Таким образом, заявление о приостановлении государственной регистрации прав может быть подано любой из сторон договора. Вторая сторона сделки вправе представить заявление о возобновлении государственной регистрации прав. Повторное приостановление в заявительном порядке не допускается (ч. 1 ст. 30 Федерального закона № 218-ФЗ). Вместе с тем для прекращения государственной регистрации прав с заявлением о прекращении должны обратиться все стороны договора. В ином случае применяются положения п. 41 ч. 1 ст. 26 Федерального закона № 218-ФЗ (о приостановлении государственной регистрации).

— Необходим ли технический план для государственной регистрации права собственности на объект индивидуального жилищного строительства, ранее учтенный в государственном кадастре недвижимости? В соответствии с ч. 7 ст. 70 Федерального закона № 218-ФЗ до 1 марта 2018 года основаниями для государственного кадастрового учета и (или) государственной регистрации прав на объект индивидуального жилищного строительства являются только технический план и правоустанавливающий документ на земельный участок, если в ЕГРН не зарегистрировано право заявителя на земельный участок. Таким образом, основанием для государственной регистрации права собственности на объект индивидуального жилищного строительства будут являться: — либо технический план и правоустанавливающий документ на земельный участок в случае, если право заявителя на соответствующий земельный участок не зарегистрировано в ЕГРН, — либо только технический план, если право заявителя на соответствующий земельный участок в ЕГРН зарегистрировано. Согласно ч. 4 ст. 21 Федерального закона № 218-ФЗ технический план представляется в орган регистрации прав в форме электронного документа, подписанного усиленной квалифицированной электронной подписью кадастрового инженера. То есть, технический план должен представляться для осуществления государственного кадастрового учета и (или) государственной регистрации прав только в электронном виде. Возможность представления данного документа в бумажном виде Федеральным законом № 218-ФЗ не предусмотрена. Однако если заявленный объект недвижимости ранее уже был поставлен на государственный кадастровый учет, то должно быть представлено только заявление об осуществлении государственной регистрации прав на данный объект (если право на земельный участок зарегистрировано в ЕГРН). В соответствии с ч. 10 ст. 40, ч. 7 ст. 70 Федерального закона № 218-ФЗ технический план является основанием не только для осуществления государственного кадастрового учета, но и государственной регистрации прав в отношении вновь созданных (создаваемых) объектов недвижимости. Вместе с тем, если заявлено о государственной регистрации прав на созданные (создаваемые) объекты недвижимости, в отношении которых ранее осуществлен государственный кадастровый учет, в том числе и не на основании технического плана, правоустанавливающим документом является тот документ, на основании которого осуществлен государственный кадастровый учет.

— Кто должен обращаться с заявлением о государственной регистрации перехода права и права собственности, возникшего на основании акта органа государственной власти или акта органа местного самоуправления либо сделки с органом государственной власти или органом местного самоуправления? В соответствии с ч. 2 ст. 19 Федерального закона № 218-ФЗ орган в случае, если право, ограничение права или обременение объекта недвижимости возникают на основании акта органа либо сделки с органом в срок не позднее пяти рабочих дней обязан направить в орган регистрации прав заявление о государственной регистрации прав и прилагаемые к нему документы в отношении соответствующего объекта недвижимости в порядке, установленном ст. 18 Федерального закона № 218-ФЗ. То есть, в данной норме установлена обязанность органов государственной власти, органов местного самоуправления представлять заявление и прилагаемые к нему документы для осуществления государственного кадастрового учета и государственной регистрации прав. При этом орган должен представить все необходимые для осуществления государственной регистрации прав документы, в том числе заявления о государственной регистрации перехода права собственности и права собственности приобретателя. В части 4 ст. 19 Федерального закона № 218-ФЗ закреплено, что за непредставление указанных в настоящей статье документов, органы государственной власти, органы местного самоуправления и иные уполномоченные лица, указанные в настоящей статье, будут нести ответственность предусмотренную законодательством Российской Федерации. При этом положения ч. 2 ст. 19 Федерального закона № 218-ФЗ распространяются на любые сделки, заключенные с органом государственной власти или органом местного самоуправления, а не только на сделки, совершенные на основании акта органа государственной власти или акта органа местного самоуправления. Относительно уплаты государственной пошлины хотелось бы отметить следующее. Согласно п.п. 1, 8 ст. 45 Налогового кодекса Российской Федерации налогоплательщик обязан самостоятельно исполнить обязанность по уплате налога. В случае исполнения органом обязанности, такой орган, представляя заявление, действует как представитель плательщика, наделенный соответствующими полномочиями законом. Следовательно, обязанность по уплате государственной пошлины возлагается на лицо, в отношении которого совершаются юридически значимые действия.

Ст. 452 ГК РФ с комментариями

Основания и правила прекращения сделок и изменения их условий регламентируются ст. 450, 452 ГК РФ. В большинстве случаев прекращение правоотношений или корректировка условий сделки осуществляются по соглашению участников.

Изменение и расторжение договоров: ст. 452 ГК РФ

Соглашение о прекращении правоотношений либо о корректировке условий сделки должно совершаться в той же форме, в какой заключен договор. Соответствующее положение закреплено п. 1 ст. 452 ГК РФ. Это правило применяется, если законодательными или иными нормативными актами, обычаями или договором не установлено иное.

По п. 2 ст. 452 ГК РФ, требование в суд о прекращении правоотношений или корректировке условий сделки может заявляться только после того, как другая сторона направит отказ на предложение об этом. Обратиться с иском лицо может и в случае, когда другой участник не ответит на предложение в срок, установленный в нем, договоре или законе, а при отсутствии соответствующего указания – в течение 30 дн.

Ст. 452 ГК РФ с комментариями

Правило о форме заключения соглашения о прекращении сделки является диспозитивным. Это значит, что условиями сделки может предусматриваться и иной порядок. К примеру, стороны могут установить, что все изменения, вносимые в договор, должны заверяться нотариально. Участники вправе также обозначить некоторые корректировки в устной форме.

Соглашение, согласно ст. 452 ГК РФ, может совершаться и в порядке, установленном законом или обычаями оборота. К примеру, потребитель вправе выразить отказ от исполнения условий сделки купли-продажи, когда продавец отказывается передавать ему приобретенный товар, не предоставил документы или принадлежности, относящиеся к предмету, выдал меньшее количество продукции, чем предусмотрено сделкой либо не выполнил требование приобретателя о доукомплектовании или передал некачественное изделие.

Конклюдентные действия

Под ними следует понимать действия, прямо выражающие намерения лица. В ряде случаев они могут расцениваться как форма совершения соглашения о корректировке условий сделки или ее прекращении. Это положение подтверждает и Президиум ВАС в информационном письме № 14 от 1997 г. Суд разъяснил, что конклюдентные действия в определенных обстоятельствах могут расцениваться как согласие на изменение условий договора, заключенного письменно. К примеру, неоплата приобретателем товара в установленные сроки будет признана отказом от исполнения, если сделка предполагает предоплату.

Конклюдентные действия могут совершаться и в рамках правоотношений, связанных с управлением многоквартирными домами. В 162 статье ЖК закреплено, что договор об управлении МКД оформляется письменно. При этом он должен заключаться с каждым собственником в отдельности на условиях, установленных общим собранием. Вместе с этим управляющая компания должна приступить к выполнению условий соглашения вне зависимости от того, заключено оно со всеми или только с некоторыми собственниками. Со стороны организации будут иметь место конклюдентные действия. Организация в интересах владельцев помещений в МКД начала оказывать услуги.

Спорные моменты

Отношения, в рамках которых совершаются конклюдентные действия, могут квалифицироваться как договорные вне зависимости от факта заключения договора. Это означает, что при возникновении спора заявитель не может ссылаться на отсутствие письменного соглашения.

К примеру, в практике судов имеют место случаи, когда признаются правомерными требования энергоснабжающих предприятий о взыскании с абонентов задолженности за поставленную энергию при незаключенном договоре. Ссылка на отсутствие соглашения судами отклоняется. Инстанции объясняют свои решения тем, что фактическое потребление энергии, согласно положениям 3 пункта 438 статьи ГК, расценивается как принятие оферты (акцепт предложения). Если жилые дома подсоединены к магистральным и внутриквартальным сетям заявителя, оснащены энергопринимающим оборудованием, между сторонами складываются договорные отношения.

Досудебный порядок

В пункте 2 ст. 452 ГК РФ закреплены случаи, когда сторона может направить в суд требование о прекращении правоотношений или изменении условий сделки. Такое действие допускается, если сторонам не удалось урегулировать конфликт в претензионном порядке.

При реализации положений ст. 452 ГК РФ, заявителю необходимо предоставить суду документы, подтверждающие меры, предпринятые им. Это может быть письменный отказ участника сделки, уведомление о получении им предложения и пр.

Сроки

Исходя из положений ст. 452 ГК РФ, время на получение ответа на предложение расторгнуть или изменить договор может устанавливаться непосредственно в самом обращении или в законодательстве. Если такого указания нет ни в предложении, ни в нормах, предполагается, что срок составляет 30 дней. По истечении этого периода считается, что сторона предприняла все необходимые меры для досудебного урегулирования.

Важный момент

Следует подчеркнуть, что суды требуют доказательств совершения стороной всех надлежащих действий, направленных на досудебное урегулирование, а не только подтверждения самого факта надлежащего извещения участника. Данное положение подтверждается и разъяснениями Пленума ВС. В постановлении № 6 от 1996 г. Суд указал, что споры о расторжении или изменении договоров могут рассматриваться по существу только в том случае, если истец представит доказательства, подтверждающие совершение им действий, направленных на урегулирование спора и предусмотренных 2 пунктом 452 статьи.

Так, к примеру, по одному из дел арендодателю было отказано в удовлетворении требований о досрочном расторжении договора. Суд указал, что заявитель не совершил никаких действий в рамках досудебного урегулирования. Согласно положениям 2 пункта 452 статьи и ч. 3 619 нормы ГК, арендодатель до обращения в судебную инстанцию должен направить арендатору предупреждение о необходимости исполнить обязательство в разумные сроки и предложение расторгнуть сделку. При этом данное уведомление должно быть письменным. Истец должен направить его таким способом, при котором будет иметь достоверное доказательство получения предупреждения ответчиком.

Если будет установлено, что заявитель отправил другой стороне только предложение о прекращении правоотношений, не указав на необходимость исполнить принятые обязательства, требование о прекращении договора в суде может быть не удовлетворено. Для вынесения решения в пользу истца ему необходимо предоставить доказательства направления ответчику еще и предупреждения. Только в этом случае досудебный порядок будет признан соблюденным.

Заключение

Достаточно часто в рамках гражданского оборота возникают ситуации, когда необходимо изменить или расторгнуть договор. В большинстве таких случаев законодательство предусматривает досудебный порядок урегулирования конфликта. Его соблюдение является обязательным для сторон, даже если соответствующие положения не закреплены договором.

Разбирательство в суде допускается только в случае предоставления истцом доказательств факта совершения действий по досудебному урегулированию. В их число входит не только предложение расторгнуть или изменить соглашение, но и предупреждение о необходимости исполнить другой стороной взятых на себя обязательств.

Спорт / 300

Олимпийское « золото » завоевала представительница Австрии Анна Гассер . По сумме 3-х попыток чемпионка мира 2017 года показала результат 185 баллов.

Замкнул тройку уполномоченный Австрии Микаэль Матт (+0,67). Отметим, что житель россии Александр Хорошилов с результатом 49,72 секунды занимает 21-е место.

До этого Крушельницкий признал факт обнаружения в допинг-пробах следов запрещенных препаратов и объявил о том, что возвратит медали. Об этом стало известно из сообщения издания « Свободная пресса » ссылаясь на секретаря Федерации керлинга РФ Валентину Паринову .

