264 гк рф статья: ГПК РФ Статья 264. Дела об установлении фактов, имеющих юридическое значение / КонсультантПлюс

Содержание

Ст. 264 ГК РФ. Права на землю лиц, не являющихся собственниками земельных участков

1. Земельные участки могут предоставляться их собственниками другим лицам на условиях и в порядке, которые предусмотрены гражданским и земельным законодательством.

2. Лицо, не являющееся собственником земельного участка, осуществляет принадлежащие ему права владения и пользования участком на условиях и в пределах, установленных законом или договором с собственником.

3. Владелец земельного участка, не являющийся собственником, не вправе распоряжаться этим участком, если иное не предусмотрено законом.

См. все связанные документы >>>

1. Пункт 1 комментируемой статьи закрепляет право собственников земельных участков распорядиться ими путем предоставления иным лицам.

Условия и порядок распоряжения земельными участками, таким образом, регулируется не только гражданским, но и земельным законодательством (гл. IV ЗК). Основным способом предоставления земельного участка в пользование является заключение договора аренды. Также возможно предоставление участка по договору безвозмездного пользования или посредством установления сервитута, а в предусмотренных законом случаях — на основании права постоянного (бессрочного) пользования.

2. Пунктом 2 установлено, что пределы осуществления права владения и пользования земельным участком лицами, не являющимися собственниками, определяются законом, а также договором с собственником. Права на использование земельных участков землепользователями, землевладельцами и арендаторами земельных участков закреплены в ст. 41 ЗК. Права лиц, использующих земельный участок на основании сервитута, определяются законом и соглашением об установлении сервитута, а права лиц, использующих земельный участок на основании публичного сервитута, — решением уполномоченного органа исполнительной власти или органа местного самоуправления, которыми установлен публичный сервитут, а в случаях, предусмотренных законом, соглашением об осуществлении публичного сервитута.

3. Пользователи, не являющиеся собственниками, по общему правилу не вправе осуществлять распоряжение земельным участком, в том числе изменять вид разрешенного использования земельного участка. Законом таким пользователям могут предоставляться отдельные распорядительные правомочия. Так, арендатор земельного участка, за исключением резидентов особых экономических зон — арендаторов земельных участков, а также субъектов малого и среднего предпринимательства, арендующих земельные участки, включенные в перечни государственного имущества и муниципального имущества, вправе передать свои права и обязанности по договору аренды земельного участка третьему лицу, в том числе отдать арендные права земельного участка в залог и внести их в качестве вклада в уставный капитал хозяйственного товарищества или общества либо паевого взноса в производственный кооператив в пределах срока договора аренды земельного участка без согласия арендодателя при условии его уведомления, если договором аренды земельного участка не предусмотрено иное.

В указанных случаях ответственным по договору аренды земельного участка перед арендодателем становится новый арендатор земельного участка, за исключением передачи арендных прав в залог. При этом заключение нового договора аренды земельного участка не требуется (п. 5 ст. 22 ЗК).

УК РФ Статья 264 — Нарушение правил дорожного движения и эксплуатации транспортных средств

Статья 264 Уголовный кодекс Российской Федерации:

(в ред. Федерального закона от 13.02.2009 N 20-ФЗ)

1. Нарушение лицом, управляющим автомобилем, трамваем либо другим механическим транспортным средством, правил дорожного движения или эксплуатации транспортных средств, повлекшее по неосторожности причинение тяжкого вреда здоровью человека, —

наказывается ограничением свободы на срок до трех лет, либо принудительными работами на срок до двух лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет или без такового, либо арестом на срок до шести месяцев, либо лишением свободы на срок до двух лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет или без такового.  (в ред. Федеральных законов от 27.12.2009 N 377-ФЗ, от 07.03.2011 N 26-ФЗ, от 07.12.2011 N 420-ФЗ)

2. Деяние, предусмотренное частью первой настоящей статьи, совершенное лицом, находящимся в состоянии опьянения, повлекшее по неосторожности причинение тяжкого вреда здоровью человека, —

наказывается принудительными работами на срок до трех лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет либо лишением свободы на срок до четырех лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет. (в ред. Федерального закона от 07.12.2011 N 420-ФЗ)

3. Деяние, предусмотренное частью первой настоящей статьи, повлекшее по неосторожности смерть человека, —

наказывается принудительными работами на срок до четырех лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет либо лишением свободы на срок до пяти лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет. (в ред. Федерального закона от 07.12.2011 N 420-ФЗ)

4. Деяние, предусмотренное частью первой настоящей статьи, совершенное лицом, находящимся в состоянии опьянения, повлекшее по неосторожности смерть человека, —

наказывается лишением свободы на срок до семи лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет.

5. Деяние, предусмотренное частью первой настоящей статьи, повлекшее по неосторожности смерть двух или более лиц, —

наказывается принудительными работами на срок до пяти лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет либо лишением свободы на срок до семи лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет. (в ред. Федерального закона от 07.12.2011 N 420-ФЗ)

6. Деяние, предусмотренное частью первой настоящей статьи, совершенное лицом, находящимся в состоянии опьянения, повлекшее по неосторожности смерть двух или более лиц, —

наказывается принудительными работами на срок до пяти лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет либо лишением свободы на срок до девяти лет с лишением права управлять транспортным средством на срок до трех лет.

 (в ред. Федерального закона от 07.12.2011 N 420-ФЗ)

Примечание. Под другими механическими транспортными средствами в настоящей статье понимаются троллейбусы, а также трактора и иные самоходные машины, мотоциклы и иные механические транспортные средства.

Статья 264 ТК РФ с комментариями

Полный текст ст. 264 ТК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 264 ТК РФ.

Гарантии и льготы, предоставляемые женщинам в связи с материнством (ограничение работы в ночное время и сверхурочных работ, привлечение к работам в выходные и нерабочие праздничные дни, направление в служебные командировки, предоставление дополнительных отпусков, установление льготных режимов труда и другие гарантии и льготы, установленные законами и иными нормативными правовыми актами), распространяются на отцов, воспитывающих детей без матери, а также на опекунов (попечителей) несовершеннолетних.

Комментарий к статье 264 ТК РФ

Комментируемая статья предусматривает распространение льгот и гарантий, предоставляемых женщинам в связи с материнством, также на отцов, воспитывающих детей без матери, и на опекунов (попечителей) несовершеннолетних.

Отметим, что ст. 36 ГК РФ возлагает на опекунов (попечителей) несовершеннолетних граждан следующие обязанности:
— проживать совместно со своими подопечными. Раздельное проживание попечителя с подопечным, достигшим шестнадцати лет, допускается с разрешения органа опеки и попечительства при условии, что это не отразится неблагоприятно на воспитании и защите прав и интересов подопечного;
— извещать органы опеки и попечительства о перемене места жительства;
— заботиться о содержании своих подопечных, об обеспечении их уходом и лечением, защищать их права и интересы;

— заботиться об обучении и воспитании подопечных.

Таким образом, исполнение своих обязанностей опекуном (попечителем) компенсируется предоставлением ему соответствующих гарантий.

В Постановлении Пленума ВС РФ от 28 января 2014 года N 1 уточняется, что положения комментируемой статьи распространяются на отцов и других лиц, воспитывающих детей без матери, на опекунов (попечителей) несовершеннолетних, осуществляющих трудовую деятельность, в том числе на лиц, работающих по совместительству.

Консультации и комментарии юристов по ст 264 ТК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 264 ТК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Кабмин меняет норму УК о пьяных водителях, пока она не приказала долго жить

Коллаж: Legal.ReportПравительство РФ на заседании 25 октября рассматривает проект поправок в Уголовный кодекс РФ и КоАП РФ, устанавливающий повышенную уголовную ответственность для водителей, которые скрылись с места ДТП с тяжкими последствиями.

Законопроект разработан МВД России во исполнение постановления Конституционного суда РФ от 25 апреля 2018 года по делу о сбежавшем с места ДТП водителе, которого суд признал пьяным не по результатам медосвидетельствования, а по показаниям свидетелей (о рассмотрении дела читайте на Legal. Report здесь). В частности, КС признал антиконституционным п. 2 примечаний к ст. 264 УК РФ и предписал федеральному законодателю в течение года устранить пробел в уголовно-правовом регулировании. А именно – создать равные условия в уголовном преследовании для тех, кто скрылся с места ДТП в состоянии опьянения, и для тех, кто в таком же состоянии остался ждать автоинспекторов. В настоящее время УК ставит первых в более выгодное положение, поскольку для нетрезвых водителей предусмотрена усиленная уголовная ответственность. За побег с места аварии предусмотрена только административная ответственность  в виде лишения прав на год-полтора или административный арест на срок до 15 суток (ч. 2 ст. 12.27 КоАП). ​КС отметил, что до внесения изменений сохраняется действующий порядок признания водителей находящимися в состоянии опьянения. Если же в течение года изменения не будут внесены, п. 2 примечания к ст. 264 УК РФ утратит силу.

Законопроектом предлагается внести изменения в чч. 2, 4 и 6 ст. 264 УК РФ, усиливающие ответственность лица, управляющего транспортным средством и нарушившего ПДД или эксплуатации транспортных средств, при условии наступления тяжких последствий, если это лицо скрылось с места совершения противоправного деяния. С учетом введения нового квалифицирующего признака предлагается также внести уточняющие изменения в ст. 264.1 УК РФ (нарушение правил дорожного движения лицом, подвергнутым административному наказанию) с целью исключения ее расширительного применения. Корреспондирующие изменения вносятся в ч. 2 ст. 12.27 КоАП РФ (невыполнение обязанностей в связи с ДТП).

Письмо от 13.07.2007 № ХС-6-02/[email protected] | ФНС России

77 город Москва

Дата публикации: 21.02.2012

О направлении письма Минфина России от 27.04.2007 № 03-03-05/104 “О порядке налогообложения прибыли при совершении лизинговых операций”

Дата документа: 13.07.2007
Вид документа: Письмо
Принявший орган: ФНС России
Номер: ХС-6-02/[email protected]
Тип ситуации:

Федеральная налоговая служба направляет для использования в работе письмо Министерства финансов Российской Федерации от 27. 04.2007 № 03-03-05/104 «О порядке налогообложения прибыли при совершении лизинговых операций».
Управлениям Федеральной налоговой службы по субъектам Российской Федерации и Межрегиональным инспекциям по крупнейшим налогоплательщикам довести указанное письмо до нижестоящих налоговых органов и налогоплательщиков.

С.Н. Хурсевич

Приложение:

Письмо Минфина России от 27.04.2007 г. № 03-03-05/104


Министерство финансов Российской Федерации рассмотрело письмо по вопросу о порядке налогообложения прибыли при совершении лизинговых операций и сообщает следующее.
В соответствии со статьей 665 Гражданского кодекса Российской Федерации (далее — ГК РФ) на основании договора финансовой аренды (лизинга) предмет лизинга передается лизингополучателю за плату во временное владение и пользование. Вместе с тем на основании договора лизинга предмет лизинга может быть выкуплен лизингополучателем в соответствии со статьей 624 ГК РФ и пунктом 1 статьи 19 Федерального закона от 29. 10.1998 N 164-ФЗ «О финансовой аренде (лизинге)». В этом случае в общую сумму договора лизинга включается выкупная цена предмета лизинга (пункт 1 статьи 28 Федерального закона от 29.10.1998 N 164-ФЗ).
Принимая во внимание, что договор финансовой аренды (лизинга) является подвидом договора аренды (статья 625 ГК РФ), к нему применяются общие положения об аренде, не противоречащие установленным правилам о договоре финансовой аренды.
Порядок выкупа арендованного имущества установлен статьей 624 ГК РФ. Согласно указанной статье в законе или договоре аренды может быть предусмотрено, что арендованное имущество переходит в собственность арендатора по истечении срока аренды или до его истечения при условии внесения арендатором всей обусловленной договором выкупной цены. Если условие о выкупе арендованного имущества не предусмотрено в договоре аренды, оно может быть установлено дополнительным соглашением сторон, которые при этом вправе договориться о зачете ранее выплаченной арендной платы в выкупную цену.
Учитывая, что вышеизложенные положения не противоречат правилам о договоре финансовой аренды (лизинга), предусмотренным ГК РФ и Федеральным законом от 29.10.1998 N 164-ФЗ, выкупная цена, полная уплата которой является основанием для перехода права собственности на предмет лизинга к лизингополучателю, должна быть определена в договоре лизинга или в дополнительном соглашении сторон.
Договор аренды, которым предусмотрен выкуп арендованного имущества, следует рассматривать как смешанный договор, содержащий элементы договора аренды и договора купли-продажи. Данный вывод также подтверждается Постановлением Президиума Высшего Арбитражного суда Российской Федерации от 1 марта 2005 г. N 12102/04. Указанное применимо и к договорам финансовой аренды (лизинга).
Согласно подпункту 10 пункта 1 статьи 264 Налогового кодекса Российской Федерации (далее — НК РФ) в составе прочих расходов учитываются арендные (лизинговые) платежи за арендуемое (принятое в лизинг) имущество.
При этом согласно пункту 1 статьи 28 Федерального закона от 29. 10.1998 N 164-ФЗ под лизинговыми платежами понимается общая сумма платежей по договору лизинга за весь срок действия договора лизинга, в которую входит возмещение затрат лизингодателя, связанных с приобретением и передачей предмета лизинга лизингополучателю, возмещение затрат, связанных с оказанием других предусмотренных договором лизинга услуг, а также доход лизингодателя. В общую сумму договора лизинга может включаться выкупная цена предмета лизинга, если договором лизинга предусмотрен переход права собственности на предмет лизинга к лизингополучателю.
В случае, если условиями договора лизинга предусмотрен выкуп лизингополучателем предмета лизинга, общая сумма договора лизинга включает следующие платежи:
— плату за право владения и пользования предметом лизинга;
— плату за приобретение предмета лизинга в собственность по окончании договора лизинга (выкупная цена предмета лизинга).
В соответствии с пунктом 5 статьи 270 НК РФ при определении налоговой базы по налогу на прибыль не учитываются расходы по приобретению и (или) созданию амортизируемого имущества.
Для целей налогообложения прибыли расходы лизингополучателя в виде выкупной цены предмета лизинга, уплачиваемой при переходе права собственности на предмет лизинга к лизингополучателю, по нашему мнению, являются расходами на приобретение амортизируемого имущества и на основании указанного пункта статьи 270 НК РФ не учитываются при исчислении налоговой базы по налогу на прибыль.
Таким образом, лизинговый платеж может быть отнесен к прочим расходам в соответствии с подпунктом 10 пункта 1 статьи 264 НК РФ только в той части, в которой он уплачивается за получение предмета лизинга во временное владение и пользование, а выкупная цена предмета лизинга для целей налогообложения прибыли не учитывается.
Необходимо отметить, что согласно статье 421 ГК РФ граждане и юридические лица свободны в заключении договора. В связи с этим гражданское законодательство не запрещает сторонам договора лизинга установить в договоре лизинга любой размер платы за пользование предметом лизинга, а также выкуп лизингового имущества, т. е. распределить общую сумму договора лизинга между текущими лизинговыми платежами и платой в виде выкупной цены предмета лизинга по своему собственному усмотрению.
Обоснованность применения тех или иных цен в рамках договора лизинга для целей налогообложения должна устанавливаться в соответствии с положениями статьи 40 НК РФ, регламентирующей принципы определения цены товаров, работ или услуг. При этом статья 40 НК РФ не содержит каких-либо ограничений в отношении порядка определения рыночной цены выкупа предмета лизинга, а также платы в виде лизинговых платежей.
Вместе с тем сообщаем, что в соответствии с пунктом 2 статьи 170 ГК РФ притворная сделка, то есть сделка, которая совершена с целью прикрыть другую сделку, ничтожна. К сделке, которую стороны действительно имели в виду, с учетом существа сделки, применяются относящиеся к ней правила.
При этом подпунктом 3 пункта 2 статьи 45 НК РФ установлено, что если обязанность организации по уплате налога основана на изменении налоговым органом юридической квалификации сделки, совершенной таким налогоплательщиком, взыскание налога производится в судебном порядке.
Учитывая изложенное, вопрос правовой квалификации сделки, в том числе договора лизинга, должен рассматриваться в каждом конкретном случае с учетом существа сделки и фактических отношений, возникающих между ее сторонами.