Дмитрий Свищев: «Сейчас мы готовим официальные запросы. К сожалению, с бронзовой олимпийской наградой нам придется расстаться», — резюмировал Свищев. 18 февраля в пробе русского керлингиста обнаружили мельдоний. При этом он подчеркнул, что фактически все высокопоставленные чиновники интернациональных спортивных федераций считают, что Крушельницкий не мог умышленно нарушить антидопинговые правила.

В сезоне-2017/18 в составе «Тосно» 27-летний футболист провёл 13 матчей в русской футбольной Премьер-Лиге, в которых не отметился результативными деяниями. В конце лета футболист вызывался в национальную сборную РФ и провел контрольный матч с столичным «Динамо». За «Тосно» Шахов начал выступать с 2017 года, проведя за этот период времени 14 матчей.

Канадки изменили ход игры за 5 минут на старте 2-го периода, на протяжении которых отличились Хейли Ирвин и Мари-Филип Пулен. Женская сборная США по хоккею победителем олимпийского хоккейного турнира. Таким образом, женская сборная США завоевала «золото» Игр 2-ой раз в своей истории. Сборная США стала победителем Олимпиады во 2-ой раз, впервые американские хоккеистки завоевали золото в 1998 на Играх в Нагано.

Дальневосточное дерби сдвинули на один день, домашняя игра пройдет в «Платинум Арене» 27 февраля, а 1 марта «тигры» сыграют во владивостокской «Фетисов Арене». Перенос связан с участием игроков «Амура» Яна Коларжа, Михала Йордана и Томаша Зогорны в заключительной стадии олимпийского хоккейного турнира в Пхёнчхане.

Сегодня мы показали умную и терпеливую игру, хотя время от времени нам необходимо было действовать быстрее. Ответная встреча пройдет на «Олд Траффорд» 13 марта и начнется в 22:45 по мск.

Таким образом, возможно того, что русские спортсмены, участвующие в Олимпиаде в Пхенчхане, смогут пройти под российским флагом за церемонии закрытия игр. «Чистых» атлетов допустили до Игр под олимпийским флагом при соблюдении нескольких условий в статусе «спортсмены-олимпийцы из России». Он отказался от проведения слушаний в Спортивной арбитражном суде (CAS), возбудившего в отношении него дело.

Премьер РФ Д. Медведев поздравил с серебряной наградой на Олимпиаде в Пхенчхане. Пхёнчхан. Южная Корея. Копилка наград русской сборной на Олимпиаде в Пхёнчхане пополнилась 4-м по счету «серебром». «Поддержка болельщиков очень помогает». «Как такой тактики не было, мы не думали об этом, а стремились смотреть по ходу гонки. Мы вчера чуть поработали над передачей эстафеты и использовали это», — сообщил Большунов корреспондентам.

По заявлению спортсмена начато расследование. Напомним, что результаты допинг-пробы «В» Крушельницкого будут оглашены утром вторника. Александр Крушельницкий, что использовать какие-то запрещенные препараты на Олимпиаде может только «лишенный здравого смысла человек».

После невыхода сборной Италии на ЧМ-2018 34-летний футболист объявил об уходе из национальной команды. «После матчей плей-офф со Швецией я подумал, что для некоторых из нас эпоха в сборной завершилась. Сейчас предстоит выбрать нового тренера сборной. «Что тогда? Конечно, мне все еще 34 года, и я ничего не могу с этим поделать», — сообщил Де Росси. — После матче со Швецией я решил, что для некоторых игроков время в сборной закончилось, — цитирует Football Italia Де Росси.

Установлено, что в середине осени предыдущего года юноша, находясь в состоянии алкогольного опьянения, в компании друзей во дворе дома на улице Минской в Казани выкрикивал призывы террористического характера. Подсудимый на 100% признал свою вину. Суд признал мужчины виновным в совершении правонарушения по ч. 1 ст. 318 УК РФ и назначил ему наказание в виде штрафа в 35 тыс.

Установлено, что в минувшем году руководитель заключила договоры на оказание туристических услуг с тремя гражданами, планировавшими отдых за рубежом. Приобретенные средства туроператорам и на бронирование путевок женщина не перечисляла, а присваивала.

На конкурсе он приготовил в джезве два напитка, которые и принесли ему победу. Конкурс под названием Cezve/Ibrik Championship в нынешнем году проходил в Дубае (ОАЭ). Заняв первое место на чемпионате по приготовлению кофе в турке, киевлянин обошел уполномченных Российской Федерации, ОАЭ и даже Турции, которые профессионально разбираются в кофе.

Счёт личных встреч оппоненток стал 2:0 в пользу украинки. Во 2-ой партии Элина неожиданно уступила, однако смогла собраться и забрала третий сет также уверенно, как и первый. Отыгравшись со счета 2:5, Свитолина провалила концовку сета и оказалась в непростом положении. Два брейка Свитолина подкрепила надежной игрой на собственной подаче и вышла в четвертьфинал, где ее уже ожидает японка Наоми Осака .

Могу сказать только самое хорошее. Большое количество мне помогал Огнен Вукоевич. Меня команда замечательно приняла на сборах в Испании, чему очень рад. «Рад, что буду за нее выступать», — цитирует Артема Шабанова официальный сайт Динамо . Рад, что эти футболисты находятся у нас в команде, что каждый влился в коллектив довольно быстро.

Об этом он написал в социальная сеть Facebook . — Скажите мне, что это ложь! По утверждению Ильи Бурова , он поддерживает отличные отношения с фристайлистов из Украинского государства, и между ними никогда не было вражды. В интервью «Чемпионат.com» Буров поведал, что давно дружит с Абраменко. Собственный поступок юноша разъяснил желанием укрепить отличные отношения между государствами.

Проигрывая после первого тайма с результатом 0:1, хозяева поля сумели не только лишь отквитать мяч, однако и выйти вперед. « Шахтер » в статусе владельца поля одержал волевую победу над «Ромой» с результатом 2:1. Итальянцы пытались отыграться, но больше не смогли пробить Андрея Пятова. Ответная встреча между этими командами состоится 13 марта в Италии. 1:1 — Феррейра (52′).

После тайм-аута ростовчанки сократили разрыв, но на перерыв команды ушли с результатом 12:10 в пользу гостей. Коллективы ушли на отдых при счете — 12:10 в пользу гостей. Встреча, состоявшаяся в Ростове-на-Дону во вторник, завершилась с результатом 26:22 (10:12). 2-ой тайм особенно удался Анне Седойкиной — наш вратарь вначале отбила пенальти, а потом сделала несколько красивых сейвов.

Турнир открыли хозяева состязания и омичи. Матч завершился с результатом 2:0 в пользу нижегородцев. Кульминацией противоборства стала вторая шайба, заброшенная менее чем за три мин. В заключительном периоде, за три мин. до финальной сирены вратарь «Авангарда» Олег Шилин попытался выступить в роли защитника, выкатился далеко из-за ворот, чем пользовался экс-игрок «ястребов» Денис Паршин.

Поединок закончился с результатом 6:4, 4:6, 10:6 в пользу белорусско-австрийского дуэта. Титул в Нью-Йорке стал вторым совместным трофеем для Мирного и Освальда в их третьем финале (до этого они были сильнейшими в столице России в 2017-м и уступили в финале в Окленде с начала этого года).

Футболист получил повреждение задней поверхности бедра, что ставит под вопрос его возможное участие в ответной игре 1/8 финала Лиги чемпионов с « ПСЖ ». Посмотрим, что скажут медики. — Он был вынужден покинуть поле и опасаюсь, новости будут плохие. «Через два дня узнаем реальный срок его восстановления», — сообщил Бутрагеньо.

Вначале Ранжело Джанга один мяч отквитал, а потом Яремчук сравнял счет. Это уже 6-й гол Яремчука за Гент в текущем чемпионате. В сегодняшнем сезоне 22-летний форвард провел 23 поединка за бельгийскую команду во всех турнирах (16 — в основе).

Сотрудники ГУ МВД Российской Федерации по Ханты-Мансийскому автономному округу — Югре вместе с членом социального совета записали ролик в поддержку олимпийских атлетов из РФ. «Этот ролик — очередное подтверждение тому, что за каждым нашим спортсменом стоит целая армия болельщиков дома, на родной земле, которая следит, переживает и ожидает от них высоких результатов на Олимпиаде», — объяснил смысл акции член публичного совета Михаил Слинкин , который является членом паралимпийской сборной РФ …

После первого тайма «шпоры» уступали с минимальным счетом, однако сначала 2-ой половины новобранец команды Лукас Моура восстановил равновесие, а в концовке встречи Гарри Кейн вывел « Тоттенхэм » вперед. Конкурентом лучшего в данной дуэли в ¼ финала будет победитель пары «Шеффилд Уэнсдэй» — «Суонси». Финал 137-го розыгрыша Кубка Британии по футболу пройдет 19 мая на стадионе «Уэмбли» в Лондоне.

Футболист ивуарийского происхождения — воспитанник 10-кратного чемпиона Франции, спортивной школы «Сент-Этьена». Хабиб Майга выступал в юношеских и молодежной сборных Кот-д’Ивуара, а осенью 2017-ого года полузащитник вызывался в национальную сборную страны.

Об этом передает Sport Агепа ссылаясь на официальный сайт IIHF. Дисциплинарный Совет не отыскал достаточных свидетельств, что матч апреля 2017 г был договорной. Захарченко считается основным вратарем сборной Украинского государства на протяжении последних нескольких лет. Хотя это еще не окончательное решение по делу, а просто отмена дисквалификации.

Пиварич уже приступил к тренировкам, однако его уровень готовности пока не дает возможность играть. «На текущий момент он тренируется индивидуально и к полноценной работе возвратится через две-три недели», — подчеркнул Хацкевич. — В последних 2-х матчах ваши подопечные получили 10 желтых карточке. Другими словами двигательная активность довольно хорошая. «В матче с Олимпиком мы пробежали 117 км — это очень хороший показатель, который не заставляет нас беспокоиться».

Встреча, минувшая во вторник в Новогорске, закончилась в овертайме с результатом 4:3 (1:2, 0:0, 2:1, 1:0) в пользу хозяев. Дублем в составе победителей отметился Андрей Марков . «Ак Барс»: Гарипов. Марков — Манухов, Токранов — Фаткуллин, Яруллин — Лямкин, Сидоров — Батыршин; Галиев — Ткачев — Зарипов, Глинкин — Попов — Азеведо, Лукоянов — Потапов — Глухов, Косов — Свитов — Бурмистров, Обухов.

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы он включал информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected].

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.14ecef50.1622109120.11272ac3

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Путь конформационного перехода в аллостерическом процессе глюкокиназы человека

Абстрактные

Глюкокиназа (GK) является важным ферментом для регулирования уровня глюкозы в крови и потенциально привлекательной мишенью для лечения диабета у молодых людей 2 типа и стойкой гиперинсулинемической гипогликемии младенчества. Чтобы охарактеризовать конформационный переход GK из закрытого состояния в супероткрытое состояние, была проведена серия моделирования традиционной молекулярной динамики (MD) и целевой MD (TMD) как для фермента дикого типа, так и для его мутантов.Два обычных 10-нсекундных моделирования МД показали, что, хотя аллостерический сайт GK находится на расстоянии ≈20 Å от активного сайта, активатор способен усиливать активность фермента за счет конформационного ограничения. Четырнадцать симуляций TMD на GK и пяти его мутантах выявили надежный путь конформационного перехода. Общий конформационный переход включает три стадии, и три вероятных стабильных промежуточных состояния были идентифицированы сканированием свободной энергии для моментальных снимков на всем пути.Особенность конформационного перехода, выявленная с помощью нашего моделирования TMD, рационализировала некоторые важные мутагенезные и кинетические данные. Примечательно, что моделирование TMD предсказало, что мутации Y61S, I159A, A201R, V203E и V452S, которые до сих пор не исследовались, могут способствовать процессу открытия GK. Эти прогнозы также были подтверждены мутагенезом и кинетическим анализом в этом исследовании. Эти наблюдения полезны для понимания механизма регуляции GK и разработки соединений для лечения метаболических заболеваний.

Глюкокиназа (GK) (гексокиназа IV или D) представляет собой гликолитический фермент, который играет важную роль в регуляции уровня сахара в крови, связанной с использованием и метаболизмом глюкозы в β-клетках печени и поджелудочной железы. Выступая в качестве сенсора глюкозы, GK контролирует уровень глюкозы в плазме (1). GK играет двойную роль в снижении уровня глюкозы в плазме: глюкозо-опосредованная активация фермента в гепатоцитах способствует обновлению глюкозы в печени и синтезу гликогена, тогда как в β-клетках поджелудочной железы в конечном итоге индуцирует секрецию инсулина.Оба эти эффекта, в свою очередь, снижают уровень глюкозы в плазме (2, 3). Клинические данные показали, что варианты GK со сниженной и повышенной активностью связаны с диабетом молодого типа 2 (MODY2) и стойкой гиперинсулинемической гипогликемией младенчества (PHHI), соответственно (4–7). Следовательно, GK может быть важной мишенью для этих двух метаболических заболеваний.

ГК относится к семейству гексокиназ (8). Хотя GK имеет высокую степень гомологии последовательностей с другими членами семейства, такими как гексокиназа I (≈54.4%), он отличается от других членов в различных аспектах, таких как связывание глюкозы с более низким сродством, положительное кооперативное поведение в отношении связывания глюкозы и отсутствие ингибирования глюкозо-6-фосфата (9). Примечательно, что активность GK представлена ​​сигмоидальной кинетической кривой глюкозы вместо кинетической кривой Михаэлиса – Ментен неаллостерических гексокиназ (10). Структурно GK представляет собой мономерный фермент, содержащий единственный активный центр. Следовательно, он должен вести себя как отдельный аллостерический механизм, отличный от механизма других хорошо изученных аллостерических ферментов, которые состоят из нескольких субъединиц, которые активируются и инактивируются согласованным образом (11).Чтобы проиллюстрировать аллостерический механизм GK, были проведены многочисленные исследования мутагенеза (9, 12–14). Недавно были обнаружены несколько активаторов ГК, обладающих таким же действием, что и активирующие мутации (15, 16). Рентгеновское кристаллографическое определение касалось кристаллических структур GK в закрытом (активном) и супероткрытом (неактивном) состояниях, подразумевая, что GK демонстрирует глобальный конформационный переход между этими двумя состояниями, и такое глобальное изменение конформации фермента может быть связано с особые аллостерические характеристики ГК (17).Таким образом, тщательное механистическое исследование глобального конформационного перехода имеет решающее значение для понимания механизма регуляции GK и для разработки новых терапевтических подходов к диабету 2 типа и стойкой гиперинсулинемической гипогликемии младенчества.

Хотя кристаллические структуры GK были определены и способствовали предложению мнемонического механизма для кооперативности GK, несколько фундаментальных вопросов все еще остаются без ответа. Аллостерический сайт находится на расстоянии ≈20 Å от активного сайта, так как же активатор усиливает активность GK? Каким образом GK добивается прогресса в крупномасштабном конформационном изменении из закрытого состояния в сверхоткрытое? Почему некоторые мутации могут активировать аллостерические признаки? К сожалению, из-за того, что сложно уловить структуры промежуточных состояний на пути глобального конформационного перехода GK, исследование вышеуказанных проблем в атомных деталях с помощью экспериментальных методов все еще остается неразрешимым.Вычислительное моделирование с его чрезвычайно высоким временным разрешением и представлением на атомарном уровне все чаще используется для понимания сложных конформационных свойств белков и прогнозирования структурных предпочтений (18-24). Насколько нам известно, глобальное изменение конформации GK не моделировалось с помощью вычислений.

Здесь мы сообщаем результаты конформационного перехода GK, обращенного к серии обычных молекулярной динамики (CMD) и целевой молекулярной динамики (TMD) моделирования.Выполнив два 10-нс моделирования CMD в водном растворе, мы показали, что, хотя аллостерический сайт GK находится на расстоянии ≈20 Å от активного сайта, активатор способен повышать активность фермента за счет конформационного ограничения. После этого, запустив 14 симуляций TMD на GK и пяти его мутантах, мы находим надежный путь конформационного перехода из закрытого состояния в супероткрытое. Общий конформационный переход включает три стадии, и три вероятных стабильных промежуточных состояния были идентифицированы сканированием свободной энергии для моментальных снимков на всем пути.Важные компоненты, относящиеся к конформационному изменению GK, были рассмотрены путем анализа детальных структур траекторий TMD. Результаты моделирования соответствуют недавним результатам экспериментов по мутагенезу и связанных с ними кинетических исследований. Кроме того, моделирование TMD предсказало, что мутации Y61S, I159A, A201R, V203E и V452S, которые до сих пор не исследовались, могут способствовать процессу открытия GK. Примечательно, что мы подтвердили эти прогнозы с помощью мутагенеза и кинетического анализа, которые также представлены в этой работе.Эти наблюдения полезны для понимания механизма регуляции GK и разработки соединений для лечения метаболических заболеваний.

Результаты и обсуждение

Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить аллостерический процесс GK человека, который больше связан с конформационным изменением из закрытого состояния в сверхоткрытое. С этой целью были разработаны четыре модели для симуляций CMD и TMD. В модели I было проведено два 10-нс моделирования CMD (A1 и A2) для закрытого состояния и его комплекса с активатором свободного белка, чтобы исследовать, как активатор влияет на конформационное изменение GK.В модели II было выполнено шесть симуляций TMD (B1 – B6) с использованием силовой постоянной 0,1 ккал · моль ⁻¹ · Å ⁻² с разными начальными скоростями для исследования пути минимальной энергии между закрытым и сверхоткрытым состояниями. . В модели III для проверки надежности пути конформационного альтернирования GK были проведены три дополнительных моделирования TMD (C1 – C3) с силовыми константами 0,2, 0,5 и 1,0 ккал · моль ⁻¹ · Å ⁻² соответственно. В модели IV были сконструированы мутанты K56A, E256A, V62M, E158A и I159A для GK, и на этих мутантах было выполнено пять симуляций TMD.Всего было выполнено 2 моделирования CMD и 14 TMD для GK и его мутантов. Более подробная информация для этих моделей молекулярной динамики (МД) представлена ​​в таблице 2, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.

Влияние активатора на конформационную динамику ГК.

Структурно GK состоит из большого и малого домена; активный сайт фосфорилирования расположен в глубокой щели между этими двумя доменами, а на обратной стороне щели находится аллостерический сайт для связывания активатора (рис.1 А ). Два 10-нс симуляции CMD для модели I были выполнены для изучения влияния активатора на конформационную динамику GK. Временные изменения углов между двумя доменами, определяемыми двумя линиями от атома C ^α Cys-223 (шарнирный остаток) до атомов C ^α Gly-229 и Lys-169 (обозначены как расщелины- угол в нижеследующем) отслеживались во время моделирования. Результаты представлены на рис.1. В .Профиль угла расщелины показывает закрытое и открытое движение между двумя доменами для свободного GK, указывая на то, что GK по своей природе динамичен. Анализ главных компонент (PCA) MD-траектории свободного GK подтвердил это предположение. Результаты PCA показали, что первые два основных компонента соответствуют скручивающим и открывающим и закрывающим движениям между двумя доменами (рис. С ). Кроме того, анализ нормального режима на свободном GK также обнаружил движение открытия и закрытия (J.З., неопубликованные данные). Максимальный угол расщелины может открываться на ≈10 ° в течение 10 нс моделирования CMD (рис. В ). Эти результаты показывают, что конформационная динамика GK является его неотъемлемым свойством, которое способствует аллостерической функции этого фермента (16). Однако при моделировании ЦМД на комплексе активатор – ГК (траектория А2; рис. 1) открытое и закрытое движение не обнаружено. В ). Результаты PCA на траектории A2 показали, что между большим и малым доменами в комплексе активатор-GK существует только небольшая крутильная вибрация (рис.1 C ), указывая на то, что активатор может заблокировать конформацию GK в закрытом состоянии, что благоприятно сказывается на каталитической активности фермента. Взвешенные по массе среднеквадратичные значения снимков вдоль траекторий CMD (A1 и A2) относительно рентгеновской кристаллической структуры закрытого состояния GK также указали на разницу в динамике между свободным GK и GK в комплексе с активатором (см. Рис. 5, который публикуется в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Соответственно, хотя аллостерический сайт находится на расстоянии ≈20 Å от активного сайта, активатор все еще способен усиливать активность фермента за счет конформационного ограничения.Этот результат согласуется с кинетическим анализом GK, согласно которому активатор изменяет форму кривой насыщения глюкозой с сигмоидальной на гиперболическую кривую Михаэлиса-Ментен и увеличивает значение V _{макс. Значение} (15, 16, 25).

Анализы для моделирования CMD на GK (траектория A1) и его комплексе с активатором (траектория A2).( A ) 2D-график топологической структуры GK. ( B ) Профили угла расщелины вдоль траекторий A1 (красный) и A2 (зеленый). Угол определяется двумя линиями от атома C ^α Cys-223 (шарнирный остаток) до атомов C ^α Gly-229 и Lys-169 (см. Cii ). ( C ) Основные составляющие моды движений в A1 ( i и ii ) и A2 ( iii ). Цвета стрелок обозначают конкретную движущуюся область (правило правой руки).Фиксированные домены и подвижный домен отмечены синим и красным цветом соответственно; остатки для вращения по оси — зеленым.

Потенциальный путь глобального конформационного перехода.

Моделирование CMD на GK показало, что закрытое состояние фермента может в некоторой степени раскрыться без какого-либо действия внешней силы. Однако современные методы CMD не могут моделировать такие крупномасштабные конформационные изменения, как глобальное изменение конформации GK.Соответственно, TMD, который может ускорить процесс крупномасштабного конформационного движения между двумя существующими состояниями, был использован в этом исследовании для изучения вероятного аллостерического пути GK. Чтобы получить надежный путь глобального конформационного перехода из закрытого в сверхоткрытое состояние, шесть симуляций TMD (B1 – B6) были выполнены на модели II при силовой постоянной 0,1 ккал · моль ⁻¹ · Å ⁻² с разные начальные скорости (табл. 2). Шесть симуляций TMD почти привели к одному и тому же пути конформационного перехода, что продемонстрировано взвешенными среднеквадратичными значениями для шести траекторий (см. Таблицу 3, которая опубликована в качестве дополнительной информации на веб-сайте PNAS), что указывает на то, что начальные скорости для симуляций TMD не повлияли путь перехода.Чтобы исследовать влияние силовой постоянной на путь конформационного перехода, были проведены три дополнительных моделирования TMD (C1 – C3) на модели III при силовых постоянных 0,2, 0,5 и 1,0 ккал · моль ⁻¹ · Å ⁻² соответственно. По сравнению с траекториями B1 – B6, траектории C1 – C3 не дали качественно отличных результатов (см. Таблицу 4 и Рис. 6, которые опубликованы в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Все эти данные свидетельствуют о надежности пути конформационного перехода.Далее мы используем траекторию B1 для дальнейшего обсуждения.