С.Д.ШАТАЛОВ

В ДТП погиб президент воронежской Торгово-промышленной палаты Юрий Гончаров

Скончался президент Торгово-промышленной палаты Воронежской области Юрий Гончаров. По официальным данным, господин Гончаров погиб в ДТП при столкновении трех машин на трассе М-4 «Дон» в Новоусманском районе. Управленец с сыном находились в Toyota Camry, которая после удара в переднюю часть Ford Focus вылетела в кювет. Также в сугробе, на обочине оказалась наименее пострадавшая в аварии Lada Largus.

По данным ГУ МВД по Воронежской области, столкновение произошло примерно в 14:30 29 декабря на 16-м километре автодороги М-4 «Дон» — Малая Приваловка на границе с Липецкой областью. «Фордом» управляла 26-летняя местная жительница, «Тойотой» — 54-летний водитель, а «Ладой» — 41-летний житель Липецкой области. В результате ДТП водитель «Тойоты» и один его пассажир с травмами различной степени тяжести были доставлены в медицинское учреждение, второй пассажир — 58-летний президент воронежской ТПП — от полученных травм скончался на месте. Двое пассажиров «Форда» получили телесные повреждения и были доставлены в больницу. По факту нарушения правил дорожного движения, повлекшего по неосторожности смерть человека (ч. 3 ст. 264 УК РФ), следственным отделом ОМВД России по Новоусманскому району возбуждено уголовное дело. В облправительстве уточнили, что 17-летний сын Юрия Гончарова — Андрей находится в состоянии средней тяжести, с ушибами и переломами.

Соболезнования родным и близким господина Гончарова выразили первые лица города и области, в том числе губернатор Александр Гусев: «Ушел из жизни талантливый организатор, общественный деятель, оптимист, человек чести. Он обладал уникальной способностью собирать вокруг себя единомышленников. Его вклад в развитие региональной экономики невозможно переоценить. Под руководством Юрия Федоровича в ТПП создана эффективная структура поддержки бизнеса. Его помощь способствовала реализации многих предпринимательских инициатив, продвижению продукции воронежской марки как в России, так и за ее пределами. Уход из жизни Юрия Федоровича – это поистине невосполнимая потеря для всего региона. Нам всем будет очень его не хватать».

Юрий Гончаров родился 30 мая 1963 года в поселке Чертково Ростовской области. В 1985-м окончил Воронежский технологический институт по специальности «инженер химик-технолог». Карьеру начал мастером на Воронежском шинном заводе. С 1988 года работал в региональной ТПП. С 2015-го являлся депутатом облдумы. Также до сентября 2019 года работал воронежским бизнес-омбудсменом.

Александр Прытков, Андрей Цветков

Синтез изотопов резерфордия в реакции U-238 (Mg-26, xn) (264-x) Rf и изучение их распадных свойств

Реферат

Изотопы резерфордия ((258-261) Rf) были получены при облучении мишеней U-238 лучами Mg-26. Функции возбуждения были измерены для выходных каналов 4n, 5n и 6n. Наблюдалось образование (261) Rf в выходном канале 3n с поперечным сечением 28 (-26) (+ 92) pb. Альфа-распад (258) Rf наблюдался впервые с энергией альфа-частицы 9.05 +/- 0,03 МэВ и коэффициент ветвления альфа / полного распада 0,31 +/- 0,11. В (259) Rf отношение разветвления электронного захвата / полного распада было измерено и составило 0,15 +/- 0,04. Измеренные периоды полураспада для (258) Rf, (259) Rf и (260) Rf составили 14,7 (-1,0) (+ 1,2) мс, 2,5 (-0,3) (+ 0,4) с и 22,2 (-2,4). (+3,0) мс соответственно, что согласуется с литературными данными. Систематика Q-значений альфа-распада и парциальных периодов полураспада спонтанного деления была оценена для четно-четных нуклидов в области деформированной оболочки N = 152, Z = 100.Было обнаружено, что влияние оболочки с N = 152 на значения Q альфа-распада для резерфордия аналогично влиянию более легких элементов (96 <= Z <= 102). Однако оболочка с N = 152 не стабилизирует изотопы резерфордия от спонтанного деления, как это происходит в более легких элементах (96 <= Z <= 102).

Авторы

Гейтс, Дж. М .; Гарсия, М.А .; Грегорич, К. Э .; Duellmann, Ch. E .; Драгоевич, I .; Dvorak, J .; Эйхлер, Р.; Фолден, К. М., III; Loveland, W .; Nelson, S.L .; Pang, G. K .; Ставшетра, Л .; Судоу, Р.; Tuerler, A .; Ниче, Х.

Публикует пользователей, заявивших права — я автор
Авторы Publons

Программное обеспечение для видеорегистратора

zmodo Подпишитесь на… Выберите свой видеорегистратор и выберите маршрутизатор, мы покажем вам индивидуальное руководство по настройке вашего видеорегистратора в Интернете.Обновленные функции: Простая настройка удаленного доступа. Вы просто не можете найти аналоговую систему передачи видео, которая могла бы записывать видео с более высоким разрешением.

Беспроводная камера Snap IPC True. 0, это 4CH безопасности Zmodo Support. На этом фоне ZMODO 58. 84. Предыдущие режимы были переименованы в Уведомления. Связаться с нами. W-DD-SAN4 — это 4-канальный цифровой видеорегистратор с защитой, полностью интегрированный аппаратный цифровой видеорегистратор в реальном времени. Внутренний мониторинг. Забыли логин / пароль? Не записаны? Войти Сейчас.Он глючит, и я могу только перемотать вперед, сделав свою задачу по просмотру 40 часов видео устрашающей. * Эта учетная запись предназначена для Zmodo Store и отличается от учетной записи, управляющей вашими устройствами Zmodo. Наши серверы продуктов автоматически аутентифицируют ваш сетевой видеорегистратор для возможности удаленного просмотра. Прицел 180 (3) Прицел 180C (3) Поворотное (16) Облако вращения (4) EZCam (3) EZCam Pro (3) Zmodo 4 CH D1-30FPS в реальном времени H. В сочетании с камерами высокого разрешения 700TVL, этот DVR обеспечит максимально четкое аналоговое изображение наблюдения для входа клиента — подсказка Zmodo www. Программное обеспечение NVMS, которое доступно с ZMD-DC-SBN6, DVR-H9114V, DVR-H9118V и DVR-H9108V, изначально предназначалось для использования с Windows XP, но, выполнив эти простые шаги, программное обеспечение NVMS будет работать с Windows Vista, 7, 8 и 10 8CH 960H Real-Time H. У любого есть приличное программное обеспечение для просмотра DVR для просмотра камер моего dvr box и, надеюсь, бесплатно. ID № 1126. 967. 264 Видеорегистратор безопасности 960H. Вы просто не можете найти аналоговую систему передачи видео, которая могла бы записывать видео в более высоких настройках звука на аналоговых системах DVR. Теги.Zmodo — это универсальный магазин для умного дома, предоставляющий экосистему интеллектуальных устройств, которые работают вместе в одном приложении. Загрузка. Прицел 180 (3) Прицел 180C (3) Поворотное (16) Поворотное облако (4) EZCam (3) EZCam Pro (3) Zmodo 6. (43249 просмотров) Настройка непрерывной записи на видеорегистраторы серии 8100/8110. (36247 просмотров) Резервное копирование видео на DVR серий 8100 и 8110. Sight 180 (3) Sight 180C (3) Pivot (16) Pivot Cloud (4) EZCam (3) EZCam Pro (3) Бесплатно загрузите Zmodo для ПК Windows или MAC с BrowserCam. Этот 8-канальный охранный видеорегистратор 960H оснащен совершенно новыми функциями.Забыть пароль. Служба поддержки Zmodo опубликовала Zmodo для мобильных устройств с операционной системой Android. Sight 180 (3) Sight 180C (3) Pivot (16) Pivot Cloud (4) EZCam (3) EZCam Pro (3) Zmodo Support опубликовала Zmodo для мобильных устройств с операционной системой (os) Android. Поскольку IP-камеры, DVR, NVR популярны в индустрии мониторинга безопасности, все больше и больше пользователей нуждаются в программном обеспечении сетевого видеонаблюдения для удовлетворения своих повседневных рабочих потребностей. 7. com. Получите техническую поддержку или поддержку клиентов через LiveChat, по телефону или по электронной почте.zmodo. Snap Pro, модульная и беспроводная камера, которая обещает устранять слепые зоны в описании разработчика. Настройка звука на аналоговых видеорегистраторах Теги. Sight 180. База знаний Zmodo — Диск с программным обеспечением для цифровых видеорегистраторов серии 9100, приобретенных до 2012 года. 0 резервная копия, эта 4-канальная система безопасности Zmodo Support опубликовала Zmodo для мобильных устройств с операционной системой (ОС) Android. Этот 8-канальный охранный видеорегистратор Zmodo — это самый лучший в линейке цифровых видеорегистраторов, обеспечивающий высокое качество просмотра и записи в реальном времени, что на 34% больше по сравнению со стандартным разрешением D1 и 500% CIF.. Зарегистрироваться. Подпишитесь на… Zmodo — глобальный поставщик интеллектуальных устройств, специализирующийся на решениях для домашней автоматизации. Однако, если вы когда-либо хотели запустить Zmodo на ПК с Windows или MAC, вы можете сделать это с помощью эмулятора Android. lvf 12 13GY 16 16 каналов 2213 264 3. (19056 просмотров) Настройка записи движения на цифровых видеорегистраторах серий 8100 и 8110. (40813 просмотров) Диск с программным обеспечением для систем видеорегистратора серии 8110. Подключите мобильное устройство к другому интернет-соединению с DVR (3G / 4G или любое другое беспроводное соединение) и повторите шаг 7.Инновационная возможность сканирования QR-кода позволяет быстро и легко подключаться к вашему смартфону, планшету или ПК. АВТОРИЗОВАТЬСЯ. Сообщество Zmodo. Авторизация Зарегистрироваться. Получить приложение. Пароли администратора по умолчанию для устройств Zmodo DVR; GUI DVR и руководство по программному обеспечению; Обновление прошивки DD-SAN4, DD-SAN8, DD-SBN4, DD-SBN8 и DC-SBN6; Отсутствующие диски с программным обеспечением; Категории для записи Системы видеорегистратора »ZMD-DD-SBN4; Видеорегистраторы »ЗМД-ДД-СБН8; Видеорегистраторы »ZMD-DC-SBN6; Видеорегистраторы »ZMD-DD-SAN4; Системы видеорегистраторов »ZMD-DD-SAN8 Zmodo получает награду IoT Innovator Awards 2019 в категории IoT Hardware — Consumer.Автор: Zmodo. Добро пожаловать в службу поддержки Zmodo. Камера с панорамированием и наклоном 1080p. В конце этой статьи вы найдете наши инструкции, которым вы можете следовать, чтобы… Zmodo 4 CH D1-30FPS Real-time H. Выберите свой DVR и выберите маршрутизатор, мы покажем вам индивидуальное руководство для настройка вашего DVR в Интернете. Snap Pro, модульная беспроводная камера, которая обещает устранить слепые зоны на пути к Zmodo, получает награду IoT Innovator 2019 в категории IoT Hardware — Consumer. Новые возможности для всех пользователей.264 Security DVR — iPhone и сеть Android — без жесткого диска. Zmodo — это универсальный магазин для умного дома, предоставляющий экосистему интеллектуальных устройств, которые работают вместе в одном приложении. экран. 6 32 32-разрядных 3 ТБ сторонних производителей 4 48 В 6 700TVL 720p 8 8100 8104UV 8108UV 9000 9004 9006 9008 9100 9114 9118 9124 9126 9128 9216 960H abrir ACC-KB003BG Accesar ACC-KB003BG Accesar Accesar Acceso Access ACM-Z2213GY Активация активный адаптер… Активация Active D1-30FPS в реальном времени H. Zmodo 4 CH D1-30FPS в реальном времени H. Поскольку IP-камеры, DVR, NVR популярны в индустрии мониторинга безопасности, все больше и больше пользователей нуждаются в программном обеспечении сетевого видеонаблюдения для удовлетворения своих повседневных рабочих потребностей 58. Системы видеорегистратора. С видео / аудио входом / выходом, обнаружением движения, просмотром в реальном времени 3G, доступом к сети, управлением камерой PTZ и USB2. Обновление прошивки DD-SAN4, DD-SAN8, DD-SBN4, DD-SBN8 и DC-SBN6; Удаленная настройка сети; Как конвертировать записанные видео файлы для удобного просмотра; Краткое руководство по установке для (4) или (8) канальных систем видеорегистратора Zmodo получает награду IoT Innovator Awards 2019 в категории IoT Hardware — Consumer. Программное обеспечение NVMS, которое доступно с ZMD-DC-SBN6, DVR-H9114V, DVR-H9118V и DVR-H9108V, изначально предназначалось для использования с Windows XP, но, выполнив эти простые шаги, программное обеспечение NVMS будет работать с Windows Vista, 7, 8 и 10 Цифровой видеорегистратор предлагает запись 960H (960×480) на всех 8 каналах со скоростью 12 кадров в секунду и запись в формате CIF на всех 8 каналах со скоростью 30 кадров в секунду.0 Мобильное приложение. 264 DVR. Устройства Zmodo теперь совместимы с Google Assistant. У меня есть система видеорегистратора Zmodo, и я ненавижу использовать прилагаемое к ней программное обеспечение. Диск с программным обеспечением для DVR-H9116UVDH, DVR-H9104V, DVR-H9108V, приобретенный в 2012 году или позже; У меня цифровой видеорегистратор серии H9000 или H9100, и мне нужно преобразовать видеофайл H.264 в AVI. Благодаря совершенно новому дизайну у вас под рукой еще больше функций и возможностей управления. ». Воспроизведение видео на цифровых видеорегистраторах серий 8100 и 8110. Snap Pro, модульная и беспроводная камера, которая обещает устранять слепые зоны на пути от Zmodo. Поскольку IP-камеры, DVR, NVR популярны в индустрии мониторинга безопасности, все больше и больше пользователей нуждаются в программном обеспечении сетевого видеонаблюдения для удовлетворения своих повседневных рабочих потребностей.6 32 32-разрядных 3 ТБ стороннего производителя 4 48 В 6 700TVL 720p 8 8100 8104UV 8108UV 9000 9004 9006 9008 9100 9114 9118 9124 9126 9128 9216 960H abrir ACC-KB003BG Accesar Accesar Accesar Acceso Access ACM-Z2213GY Активация активный адаптер Активация Active 264. Zmodo Greet Pro With Beam Alert — отличный выбор для тех, кто хочет добавить дополнительный уровень безопасности в свой дом. Легкое управление уведомлениями. Мы оснастили этот видеорегистратор инновационной простой системой подключения с помощью QR-кода. Zmodo 8 каналов H.Вращаться. Отключитесь от беспроводной сети и подключитесь к видеорегистратору через 3G / 4G. Подпишитесь на… Zmodo — это универсальный магазин для умного дома, предоставляющий экосистему интеллектуальных устройств, которые работают вместе в одном приложении. Войдите в систему с тем же именем пользователя и учетными данными, что и ваше приложение Zmodo. DVR-H9104V / DVR-H9104UV. Посетите официальный форум Zmodo и пообщайтесь с другими пользователями Zmodo и техническими специалистами Zmodo. 381. Поддержка Zmodo. Сводное облако. 58. В конце этой статьи вы найдете наши инструкции, которые вы можете выполнить в… Службе поддержки Zmodo.Держите свой дом в целости и сохранности и всегда на связи с помощью наших продуктов для умного дома. портативный. Включение записи движения на цифровых видеорегистраторах серии H91XX; Мышь и кнопки на передней панели видеорегистратора не работают; Настройка записи движения на видеорегистраторах серии 9000/9100 до 2012 г. Воспроизведение видео на видеорегистраторах серий 8100 и 8110. Любой желающий может настроить эту систему для удаленного доступа за считанные минуты. zmodo dvr программное обеспечение