TMD-смоделированный путь конформационного перехода GK из закрытого в сверхоткрытое состояние показан на рис. 2. Хотя переход происходит непрерывно, общий конформационный переход можно грубо разделить на три стадии (рис. 2). Конформационный переход начинается со стадии, на которой угол расщелины постепенно открывается ≈9 ° в течение периода времени от 0 до 160 пс. Выше 10 нс моделирование CMD на свободном GK также обращалось к конформационному альтернированию этой стадии (рис.1). Поскольку трудно преодолеть энергетический барьер, создаваемый сильным взаимодействием петли I между α4 и β7 в малой области с β1 и β11 в большой области (рис. A ), симуляция CMD не может пройти весь путь конформационного перехода. По мере продолжения симуляции TMD взаимодействие между малым и большим доменами разрушается, и угол расщепления открывается ≈40 °. На второй стадии (360-700 пс) цепи β6 и β7 в малом домене постоянно расслабляются в своих положениях в пределах локального пространства после того, как GK подвергается быстрому процессу открытия.При ≈550 пс нити β6 и β7 удаляются от аллостерического сайта, меняют свою ориентацию и полностью уходят в растворитель. На этом этапе эти две β-нити начинают разворачивать свои вторые структуры в спирали. В третьем периоде (700–1000 пс) угол расщелины достигает сверхоткрытого состояния, и нити β6 и β7 полностью превращаются в клубковые структуры и обнажают растворитель. Между тем спираль α13 отходит от малого домена. В общем, большой домен во время конформационного перехода движется почти как твердое тело; однако движение малого домена более сложное, что связано с биологической функцией GK, как мы обсудим ниже.

Путь конформационного перехода GK из закрытого в сверхоткрытое состояние. Центральное изображение представляет собой временную зависимость угла расщелины между двумя доменами. Вокруг центрального изображения шесть снимков извлекаются из траектории B1 в моменты времени 150 (1), 320 (2), 400 (3), 600 (4) и 800 (5) пс, а также в сверхоткрытом состоянии (6). , соответственно.Петля I между сегментами α4 и β7 красного цвета; цепи β6 и β7 окрашены в голубой цвет; спираль α13 — желтого цвета.

Возможные промежуточные состояния на пути перехода.

Рентгеновские кристаллические структуры GK показывают, что конформационный переход из закрытого в сверхоткрытое состояние является сложным процессом. Согласно мнемоническому механизму регуляции GK, предложенному Kamata et al. (17) и поведения других гексокиназ (25), стабильные промежуточные состояния должны существовать в пути конформационного перехода, чтобы снизить стоимость крупномасштабных конформационных изменений и увеличить возможность регуляции.Тем не менее такие промежуточные состояния ГК экспериментальными методами не обнаружены (17). Чтобы исследовать возможные промежуточные состояния для GK, ландшафт свободной энергии вдоль пути конформационного перехода был рассчитан с использованием метода MM-PBSA-Nmode, закодированного в AMBER (версия 7.0) (26). Результат показан на рис.3. A , что указывает на наличие трех энергетических ям (обозначенных P1, P2 и P3) на пути в периоды времени ≈130–160, ≈370–550 и ≈695–705 пс.Конформации в этих энергетических ямах, возможно, являются стабильными промежуточными состояниями. Чтобы дополнительно проверить возможность этих промежуточных состояний, снимки были изолированы от траекторий B1 – B6 и наложены на кристаллические структуры других гексокиназ. Результат показал, что конформации в лунке P1 очень похожи на рентгеновскую кристаллическую структуру открытого состояния гексокиназы I (рис. B ) (25). Этот результат показывает, что состояние P1 может быть реальным стабильным промежуточным состоянием GK, т.е.е., открытое состояние GK, что является желаемым результатом (17). Конформации, попавшие во вторую и третью лунки (состояния P2 и P3), также могут быть промежуточными состояниями в пути конформационных переходов, как мы обсудим ниже.

Ландшафт свободной энергии и промежуточные состояния на пути конформационного перехода.( A ) Профили свободной энергии конформаций вдоль траектории B1. Тени указывают на три ямы с минимальной свободной энергией. ( B ) rmsd эволюции конформаций вдоль шести траекторий TMD (B1 – B6) с закрытым ( i ) и открытым ( ii ) состояниями гексокиназы I. ( C ) Важные взаимодействия для три возможных промежуточных состояния [P1 ( i ), P2 ( ii ) и P3 ( iii )] на пути конформационного перехода.

Важные компоненты на пути перехода и подтверждение мутагенеза.

Рентгеновская кристаллическая структура закрытого состояния указывает на наличие двух прямых водородных связей (Н-связей) между малым и большим доменами, то есть Lys-56 ··· Asn-166 и Glu-256 ··· Lys. -169. Моделирование TMD показало, что эти две Н-связи стабильны до 160 пс (первая стадия пути конформационного перехода) (рис. Ci , а также см. Рис.7, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). По мере продолжения TMD эти две H-связи разорвались, и трещина в GK открылась еще больше. Интересно, что точка разрыва Н-связей (≈160 пс) точно соответствует предсказанному промежуточному (P1) состоянию, на что указывает расчет свободной энергии (рис. А ). Этот результат подчеркивает, что эти две Н-связи играют важную роль в конформационном переходе. Скорее всего, сила разрыва, необходимая для разрыва этих двух Н-связей, вызвала энергетический барьер от P1 до сверхоткрытого состояния.Для картирования функциональности этих двух Н-связей было выполнено два дополнительных моделирования TMD (D1 и D2) на мутантах K56A и E256A. Результаты показали, что мутация K56A не изменяет путь конформационного перехода, тогда как мутация E256A задерживает процесс открытия двух доменов (рис. A и B ). Эти результаты согласуются с исследованиями мутагенеза, которые показали, что K56A мало влияет на кинетические свойства GK, но E256A серьезно снижает сродство и кооперативность GK с глюкозой (27).Структурный анализ показал, что, хотя мутация K56A уничтожила H-связь Lys-56 ··· Asn-166, H-связь Glu-256 ··· Lys-169 все еще сохранялась до 160 пс во время моделирования TMD. Однако мутация E256A изменила локальную структуру интерфейса взаимодействия между двумя доменами. Кроме того, Asn-166 образовал новую Н-связь с Ala-256, а боковая цепь Lys-169 глубоко вставлена ​​в щель между двумя доменами (см. Рис. 8, который опубликован в качестве вспомогательной информации в сети PNAS). сайт).Эта структурная перестройка усиливает взаимодействие между двумя доменами, замедляя процесс открытия щели и препятствуя связыванию глюкозы с GK.

Влияние мутаций K56A ( A ), E256A ( B ), V62M ( C ), D158A ( D ) и I159A ( E ) на путь конформации GK.Углы в A и B определяются так же, как на рис. В . Расстояния в C — E измерены между атомами C ^α I159 и V452.

Несколько экспериментов показали, что каталитический цикл GK является медленным процессом, подразумевая, что конформационный переход, соответствующий этому циклу, идет медленно (28, 29). Примечательно, что расчет свободной энергии захватил еще одно вероятное промежуточное состояние второй стадии пути конформационного перехода (состояние P2 на рис.3 А ). Соответственно, были тщательно проанализированы структурные детали состояния P2. Результат показал, что на втором этапе Tyr-61, Val-62, Ala-201, Val-203 и Val-452 образуют «гидрофобный карман», а боковые цепи Asp-158 и Ile-159 в цепь β6 вставляется в гидрофобный карман посредством гидрофобных взаимодействий, которые блокируют движение между двумя доменами GK (рис. Cii ). Следовательно, энергетический барьер, вызванный состоянием P2, может быть причиной медленного процесса каталитического цикла.Чтобы подтвердить этот вывод, были проведены три дополнительных моделирования TMD (D3 – D5) на мутантах GK V62M, D158A и I159A. Первые две мутации усилили гидрофобные взаимодействия, а последняя мутация уменьшила гидрофобные взаимодействия между двумя доменами на второй стадии. Действительно, мутации V62M и D158A задерживают процесс открытия из закрытого состояния в сверхоткрытое, на что указывают профили расстояния между Ile-159 и Val-452 в зависимости от времени моделирования (рис. C и D ).Этот результат согласуется с результатами мутагенеза, которые показали, что V62M и D158A активируют мутации с пониженным значением S . _0,5 значений (концентрация глюкозы, при которой GK показывает половину активности V _макс ) (9, 30). Моделирование TMD предсказало, что мутация I159A может способствовать процессу открытия GK (рис. E ). Однако экспериментальных данных об этой мутации нет.Мы сконструировали клон этого мутанта и получили чистый белок путем экспрессии (подробные процедуры для экспрессии белка, очистки и ферментативного анализа описаны в Вспомогательные материалы и методы , который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Кинетический анализ показал, что I159A является инактивирующей мутацией: его S _0,5 увеличилась в ≈8 раз, а В _max уменьшилось по сравнению с GK дикого типа (таблица 1).Моделирование TMD также указывает на важность остатков Tyr-61, Ala-201, Val-203 и Val-452 в стабилизации структуры P2 (рис. Cii ). Кроме того, для этих остатков не поступало данных о мутациях. Чтобы проверить результат моделирования, эти остатки были преобразованы в полярные аминокислоты, в результате чего были получены мутанты Y61S, A201R, V203E и V452S для ослабления гидрофобных взаимодействий Asp-158 и Ile-159 с гидрофобным карманом (рис. 3). Cii ).Действительно, кинетические определения показали, что все эти мутации снижают ферментативную активность GK с увеличением S _0,5 и уменьшено В _max значений (Таблица 1), предполагая, что, подобно I159A, эти мутации облегчают процесс открытия GK. Эти анализы мутагенеза подтвердили предсказание TMD, снова продемонстрировав надежность пути конформационного перехода и соответствующих промежуточных состояний, полученных из моделирования TMD.

Кинетический анализ GK и его мутантов

Спираль α13 окружена α5, β3, β4 и β5, а Tyr-215 на β5 служит привратником для предотвращения выхода спирали α13 из небольшого домена. Этот процесс произвел третье промежуточное состояние в пути конформационного перехода (P3 на рис. С ). По мере того, как щель открывалась больше после состояния P2, цепи β6 и β7 постепенно отходили от аллостерического сайта, меняли ориентацию и уходили в растворитель.На этом этапе маленький домен слегка скручен относительно большого домена, освобождая пространство для спирали α13, чтобы выйти из малого домена. Подробный процесс освобождения спирали α13 из малого домена показан на рис. 9, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS. Во время этого процесса Tyr-215 на α5 предотвращает выход спирали α13 из малого домена, а остатки в спирали α13, которые непосредственно контактируют с Tyr-215, представляют собой Val-455 и Ala-456. По результатам TMD можно предсказать, что мутации по остаткам с более объемными боковыми цепями могут ингибировать высвобождение спирали α13, тем самым продлевая процесс конформационного перехода.Два таких мутанта GK (V455M и A456V) были обнаружены у пациентов с метаболическим заболеванием. В соответствии с результатами TMD, кинетический анализ этих двух мутантов показал значительное снижение S _0,5 значений (6, 7). Соответственно, высвобождение спирали α13 из небольшого домена, особенно контактов Val-455 и Ala-456 из α13 с Tyr-215 из α5, также является важным компонентом конформационного перехода.

Последствия в аллостерическом механизме.

На основе рентгеновских структур GK, Kamata et al. (17) разработал кинетическую модель для аллостерического механизма регуляции GK и предсказал, что промежуточные состояния, вероятно, существуют в пути конформационных переходов между закрытыми и супероткрытыми состояниями. Однако эти промежуточные состояния ГК экспериментальными методами пока не обнаружены. Очень важный механистический вывод из нынешнего TMD-моделирования GK состоит в том, что существует три промежуточных состояния (P1 – P3 на рис.3 A ) в пути конформационного перехода из закрытого состояния в сверхоткрытое. Компоненты взаимодействия, которые вызвали энергетические барьеры, соответствующие промежуточным состояниям, были учтены с помощью моделирования TMD, и все они согласуются с имеющимися данными мутагенеза и кинетического анализа. Примечательно, что моделирование TMD показало, что Ile-159, который ранее не исследовался, может играть существенную роль во время конформационного перехода GK, и его мутация является инактивирующей.Используя мутагенез и кинетический анализ, мы подтвердили прогноз TMD.