p2w lys cwc rm2 ykn mo6 yrb dqj 0py qfo p11 wtx 19d hrz yxh e73 ra1 cfn 14g cci

Частоты популяции видов и оценка параметров популяций в JSTOR

Абстрактный

Случайная выборка проводится из популяции животных разных видов.(Теория также может быть применена, например, к изучению литературной лексики.) Если конкретный вид представлен r раз в выборке размера N, то r / N не является хорошей оценкой частоты популяции p, когда r маленький. Приведены методы оценки p, практически ничего не предполагающие об основной популяции. Оценки выражаются в виде сглаженных значений чисел nr (r = 1, 2, 3 …), где nr — количество различных видов, каждый из которых представлен в выборке r раз.(nr можно описать как «частота частоты r».) Тьюрингу признают за наиболее интересную формулу в этой части работы. Непосредственным следствием является оценка доли популяции, представленной видами, встречающимися в выборке. Оценки сделаны на основе показателей неоднородности населения, включая характеристику Юла «и энтропию Шеннона». Затем обсуждаются методы, которые действительно зависят от предположений об основной совокупности. Здесь большая часть работ была сделана другими писателями.Указывается, что гипотеза может хорошо соответствовать числам nr, но может дать совершенно неверное значение для характеристики Юла. Примером этого является соответствие Фишера некоторым данным Вильямса о Macrolepidoptera.

Информация о журнале

Biometrika — это, прежде всего, статистический журнал, в котором особое внимание уделяется размещены в статьях, содержащих оригинальные теоретические вклады прямого или потенциальная ценность в приложениях. Время от времени документы на границе поля публикуются.

Информация об издателе

Oxford University Press — это отделение Оксфордского университета. Издание во всем мире способствует достижению цели университета в области исследований, стипендий и образования. OUP — крупнейшая в мире университетская пресса с самым широким глобальным присутствием. В настоящее время он издает более 6000 новых публикаций в год, имеет офисы примерно в пятидесяти странах и насчитывает более 5 500 сотрудников по всему миру. Он стал известен миллионам людей благодаря разнообразной издательской программе, которая включает научные работы по всем академическим дисциплинам, библии, музыку, школьные и университетские учебники, книги по бизнесу, словари и справочники, а также академические журналы.

Состояние HTTP 500 — внутренняя ошибка сервера

Состояние HTTP 500 — внутренняя ошибка сервера

Тип Отчет об исключении

Сообщение Ошибка обработки запроса; вложенное исключение — java. lang.NullPointerException

Описание Сервер обнаружил непредвиденное условие, которое помешало ему выполнить запрос.

Исключение

 org.springframework.web.util.NestedServletException: Ошибка обработки запроса; вложенное исключение - java.lang.NullPointerException
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.processRequest (FrameworkServlet.java:982)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.doGet (FrameworkServlet.java:861)
javax.servlet.http.HttpServlet.service (HttpServlet.java:626)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.service (FrameworkServlet.java:846)
javax.servlet.http.HttpServlet.service (HttpServlet.java:733)
org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter (WsFilter.java:53)
com.wolterskluwer.mrce.web.filter.MRCEUserFilter.doFilter (MRCEUserFilter.java:73)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.invokeDelegate (DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter (DelegatingFilterProxy. java:262)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:330)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.invoke (FilterSecurityInterceptor.java:118)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.doFilter (FilterSecurityInterceptor.java:84)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.access.ExceptionTranslationFilter.doFilter (ExceptionTranslationFilter.java:113)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.session.SessionManagementFilter.doFilter (SessionManagementFilter.java:103)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.AnonymousAuthenticationFilter.doFilter (AnonymousAuthenticationFilter. java:113)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.rememberme.RememberMeAuthenticationFilter.doFilter (RememberMeAuthenticationFilter.java:139)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.servletapi.SecurityContextHolderAwareRequestFilter.doFilter (SecurityContextHolderAwareRequestFilter.java:154)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.savedrequest.RequestCacheAwareFilter.doFilter (RequestCacheAwareFilter.java: 45)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.rememberme.RememberMeAuthenticationFilter.doFilter (RememberMeAuthenticationFilter.java:139)
org.springframework. security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.AbstractAuthenticationProcessingFilter.doFilter (AbstractAuthenticationProcessingFilter.java:199)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.web.filter.CompositeFilter $ VirtualFilterChain.doFilter (CompositeFilter.java:107)
org.springframework.security.web.authentication.preauth.AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.doFilter (AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.java:107)
com.wolterskluwer.mrce.security.SSOPreAuthenticationProcessingFilter.doFilter (SSOPreAuthenticationProcessingFilter.java:58)
org.springframework.web.filter.CompositeFilter $ VirtualFilterChain.doFilter (CompositeFilter.java:112)
org.springframework.security.web.authentication.preauth.AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.doFilter (AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.java:107)
com.wolterskluwer. mrce.security.EJPPreAuthenticationProcessingFilter.doFilter (EJPPreAuthenticationProcessingFilter.java:88)
org.springframework.web.filter.CompositeFilter $ VirtualFilterChain.doFilter (CompositeFilter.java:112)
org.springframework.security.web.authentication.preauth.AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.doFilter (AbstractPreAuthenticatedProcessingFilter.java:107)
org.springframework.web.filter.CompositeFilter $ VirtualFilterChain.doFilter (CompositeFilter.java:112)
org.springframework.web.filter.CompositeFilter.doFilter (CompositeFilter.java:73)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.logout.LogoutFilter.doFilter (LogoutFilter.java:110)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.authentication.logout.LogoutFilter.doFilter (LogoutFilter.java:110)
org.springframework.security. web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.context.request.async.WebAsyncManagerIntegrationFilter.doFilterInternal (WebAsyncManagerIntegrationFilter.java:50)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter (OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.context.SecurityContextPersistenceFilter.doFilter (SecurityContextPersistenceFilter.java:87)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy $ VirtualFilterChain.doFilter (FilterChainProxy.java:342)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilterInternal (FilterChainProxy.java:192)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilter (FilterChainProxy.java:160)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.invokeDelegate (DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter (DelegatingFilterProxy. java:262)
 

Основная причина

 java.lang.NullPointerException
 

Примечание Полная трассировка стека основной причины доступна в журналах сервера.


Apache Tomcat / 9.0.39

Биологические свойства внеклеточных везикул и их физиологические функции

Белки и связанные с белками функции EV

Протеомные исследования EV, высвобождаемых первичными культурами клеток, линиями клеток, культурами тканей или изолированными из биожидкостей дали обширные каталоги изобилия белка в различных типах электромобилей.Доступны общедоступные онлайн-базы данных, в которых каталогизируются компоненты, связанные с электромобилями. К ним относятся Vesiclepedia (www.microvesicles.org/) (34), EVpedia (www.evpedia.info) (35) и ExoCarta (www.exocarta.org) (36).

EV содержат белки, которые считаются маркерами пан-EV (т. Е. Общими для большинства EV), а также их белки и посттрансляционные модификации белков, которые специфически отражают локализацию везикул, клеточное происхождение и механизм секреции (37-40). В целом, EV очень распространены в белках цитоскелета, цитозоля, теплового шока и плазматической мембраны, а также в белках, участвующих в переносе везикул.Белки внутриклеточных органелл встречаются реже. Было обнаружено, что полученные протеомные профили сильно зависят от того, как были выделены EV. Различные методы позволяют получать EV и субфракции EV переменной однородности, что затрудняет экстраполяцию результатов между различными протеомными исследованиями EV.

Хотя белковые профили могут быть характерными для разных подгрупп EV, тем не менее не существует единого маркера, который мог бы однозначно идентифицировать EV. Эти пузырьки лучше всего изолировать, определить и охарактеризовать с помощью нескольких методов.К ним относятся выделение с помощью дифференциального ультрацентрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности (градиенты сахарозы или йодиксанола), фильтрация и эксклюзионная хроматография. Из-за небольших различий в физических свойствах и составе различение между разными подгруппами ЭВ после их клеточного высвобождения остается трудным. Кроме того, один и тот же тип клеток может секретировать разные подгруппы везикул в зависимости от факторов окружающей среды (например, напряжения кислорода), топографии клетки (например, от базолатеральной или апикальной поверхности клеток) (41) или активирующего стимула (например,г. апоптоз или аутофагия) (42). Кроме того, содержание белков одних и тех же подгрупп EV регулируется на основе активирующего стимула (43). Кроме того, данная клетка может содержать разные типы MVB, характеризующиеся разным содержанием экзосом (44, 45). Характеристику содержания белка EV обычно проводят, например, с помощью иммуноблоттинга, иммуно-золотого мечения в сочетании с электронной микроскопией и анализом проточной цитометрии на основе гранул с антителами. Белки, обогащенные субпопуляциями EV, которые часто используются в качестве маркеров (хотя и не обязательно специфические), включают тетраспанины (CD9, CD63, CD81 и CD82), белки 14-3-3, молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) и цитозольные белки, такие как специфические стрессовые белки (белки теплового шока; HSP), Tsg101 и эндосомный сортировочный комплекс, необходимый для транспорта (ESCRT-3), связывающий белок Alix (46). Ранее считалось, что тетраспанины CD9, CD63 и CD81 являются специфическими маркерами экзосом; однако эти белки теперь также наблюдаются в апоптотических телец и микровезикулах (41, 47). Напротив, некоторые исследования показывают, что CD63 (и Tsg101) присутствуют только в определенных подгруппах EV (48). В целом, CD9 и CD81 относятся к 200 наиболее часто определяемым белкам EV (35). Консенсус по процедурам выделения и дополнительные экспериментальные данные необходимы, чтобы определить, действительно ли существуют определенные белки, которые должны быть связаны с конкретными EV-подгруппами (41).

Гликозилирование белков и лектины

Первое исчерпывающее представление о гликоме ЭВ было получено с помощью лектинового микроматричного анализа ЭВ из Т-клеток. Было обнаружено, что их глико-паттерн отличен от такового из родительской клеточной мембраны (49). EV были обогащены высокоманнозилированными эпитопами, включая сложные N-гликаны, N-ацетиллактозамин, сиалированные и фукозилированные эпитопы, в то время как антигены группы крови A / B были исключены. Такие же отличия от мембран родительских клеток были обнаружены у ЭВ из ряда линий клеток человека (Т-клетки, меланома и рак толстой кишки) (50).Было обнаружено, что паттерны связывания лектина сохраняются во всех исследованных ЭВ, хотя связывание данного лектина было связано с разными белками. Было обнаружено различие гликозилирования экзосом и апоптотических телец (37). В нескольких исследованиях сообщалось об изменениях в паттернах гликозилирования EV при патологических состояниях, включая рак яичников (37), классическую галактоземию (51) и поликистоз почек (52), указывая на важную роль гликозилирования в физиологии EV (пато).

Исследования с использованием классических биохимических методов и протеомного профилирования EV показали присутствие нескольких гликановых белков. Они могут быть особенно важны для того, какие ячейки будут нацелены на EV и как они взаимодействуют с этими ячейками-мишенями. Например, P-селектин C-типа (CD62), который присутствует на поверхности EV, высвобождаемых из активированных тромбоцитов, позволяет EV связываться с клетками-мишенями через его классический лиганд-1 гликопротеина P-селектина (PSGL- 1) лиганд (53). Кроме того, было обнаружено, что происходящие из В-клеток ЭВ обогащены α2,3-связанной сиаловой кислотой, что позволяет им захватывать сиалоадгезин (CD169, Siglec1) на макрофагах (54). Протеомное профилирование EV, полученных из плазмы человека, выявило 9 лектинов, включая член 10 подсемейства коллектинов (COLEC10), предшественники фиколина 1, 2 и 3, маннозу-связывающую лектин-серинпротеазу 1 и предшественники 2 (55). Сообщалось о присутствии лектина эндоплазматического ретикулума амплифицированного-9 остеосаркомы и маннозосвязывающих лектинов в слюне (56), плазме (55) и моче (18, 38).Интелектин-1, лектин, связывающий галактофуранозу, был обнаружен в мочевых ЭВ (56). Лектин-галактозосвязывающий белок-3 (LGALS3BP), который связывает галектин 3, был преимущественно обнаружен в ЭВ, полученных из линий клеток рака предстательной железы (57) и рака яичников (58).