На основе настоящего анализа моделирования методом МД мы предлагаем атомарный механизм для кинетической модели аллостерического процесса GK. Как показано на рис. 3 A , GK может существовать в трех промежуточных состояниях (P1 – P3) между закрытым и сверхоткрытым состояниями. Моделирование TMD показало, что GK претерпевает конформационный переход из закрытого в сверхоткрытое состояние через три стадии (рис.2). На первом этапе GK открывается из закрытого состояния в состояние P1, которое является открытым состоянием, как предсказано Kamata et al. (17). Моделирование CMD за 10 нс показало, что закрыто-открытое конформационное изменение между закрытым и P1-состоянием является внутренним свойством GK. Этот процесс соответствует «быстрому циклу» для каталитического механизма GK, предложенному Kamata et al. (17). Две Н-связи, образованные между Lys-56 и Asn-166 и между Glu-256 и Lys-169, являются основными компонентами для стабилизации структуры состояния P1.На втором этапе конформация меняется с P1 на P2. На этой стадии важным компонентом для создания энергетического барьера для конформационного изменения являются гидрофобные взаимодействия между боковыми цепями Asp-158 и Ile-159 и гидрофобным карманом, окруженным Tyr-61, Val-62, Ala-201, Вал-203 и Вал-452. Третья стадия — это высвобождение спирали α13 из небольшого домена, и энергетический барьер этого этапа в основном обусловлен устойчивым взаимодействием между спиралью α13 (Val-455 и Ala-456) и спиралью α5 (Tyr-215). .Существование состояний P2 и P3 согласуется с выводом, сделанным на основании фосфорилирования глюкозы, что конформационные изменения между открытым и сверхоткрытым состояниями происходят медленнее, чем конформационные изменения закрыто-открытое (17).

Методы

Системы моделирования.

Начальные координаты для закрытого и сверхоткрытого состояний GK были взяты из рентгеновских кристаллических структур (17) (коды Protein Data Bank ID 1V4S и 1V4T).Недостающие остатки были восстановлены с использованием метода поиска петель в модуле гомологии Insight II (Accelrys, Сан-Диего, Калифорния). Для моделирования GK (или мутированного GK) в водном растворе белок сначала помещали в коробку подходящего размера, в которой минимальное расстояние от белка до стенки коробки составляло 1,5 нм. Затем бокс был сольватирован с помощью модели воды SPC (31). Система белок / вода была подвергнута минимизации энергии. После этого в систему были добавлены противоионы, чтобы обеспечить нейтральную систему моделирования.Впоследствии вся система была снова свернута. Заряды атомов активатора N- тиазол-2-ил-2-амино-4-фтор-5- (1-метилимидазол-2-ил) тиобензамида рассчитывали с помощью метода RESP (32), кодированного в Программный комплекс AMBER (26) на уровне RHF / 6-31G *. Ковалентные и несвязанные параметры для атомов активатора были назначены по аналогии или путем интерполяции из уже присутствующих в силовом поле AMBER (33).

Моделирование CMD и TMD.

CMD было выполнено с использованием пакета AMBER (версия 7.0) с постоянной температурой, постоянным давлением (NPT) и периодическими граничными условиями. К белкам применялось силовое поле Amber Parm99 (33). Метод Эвальда с сеткой частиц (34) был использован для расчета дальнодействующих электростатических взаимодействий. Пороговое значение для несвязанных элементов было установлено на 12,0 Å, а значения для несвязанных пар обновлялись каждые 25 шагов. Метод SHAKE (35) применялся для ограничения всех ковалентных связей с участием атомов Н.Каждое моделирование было связано с термостатом 300 K при давлении 1,0 атм (1 атм = 101,3 кПа) с применением алгоритма Berendsen et al. (36). Параметры связи по температуре и давлению были установлены равными 0,2 и 0,05 пс соответственно. Для моделирования МД был установлен шаг интегрирования 2 фс. Моделирование TMD было выполнено с использованием модуля Sander, закодированного в AMBER (версия 7.0) (26). Сдерживающая сила была приложена к каждой исходной структуре для смещения траекторий к каждой соответствующей целевой структуре.Шаг интегрирования для моделирования TMD был установлен на 1 фс. Подробную процедуру моделирования TMD можно найти в ссылке. 37 и в нескольких недавних приложениях (38, 39).

Кинетический анализ GK и его мутантов.

Последовательность ДНК изоформы 2 GK печени человека (hLGK2) была получена путем полного синтеза гена (Сангон, Шанхай, Китай), а затем клонирована в pQE-30 (Qiagen, Валенсия, Калифорния), чтобы получить рекомбинантную плазмиду pQE-30-hLGK2. . Мутантные клоны Y61S, I159A, A201R, V203E и V452S получали с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) с использованием pQE-30-hLGK2 в качестве матрицы.Экспрессию и очистку рекомбинантных белков осуществляли согласно His · Bind Kits (Novagen, Сан-Диего, Калифорния). Затем тип hLGK2 и мутантные белки подвергали кинетическому анализу, как описано Grimsby et al. (16).

Для получения дополнительной информации см. Вспомогательные материалы и методы .

Благодарности

Мы благодарим Шанхайский суперкомпьютерный центр и Информационный центр компьютерных сетей Китайской академии наук за выделенное вычислительное время.Эта работа была поддержана Специальным фондом для крупного государственного проекта фундаментальных исследований Китая, грант 2002CB512802, Национальный фонд естественных наук Китая, грант 30525024 и Шанхайская комиссия по науке и технологиям, грант 03DZ19228.

Сноски

• ^§ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронное письмо: hljiang {at} mail.shcnc.ac.cn или xshen {at} mail.shcnc.ac.cn

• Вклад авторов: X.С. и Х.Дж. разработали исследование; J.Z., C.L., W.Z. и X.S. проведенное исследование; J.Z., C.L., K.C., W.Z. и H.J. проанализировали данные; и J.Z., X.S. и H.J. написали статью.

• Заявление о конфликте интересов: о конфликте интересов не сообщалось.

• Сокращения:

  GK,

  глюкокиназа;

  MD,

  молекулярная динамика;

  CMD,

  обычные MD;

  TMD,

  мишень MD.

• © 2006 Национальная академия наук США

Микроорганизмы | Бесплатный полнотекстовый | Характеристика INS-15, металлопротеиназы, потенциально участвующей во вторжении Cryptosporidium parvum

1. Введение

В этом исследовании мы сосредоточились на INS-15, кодируемом геном cgd3_4260. Он был выбран потому, что он кодируется одним членом кластера 11 генов на хромосоме 3 и имеет все 4 домена, которые присутствуют в классических металлопротеазах M16A, а другие протеазы INS — в Cryptosporidium spp. в основном отсутствует один или несколько доменов. Поскольку INS-15 имеет значительную гомологию последовательностей (90% идентичности нуклеотидных последовательностей) с INS-16, кодируемым геном cgd3_4270, который отсутствует у C.ubiquitum, он может выполнять важные биологические функции у Cryptosporidium spp.

3. Обсуждение

4. Материалы и методы

4.1. Паразиты и клеточная линия

Ооцисты изолята C. parvum IOWA были приобретены у Waterborne, Inc. (Новый Орлеан, Лос-Анджелес, США) и хранились при 4 ° C в течение менее двух месяцев с момента их сбора.Перед использованием их обрабатывали 0,5% гипохлоритом натрия на льду в течение 10 минут и трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) центрифугированием. Геномную ДНК экстрагировали из ооцист C. parvum с использованием набора Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Германия).

Клетки илеоцекальной аденокарциномы человека HCT-8 были получены из Шанхайского отделения Китайской академии наук. Для экспериментов in vitro клетки HCT-8 высевали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C до ~ 90% слияние.Обработанные гипохлоритом ооцисты суспендировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2% FBS и добавляли в планшеты в количестве 5 × 10 ⁵ ооцист / лунку. После инкубации в течение 2 ч непораженных паразитов смывали с культуры с помощью PBS. К культуре добавляли свежую среду RPMI 1640 с добавлением 2% FBS, которую поддерживали в течение определенного времени в зависимости от анализа.

4.2. Клонирование, экспрессия и очистка домена I INS-15 и INS-15. Домены

Плазмиду, содержащую правильную последовательность гена cgd3_4260 или фрагмента домена I, трансформировали в клетки E. coli BL21 (DE3) или клетки Rosetta (DE3) для экспрессии белка.В некоторых экспериментах кодоны в гене cgd3_4260 были изменены на кодоны E. coli с использованием подхода генного синтеза до трансформации клеток BL21-Codon plus (DE3) -RIPL. Клетки BL21 (DE3) культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг / мл канамицина, при 37 ° C, тогда как клетки Rosetta (DE3) или BL21-Codon plus (DE3) -RIPL культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг / мл канамицина. и 34 мкг / мл хлорамфеникола при 37 ° C. После того, как OD ₆₀₀ достигнет 0,6–0,8, экспрессия домена I INS-15 или INS-15 в E.coli индуцировали добавлением к культуре 0,1 мМ IPTG при 18 ° C в течение 8 часов. Уровень экспрессии целевого белка оценивали с помощью SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим G-250.

Для очистки домена I INS-15 и INS-15 культивированные клетки E. coli собирали центрифугированием и лизировали обработкой ультразвуком на льду. Лизат центрифугировали и осадок растворяли в буфере PBS, содержащем 8 М мочевину. После повторного центрифугирования супернатант фильтровали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,45 мкм (Millipore, Billerica, MA, US) и загружали на шарики Ni-NTA (Novagen, Мэдисон, Висконсин, США) при 16 ° C и 90 об / мин. за 4 ч.Гранулы промывали 10 объемами мочевины с буфером 6 M PBS, содержащей 20 мМ имидазола, и элюировали 6 объемами мочевины с буфером 6 M PBS, содержащей 250 мМ имидазола. Очищенный белок исследовали с использованием SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим G-250 и анализировали на идентичность с использованием матричной лазерной десорбции / время ионизации масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS).

4.3. Получение антител против домена I INS-15 и полипептида

4.4. Вестерн-блоттинг нативного INS-15

Для оценки экспрессии нативного INS-15 ооцисты, обработанные 0,5% гипохлоритом натрия, суспендировали в буфере PBS, содержащем 0,75% тауродезоксихолевой кислоты и 0,25% трипсина, и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. час Высвободившиеся спорозоиты собирали центрифугированием и ресуспендировали в PBS, содержащем 1% коктейль ингибиторов протеазы (Merck, Дармштадт, Германия). Их лизировали путем добавления буфера для загрузки белка (Yeasen, Shanghai, China) и кипячения в течение 5 мин.Белки (из ~ 5 × 10 ⁶ спорозоитов / дорожка) в лизате разделяли на SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Последние блокировали 5% обезжиренным PBST молока в течение 2 часов и инкубировали с антителами против INS-15 домена I (~ 0,5 мкг / мл), антителами против полипептида INS-15 (~ 1,5 мкг / мл) или предварительно -иммунная сыворотка (1: 1000) на 2 ч. Козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Earthox, Millbrae, CA, USA), использовали в соотношении 1: 5000 в качестве вторичных антител в вестерн-блот-анализе.После 1-часовой инкубации и трех промывок PBST блоты обрабатывали усиленным хемилюминесцентным реагентом (Thermo Fisher, Rockford, IL, USA) и анализировали с помощью Tanon 5200 (Tanon, Шанхай, Китай).

4.5. Количественный анализ экспрессии гена cgd3_4260

4.6. Иммунофлуоресцентный анализ (IFA)

Спорозоиты, ресуспендированные в PBS, сушили на предметных стеклах микроскопа, тогда как внутриклеточные стадии C. parvum в клетках HCT-8 выращивали на покровных стеклах в течение 24 и 48 часов. Эти слайды или покровные стекла фиксировали метанолом при комнатной температуре в течение 15 мин.После трех промывок PBS фиксированные спорозоиты или клетки обрабатывали 0,5% Triton-X в PBS в течение 15 минут и блокировали для неспецифического связывания 5% BSA в PBS в течение 1 часа. После трех промываний PBS их инкубировали с антителами против домена I INS-15 (~ 0,6 мкг / мл) или полипептида INS-15 (~ 3,9 мкг / мл) в 5% BSA-PBS в течение 1 ч с последующей инкубацией с Конъюгированный с Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США) в 5% BSA-PBS при 1: 400 в течение еще одного часа. После трех промывок предметные стекла или покровные стекла контрастировали с ядерным красителем 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США).После еще трех промывок предметные стекла или покровные стекла закрывали установочной средой No-Fade Mounting Medium (Booster, Ухань, Китай) и исследовали с использованием дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной микроскопии на микроскопе BX53 (Olympus, Токио, Япония).