Галектины — это семейство растворимых лектинов, характеризующихся их сродством к бета-галатозидам в отсутствие двухвалентных катионов. Сообщалось, что ЭВ, полученные из рака мочевого пузыря (59), несут галектин-1 и галектин-3; последний также был обнаружен в ЭВ, полученных из слюны (60), околоушной железы (56), кондиционированной среды из линии клеток рака толстой кишки человека LIM1215 (28), мочи (18, 38) и плазмы (55).Галектин-4 был обнаружен в ЭВ, секретируемых линией колоректальных клеток человека HT 29 (61) и линией опухолевых клеток толстой кишки LIM1215 (28), в то время как галектин-5 на поверхности ЭВ из ретикулоцитов оказался решающим для захвата ЭВ макрофагами. (62). Наконец, галектин-7 был обнаружен в ЭВ, полученных из околоушной слюны человека (56).

Важность глико-взаимодействий в сортировке EV и их влиянии на клетки-мишени подтверждается недавними исследованиями (63, 64). Более того, паттерны поверхностного гликозилирования могут быть важны для поглощения EV клетками-реципиентами (37, 50) (62), которое, как было показано, зависит от протеогликанов сульфата гепарина (65), так что его можно ингибировать добавлением гепарина (30). .

Сортировка молекул по EV

Общая белковая сигнатура различных видов EV, которая, вероятно, имеет решающее значение для их функции и может иметь отношение к их биогенезу, также может быть связана с кривизной мембраны (Рис. 2). Составляющие мембраны могут более или менее свободно перемещаться по мембране в боковом направлении, поэтому молекулы с заданной эффективной формой будут накапливаться в областях, которые являются энергетически выгодными (66), определяя локальный состав мембраны и ее кривизну (т.е.е. форма). Сортировка белков (67, 68) и липидов (69, 70) на основе кривизны была изучена в искусственных и эукариотических мембранах, и было установлено, что бактерии способны сортировать макромолекулы на отдельные субклеточные домены (71, 72).

Биологические свойства внеклеточных везикул и их физиологические функции

Все авторы

Мария Яньес-Мо, Пиа Р.-М. Сильяндер, Зораида Андреу, Аполлония Бедина Завец, Франческ Э. Боррас, Эдит И. Бузас, Кристина Бузас, Энрикета Казаль, Франческо Каппелло, Жоана Карвалью, Ева Колас, Анабела Кордейро-да Силва, Стефано Фейс, Хуан М. Фалькон-Перес, Ирен М. Гобриал, Бернд Гибель, Марио Гимона, Майкл Гранер, Ихсан Гурсель, Майда Гурсель, Нильс Х. Х. Хегаард, Ан Хендрикс, Питер Киерульф, Кацутоши Кокубун, Майя Косанович, Вероника Краль-Иглич, Ева-Мария Альберс, Саара Лайтинен, Сесилия Лессер, Томас Ленер, Эржебет Лигети, Айя Лине, Георг Липпс, Алисия Льоренте, Ян Летвалл, Матея Манчек-Кебер, Антонио Марсилла, Мария Миттельбрунн, Ирина Назаренко, Эстер Н.М. . Найман, Лоррейн О’Дрисколл, Мирейя Оливан, Карла Оливейра, Ива Паллинджер, Эрнандо А.дель Портильо, Жауме Ревентос, Марина Ригау, Ева Роде, Марей Саммар, Франсиско Санчес-Мадрид, Н. Сантарем, Катарина Шальмозер, Мари Стампе Остенфельд, Виллем Стурвогель, Роман Стукель, Сюзанна Г. Ван дер Грейнселос, М. Хелена Васка HM Wauben & Olivier De Wever https://doi.org/10.3402/jev.v4.27066

Опубликовано онлайн:
14 мая 2015 г.

Рис. 2. Механизм сортировки по кривизне.

В процессе образования почки составляющие мембраны перераспределяются в области с подходящей кривизной мембраны, чтобы минимизировать свободную энергию мембраны. Затем перераспределение компонентов мембраны отражается в отторгнутых пузырьках. В качестве примеров на этой схеме показаны тетраспанины, комплексы ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), анонимные интегральные мембранные белки данного типа, гликопротеины и белки, которые преимущественно расположены внутри и снаружи клетки. Комплекс ESCRT благоприятствует шейке зародыша и распадается после защемления пузырька. Содержимое, заключенное в мембрану везикул, становится подвижным и может достигать отдаленных клеток.

Этот самосогласованный механизм сортировки по кривизне составляющих мембраны (73) начинается в родительской клетке во время отрастания мембраны. Он во многом определяет форму, размер и состав электромобилей и, следовательно, влияет на их физиологическую роль. Механизм неспецифический; он имеет место во всех типах мембран и применяется к пузырькам, образованным либо внутри MVB, либо путем отпочкования от плазматической мембраны.Таким образом, этот механизм подразумевает, что несколько структурных компонентов являются общими для разных видов везикул.

Некоторые компоненты мембраны, такие как лектины (50) и микродомены, обогащенные тетраспанином (74, 75), как уже сообщалось, играют решающую роль в концентрации компонентов белка EV и, в то же время, в рекрутировании структурных и формирующие компоненты. Вызванная кривизной сортировка компонентов мембраны и их прямые взаимодействия могут привести к образованию латеральных микродоменов определенного состава, таких как микродомены, обогащенные тетраспанином (76) и мембранные рафты (77) (рис.2). Было высказано предположение, что тетраспанины вызывают искривление мембраны (78), и было показано, что включение мембранных рецепторов в микродомены, обогащенные тетраспанином, имеет отношение к их направлению к экзосомам (74, 75) (79). Анализ ганглиозида GM1 и содержания цитозольного белка в зачатках мембран эритроцитов и высвобожденных везикулах показал перераспределение этих молекул по отношению к мембране родительской клетки. Это указывает на то, что целые микродомены могут быть отсортированы в относительно плоские мембранные области или в сильно изогнутые (которые в конечном итоге становятся EV), в зависимости от их внутренней молекулярной формы и / или взаимодействий между элементами микродоменов (73).Среди структурных компонентов, способствующих кривизне, было показано, что белки, содержащие домен BAR (Bin / Amphiphysin / Rvs), управляют образованием тубулярных и везикулярных мембранных структур (80, 81). Белки ESCRT, по-видимому, отдают предпочтение шейной области формирующихся EV (82, 83), где они играют важную роль в делении мембранных зачатков (84, 85). Помимо морфологического расположения мембран, индуцирующих образование ILV в MVBs (86), комплекс ESCRT рекрутирует компоненты экзосомального груза посредством связывания с убиквитинилированными белками.Включение данного белка в EV может зависеть от места образования везикул (плазматическая мембрана по сравнению с MVB) и следовать либо ESCRT-зависимым, либо независимым путем. Внутрипросветные компоненты EV-мембраны, например, адапторные молекулы цитоскелета, также могут играть роль как в редактировании, так и в поддержании морфологии везикул. Сообщалось, что белок постсинаптической плотности, большой диск, белок zonulin I (PDZ) синтенин, необходим для образования ILV MVB и, следовательно, экзосом (87, 88).Белки семейства ERM (Ezrin, Radixin и Moesin) высоко обогащены EV и связаны с различными компонентами внутри микродоменов, обогащенных тетраспанином (74, 89). Вставка в микродомены мембраны также может влиять на степень олигомеризации, которая также может функционировать как механизм нацеливания (90, 91). Все эти исследования показывают, что локальный белок и, как описано ниже, сортировка липидов внутри мембраны тесно связаны с образованием и идентичностью EV.

Механизмы захвата

Благодаря большому и вариабельному содержанию белка, ЭВ можно рассматривать как векторные сигналосомы (92).Белковый состав EV может определять их функциональность несколькими разными способами. Открытые на поверхности рецепторы и лиганды ответственны за биораспределение, за связывание EV с клетками-мишенями или с внеклеточным матриксом. Впоследствии EV могут запускать внутриклеточные сигнальные пути посредством простого взаимодействия с поверхностными рецепторами или лигандами клеток-мишеней или посредством интернализации. Кроме того, ЭВ могут вызывать изменения клеточного фенотипа путем переноса в клетку-мишень функционально активных рецепторов, таких как CCR5 (93), EGFRvIII (94) или MET (95).

Поглощение

EV клетками-мишенями, по-видимому, зависит от типа клеток-реципиентов. В большинстве случаев поглощение EV, по-видимому, происходит через фагоцитоз (65, 96), и его степень может зависеть от фагоцитарных способностей клетки-реципиента (97). Макропиноцитоз может представлять собой альтернативный путь, с помощью которого ЭМ могут передавать свое содержимое (98–100). Поскольку слияние мембран требует одинаковой текучести между двумя сливающимися мембранами, и как EV, так и плазматические мембраны демонстрируют одинаковую текучесть при pH 5.0 (101, 102), но не при нейтральном pH (что делает мембрану более жесткой) (103), прямое слияние EV с плазматической мембраной может быть ограничено кислыми условиями pH, такими как те, которые обнаруживаются внутри опухоли (99). Примечательно, что MVB имеют pH ~ 5, и что также сообщалось о слиянии ILV с лимитирующей мембраной MVB (т.е. обратное слияние) (104). Ключевое влияние pH микроокружения предполагает, что различия в электростатических зарядах между электромобилями и плазматической мембраной клеток следует рассматривать в связи с физиологической ролью электромобилей.

Следовательно, возможно, что когда функциональная молекула доставляется с помощью ЭВ, она может быть более активной, чем в ее растворимой форме. Ярким примером этого являются лиганды рецепторов смерти, которые более функциональны, когда экспрессируются на мембране, чем в их растворимой форме (105, 106). Кроме того, протеомный анализ показал, что металлопротеиназы, закрепленные на клеточной поверхности, и растворимые матриксные металлопротеиназы присутствуют в EV из клеточных культур и жидкостей организма (107). Некоторые из этих металлопротеиназ были протеолитически активными, что позволяет предположить, что они могут изменять содержание EV; напрямую взаимодействуют или расщепляют белки внеклеточного матрикса; или избавиться от заякоренных в мембране рецепторов из клеток-мишеней.

Биораспределение и таргетинг

Устойчивый уровень ЭМ в обращении отражает баланс между поколением ЭМ и их вывозом. Независимые исследования показывают, что период полураспада очищенных экзогенных ЭВ, искусственно введенных в обращение, очень короткий. Биотинилированные кроличьи ЭВ выводились из кроличьей циркуляции за ~ 10 мин (108). EV из супернатантов спленоцитов (54), EV из красных кровяных телец (109) и EV из клеток меланомы B16 (110) — все показали клиренс более 90% через 30 минут.Однако ЭВ, полученные из концентратов тромбоцитов человека, оставались в кровотоке с периодом полураспада 5,5 часа (111). Поскольку EV могут проявлять защиту от комплемент-опосредованного лизиса из-за экспрессии гликозилфосфатидилинозитола (GPI) -зависимых CD55 и CD59 (112), их выведение из кровотока, скорее всего, связано с задержкой и захватом в органах-мишенях. Действительно, исследование биораспределения ЭВ, полученных из красных кровяных телец, показало захват печенью (44,9%), костью (22,5%), кожей (9,7%), мышцами (5,8%), селезенкой (3.4%), почки (2,7%) и легкие (1,8%) (109). Напротив, ЭВ, происходящие из меланомы, в основном поглощались легкими и селезенкой (110). Биораспределение EV, скорее всего, зависит от источника родительских клеток, а также от доступности различных типов клеток-мишеней для интернализации циркулирующих EV. Для установления клиренса и поглощения органами различных популяций ЭВ необходимы более подробные исследования, сравнивающие различные места инъекции, донорские клетки, а также здоровые и болезненные состояния.

Нацеливание на определенные молекулы адгезии определяет биораспределение EV.Связывающие сиаловую кислоту иммуноглобулиновые лектины (сиглек) экспрессируются на множестве лейкоцитов, а CD169 (сиалоадгезин) предпочтительно связывается с α2,3-связанными сиаловыми кислотами, которые украшают белки на поверхности ЭВ. Действительно, происходящие из В-клеток EV захватываются экспрессирующими CD169 макрофагами как в селезенке, так и в лимфатических узлах (54). У мышей с нокаутом CD169 доступ EV к лимфоидной системе нарушен, что приводит к аберрантному перемещению EV в красную пульпу селезенки или кору лимфатических узлов (54). Еще одно понимание потенциального влияния сахаридов произошло из открытия, что поглощение EV дендритными клетками (DC) снижалось в присутствии D-маннозы или D-глюкозамина (113), предполагая, что механизм поглощения EV основан на C-типе. лектиновое взаимодействие.Кроме того, β-галактозиды на поверхности EV ретикулоцитов могут участвовать в их поглощении макрофагами через взаимодействие с галектином-5 (62). Тем не менее, сахара, по-видимому, не играют значительной роли во взаимодействии EV и их поглощении, по крайней мере, в исследованиях in vitro с клеточной линией карциномы яичника SKOV-3 (37), что предполагает различия в поглощении, специфичные для клеток или состояний. механизмы.

Лактадгерин (также известный как глобула молочного жира-эпидермальный фактор роста 8) связывает фосфатидилсерин (PS) на поверхности апоптотических клеток и тромбоцитарных ЭВ (114, 115).После связывания конформационное изменение обнажает мотив Arg-Gly-Asp (RGD), который затем связывается с интегринами αvβ3 и αvβ5, впоследствии способствуя фагоцитозу EV макрофагами (115). Таким образом, лактадгерин связывает PS-положительные EV с макрофагами селезенки, обеспечивая их удаление из кровотока (114). Точно так же онтогенетический эндотелиальный локус-1 (Del-1) также опосредует связывание как с PS на тромбоцитарных EV, так и с интегрином αvβ3 на эндотелиальных клетках (EC) (116). Как взаимодействие, так и захват EVs поверхностями клеток в значительной степени облегчается за счет реципрокной экспрессии молекул межклеточной адгезии, таких как интегрин ICAM-1 и LFA-1 (117–119).

Взаимодействие с мембранными рецепторами

EV могут взаимодействовать с клетками-мишенями посредством взаимодействия лиганд-рецептор. Специфические белки EV, такие как MHC I и II (119–124), рецепторы трансферрина (125) и тетраспанины (74, 75), активны в нижестоящих сигнальных путях клеток-мишеней, запуская, например, интегрины и передачу сигналов кальция (126). активация митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) (125) или передача сигналов 2D группы естественных киллеров (NKG2D) (127, 128).

Среди взаимодействий лиганд-рецептор заслуживают внимания взаимодействия между некоторыми HSP, такими как HSP60 и HSP70, и рядом мембранных рецепторов, присутствующих в основном на иммунных клетках, таких как CD14, CD91, Toll-подобный рецептор (TLR) -2. , TLR-4 и LOX-1 (129), а также CD94 / CD56 (130). В частности, некоторые HSP, такие как HSP 27, 60, 70 и 90, могут внутриклеточно перераспределяться от своих канонических сайтов к плазматической мембране, липидным рафтам и MVB при некоторых патологических состояниях, таких как рак. В свою очередь, они секретируются через EV, в которых они локализованы на уровне мембраны (31, 32) (131, 132). Как следствие, их связывание с этими рецепторами может иметь значение для взаимодействия между EV и клетками-мишенями во время этих заболеваний.

Однако вероятно, что обогащение только сигнальными молекулами недостаточно для облегчения сигнальных функций EV.Фактически, EV также содержат активные липолитические фрагменты, такие как фосфолипазы, что приводит к образованию биоактивных липидных медиаторов (жирных кислот и простагландинов), которые могут взаимодействовать с периферическими рецепторами, связанными с G-белком, и ядерными рецепторами в клетках-мишенях (133). .

Ярким примером функциональной роли лигандов EV для мембранных рецепторов является присутствие лигандов для рецепторов смерти в EV. Было показано, что естественные киллеры человека (NK) выделяют EV, которые экспрессируют как маркеры NK-клеток, так и цитотоксические молекулы, такие как FasL и перфорин (134).Кстати, это очевидно и для других цитотоксических клеток (135). Эти EV были выпущены во внеклеточную среду и и могли быть обнаружены в кровотоке. EV, производные от NK, полностью активны в индукции гибели клеток-мишеней. Более того, опухолевые клетки человека высвобождают EV, экспрессирующие лиганды рецепторов смерти, включая FasL и связанный с TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL). Эти связанные с EV лиганды полностью функциональны в индукции гибели клеток, опосредованной рецептором смерти.Интересно, что EV, несущие FasL и TRAIL, высвобождаемые злокачественными опухолевыми клетками, могут участвовать в лизисе лимфоцитов, которые должны убивать опухолевые клетки, но при этом не могут вызывать гибель клеток в родительских опухолевых клетках, высвобождающих EV (136, 137).

Цитокины, ассоциированные с EV

Было показано, что помимо опосредования обмена межклеточной информацией посредством своих поверхностных молекул, EV являются носителями важных растворимых медиаторов, таких как цитокины. Для цитокинов, у которых отсутствует N-концевой сигнальный пептид, высвобождение EV представляет собой форму безлидерной секреции.Примеры EV-ассоциированных или секретируемых цитокинов приведены в таблице I.

Биологические свойства внеклеточных везикул и их физиологические функции

Все авторы

Мария Яньес-Мо, Пиа Р.-М. Сильяндер, Зораида Андреу, Аполлония Бедина Завец, Франческ Э. Боррас, Эдит И. Бузас, Кристина Бузас, Энрикета Казаль, Франческо Каппелло, Жоана Карвалью, Ева Колас, Анабела Кордейро-да Силва, Стефано Фейс, Хуан М. Фалькон-Перес Ирен М. Гобриаль, Бернд Гибель, Марио Гимона, Майкл Гранер, Ихсан Гурсель, Майда Гурсель, Нильс Х.Х. Хегаард, Ан Хендрикс, Петер Киерульф, Кацутоши Кокубун, Майя Косанович, Вероника Краль-Иглич, Ева-Мария Кремер-Альберс, Саара Лайтинен, Сесилия Лессер, Томас Ленер, Эржебет Лигети, Айя Лине, Георг Липплоренте, Алисия Летвалль, Матея Манчек-Кебер, Антонио Марсилла, Мария Миттельбрунн, Ирина Назаренко, Эстер Н.М. Нольте-‘т Хоэн, Туула А. Найман, Лоррейн О’Дрисколл, Мирейя Оливан, Карла Оливейра, Ива Паллингер, Эрнандо А. дель Портильо Ревентос, Марина Ригау, Ева Роде, Марей Саммар, Франсиско Санчес-Мадрид, Н.Сантарем, Катарина Шальмозер, Мари Стампе Остенфельд, Виллем Стоорвогель, Роман Стукель, Сюзанна Г. Ван дер Грейн, М. Хелена Васконселос, Марка HM Вобен и Оливье Де Вевер https://doi.org/10.3402/jev.v4.27066

Опубликовано на сайте: 14 мая 2015 г.

Таблица I . Примеры цитокинов, ассоциированных с EV

Наиболее известным примером участия EV в транспорте цитокинов является интерлейкин 1β (IL-1β). IL-1β не только высвобождается клетками при слиянии секреторных лизосом с плазматической мембраной, но также секретируется ЭВ (138, 139).Как только IL-1β-содержащие EV секретируются, их цитокиновый груз высвобождается во внеклеточное пространство после связывания АТФ с P2X7R на EV (140). Другой член семейства IL-1, IL-1α, был обнаружен в апоптотических тельцах, происходящих из EC, как в его предшественниках, так и в зрелых формах (141).

Было показано, что, как и IL-1β, безлидерный цитокин IL-18, который также секретируется при активации инфламмасом, связан с EV, отщепляющимися с поверхности макрофагов (142). Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) (143) и IL-32 (144) представляют собой другие примеры EV-ассоциированных цитокинов, подвергающихся нетрадиционной секреции в отсутствие сигнального пептида.Было показано, что связанный с мембраной фактор некроза опухоли (TNF) секретируется EV (145), тучные клетки выделяют везикулярный IL-6 при стимуляции IL-1 (146), в то время как тромбоциты высвобождают EV, содержащие фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) ( 147). Было также показано, что VEGF присутствует в выделенных опухолью ЭВ и высвобождается из ЭВ в биоактивной форме только при кислом pH, характерном для микроокружения опухоли (148).

Хемокины представляют собой очень важную и особую категорию цитокинов.Среди хемокинов было обнаружено, что IL-8 (CXCL8) и фракталкин (CX3CL1) связаны с EV (149, 150), в то время как EV из опухолевых клеток, подвергшихся тепловому стрессу, были связаны с CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 и CCL20 (151). .

Что касается регуляторных цитокинов, было показано, что происходящие из тимуса ЭВ индуцируют регуляторные Т-клетки через связанный с пузырьками трансформирующий фактор роста (TGF) β (152). Также было обнаружено, что происходящие из опухоли EV используют TGFβ-опосредованный механизм для индукции регуляторных Т-клеток (153, 154) и миелоидных супрессорных клеток (155).Хотя природа ассоциации цитокинов с различными ЭВ в целом плохо изучена, сообщалось о роли гепарансульфатных протеогликанов в прикреплении TGF-бета к мембране везикул и его функциональной передаче реципиентным клеткам (156, 157). Однако на самом деле никаких систематических исследований для определения полного спектра цитокинов, связанных с ЭВ, не проводилось. Более того, степень, в которой везикулярная локализация цитокинов влияет на обычные измерения цитокинов, остается ключевым вопросом, который еще предстоит решить.

Состав РНК

Внеклеточная РНК существует в различных формах. Он может быть заключен в EV, связываться в белковые комплексы или существовать в свободно циркулирующей форме. Присутствие функциональной РНК в ЭВ было впервые описано в 2006 г. для ЭВ, полученных из мышиных стволовых клеток (17), и в 2007 г. для ЭВ, полученных из тучных клеток мыши, поглощаемых тучными клетками человека (16). В то время как клеточная мРНК варьируется по размеру от 400 до 12000 нуклеотидов (нт), РНК, обнаруживаемая в ЭМ, имеет преобладающий размер <700 нт (158, 159).Однако EV содержат интактную мРНК (160), фрагменты мРНК (159), длинную некодирующую РНК (161, 162), миРНК (163, 164), piwi-взаимодействующую РНК (161), рибосомную РНК (рРНК) ( 161) и фрагменты тРНК, свод- и Y-РНК (165, 166). Большинство исследований сообщают об отсутствии или незначительном количестве рибосомных 18S и 28S в ЭМ, в отличие от их обильного внутриклеточного присутствия (например, 16,47,161,166). Однако некоторые исследования сообщают о значительной доле рРНК (~ 87%) в этой подгруппе EV (167), а другие сообщают о большом количестве фрагментов рРНК на основе секвенирования следующего поколения (168).Таким образом, вариативность может существовать в зависимости от источника электромобиля и методологии, используемой для получения данных. Проверка внутрипросветной локализации РНК в ЭВ, а не в свободно циркулирующей форме, в основном проводится путем обработки ЭВ РНКазой А (47, 169). Однако в некоторых исследованиях сообщается, что взаимодействие белков с Ago2 может также обеспечивать устойчивость к РНКазе A (170), поэтому также следует проводить предварительную обработку протеиназой K, которая делает комплексы AGO – РНК чувствительными к деградации РНКазы (171).

Сообщалось об обогащении ЭВ фрагментами 3’UTR мРНК, а не интактными молекулами мРНК (159). Поскольку 3’UTR содержит несколько сайтов для регуляторного связывания miRNA, это предполагает, что РНК EV может конкурировать с клеточной РНК за связывание miRNA или РНК-связывающих белков в реципиентных клетках, чтобы регулировать стабильность и трансляцию (159). Высвобождение специфических молекул РНК может также оказывать внутреннее влияние на регуляцию экспрессии генов в родительских клетках (172).

МикроРНК (miRNA) представляют собой регуляторные молекулы размером ~ 21 нуклеотид, которые транскрибируются как предшественники шпилек (pri-miRNAs), расщепляются Dicer (на пре-miRNA), связываются белками Argonaute (Ago) и загружаются в индуцированный miRNA комплекс сайленсинга. (miRISC) для регуляции мРНК-мишени. miRNA секретируются как в EV, так и в невезикулярной форме. При высвобождении в виде молекул растворимых белковых комплексов miRNAs были обнаружены в комплексах с белком Ago2 или липопротеином высокой плотности (HDL) (173–175).

Некоторые исследования сообщают об отсутствии белков комплекса miRISC (включая Ago2) в подгруппе экзосом EVs (39), тогда как другие сообщают о присутствии Ago2 (170). В связи с этим было высказано предположение, что белки RISC в EVs могут преобразовывать микроРНК-предшественники (pre-miRNAs) в зрелые miRNA, индуцируя клеточно-независимый биогенез микроРНК (176).

Наблюдались относительно пониженные уровни мРНК-мишеней экзоцитированных миРНК (39, 172) (177). Вместе эти наблюдения указывают на то, что загрузка miRNA в EVs может происходить независимо от вовлечения мРНК в мишень и с помощью механизма, отличного от секреции miRNA в комплексе с Ago2.Наблюдение за тем, что miRISCs накапливается в сайтах MVB, предполагает, что может существовать регуляторный контур активности miRISC и / или нагрузки экзосом miRNA (177).

Механизмы, которые контролируют сортировку РНК в EV

С момента открытия РНК в EV (16, 17) (178) появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что РНК не пассивно загружается в EV, но что определенные популяции РНК становятся обогащенными EV. по сравнению с родительскими клетками. Хотя это обогащение может происходить из-за ограничения размера, существует определенный репертуар miRNA, избирательно экспортируемых в EV даже среди малых видов РНК, тогда как другие miRNA обычно исключаются (164, 166) (179, 180), что указывает на то, что активная сортировка механизм происходит на уровне РНК.Обогащение РНК, содержащей специфические нуклеотидные мотивы, было зарегистрировано в EVs (181, 182). Кроме того, экспрессия клеточных miRNA или целевых последовательностей miRNA может модулировать присутствие miRNA в экзосомах (183).

Было показано, что загрузка miRNAs в EV контролируется гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином (hnRNP) A2B1 (182). hnRNPs представляют собой семейство вездесущих белков, которые участвуют в транспортировке и функционировании РНК. hnRNPA2B1 распознает EXOmotif (тетрануклеотид GGAG) в miRNA и контролирует загрузку этих miRNA в EV.hnRNPA2B1 внутри ЭВ является сумоилированным; эта посттрансляционная модификация необходима для загрузки miRNAs в EV. Виды мРНК также демонстрируют избирательное обогащение EV. Данные свидетельствуют о том, что консенсусная последовательность в 3’UTR ряда мРНК, обогащенных EV, может действовать как последовательность почтового индекса, которая нацелена на мРНК в EV, подобно EXO-мотиву miRNA. Этот почтовый индекс состоит из последовательности из 25 нуклеотидов, которая содержит короткий коровой домен CTGCC в структуре стержень-петля и несет сайт связывания miR-1289 (184).Также было высказано предположение, что добавление нестандартных нуклеотидов к 3′-концу микроРНК может способствовать непосредственной сортировке микроРНК в EV (185).

Биологическое значение горизонтального переноса мРНК

Первое экспериментальное доказательство того, что ЭВ могут переносить интактные функциональные мРНК в клетки-реципиенты, было получено благодаря открытию того факта, что обработка мононуклеарных клеток костного мозга мыши с помощью ЭВ, полученных из эмбриональных стволовых клеток, обогащенных МРНК Oct4 приводила к увеличению экспрессии белка Oct4 в клетках костного мозга, тогда как предварительная обработка ЭВ РНКазой аннулировала этот эффект (17). В свою очередь, впоследствии было продемонстрировано путем инкубации тучных клеток человека с ЭВ, полученными из тучных клеток мыши, что мышиные мРНК могут быть перенесены в клетки-реципиенты с помощью ЭВ, где они транслируются в мышиные белки, хотя сами ЭВ не имеют функционального аппарата для синтез белка (16). Еще одно исследование показало, что ЭВ, происходящие из эндотелиальных клеток-предшественников, могут передавать функциональные мРНК в микрососудистые ЭК, тем самым запуская неоангиогенез (186). Перенос функциональной мРНК был доказан путем создания клеток, которые экспрессируют мРНК GFP, но не имели обнаруживаемых уровней белка в своих EV, однако ЭК, обработанные этими EV, начали экспрессировать белок GFP (186).Взятые вместе, эти исследования обеспечивают прочную основу для концепции, что EV переносят функциональные мРНК, которые могут быть интернализованы и транслированы в реципиентных клетках.