4.7. Анализ нейтрализации инвазии

Источников | Технологии отрицательных выбросов и надежное улавливание: программа исследований

Лал, Р.и Дж. П. Брюс. 1999. Потенциал мировых пахотных земель по улавливанию углерода и снижению парникового эффекта. Экологическая наука и политика 2 (2): 177-185. DOI: https: //org/10.1016/S1462-9011 (99) 00012-X.

Лал Р., Дж. М. Кимбл, Р. Ф. Фоллет и К. В. Коул. 1998. Потенциал пахотных земель США по улавливанию углерода и смягчению парникового эффекта. Челси, Мичиган: Ann Arbor Press.

Ламбарт, С., Х. М. Сэвидж и П. Б. Келемен. 2018.Экспериментальное исследование давления кристаллизации Ca (OH) 2: последствия для процесса реактивного крекинга G-cubed (представлен).

Лэнд, С. С. 1968. Расчет относительной проницаемости впитывания для двух- и трехфазного потока на основе свойств породы. Журнал Общества инженеров-нефтяников 8 (2): 149. DOI: 10.2118 / 1942-Pa.

Langenbruch, C., and M. D. Zoback. 2016. Как индуцированная сейсмичность в Оклахоме отреагирует на снижение темпов закачки соленой воды? Научный прогресс 2 (11).DOI: 10.1126 / sciadv.1601542.

Ф. Ларачи, И. Далдул и Г. Бодуан. 2010. Фиксация CO ₂ хризотилом при сухой и влажной карбонизации при низком давлении: характеристики Ex-situ и in-situ. Geochimica Et Cosmochimica Acta 74 (11): 3051-3075. DOI: 10.1016 / j.gca.2010.03.007.

Ф. Ларачи, Дж. П. Гравел, Б. П. А. Гранджан и Г. Бодуан. 2012. Роль пара, водорода и предварительной обработки в газо-твердой карбонизации хризотила: возможности для улавливания CO ₂ перед сжиганием. Международный журнал по контролю за парниковыми газами 6: 69-76. DOI: 10.1016 / j.ijggc.2011.10.010.

Launay, J., and J.-C. Fontes. 1985. Les sources thermales de Prony (Nouvelle-Calédonie) et leurs précipités chimiques: Exemple de education de brucite primaire. Géologie de la France 1985 (1): 83-100.

Лоулер, Дж. Дж., Д. Дж. Льюис, Э. Нельсон, А. Дж. Плантинга, С. Поласки, Дж. К. Уити, Д. П. Хелмерс, С. Мартинуцци, Д. Пеннингтон и В. К. Раделофф. 2014 г.Прогнозируемые воздействия изменений в землепользовании на экосистемные услуги в США. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111 (20): 7492-7497. DOI: 10.1073 / pnas.1405557111.

Лазард. 2016. Приведенный анализ затрат на энергоресурсы 10.0. Доступно по адресу https://www.lazard.com/perspective/levelized-cost-of-energy-analysis-100, по состоянию на 12 апреля 2018 г.

Ле Кере, К., Р. М. Эндрю, Дж. Г. Канадель, С. Ситч, Дж. И. Корсбаккен, Г. П. Петерс, А.К. Мэннинг, Т. А. Боден, П. П. Танс, Р. А. Хоутон, Р. Ф. Килинг, С. Алин, О. Д. Эндрюс, П. Антони, Л. Барберо, Л. Бопп, Ф. Шевалье, Л. П. Чини, П. Сиайс, К. Карри, К. Делире, С. К. Дони, П. Фридлингштейн, Т. Гкрицалис, И. Харрис, Дж. Хаук, В. Хаверд, М. Хоппема, К. К. Голдевейк, А. К. Джайн, Э. Като, А. Кёртцингер, П. Ландшютцер, Н. Lefèvre, A. Lenton, S. Lienert, D. Lombardozzi, JR Melton, N. Metzl, F. Millero, PMS Monteiro, DR Munro, JEMS Nabel, S.-i. Накаока, К.О’Брайен, А. Олсен, А. М. Омар, Т. Оно, Д. Пьеро, Б. Поултер, К. Рёденбек, Дж. Солсбери, У. Шустер, Дж. Швингер, Р. Сефериан, И. Скельван, Б. Д. Стокер, AJ Sutton, T. Takahashi, H. Tian, ​​B. Tilbrook, IT van der Laan-Luijkx, GR vd Werf, N. Viovy, A. P. Walker, A. J. Wiltshire, S. Zaehle. 2016 г. Глобальный углеродный бюджет на 2016 г. Данные науки о системе Земли 8: 605-649. DOI: 10.5194 / essd-8-605-2016.

Ле Кере, К., Р. М. Эндрю, П. Фридлингштейн, С. Ситч, Дж.Понграц, А.С. Мэннинг, Дж. И. Корсбаккен, Г. П. Питерс, Дж. Г. Канаделл, Р. Б. Джексон, Т. А. Боден, П. П. Танс, О. Д. Эндрюс, В. К. Арора, DCE Баккер, Л. Барберо, М. Беккер, Р. А. Беттс, Л. Бопп, Ф. Шевалье , LP Chini, P. Ciais, CE Cosca, J. Cross, K. Currie, T. Gasser, I. Harris, J. Hauck, V. Haverd, RA Houghton, CW Hunt, G. Hurtt, T. Ilyina, AK Джайн, Э. Като, М. Каутц, Р. Ф. Килинг, К. К. Голдевейк, А. Кёртцингер, П. Ландшютцер, Н. Лефевр, А. Лентон, С. Линерт, И. Лима, Д.Ломбардоцци, Н. Метцль, Ф. Миллеро, П. М. С. Монтейро, Д. Р. Манро, Дж. Э. М. С. Набель, С.-и. Накаока, Ю. Нодзири, Х.А. Падин, А. Перегон, Б. Пфейл, Д. Пьеро, Б. Поултер, Г. Редер, Дж. Реймер, К. Рёденбек, Дж. Швингер, Р. Сефериан, И. Скельван, Б. Д. Stocker, H. Tian, ​​B. Tilbrook, FN Tubiello, IT van der Laan-Luijkx, GR van der Werf, S. v. Heuven, N. Viovy, N. Vuichard, AP Walker, AJ Watson, AJ Wiltshire, S. Zaehle и D. Zhu. 2018. Global Carbon Budget 2017. Earth System Science Data 10: 405-488.DOI: 10.5194 / essd-10-405-2018.

Лил, П. П., К. Л. Херд, П. А. Фернандес и М. Ю. Роледа. 2017. Закисление океана и развитие ламинарии: снижение pH не оказывает отрицательного воздействия на прорастание мейоспор и развитие гаметофитов Macrocystis pyrifera и Undaria pinnatifida . Психологический журнал 53 (3): 557-566. DOI: 10.1111 / JPY.12518.

Ли, С.Ю., Дж. Х. Примавера, Ф. Дахдух-Гебас, К. Макки, Дж. О. Бозире, С. Канниччи, К. Диле, Ф.Фромард, Н. Коэдам, К. Марчанд, И. Мендельсон, Н. Мукерджи и С. Рекорд. 2014. Экологическая роль и услуги тропических мангровых экосистем: переоценка. Глобальная экология и биогеография 23 (7): 726-743. DOI: 10.1111 / geb.12155.

К. Лефевр, Ф. Рекик, В. Алькантара и Л. Визе. 2017. Органический углерод почвы: скрытый потенциал . Рим: ФАО.

Леман, Р. М., В. Акоста-Мартинес, Дж. С. Байер, К. А. Камбарделла, Х. П. Коллинз, Т. Ф. Дьюси, Дж.Дж. Халворсон, В. Л. Джин, Дж. М. Ф. Джонсон, Р. Дж. Кремер, Дж. Г. Лундгрен, Д. К. Мантер, Дж. Э. Мол, Дж. Л. Смит и Д. Э. Стотт. 2015. Биология почвы для устойчивой и здоровой почвы. Журнал охраны почв и водных ресурсов 70 (1): 12a-18a. DOI: 10.2489 / jswc.70.1.12A.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

(PDF) Определение естественных изображений по активности человеческого мозга

реконструировано и затем совместно зарегистрировано для исправления различий в положении головы

в рамках сеансов сканирования и между ними.Данные временных рядов были предварительно обработаны таким образом, что

, так что курсы времени отклика, зависящие от вокселей, были деконволюционны из данных.

Вокселы были назначены визуальным областям на основе данных ретинотопного картирования.

17

столбцы

сняты в отдельных сеансах сканирования.

На этапе оценки модели в эксперименте модель рецептивного поля оценивалась в

для каждого воксела. Модель была основана на пирамиде вейвлетов Габора

11–13

(дополнительные рисунки 2 и 3) и была способна охарактеризовать отклики вокселов в

ранних визуальных областях V1, V2 и V3 (дополнительная таблица 1).Также использовались альтернативные рецептивные модели поля

, включая модель только для ретинотопии и несколько версий

с ограничениями модели вейвлет-пирамиды Габора. Подробная информация об этих моделях

и процедурах оценки моделей приведены в дополнительных методах.

На этапе идентификации изображений в эксперименте использовались оценочные модели восприимчивого поля

для идентификации изображений, просматриваемых испытуемыми, на основе

измеренной активности вокселей.Алгоритм идентификации описан в основном тексте

. Для получения подробной информации о выборе вокселей, производительности для наборов различных размеров и оценке предельного уровня шума

см. Дополнительный рисунок 4 и Дополнительные методы.

Полные методы и любые связанные ссылки доступны в онлайн-версии статьи

по адресу www.nature.com/nature.

Поступило 16.06.2007 г .; принята 17 января 2008 г.

Опубликована в Интернете 5 марта 2008 г.

1.Хейнс, Дж. Д. и Рис, Г. Предсказание ориентации невидимых стимулов на основе активности

в первичной зрительной коре головного мозга человека. Nature Neurosci. 8, 686

—

691 (2005).

2. Камитани Ю. и Тонг Ф. Расшифровка визуального и субъективного содержимого человеческого мозга

. Nature Neurosci. 8, 679

—

685 (2005).

3. Thirion, B. et al. Обратная ретинотопия: вывод визуального содержания изображений из

паттернов активации мозга.Neuroimage 33, 1104

—

1116 (2006).

4. Кокс, Д. и Савой, Р. Л. Функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) «чтение мозга

»: обнаружение и классификация распределенных паттернов активности фМРТ в зрительной коре

человека. Neuroimage 19, 261

—

270 (2003).

5. Haxby, J. V. et al. Распределенные и перекрывающиеся изображения лиц и предметов

в вентральной височной коре. Наука 293, 2425

—

2430 (2001).

6. Хейнс, Дж. Д. и Рис, Г. Расшифровка психических состояний по активности мозга у людей.

Nature Rev. Neurosci. 7, 523

—

534 (2006).

7. Хунг, К. П., Крейман, Г., Поджио, Т. и ДиКарло, Дж. Дж. Быстрое считывание идентичности объекта

из нижней височной коры макака. Наука 310, 863

—

866 (2005).

8. Цао, Д. Ю., Фрейвальд, В. А., Тутелл, Р. Б. и Ливингстон, М. С. Кортикальная область

, полностью состоящая из селективных по лицу клеток.Наука 311, 670

—

674 (2006).

9. Симончелли, Э. П. и Ольсхаузен, Б. А. Статистика естественных изображений и нейронное представление

. Анну. Rev. Neurosci. 24, 1193

—

1216 (2001).

10. Ву, М. К., Дэвид, С. В. и Галлант, Дж. Л. Полная функциональная характеристика

посредством системной идентификации. Анну. Rev. Neurosci. 29, 477

—

505

(2006).

11.Даугман, Дж. Г. Отношение неопределенности для разрешения в пространстве, пространственной частоты и ориентации

, оптимизированной двумерными визуальными кортикальными фильтрами. J. Opt. Soc. Являюсь. А

2, 1160

—

1169 (1985).

12. Джонс, Дж. П. и Палмер, Л. А. Оценка двухмерной модели простых рецептивных полей с фильтром Габора

в полосатом теле кошки. J. Neurophysiol. 58,

1233

—

1258 (1987).

13.Ли, Т.С. Представление изображений с помощью двумерных вейвлетов Габора. IEEE Trans. Pattern Anal.

18, 959

—

971 (1996).

14. DeYoe, E.A. et al. Картирование полосатых и экстрастриарных зрительных областей в коре головного мозга человека

. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 2382

—

2386 (1996).

15. Дюмулен С. О. и Ванделл Б. А. Оценки рецептивного поля населения в зрительной коре

человека. Neuroimage 39, 647

—

660 (2008).

16. Engel, S.A. et al. ФМРТ зрительной коры головного мозга человека. Nature 369, 525 (1994).

17. Хансен, К. А., Дэвид, С. В. и Галлант, Дж. Л. Параметрическая обратная корреляция показывает

пространственной линейности ретинотопного ответа человека V1 BOLD. Нейроизображение 23, 233

—

241

(2004).

18. Sereno, M. I. et al. Границы множественных зрительных зон у человека выявлены с помощью функциональной магнитно-резонансной томографии

. Наука 268, 889

—

893 (1995).

19. Смит, А. Т., Синг, К. Д., Уильямс, А. Л. и Гринли, М. В. Оценка размера

на основе данных фМРТ в полосатой и экстрастриальной зрительной коре человека. Цереб.

Cortex 11, 1182

—

1190 (2001).

20. Sasaki, Y. et al. Радиальное смещение: различный наклон чувствительности к визуальной ориентации у

человекообразных и нечеловеческих приматов. Нейрон 51, 661

—

670 (2006).

21. Ольман, К. А., Ugurbil, K., Schrater, P. & Kersten, D. BOLD fMRI и

психофизических измерений контрастного отклика на широкополосные изображения. Видение

Рез. 44, 669

—

683 (2004).

22. Сингх, К. Д., Смит, А. Т. и Гринли, М. В. Пространственно-временная частота и

направленная чувствительность областей зрения человека, измеренные с помощью фМРТ. Нейроизображение 12,

550

—

564 (2000).

23. Haynes, J. D. & Rees, G.Прогнозирование потока сознания по активности

зрительной коры головного мозга человека. Curr. Биол. 15, 1301

—

1307 (2005).

24. Хигер, Д. Дж. И Ресс, Д. Что фМРТ сообщает нам о нейронной активности? Природа

Rev. Neurosci. 3, 142

—

151 (2002).

25. Логотетис, Н. К. и Ванделл, Б. А. Интерпретация жирного сигнала. Анну. Rev. Physiol.

66, 735

—

769 (2004).

26.Стэнли, Г. Б., Ли, Ф. Ф. и Дэн, Ю. Реконструкция естественных сцен из ансамбля

ответов в латеральном коленчатом ядре. J. Neurosci. 19, 8036

—

8042 (1999).

27. Хейнс, Дж. Д., Лотто, Р. Б. и Рис, Г. Ответы зрительной коры человека на однородные поверхности

. Proc. Natl Acad. Sci. США 101, 4286

—

4291 (2004).

28. Райнер, Г., Аугат, М., Тринат, Т. и Логотетис, Н. К. Настройка немонотонного шума

сигнала BOLD фМРТ на естественные изображения в зрительной коре обезьяны

под наркозом.Curr. Биол. 11, 846

—

854 (2001).

29. Салинас, Э. и Эбботт, Л.Ф. Реконструкция вектора по скоростям стрельбы. J. Comput.

Neurosci. 1, 89

—

107 (1994).

30. Чжан, К., Гинзбург, И., Макнотон, Б. Л., Сейновски, Т. Дж. Интерпретация активности нейронов

популяций путем реконструкции: унифицированная структура с применением к

клеткам гиппокампа. J. Neurophysiol. 79, 1017

—

1044 (1998).

Дополнительная информация размещена по ссылке на онлайн-версию документа по адресу

www.nature.com/nature.

Выражение признательности Эта работа была поддержана Национальной оборонной наукой и стипендией

для выпускников инженерных специальностей (K.N.K.), Национальными институтами здравоохранения и

Калифорнийского университета, дневные фонды Беркли. Мы благодарим Б. Инглиса за помощь

в МРТ, К. Хансена за помощь в ретинотопном картировании, Д. Вудса

и X.Канга за сбор анатомических данных всего мозга и А. Рокема за

за помощь в работе со сканером. Мы также благодарим C. Baker, M. D’Esposito, R. Ivry,

A. Landau, M. Merolle и F. Theunissen за комментарии к рукописи. Наконец,

мы благодарим С. Нишимото, Р. Редферна, К. Шрайбера, Б. Уиллмора и Б. Ю за их помощь

в различных аспектах этого исследования.

Вклад авторов K.N.K. разработал и провел эксперимент и был первым

автором статьи.К.Н.К. и Т. проанализировали данные. R.J.P. предоставил

математических идей и помощь. J.L.G. предоставил руководство по всем аспектам проекта

. Все авторы обсудили результаты и оставили комментарии к рукописи.

Информация об авторе Информация о перепечатках и разрешениях доступна по адресу

www.nature.com/reprints. Переписка и запросы материалов следует направлять по номеру

на адрес J.L.G. ([email protected]).

ПРИРОДА

|

Том 452

|

20 марта 2008 г. ПИСЬМА

355

Nature

Publishing

Группа

© 2008

Ретроспективное исследование 100 пациентов с варикозным расширением вен, получавших радиочастотную абляцию и стриппинг — Servier

Ретроспективное исследование 100 пациентов с варикозным расширением вен, получавших радиочастотную абляцию и полоскание

Андриан О.Тонев,
Стоян Г. Генадиев,
Святослав Г. Димитров,
Захариев Тодор Т.,
Генчо К. Начев

Клиника сосудистой хирургии и ангиологии
«Св. Екатерина »Университетская больница
София, Болгария

РЕФЕРАТ

В последние годы методы лечения варикозного расширения вен стремительно изменились. Перевязка подкожно-бедренной кости и удаление большой подкожной вены (БПВ), которые когда-то были стандартным методом лечения БПВ-рефлюкса, подверглись сомнению, а в некоторых областях были заменены эндовенозной терапией.Мы ретроспективно проанализировали истории болезни 100 последовательных пациентов с хронической сафенофеморальной недостаточностью. В период с 2009 по 2011 год 50 пациентам была выполнена эндовенозная аблация с использованием радиочастоты с катетером ClosureFAST ™ (группа 1) и 50 пациентам было выполнено классическое удаление БПВ (группа 2). В обеих группах флебэктомии с микроразрезами варикозных вен ниже колена выполнялись одновременно с выбранной процедурой. Настоящее исследование показывает улучшенные результаты при использовании новой техники ClosureFAST ™, ведущей к хорошему закрытию вен с минимальными осложнениями и повышенным комфортом для пациента.Результаты радиочастотной облитерации рефлюкса подкожной вены были сопоставимы с таковыми при традиционном удалении и лигировании через 1 год наблюдения. Радиочастотная абляция связана с меньшим количеством осложнений, а когда они возникают, они ограничены по времени и обычно имеют незначительные последствия.

ВВЕДЕНИЕ

Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей — распространенное заболевание, которым страдают 25% женщин и 15% мужчин, причем венозный рефлюкс в области сафенофеморального соединения (SFJ) является наиболее частой причиной, приводящей к варикозному расширению вен. ¹ В последние годы методы лечения варикозного расширения вен стремительно изменились. Перевязка подкожно-бедренной кости и удаление большой подкожной вены (БПВ) когда-то были стандартным методом лечения БПВ-рефлюкса, но в последнее время она подверглась сомнению и в некоторых областях была заменена эндовенозной терапией (EVT). ^2-5 За последнее десятилетие технический прогресс позволил разработать и применить новые малоинвазивные методы лечения, такие как эндовенозная радиочастотная абляция (РЧА) с закрытием VNUS и эндолазер. ^5-7 За последние 2 года развитие технологий, связанных с использованием катетеров RFA, привело к появлению катетера ClosureFAST ™. Имеющиеся данные подтверждают использование эндовенозных методов с точки зрения сокращения послеоперационного пребывания в больнице, раннего возвращения к работе и низкого уровня осложнений. ⁸

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Мы ретроспективно проанализировали истории болезни 100 последовательных пациентов с хронической сафенофеморальной недостаточностью.В период с 2009 по 2011 год в общей сложности 50 пациентам была выполнена эндовенозная аблация с использованием РЧА с катетером ClosureFAST ™ (группа 1), а 50 пациентам — классическое удаление БПВ (группа 2). В обеих группах флебэктомии с микроразрезами варикозных вен ниже колена выполнялись одновременно с выбранной процедурой (, рисунок 1, ). Также были проанализированы контрольные визиты, проведенные через 2 недели, 3 месяца и 1 год. Все пациенты имели симптоматическое варикозное расширение вен, и критерии включения в исследование были основаны на клинической, этиологической, анатомической и патофизиологической (CEAP) классификации.В исследование были включены все пациенты с заболеванием C1-C5 (C1: сосудистые звездочки, C2: варикозное расширение вен, C3: отек голеностопного сустава, C4: липодерматосклероз и C5: зажившая язва). Исключались пациенты в стадии C6 с активными язвами и пациенты с посттромботической этиологией. Диагноз был основан на клиническом и цветном допплеровском исследовании. В исследование были включены пациенты, у которых отмечался венозный рефлюкс в длинной подкожной вене с продолжительностью не менее 0,5 секунды. Критерием исключения для РЧА был диаметр БПВ более 16 мм.

баллов по шкале клинической тяжести вен (VCSS). VCSS оценивает характерные признаки венозного заболевания по шкале тяжести от 1 до 3 (легкая, умеренная и тяжелая), а затем баллы складываются, чтобы получить максимум 30 баллов. ⁹ Характеристики заболевания: боль, варикозное расширение вен, венозный отек, пигментация, воспаление, уплотнение, усталость, судороги, компрессия и общий ответ. Мы также искали и регистрировали следующие осложнения: гиперпигментацию, тромбофлебит, парестезии подкожной вены, экхимоз, гематому, инфекцию и термическую травму.

Рисунок 1. Заключительный этап радиочастотной абляции.

Последующие клинические и допплеровские исследования были выполнены через 2 недели, 3 месяца и 12 месяцев для определения как краткосрочных, так и долгосрочных результатов, а окончательный VCSS был определен через 1 год. Были отмечены все пациенты с реканализацией закрытой вены, рецидивирующим рефлюксом или неоваскуляризацией. Всем пациентам рекомендовалось принимать веноактивный препарат (микронизированная очищенная фракция флавоноидов, MPFF *) два раза в день в течение 3 месяцев и носить компрессионные чулки не менее 1 месяца.

* Зарегистрировано как: Дафлон® 500 мг, Альвенор®, Ардиум®, Арвенум® 500, Капивен®, Детралекс®, Элатек®, Флеботропин®, Варитон®, Венитол®.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы провели ретроспективный анализ данных от 100 последовательных пациентов с несостоятельностью сафено-бедренного перехода, которым выполнялась РЧА и стриппинг. Из этих пациентов 64 (64%) были женщинами и 36 мужчинами (36%) со средним возрастом 36,4 ± 9 и 48,3 ± 12 лет соответственно. Средняя длина сегмента БПВ, обработанного РЧА, составляла 35 см (диапазон от 20 до 60 см).