Было также показано, что содержащие мРНК EV

увеличивают выживаемость клеток и восстановление тканей в различных стрессовых условиях (187–189). Было обнаружено, что ЭВ, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток человека, содержат 239 мРНК, большинство из которых участвует в дифференцировке клеток, транскрипции, пролиферации клеток и иммунной регуляции (188). Было показано, что два из них интернализуются и транслируются в полноразмерные белки в эпителиальных клетках почек мышей in vitro и in vivo, что демонстрирует возможность горизонтального переноса мРНК в этих экспериментальных условиях (187, 188).Лечение мышей этими ЭВ защищает от повреждения почек, вызванного глицерином или цисплатином (187, 188). Интересно, что содержание мРНК в EV модулируется физиологическим состоянием клетки и стрессовыми условиями и может играть роль в поддержании тканевого гомеостаза и синхронизации функционального состояния клеток. Например, было обнаружено, что содержание мРНК значительно различается между EV, полученными из тучных клеток, выращенных в условиях окислительного стресса и нормальных условиях (189). ЭВ, высвобождаемые при окислительном стрессе, увеличивают способность необработанных тучных клеток справляться с окислительным стрессом, индуцированным H 2 O 2 , тогда как воздействие УФ-света устраняет защитный эффект (189). Аналогичным образом, было обнаружено, что мРНК, содержащие EV, регулируются стимуляцией факторами роста кардиомиоцитов (190) и гипоксией в клетках глиомы, что приводит к экспрессии множества индуцированных гипоксией мРНК и белков в EV, происходящих из гипоксической глиомы (191). . Что касается синхронизации функционального статуса клеток, было показано, что EV, полученные из больших адипоцитов, переносят специфические мРНК, участвующие в этерификации жирных кислот и биогенезе липидных капель, в маленькие адипоциты, где они стимулируют синтез и накопление липидов (192).

Все эти эффекты, по крайней мере, частично опосредованы горизонтальным переносом РНК. Однако в настоящее время трудно различить эффекты, запускаемые мРНК и различными некодирующими РНК, которые являются многочисленными компонентами экзосомальных РНК (161), и оценить степень, в которой отдельные мРНК способствуют этим эффектам. Более того, еще не ясно, какая часть транскриптома клетки в EVs состоит из интактных мРНК, которые могут транслироваться в реципиентных клетках, и какие фрагменты мРНК могут играть регуляторные роли (159, 161).

функций на основе miRNA

Накапливающиеся данные указывают на то, что включение miRNAs в EV позволяет этим miRNAs циркулировать в крови, избегая при этом деградации из-за активности РНКаз крови. Селективное удаление некоторых miRNA в EV также считается быстрым способом регуляции экспрессии генов, например, во время активации лимфоцитов, как это было вызвано вакцинацией (193), или как механизм удаления miRNA-супрессора опухоли при раке (172). ). Полный список микроРНК, обнаруженных в составе ЭМ, доступен в базе данных miRandola (www.atlas.dmi.unict.it/mirandola/index.html) (194) и другие базы данных, такие как EVpedia или Vesiclepedia. Такие миРНК могут секретироваться различными клетками, такими как иммунные клетки (164), стволовые клетки (195), клетки крови (196) или адипоциты (192, 197), и все больше данных указывает на то, что они могут играть важную физиологическую роль [ рассмотрено в работах. (198–202)]. По крайней мере, для некоторых типов клеток miRNA могут переноситься внутри EV в соседние клетки, где они изменяют экспрессию генов и фенотип клеток-реципиентов.

EV-опосредованный перенос miRNAs, как было показано, имеет иммунологическое значение (203). Например, было продемонстрировано, что управляемый антигеном однонаправленный перенос некоторых miRNA (таких как miR-335) от Т-клеток к антигенпрезентирующим клеткам (APC), опосредованный CD63 + EV, происходит во время образования иммунных синапсов. Было показано, что перенесенные miRNA модулируют экспрессию генов в реципиентных клетках (164). Было описано, что EV, высвобождаемые различными подмножествами эффекторных Т-клеток (Th2, Th3 и Treg), имеют разные сигнатуры miRNA (204).Авт. Идентифицировали перемещаемые через экзосомы специфические miRNAs, переносимые из Treg, которые подавляют патогенные клетки Th2 и предотвращают воспаление. Аналогичным образом было показано, что происходящие из тучных клеток EV содержат miRNA (205), а микровезикулы, происходящие из макрофагов, переносят miR-223 и индуцируют дифференцировку наивных моноцитов, предполагая, что петля амплификации, опосредованная EV, может существовать для усиления иммунной функции (206). ). Интересно, что высокие уровни экспрессии связанных с иммунитетом miRNA (таких как miR-181a и miR-17) в CD63 + EV были обнаружены в материнском молоке в течение первых 6 месяцев лактации (207).Технология глубокого секвенирования позволила идентифицировать множество miRNA в ЭМ грудного молока человека с большим количеством связанных с иммунитетом miRNA. Это предполагает, что эти микроРНК EV передаются из материнского молока младенцу, возможно, играя важную роль в развитии иммунной системы младенца (208). Плацентоспецифичные miRNA также упакованы в EV и могут опосредовать перекрестный обмен между фетоплацентарной единицей и матерью во время беременности [см. (209)].

Доказательства подтверждают, что miRNAs, транспортируемые с помощью EVs, также играют физиологическую роль в ECs.Например, эффективность трансплантации островков у пациентов с диабетом 2 типа часто ограничивается плохой васкуляризацией трансплантата. Однако EV, происходящие из эндотелиальных клеток-предшественников, активируют ангиогенную программу в эндотелии островков, опосредованную проангиогенными miR-126 и miR-296, и, как было показано, имеют решающее значение для приживления трансплантированных островков и выживания (210). Во время атеросклероза производные EC апоптотические тельца, обогащенные miR-126, генерируются и передают паракринные «сигналы тревоги» реципиентным сосудистым клеткам, вызывая CXCL12-зависимую защиту сосудов (211).ЭВ, происходящие из клеток крови, содержащие miR-150 (более распространенные у пациентов с атеросклерозом), как было показано, проникают в эндотелиальные клетки HMEC-1, доставляя miR-150, что снижает экспрессию c-Myb и увеличивает миграцию клеток HMEC-1 (179 ). В свою очередь, происходящие из ЕС ЭВ переносили miR-143 и miR-145 в гладкомышечные клетки, вызывая атеропротекторный фенотип (212).

Хотя исследования все еще находятся в зачаточном состоянии, есть сообщения, показывающие актуальность переноса miRNA в некоторых физиологических условиях.Например, транспорт miRNAs в EVs, по-видимому, функционирует как путь коммуникации между нейронами и астроцитами в центральной нервной системе (ЦНС) (213). Другими примерами являются EV-опосредованный перенос miRNAs во время дифференцировки мышечных клеток (214), созревания фолликулов (215) или остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека (216). Кроме того, в стволовых клетках miR-126 в EV участвует в регуляции переноса гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников между костным мозгом и периферическими участками (217).Кроме того, сообщалось, что EV из эмбриональных стволовых клеток содержат большое количество miRNA, которые могут быть перенесены в эмбриональные фибробласты мыши in vitro (218). Интересно, что EVs, происходящие из преостеобластов, как было обнаружено, влияют на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток, и 20% исследованных miRNAs в грузе EV были увеличены более чем в два раза по сравнению с клетками преостеобластов (219). Несмотря на появляющиеся доказательства того, что miRNA, транспортируемые в EV, могут быть ответственны за межклеточную коммуникацию, еще предстоит определить, являются ли количества miRNA, необходимые для создания этого эффекта, достаточными для обеспечения соответствующих паракринных и / или эндокринных эффектов в отношении физиологического воздействия in vivo. и насколько распространен этот процесс in vivo [см. (220)].

Рис. 2. Механизм сортировки по кривизне.

В процессе образования почки составляющие мембраны перераспределяются в области с подходящей кривизной мембраны, чтобы минимизировать свободную энергию мембраны. Затем перераспределение компонентов мембраны отражается в отторгнутых пузырьках. В качестве примеров на этой схеме показаны тетраспанины, комплексы ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), анонимные интегральные мембранные белки данного типа, гликопротеины и белки, которые преимущественно расположены внутри и снаружи клетки. Комплекс ESCRT благоприятствует шейке зародыша и распадается после защемления пузырька. Содержимое, заключенное в мембрану везикул, становится подвижным и может достигать отдаленных клеток.

Стал ли вирус Западного Нила забытой тропической болезнью?

Образец цитирования: Ronca SE, Ruff JC, Murray KO (2021) 20-летний исторический обзор вируса Западного Нила с момента его первоначального появления в Северной Америке: превратился ли вирус Западного Нила в забытую тропическую болезнь? PLoS Negl Trop Dis 15 (5): e0009190. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009190

Редактор: Педро ФК Васконселос, Instituto Evandro Chagas, БРАЗИЛИЯ

Опубликовано: 6 мая 2021 г.

Авторские права: et © 2021 Ronca al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Авторы были частично профинансированы NIH / NIAID (U19AI089992-06) (K. O.M.), Фондом Чао (K.O.M.) и Фондом Брокмана (https://brockmanfoundation.org) (K.O.M). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Интродукция и история вируса Западного Нила в Северной Америке

Вирус Западного Нила (ВЗН) был впервые обнаружен в Уганде в 1937 году [1] и более 60 лет циркулировал в цикле передачи энзоотических комаров по всей Африке. Ближний Восток, Россия и Европа, с преобладающим штаммом линии 2 [2]. Инфекции обычно характеризовались как субклинические или вызывающие легкое лихорадочное заболевание [3].В середине 1990-х годов появился новый штамм WNV (линия 1), который привел к высокой доле неврологических инфекций с эпизоотиями в Румынии, других частях Европы, России и Израиле [2,4].

В конце августа 1999 года врач-инфекционист (доктор Дебора Аснис) из района Куинс сообщил в Департамент здравоохранения и психической гигиены Нью-Йорка (NYCDOH) 2 случая энцефалита, что привело к расследованию [5] . Подобные случаи также были быстро выявлены в соседних больницах, и NYCDOH обратилось за помощью в Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), чтобы помочь определить причину.На основании опросов пациентов и членов их семей, а также экологических проверок стало очевидно, что наиболее вероятным возбудителем болезни были комары. Первоначальный анализ сыворотки и спинномозговой жидкости (CSF) от подгруппы подозреваемых пациентов показал положительный результат на IgM-антитела против вируса энцефалита Сент-Луиса (SLEV) с помощью иммуноферментного анализа с захватом моноклональных антител (MAC-ELISA) в CDC. что привело к быстрому осуществлению мер по борьбе с комарами [6].

В то время как первоначально считалось, что массовое вымирание американских ворон (семейство Corvidae) связано со вспышкой среди людей, патобиолог штата Нью-Йорк сообщил, что эти смерти были связаны с массовыми отравлениями.Примерно через 2 недели после начала расследования NYCDOH, содержащиеся в неволе экзотические птицы в зоопарке Бронкса начали умирать от энцефалита, который, как установил патолог зоопарка, д-р Трейси Макнамара, стал причиной смерти. Ткани головного мозга этих птиц были отправлены в лаборатории национальных ветеринарных служб Министерства сельского хозяйства США (NVSL), а вирусные изоляты затем отправлены в CDC для секвенирования [7]. Секвенирование первоначально выявило штамм, наиболее вероятно связанный с WNV, первоначально называвшийся WNV-подобным, а затем подтвержденный как WNV линии 1, наиболее близкий к штамму Israel 1998 года [7].Одновременно исследователи выделили вирус из мозга пациентов, умерших от энцефалита во время вспышки, и на основе секвенирования идентифицировали флавивирус, похожий на Кунджин / Западный Нил, что дополнительно подтвердило этиологию [8]. Затем было подтверждено, что смерть ворон была вызвана WNV [6]. К октябрю 15 лошадей заболели энцефалитом на Лонг-Айленде в Нью-Йорке и оказались положительными на ВЗН. Наконец, вирус был изолирован от комаров Culex pipiens , что свидетельствует о предполагаемом переносчике вируса [9].До 1999 года WNV никогда не обнаруживали в Западном полушарии.

Ретроспективный иммуноферментный анализ IgM сыворотки и спинномозговой жидкости от пациентов с энцефалитом или менингитом, у которых ранее был выявлен SLEV, был подтвержден положительный результат на инфекцию WNV, даже у тех, у кого ранее были отрицательные или сомнительные результаты SLEV [6,10]. В конечном итоге вспышка в Нью-Йорке (NYC) в 1999 г. привела к 62 подтвержденным случаям заболевания, в том числе 7 летальным исходом [5]. Ближе к концу вспышки крупное кластерное серологическое обследование на уровне домохозяйств было проведено в наиболее пострадавшем районе Куинса [11].Исследователи определили взвешенную (с поправкой на кластеры) серологическую распространенность инфекции WNV на уровне 2,6%. Основываясь на сообщенных признаках и симптомах участников исследования, исследователи экстраполировали, что примерно 80% инфицированных протекали бессимптомно, примерно у 20% развилось неосложненное лихорадочное заболевание, и только у 1 из 140 развился более тяжелый процесс заболевания в виде энцефалита или менингита, который позже был придуман « Нейроинвазивная болезнь Западного Нила »(WNND). По оценкам этого исследования, около 8 200 человек были инфицированы WNV в Нью-Йорке во время начальной вспышки [11].

До сих пор неизвестно, как вирус был занесен в Нью-Йорк. Правдоподобные теории включают занесение инфицированных комаров через морские перевозки или авиаперевозки, зараженных перелетных птиц из Европы, инфицированных завезенных птиц или домашних животных, преднамеренную интродукцию (биотерроризм) или виремическое лицо. Хотя люди считаются тупиковыми хозяевами, последняя теория могла бы быть возможной, если бы у инфицированного человека был серьезный иммунодефицит.

Географическое появление

После вспышки в 1999 г. возникла неуверенность в способности вируса перезимовать, а затем распространиться в новые географические районы.Учитывая высокий процент смертей среди врановых, в CDC был установлен надзор за смертностью птиц в качестве средства раннего обнаружения вирусной активности и инструмента мониторинга географического распространения [12–14]. В конечном итоге, наблюдение за смертностью птиц было объединено с наблюдением за людьми, лошадьми и переносчиками в новый инструмент наблюдения под названием ArboNET, со связями карт в реальном времени, предоставленными Геологической службой США [15]. Как и предполагалось, эпиднадзор за смертностью птиц стал эффективным инструментом раннего обнаружения по мере того, как он переместился в новые географические районы, причем обнаружение гибели птиц часто предшествовало выявлению положительных случаев заражения комаров и людей [12,16–18].

В первый год после первоначальной вспышки в Нью-Йорке WNV оставался изолированным на северо-востоке, и 21 случай заражения людей был выявлен в Нью-Йорке, Нью-Джерси и Коннектикуте [19]. В 2001 г. WNV распространился географически вдоль восточного побережья: 66 случаев заболевания было выявлено в 10 штатах между Массачусетсом и Флоридой. При южном распространении вирус был обнаружен в популяциях Culex quinquefasciatus , что вызывает опасения по поводу дальнейшего эпидемического потенциала, как видно на SLEV, родственном флавивирусе [20–22]. Тем не менее, распространение и степень передачи эпидемии в 2002 году были беспрецедентными: 4 156 случаев заражения людей ВЗН в США, включая 284 смертельных случая [19], зарегистрированы на западе, в Техасе и Монтане, и на севере, в провинциях Квебек и Квебек. Онтарио, 414 зарегистрированных случаев заболевания в Канаде [23]. Эпизоотическая передача также была высокой: зарегистрировано более 15 000 случаев заражения лошадьми [24]. Во время этой эпидемии быстро стало очевидно, что ЛЗН может передаваться от человека к человеку через донорство виремической крови, трансплантацию органов, трансплацентарное перемещение и грудное молоко [25].Это побудило принять экстренные меры по разработке скрининга доноров крови для предотвращения заражения крови, который был осуществлен в 2003 году [26,27]. К 2003 году вирус был обнаружен в Culex tarsalis , и его беспрецедентное распространение продолжилось, охватив 45 штатов США, при этом было зарегистрировано 9862 случая и 264 смертельных случая [19]. Важно отметить, что общее число случаев заболевания в США в 2003 г. было несколько завышено по сравнению с предыдущими годами, поскольку CDC потребовали также сообщать в органы здравоохранения о случаях не нейроинвазивных заболеваний (например, лихорадки Западного Нила [WNF]) [13 ].Как и в США, WNV продолжил свое распространение в Канаде: на их веб-сайте здравоохранения сообщается о 5 провинциях с подтвержденными автохтонными инфекциями и 8 провинциях / территориях, в которых сообщается в общей сложности о 1481 заболевании людей. Серологические доказательства вируса были зарегистрированы у лошадей и птиц-хозяев в некоторых странах Латинской Америки и Карибского бассейна; однако случаи заражения людей были необъяснимо редкими [28].

К 2004 г. эпизоотия ВЗН распространилась по западному побережью США, а к 2012 г. все 48 континентальных штатов и округ Колумбия сообщили о местном заболевании человека [29].В период с 2002 по 2007 год WNV находился на пике эпидемии как в США, так и в Канаде (рис. 1), а затем резко снизился в период с 2008 по 2011 год. В 2012 году неожиданная эпизоотия произошла с рекордным числом случаев в Техасе [30], Луизиане, Оклахома, Арканзас, Миссисипи и Алабама [19]. Большое количество случаев (> 2000 ежегодно) продолжало регистрироваться в период с 2013 по 2018 год, что свидетельствует о высоком потенциале эпизоотических вспышек в обозримом будущем. Факторы эпизоотической передачи, включая численность комаров, круговорот популяции птиц, а также климатические условия и изменение, требуют дальнейшего изучения для прогнозирования будущих вспышек.

Филогенетика

Сдвиг в циркулирующем штамме WNV наблюдался между первоначальной вспышкой в ​​Нью-Йорке в 1999 г. и последующими вспышками с 2002 г. [2,20,31–34]. Штамм NY99 очень нейровирулентен у мышей [35]. При пассировании у хомяков этот штамм также вызывал хроническую почечную инфекцию, которая затем воспроизводилась у мышей с использованием штаммов после пассирования хомяка [36–39]. Другой штамм, WN2002, с двумя нуклеотидными различиями, был идентифицирован во время вспышки 2002 г. и продолжает циркулировать сегодня [21,34].Как описано в 20-летнем анализе доступных генотипов WNV Hadfield и его коллегами, WN02 в сочетании с SW03 вытеснил штамм NY99 в США [20,21] (Рис. 2). Некоторые исследования предполагают, что виды комаров Culex более эффективно передают штаммы вируса WN02 по сравнению со штаммами NY99 [40,41], но не все исследования согласны с этим [42–44]. На моделях мышей было обнаружено, что этот штамм WN02 вызывает вялый паралич, аналогичный тому, что наблюдается при заболеваниях человека [35]. Постоянная оценка генотипа и фенотипа штаммов, выделенных из эндемичных регионов, необходима для обеспечения соответствия штаммов, используемых в моделях на животных для оценки вакцин и терапевтических средств.

Бремя инфицирования людей ЛЗН, США

За 20 лет существования WNV в США (между 1999 и 2019 гг.) В CDC ArboNET было зарегистрировано 51 702 случая WNV, в том числе 25 227 (48,8%) WNND и 2376 (4,6%) смертельных случаев [45] . Исходя из первоначальной оценки Мосташари 1 случая WNND на каждые 140 инфекций, эти 25 227 случаев WNND предполагают почти 3,5 миллиона случаев инфицирования в США на сегодняшний день. Однако дополнительные серологические исследования показывают, что эта экстраполяция, вероятно, занижена [46–48].В исследовании, опубликованном в 2013 г. Петерсеном и его коллегами, оценивалась совокупная заболеваемость ВЗН среди взрослых в США с 1999 по 2010 г., применяя методы Карсона и его коллег [47], и было установлено, что 3 миллиона взрослых, вероятно, были инфицированы ВЗН в течение этого периода времени [49]. . Поскольку примерно 40% всех случаев WNND произошли после исследования Петерсена, и их исследование не отражало инфекции детей, наша команда обновила расчетное количество случаев во всех возрастных группах с 1999 по 2016 год, используя методы Петерсена, но включая детей, по оценке Мандалакас и его коллеги [48].В этом исследовании мы оценили почти 7 миллионов случаев инфицирования WNV в континентальной части США. Это, вероятно, заниженная оценка, поскольку несколько исследований, оценивающих частоту тестирования, определили, что только примерно 40% случаев, соответствующих критериям WNND, тестируются при обращении в медицинское учреждение [50,51].

Понимание истинного бремени WNV имеет решающее значение. Определенные группы населения особенно уязвимы к инфекции, включая бездомных и других, затронутых социально-экономическими детерминантами [52–56] и тяжелыми заболеваниями, в том числе пожилые люди и люди с сопутствующими заболеваниями [5].Эпидемиологические исследования описывают тяжелые и хронические последствия инфекций WNV, особенно у лиц с WNND, когда до 40% пациентов не могут вернуться к своему исходному состоянию здоровья [57]. Понимание истинного бремени также предоставит ценные данные для оценки политики общественного здравоохранения по контролю и профилактике заболеваний, а также для определения потребности в инвестициях в клинические испытания для разработки вакцин и терапевтических средств.

Стоимость Западного Нила

В связи с высокой распространенностью и эндемичностью WNV в Северной Америке необходимо понимать, какое бремя несет система здравоохранения и какое влияние оказывает на экономику. Zohrabian и его коллеги определили краткосрочные затраты на WNV в Луизиане с июня 2002 г. по февраль 2003 г. в размере 10,9 млн долларов США, из которых 4,4 млн долларов США — медицинские расходы и 6,5 млн долларов США — немедицинские затраты, такие как потеря производительности [58]. В аналогичном исследовании Барбер и его коллеги [59] оценили затраты, связанные со вспышкой ВЗН в 2005 г. в округе Сакраменто, Калифорния. Эта вспышка среди 163 человек обошлась примерно в 2,98 миллиона долларов США, включая борьбу с переносчиками болезней (примерно 702 000 долларов США), медицинские расходы на лечение и снижение производительности.Они определили, что необходимо предотвратить только 15 случаев WNND, чтобы меры по борьбе с переносчиками считались рентабельными [59]. Исследование, проведенное в Квебеке, Канада, определило затраты для региона с 2012 по 2013 год [60]. В этом исследовании 90 пациентов были оценены ретроспективно, и средние затраты составили 21 330 долларов США на пациента с энцефалитом, 8 124 доллара США на пациента с менингитом и 192 доллара США на пациента с WNF. В целом, по их оценкам, в 2012 г. было израсходовано около 1,7 миллиона долларов США на 124 симптоматических случая и 430 000 долларов США на 31 симптоматический случай [60].Пройдя немного дальше, Стейплс и его коллеги оценили как краткосрочные, так и долгосрочные затраты, связанные со вспышкой, охватившей 80 случаев заболевания в Колорадо в 2003 году. Важно выделить диапазон затрат для этих пациентов, поскольку затраты на неотложную помощь варьируются от примерно от 4000 до 325000 долларов США для случаев энцефалита, примерно от 5000 до 283000 долларов США для острого вялого паралича (ОВП), примерно от 1000 до 15000 долларов США для менингита и примерно от 500 до 24000 долларов США для WNF, поскольку это подтверждает крайний и уникальный сценарии, которые могут испытать пациенты.При оценке долгосрочных затрат диапазоны составляют примерно от 0 до 24 000 долларов США для случаев энцефалита (вероятно, из-за более высокого уровня смертности, чем другие), примерно от 600 до 440 000 долларов США для ОВП, примерно от 0 до 261 000 долларов США для менингита и примерно от 0 до 41 000 долларов США для WNF. Эти долгосрочные затраты включают посещение врача и оборудование, лекарства, долгосрочное лечение и потерю производительности, но нам не хватает информации, чтобы понять, как параметры острой инфекции, такие как продолжительность пребывания в больнице, могут повлиять на долгосрочные затраты.Используя свои расчеты для этих пациентов, они оценили общую стоимость WNV с 1999 по 2012 год в США примерно в 778 миллионов долларов США с доверительным интервалом от 673 миллионов долларов США до 1,01 миллиарда долларов США [61]. Ежегодно это равняется 56 миллионам долларов США, потерянным WNV.

Исследование экономической эффективности вакцин, проведенное Зограбианом и его коллегами, показало, что универсальная программа вакцинации в США вряд ли приведет к экономии [62]. Однако это исследование было проведено в начале внедрения WNV и оценивало бремя случаев заболевания с 1999 по 2004 год.В то время было зарегистрировано примерно 16 000 случаев и 7 000 случаев WNND. Крупная вспышка 2012 г. надвигалась, но неожиданно. Авторы обсуждали, что риск заражения, вероятность симптоматического заболевания и стоимость вакцинации имеют решающее значение для оценки экономической эффективности. С тех пор, как это исследование было опубликовано в 2006 году, эти факторы изменились. Кроме того, мы должны учитывать потребности в вакцинах в регионах с низкой плотностью населения, где борьба с комарами менее осуществима на больших территориях.

Трудно интерпретировать, повлияло ли это исследование напрямую на будущий прогресс разработки вакцин против WNV или на инвестиции в коммерциализацию имеющихся вакцин. Спустя более 10 лет, в 2017 году, Стейплс и его коллеги [61] оценили рентабельность целевой вакцинации и пришли к выводу, что вакцинация на основе возраста может быть наиболее экономически эффективным методом борьбы с ВЗН, но нам еще предстоит увидеть, чтобы вакцина достигла широкого распространения. рынок, чтобы оценить его в полной мере.

Разработка вакцины

Быстрое распространение WNV по Северной Америке в начале 2000-х годов и высокая стоимость заболеваемости вызвали большой интерес к разработке вакцины WNV как для людей, так и для других животных, особенно для лошадей. Инактивированная цельновирусная вакцина была быстро разработана и лицензирована для ветеринарного использования в 2003 г. [64]. В ближайшие годы были одобрены различные вакцины для лошадей, в том числе первая ДНК-вакцина, лицензированная Министерством сельского хозяйства США (USDA) в 2005 г. [64] (пресс-релиз: https://www.cdc.gov/media/ прессрел / r050718.htm).

Ряд кандидатных вакцин для человека все еще находится на доклинических стадиях разработки [63]. На сегодняшний день в ClinicalTrials зарегистрировано 9 клинических испытаний по оценке кандидатов вакцины против ВЗН для человека.gov, при этом были исследованы только 6 отдельных агентов (Таблица 1). До сих пор ни одно испытание на людях не продвинулось дальше фазы II.

Первым агентом, прошедшим клинические испытания фазы I, была живая аттенуированная химерная вакцина Западного Нила-Денге. Три исследования фазы I для этой вакцины-кандидата были зарегистрированы на сайте ClinicalTrials.govhttp: //clinicaltrials.gov/ в 2004, 2007 и 2014 годах. Эта химерная вакцина основана на вакцине-кандидате DENV-4 rDEN4delta 30 с prM и E гены белков заменены генами штамма WNVNY99 [65].Минимальные побочные эффекты наблюдались во время всех 3 испытаний фазы I. Исследования 2004 и 2007 годов продемонстрировали сероконверсию примерно у 75% вакцинированных участников в возрасте от 18 до 50 лет после одной дозы 10 3 или 10 4 бляшкообразующих единиц (БОЕ). Более высокая доза 10 5 БОЕ приводила к более низкому уровню сероконверсии (55%), но была увеличена до 89% после 6-месячной ревакцинации [65]. В исследовании 2014 года среди взрослых в возрасте от 50 до 65 лет у 19/20 (95%) субъектов произошла сероконверсия после одной дозы 10 4 БОЕ.Снова была введена 6-месячная ревакцинация, но она не привела к значительному увеличению титра антител и, следовательно, считалась ненужной [66].

В 2005 и 2006 годах на 2 фазе испытаний началось изучение использования ДНК-вакцины, аналогичной той, которая была одобрена для использования на животных. Вакцины на основе нуклеиновых кислот кодируют специфические антигенные субъединицы патогена и привлекают клетки-хозяева для продуцирования этих антигенов. Это привлекательная технология, поскольку она может обеспечить длительный иммунитет без введения какой-либо части патогена, кроме антигена, тем самым обеспечивая специфический иммунный ответ без риска реактивации ослабленного живого вируса [67].Оба этих кандидата в вакцины кодируют одни и те же белки prM и E, используемые в химерном кандидате, описанном выше, хотя один включает модифицированную версию компонента промотора гена [67,68]. Оба испытания сообщают о легких побочных эффектах, связанных с вакцинами, и благоприятных иммунных ответах. Более поздняя версия, которая включала модифицированный промотор гена, действительно вызывала более сильный клеточный и гуморальный иммунный ответ [68].