Все пациенты имели венозные проблемы с симптомами, с изменениями кожи или без них. Большинство из них были в группе C2 по классификации CEAP (26 пациентов в группе 1 и 22 в группе 2), затем следовали C3 (20 пациентов в группе 1 и 18 пациентов в группе 2) и C4-C5 (4 пациента в группе 1). и 10 в группе 2) ( Рисунок 2 ). Рисунок 2 также иллюстрирует распределение пациентов через 1 год наблюдения: C0-C1 (42 пациента в группе 1 и 41 в группе 2), C2 (5 пациентов в обеих группах), C3 (2 пациента в обеих группах). ) и C4-C5 (1 пациент в группе 1 и 2 пациента в группе 2).

баллов VCSS отображены на Рисунок 3 . Наибольшее количество пациентов наблюдалось в группе средней степени тяжести (10-20) с 36 пациентами из группы 1 и 30 пациентов из группы 2, затем следовала группа тяжелой степени (20-30) с 8 пациентами из группы 1 и 16 из группы 2. , а затем мягкая группа (0-10) с 6 пациентами из группы 1 и 4 из группы 2. Оценка VCSS после лечения была проведена через 12 месяцев и показала значительно более низкие баллы: только 4 пациента из группы 1 и 8 из группы 2 находились в группа средней степени тяжести, за которой следуют 1 пациент из группы 1 и 3 пациента из группы 2 в группе легкой степени тяжести (, рисунок 3, ).

Рис. 2. Сравнение распределения клинических классов CEAP у
пациентов, перенесших либо радиочастотное (RFA), либо стриппинг
(Strip), до и через 1 год после процедуры.

Рис. 3. Сравнение баллов по шкале VCSS у пациентов, которым
подверглись либо радиочастотной (РЧА), либо стриппинге (полоска),
до и через 1 год после процедуры.

Таблица I. Распределение осложнений как в группах радиочастотной абляции
(РЧА), так и в группах стриппинга.

Осложнения, наблюдаемые через 2 недели наблюдения, показаны в Таблице I . Наиболее частыми осложнениями были парестезии подкожной вены (1 пациент из 1-й группы и 5 пациентов из 2-й группы), за которыми следовали экхимозы (1 пациент из 1-й группы и 5 пациентов из 2-й группы), гиперпигментация (2 пациента из обеих групп), тромбофлебит в дистальных отделах. варикозное расширение вен (2 пациента из 1-й группы), гематома (1 пациент из 2-й группы) и инфекция пахово-бедренной области (1 пациент из 2-й группы).Постпроцедурные допплеровские исследования показали полное закрытие вен у 100% пациентов из группы 1. Частота отсутствия рефлюкса и окклюзии вен через 1 год составила 100% в группе 1. У одного пациента из группы 2 была выявлена ​​неоваскуляризация, а у другого пациента наблюдался рефлюкс de novo. в переднебоковой вене, которая отдельно открывалась в общую бедренную вену.

Совокупная частота рецидивов варикозного расширения вен через 1 год составила 2% (1 пациент) в группе 1 и 4% (2 пациента) в группе 2.

ОБСУЖДЕНИЕ

РЧА БПВ — это вариант лечения, альтернативный удалению вен, который может привести к болезненному и длительному послеоперационному восстановлению с высокой частотой образования гематом, травм нервов и инфекций. ^10-12 В ранних исследованиях РЧА использовалась методика медленного постепенного отката катетера, что было связано с более высокой частотой образования сгустков, ранней реканализации сосудов и термического повреждения. Общий зарегистрированный успех в этих исследованиях составил 83% -100%. ^13,14 Настоящий анализ сообщает об улучшенных результатах с хорошим венозным закрытием и минимальными осложнениями при использовании новой техники ClosureFAST ™, которая преодолела ограничения предыдущих методов РЧА, а также повысила комфорт пациента.Настоящая методика не требовала использования каких-либо анальгетиков после процедуры, когда пациент был амбулаторным в тот же день, что является большим преимуществом для скорейшего выздоровления пациента. Результаты VCSS через 2 недели, 3 месяца и 1 год также показали значительное снижение баллов, что свидетельствует о превосходном симптоматическом выздоровлении с лучшими результатами в группе 1.

Повреждение нервов — одна из самых частых причин судебных тяжб после операции на варикозном расширении вен. ¹⁵ Парестезия или онемение могут возникнуть после РЧА и стриптиза, но в большинстве случаев улучшаются в течение нескольких недель. ¹⁶ Было показано, что RFA вызывает меньше боли и синяков, чем хирургическое вмешательство, а также занимает меньше времени. ¹⁷ Наше исследование показало 2% неоваскуляризации в группе 2 и отсутствие реканализации в группе 1 через 1 год наблюдения. Техника открытой хирургии была связана с частотой рецидивов 4% по сравнению с 2% в группе 1. Для сравнения, в исследовании EVOLVeS сообщалось о частоте неоваскуляризации 3% при использовании традиционной техники закрытия и 17% при удалении. ¹⁸

Реканализация вены может быть вызвана либо рефлюксом из притока, либо некомпетентным перфоратором.Точно так же, если основной просвет открыт, рефлюкс из паха из-за добавочной вены также может привести к неудаче и рецидиву. ¹⁹ Технические проблемы, такие как затрудненный доступ, проблемы с продвижением катетера или извилистый БПВ, также могут сыграть роль в неудаче процедуры или неполной окклюзии вены и в конечном итоге привести к рецидиву. ¹⁹

Тромбоз глубоких вен может развиться в глубоких венах теленка, или тромб может циркулировать из обработанных поверхностных вен после РЧА и зачистки.В нашем исследовании мы не наблюдали тромбообразования в системе глубоких вен. Тромбоз глубоких вен после эндовенозной абляции встречается крайне редко, и в большинстве серий клинических случаев и испытаний не обнаружено никаких доказательств этого. ^2,20

Все пациенты 1-й группы и 56% пациентов 2-й группы вернулись к нормальной деятельности в течение 1 дня после процедуры. Этот результат даже лучше, чем результат, наблюдаемый в исследовании EVOLVeS, ¹⁸ , в котором использовалась обычная техника закрытия и где 80% пациентов возобновили свою нормальную деятельность через 24 часа после процедуры, по сравнению с только 47% после удаления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашей серии пациентов показывают, что РЧА с использованием методики ClosureFAST ™ является безопасным и многообещающим инструментом для лечения недостаточности сафенофеморального перехода. Результаты через 1 год после облитерации рефлюкса подкожной вены с помощью РЧА были сопоставимы с таковыми при традиционном удалении и лигировании. Когда действительно возникали осложнения, они были ограничены по времени и обычно имели незначительные последствия. Существенными преимуществами РЧА перед стриптизом у этой группы пациентов были уменьшение боли, раннее возвращение к нормальной деятельности, меньшее количество выходных на работе, а также лучшие косметические результаты и показатели качества жизни.Подтверждение того, что РЧА является методом выбора, следует изучить в дальнейших рандомизированных исследованиях.

ССЫЛКИ
1. Callan MJ. Эпидемология варикозного расширения вен. Br J Surg . 1994; 81: 167-173.
2. Rasmussen LH, Lawaetz M, Bjoern L, Vennits B, Blemings A, Eklof B. Рандомизированное клиническое испытание, сравнивающее эндовенозную лазерную абляцию, радиочастотную абляцию, пенную склеротерапию и хирургическое удаление при варикозном расширении больших подкожных вен. Br J Surg . 2011; 98: 1079-1087.
3. Lane TR, Pandey VA, Davies AH. Лечение поверхностных венозных заболеваний — останется ли открытая операция в 2011 году важной? Акта Чир Бельг . 2011; 111: 125–129.
4. Чандлер Дж. Г., Пичот О., Сесса С., Шуллер-Петрович С., Кабник Л. С., Берган Дж. Дж. Лечение первичной венозной недостаточности методом эндовенозной облитерации подкожных вен. Эндоваскулярная хирургия сосудов . 2000: 34: 201-214.
5. Puggioni A, Kalra M, Carmo M, Mozes G, Gloviczki P.Эндовенозная лазерная терапия и радиочастотная абляция большой подкожной вены: анализ ранней эффективности и осложнений. J Vasc Surg . 2005; 42: 488-493.
6. Creton D, Pichot O, Sessa C, Proebstle TM; ClosureFast Europe Group. Сегментарная термическая облитерация с использованием радиочастоты, проведенная с помощью процедуры ClosureFast: результаты через 1 год. Энн Васк Сург . 2010; 24: 360-366.
7. Roth SM. Эндовенозная радиочастотная абляция поверхностных и прободных вен. Surg Clin North Am . 2007; 87: 1267-1284.
8. Анвар М.А., Лейн Т.А., Дэвис А.Х., Франклин И.Дж. Осложнения радиочастотной абляции варикозного расширения вен. Флебология . 2012; 27 (приложение 1): 34-39.
9. Васкес М.А., Ван Дж., Махатханарук М., Бучковски Г., Спрехе Е., Дослуоглу Х. Х. Применение шкалы клинической степени тяжести вен для 682 конечностей, подвергшихся радиочастотной абляции подкожной вены. J Vasc Surg . 2007; 45: 1008-1014.
10. Dietzek AM. Эндовенозная радиочастотная абляция для лечения варикозного расширения вен. Сосудистые . 2007; 15: 255-261.
11. Леопарди Д., Хогган Б.Л., Фитридж Р.А., Вудрафф П.В., Мэддерн Дж. Систематический обзор методов лечения варикозного расширения вен. Энн Васк Сург . 2009; 23: 264-276.
12. Торговец РФ. Радиочастотная абляция несостоятельной подкожной вены — извлеченные уроки. Флеболимфология . 2009; 16: 237-245.
13. Торговец РФ, Пичот О.Эндовенозная радиочастотная абляция поверхностных и прободных вен. Vasc Surg . 2005; 42: 502-509.
14. Коричневый DB. Концепции, соображения и проблемы на переднем крае радиочастотной абляции. J Vasc Interv Radiol . 2005; 16: 597-613.
15. Маркидес Г.А., Субар Д., Аль-Хаффаф Х. Судебные иски в сосудистой хирургии в Национальной службе здравоохранения Соединенного Королевства. евро J Vasc Endovasc Surg . 2008; 36: 452-457.
16. Ганди А., Фроги Ф., Шеперд А.С. и др.Исследование удовлетворенности пациентов после эндотермической абляции варикозного расширения вен. J Vasc Endovasc Surg . 2010; 44: 274-278.
17. Раутио Т., Охинмаа А., Перяля Дж. Эндовенозная облитерация по сравнению с обычной операцией по удалению при лечении первичного варикозного расширения вен: рандомизированное контролируемое исследование со сравнением затрат. J Vasc Surg . 2002; 35: 958-965.
18. Лурье Ф., Кретон Д., Элкоф Б. и др. Проспективное рандомизированное исследование эндовенозной радиочастотной облитерации (процедура закрытия) в сравнении с лигированием и стриппингом в выбранной популяции (исследование EVOLVeS). J Vas Surg . 2003; 38: 207-214.
19. Lohr J, Kulwicki A. Радиочастотная абляция: эволюция лечения. Semin Vasc Surg . 2010; 23: 90-100.
20. Proebstle TM, Alm J, Göckeritz O, et al; Европейская группа клинических исследований быстрого закрытия. Трехлетнее наблюдение в Европе за эндовенозной радиочастотной сегментарной термической абляцией большой подкожной вены с лечением варикозного расширения вен голени или без него. J Vasc Surg . 2011; 54: 146-152.
21. Rasmussen LH, Lawaetz M, Bjoern L, et al. Рандомизированное клиническое испытание, сравнивающее эндовенозную лазерную абляцию, радиочастотную абляцию, пенную склеротерапию и хирургическое удаление варикозного расширения вен большой подкожной вены. Br J Surg . 2011; 98: 1079-87.