Кроме того, рекомбинантная субъединичная вакцина с адъювантом была зарегистрирована для клинических испытаний в 2008 году и запатентована Hawaii Biotech в 2018 году, хотя отчета о результатах клинических испытаний на людях не публиковалось. Другой, внесенный в список в 2015 году, исследовал инактивированную цельновирусную вакцину HydroVax-001, которая, как было обнаружено, в целом хорошо переносится при концентрации как 1 мкг, так и 4 мкг в последовательности из 2 доз. Как и ожидалось с вакциной на основе инактивированного вируса, при тестировании через 4 дня после каждого введения ни у одного участника не было обнаружено виремии, но сероконверсия через PRNT 50 при более низкой дозе не вызывалась, и только 31% сероконверсии произошел после более высокой дозы. Специфический ответ ELISA был немного лучше, достигая 41% сероконверсии после второй дозы 1 мкг и 75% после дозы 4 мкг [69].

Только одна вакцина-кандидат прошла в фазу II клинических испытаний. Это агент ChimeriVax-WN002, еще один живой аттенуированный химерный вирус. Этот вирус также содержит гены белков prM и E из NY99, но построен на основе вируса желтой лихорадки 17D. Благоприятный профиль безопасности у взрослых был продемонстрирован в исследовании фазы I [70], а у пожилых людей — в 2 исследованиях фазы II [63,71]. Виремия была низкой и не ассоциировалась с нежелательными явлениями ни в одной возрастной группе. По крайней мере, 4-кратное увеличение титров антител наблюдалось у> 90% всех пролеченных участников в обоих исследованиях фазы II [63,71].

Эти предварительные испытания продемонстрировали, что все существующие вакцины-кандидаты в целом хорошо переносятся и обладают различной иммуногенностью, однако прогресс в лицензировании для использования людьми со временем застопорился. Препятствия для продвижения этих испытаний могут включать финансовые проблемы и нормативные требования, которые может быть трудно оправдать из-за большого количества добровольцев и ресурсов, необходимых в случае спорадических вспышек WNV.

Терапия

Параллельно с задержкой с утверждением вакцины также не существует специальных терапевтических средств для лечения инфекций, вызванных WNV.В ряде серий случаев и тематических исследований описывается использование интерферона, рибавирина и кортикостероидов [72–77], но отчеты неубедительны, и никакие клинические испытания официально не оценивали эти варианты. Фактически, только 3 агента были зарегистрированы для клинических испытаний в США. В ходе исследования фазы I / II, зарегистрированного в 2003 году, изучали Omr-IgG-am, который представляет собой соединение внутривенного иммуноглобина (ВВИГ) с высоким титром против WNV, одобренное для использования в Израиле. В этом испытании была когорта с низкой и высокой дозой, и его контролировали с помощью активного плацебо IVIG (Polygam S / D) и пассивного плацебо в виде физиологического раствора.Не было отмечено значительных различий между группами лечения, активного плацебо или пассивного плацебо в отношении побочных эффектов или 90-дневного исхода. К сожалению, это испытание столкнулось с множеством проблем с набором участников и получением как исследуемого препарата, так и активного плацебо, поэтому оно было прекращено до достижения целевого набора, а группа лечения с более высокими дозами была прекращена [78].

Затем, в 2004 году, Sarepta Therapeutics зарегистрировала испытание по изучению фосфородиамидат-морфолиноолигомера (PMO) агента AVI-4020. PMO представляют собой аналоги нуклеиновых кислот, которые в контексте WNV могут использоваться для блокирования трансляции вирусных белков, тем самым предотвращая репликацию вируса [79]. На момент написания этой статьи компания установила, что AVI-4020 присутствует в спинномозговой жидкости здоровых добровольцев в течение 18 часов после приема однократной дозы [80], но не было опубликовано никаких отчетов об испытании, посвященном использованию в WNND.

Последним агентом, зарегистрированным для клинических испытаний в США, является моноклональное антитело MGAWN1. Исследование фазы I с 2007 по 2009 год показало, что этот препарат в целом хорошо переносился 40 здоровыми участниками после однократного внутривенного введения в диапазоне от 0.От 3 мг / кг до 30 мг / кг. Было обнаружено, что у одного участника выработались антитела против MGAWN1 через 3 месяца после воздействия препарата. Авторы сообщают, что это могло повлиять на эффективность препарата для этого участника, но, поскольку разовая доза, по-видимому, обеспечивает достаточное покрытие на время острого заболевания, считается, что это не представляет большого риска для реакций чувствительности [81] . Учитывая очевидный успех исследования фазы I, в 2009 году началось исследование фазы II того же препарата.Однако, как и испытание OMR-IgG-am, оно было прекращено досрочно из-за низкой посещаемости. Все исследования сведены в Таблицу 2.

Одним из факторов, которые авторы исследования Omr-IgG-am называют препятствием для регистрации, был длительный период, необходимый для получения одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) для каждого клинического центра. В настоящее время каждое клиническое учреждение, участвующее в исследовании, должно иметь независимое одобрение IRB, что может занять до 6 месяцев. Это исключает регистрацию любых острых случаев, которые присутствуют в больнице или клинике, которые еще не одобрены.Эти авторы утверждают, что наличие одного централизованного IRB облегчило бы своевременный набор участников из самых разных клинических центров [78]. Кроме того, спорадическое возникновение многих случаев WNND может затруднить достижение необходимого целевого набора.

Диагностика

В нескольких исследованиях задокументирована недостаточная диагностика ЛЗН [27,50,82] с превалирующими и разнообразными препятствиями для диагностики. У большинства инфицированных наблюдается легкое течение болезни с небольшими преходящими признаками и симптомами или их отсутствие (субклиническое заболевание) [83].Существует мало возможностей диагностировать эти случаи, поскольку их симптомы недостаточно серьезны, чтобы они могли обратиться за медицинской помощью. Эти пропущенные случаи не только усложняют расчет оценок заболеваемости и распространенности, но также вызывают озабоченность по поводу передачи через продукты крови, предоставленные бессимптомными виремическими донорами. В ответ на эту озабоченность в 2003 г. были инициированы требования по скринингу кровоснабжения США на вирусную РНК [26,27]. С тех пор эпиднадзор за предполагаемыми виремическими донорами крови со стороны общественного здравоохранения стал важным ресурсом для определения частоты бессимптомных и субклинических инфекций [46,84].

Даже клинически очевидные инфекции сталкиваются с проблемами диагностики. WNF — это слабо выраженный синдром, напоминающий грипп и другие вирусные синдромы [83,85]. Крупное исследование доноров крови в США показало, что только 38% субъектов, которые были положительными на ВЗН и имели симптомы, обращались за медицинской помощью, и только 5% из них имели формальный диагноз ВЗН [27]. Пациенты с нейроинвазивными проявлениями (WNND) чаще получают диагноз, чем пациенты с WNF, в основном потому, что серьезность признаков и симптомов требует медицинской помощи, а окончательный диагноз активно проводится.Клиническое тестирование на ВЗН проводится примерно в 40% случаев заражения ВЗН-совместимым менингитом и энцефалитом у взрослых [50,51] и примерно в 25% совместимых педиатрических случаев [50]. Пациенты с энцефалитом с большей вероятностью будут проверены на ВЗН, чем пациенты с менингитом, хотя, по оценкам, на менингит приходится от 30% до 50% случаев БЗН [50]. Недостаточная диагностика WNV дополнительно проиллюстрирована в ходе многоцентрового анализа больничных тестов WNV среди пациентов с менингитом и энцефалитом.В этом исследовании 84% пациентов, у которых группа исследователей обнаружила, что они имеют положительный эффект на ВЗН IgM в спинномозговой жидкости, прошли тестирование на ВЗН в рамках диагностической работы, но 25% пациентов, прошедших клиническое тестирование, были пропущены из-за неадекватного тестирования [82].

В настоящее время наиболее широко используемым методом диагностики ВЗН является обнаружение антител IgM к ВЗН в сыворотке или спинномозговой жидкости. У этого метода есть несколько важных недостатков. Во-первых, известно, что флавивирусы вырабатывают антитела, которые обладают перекрестной реактивностью с другими флавивирусами, поэтому рекомендуется подтверждать все диагнозы, поставленные таким образом, путем отправки образцов сыворотки крови в остром периоде и в период выздоровления в референс-лабораторию для проведения тестов нейтрализации уменьшения образования бляшек (PRNT). ).Этот дополнительный этап должен выполняться в лаборатории с уровнем биобезопасности 3 (BSL-3) [86], что может быть неудобным и отнимать много времени. Альтернативно, для использования PRNT доступны псевдотипные вирусы, что дает возможность обойти необходимость сдерживания BSL-3 [87]. Во-вторых, антитела IgM появляются в сыворотке крови между 3 и 8 днями после появления симптомов, поэтому возможно, что раннее тестирование может дать ложноотрицательный результат. Антитела IgM к WNV могут сохраняться в сыворотке крови в течение многих лет после острой инфекции [88,89], при этом в одном исследовании сообщается об обнаруживаемых уровнях IgM в течение 8 лет после инфицирования примерно у 20% участников [90].Кроме того, доступные в настоящее время тесты для выявления WNV IgM не обладают высоким уровнем чувствительности, только 54% ​​для ELISA и 45% для иммунофлуоресцентного анализа (IFA), а показатели чувствительности и специфичности могут варьироваться в зависимости от вирусных клонов [91]. Это значительно снижает диагностическую ценность этого теста в острых условиях, поскольку нельзя быть уверенным, что отсутствие IgM исключает диагноз ЛЗН или его присутствие указывает на острую инфекцию.

Ограничения тестирования были важным фактором в обеспечении адекватного скрининга донорской крови.Тестирование нуклеиновых кислот (NAT) донорской плазмы используется для скрининга донаций крови в США с 2003 года. Мини-бассейны, состоящие из нескольких донорских образцов, обычно тестируются в первую очередь (MP-NAT), а реактивные пулы дополнительно исследуются с помощью индивидуального тестирования донации (ID- NAT) каждого образца, включенного в пул. Поскольку ID-NAT более чувствителен, чем MP-NAT, существуют протоколы, позволяющие лабораториям переключаться на ID-NAT в условиях высокой активности WNV. За годы, прошедшие после внедрения этих методов скрининга, идентификация ряда связанных с переливанием передач WNV вызвала интерес к распределению вирионов в различных компонентах крови.В исследовании 2007 года, проведенном учеными Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), использовалась полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для оценки вирусной нагрузки в компоненте красных кровяных телец (RBC) по сравнению с компонентом плазмы, и было обнаружено, что вирусная нагрузка составляла один порядок по величине выше в компоненте эритроцитов [92]. Другие продолжили это исследование и подтвердили, что РНК ВЗН присутствует в компоненте эритроцитов до 3 месяцев [93]. Интересные теории, возникшие в результате этого исследования, включают то, что прикрепление вирусов к эритроцитам происходит примерно во время сероконверсии [86] и что группа крови может влиять на способность вирионов прикрепляться к белкам на клеточной мембране [93].Включение ПЦР цельной крови с тестированием на IgM может иметь решающее значение для своевременного и экономичного выявления случаев заболевания в будущем.

ОТ-ПЦР использовалась для идентификации РНК ВЗН в других типах образцов, включая спинномозговую жидкость, мочу и слюну [82,94–97]. Тестирование на вирусную РНК в спинномозговой жидкости, по-видимому, имеет ограниченную ценность, поскольку в некоторых отчетах утверждается, что его часто невозможно обнаружить во время появления симптомов [82]. Это может помочь объяснить, почему только 16,6% образцов от пациентов, которым был поставлен диагноз ЛЗН с помощью других методов, были положительными в спинномозговой жидкости после ОТ-ПЦР [97].На сегодняшний день только одно исследование изучило присутствие РНК ВЗН в слюне. Он был обнаружен только у 1 из 10 участников и сохранялся примерно до 9 дней после начала заболевания [95]. В нескольких исследованиях изучалась полезность тестирования РНК ВЗН в моче [94,95,97], и хотя он, по-видимому, работает лучше, чем слюна и спинномозговая жидкость, наилучшая зарегистрированная оценка чувствительности составила 58,3% [97]. Что касается тестирования цельной крови, результаты этих исследований согласуются с ранее процитированной работой. Было обнаружено, что цельная кровь имеет чувствительность 86.8% [97], а модель распределения Вейбулла, основанная на банках образцов из когорты Западного Нила Хьюстона, показала, что большинство серийных образцов цельной крови были положительными на РНК WNV примерно до 3 месяцев после появления симптомов (50% отрицательных на 79 день и 95% отрицательных на 119 день) [95].

Заболевание, которым не уделяют должного внимания: грантовое финансирование и публикации со временем

В течение последних двух десятилетий ВЗН обсуждался как развивающееся инфекционное заболевание, но мы и другие находим доказательства, подтверждающие его обозначение как забытое заболевание.Хотя исследования продолжаются, стандарты ухода по-прежнему ограничиваются только поддерживающими мерами без проверенных терапевтических целей или профилактических вакцин. Когда грантовое финансирование, направленное на эти усилия со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH), оценивалось с помощью инструмента RePORTER, около 67 миллионов долларов США было направлено на исследования, связанные с WNV с 2000 по 2019 год (примерно 3,4 миллиона долларов США в год), хотя некоторые из этого было посвящено общему исследованию флавивирусов. Количество заявок на гранты, финансируемых NIH в год с того времени, также может быть записано (рис. 3), при этом большинство этих грантов составляют R01, за ними следуют небольшие гранты, такие как R03 и R21, с наименьшим объемом финансирования, обнаруженным в развитии карьеры. награды.Для сравнения, за тот же период NIH наградил более 922 миллионов долларов США на исследования вируса Зика, при этом более 99% наград было получено в период с 2016 по 2019 год (примерно 230 миллионов долларов США в год).

Поиск PubMed исследования «вирус Западного Нила» в заголовках проиндексированных статей дает 3978 статей (рис. 4). Эти статьи охватывают период с 1946 года по начало ноября 2019 года и посвящены статьям, в которых подробно исследуются аспекты ЛЗН, будь то экология, эпидемиология, генетика, последствия, терапевтические разработки или другие важные аспекты процесса болезни.

WNV не только широко исследовался сам по себе, но также использовался в качестве инструмента или руководства для определения механизмов и результатов связанных флавивирусных инфекций. Фактически, если этот поиск PubMed будет расширен за счет включения «вируса Западного Нила» как в заголовки, так и в абстрактные поля, по состоянию на начало ноября 2019 года можно будет найти 6 229 результатов. Многие из этих дополнительных примерно 2000 статей ссылаются на пути или результаты WNV в качестве ориентира. принцип исследования, которое стремились завершить их команды.Интересно отметить, что при сравнении публикаций WNV с другим флавивирусом — вирусом Зика — за период с 2016 по 2019 год в заголовке примерно 3600 статей упоминается вирус Зика. меньше, чем у других, недавно возникших и родственных инфекций.

Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *