128 1 ч 1 ук рф: Привлечение к уголовной ответственности по статье 128.1 Уголовного кодекса Российской Федерации БАРНАУЛ

Содержание

О клевете в уголовном праве

Клевета, в качестве уголовно-наказуемого деяния была декриминализирована федеральным законом №420 от 07.12.2011 и вновь признана преступлением федеральным законом №141 от 28.07.2012, что свидетельствует о высокой общественной значимости данного преступления.

Объектом клеветы выступают общественные отношения, складывающиеся по поводу реализации человеком естественного, гарантированного нормами международного и конституционного законодательства права на достоинство, честь и репутацию. Достоинство личности представляет отражение в индивидуальном сознании человека его собственных качеств, способностей, мировоззрения, социальной ценности и значимости, честь — отражение личностных (моральных) свойств и качеств человека в общественном сознании и репутация — отражение социальных свойств и качеств человека в общественном сознании тесно взаимосвязаны и в совокупности составляют предмет охраны рассматриваемой уголовно-правовой нормы.

Честь и достоинство личности охраняются как в гражданско-правовом, так и в уголовно-правовом порядке. При этом отмена решения по гражданскому делу по иску о защите чести и достоинства при отсутствии других обстоятельств не может являться основанием для отказа в возбуждении уголовного дела.

Потерпевшим от клеветы может выступать любое лицо вне зависимости от его способности воспринимать и осознавать смысл и значение распространяемых в отношении его сведений (малолетний, душевнобольной и др.).

Клевета может состоять в распространении заведомо ложных сведений как об одном, так и о нескольких лицах. Согласно закону потерпевшим от клеветы всегда является «другое» лицо, в связи с чем распространение человеком заведомо ложных сведений о самом себе, даже если оно причиняет вред правам и законным интересам третьих лиц, не может образовывать состав клеветы.

Не может квалифицироваться по ст. 128.1 УК РФ и распространение заведомо ложных сведений, подрывающих деловую репутацию юридического лица и иных корпоративных образований; защита их репутации осуществляется в гражданско-правовом порядке.

Объективная сторона клеветы характеризуется действиями, состоящими в распространении заведомо ложных сведений, порочащих честь и достоинство другого лица или подрывающих его репутацию.

Отличительные признаки состава характеризуют распространяемые виновным сведения: они должны быть ложными и порочащими другого человека.

Не соответствующими действительности (заведомо ложными) сведениями являются утверждения о фактах или событиях, которые не имели места в реальности во время, к которому относятся распространяемые сведения. Эти сведения могут относиться лишь к фактам прошлого или настоящего; измышления о позорящих фактах, которые могут наступить в будущем, состава клеветы не образуют. Распространяемые при клевете сведения должны в деталях либо в общих чертах характеризовать какой-либо конкретный факт, при этом они могут прямо указывать на событие или содержать косвенную информацию о нем. Заявления общего характера, не содержащие указания на определенный ложный факт (например, выражения «вор», «мошенник», «взяточник», «подлец» и др.

), не образуют состава клеветы.

Не могут рассматриваться как не соответствующие действительности сведения, содержащиеся в судебных решениях и приговорах, постановлениях органов предварительного следствия и других процессуальных или иных официальных документах, для обжалования и оспаривания которых предусмотрен иной установленный законами судебный порядок.

Согласно ст. 128.1 УК РФ уголовная ответственность за клевету наступает в том случае, если виновный заведомо осознавал ложность сообщаемых им сведений, порочащих честь и достоинство других лиц или подрывающих их репутацию, и желал их распространить. Если гражданин уверен в том, что сведения, которые он распространяет, содержат правдивые данные, хотя на самом деле они ложные, он не может нести уголовную ответственность по указанной статье УК РФ. Исключается признак заведомой ложности в ситуациях, когда человек высказывает свое, не соответствующее действительности суждение о факте, который реально имел место, либо в ситуации, когда, распространяя те или иные сведения, человек добросовестно заблуждается об их ложности.

Для установления признаков состава клеветы необходимо, чтобы распространяемые о потерпевшем ложные сведения порочили его честь, достоинство и репутацию. Порочащими, в частности, являются сведения, содержащие утверждения о нарушении гражданином или юридическим лицом действующего законодательства, совершении нечестного поступка, неправильном, неэтичном поведении в личной, общественной или политической жизни, недобросовестности при осуществлении производственно-хозяйственной и предпринимательской деятельности, нарушении деловой этики или обычаев делового оборота, которые умаляют честь и достоинство гражданина или деловую репутацию гражданина либо юридического лица. Если распространяемые, хотя и ложные, сведения не позорят потерпевшего, состав клеветы отсутствует.

Под распространением сведений, порочащих честь, достоинство или деловую репутацию граждан, следует понимать опубликование таких сведений в печати, трансляцию по радио и телевидению, демонстрацию в кинохроникальных программах и других средствах массовой информации, распространение в сети Интернет, а также с использованием иных средств телекоммуникационной связи, изложение в служебных характеристиках, публичных выступлениях, заявлениях, адресованных должностным лицам, или сообщение в той или иной, в том числе устной, форме хотя бы одному лицу

Сообщение таких сведений лицу, которого они касаются, не может признаваться их распространением, если лицом, сообщившим данные сведения, были приняты достаточные меры конфиденциальности, с тем чтобы они не стали известными третьим лицам.

Состав преступления, предусмотренный ст. 128.1 УК РФ, является формальным; клевета окончена с момента распространения указанных сведений вне зависимости от того, были ли они восприняты потерпевшим и причинили ли какой-либо вред его физическому, психическому здоровью. Восприятие сведений и осознание факта их распространения потерпевшим или его законными представителями значимы лишь в процессуальном плане, поскольку служат условием их обращения в суд. В соответствии с ч. 2 ст. 20 УПК РФ уголовные дела о клевете считаются уголовными делами частного обвинения и возбуждаются не иначе как по заявлению потерпевшего, его законного представителя и подлежат прекращению в связи с примирением потерпевшего с обвиняемым.

Субъективная сторона клеветы выражена умышленной формой вины. Совершая деяние, субъект осознает общественную опасность своих действий, заведомо понимает ложность распространяемых сведений, а также то, что эти сведения порочат честь и достоинство другого лица, подрывают его репутацию. Мотивы и цели преступления (месть, личная неприязнь и т.д.) не влияют на квалификацию, но могут учитываться при индивидуализации уголовного наказания.

Закон предусматривает несколько квалифицированных составов клеветы.

Более строгое наказание следует за клевету, содержащуюся в публичном выступлении, публично демонстрирующемся произведении или средствах массовой информации (ч. 2 ст. 128.1 УК РФ).

Публичность как признак клеветы предполагает открытость, доступность распространяемых сведений, их способность быть воспринимаемыми неопределенным кругом лиц. Публичная клевета может состоять в распространении заведомо ложных сведений либо непосредственно в присутствии публики (зрителей, слушателей и т.п.), либо в такой форме или таким способом, что они становятся или могут стать известными многим людям (например, путем публичной демонстрации надписей, рисунков и др.). Количество присутствующих или воспринявших клевету не имеет решающего значения, главное здесь — открытость, гласность, обращенность сведений ко многим людям.

С публичной клеветой к другим лицам субъект может обратиться устно, письменно, с использованием различных изобразительных форм, наглядно-демонстрационным способом, с помощью технических средств.

В ч. 3 ст. 128.1 УК РФ установлена повышенная ответственность за клевету, совершенную с использованием своего служебного положения. Клевета о том, что лицо страдает заболеванием, представляющим опасность для окружающих, а равно клевета, соединенная с обвинением лица в совершении преступления сексуального характера, влечет ответственность по ч. 4 ст. 128.1 УК РФ.

Под заболеваниями, представляющими опасность для окружающих, следует понимать болезни, включенные в соответствующий список на основании Постановления Правительства РФ от 1 декабря 2004 г. N 715 «Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих». Таковыми, в частности, признаются: болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусные лихорадки, передаваемые членистоногими, и вирусные геморрагические лихорадки, гельминтозы, гепатит B, гепатит C, дифтерия, инфекции, передающиеся преимущественно половым путем, лепра, малярия, педикулез, акариаз и другие инфестации, сап и мелиоидоз, сибирская язва, туберкулез, холера, чума.

Клевета, соединенная с обвинением лица в совершении тяжкого или особо тяжкого преступления, образует особо квалифицированный состав преступления (ч. 5 ст. 128.1 УК РФ).

В ситуации, когда клевета является систематической, носит характер травли и служит способом доведения лица до самоубийства, она не требует самостоятельной квалификации и охватывается составом преступления, предусмотренного ст. 110 УК РФ.

клевета состав преступления 128 1 – Profil – Groupe des Ulis Forum

Для просмотра нажмите на картинку

Читать далее

Смотреть видео

Статья 128.

1 УК РФ. Клевета
Ст.128 УК РФ: «клевета»
Статья 128.1. Клевета
Клевета (статья УК РФ) — комментарии Федерального Судьи / Юргруппа МИП
О клевете в уголовном праве
Клевета (ст. 128.1 УК). Как привлечь к ответственности за клевету? Деловая репутация и сплетни
Клевета: статья и наказание в 2021 году
Какое наказание за клевету на человека статья УК РФ 128.1

Недорогие фидерные удилища и катушки для них

Состав преступления, предусмотренный ст. УК РФ, является формальным; клевета окончена с момента распространения указанных сведений вне зависимости от того, были ли они восприняты потерпевшим и причинили ли какой-либо вред его физическому, психическому здоровью. Восприятие сведений и осознание факта их распространения потерпевшим или его законными представителями значимы лишь в процессуальном плане, поскольку служат условием их обращения в суд.
Состав преступления является формальным — клевета окончена с момента распространения указанных сведений вне зависимости от того, причинили они какой-либо вред охраняемым законом интересам потерпевшего.
(Статья дополнительно включена с 10 августа года Федеральным законом от 28 июля года N ФЗ). Состав преступления: 1) объект: основной — общественные отношения, связанные.
Состав преступления формальный, преступление признается оконченным с момента распространения ложных сведений хотя бы одному лицу. предусмотрена ответственность за клевету, соединенную с обвинением лица в совершении тяжкого или особо тяжкого преступления (ч. Особо квалифицированный вид клеветы необходимо отличать от заведомо ложного доноса, соединенного с обвинением лица в совершении тяжкого или особо тяжкого преступления (ч.
Факт совершения преступления должен быть доказан. Доказательство наказания регулируется статьей Уголовным Кодексом РФ.
Федерального закона от N ФЗ) (см. текст в предыдущей редакции) 1. Клевета, то есть распространение заведомо ложных сведений, порочащих честь и достоинство другого лица или подрывающих.
Специализируемся по статье УК РФ. Профессиональные разъяснения. Неограниченное время консультации. Клевета – бесплатные ответы юристов онлайн. Клевета и потерпевшие от нее. Таким образом, по УК РФ преступление имеет формальный состав и является совершенным только тогда, когда данные сведения были переданы хотя бы одному лицу. В УК РФ говорится о том, что если гражданин осуществляет распространение ложных данных о другом лице и добросовестно заблуждается в их правильности, то в данном случае состава клеветы и преступления нет.
Потерпевшим от клеветы может стать только физическое лицо. То есть ему было известно об отсутствии нарушений или преступлений, а целью обращения было навредить тому, о ком в нем сообщалось. Чем может обернуться клевета? УК РФ состоит из 5 частей. Ими закреплены меры ответственности за клевету в зависимости от формы и содержания, которые влияют на размер наказания, так как усиливают опасность деяния для общества. Частью 1 статьи определено наказание за простую клевету.
Cостав преступления предусмотренный ч.1 ст УК РФ. Обстоятельства отягчающими вину по ст УК РФ. Какое наказание за клевету? Данные статистики преступлений по ст УК РФ. Статья за клевету существовала в УК РФ еще с года, однако в году данное деяние было переведено из разряда уголовных в категорию административных правонарушений. Всего через 8 месяцев обновленная статья вернулась в Уголовный Кодекс РФ, поскольку ее декриминализация привела к значительному росту подобных нарушений. В настоящее время статья УК РФ – единственная, по которой число оправдательных приговоро.
Преступление о клевете могут быть как частного обвинения, так и публичного. Если в отношении вас совершено преступление по части первой статьи УК РФ, то это дело частного обвинения и вам будет необходимо самому писать заявление в суд и принимать участие во всех судебных заседаниях, представляя доказательства и поддерживая обвинение фактически заменяя прокурора. Если в отношении вас совершено преступление любой другой части статьи УК РФ, то это дело публичного обвинения и для его возбуждения необходимо написать заявление в полицию и в случае если по результатам проверки в действиях.

СМИ о СК — Следственный комитет Российской Федерации

Украинского чиновника подозревают сразу по пяти статьям УК РФ

«Помимо этого период вооруженного конфликта на юго-востоке Украины сотрудники СБУ по указанию Наливайченко пытали, истязали и жестоко избивали захваченных в плен мирных жителей, не поддерживающих киевскую власть», — заявил официальный представитель СКР Владимир Маркин. «И не нужно быть Цицероном, чтобы понимать, что справедливость проявляется в воздаянии каждому по его заслугам», — добавил он.

Следственный комитет России возбудил уголовное дело в отношении главы Службы безопасности Украины Валентина Наливайченко. Как сообщил официальный представитель ведомства Владимир Маркин, украинского чиновника подозревают по пяти статьям УК РФ: ч 2, 3, 5 ст.128-1, ч.3 ст.33, ч.1 ст.356, ч.3 ст.144, п.«а» ч.3 ст.126 УК РФ (клевета, организация применения запрещенных средств и методов ведения войны, воспрепятствования законной профессиональной деятельности журналиста, похищения человека), предусматривающим наказания до 20 лет лишения свободы.

По версии следствия, Наливайченко, действуя согласованно с руководителями силовых структур Украины, используя силы и средства СБУ, в ходе вооруженного конфликта в Донбассе организовал похищение не участвовавших в вооруженном конфликте журналистов российского телеканала LifeNews Олега Сидякина и Марата Сайченко, которые незаконно удерживались до 25 мая 2014 года на территории Украины, при этом «потерпевшим причиняли физические и психические страдания путем систематического нанесения побоев и иных насильственных действий».

Кроме того, 14 июня на блокпосту трассы «Донецк – Днепропетровск» в районе населенного пункта Покровское Наливайченко организовал захват и похищение российских журналистов телерадиокомпании «Звезда» Евгения Давыдова и Никиты Конашенкова. В течение двух дней его подчиненные «незаконно удерживали россиян в здании СБУ в городе Днепропетровске, систематически избивая, а также заставляя делать заявления, содержащие заведомо ложную оценку событий, происходящих на Украине».

«Помимо этого в период вооруженного конфликта на юго-востоке Украины сотрудники СБУ по указанию Наливайченко пытали, истязали и жестоко избивали захваченных в плен мирных жителей, не поддерживающих киевскую власть, — добавил Маркин, отметив, что «жестокость – это признак бессилия и трусости, а местью трусов, как заметил еще классик, всегда является клевета». — И подтверждая эту мысль, Наливайченко после всего, что он приказывал делать с безоружными и беззащитными гражданами, публично выступает с нелепыми и лживыми обвинениями в отношении главы Чеченской Республики Рамзана Кадырова, видимо, пытаясь переложить вину с больной головы на здоровую».

Представитель СКР уверен, что «Наливайченко и ему подобным за эти преступления рано или поздно придется ответить». «И не нужно быть Цицероном, чтобы понимать, что справедливость проявляется в воздаянии каждому по его заслугам», — подытожил он.

Напомним, ранее чеченский лидер поручил правоохранительным органам республики «незамедлительно возбудить» уголовные дела в отношении нардепов Юрия Березы, Андрея Левуса и Игоря Мосийчука и доставить их в Грозный, отметив, что необходимо проверить их роль в событиях, произошедших 4 декабря в столице республики. «Мы и ранее предполагали, что украинские фашисты и националисты оказывают финансовую или иную помощь остаткам террористов на Кавказе. Сейчас никаких сомнений не осталось», – подчеркнул он. После чего СКР возбудил против трех украинских парламентариев уголовное дело за то, что «с помощью СМИ призывали к совершению аналогичных преступлений» на территории РФ.

В начале декабря Служба безопасности Украины отреагировала на угрозы главы Чечни Рамзана Кадырова задержать и доставить в республику народных депутатов Верховной Рады, которые «публично поддержали террористов, причастных к гибели в Грозном 14 сотрудников полиции», и возбудила против него уголовное дело.

«Террористические угрозы, от кого бы они ни звучали, являются преступлением международного характера и столкнутся с нашим решительной отпором», — заявил глава ведомства Валентин Наливайченко, подчеркнув, что слова Кадырова должны получить также надлежащую оценку международного сообщества.

Наталья Демидюк

поиск оптимального баланса.

— Блог руководителя — Университет прокуратуры Российской Федерации

Криминализация и декриминализация деяний: поиск оптимального баланса.

Аннотация. В современном российском уголовном законодательстве прослеживается избыточная криминализация деяний, которая идет вразрез с тенденциями развития преступности в России. Экстенсивный рост количества уголовно-правовых запретов объясняется дефектами управленческой практики в сфере противодействия преступности, переоценкой реальных превентивных возможностей уголовного закона, репрессивностью юридического и обыденного массового сознания, кризисом в отношениях общества и государства. Учитывая широкий спектр деструктивных последствий чрезмерной уголовно-правовой репрессии, многие из которых ощущаются уже сегодня, автор предлагает, во-первых, ограничить процессы криминализации, прибегая к ним только в случае крайней необходимости, а во-вторых, провести «ревизию» Особенной части УК РФ, объективно оценить существующие уголовно-правовые запреты на предмет соответствия критериям криминализации деяний, и на этом основании декриминализовать те деяния, которые не представляют значительной общественной опасности. Сбалансированное использование уголовно-политических инструментов криминализации и декриминализации деяний способно обеспечить эффективную защиту важнейших социальных ценностей, не допуская избыточного ограничения уровня свободы личности.

Ключевые слова: криминализация деяний, декриминализация деяний, объем уголовно-правовой репрессии, уголовно-правовые запреты, уголовная политика.

Современный период развития человечества отмечен стремительным научно-техническим прогрессом, усложнением общественных процессов, резким ускорением социальной динамики. Эти тенденции не обошли стороной и сферу девиантного, противоправного поведения. Появляются качественно новые общественно опасные вызовы и угрозы (например, киберпреступность, деяния, связанные с клонированием человека, изменением генотипа человека), трансформируются традиционные и давно известные проявления преступности, изменяется социальная оценка деяний, запрещенных уголовным законом, что вынуждает законодателя пересматривать круг уголовно-наказуемых деяний, т. е. осуществлять криминализацию и декриминализацию.

Под криминализацией деяния традиционно понимается процесс и результат установления уголовно-правового запрета. Соответственно, декриминализацией принято называть устранение уголовной ответственности за деяние, ранее считавшееся преступлением.

В практике конституционного нормоконтроля подчеркивается, что «закрепление в законе уголовно-правовых запретов и санкций за их нарушение не может быть произвольным» (Постановление Конституционного Суда Российской Федерации от 19 марта 2003 г. № 3-П). Процесс этот чрезвычайно важный и ответственный; от его результатов в конечном итоге зависит как степень защищенности правоохраняемых интересов, так и уровень свободы общества [Пудовочкин, 2008]. Принимая подобные решения, законодатель должен руководствоваться научно обоснованными правилами и критериями криминализации (декриминализации) деяний, учитывать взаимосвязанные факторы социального, экономического, культурного, морально-этического, социально-психологического, правового характера, просчитывать их социально-криминологические, экономические и уголовно-политические последствия.

В настоящее время основные доктринальные постулаты криминализации деяний получили отражение в правовых позициях Конституционного Суда Российской Федерации (Постановления от 27 июня 2005 г. № 7-П, от 27 мая 2008 г. № 8-П, от 13 июля 2010 г. № 15-П, от 17 июня 2014 г. № 18-П, от 16 июля 2015 г. № 22-П, от 10 февраля 2017 г. № 2-П и др.), благодаря чему приобрели нормативный, юридически обязательный характер. Не углубляясь в их детальный анализ, отметим, что к числу базовых оснований криминализации деяний Конституционный Суд относит высокую (криминальную) степень их общественной опасности (она определяется масштабом распространенности соответствующих деяний, значимостью охраняемых законом ценностей, на которые они посягают, существенностью причиняемого ими вреда), а также невозможность противодействия соответствующим деяниям с помощью иных правовых средств. Как справедливо отмечает Конституционный Суд Российской Федерации, «уголовное законодательство является по своей правовой природе крайним (исключительным) средством, с помощью которого государство реагирует на факты противоправного поведения в целях охраны общественных отношений, если она не может быть обеспечена должным образом только с помощью правовых норм иной отраслевой принадлежности» (Постановление от 10 февраля 2017 г. № 2-П).

Определяя исходные требования к криминализации деяний, Конституционный Суд Российской Федерации подчеркивает, что «федеральный законодатель … обязан избегать избыточного использования уголовно-правовой репрессии» (Постановление от 27 июня 2005 г. № 7-П). Однако, как показывает практика, законодатель использует уголовную репрессию не очень экономно. За время существования УК РФ в его Особенную часть включено 113 новых статей[i]. В результате столь масштабного реформирования уголовного законодательства были криминализованы свыше 100 деяний[ii]. Для сравнения укажем, что исключено из Особенной части УК РФ только 10 статей[iii]. При этом полностью декриминализовано лишь 2 (!) деяния[iv] – оскорбление (ст. 130 УК РФ) и заведомо ложная реклама (ст. 182 УК РФ). Таким образом, несмотря на официальные лозунги о либерализации уголовного законодательства, в нем явно прослеживается репрессивный уклон, который проявляется в перманентном увеличении числа уголовно-правовых запретов и сужении уголовно-правовых границ дозволенного поведения.

Безусловно, нельзя не признать, что криминализация многих общественно опасных деяний, осуществленная в последние годы, полностью оправданна. Так, например, учитывая высокую общественную опасность деяний, направленных на сексуальную эксплуатацию несовершеннолетних, объективную невозможность противодействия им посредством иных правовых мер, не связанных с уголовной репрессией, законодатель установил уголовную ответственность за изготовление и оборот материалов или предметов с порнографическими изображениями несовершеннолетних (ст. 242¹ УК РФ), за использование несовершеннолетнего в целях изготовления порнографических материалов или предметов (ст. 242² УК РФ), за получение сексуальных услуг несовершеннолетнего (ст. 240¹ УК РФ). Это позволило создать действенный уголовно-правовой инструментарий для противодействия сексуальной эксплуатации подростков, а также реализовать требования международных стандартов защиты детей.

Новые формы и методы посягательств на жизнь и здоровье подростков, которые проявились в 2016-2017 гг., потребовали установления уголовной ответственности за склонение к совершению самоубийства или содействие совершению самоубийства (ст. 110¹ УК РФ), организацию деятельности, направленной на побуждение к совершению самоубийства (ст. 110² УК РФ), вовлечение несовершеннолетнего в совершение действий, представляющих опасность для его жизни (ст. 151² УК РФ).

Вместе с тем современная нормотворческая практика демонстрирует немало примеров обратного порядка, когда решение о криминализации деяния было принято в отсутствие необходимых предпосылок. Весьма показательным в этом отношении является установление уголовной ответственности за неисполнение обязанности по подаче уведомления о наличии у гражданина Российской Федерации гражданства (подданства) иностранного государства либо вида на жительство или иного действительного документа, подтверждающего право на его постоянное проживание в иностранном государстве (ст. 330² УК РФ, введена Федеральным законом от 4 июня 2014 г. № 142-ФЗ). По общему признанию специалистов в области уголовного права, это деяние по степени общественной опасности не выходит за рамки административного правонарушения и явно «не дотягивает» до уровня преступления. Представители уголовно-правовой науки даже затрудняются точно определить объект этого «преступления», т.е. назвать социальные ценности, которым причиняется вред в результате невыполнения лицом обязанности проинформировать власти о наличии у него иностранного гражданства или вида на жительство.

С точки зрения требований к криминализации деяний, сформулированных в правовых позициях Конституционного Суда Российской Федерации, серьезные сомнения вызывает обоснованность целого ряда иных уголовно-правовых запретов, появившихся в последние годы в УК РФ. В частности, речь идет об уголовно-правовых запретах, предусмотренных ст. 171³, 171⁴, 200¹, 212¹, 322², 322³ УК РФ. Представляется, что противодействие незаконному производству и обороту этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции, незаконной розничной продаже алкогольной и спиртосодержащей пищевой продукции, контрабанде наличных денежных средств и денежных инструментов, неоднократному нарушению установленного порядка организации либо проведения собрания, митинга, демонстрации, шествия или пикетирования, фиктивной регистрации по месту пребывания или по месту жительства можно успешно осуществлять посредством административно-правовых мер воздействия, не прибегая к уголовной репрессии.

Учитывая ограниченный объем статьи, не будем более останавливаться на частных примерах необоснованной криминализации. Каждый из них, безусловно, заслуживает серьезного внимания, но сейчас намного важнее отвлечься от деталей и сделать акцент на общей тенденции, которая прослеживается в практике уголовного нормотворчества.

Эта тенденция вполне очевидна – с каждым годом количество деяний, запрещенных под угрозой уголовного наказания, лишь растет; объемы криминализации постоянно увеличиваются. Причем ознакомление с законопроектным «портфелем» Государственной Думы не позволяет надеяться на смену этого тренда, поскольку большинство находящихся на рассмотрении парламента нормотворческих инициатив в сфере уголовного права связано с криминализацией деяний. В частности, российские парламентарии предлагают установить уголовную ответственность за угрозу уничтожения имущества (законопроект № 377933-7), принудительную эвакуацию транспортного средства при нахождении в нем человека (законопроект № 794484-6), самовольную добычу драгоценных металлов, природных драгоценных камней, жемчуга, полудрагоценных камней или янтаря (законопроект № 1186921-6), оскорбление чувств ветеранов Великой Отечественной войны (законопроект № 1166853-6), надругательство над гербом или флагом субъекта Российской Федерации (законопроект № 86076-7), дискредитацию Российской Федерации (законопроект № 1111185-6)[v].

Содержание этих законодательных инициатив, равно как и уже состоявшихся решений о криминализации, показывает, что парламентарии явно переоценивают реальные превентивные возможности уголовного закона, наивно полагая, что посредством установления уголовно-правовых запретов можно решить чуть ли не любую социальную проблему. Однако это не так. Уголовное право – это крайнее, исключительное средство реагирования на факты противоправного поведения, причем средство весьма несовершенное. Даже в тех случаях, когда без применения уголовной репрессии обойтись невозможно, она неизбежно причиняет негативные социальные последствия. Как справедливо отмечает академик В.Н. Кудрявцев, «уголовный закон поражает не только виновного, но и ни в чем не повинных членов его семьи, избавляет общество не только от правонарушителя, но и от участников общественного производства, разрывает у осужденного не только преступные, но и полезные, необходимые социальные связи» [Кудрявцев, 1982]. Поэтому вводить новые уголовно-правовые запреты следует крайне осторожно, соизмеряя ожидаемый позитивный эффект от криминализации деяния с ее неизбежными «издержками», с той «ценой», которую придется платить за уголовную репрессию.

И без того серьезные сомнения в обоснованности и целесообразности масштабной криминализации деяний подкрепляются результатами криминологического анализа состояния и основных тенденций преступности. По данным статистики, количество зарегистрированных в России преступлений демонстрирует последовательное снижение. В 2016 г. зарегистрированная преступность сократилась на 9,6 % (абс. 2 160 063), в 2017 г. – на 4,7 % (абс. 2 058 476). За 10 лет (с 2008 по 2017 гг.) число зарегистрированных преступлений снизилось на 35,9 %. И хотя многие криминологи относятся к этой статистике недоверчиво (причем не без оснований), очевидно, что криминальная ситуация в стране постепенно улучшается. Это подтверждается и динамикой социальных настроений в российском обществе. Как показывают социологические опросы, страх перед преступностью находится далеко на «заднем» плане. В первую очередь россияне опасаются роста цен и международных военных конфликтов, проблем со здоровьем и трудностей с получением медицинской помощи[vi]. На этом фоне объемы уже состоявшейся и планируемой криминализации выглядят явно избыточными.

Чрезмерная криминализация деяний объясняется дефектами управленческой практики в сфере противодействия преступности. Не имея научно обоснованной концепции уголовной политики, четких представлений о целях, задачах, принципах, пределах уголовно-правового противодействия преступности, его ожидаемых результатах, законодатель осуществляет криминализацию деяний по принципу «стимул – реакция», «вызов – ответ». Как показывает практика уголовного нормотворчества, решения о криминализации деяний в большинстве случаев принимаются спонтанно, импульсивно. Новые уголовно-правовые запреты чаще всего являются результатом эмоционального отклика на отдельные резонансные события; их введение продиктовано преимущественно конъюнктурными, сиюминутными соображениями, а иногда и желанием заработать «политические очки». При этом ключевой вопрос о наличии социально-криминологических оснований и предпосылок для установления уголовной ответственности отходит на второй план, о чем наглядно свидетельствует содержание пояснительных записок к соответствующим законопроектам. Их авторы, как правило, не утруждают себя обоснованием наличия критериев криминализации деяния, криминологическим анализом, прогнозными расчетами последствий введения нового уголовно-правового запрета. В современных сложнейших (неоднозначных, многовариантных, нелинейных и т.п.) процессах социального бытия подобное управление сферой борьбы с преступностью является глубоко архаичным, стратегически неверным и даже опасным [Бабаев, Пудовочкин, 2012].

Социально-психологической, ментальной основой избыточной криминализации деяний являются стереотипы репрессивного мышления, явно гипертрофированные представления о роли и возможностях уголовной кары в решении возникающих социальных проблем. «Именно репрессивное мышление с его магией запретов чаще всего дает «творческий импульс» любителям перекраивать Уголовный кодекс, не задумываясь, есть ли к тому достаточные основания, бесконечно ужесточать наказания, криминализовать «некриминализуемое»» [Бабаев, Пудовочкин, 2017]. В рамках этой репрессивной парадигмы происходит возврат к запретительным, карательным, силовым стратегиям управления общественными процессами, о которых с ностальгией вспоминают сторонники «сильного» государства. Уголовная репрессия рассматривается как наиболее эффективный, простой и доступный способ разрешения социальных конфликтов и проблем, что неизбежно приводит к умножению уголовно-правовых запретов.

Помимо прочего, рост объемов уголовной репрессии детерминирован наличием глубокого кризиса в отношениях общества и государства. Общая закономерность здесь такова. Когда общество и государство отчуждены друг от друга, когда их интересы расходятся, интенсивность уголовно-правовой репрессии, как правило, возрастает, так как уголовно-правовые меры используются не только для противодействия деструктивному антиобщественному поведению, борьбы с реальными криминальными угрозами, но и для обеспечения безопасности элит, сохранения власти, для репрессий в отношении протестных групп населения, «инакомыслящих». И наоборот: если векторы общественных и государственных интересов совпадают, если уровень взаимного доверия высок, то объемы и интенсивность уголовно-правовой репрессии снижаются.

Репрессивная управленческая стратегия, сопровождающаяся экстенсивным ростом числа уголовно-правовых запретов, влечет целый спектр негативных последствий, многие из которых ощущаются уже сегодня.

Она снижает и без того довольно невысокую эффективность уголовно-правовых запретов. Срабатывает закономерность, давно известная в психологии: чем больше запретов, тем меньше они соблюдаются. Это обстоятельство признают и специалисты в области правоведения, которые констатируют, что «печатание законодательных запретов так же мало помогает оздоровлению общества, как печатание денег – экономике. Чем больше законов и запретов, тем меньше вероятности их исполнения, даже если государство бросит все деньги налогоплательщиков на повышение бюджетов и зарплат силовиков» [Волков, 2013].

Криминализация деяний с недостаточно высокой или неочевидной общественной опасностью размывает традиционные социальные представления о преступлении как вопиющем нарушении правопорядка, стирает границу между преступлениями и иными правонарушениями. В свою очередь «измельчание» уголовно-правовых запретов снижает «порог входа» в УК РФ, «открывает дверь» для включения в него новых деяний с невысокой общественной опасностью, поскольку при решении вопроса о межотраслевой дифференциации ответственности парламентарии, так или иначе, ориентируются на уже имеющиеся в УК РФ нормы.

Таким образом, «гиперинфляция» Особенной части УК РФ закономерно приводит к обесцениванию уголовного права, снижению его авторитета и эффективности. Тиражирование совершенно необязательных уголовно-правовых запретов фактически демонстрирует неспособность государственной власти предложить позитивные – социальные, экономические и иные способы разрешения социальных конфликтов и проблем. Реагируя на очередное резонансное событие посредством внесения изменений в УК РФ, законодатель лишь «затушевывает» проблему, создает видимость ее решения, не решая ее по сути.

В условиях лимитированных кадровых и финансовых ресурсов правоохранительной системы, ее ограниченной «пропускной способности», поставленная «на поток» криминализация деяний приводит лишь к умножению числа «мертвых» уголовно-правовых норм, невостребованных практикой[vii], к неспособности обеспечить соблюдение уголовно-правовых запретов. На этом фоне в массовом сознании россиян укрепляются представления о девальвации закона, сомнения в эффективности правовой системы и недоверие к правовым институтам, проявляются иные симптомы правового нигилизма. Исследования, проводимые Академией Генеральной прокуратуры Российской Федерации, показывают, что значительная часть населения не считает уголовно-правовые запреты рациональными и справедливыми. Они рассматриваются, главным образом, как авторитарные предписания государства, направленные исключительно на контроль, а не на защиту граждан, и, таким образом, отчуждаются от рядового человека [Ситковская, 2016; Тихомиров, Субанова, 2017].

Говоря о социально-психологических последствиях чрезмерной криминализации деяний, нельзя также не отметить, что нескончаемая череда новых уголовно-правовых запретов шаг за шагом сужает границы дозволенного поведения, ограничивает свободу, создает неблагоприятную, «удушливую» социально-психологическую атмосферу. Опутанное липкой паутиной избыточных уголовно-правовых запретов, общество может постепенно утратить позитивные импульсы развития, способность генерировать и применять альтернативные, не связанные с уголовной репрессией формы и методы социального контроля над отклоняющимся поведением.

Все вышеизложенное наводит на мысль о том, что законодателю стоит, во-первых, ограничить процессы криминализации, прибегая к ним только в случае крайней необходимости, а во-вторых, провести «ревизию» Особенной части УК РФ, объективно оценить существующие уголовно-правовые запреты на предмет соответствия критериям криминализации деяний, и на этом основании декриминализовать те деяния, которые не представляют значительной общественной опасности.

К сожалению, законодатель осуществляет декриминализацию деяний довольно редко (по крайней мере, если сравнивать с интенсивностью процессов криминализации). Причем даже в тех немногих случаях, когда этот уголовно-политический инструмент все же используется, за декриминализацией может последовать повторная криминализация или, говоря иначе, рекриминализация.

Показательным в этом плане является пример с уголовной ответственностью за лжепредпринимательство. Федеральным законом от 7 апреля 2010 г. № 60-ФЗ ст. 173, предусматривающая ответственность за лжепредпринимательство, была исключена из УК РФ. Однако через полтора года Федеральным законом от 7 декабря 2011 г. № 419-ФЗ в УК РФ были включены две новые уголовно-правовые нормы (ст. 173¹ «Незаконное образование (создание, реорганизация) юридического лица», ст. 173² «Незаконное использование документов для образования (создания, реорганизации) юридического лица»), которые фактически восполнили ранее исключенную ст. 173 УК РФ.

Чуть более семи месяцев понадобилось для рекриминализации клеветы. Федеральным законом от 7 декабря 2011 г. № 420-ФЗ клевета была декриминализована (ст. 129 исключена из УК РФ), а Федеральным законом от 28 июля 2012 г. № 141-ФЗ уголовно-правовой запрет на клевету «реанимирован» (в УК РФ была введена статья 128¹ «Клевета»).

Сходная ситуация складывается и с так называемой «экономической» или «товарной» контрабандой. В декабре 2011 г. она была декриминализована (Федеральный закон от 7 декабря 2011 г. № 420-ФЗ исключил ст. 188 из УК РФ), однако в течение 2013-2014 гг. отдельные проявления экономической контрабанды вновь были объявлены преступными. Федеральным законом от 28 июня 2013 г. № 134-ФЗ была восстановлена уголовная ответственность за контрабанду наличных денежных средств и (или) денежных инструментов (ст. 200¹ УК РФ), а Федеральным законом от 31 декабря 2014 г. № 530-ФЗ – уголовная ответственность за контрабанду алкогольной продукции и (или) табачных изделий (ст. 200² УК РФ).

Столь непоследовательная смена ориентиров правомерного поведения умножает и без того высокую неопределенность уголовного законодательства, фактически лишая граждан представлений о границах возможного и допустимого.

По всей видимости, одной из причин неохотного использования декриминализации является пресловутая репрессивность профессионального юридического и массового сознания, которая удивительным образом сочетается с правовым нигилизмом. Попытки снизить объемы уголовно-правовой репрессии, полностью или частично исключить те или иные деяния из УК РФ нередко вызывают бурную реакцию и общественное возмущение.

Примером может служить частичная декриминализация побоев. Как известно, Федеральным законом от 3 июля 2016 г. № 323-ФЗ в ст. 116 УК РФ были внесены изменения, в результате которых уголовно-наказуемыми остались только побои в отношении близких лиц, а равно побои, совершенные из хулиганских или экстремистских побуждений. Иные побои были переведены в разряд административных правонарушений (ст. 6.1.1 КоАП РФ). Одновременно с этим в уголовный закон была включена норма об ответственности за нанесение побоев лицом, подвергнутым административному наказанию (ст. 116¹ УК РФ). Буквально через 7 месяцев было принято решение о декриминализации побоев в отношении близких лиц (Федеральный закон от 7 февраля 2017 г. № 8-ФЗ), которые стали расцениваться как административные правонарушения.

Декриминализация семейных побоев вызвала шквал критики. Представители правоохранительных органов объясняют свое недовольство тем, что норма об ответственности за побои выполняет двойную превентивную функцию, способствуя предупреждению более тяжких преступлений против личности. А правозащитные организации расценили декриминализацию побоев в отношении близких без признаков повторности чуть ли не как легализацию домашнего насилия, как возврат к «домострою».

Однако если отвлечься от этих эмоциональных и притом не всегда профессиональных оценок, и оценить последствия частичной декриминализации побоев на основании данных статистики, то мы получим совершенно иную картину.

В 2015 г. по ст. 116 УК РФ за побои были осуждены 19 643 человека, в 2016 г. количество осужденных по ст. 116 УК РФ составило 19 770, т.е. практически не изменилось, а в первом полугодии 2017 г. резко снизилось до 2 856 человек. Экстраполируя данные за первое полугодие 2017 г. на весь прошедший год, можно заключить, что после частичной декриминализации побоев число осужденных по ст. 116 УК РФ снизилось более чем в три раза.

Однако одновременно с обвальным снижением количества осужденных по ст. 116 УК РФ резко выросло число лиц, привлеченных к административной ответственности за побои. В первое полугодие 2017 г. по ст. 6.1.1 КоАП РФ назначены административные наказания 51 689 лицам. Данные за весь 2017 г. пока отсутствуют, но даже по «грубым» прикидкам, количество административно наказанных за побои в 2017 г. составляет не менее 100 тыс. человек.

Таким образом, после частичной декриминализации побоев наказывать за них стали намного чаще (как минимум в 5 раз). Интерпретируя вышеизложенные статистические данные, эксперты Института проблем правоприменения справедливо отмечают, что «частичная декриминализация побоев существенно изменила практику работы судебной системы, правоохранительных органов и организаций, отвечающих за профилактику в социальной сфере», привела «к росту социального контроля, а не к его ослаблению» [Ходжаева, Четверикова, 2017]. Таким образом, административная ответственность за побои оказалась более эффективной, чем уголовная, по крайней мере, с точки зрения ее неотвратимости.

Приведенный пример убедительно доказывает, что декриминализация в ряде случаев может оказаться намного более действенным инструментом, чем криминализация. Тем не менее, складывается стойкое впечатление, что субъекты уголовной политики опасаются использовать этот инструмент. В этом контексте нельзя не упомянуть нашумевшую законодательную инициативу Верховного Суда Российской Федерации об уголовных проступках. Основная идея законопроекта, внесенного Верховным Судом в Государственную Думу[viii], заключается в следующем. Во-первых, предполагается обособить внутри категории преступлений небольшой тяжести «подкатегорию» уголовных проступков и отнести к ней те преступления небольшой тяжести, за которые не предусмотрено наказание в виде лишения свободы. Во-вторых, предлагается регламентировать в УК РФ обязательное и безусловное освобождение от уголовной ответственности лиц, впервые совершивших уголовные проступки, с применением к ним иных мер уголовно-правового характера (судебного штрафа, обязательных или исправительных работ).

Таким образом, вместо того чтобы декриминализовать наименее опасные деяния, высшая судебная инстанция предлагает очень странную уголовно-правовую конструкцию, на основании которой впервые совершенный уголовный проступок влечет «автоматическое» освобождение от уголовной ответственности, «механическую» замену уголовной ответственности на «иные меры уголовного характера». Иными словами, Верховным Судом предлагается депенализация впервые совершенного уголовного проступка без его декриминализации. Однако преступление без наказания – это юридический нонсенс, даже если назвать его уголовным проступком.

Полностью поддерживая вектор рассматриваемых законодательных инициатив, который направлен на сокращение объемов уголовной репрессии, отмечу, что, на наш взгляд, Верховному Суду Российской Федерации следовало бы проявить большую решительность в этом отношении. Не изобретая новых категорий преступлений, каких-то сложных и не совсем корректных форм освобождения от уголовной ответственности, необходимо поставить перед законодателем вопрос о декриминализации преступлений небольшой тяжести, за которые не предусмотрено лишение свободы.

Разумеется, декриминализация преступлений небольшой тяжести, за которые не предусмотрено лишение свободы, не должна быть механической. Как отмечает Конституционный Суд Российской Федерации, в процессе корректировки уголовного закона, его приведения в соответствие с новыми социальными реалиями, законодатель должен соблюдать конституционные принципы равенства и справедливости, обеспечивать баланс конституционно значимых целей и ценностей (Постановление от 20 апреля 2006 г. № 4-П). Поэтому к декриминализации каждого деяния следует подходить индивидуально, учитывая специфику объекта посягательства, характер причиняемых последствий, его распространенность.

Где-то необходима полная декриминализация, как в случае с уже упоминавшимся уголовно-правовым запретом, предусмотренным ст. 330² УК РФ. А в некоторых случаях одновременно с исключением уголовно-правового запрета целесообразно сконструировать состав преступления с административной преюдицией. Замена «обычного» состава преступления на состав с административной преюдицией позволит гуманизировать уголовный закон и одновременно активизировать превентивные возможности деликтного (административного и уголовного) законодательства.

Стоит оговорить, что предлагаемые нами изменения не должны коснуться специальных уголовно-правовых норм с так называемыми «привилегированными» составами преступлений, которые не предусматривают лишение свободы (ч. 1 ст. 159¹, ч. 1 ст. 159², ч. 1 ст. 159³, ч. 1 ст. 159⁵, ч. 1 ст. 159⁶, ст. 204² УК РФ). Исключение этих норм из УК РФ привело бы не к декриминализации соответствующих преступлений, а к их «переводу» в сферу общих уголовно-правовых норм с более строгими санкциями, что противоречит самой сути предложенной реформы уголовного законодательства.

В завершение статьи хотелось бы подчеркнуть, что предлагаемая нами «разгрузка» Особенной части УК РФ вовсе не исключает необходимости дальнейшей криминализации общественно опасных деяний. Уголовное право в силу своего предназначения не может игнорировать новые формы деструктивной социальной активности. И если купировать их без использования уголовной репрессии невозможно, то при соблюдении всех требований к криминализации деяний включение в УК РФ новых уголовно-правовых запретов будет, безусловно, оправданным.

Таким образом, динамика общественного развития вынуждает законодателя сочетать процессы криминализации и декриминализации деяний. Лишь сбалансированное использование этих уголовно-политических инструментов способно обеспечить эффективную защиту важнейших социальных ценностей, не допуская при этом избыточного ограничения уровня свободы общества.

Библиографический список:

1. Бабаев М.М., Пудовочкин Ю.Е. Изменения российского уголовного закона и их уголовно-политическая оценка // Государство и право. – 2012. – № 8. – С. 36-37.
2. Бабаев М.М., Пудовочкин Ю.Е. Российская уголовная политика и уголовный закон: опыт критического анализа: монография. – М.: Юрлитинформ, 2017. – С. 585-586.
3. Волков В. Extra Jus: Год запретительной политики // Ведомости. – 2013, 26 декабря.
4. Пудовочкин Ю.Е. Учение о преступлении: избранные лекции. – М.: Издательство «Юрлитинформ», 2008. – С. 9.
5. Основания уголовно-правового запрета (криминализация и декриминализация) / Под ред. В.Н. Кудрявцева, А.М. Яковлева. – М.: Наука, 1982. – С. 220.
6. Теоретические основы использования психологических знаний в прокурорской деятельности: монография / под ред. О.Д. Ситковской. – М.: Проспект, 2016. – С. 95-108.
7. Социально-психологические аспекты обеспечения законности // Законность: теория и практика: монография / отв. ред. Ю.А. Тихомиров, Н.В. Субанова. – М.: ООО «ЮРИДИЧЕСКАЯ ФИРМА КОНТРАКТ», 2017. – С. 169-185.
8. Ходжаева Е., Четверикова И. Чем полезна декриминализация побоев // Ведомости. – 2017, 14 декабря.

[i] Статьи 110¹, 110², 116¹, 127¹, 127², 128¹, 138¹, 141¹, 142¹, 142², 145¹, 151¹, 151², 158¹, 159¹, 159², 159³, 159⁴, 159⁵, 159⁶, 170¹, 170², 171¹, 171², 171³, 171⁴, 172¹, 172², 173¹, 173², 174¹, 185¹, 185², 185³, 185⁴, 185⁵, 185⁶, 191¹, 193¹, 199¹, 199², 199³, 199⁴, 200¹, 200², 200³, 200⁴, 200⁵, 201¹, 204¹, 204², 205¹, 205², 205³, 205⁴, 205⁵, 205⁶, 212¹, 215¹, 215², 215³, 215⁴, 217¹, 217², 222¹, 223¹, 226¹, 228¹, 228², 228³, 228⁴, 229¹, 230¹, 230², 234¹, 235¹, 238¹, 240¹, 242¹, 242², 243¹, 243², 243³, 258¹, 263¹, 264¹, 267¹, 271¹, 274¹, 280¹, 282¹, 282², 282³, 283¹, 284¹, 285¹, 285², 285³, 285⁴, 286¹, 291¹, 291², 292², 298¹, 314¹, 322¹, 322², 322³, 325¹, 327¹, 327², 330¹, 330², 354¹, 361 УК РФ.

[ii] Включение в Особенную часть УК РФ новых статей далеко не во всех случаях равнозначно криминализации деяний. В статьях-новеллах законодатель нередко конструирует специальные уголовно-правовые нормы, посредством которых осуществляется дифференциация уголовной ответственности за ранее криминализованные деяния. Примером могут являться нормы об ответственности за специальные виды мошенничества (ст. 159¹ – 159⁶ УК РФ), норма о мелком взяточничестве (ст. 291² УК РФ).

[iii] Статьи 129, 130, 152, 159.4, 173, 182, 188, 200, 265, 298 УК РФ.

[iv] Стоит оговорить, что решение об исключении статьи из Особенной части уголовного закона нельзя отождествлять с декриминализацией. Так, например, исключение ст. 265 из УК РФ не привело к декриминализации оставления места дорожно-транспортного происшествия, поскольку соответствующие деяния охватываются общей нормой об ответственности за оставление в опасности. А торговля несовершеннолетними, несмотря на исключение ст. 152 из УК РФ, признается преступным деянием на основании общей нормы от ответственности за торговлю людьми (ст. 127¹ УК РФ).

[v] См.: Автоматизированная система обеспечения законодательной деятельности. URL: http://asozd2.duma.gov.ru/

[vi] https://wciom.ru/index.php?id=236&uid=116418.

[vii] По данным уголовной статистики за 2015-2017 гг. целый ряд норм-новелл (в частности, ст. 110¹, 110², 141¹,142², 152², 170², 172¹, 172², 185¹,185², 185³, 185⁴, 185⁶, 199³, 199⁴, 212¹, 215¹, 215⁴, 230¹, 230², 243³, 263¹, 267¹, 271¹, 282³,^{284¹, 286¹, 327², 330¹, 361 УК РФ) не применялись ни разу либо применялись в единичных случаях.}

[viii] См.: Постановление Пленума Верховного Суда Российской Федерации от 31 октября 2017 г. № 42 «О внесении в Государственную Думу Федерального Собрания Российской Федерации проекта федерального закона «О внесении изменений в Уголовный кодекс Российской Федерации и Уголовно-процессуальный кодекс Российской Федерации в связи с введением понятия уголовного проступка»» // СПС «Консультант Плюс».

Денежные взыскания (штрафы) | ФНС России

Наименование доходов	Коды бюджетной классификации
Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за осуществление предпринимательской деятельности без государственной регистрации или без специального разрешения (лицензии))	182 1 16 01141 01 0001 140
Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за незаконную организацию и проведение азартных игр)	182 1 16 01141 01 0101 140
Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение организаторами азартных игр в букмекерской конторе и тотализаторе требований к заключению пари на официальные спортивные соревнования и проведению других азартных игр)	182 1 16 01141 01 0111 140
Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за продажу товаров, выполнение работ либо оказание услуг при отсутствии установленной информации либо неприменение в установленных федеральными законами случаях контрольно-кассовой техники)	182 1 16 01141 01 0005 140
Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение срока постановки на учет в налоговом органе)	182 1 16 01151 01 0003 140
Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение сроков представления налоговой декларации (расчета по страховым взносам))	182 1 16 01151 01 0005 140
Административные штрафы, установленные Главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за непредставление (несообщение) сведений, необходимых для осуществления налогового контроля)	182 1 16 01151 01 0006 140
Административные штрафы, установленные Главой 18 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области защиты государственной границы Российской Федерации и обеспечения режима пребывания иностранных граждан или лиц без гражданства на территории Российской Федерации, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы)	182 1 16 01181 01 9000 140
Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за невыполнение в срок законного предписания (постановления, представления, решения) органа (должностного лица), осуществляющего государственный надзор (контроль), организации, уполномоченной в соответствии с федеральными законами на осуществление государственного надзора (должностного лица), органа (должностного лица), осуществляющего муниципальный контроль)	182 1 16 01191 01 0005 140
Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за непредставление сведений (информации)	182 1 16 01191 01 0007 140
Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за осуществление деятельности, не связанной с извлечением прибыли, без специального разрешения (лицензии)	182 1 16 01191 01 0020 140
Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за воспрепятствование законной деятельности должностного лица органа государственного контроля (надзора), должностного лица организации, уполномоченной в соответствии с федеральными законами на осуществление государственного надзора, должностного лица органа муниципального контроля)	182 1 16 01191 01 0401 140
Административные штрафы, установленные Главой 19 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения против порядка управления, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы)	182 1 16 01191 01 9000 140
Штрафы, установленные Главой 22 Уголовного кодекса Российской Федерации, за преступления в сфере экономической деятельности	182 1 16 03122 01 0000 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка постановки на учет в налоговом органе)	182 1 16 05160 01 0001 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление налоговой декларации (расчета финансового результата инвестиционного товарищества, расчета по страховым взносам))	182 1 16 05160 01 0002 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение установленного способа представления налоговой декларации (расчета))	182 1 16 05160 01 0003 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за представление в налоговый орган управляющим товарищем, ответственным за ведение налогового учета, расчета финансового результата инвестиционного товарищества, содержащего недостоверные сведения)	182 1 16 05160 01 0004 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за грубое нарушение правил учета доходов и расходов и объектов налогообложения (базы для исчисления страховых взносов))	182 1 16 05160 01 0005 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за несоблюдение порядка владения, пользования и (или) распоряжения имуществом, на которое наложен арест или в отношении, которого налоговым органом приняты обеспечительные меры в виде залога)	182 1 16 05160 01 0006 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление налоговому органу сведений, необходимых для осуществления налогового контроля)	182 1 16 05160 01 0007 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за представление налоговым агентом налоговому органу документов, содержащих недостоверные сведения)	182 1 16 05160 01 0008 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неявку либо уклонение от явки без уважительных причин лица, вызываемого по делу о налоговом правонарушении в качестве свидетеля, неправомерный отказ свидетеля от дачи показаний, а равно дача заведомо ложных показаний)	182 1 16 05160 01 0009 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за отказ эксперта, переводчика или специалиста от участия в проведении налоговой проверки, дача заведомо ложного заключения или осуществление заведомо ложного перевода)	182 1 16 05160 01 0010 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное несообщение сведений налоговому органу)	182 1 16 05160 01 0011 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка регистрации объектов игорного бизнеса)	182 1 16 05160 01 0012 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное непредставление уведомления о контролируемых сделках, представление недостоверных сведений в уведомлении о контролируемых сделках)	182 1 16 05160 01 0013 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неправомерное непредставление уведомления о контролируемых иностранных компаниях, уведомления об участии в иностранных организациях, представление недостоверных сведений в уведомлении о контролируемых иностранных компаниях, уведомлении об участии в иностранных организациях)	182 1 16 05160 01 0014 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за ненаправление (невключение) организацией финансового рынка финансовой информации о клиентах организации финансового рынка, выгодоприобретателях и (или) лицах, их контролирующих)	182 1 16 05160 01 0015 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение организацией финансового рынка порядка установления налогового резидентства клиентов организаций финансового рынка, выгодоприобретателей и лиц, прямо или косвенно их контролирующих)	182 1 16 05160 01 0016 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление уведомления об участии в международной группе компаний, представление уведомления об участии в международной группе компаний, содержащего недостоверные сведения)	182 1 16 05160 01 0017 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление странового отчета, представление странового отчета, содержащего недостоверные сведения)	182 1 16 05160 01 0018 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление документации по международной группе компаний)	182 1 16 05160 01 0019 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка и (или) сроков передачи налогоплательщиками сведений о произведенных расчетах при реализации товаров (работ, услуг, имущественных прав)	182 1 16 05160 01 0020 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение порядка и (или) сроков передачи сведений о произведенных расчетах операторами электронных площадок и кредитными организациями)	182 1 16 05160 01 0021 140
Штрафы за налоговые правонарушения, установленные Главой 16 Налогового кодекса Российской Федерации (иные штрафы)	182 1 16 05160 01 9000 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение банком порядка открытия счета)	182 1 16 05180 01 0001 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение срока исполнения поручения о перечислении налога (сбора, страховых взносов), авансового платежа, единого налогового платежа физического лица, пеней, штрафа)	182 1 16 05180 01 0002 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неисполнение банком решения налогового органа о приостановлении операций по счетам налогоплательщика, плательщика сбора, плательщика страховых взносов или налогового агента, счету инвестиционного товарищества)	182 1 16 05180 01 0003 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за неисполнение банком поручения налогового органа о перечислении налога, авансового платежа, сбора, страховых взносов, пеней, штрафа)	182 1 16 05180 01 0004 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за непредставление банком справок (выписок) по операциям и счетам (счету инвестиционного товарищества) в налоговый орган)	182 1 16 05180 01 0005 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (штрафы за нарушение банком обязанностей, связанных с электронными денежными средствами)	182 1 16 05180 01 0006 140
Штрафы за нарушения банком обязанностей, установленных Главой 18 Налогового кодекса Российской Федерации (иные штрафы)	182 1 16 05180 01 9000 140
Штрафы, неустойки, пени, уплаченные в случае просрочки исполнения поставщиком (подрядчиком, исполнителем) обязательств, предусмотренных государственным контрактом, заключенным федеральным государственным органом, федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией (иные штрафы)	182 1 16 07010 01 9000 140
Иные штрафы, неустойки, пени, уплаченные в соответствии с законом или договором в случае неисполнения или ненадлежащего исполнения обязательств перед федеральным государственным органом, федеральным казенным учреждением, Центральным банком Российской Федерации, государственной корпорацией (иные штрафы)	182 1 16 07090 01 9000 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в федеральный бюджет по нормативам, действовавшим в 2019 году (за исключением доходов, направляемых на формирование Федерального дорожного фонда)	182 1 16 10121 01 0001 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет субъекта Российской Федерации по нормативам, действовавшим в 2019 году (за исключением доходов, направляемых на формирование дорожного фонда субъекта Российской Федерации, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом субъекта Российской Федерации о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10122 01 0001 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов внутригородских муниципальных образований городов федерального значения за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0031 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских округов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0041 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов муниципальных районов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0051 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов сельских поселений за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности	182 1 16 10123 01 0101 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских округов с внутригородским делением за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0111 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов внутригородских районов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0121 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов городских поселений за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0131 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в федеральный бюджет и бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году	182 1 16 10129 01 0000 140
Возмещение ущерба при возникновении страховых случаев, когда выгодоприобретателями выступают получатели средств федерального бюджета (иные штрафы)	182 1 16 10012 01 9000 140
Платежи в целях возмещения убытков, причиненных уклонением от заключения с федеральным государственным органом (федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией) государственного контракта, а также иные денежные средства, подлежащие зачислению в федеральный бюджет за нарушение законодательства Российской Федерации о контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд (за исключением государственного контракта, финансируемого за счет средств Федерального дорожного фонда) (иные штрафы)	182 1 16 10051 01 9000 140
Платежи в целях возмещения ущерба при расторжении государственного контракта, заключенного с федеральным государственным органом (федеральным казенным учреждением, государственной корпорацией), в связи с односторонним отказом исполнителя (подрядчика) от его исполнения (за исключением государственного контракта, финансируемого за счет средств Федерального дорожного фонда) (иные штрафы)	182 1 16 10071 01 9000 140
Денежные средства, обращенные в собственность государства на основании обвинительных приговоров судов, подлежащие зачислению в федеральный бюджет	182 1 16 08010 01 0000 140
Прочее возмещение ущерба, причиненного федеральному имуществу (за исключением имущества, закрепленного за федеральными бюджетными (автономными) учреждениями, унитарными предприятиями)	182 1 16 10013 01 0000 140
Денежное возмещение в размере двукратной суммы причиненного ущерба, перечисляемое в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности	182 1 16 10091 01 0000 140
Доход, полученный в результате совершения преступления, и денежное возмещение в размере двукратной суммы дохода, полученного в результате совершения преступления, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности	182 1 16 10092 01 0000 140
Денежная сумма, эквивалентная размеру убытков, которых удалось избежать в результате совершения преступления, и денежное возмещение в размере двукратной суммы убытков, которых удалось избежать в результате совершения преступления, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности	182 1 16 10093 01 0000 140
Денежная сумма, эквивалентная размеру совершенного деяния, предусмотренного соответствующей статьей Особенной части Уголовного кодекса Российской Федерации, и денежное возмещение в двукратном размере этой суммы, перечисляемые в федеральный бюджет лицом, впервые совершившим преступление, для освобождения от уголовной ответственности	182 1 16 10094 01 0000 140
Административные штрафы, установленные Главой 14 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области предпринимательской деятельности и деятельности саморегулируемых организаций, налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы, за исключением штрафов за административные правонарушения в области производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции)	182 1 16 01141 01 9002 140
Административные штрафы, установленные главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (штрафы за нарушение валютного законодательства Российской Федерации и актов органов валютного регулирования)	182 1 16 01151 01 0025 140
Административные штрафы, установленные главой 15 Кодекса Российской Федерации об административных правонарушениях, за административные правонарушения в области финансов, налогов и сборов, страхования, рынка ценных бумаг (за исключением штрафов, указанных в пункте 6 статьи 46 Бюджетного кодекса Российской Федерации), налагаемые судьями федеральных судов, должностными лицами федеральных государственных органов, учреждений, Центрального банка Российской Федерации (иные штрафы, за исключением штрафов за административные правонарушения в области производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции)	182 1 16 01151 01 9002 140
Доходы от денежных взысканий (штрафов), поступающие в счет погашения задолженности, образовавшейся до 1 января 2020 года, подлежащие зачислению в бюджет муниципального образования по нормативам, действовавшим в 2019 году (доходы бюджетов муниципальных округов за исключением доходов, направляемых на формирование муниципального дорожного фонда, а также иных платежей в случае принятия решения финансовым органом муниципального образования о раздельном учете задолженности)	182 1 16 10123 01 0141 140
Денежные средства, обращенные в собственность государства на основании обвинительных приговоров судов, подлежащие зачислению в федеральный бюджет	182 1 16 08030 01 0000 140

Массовое убийство учащихся в одной из гимназий Казани — Реальный Тагил

Массовое убийство учащихся в одной из гимназий Казани

По последней информации, распространяемой телеграмм-каналами и пресс-службой Президента Татарстана от рук террориста погибли 10 детей, охранник гимназии и учительница. По предварительным данным, количество пострадавших достигло 21 человека. Они доставлены в клиники города. Шестеро подростков находятся в реанимации.

Напомним, сегодня утром в Казани, в гимназии №175 девятнадцатилетний молодой человек устроил стрельбу и совершил подрыв взрывного устройства. Он был задержан. Занятия во всех школах Казани отменены.

Фото: rbc.ru
Задержанный стрелок 2001 г.р., имевший легальное гладкоствольное ружьё, приобретённое 28 апреля, успел застрелить семерых восьмиклассников и учительницу. За несколько дней до нападения он завёл канал в telegram, в котором выкладывал угрожающие тесты и фото.
Как сообщает ТК «Раньше всех. Ну почти» в столице Татарстана задержан 41-летний пособник террориста, а также два человека, распространявших через WhatsApp панические слухи о нападениях на другие учебные заведения.
Национальный антитеррористический комитет в своих сообщениях настаивает, что нападавший был один, хотя первоначально в СМИ появились данные о двух стрелках.
Фото: rbc.ru
Реагируя на известие о происшествии в Казани, Президент России Владимир Путин дал поручение проработать вопрос ужесточения правил оборота гражданского оружия.
Фото: region_kazan116 / VK
Губернатор Свердловской области Евгений Куйвашев выразил соболезнование в связи со случившейся в гимназии Казани трагедией.
12 мая объявлено днём траура в Татарстане.
Диполярный порядок, опосредованный кросс-поляризацией 1H → 13C для растворения-динамической ядерной поляризации
Арденкьер-Ларсен, Й.-Х., Фридлунд, Б., Грам, А., Ханссон, Г., Ханссон, L., Lerche, M.H., Servin, R., Thaning, M., and Golman, K .: Увеличение отношение сигнал / шум> 10000 раз в жидком ЯМР, P. Natl. Акад. Sci. США, 100, 10158–10163, https://doi.org/10.1073/pnas.1733835100, 2003.
Бател, М., Краевски, М., Дэпп, А., Хункелер, А., Мейер, Б. Х., Козерке, С., и Эрнст, М .: Кросс-поляризация для динамики растворения ядерных поляризация, Chem. Phys. Lett., 554, 72–76, https://doi.org/10.1039/C4CP02696A, 2012.
Bornet, A., Melzi, R., Jannin, S., and Bodenhausen, G .: Cross Polarization для экспериментов по динамической ядерной поляризации растворения Допустимые температуры 1,2 < T <4,2, прибл. Magn. Резон., 43, 107–117, https://doi.org/10.1007/s00723-012-0358-1, 2012.
Bornet, A., Melzi, R., Perez Linde, A.J., Hautle, P., van den Brandt, B., Джаннин С., Боденхаузен, Г.: Повышение растворения динамических ядер Поляризация перекрестной поляризацией, J. Chem. Phys. Lett., 4, 111–114, https://doi.org/10.1021/jz301781t, 2013.
Bornet, A., Milani, J., Vuichoud, B., Perez Linde, A.J., Bodenhausen, G., и Джаннин, С .: Микроволновая частотная модуляция для улучшения растворения. Динамическая ядерная поляризация, Chem. Phys. Lett., 602, 63–67, https://doi.org/10.1016/j.cplett.2014.04.013, 2014a.
Борнет, А., Джи, X., Маммоли, Д., Вишо, Б., Милани, Дж., Боденхаузен, Г., и Джаннин, С.: заселены долгоживущие состояния магнитно эквивалентных спинов. с помощью растворения-ДНФ и выявленных ферментативных реакций, Chem. Евро. J., 20, 17113–17118, https://doi.org/10.1002/chem.201404967, 2014b.
Борне, А., Мокур, М., Деборд, К., Якоб, Д., Милани, Дж., Вишо, Б., Джи, X., Думес, Ж.-Н., Моинг, А., Боденхаузен, Г., Джаннин, С., и Жиро, P .: Высокая воспроизводимость динамической ядерной поляризации растворения для Гетероядерная метаболомика ЯМР, Anal.Chem., 88, 6179–6183, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b01094, 2016a.
Борнет, А., Пинон, А., Джаджхария, А., Бауден, М., Джи, Х., Эмсли, Л., Боденхаузен, Г., Арденкьер-Ларсен, Ж.-Х., и Яннин, С .: Динамическая поляризация ядер, управляемая микроволнами, Phys. Chem. Chem. Физ., 18, 30530–30535, https://doi.org/10.1039/C6CP05587G, 2016b.
Бунтковский, Г., Стехлик, Д., Вьет, Х.-М., Салихов, К.М .: Наносекунда. временное разрешение электронно-ядерной кросс-поляризации в пределах оптического процесс ядерной поляризации (ОНП), J.Phys., 3, 6093–6111, https://doi.org/10.1088/0953-8984/3/32/015, 1991.
Кавай, М., Борне, А., Жоран, X., Вюшу, Б., Бодуэн, Д., Бауден, М., Вейре, Л., Боденхаузен, Г., Думес, Ж.-Н., Джаннин, С., Копере, К., Тьёле, К.: Специальная микроструктурированная гиперполяризация Матрицы для оптимальной магнитно-резонансной томографии, Angew. Chem. Int. Ред., 130, 7575–7579, https://doi.org/10.1002/anie.201801009, 2018.
Демко, Д. Э., Тегенфельдт, Дж., И Во, Дж. С .: Динамика перекрестной релаксации. в ядерном магнитном двойном резонансе, Физ.Ред. B, 11, 4133–4151, https://doi.org/10.1103/PhysRevB.11.4133, 1975.
Dumez, J.-N., Milani, J., Vuichoud, B., Bornet, A., Lalande-Martin, J., Tea, И., Йон, М., Мокур, М., Деборд, К., Моинг, А., Фридман, Л., Боденхаузен, G., Jannin, S., и Giraudeau, P .: Гиперполяризованный ЯМР растений и рака. клеточные экстракты в естественном изобилии, Аналитик, 140, 5860–5863, https://doi.org/10.1039/C5AN01203A, 2015.
Эмид, С., Конийнендейк, Дж., Смидт, Дж., и Пайнс, А .: В короткие сроки поведение дипольного сигнала при релаксационных измерениях по импульсу метод, Physica B + C, 100, 215–218, https: // doi.org / 10.1016 / 0378-4363 (80) -X, 1980.
Фукусима, Э. и Редер, С. Б. В .: Экспериментальный импульсный ЯМР: гайки и Bolts Approach, CRC Press, Boca Raton, 1981.
Гадиан, Д. Г., Панесар, К. С., Перес Линде, А. Дж., Хорсвилл, А. Дж., Кёкенбергер В. и Оверс-Брэдли Дж. Р .: Приготовление высокоэффективных поляризованные системы ядерных спинов, использующие грубую силу и низкополевые тепловые перемешивание, Phys. Chem. Chem. Phys., 14, 5397–5402, https://doi.org/10.1039/C2CP23536F, 2012.
Хартманн, Г., Хьюберт, Д., Манго, С., Морхаус, К. К., и Плог, К.: Протон поляризация в спиртах при 50 кГс, 1 К, Nucl. Instrum. Meth. А, 106, 9–12, https://doi.org/10.1016/0029-554X(73)
-6, 1973.
Хартманн, С. Р. и Хан, Э. Л .: Двойной ядерный резонанс во вращающемся Frame, Phys. Ред., 128, 204–2053, https://doi.org/10.1103/PhysRev.128.2042, 1962.
Jannin, S., Bornet, A., Colombo, S., and Bodenhausen, G .: Низкотемпературный кросс-поляризация ввиду увеличения растворения Dynamic Nuclear Поляризация в ЯМР, Chem.Phys. Lett., 517, 234–236, https://doi.org/10.1016/j.cplett.2011.10.042, 2011.
Джинер Дж. и Брокерт П .: Ядерный магнитный резонанс в твердых телах: Термодинамические эффекты пары высокочастотных импульсов // Физ. Мезомех. Rev., 157, 232–240, https://doi.org/10.1103/PhysRev.157.232, 1967.
Джинер, Дж., Дю Буа, Р., и Брокерт, П .: «Зееман» и «Диполярное» вращение Температуры при сильном радиочастотном облучении // Физ. Мезомех. Ред., 139, A1959 – A1961, https://doi.org/10.1103/PhysRev.139.A1959, 1965.
Цзи, X., Bornet, A., Vuichoud, B., Milani, J., Gajan, D., Rossini, A.J, Эмсли, Л., Боденхаузен, Г., Джаннин, С .: переносимый гиперполяризованный Метаболиты, Nat. Commun., 8, 13975, https://doi.org/10.1038/ncomms13975, 2017.
Кессених А.В., Лущиков В.И., Маненков А.А., Таран Ю.В. Поляризация протонов в облученных полиэтиленах. Phys.-Sol. State, 5, 321–329, 1963.
Хитрин, А.К., Сюй, Дж., И Рамамурти, А .: Взаимные корреляции между low- γ ядер в твердых телах через общую дипольную ванну, J.Magn. Резон., 212, 95–101, https://doi.org/10.1016/j.jmr.2011.06.015, 2011.
Кунитомо, М., Хатанака, Х., Хаши, Т .: Адиабатическое размагничивание в вращающаяся рамка нерезонансным колеблющимся полем, Phys. Lett. А, 49, 135–136, https://doi.org/10.1016/0375-9601(74)-1, 1974.
Курур Н. Д. и Боденхаузен Г.: Адиабатический перенос когерентности в магнитном поле. Резонанс гомоядерных скалярно-связанных систем, J. Magn. Резон. Сер. А, 114, 163–173, https://doi.org/10.1006/jmra.1995.1123, 1995.
Lee, J.-S. и Хитрин, А.К .: Термодинамика адиабатического креста. поляризация, J. Chem. Физ., 128, 114504, https://doi.org/10.1063/1.2839436, 2008.
Lipsø, K. W., Bowen, S., Rybalko, O., and Ardenkjr-Larsen, J.-H .: Большая доза гиперполяризованной воды с растворением-ДНП в сильном магнитном поле, J. Magn. Резон., 274, 65–72, https://doi.org/10.1016/j.jmr.2016.11.008, 2017 г.
Macho, V., Stehlik, D., и Vieth, H.-M .: Эффекты спиновой когерентности в электронно-ядерный процесс передачи поляризации, Chem.Phys. Lett., 180, 398–402, https://doi.org/10.1016/0009-2614(91)85139-N, 1991.
Nelson, S.J., Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., Larson, P.E.Z., Харцстарк, А. Л., Ферроне, М., ван Крикинг, М., Чанг, Дж. У., Бок, Р., Парк, И., Рид, Г., Карвахал, Л., Смолл, Э. Дж., Мюнстер, П., Вайнберг, В. K., Ardenkjr-Larsen, J.-H., Chen, A.P., Hurd, R.E., Odegardstuen, Л.-И., Робб Ф. Дж., Тропп Дж. И Мюррей Дж. А .: Метаболическая визуализация пациенты с раком простаты, использующие гиперполяризованный [1- ¹³ C] пируват, Sci.Пер. Мед., 5, 198ра108, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3006070, 2013.
Торф, Д. Т., Хирш, М. Л., Гадиан, Д. Г., Хорсвилл, А. Дж., Оверс-Брэдли, Дж. Р. и Кемпф, Дж. Г .: Тепловое смешение в низком поле в [1- ¹³ C] пировиноградной кислота для гиперполяризации методом грубой силы, Phys. Chem. Chem. Физ., 18, 19173–19182, https://doi.org/10.1039/C6CP02853E, 2016.
Перес Линде, А. Дж .: Применение методов кросс-поляризации к динамическим Эксперименты по растворению ядерной поляризации, докторская диссертация, Университет г. Ноттингем, Великобритания, 2009 г.
Пайнс, А., Гибби, М., и Во, Дж .: Протонно-усиленная ядерная индукция спектроскопия ¹³ C анизотропия химической защиты в некоторых органических твердых веществах, Chem. Phys. Lett., 15, 373–376, https://doi.org/10.1016/0009-2614(72)80191-X, 1972.
Редфилд А.Г .: Термодинамика ядерного спина во вращающейся системе отсчета, Наука, 164, 1015–1023, https://doi.org/10.1126/science.164.3883.1015, 1969.
Сугишита Т., Мацуки Ю. и Фудзивара Т .: Абсолютная ¹ H поляризация. измерение со спин-коррелированной компонентой намагниченности гиперполяризованный твердотельный ЯМР MAS-DNP, J.Magn. Резон., 99, 20–26, https://doi.org/10.1016/j.ssnmr.2019.02.001, 2019.
Vieth, H.-M. и Яннони, С.С.: Кросс-поляризация в твердотельном ЯМР. спектроскопия. Эффективная передача поляризации с помощью незеемановского спина резервуар, Chem. Phys. Lett., 205, 153–156, https://doi.org/10.1016/0009-2614(93)89220-C, 1993.
Винтер, Дж. М. О., Журбенко, В., Албаннай, М. М., и Арденкьер-Ларсен, Ж.-Х .: Разработка локальной квазираспределенной схемы настройки и согласования для растворение Кросс-поляризация DNP, Solid State Nucl.Mag., 102, 12–20, https://doi.org/10.1016/j.ssnmr.2019.04.006, 2019.
Вюишо, Б., Борне, А., де Нантей, Ф., Милани, Дж., Кане, Э., Джи, ИКС., Миевиль, П., Вебер, Э., Курцбах, Д., Фламм, А., Конрат, Р., Госсерт, A.D., Jannin, S. и Bodenhausen, G .: Фильтруемые агенты для Гиперполяризация воды, метаболитов и белков, Chem. Евро. J., 22, 14696–14700, https://doi.org/10.1002/chem.201602506, 2016.
Zhang, S., Stejskal, E., Fornes, R., and Wu, X .: Mismatching Cross Поляризация во вращающейся рамке, Дж.Magn. Резон. Сер. А, 104, 177–179, https://doi.org/10.1006/jmra.1993.1206, 1993.
Диагностика | Бесплатный полнотекстовый | Последние достижения в технологии радиочастотных катушек для птичьей клетки для системы МРТ
1. Введение
Ядерно-магнитно-резонансная томография (ЯМР) считается наиболее передовым и всеобъемлющим методом анализа в различных областях исследований современной науки. Явление ЯМР было впервые введено в 1936 году для измерения ядерных магнитных моментов различных ядер и нейтронов [1,2,3,4].Метод основан на обнаружении электромагнитных волн определенной частоты, которые излучаются предварительно возбужденными протонами водорода (¹ H) в сильном и однородном магнитном поле. Долгое время основное применение ЯМР ограничивалось спектроскопическим анализом в химии и физике. Однако спектроскопия ЯМР не ограничивалась протоном ¹ H; он был расширен на элемент с неспаренным протоном, такой как ¹³ C, ¹⁴ N, ¹⁷ O, ¹⁹ F, ²³ Na и ³¹ P [5].В начале 1970-х годов было предложено использование ЯМР для клинической медицинской визуализации [6,7,8]. Однако методы использования метода ЯМР для медицинской визуализации с помощью некоторых подходящих инструментов, которые в настоящее время известны как система магнитно-резонансной томографии (МРТ), для клинического использования были продемонстрированы в конце 1970-х — начале 1980-х годов [9, 10,11,12]. МРТ — это безызлучательная и неинвазивная процедура, которая выполняется для получения подробной информации о внутреннем метаболизме биологических объектов, таких как человек и животное, в виде двухмерных (2D) изображений в оттенках серого.Эта функция сделала МРТ предпочтительным выбором для медицинской визуализации в течение последних трех десятилетий, даже при наличии некоторых превосходных медицинских методов визуализации, таких как рентген, ультразвуковое исследование, компьютерная томография (КТ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и т. Д. . Среди различных частей системы МРТ радиочастотные (РЧ) катушки привлекают больше внимания из-за их непосредственного участия в передаче и приеме РЧ-сигналов [13]. Радиочастотные катушки создают чисто однородное переменное магнитное поле (известное как поле B1) в направлении, поперечном к основному статическому магнитному полю (известному как поле B0) системы МРТ.Поле B1 возбуждает неспаренные протоны на определенной радиочастоте, известной как частота Лармора [4,9]. Этот процесс увеличивает уровень энергии неспаренных протонов, что позволяет им переходить в нестабильное состояние с более высокой энергией. После удаления магнитного поля B1 протоны высвобождают поглощенную энергию на той же ларморовской частоте и возвращаются в свое исходное стабильное энергетическое состояние. Высвободившаяся энергия известна как задержка индукции поля (FID), которая в рукописи будет обозначаться как сигнал ЯМР.Такой сигнал принимается или обнаруживается той же передающей РЧ катушкой или отдельной приемной РЧ катушкой. Радиочастотная катушка может быть предназначена для регистрации сигнала ЯМР как от всего объема, так и от определенного места объекта. Сигнал ЯМР — слабый сигнал, появляющийся через короткий промежуток времени [9]. Этот слабый сигнал ЯМР может быть обнаружен с помощью хорошо спроектированной высокочувствительной РЧ-катушки с более высоким отношением сигнал / шум (SNR), а затем он преобразуется в значимые изображения при использовании методов обработки сигналов и изображений.Однако радиочастотная катушка, разработанная для определенной частоты ЯМР определенного элемента, не может использоваться для любого другого элемента или системы магнитно-резонансной томографии с другой напряженностью поля. Было разработано несколько конструкций радиочастотных катушек для различных применений [14,15]. Более того, существует несколько методов классификации этих РЧ-катушек на основе их определенных характеристик. При рассмотрении их принципов работы РЧ катушки можно разделить на РЧ катушку передатчика, РЧ катушку приемника и РЧ катушку приемопередатчика [10,13].Радиочастотная катушка передатчика используется только для создания однородного магнитного поля B1 в объеме изображения на частоте Лармора, тогда как катушка приемника с высоким SNR используется только для обнаружения сигнала ЯМР на той же частоте Лармора. И наоборот, радиочастотная катушка приемопередатчика используется как для передачи, так и для приема. Исходя из структурной геометрии ВЧ катушек, их можно разделить на объемные катушки и поверхностные катушки [16]. Как правило, объемные катушки в основном имеют цилиндрическую форму и используются для получения ЯМР-изображений всего объекта.Седловая катушка [17], катушка «птичья клетка» [18], катушка с поперечным электромагнитным излучением (ТЕМ) [19] и катушка с фазированной решеткой [20] являются некоторыми известными и широко используемыми объемными катушками. С другой стороны, поверхностные катушки считаются 2D-планировочной версией ВЧ-катушек [21,22]. Они используются для получения ЯМР-изображений конкретного интересующего места из всего объема. С точки зрения поляризации переменного магнитного поля B1 ВЧ катушки делятся на линейные и циркулярно поляризованные типы [13].Радиочастотные катушки с линейной поляризацией оснащены одним портом, тогда как радиочастотные катушки с круговой поляризацией оснащены двумя портами (в квадратуре фазы относительно друг друга) для передачи и / или приема радиочастотного сигнала. Радиочастотная катушка с круговой поляризацией имеет отношение сигнал / шум в 2 раза выше, чем ее версия с линейной поляризацией [23]. Учитывая направление магнитного поля B1, РЧ катушки можно разделить на РЧ катушку с осевым полем и РЧ катушку с поперечным полем [24]. Радиочастотные катушки с осевым полем используются для создания магнитного поля B1 в направлении, параллельном их оси симметрии, тогда как радиочастотные катушки с поперечным полем используются для создания магнитного поля B1 в направлении, перпендикулярном их оси симметрии.Радиочастотные катушки, используемые для МРТ, на самом деле являются микроволновыми резонаторами, которые способны создавать однородно распределенное сильное магнитное поле в ближней зоне (B1) [25]. Они состоят из индуктивных и емкостных элементов с идеально нулевым сопротивлением для получения желаемой резонансной частоты [15]. Обычно процесс проектирования и анализа радиочастотных катушек выполняется с использованием простых в использовании методов анализа микроволновых цепей. Однако их точность ограничена двумя факторами. Во-первых, это отсутствие точности в создании модели электрической эквивалентной схемы излучающей структуры.Второе, что более важно, — это их неспособность должным образом дискретизировать область вокруг излучающей структуры для анализа электромагнитных (ЭМ) полей. Другим очевидным решением для проектирования и анализа ВЧ-катушек являются сложные аналитические численные методы, такие как метод конечных элементов (FEM), метод конечных разностей во временной области (FDTD) и метод моментов (MoM). Эти методы обеспечивают более точную конструкцию и анализ ВЧ-катушки, поскольку они довольно эффективно решают описанный выше второй фактор.Однако они включают сложные численные вычисления, требующие обширных математических знаний. За последнее десятилетие развитие и развитие программного обеспечения для трехмерного двухполупериодного электромагнитного моделирования полностью изменили тенденции в области проектирования радиочастотных катушек. Это программное обеспечение, основанное на аналитических численных методах, обеспечивает единую платформу для проектирования и анализа ВЧ-катушек. Реализация ВЧ-катушек является чувствительной и важной процедурой. Тип и геометрия проводника, собственная индуктивность и взаимная индуктивность, а также сосредоточенная емкость — это факторы, которые необходимо серьезно учитывать.Введение протравленных проводников на гибких печатных платах (FPCB) в процесс создания РЧ катушек произвело революцию в области техники РЧ катушек [26]. ВЧ-катушки, реализованные с использованием таких методов, более механически устойчивы, менее устойчивы к потерям в цепи и демонстрируют отличные характеристики. ВЧ-резонатор в виде птичьей клетки — самая известная и широко используемая ВЧ-катушка для объемной ЯМР-визуализации в клинических и доклинических исследованиях [27]. . Катушки с ПЭМ и фазированной решеткой также являются выдающимися кандидатами для применения в области объемной ЯМР-визуализации.Однако они требуют строгой конструкции в отношении целевых приложений, а также сложной электронной схемы для управления передаваемым и принимаемым радиочастотным сигналом, что в некоторой степени превращается в недостаток. С другой стороны, катушка в виде птичьей клетки известна тем, что создает сильное и однородное магнитное поле, независимо от размера катушки, целевого применения и напряженности поля системы МРТ. В этой статье представлен всесторонний обзор прогресса в разработке, анализе и реализации методов катушки для птичьей клетки.Помимо обзора развития традиционных методов, основным мотивом этой работы является сосредоточение внимания на последних тенденциях, которые были приняты в предыдущем десятилетии для проектирования, анализа и реализации катушки для птичьей клетки для различных приложений МРТ. Этот документ разделен на три части. Первая часть посвящена «Катушке для птичьей клетки», посвященной литературе, касающейся принципа и функциональности обычной катушки для птичьей клетки. Вторая часть представляет собой всесторонний обзор работы, представленной в области «Проектирование и анализ катушки для птичьей клетки».В последней части представлен обзор литературы «Методики реализации катушки для птичьей клетки».
5. Выводы
Резонатор в форме птичьей клетки считается наиболее успешной радиочастотной катушкой для МРТ всего объема в клинических и исследовательских целях. Его превосходная однородность магнитного поля B1 и высокое отношение сигнал / шум, независимо от его размера, делают его предпочтительным выбором для визуализации в любой системе МРТ с напряженностью поля. В статье представлен подробный литературный обзор принципа, функциональности, конструкции, анализа, реализации и специальных типов катушки для птичьей клетки.Основная цель этой работы состояла в том, чтобы показать общий прогресс во всех областях, связанных с разработкой катушек для птичьих клеток. Обзор литературы, представленный в этой статье, можно резюмировать по трем основным пунктам. Во-первых, программное обеспечение для трехмерного электромагнитного моделирования стало неотъемлемой частью процедур анализа и проектирования ВЧ-катушки для птичьей клетки. Большинство исследований, связанных с катушкой для птичьей клетки, о которых сообщалось в предыдущее десятилетие, полностью или частично основаны на численном электромагнитном моделировании.Программное обеспечение для трехмерного электромагнитного моделирования на основе FEM и FDTD, которое имеется в продаже, стало предпочтительным выбором из-за их надежности и эффективности. Во-вторых, даже при наличии передового программного обеспечения для численного электромагнитного моделирования разработка аналитических методов для упрощения проектирования и анализа катушки для птичьей клетки стала предметом интереса. Наиболее желательной и важной особенностью аналитических решений является установление взаимосвязи между расчетными параметрами и параметрами анализа.Сохранение расстояния между проводниками ножек катушки и геометрия проводов считаются критическими факторами для надлежащей работы катушки для птичьей клетки. Третий и наиболее важный момент — это прогресс в реализации прототипа катушки для птичьей клетки. Рабочие характеристики проводников с цилиндрическим и прямоугольным поперечным сечением при различной напряженности поля были предметом обсуждения. Более того, было замечено, что цилиндрические проводники для низкополевых и прямоугольные проводники для высокополевых приложений были обычным выбором для реализации прототипа новых катушек для птичьей клетки.Однако при таком выборе ножных проводников поддержание соответствующего разделения всегда было важной проблемой. К счастью, эта проблема была эффективно решена с помощью технологии протравливания проводников FPCB. Эта технология является ключевым фактором при разработке специальных катушек для птичьих клеток. Большинство обычных, модифицированных и мультирезонансных катушек типа «птичья клетка», о которых сообщалось в предыдущем десятилетии, были реализованы с использованием паттерна проводников, протравленного FPCB.
2D гомоядерная корреляция 1H твердотельный ЯМР с помощью wPMLG | Приложения
Спектроскопия ЯМР с многомерной корреляцией, которая обеспечивает межъядерную близость / связь, играет решающую роль в исследовании структур с атомным разрешением.В частности, гомоядерная корреляционная спектроскопия ¹ H- ¹ H является весьма полезным источником информации из-за высокой распространенности (> 99%) и гиромагнитного отношения, что приводит к сильным межъядерным взаимодействиям. Благодаря развитию твердотельного ЯМР высокого разрешения ¹ H, теперь стало возможным наблюдать твердотельный ЯМР высокого разрешения с корреляцией ¹ H- ¹ H [1]. Есть две отличительные категории; 1) одноквантовые (SQ) / SQ-корреляции и 2) двойные квантовые (DQ) / SQ-корреляции.В этой заметке мы представляем корреляционную спектроскопию 2D ¹ H SQ / ¹ H SQ и ¹ H DQ / ¹ H SQ для исследования межъядерной близости с использованием методов твердотельного ЯМР ¹ H с высоким разрешением.
¹ H SQ / ¹ H SQ корреляции Когерентность
SQ наблюдается в косвенном измерении t ₁, таким образом, практически одинаковые спектры появляются в обоих измерениях. Это упрощает спектральную интерпретацию.Связность можно определить по недиагональным поперечным пикам. Последовательность в основном такая же, как в экспериментах NOESY, но wPMLG применяется во время измерений t ₁ и t ₂ для достижения развязки ¹ H- ¹ H во время эволюции спина (рис. 1). Первый импульс возбуждает когерентность SQ. После эволюции t ₁ намагниченность сохраняется вдоль оси z с помощью второго 90-градусного импульса. Намагниченность ¹ H распространяется на другие ¹ H во время смешивания.Наконец, намагничивание наблюдается в течение t ₂ после третьего 90-градусного импульса. В этом подходе корреляция ¹ H- ¹ H устанавливается во время смешивания между косвенным SQ и прямым SQ измерениями. Поскольку намагниченность сохраняется вдоль оси z, можно увеличить время перемешивания до порядка ¹ H T ₁, обеспечивая множественную ретранслируемую передачу когерентности или спиновую диффузию. Таким образом, SQ / SQ потенциально может обеспечить корреляцию на большом расстоянии (~ 100 А).Кроме того, полуколичественное измерение расстояния может быть достигнуто путем мониторинга нарастания корреляционных пиков. Обычно кривая нарастания рассчитывается с помощью эмпирического уравнения спиновой диффузии [2], однако также может применяться явный расчет спиновой динамики [3]. Один из недостатков — наличие некоррелированного пика на диагональной линии. Это затрудняет наблюдение корреляций между ядрами, обладающими одинаковыми или очень близкими химическими сдвигами.
Рис. 1.
Последовательность импульсов (слева) и схематическое представление спектра корреляции ¹ H SQ / ¹ H SQ (справа).
¹ H SQ / ¹ H SQ корреляции: экспериментальная установка Разделение wPMLG оптимизировано экспериментами со спин-эхом. Мы рекомендуем суперциклинг wPMLG с вращением по оси z, чтобы избежать необходимости подстройки импульсов. Поскольку в косвенном измерении окно сбора данных не требуется, PMLG без окон или другие последовательности развязки без окон ¹ H-¹ H могут использоваться во время t ₁. Однако это приводит к другому коэффициенту масштабирования в измерении t ₁, чем в t ₂, что усложняет обработку.Здесь мы рекомендуем для простоты использовать ту же последовательность развязки ¹ H, что и размер t ₂. Непрямая спектральная ширина автоматически синхронизируется с блоком wPMLG и определяется LG_Loop в импульсной программе. Сигнал дискретизируется каждые время цикла LG_Loop блока wPMLG в косвенном измерении. Максимизируя LG_LOOP или минимизируя косвенную спектральную ширину, можно сократить время эксперимента. Можно легко оптимизировать минимальную непрямую спектральную ширину, исследуя одномерный спектр wPMLG.Поскольку 1D спектр wPMLG дискретизируется в каждом блоке wPMLG, ширина спектра автоматически устанавливается как 1 / cycle_time. Таким образом, спектральный диапазон составляет от -1 / (2 x cycle_time) до + 1 / (2 x cycle_time). Если пики появляются только между -1 / (n x 2 x cycle_time) до + 1 / (n x 2 x cycle_time), можно безопасно дискретизировать сигнал каждые n x время цикла wPMLG. Как показано на рис. 2, LG_LOOP = 4 достаточно широк, чтобы покрыть спектральный диапазон в этом случае. Однако артефакты, которые появляются за пределами области пика, будут свернуты в спектральный диапазон, установив LG_LOOP больше единицы.
Таким образом, если позволяет время, предпочтительнее использовать LG_LOOP = 1, чтобы избежать сложности. Поскольку ¹ H- ¹ H спиновая диффузия является достаточно быстрой при умеренной скорости MAS, в большинстве случаев во время перемешивания радиочастотное поле не применяется. Однако при необходимости может быть применена последовательность восстановления / развязки [4]. Поскольку время смешивания работает как z-фильтр, или, другими словами, остаточная поперечная намагниченность подавляется во время смешивания, двухступенчатого фазового цикла достаточно для выбора пути когерентности. В случае нулевого или очень короткого времени смешивания необходимо дополнительное трехступенчатое переключение фаз, которое составляет общее 6-ступенчатое переключение фаз, чтобы подавить поперечное намагничивание во время перемешивания.Хотя для распространения намагниченности ¹ H на удаленные ¹ Hs можно использовать длительное время перемешивания, время перемешивания должно быть меньше, чем ¹ H T ₁. В противном случае сигнал будет потерян.
Рис. 2.
¹ H wPMLG Спектр L-тирозина.HCl при 12 кГц при 14,1 Тл. Ширина спектра автоматически устанавливается равной 1 / cycle_time. Поскольку весь пик составляет от -1 / (4 x 2 x cycle_time) до + 1 / (4 x 2 x cycle_time), выборки каждые четыре времени цикла wPMLG достаточно для покрытия всей спектральной области в косвенном измерении ^{. 1} H SQ / ¹ H SQ корреляционные спектры.
¹ H SQ / ¹ H SQ корреляции: обработка данных
Прямое измерение такое же, как 1D wPMLG. Linear_Ref и Reference должны применяться для корректировки масштабирования химического сдвига. Поскольку косвенный размер представляет собой химический сдвиг SQ, можно применить такое же масштабирование. На рис. 3 показан результирующий двухмерный спектр и список используемых процессов.
Рис. 3.
¹ H SQ / ¹ H SQ-корреляционный спектр L-тирозина.HCl при 12 кГц ниже 14.1 Т (слева). Разделение wPMLG применяется как к размерам t ₁, так и к t ₂. Время перемешивания не используется (время перемешивания = 0). Список процессов в основном такой же, как и в обычном 2D, но функции Linear_Ref и Reference должны применяться к обоим измерениям (справа). Приращение косвенного измерения устанавливается равным четырехкратному времени цикла wPMLG, задав Lg_loop = 4. 128 t ₁ точек было собрано с 6 банками для каждого. Общее время измерения составляло 128 x 6 x 2 x 1.5 с (задержка повторения) = 39 мин.
На рис. 3 не появляются корреляционные пики из-за отсутствия времени перемешивания. Однако даже очень короткое время смешивания 50 мкс приводит к появлению кросс-пиков между соседними ¹ Hs (рис. 4a). Интенсивность кросс-пиков быстро растет со временем перемешивания. (Рис. 4b и c). Анализ нароста дает полуколичественную информацию о расстоянии между ¹ Hs.
Рис. 4.
¹ H SQ / ¹ H SQ корреляционный спектр L-тирозина.HCl при 12 кГц при 14,1 Тл при времени смешивания 50 мс (а), 0,1 мс (б) и 0,2 мс (в). Глюк, отмеченный звездочкой, — это артефакт, появляющийся в центре косвенного измерения. Приращение косвенного измерения устанавливается равным четырехкратному времени цикла wPMLG, задав Lg_loop = 4. 128 t ₁ точек было собрано с 2 банками для каждого. Общее время измерения составляло 128 x 2 x 2 x 1,5 с (задержка повторения) = 13 минут для каждого.
¹ H DQ / ¹ H SQ корреляции
Близость между ¹ Hs также можно контролировать с помощью корреляционной спектроскопии ¹ H DQ / ¹ H SQ (рис. 5).В отличие от корреляции ¹ H SQ / ¹ H SQ, корреляция ¹ H DQ / ¹ H SQ дает очень локальную близость ниже <4A и полезна для исследования структуры атомного разрешения. В этих экспериментах первая когерентность DQ создается блоком возбуждения DQ. Когерентность DQ развивается в течение периода t ₁ под облучением wPMLG. Затем он преобразуется в продольную намагниченность блоком преобразования DQ. Перед окончательным считыванием импульса под углом 90 градусов можно было вставить шофт-фильтр.Наконец, SQ-когерентность наблюдается при разделении wPMLG. Можно обнаружить близкое сходство с последовательностью ¹ H SQ / ₁ H SQ. Фактически, последовательность DQ / SQ может быть описана путем замены первого и второго 90-градусного импульса в блоках возбуждения и реконверсии SQ / SQ на DQ, соответственно. Основное отличие заключается в механизме установления корреляции ¹ H- ¹ H. В то время как в экспериментах SQ / SQ используется спиновая диффузия ¹ H-¹ H во время смешивания, две спиновые когерентности DQ, которые создаются блоком возбуждения DQ, сообщают о двух близостях спинов в экспериментах DQ / SQ.Диполярное усечение во время воссоединения DQ препятствует созданию DQ-когерентности между удаленными спинами. Таким образом, наблюдается только короткое (обычно <4 A) приближение ¹ H. Вся корреляция появляется в спектрах DQ / SQ из-за двух спиновых связей в 4 А. Никаких некоррелированных пиков не появляется. Это упрощает спектральную интерпретацию. Схематический 2D-спектр DQ / SQ показан на рис. 5. Два пика появляются при ω _A и ω _B в измерении SQ.Корреляция между одинаковым вращением между A и A проявляется в ω _A + ω _A = 2 ω _A в косвенном измерении, таким образом (DQ, SQ) = (2 ω _А, ω _А). По этой причине диагональная линия строится с наклоном 2, проходящим при (0, 0) ppm. Отсутствие корреляции при (DQ, SQ) = (2 ω _A, ω _A) показывает, что B не имеет подобного спина на близком расстоянии.Корреляция между A и B появляется при (DQ, SQ) = ( ω _A + ω _B, ω _A) и ( ω _A + ω _B, ω _B) на равноудалении от диагональной линии.
Рис. 5.
Последовательность импульсов (слева) и схематическое представление спектра корреляции ¹ H DQ / ¹ H SQ (справа). Все пики, появляющиеся в спектрах, являются коррелированными пиками.
¹ H DQ / ¹ H SQ корреляции: экспериментальная установка
Один и тот же блок wPMLG с поворотом по оси z применяется в течение периодов t ₁ и t ₂. Хотя любая схема воссоединения ¹ H DQ, в принципе, может использоваться для периодов возбуждения и реконверсии, мы рекомендуем POST-C7 из-за устойчивости к экспериментальным недостаткам и его гамма-кодированной природы [5,6]. Поскольку POST-C7 требует, чтобы напряженность ВЧ-поля в семь раз превышала скорость MAS, максимальная скорость MAS часто ограничивается возможностями ВЧ-поля ¹ датчика.Например, зонд, который может принимать облучение 100 кГц ¹ H, поддерживает POST-C7 со скоростью 100/7 = 14,3 кГц MAS. Таким образом, скорость MAS должна быть тщательно выбрана, чтобы можно было применить POST-C7. POST-C7 имеет только один параметр, который нужно оптимизировать, то есть напряженность РЧ поля. Экспериментальная оптимизация может быть выполнена путем сравнения одномерных спектров при t ₁ = 0 с изменяющейся напряженностью радиочастотного поля (obs_amp_c7). (Рис. 6) Поскольку POST-C7 достаточно устойчив к изменению напряженности РЧ поля, нет необходимости в точной пошаговой настройке.Обычно мы меняем каждые 5 кГц или около того. Эффективность фильтрации DQ по сравнению с обычным 1D wPMLG обычно составляет 5-20% для твердых тел. Следует отметить, что пики в косвенном измерении DQ появляются не в центре, а в положении вращающейся боковой полосы из-за механизма повторной связи DQ. [7] POST-C7 объединяет m = 1 членов гамма-кодированным способом, таким образом, пик появляется в положениях +1 SSB, или, другими словами, все пики смещены со скоростью MAS в сторону высоких частот (рис. 7). .Таким образом, положения пиков можно легко скорректировать, просто сместив положение пика со скоростью MAS. Любая скорость MAS может использоваться в случае POST-C7, если зонд принимает напряженность РЧ поля. Положение пика в косвенном измерении можно предсказать, включая сдвиг частоты + MAS. Однако это немного сложно. Таким образом, мы рекомендуем использовать максимально широкий спектральный диапазон с LG_LOOP = 1, если позволяет время. Вместо этого можно повторить быстрые 2D-эксперименты, варьируя LG_LOOP так, чтобы все пики попадали в непрямой спектральный диапазон.Во время этой оптимизации можно использовать z-фильтр, если z-фильтр не изменяет спектральный диапазон в косвенном измерении. Это позволяет переключать фазы в 4 этапа, сокращая время эксперимента.
[Последовательности обратного связывания DQ без гамма-кодирования создают дополнительную трудность, поскольку косвенная спектральная ширина должна быть такой же, как скорость MAS, как обсуждается ниже. По этой причине мы рекомендуем гамма-кодированную последовательность. Последовательности без гамма-кодирования дают пики в +/- 1 или 2 положениях SSB, что дает дополнительные расщепления. Чтобы избежать расщепления, спектральная ширина косвенного измерения должна быть синхронизирована со скоростью MAS.Когда спектральная ширина равна скорости MAS, все пики DQ возвращаются обратно в центральную полосу. Этот подход часто используется на быстрых MAS, избегая сложности смещения пиков. Однако это также создает дополнительную проблему ограниченной спектральной ширины, особенно при умеренной скорости MAS. Например, ширина спектра 12 кГц, соответствующая 20 ppm при 14,1 Тл, недостаточна для покрытия всего диапазона спектров ¹ H DQ.]
Рис. 6.
DQ-фильтр ¹ H-спектры L-тирозина.HCl при 12 кГц и 14,1 Тл, наблюдаемых при различной напряженности ВЧ поля для POST-C7. Спектры наблюдались с использованием последовательности на рис. 5 с t ₁ = 0. Хотя номинальная напряженность РЧ поля для POST-C7 в семь раз превышает скорость MAS, максимальная эффективность DQ может проявляться при немного другой напряженности РЧ поля.
Рис. 7.
Проекция на размер DQ корреляционных спектров DQ / SQ L-тирозина.HCl при скорости MAS 12 кГц и 14,1 Тл. POST-C7 используется для возбуждения / преобразования когерентности DQ.Пики DQ появляются не в центре, а в позициях +1 SSB.
Z-фильтр можно использовать для подавления поперечного намагничивания, делая всего 4 шага сканирования. Однако рекомендуется использовать нулевой z-фильтр, чтобы избежать спиновой диффузии во время z-фильтра. В этом случае для выбора когерентности нам потребуется 12-ступенчатое переключение фаз. Рис. 8 демонстрирует эффект спиновой диффузии во время z-фильтрации. При отсутствии z-фильтрации появляются обычные шаблоны ¹ H DQ / ¹ H SQ (рис. 8a).Однако установка z-фильтра длительностью 1 мс приводит к появлению множества дополнительных пиков, возникающих из-за спиновой диффузии (рис. 8b). Как видно из рис. 4, доли миллисекунды достаточно, чтобы вызвать вращательное перемешивание ¹ H- ¹ H при умеренной скорости MAS, ухудшая спектры ¹ H DQ / ¹ H SQ. Мы рекомендуем не использовать z-фильтрацию, чтобы избежать этой сложности.
Необходимо соблюдать осторожность во время сбора данных. Поскольку высокочастотное поле применяется почти непрерывно во время возбуждения, t ₁, реконверсия и период t ₂, общая продолжительность должна быть меньше 50 мс, чтобы избежать отказа датчика.Будьте осторожны с x_acq_time и y_acq_time.
Рис. 8.
¹ H DQ / ¹ H SQ-корреляционные спектры L-тирозина.HCl при 12 кГц MAS при 14,1 Тл без (a) и с (b, 1 мс) z-фильтрацией . Межъядерные связи показаны красной линией на (а). Обратите внимание, что присвоения ¹ H являются предварительными.
¹ H DQ / ¹ H SQ корреляции: обработка данных (рис.9) Прямое измерение такое же, как 1D wPMLG.Linear_Ref и Reference должны применяться для корректировки масштабирования химического сдвига. В косвенном измерении положение первого пика должно быть смещено со скоростью MAS, поскольку пики появляются на +1 SSB (а не в центре). Это можно сделать с помощью функции ссылки. Затем применяется Linier_Ref для изменения масштаба химического сдвига. Обратите внимание, что спектральный центр больше не находится на уровне 50 [%], так как мы применили эталон на первом этапе. Чтобы исправить этот коэффициент, для параметра Center следует установить значение x_offset * 2, которое автоматически преобразуется в числовое значение в зависимости от используемых экспериментальных условий.Поскольку положение пика в измерении DQ удваивается, параметр, используемый в последующем эталоне, должен быть удвоен по сравнению с размером SQ. Наконец, диагональная линия проведена с наклоном 2.
Рис. 9.
Список процессов, использованных при обработке корреляционных спектров ¹ H DQ / ¹ H SQ L-тирозина.HCl при 12 кГц MAS ниже 14.1 Т.
Полученный таким образом спектр 2D ¹ H DQ / SQ показан на рис. 8 (а). Внимательный взгляд на спектр (рис. 10) дает подробную информацию о межъядерных связях.Отдельно наблюдаются H7 и h21, которые перекрываются в одномерном измерении. Такое же улучшение разрешения можно найти и в H8 и 13. Как показано здесь, корреляционные спектры DQ / SQ иногда улучшают разрешение, добавляя измерение DQ.
Рис. 10.
Расширение ¹ H DQ / ¹ H SQ корреляционные спектры L-тирозина.HCl при 12 кГц MAS при 14,1 T. Полный спектр показан на Рис. 8 (a). Обратите внимание, что присвоения ¹ H являются предварительными. Приращение косвенного измерения устанавливается равным времени цикла wPMLG, задав Lg_loop = 1.512 т ₁ баллов собрано по 12 банок на каждую. Общее время измерения составило 512 x 12 x 2 x 1,5 с (задержка повторения) = 5,2 часа.
Артикул:
[1] С.П. Браун, Prog. Nucl. Magn. Резон. Spectrosc. 50 (2007) 199-251.
[2] E. Salager, R.S. Штейн, К.Дж. Пикард, Б. Елена, Л. Эмсли, Phys. Chem. Chem. Phys. 11 (2009) 2610-2621.
[3] Ж.-Н. Думес, М. Батлер, Э. Сэлагер, Б. Елена-Херрманн, Л. Эмсли, Phys. Chem. Chem. Phys.12 (2010) 9172-9175.
[4] N.T. Duong, S. Raran-Kurussi, Y. Nishiyama, V. Agarwal, J. Magn. Резон. 317 (2020) 106777.
[5] Х. Хоуи, Х. Дж. Якобсен, М. Иден, М. Х. Levitt, N.C. Nielsen, J. Chem. Phys. 108 (1998) 2686-2694.
[6] С.П. Браун, А. Лесаж. Б. Елена, Л. Эмсли, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 13230-13231.
[7] Х. Гин, Дж. Дж. Титман, Дж. Готвальд, Х.В. Spiess, J. Magn. Резон. А 114 (1995) 264-267.
Дополнительную информацию см. В файле PDF.
Другое окно открывается при нажатии.

PDF 2,226 КБ
Избирательная потеря нейронов полосатого тела на мышиной модели болезни Хантингтона YAC128 | Молекулярная генетика человека
Аннотация
Расширенный CAG-повтор является основным генетическим дефектом при болезни Хантингтона, расстройстве, характеризующемся моторным, психиатрическим и когнитивным дефицитом и атрофией полосатого тела, связанной с потерей нейронов. Точная модель этого заболевания на животных имеет решающее значение для выяснения естественного течения болезни, а также для тестирования экспериментальных терапевтических средств.Мы создали новую модель HD у мышей с искусственной хромосомой дрожжей (YAC) с полным человеческим геном HD, содержащим 128 CAG-повторов (YAC128), который развивает двигательные аномалии и возрастную атрофию мозга, включая атрофию коры и полосатого тела, связанную с потерей нейронов полосатого тела. Мыши YAC128 проявляют начальную гиперактивность, за которой следует начало двигательного дефицита и, наконец, гипокинез. Моторный дефицит у мышей YAC128 сильно коррелирует с потерей нейронов полосатого тела, обеспечивая структурный коррелят для поведенческих изменений.Определена естественная история изменений, связанных с HD, у мышей YAC128, демонстрирующая наличие включений хантинтина после начала поведения и невропатологических изменений. Связанные с HD фенотипы мышей YAC128 демонстрируют фенотипическую однородность с низкой вариабельностью между животными, что вместе с возрастной нейродегенерацией полосатого тела делает их идеальной мышиной моделью для оценки нейропротективных и других терапевтических вмешательств.
ВВЕДЕНИЕ
Открытие гена, ответственного за болезнь Хантингтона (БХ) в 1993 г., способствовало разработке нескольких генетических мышейных моделей этого аутосомно-доминантного нейродегенеративного заболевания (1).Модели трансгенных мышей, которые экспрессируют (в большинстве случаев) усеченный N-концевой фрагмент хантингтина под контролем различных промоторов, были первыми описанными моделями (2–4). Репликация основного генетического дефекта, экспансия CAG, путем вставки увеличенного повтора в ген хантингтина мыши, привела к созданию моделей «нокаута» (5-8).
Хотя модели knock-in точно воспроизводят лежащий в основе генетический дефект HD, они не проявляют стойких моторных дефицитов и не демонстрируют атрофию мозга и потерю нейронов, которые характеризуют заболевание человека (5-8).Напротив, усеченные, N-концевые мыши демонстрируют атрофию полосатого тела и быстрое начало двигательного дефицита (2,3). В то время как фенотип с быстрым проявлением полезен для изучения, эти усеченные мыши по определению не имеют полноразмерного белка хантинтина и, следовательно, не полностью воспроизводят белковый контекст состояния человека.
Мы ранее создали модель HD мыши с искусственной хромосомой дрожжей (YAC) (9,10). Наша цель состояла в том, чтобы создать модель мышей, которая экспрессировала полноразмерную форму хантингтина под контролем эндогенного промотора хантингтина и регуляторных элементов.YAC удовлетворяет обоим этим требованиям, охватывая всю геномную область гена HD человека, включая промоторные, интронные, расположенные выше и ниже регуляторные элементы. Полноразмерный человеческий белок хантингтин экспрессируется тканеспецифичным образом, идентичным эндогенному белку мыши (9,10).
Первоначально мы создали мышей YAC с 46 и 72 повторами CAG (мутантные мыши хантингтина) и мышей YAC с 18 повторами в гене HD (контрольные мыши) (10). Эти мыши помогли выяснить различные пути, участвующие в патогенезе HD, включая повышенную восприимчивость к эксайтотоксической гибели клеток нейронов с мутантным гентингтином (11-13), открытие снижения продукции BDNF при HD (14), наличие митохондриальной дисфункции (15). ) и антиапоптотическая роль хантингтина дикого типа (16).Однако гиперактивность и дегенерация нейронов у мышей YAC72 проявлялись на поздних сроках жизни мышей (7 и 12 месяцев, соответственно), и первоначальная оценка фенотипов, связанных с HD, у этих мышей использовала преимущественно качественные измерения (10). Кроме того, наличие значительной вариабельности у мышей, связанных с HD, вызвало беспокойство при оценке вмешательств, которые изменили естественную историю болезни. Оценка терапевтических вмешательств с использованием мышей YAC72 потребует использования большого количества животных для определения значительного эффекта вмешательства при значительных затратах.В попытке создать YAC-мышь как с ускоренным, так и с количественным фенотипом, а также с осознанием того, что увеличение длины повтора CAG приводит к более раннему возрасту возникновения (17) и снижает вариабельность (Р. Бринкман и М. Р. Хайден, рукопись готовится) , мы создали несколько линий мышей YAC со 128 повторами CAG (YAC128) и тщательно охарактеризовали одну из этих линий.
Наш анализ мышей YAC128 выявляет гиперкинетический фенотип, впервые проявляющийся в возрасте 3 месяцев, за которым следует прогрессирующий моторный дефицит на вращающемся стержне, присутствующий в 6 месяцев, с возможным прогрессированием до гипокинеза к 12 месяцам.Эти поведенческие изменения сопровождаются атрофией полосатого тела, отчетливо проявляющейся к 9-месячному возрасту, атрофией коры головного мозга к 12 месяцам и прогрессирующей потерей нейронов полосатого тела, сопровождающейся уменьшением площади поверхности полосатых клеток. Моторный дефицит у мышей YAC128 сильно коррелирует с потерей нейронов. Точная репликация состояния человека на мышиной модели YAC128 в сочетании с низкой вариабельностью между животными приводит к модели HD на мышах, которая теперь хорошо подходит для оценки различных вмешательств на фенотип заболевания.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Создание мышей YAC128
Хорошо охарактеризованный YAC (353G6), охватывающий весь ген HD, включая промоторную область, был использован для создания YAC128s (10). Гомологичная рекомбинация была использована для включения 128 повторов CAG, полученных из ПЦР-амплифицированной ДНК пациента с ювенильным началом HD, в YAC в соответствии с ранее описанной стратегией (18). Все основатели были тщательно проверены с помощью ПЦР и Саузерн-блоттинга, как описано ранее (9).Два основателя интегрировали полный YAC и были использованы для создания двух линий мышей YAC (линии 53 и 55) со 128 повторами CAG (рис. 1A). Саузерн-блоттинг этих мышей показал, что линия 53 интегрировала больше копий трансгена, чем линия 55 или линия 2511, ранее описанная мышь YAC72 (10) (фиг. 1B). РНК-анализ транскрипта хантингтина человека показал, что в линии 53 уровень РНК в два раза выше, чем в строке 55, и в три раза выше, чем в строке 2511 (фиг. 1С). Экспрессия белка, обнаруженная с помощью HD650, антитела, специфичного к хантинтину человека, точно коррелировала с уровнями РНК ( r ² = 1.0 — корреляция Пирсона; Рис. 1E). Линия 53 имела самый высокий уровень экспрессии белка хантингтина (фиг. 1D) по данным денситометрического анализа примерно на 75% от эндогенных уровней (данные не показаны). Мы дополнительно охарактеризовали линию 53 из-за более высокого уровня экспрессии белка хантингтина.
Снижение массы мозга у YAC128, строка 53
Когорты мышей линии 53 (далее YAC128) и однопометников дикого типа (WT) в возрасте 6, 9 и 12 месяцев умерщвляли, перфузировали и измеряли массу мозга.Не было обнаружено разницы в массе мозга у 6-месячных YAC128s (WT = 0,421 ± 0,016 г, YAC128 = 0,433 ± 0,02 г, n = 5; рис. 2A). Однако к 9-месячному возрасту мыши YAC128 продемонстрировали снижение средней массы мозга на 5% по сравнению с однопометниками дикого типа (WT = 0,414 ± 0,016 г, YAC128 = 0,393 ± 0,01 г, P <0,05; n = 7 ), прогрессирующая до 10% -ного уменьшения у годовалого YAC128s (WT = 0,411 ± 0,009 г, YAC128 = 0,373 ± 0,022 г, P <0,01, n = 7; рис. 2A). Анализ ANOVA дополнительно выявил влияние генотипа ( F _1,36 = 6.169, P = 0,018), возраст ( F _2,36 = 11,706, P = 0,0001) и взаимодействие возраста и генотипа ( F _2,36 = 5,002, P = 0,012) от массы мозга. Разница в массе мозга, по-видимому, не связана с общей атрофией, а скорее связана с региональным эффектом. Например, не было обнаружено значительных различий между YAC128 и однопометниками дикого типа в массе мозжечка, области, обычно не связанной с патологией HD (19), в любом из исследованных возрастов (рис.2Б).
У мышей YAC128 объем полосатого тела и коры уменьшен
Чтобы определить, были ли затронуты области мозга, наиболее пораженные у пациентов с HD, полосатое тело и кора (19,20) у мышей YAC128, оценки объема полосатого тела и коры у мышей были рассчитаны с использованием стереологического программного обеспечения. Не было обнаружено различий в объеме полосатого тела в возрасте 6 месяцев у YAC128s по сравнению с однопометниками дикого типа (WT = 14,3 ± 2,39 мм ³, YAC128 = 14.29 ± 1,25 мм ³, n = 5; Рис. 3A). Однако к 9 месяцам у мышей YAC128 было очевидно уменьшение объема полосатого тела на 15% (WT = 13,76 ± 0,5 мм ³, YAC128 = 11,81 ± 0,36 мм ³, P <0,001, n = 7; рис. 3A), что также наблюдалось у 12-месячных мышей YAC128 (WT = 11,27 ± 0,68 мм ³, YAC128 = 9,88 ± 0,33 мм ³, P <0,01, n = 7; рис. 3А). Объем коры оценивался от области, окружающей пересечение мозолистого тела до пересечения передней комиссуры (т.е. область мозга, охватывающая наибольший объем полосатого тела). В отличие от полосатого тела, не было значительной разницы в объеме коры в возрасте 9 месяцев (WT = 14,43 ± 0,79 мм ³, YAC128 = 13,57 ± 0,41 мм ³, n = 5), но 7% уменьшение в возрасте 12 месяцев (WT = 12,83 ± 0,50 мм ³, YAC128 = 11,88 ± 0,43 мм ³, P <0,05, n = 5; рис. 3B).
Потеря и дисфункция нейронов у мышей YAC128
Потеря стриатальных клеток — определяющая нейропатологическая характеристика HD (21).Стереологическое программное обеспечение использовалось для оценки количества нейронов полосатого тела в наших когортах мышей. Срезы иммуноокрашивали NeuN, антителом, специфичным к ядерному белку нейронов, который присутствует в большинстве типов нейрональных клеток (22). Подсчет нейронов, наряду со всеми другими нейропатологическими и поведенческими процедурами, проводился полностью слепо в отношении генотипа. В возрасте 9 месяцев у мышей YAC128 наблюдалось снижение на 9% количества нейронов полосатого тела, хотя эта тенденция не достигла значимости ( P = 0.1, n = 3; Таблица 1). Для дальнейшего изучения потери нейронов через 9 месяцев количество нейронов со средними шипами (MSN) оценивали с помощью иммуноокрашивания на DARPP-32, белок, специфичный для MSN (23). MSN — это нейроны, которые больше всего страдают при HD (21), и являются основным типом нейрональных клеток полосатого тела. Мыши YAC128 продемонстрировали уменьшение количества MSN на 8%, хотя эта тенденция снова не достигла значимости ( P = 0,1, n = 7; данные не показаны). Потеря нейронов прогрессировала, и к 12-месячному возрасту у YAC128s было обнаружено 15% снижение количества нейронов полосатого тела по сравнению с контрольными однопометниками ( P <0.01, n = 7; Таблица 1). Чтобы убедиться в достоверности этого открытия, анализировали другую группу YAC128 и контрольных мышей в возрасте 12 месяцев. Подобно предыдущим результатам, мыши YAC128 в этой группе также продемонстрировали 18% снижение количества нейронов полосатого тела по сравнению с контролем ( P = 0,01, n = 5; Таблица 1). Не было существенной разницы в плотности нейронов для 9-месячного возраста (WT = 135500 ± 1611 нейронов / мм ³), YAC128 = 140700 ± 3834, P = 0.28) и 12-месячной (WT = 138900 ± 3927, YAC128 = 142500 ± 2088, P = 0,43) когорты мышей. Отсутствие изменения плотности нейронов в сочетании с потерей объема полосатого тела у мышей YAC128 является дополнительным доказательством потери нейронов у этих мышей.
Мы измерили площадь поперечного сечения оставшихся нейронов полосатого тела, чтобы определить, уменьшаются ли нейроны в размере, фенотип, описанный в других моделях мышей HD (4,24,25). Средняя площадь нейронов полосатого тела, случайно выбранных стереологическим программным обеспечением, была уменьшена на 18% у 12-месячных YAC128 по сравнению с контрольной группой (WT = 65.71 ± 4,5 мкм ², YAC128 = 54,37 ± 3,7 мкм ², P <0,01, n = 8 животных), но не у 9-месячных YAC128s (WT = 57,01 ± 7,74 мкм ², YAC128 = 60,62 ± 4,76 мкм ², n = 7 животных; рис. 4).
Оценка поведения
Мышей
YAC128 изучали с интервалом в 3 месяца в возрасте от 3 до 12 месяцев. При использовании ускоряющего вращающегося стержня для изучения латентного периода падения не было обнаружено различий в его характеристиках между YAC128 и мышами дикого типа через 3 месяца (рис.5). Однако к 6-месячному возрасту у мышей YAC128 было очевидным резкое снижение производительности вращающегося стержня ( P <0,01), которое еще больше снизилось в возрасте 9 и 12 месяцев ( P <0,05, P <0,01). соответственно; рис.5). Далее анализ ANOVA выявил влияние генотипа ( F _1,28 = 6,77, P = 0,015) и взаимодействие между генотипом и возрастом ( F _3,84 = 4,662, P = 0,005). ), что указывает на значительную разницу в характеристиках вращающихся стержней между диким типом и YAC128 с возрастом.ANOVA также выявляет весьма значимое влияние возраста ( F _3,84 = 24,427, P <0,001) на характеристики вращающегося стержня для всех мышей.
Активность мышей измеряли с использованием прибора открытого поля в течение 10 минут в возрасте 3, 6, 9 и 12 месяцев. Анализ ANOVA показал очень значимую взаимосвязь между генотипом и возрастом в пройденном расстоянии ( F _3,66 = 6,808, P <0,001), амбулаторных подсчетах ( F _3,66 = 5.822, P = 0,001), амбулаторные эпизоды ( F _3,66 = 6,698, P = 0,001), время, затраченное на амбулаторные движения ( F _3,66 = 6,251, P = 0,001), и время, проведенное в покое ( F _3,66 = 2,409, P = 0,029), что выявило значительную разницу в уровнях активности мышей дикого типа и мышей YAC128 в сверхурочное время. В возрасте 3 месяцев мыши YAC128 демонстрируют гиперкинетический фенотип по сравнению с мышами дикого типа, что подтверждается значительным увеличением пройденного расстояния и амбулаторных измерений и времени, проведенного в амбулаторных движениях (рис.6A – D). Интересно, что YAC128s начинают проявлять гипокинетический фенотип в 6 месяцев по сравнению с однопометниками дикого типа, и этот гипокинетический фенотип прогрессирует с возрастом, становясь значимым к 12-месячному возрасту (Fig. 6A-E). Чтобы убедиться, что 10-минутный тест в открытом поле точно измерял активность мышей, спонтанную двигательную активность измеряли в течение 24-часового периода в условиях домашней клетки. Двенадцатимесячный YAC128 проявлял пониженную активность по сравнению с однопометниками дикого типа ( P <0.01, n = 8; Рис. 6F), воспроизводя результаты, полученные в 10-минутных анализах. Мыши YAC128 были тяжелее своих однопометников во всех исследуемых возрастах (3, 6, 9 и 12 месяцев). Поскольку эти мыши сверхэкспрессируют полноразмерный хантинтин, одна из возможностей заключается в том, что увеличение веса связано с влиянием полноразмерного хантинтина на выживаемость клеток (16,26).
Производительность Rotarod коррелирует с серьезностью потери нейронов
Пять из 12-месячных мышей YAC128, проанализированных на потерю нейронов (таблица 1), подверглись оценке на вращающихся стержнях.Производительность вращающегося стержня в этой группе мышей YAC128 измерялась с использованием вращающегося стержня с фиксированной скоростью, парадигма тестирования показала, что дает результаты, которые сильно коррелируют с результатами, полученными с использованием ускоряющего вращающегося стержня в другой модели мыши HD (27). Мыши YAC128 ( n = 9) продемонстрировали снижение производительности по сравнению с контролем дикого типа при 40 об / мин ( P <0,05) в возрасте 6 месяцев, при 34 и 40 об / мин ( P <0,05, P = 0,01) через 9 месяцев и при 34 об / мин ( P <0.001) в возрасте 12 месяцев. Двенадцатимесячных мышей из этого исследования анализировали на объем полосатого тела, массу мозга и количество нейронов полосатого тела, и, как показано в отдельном анализе (рис. 2 и 3; таблица 1), у мышей YAC128 наблюдалось уменьшение объема полосатого тела, массы мозга и нейронов. потеря. Пять мышей YAC128 были проанализированы поведенчески через 6, 9 и 12 месяцев, а также невропатологически через 12 месяцев. Высоко значимая корреляция наблюдалась между характеристиками вращающегося стержня в возрасте 12 месяцев и количеством нейронов полосатого тела ( P <0.01, r ² = 0,9214; Рис. 7D). Мыши с наибольшей степенью потери нейронов были связаны с ухудшением производительности на вращающемся стержне. Очевидно, что необходимо проанализировать дополнительных мышей, чтобы увеличить силу этого открытия. Вес мозга также слабо коррелировал с производительностью вращающегося стержня ( P <0,05, r ² = 0,808; рис. 7E), и наблюдалась тенденция к корреляции между объемом полосатого тела и производительностью вращающегося стержня ( P = 0,22, r ² = 0.442; Рис. 7F). Интересно, что потеря нейронов полосатого тела наиболее сильно коррелировала из трех нейропатологических измерений с характеристиками вращающегося стержня. Поскольку поведение мышей тестировали в течение нескольких месяцев и умерщвляли для нейропатологических измерений только через 12 месяцев, для этих мышей не было данных о невропатологии через 6 или 9 месяцев. Тем не менее, корреляция между ранней производительностью вращающегося стержня и 12-месячной невропатологией может быть исследована. Интересно, что количество нейронов полосатого тела в возрасте 12 месяцев значимо коррелировало с производительностью вращающегося стержня в возрасте 6 месяцев при 40 об / мин ( r ² = 0.8719, P = 0,02; Рис. 7A) и в возрасте 9 месяцев при 34 об / мин (Рис. 7B; r ² = 0,9108, P = 0,01) и 40 об / мин ( r ² = 0,7641, P = 0,05; рис. 7C), что позволяет предположить, что ранняя работа вращающихся стержней является предиктором степени последующей потери нейронов.
Наличие агрегатов
Срезы мозга YAC128s были иммуноокрашены с помощью ЕМ48, антитела, которое распознает N-концевой хантингтин и является высокоспецифичным для агрегатов (28).Мы наблюдали повышенное окрашивание ядерного гентингтина у 12-месячных YAC128 с помощью светлопольной микроскопии, но без ядерных включений хантинтина ( n = 5; фиг. 8A). Включения Хантингтина определяются как агрегаты, которые видны на уровне светового микроскопа. Однако при электронной микроскопии многие небольшие кластеры из трех-шести частиц иммунного золота (микроагрегаты) видны по всей нуклеоплазме (рис. 8D). EM48-положительные включения присутствовали в клетках полосатого тела всех исследованных 18-месячных YAC128 (рис.8B и C). При электронной микроскопии эти включения выглядели как большие кластеры частиц иммунозолота (рис. 8E и F). Животные дикого типа не проявляли окрашивания или включений ядерного гентингтина ни через 12, ни через 18 месяцев (данные не показаны).
Низкая изменчивость фенотипов мышей YAC128
Снижение вариабельности между животными уменьшает количество животных, необходимое для определения значительного эффекта экспериментального терапевтического средства, и, вероятно, приведет к меньшему количеству ложноотрицательных результатов.В качестве индикатора изменчивости мы смотрели на количество мышей YAC128 с измерениями, результаты которых совпадали с результатами контрольной группы дикого типа. Уменьшение фенотипа стриарного и коркового объема и уменьшение фенотипа размера стриарного нейрона не показало перекрытия между отдельными измерениями дикого типа и YAC128 (таблица 2). Напротив, индивидуальные веса мозга показали 33% -ное перекрытие, а поведенческий фенотип продемонстрировал 50% -ное перекрытие между мышами дикого типа и одиночными мышами YAC128. Используя данные, полученные при характеристике YAC128s, мы выполнили анализ мощности, чтобы оценить количество животных, которое нам потребуется для обнаружения 33, 50 или 66% спасения при значимости P <0.05 при мощности 80% (Таблица 2). По мере увеличения изменчивости количество животных, необходимое для определения значительного влияния на этот фенотип, также увеличивается. Небольшое количество животных требуется в терапевтическом испытании, цель которого состоит в том, чтобы определить 50% спасение с невропатологическими фенотипами в качестве конечных точек, от четырех животных для объема полосатого тела до 13 животных для потери нейронов полосатого тела. Для менее эффективного спасения 33% требуется только восемь животных, чтобы определить разницу, используя в качестве конечной точки объем полосатого тела.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мышь YAC128 представляет новую животную модель HD, демонстрирующую двигательный дефицит, двухфазный профиль активности и атрофию полосатого тела, связанную со значительной потерей нейронов. Фенотипы, связанные с HD, проявленные в модели мышей YAC128, точно повторяют изменения, наблюдаемые при заболевании человека. Масса мозга, которая снижается у пациентов с HD (19), прогрессирующая потеря нейронов (19, 20) и объемная потеря в полосатом теле (29) точно отражаются у мышей YAC128.Уменьшение объема коры головного мозга, которое происходит после начала потери полосатого тела, также воспроизводит патологию и порядок прогрессирования заболевания у людей (21). Дефицит моторики является признаком начала HD у пациентов (19, 20) и обычно проявляется до начала нейродегенерации (21). Эта естественная история повторяется в модели YAC128, при этом начало моторного дефицита на вращающемся стержне происходит до начала потери нейронов. Наконец, начальный период повышенной подвижности, о чем свидетельствует хорея и неуклюжесть, которая обычно переходит в более жесткое состояние по мере прогрессирования заболевания (20), параллельна двухфазному профилю активности YAC128s, состоящему из начальной гиперактивности и последующего гипокинеза.
Другие мышиные модели HD продемонстрировали различные степени атрофии полосатого тела (2,4,8), потери массы мозга (2) и двигательного дефицита (3,4,30) у людей. Однако нет воспроизводимых отчетов о количественной потере нейронов полосатого тела, что является признаком состояния человека (19). Хотя R6-усеченные мышиные модели HD, как сообщается, демонстрируют окрашивание TUNEL в полосатом теле (31) и аномальные нейроны полосатого тела при окрашивании толуидиновым синим (32), что указывает на апоптотические процессы, количественная потеря нейронов полосатого тела не описана.Мы наблюдали значительное уменьшение количества нейронов полосатого тела в модели HD у мышей YAC128. Качественные наблюдения за дегенерацией нейронов полосатого тела, включая сокращение ядер, набухание митохондрий и другие особенности, согласующиеся с апоптозом, уже сообщалось ранее в нашей модели YAC72 (10).
Главный вопрос, поднятый в этом исследовании, заключается в том, почему потеря нейронов присутствует у мышей YAC, но менее очевидна в других моделях HD? Потеря нейронов конкретно не объясняется соответствующей онтогенетической и клеточно-специфической регуляцией полноразмерного хантинтина в модели YAC, поскольку мыши с направленной вставкой расширенных полиглутаминовых трактов в эндогенный ген мыши имеют аналогичную регуляцию гена HD, но имеют не показывают такой же степени потери нейронов (5,7,8).Разница в потере нейронов полосатого тела между мышами YAC и другими животными с нокаутом также повышает вероятность того, что человеческий хантингтин с расширенным трактом CAG более токсичен, чем ген мыши с расширением CAG.
Уникальное обнаружение потери нейронов в моделях мышей YAC по сравнению с другими моделями мышей HD также может быть связано (частично) с различиями в штаммах различных моделей. Все больше данных указывает на роль эксайтотоксической гибели клеток в потере нейронов, специфичных для полосатого тела, наблюдаемой при HD (11-13).Эксайтотоксические поражения полосатого тела грызунов, вызванные инъекциями каиновой кислоты, создают нейропатологический и поведенческий фенотип, имитирующий состояние человека (33,34). Фоновым штаммом мышей YAC является FVB / N, штамм, который демонстрирует высокую степень потери нейронов при воздействии эксайтотоксического стресса после инъекции каиновой или хинолиновой кислоты (35,36). Напротив, инъекция эксайтотоксинов в C57BL / 6, фоновый штамм, характерный для большинства моделей мышей HD, приводит к гораздо более низкой степени гибели клеток по сравнению с другими окрасками мышей, включая FVB, особенно при низких дозах каиновой и хинолиновой кислоты (35 , 36).Следовательно, различия штаммов могут объяснять различия в восприимчивости к нейротоксичности экспансии полиглутамина.
Потеря нейронов полосатого тела, наблюдаемая у мышей YAC128, линейно коррелирует с моторным дефицитом, измеренным с помощью ротарода. Этот интригующий результат обеспечивает первое звено в животной модели HD между поведением и потерей нейронов, предполагая структурную основу поведенческих проявлений у мышей YAC128. Интересно, что эффективность вращающегося стержня в возрасте 6 и 9 месяцев коррелирует с потерей нейронов в возрасте 12 месяцев.Таким образом, степень ранней двигательной дисфункции может быть индикатором серьезности степени дисфункции нейронов, присутствующих в полосатом теле; нейроны, которые со временем будут дегенерировать с возрастом животного. Таким образом, возникновение дефицита вращающихся стержней представляет собой время, когда дисфункция нейронов уже имеет фенотипические эффекты, демонстрируя важность оценки эффекта терапевтических вмешательств до и после этого момента времени. Сильная корреляция между потерей нейронов полосатого тела и дефицитом ротарод предполагает, что потеря и дисфункция нейронов являются, по крайней мере, основными факторами поведенческих аномалий у мышей YAC128.
Характеристика естественного течения у мышей YAC128 делает ее идеальной моделью для определения временной взаимосвязи других изменений с потерей нейронов полосатого тела. Ядерные включения хантинтина, видимые под световой микроскопией, являются обычным нейропатологическим маркером как у людей (28,37), так и у моделей мышей HD (3,6,10,38). Роль включений хантинтина в патогенезе HD до сих пор остается спорной. Появление включений хантинтина до развития неврологического фенотипа в некоторых трансгенных моделях HD предполагало, что образование этих включений было потенциально причиной заболевания (38).Однако эксперименты in vitro с мутантным гентингтином продемонстрировали отчетливую диссоциацию между присутствием включений хантинтина и гибелью клеток, связанной с хантинтином (39,40). Исследования на людях показали небольшое совпадение между клетками, демонстрирующими ядерные включения, и клетками, которые претерпевают нейродегенерацию при HD (28), что дополнительно подтверждает отсутствие корреляции между включениями и потерей нейронов. Включения Хантингтина присутствуют у 18-месячных мышей YAC128, но не в 12-месячном возрасте, момент времени, когда присутствуют как поведенческие, так и невропатологические изменения, включая потерю нейронов, что демонстрирует, что включения не участвуют в инициации потери нейронов. .Это открытие согласуется с результатами, ранее наблюдавшимися на других моделях HD у мышей (8), демонстрирующими дисфункцию нейронов до появления включений хантингтина. Однако считается, что образование включений является конечной стадией процесса, начинающегося с транслокации хантингтина в ядро и продолжающегося образованием микроагрегатов (38,41), видимых под электронной микроскопией. Ядерная транслокация и микроагрегаты хантинтина присутствуют у 12-месячных животных, что по-прежнему оставляет вопрос о потенциальной роли ядерной транслокации и олигомеризации хантинтина как инициирующего стимула для HD на ранних этапах процесса болезни.
Мыши YAC будут полезны для оценки терапевтических вмешательств, поскольку эта модель точно воспроизводит заболевание человека и отображает фенотипы, которые можно измерить количественно с низкой вариабельностью между животными. Мыши YAC128 демонстрируют прогрессивные количественные фенотипы, которые соответствуют состоянию человека. Значимость низкой вариабельности между животными при использовании модели мышей для терапевтических вмешательств проиллюстрирована оценками анализа мощности. Фенотип с наименьшей вариабельностью, объем полосатого тела, требует только четырех животных для определения 50% спасения в возрасте 9 месяцев.Даже невропатологические фенотипы с большей вариабельностью (например, количество нейронов) требуют не более 13 животных, чтобы различить 50% -ное спасение. Для менее стойкого терапевтического эффекта (33%) для оценки объема полосатого тела необходимо всего восемь животных. Этот результат демонстрирует потенциальную полезность мышей YAC128 в терапевтических испытаниях и решающее значение предсказуемости фенотипа в модели, используемой в экспериментальной терапии.
Точная естественная история изменений модели HD у мышей YAC128 позволяет провести дальнейшее исследование временной последовательности и взаимосвязей других связанных с HD изменений в патогенезе заболевания.Особый интерес вызывает роль протеолитического расщепления мутантного хантингтина в развитии заболевания. Все больше доказательств вовлекает протеолитическое расщепление хантингтина каспазами (42), и / или кальпаинами (43,44), и / или другими неизвестными протеазами (45) в патогенез HD. Расщепление каспазой мутантного хантингтина приводит к образованию токсичного фрагмента хантингтина (46), и это событие расщепления, как известно, предшествует нейродегенерации в мозге пациента-человека (42). Экспрессия полноразмерной формы мутантного хантингтина делает модель YAC на мышах уникально подходящей для проверки эффективности ингибирования этих протеаз на развитие заболевания либо с помощью соединений, либо с помощью генетических манипуляций.Мы также можем использовать модель YAC128 для исследования времени и эффекта корковой дисфункции в естественном течении болезни. Результаты моделей на мышах (4) и других исследований (14,42) указывают на корковую дисфункцию в гибели нейронов полосатого тела при HD. Определение времени атрофии и потери нейронов в различных слоях и подмножествах корковой ткани и временной взаимосвязи этой атрофии с потерей нейронов полосатого тела дополнительно прояснит роль коры головного мозга в развитии этого разрушительного заболевания.
Модель YAC128 на мышах точно воспроизводит потерю нейронов полосатого тела, которая характеризует заболевание человека, что позволяет мышам YAC128 быть полезными при оценке экспериментальных терапевтических средств, обеспечивающих защиту от потери нейронов. Определенная естественная история у мышей YAC128 позволяет точно рассчитать моменты времени для начала терапевтических вмешательств и конечные точки для оценки эффективности этих вмешательств. Используя данные, представленные в этой рукописи, теперь мы можем разработать экспериментальные терапевтические испытания с мышами YAC128, гарантируя адекватное количество животных для правильной оценки влияния нейропротекторных стратегий на патогенез HD.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мутагенез YAC и образование мышей
Мутагенез
YAC проводили, как описано ранее (10), с использованием конструкции, содержащей 128 повторов CAG. ДНК YAC была подготовлена для микроинъекции в пронуклеусы FVB / N, и были подвергнуты скринингу детеныши-основатели (9). Мышей содержали на фоновом штамме FVB / N (Charles River, Wilmington, MA, USA), и они являются родственными этому штамму. Генотипирование мышей проводили с помощью процедуры ПЦР, описанной ранее (9).Мышей помещали, тестировали и собирали ткани в соответствии с протоколом A00-0254 Университета Британской Колумбии.
Число копий, анализ РНК и белков
Саузерн-блоттинг для оценки количества копий выполняли, как описано ранее, с использованием 12 мкг ДНК (9) и специфического для человека зонда cD70-2 (10).
Анализ белков.
Белковые лизаты получали из цельного мозга мыши в соответствии с процедурой, описанной ранее (9), с добавлением ингибитора каспаз 10 мкМ ZVAD (Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США) в буфер для лизиса.Эти лизаты обрабатывали на 7,5% полиакриламидных гелях и подвергали блоттингу на мембранах из ПВДФ. Блоты исследовали антиактином (Chemicon, Temecula, CA, USA) и моноклональным антителом HD650. HD650 продуцировался против пептидов HD 650–663 (VLRDEATEPGDQEN) и специфически реагировал на хантингтин человека. Пептиды HD (VLRDEATEPGDNQEN), связанные с белком-носителем KLH, использовали в качестве иммуногена для инъекции мышам Balb / C. Мыши подкожно инъецировали 100 мкг белка пептид-KLH в полном адъюванте Фрейнда с последующими двумя дополнительными инъекциями 100 мкг белка KLH-пептид в неполном адъюванте Фрейнда с 14-дневными интервалами.За три дня до слияния клеток мыши получали внутривенную инъекцию 100 мкг пептидов через хвостовую вену. Спленоциты были слиты с клеткой миеломы NS-1, и гибридомы были отобраны и клонированы в соответствии с процедурой, описанной ранее (47).
Анализ РНК.
Суммарную РНК
экстрагировали из коры головного мозга мыши с помощью набора RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). КДНК первой цепи получали из 1 мкг общей РНК с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript для ОТ-ПЦР (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) в конечном объеме 20 мкл.Одна из 100 реакций RT использовалась в качестве матрицы в реакциях ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени выполняли с использованием прибора ABI GeneAmp 5700 Sequence Detection System и двухступенчатой RT – PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) с использованием охватывающих интроны праймеров, специфичных для человека. Кривая диссоциации подтвердила отсутствие неспецифической амплификации. Для калибровки стандартной кривой использовали серийно разведенные образцы кДНК. Все образцы были проанализированы в четырех повторностях. Уровни экспрессии были нормализованы до уровней мРНК бета-актина.Первичный анализ данных проводился с использованием системного программного обеспечения от Applied Biosystems.
Морфологический анализ
Мышей окончательно анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2,5% авертина и перфузировали 3% параформальдегидом / 0,15% глутаральдегидом в PBS. Мозг оставляли в черепах на 24 часа в 3% параформальдегиде при 4 ° C, затем удаляли и хранили в PBS. На этом этапе из групп были исключены мозги с плохой перфузией (более мягкой, чем у других).Мы также удалили из анализа два больших мозга ( n = 1 из 9-месячной когорты, n = 1 из 12-месячной когорты), которые весили на 50–75% больше, чем другие мозги в когорте, и были значимыми. выбросы по критерию Грабба. Генотип всех выбросов был диким типом, и удаление этих выбросов не повлияло на значимость результатов. Коронковые срезы толщиной 25 и 50 мкм вырезали по всему полосатому телу с помощью вибратома. Трансгенных мышей и мышей дикого типа подбирали по возрасту и полу, и по возможности использовали однопометников.
Количественный анализ
Все количественные анализы были выполнены вслепую в отношении генотипа. Корональные срезы (25 мкм), расположенные на расстоянии 200 мкм друг от друга по всему полосатому телу, окрашивали антителом NeuN (Chemicon) в разведении 1: 100 или антителом DARPP-32 (Chemicon) в разведении 1: 500. Биотинилированные вторичные антитела (Vector, Burlington, ON, Canada), мышиные или кроличьи в соотношении 1: 200 использовали до амплификации сигнала с помощью набора ABC Elite (Vector) и детекции с помощью диаминобензидина (DAB, Pierce).Периметр полосатого тела отслеживали в каждом из серийных срезов с использованием 2,5-кратного объектива и программного обеспечения Stereoinvestigator (Microbrightfield, Williston, VT, USA). Впоследствии подсчет нейронных профилей в пределах счетных рамок 50 × 50 мкм, равномерно разнесенных по всему полосатому телу (размер сетки полосатого тела составлял 450 × 450 мкм), был получен с использованием объектива 20 ×. Последовательная реконструкция полосатого тела с помощью программного обеспечения Stereoinvestigator позволила оценить общие нейрональные профили и объем. Объем коры оценивался в области с наибольшим процентом полосатой ткани (сосредоточенной на ориентирах мозолистого тела и пересечении переднего комьюрита), всего шесть серийных срезов.Все слои и области коры, присутствующие на срезе, были очерчены в целом, а объем оценен с помощью программного обеспечения Neuroexplorer (Microbrightfield, Williston, VT, США). Площадь поперечного сечения профилей нейронов полосатого тела определяли путем очерчивания периметра всех четко определенных нейронов в пределах счетных рамок 50 × 50 мкм, равномерно расположенных по всему полосатому телу (сетки 450 × 450 мкм). Нейрональные профили были очерчены с помощью 100-кратного объектива в анатомически согласованных коронковых срезах. Примечание: ткань дикого типа и YAC128 в один и тот же момент времени (например,грамм. 9 месяцев) лечился идентично; тем не менее, наблюдалась некоторая экспериментальная вариабельность между временными точками (например, вариабельность между тканями от 6 до 9 месяцев), что делало сравнение объемов между временными точками недействительным.
Оценка агрегатов
Световая микроскопия.
Срезы головного мозга толщиной 25 мкм по всему полосатому телу окрашивали на наличие агрегатов. Срезы иммуноокрашивали, как описано ранее (28), с использованием поликлонального антитела ЕМ48 в концентрации 1: 1000 и DAB в качестве хромогена (вектор).
Электронная микроскопия.
Для ультраструктурного анализа мы использовали предварительную встраиваемую иммуно-золотую маркировку EM48. Срезы промывали PBS и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя, используя антитела ЕМ48 в соотношении 1: 500. Для связывания первичного антитела использовали ультрамалое коллоидное конъюгированное вторичное антитело (Aurion, Wageningen, Нидерланды). После постфиксации 2,5% глютеральдегидом частицы золота в срезах были усилены с использованием набора для усиления серебра R -gent SE-EM (Aurion, Wageningen, Нидерланды).Затем срезы дополнительно фиксировали 0,5% тетроксидом осмия в 0,1 М PB в течение 15 мин и обрабатывали для электронной микроскопии, как описано в другом месте (48). Затем выбранные срезы помещали в 0,5% тетроксид осмия в 0,1 М фосфатном буфере на 30 мин. Затем срезы промывали в PB, обезвоживали в 25–100% EtOH, а затем пропиленоксидом, пропитывали и плоско заливали в Epon между листами Aclar и отверждали при 60 ° C в течение 2–3 дней.
Оценка поведения
Мышей содержали поодиночке в клетках с микроизолятором при обратном освещении (свет выключается в 11:00 a.м., свет включается в 23:00). Всех мышей в тестируемой группе меняли клетку в один и тот же день, и испытания не проводили до 2 дней после смены клетки. Мышей полуслучайно кодировали номера от 1 до 40 (первая и последняя половина тестируемой группы имела равное количество самцов / самок, трансгенных / диких типов). Все поведенческие тесты выполнялись во время ночного цикла мышей, когда мыши обычно активны, с тестированием, проводимым в наборе поведенческих тестов при красном свете. Один и тот же наблюдатель проводил все тесты и не знал генотипа отдельных мышей на протяжении всего процесса тестирования.
Анализ Rotarod.
Мы использовали процедуру ускоряющего вращающегося стержня, при котором вращающийся стержень (San Diego Instuments, Сан-Диего, Калифорния, США) ускорялся от 0 до 45 об / мин в течение 120 с. Мышей обучали в течение 3 дней с двумя испытаниями в день на ускоряющем вращающемся стержне. После этого обучения мышей тестировали в трех последовательных испытаниях в течение одного дня с полуторачасовым отдыхом между испытаниями. Поворотный стержень протирали этанолом между каждым испытуемым.
Анализ открытого поля.
Мышей оценивали с помощью монитора активности открытого поля (Med Associates Inc., Сент-Олбанс, Вирджиния, США) в течение 10 мин. Тестирование начинали по крайней мере через 1 ч после начала ночного цикла мыши. Испытательную камеру протирали этанолом между каждым испытуемым. Амбулаторный подсчет определялся как количество разрыва луча, когда мышь передвигается, в то время как амбулаторные эпизоды — это количество раз, когда мышь начинает передвигаться (из положения покоя). Измерения были рассчитаны с помощью сопутствующего программного обеспечения (Med Associates).Мышей, которые кружили в течение всего 10-минутного интервала, удаляли из анализа ( n = 6 дикого типа, n = 2 YAC128).
Двигательная активность.
Активность локомотера
измеряли в течение 24 часов с использованием системы Cage Rack System (San Diego Instruments) с равномерно распределенной сеткой фотолучей 8 × 4. Клетки имели размеры 28 × 17 × 12 см, и мышей обеспечивали пищей и водой. Двигательная активность рассчитывалась по общему количеству разрывов пучка за 24-часовой период тестирования.
Анализ Rotarod — фиксированная скорость.
Мышей содержали в клетках с микроизоляторами вместе с братьями и сестрами. Все поведенческое тестирование проводилось в световом наборе поведенческого тестирования. Мышей тестировали на вращающемся стержне с фиксированной скоростью (Ugo-Basile, Норфолк, Великобритания) при 12, 24, 34 и 40 об / мин и первоначально тренировали при 24 об / мин в течение 3 дней с тремя испытаниями в день. Последующее тестирование проводилось в течение 3-дневного периода, проверяя каждую скорость один раз в день с 1,5-часовым перерывом между тестами. Мышей тестировали каждый месяц в возрасте от 3 до 12 месяцев.
Статистика
Вся статистика была проведена с использованием непарного теста Стьюдента t или двустороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями. Значения P , SEM, средние и стандартные отклонения были рассчитаны с использованием Graphpad Prism версии 3.0 или Microsoft ^® Excel 2002. SPSS 11.5 использовался для расчета значений F и P для поведенческих измерений. Расчеты корреляции со значениями r ² и P были рассчитаны с помощью корреляции Пирсона с использованием Graphpad Prism версии 3.0. Числа анализа мощности были рассчитаны с использованием веб-сайта www.health.ucalgary.ca/∼rollin/stats/ssize/n2.html.
Примечание
Эти мыши доступны исследователям для продолжающихся исследований. Заинтересованным следователям следует связаться с M.R.H.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарят Хун И и центр электронной микроскопии Эмори в Центре нейродегенеративных заболеваний. Мы благодарим Американское общество болезней Хантингтона (HDSA), Фонд наследственных болезней (HDF) и Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR) за поддержку этой работы M.R.H. E.J.S., J.V.R. и R.K.G. поддерживаются студентами CIHR и Фондом исследований в области здравоохранения Майкла Смита. C.-A.G. поддерживается Национальным научным фондом. B.R.L. поддерживается HDF, CIHR и Обществом Хантингтона Канады. E.M.S. поддерживается Канадским фондом инноваций и является обладателем кафедры канадских исследований в области генетики и поведения. M.R.H. поддерживается грантом Merck Frosst, предоставленным CMMT, CIHR, Канадской сетью центров передового опыта, и является держателем канадской кафедры исследований в области генетики человека.
Рисунок 1. Характеристика трансгенной мыши YAC128. ( A ) Агарозный гель, демонстрирующий расширение CAG-повторов. ПЦР с использованием праймеров, специфичных для человека, амплифицировала увеличенный повтор CAG из геномной ДНК. 18, 46 и 72 повтора были амплифицированы от ранее описанных мышей YAC (9,10), а 128 — от мышей YAC128 (линия 53). Контроль (+ ve) взят из вектора-переносчика дрожжей со 128 CAG. Мышь дикого типа (WT) является отрицательным контролем, а ДНК человека (18 и 35 CAG) является другим положительным контролем.Маркер — лестница 100 п.н. ( B ) Саузерн-блоттинг для оценки количества копий. Геномную ДНК, расщепленную EcoR1, зондировали специфическим для человека зондом (CD70-2). ДНК мыши представляет собой отрицательный контроль, здоровая человеческая ДНК — положительный контроль, ранее описанный YAC72 (линия 2511) и две линии YAC128 (53,55) были оценены на предмет количества копий. ( C ) Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени, показывающая уровни экспрессии YAC128 мРНК хантингтина человека. РНК выделяли из лобной коры головного мозга мыши.Все значения ПЦР выражены в виде относительных уровней мРНК, нормализованных к уровням мРНК бета-актина. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения n = 3 животных на группу. ( D ) Вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию белка YAC128. WT, линии 2511, 53, 55 и человеческий контроль зондировали специфическим человеческим антителом к хантинтину HD650. Блоты удаляли и повторно зондировали антителом против актина для демонстрации равной нагрузки. ( E ) Сравнение относительных уровней экспрессии РНК человека и белка.Уровни белка рассчитывали с помощью программного обеспечения NIH для денситометрии изображений и нормализовали по актину. Корреляция Пирсона показала r ² = 1,0.
Рисунок 1. Характеристика трансгенной мыши YAC128. ( A ) Агарозный гель, демонстрирующий расширение CAG-повторов. ПЦР с использованием праймеров, специфичных для человека, амплифицировала увеличенный повтор CAG из геномной ДНК. 18, 46 и 72 повтора были амплифицированы от ранее описанных мышей YAC (9,10), а 128 — от мышей YAC128 (линия 53).Контроль (+ ve) взят из вектора-переносчика дрожжей со 128 CAG. Мышь дикого типа (WT) является отрицательным контролем, а ДНК человека (18 и 35 CAG) является другим положительным контролем. Маркер — лестница 100 п.н. ( B ) Саузерн-блоттинг для оценки количества копий. Геномную ДНК, расщепленную EcoR1, зондировали специфическим для человека зондом (CD70-2). ДНК мыши представляет собой отрицательный контроль, здоровая человеческая ДНК — положительный контроль, ранее описанный YAC72 (линия 2511) и две линии YAC128 (53,55) были оценены на предмет количества копий.( C ) Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени, показывающая уровни экспрессии YAC128 мРНК хантингтина человека. РНК выделяли из лобной коры головного мозга мыши. Все значения ПЦР выражены в виде относительных уровней мРНК, нормализованных к уровням мРНК бета-актина. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения n = 3 животных на группу. ( D ) Вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию белка YAC128. WT, линии 2511, 53, 55 и человеческий контроль зондировали специфическим человеческим антителом к хантинтину HD650.Блоты удаляли и повторно зондировали антителом против актина для демонстрации равной нагрузки. ( E ) Сравнение относительных уровней экспрессии РНК человека и белка. Уровни белка рассчитывали с помощью программного обеспечения NIH для денситометрии изображений и нормализовали по актину. Корреляция Пирсона показала r ² = 1,0.
Рисунок 2. Вес мозга выборочно снижается у мышей YAC128. ( A ) Масса перфузированного мозга (включая мозжечок) сравнивалась между YAC128, линия 53 и однопометниками дикого типа в 6 ( n = 5), 9 ( n = 7) и 12 ( n = 7). ) месяцев возраста.Вес мозга у 9-месячных YAC128s был значительно снижен (* P <0,05) и у 12-месячных YAC128s (** P <0,01) по тесту Стьюдента t . Показана средняя масса мозга ± стандартное отклонение групп. ( B ) У YAC128s масса мозжечка не уменьшается. Мозжечок удаляли и измеряли вес. Ни в какой момент времени не было значительной разницы.
Рис. 2. Вес мозга выборочно снижается у мышей YAC128.( A ) Масса перфузированного мозга (включая мозжечок) сравнивалась между YAC128, линия 53 и однопометниками дикого типа в 6 ( n = 5), 9 ( n = 7) и 12 ( n = 7). ) месяцев возраста. Вес мозга у 9-месячных YAC128s был значительно снижен (* P <0,05) и у 12-месячных YAC128s (** P <0,01) по тесту Стьюдента t . Показана средняя масса мозга ± стандартное отклонение групп. ( B ) У YAC128s масса мозжечка не уменьшается.Мозжечок удаляли и измеряли вес. Ни в какой момент времени не было значительной разницы.
Рисунок 3. Стриатальный и корковый объемы уменьшены у мышей YAC128. Перфузированный мозг разрезали коронально на 25 мкм срезы по всему полосатому телу. Каждый восьмой срез был иммуноокрашен, и для отслеживания и расчета объема использовалось программное обеспечение Stereoinvestigator. ( A ) YAC128s не показали разницы в объеме полосатого тела через 6 месяцев ( n = 5), значительное уменьшение через 9 месяцев ( n = 7, *** P <0.001) и 12-месячного возраста ( n = 6, ** P <0,01) с помощью теста Стьюдента t . ( B ) Объем коры не отличался значимо в возрасте 9 месяцев ( n = 5), но уменьшился в возрасте 12 месяцев ( n = 5, * P <0,05). Показан средний объем ± стандартное отклонение для каждой группы.
Рисунок 3. Стриатальный и корковый объемы уменьшены у мышей YAC128. Перфузированный мозг разрезали коронально на 25 мкм срезы по всему полосатому телу.Каждый восьмой срез был иммуноокрашен, и для отслеживания и расчета объема использовалось программное обеспечение Stereoinvestigator. ( A ) YAC128s не показали разницы в объеме полосатого тела через 6 месяцев ( n = 5), значительное снижение через 9 месяцев ( n = 7, *** P <0,001) и в возрасте 12 месяцев. ( n = 6, ** P <0,01) по тесту Стьюдента t . ( B ) Объем коры не отличался значимо в возрасте 9 месяцев ( n = 5), но уменьшился в возрасте 12 месяцев ( n = 5, * P <0.05). Показан средний объем ± стандартное отклонение для каждой группы.
Рисунок 4. Площадь поверхности стриарного нейрона уменьшена у мышей YAC128. Программное обеспечение Stereoinvestigator произвольно выбирало кадры размером 50 × 50 мкм в полосатом теле коронарного среза. Площадь поверхности нейронов в кадрах рассчитывалась с помощью программного обеспечения (> 70 нейронов на животное). Нет никакой разницы в средней площади поверхности нейронов полосатого тела у 9-месячных YAC128 ( n = 7 животных), но значительное уменьшение площади поверхности нейронов полосатого тела у 12-месячных YAC128s ( n = 6 животных, ** П <0.01) по Студенческому тесту т . Показана средняя поверхность полосатого тела ± стандартное отклонение для каждой группы.
Рис. 4. Площадь поверхности нейронов полосатого тела уменьшена у мышей YAC128. Программное обеспечение Stereoinvestigator произвольно выбирало кадры размером 50 × 50 мкм в полосатом теле коронарного среза. Площадь поверхности нейронов в кадрах рассчитывалась с помощью программного обеспечения (> 70 нейронов на животное). Нет никакой разницы в средней площади поверхности нейронов полосатого тела у 9-месячных YAC128 ( n = 7 животных), но значительное уменьшение площади поверхности нейронов полосатого тела у 12-месячных YAC128s ( n = 6 животных, ** П <0.01) по Студенческому тесту т . Показана средняя поверхность полосатого тела ± стандартное отклонение для каждой группы.
Фигура 5. Дефицит ротарода у мышей YAC128. Однопометники YAC128s ( n = 16) и контроль дикого типа ( n = 14) были протестированы в трех испытаниях на ускоряющем роторном стержне с интервалом в 3 месяца. В возрасте 3 месяцев разницы между двумя группами не было. В возрасте 6 месяцев производительность ротора YAC128 снизилась (** P <0.01). Этот дефицит присутствовал в возрасте 9 (* P <0,05) и 12 месяцев (** P <0,01), хотя в эти временные точки производительность мышей дикого типа также снижалась. Анализ ANOVA выявил значимое взаимодействие генотипа и времени ( F _3,84 = 4,662, P = 0,005). Среднее время, затраченное на вращающийся стержень для каждой группы, нанесено на график, а столбцы ошибок представляют собой SEM.
Фигура 5. Дефицит ротарод у мышей YAC128. Однопометники YAC128s ( n = 16) и контроль дикого типа ( n = 14) были протестированы в трех испытаниях на ускоряющем роторном стержне с интервалом в 3 месяца.В возрасте 3 месяцев разницы между двумя группами не было. В возрасте 6 месяцев производительность ротора YAC128 снизилась (** P <0,01). Этот дефицит присутствовал в возрасте 9 (* P <0,05) и 12 месяцев (** P <0,01), хотя в эти временные точки производительность мышей дикого типа также снижалась. Анализ ANOVA выявил значимое взаимодействие генотипа и времени ( F _3,84 = 4,662, P = 0,005). Среднее время, затраченное на вращающийся стержень для каждой группы, нанесено на график, а столбцы ошибок представляют собой SEM.
Рисунок 6. YAC128 сначала проявляют гиперактивность, а затем гипокинетическое поведение. Однопометники YAC128 ( n = 14) и контрольные ( n = 12) (WT) тестировали в боксе активности открытого поля в течение 10 мин. Были измерены пять параметров активности и показаны среднее значение и стандартная ошибка для групп. Эти меры включают пройденное расстояние ( A ), амбулаторные подсчеты ( B ), амбулаторные эпизоды ( C ), время, затраченное на передвижение ( D ) и время, проведенное в покое ( E ).Двигательную активность измеряли в условиях домашней клетки в течение 24 часов ( n = 8 YAC128 и WT) ( F ). Среднее значение измерения для каждой группы нанесено на график, а столбцы ошибок представляют стандартную стандартную погрешность. Существенные различия в средних значениях групп по критерию t представлены звездочками и соответствующими значениями P .
Рис. 6. YAC128 сначала проявляют гиперактивность, а затем гипокинетическое поведение. Однопометники YAC128 ( n = 14) и контрольные ( n = 12) (WT) тестировали в боксе активности открытого поля в течение 10 мин.Были измерены пять параметров активности и показаны среднее значение и стандартная ошибка для групп. Эти меры включают пройденное расстояние ( A ), амбулаторные подсчеты ( B ), амбулаторные эпизоды ( C ), время, затраченное на передвижение ( D ) и время, проведенное в покое ( E ). Двигательную активность измеряли в условиях домашней клетки в течение 24 часов ( n = 8 YAC128 и WT) ( F ). Среднее значение измерения для каждой группы нанесено на график, а столбцы ошибок представляют стандартную стандартную погрешность.Существенные различия в средних значениях групп по критерию t представлены звездочками и соответствующими значениями P .
Рисунок 7. Нарушение активности вращающихся стержней сильно коррелирует с потерей нейронов полосатого тела. Производительность Rotarod при фиксированной скорости (34 или 40 об / мин) измеряли у 6-, 9- и 12-месячных мышей YAC128 ( n = 5) и коррелировали с нейропатологическими фенотипами с использованием корреляции Пирсона. Количество нейронов в 12-месячном возрасте достоверно коррелирует с производительностью вращающегося стержня у 6-месячных мышей YAC128 при 40 об / мин ( A , r ² = 0.8719, P = 0,02), 9-месячные мыши YAC128 в возрасте 34 ( B , r ² = 0,9108, P = 0,01) и 40 об / мин ( C , r ² = 0,7641, P = 0,05) и 12-месячных мышей YAC128 при 34 об / мин ( D , P <0,01, r ² = 0,9214). Производительность Rotarod у 12-месячных мышей YAC128 слабо коррелирует с массой мозга ( E , P <0,05, r ² = 0.808) и объем полосатого тела ( F , P = 0,22, r ² = 0,442) в возрасте 12 месяцев. Отдельные мыши YAC128 представлены в виде ромбов.
Рис. 7. Нарушение активности вращающихся стержней сильно коррелирует с потерей нейронов полосатого тела. Производительность Rotarod при фиксированной скорости (34 или 40 об / мин) измеряли у 6-, 9- и 12-месячных мышей YAC128 ( n = 5) и коррелировали с нейропатологическими фенотипами с использованием корреляции Пирсона.Количество нейронов в 12-месячном возрасте достоверно коррелирует с производительностью ротарного стержня у 6-месячных мышей YAC128 при 40 об / мин ( A , r ² = 0,8719, P = 0,02), 9-месячный YAC128 мышей при 34 ( B , r ² = 0,9108, P = 0,01) и 40 об / мин ( C , r ² = 0,7641, P = 0,05) и 12 месяцев -старых мышей YAC128 при 34 об / мин ( D , P <0,01, r ² = 0.9214). Производительность Rotarod у 12-месячных мышей YAC128 слабо коррелирует с массой мозга ( E , P <0,05, r ² = 0,808) и объемом полосатого тела ( F , P = 0,22, ). r ² = 0,442) в возрасте 12 месяцев. Отдельные мыши YAC128 представлены в виде ромбов.
Рисунок 8. Иммунореактивность EM48 в полосатом теле 12- ( A и D ) и 18- ( B , C , E и F ) месячных мышей YAC128.Через 12 месяцев продукт реакции EM48 DAB присутствует во многих ядрах (A). Иммунореактивность ЕМ48 проявляется в диффузном окрашивании, а также в небольших положительных точках ЕМ48 по всей нуклеоплазме. С помощью электронной микроскопии по всей нуклеоплазме можно увидеть множество небольших кластеров из трех-шести частиц иммунозолота, образующих микроагрегаты (D, стрелки). К 18 месяцам, помимо диффузного окрашивания и микроагрегатов, продукт реакции EM48 DAB также виден во включениях, видимых как темные положительные точки EM48 при микроскопии уровня света (B и C, стрелки).По данным электронной микроскопии включения состоят из крупных скоплений частиц иммунозолота (F, стрелки). Масштабные линейки: A – C, 10 мкм; D и E, 1 мкм; F, 270 нм.
Рис. 8. Иммунореактивность EM48 в полосатом теле 12- ( A и D ) и 18- ( B , C , E и F ) месячных мышей YAC128. Через 12 месяцев продукт реакции EM48 DAB присутствует во многих ядрах (A). Иммунореактивность ЕМ48 проявляется в диффузном окрашивании, а также в небольших положительных точках ЕМ48 по всей нуклеоплазме.С помощью электронной микроскопии по всей нуклеоплазме можно увидеть множество небольших кластеров из трех-шести частиц иммунозолота, образующих микроагрегаты (D, стрелки). К 18 месяцам, помимо диффузного окрашивания и микроагрегатов, продукт реакции EM48 DAB также виден во включениях, видимых как темные положительные точки EM48 при микроскопии уровня света (B и C, стрелки). По данным электронной микроскопии включения состоят из крупных скоплений частиц иммунозолота (F, стрелки). Масштабные линейки: A – C, 10 мкм; D и E, 1 мкм; F, 270 нм.
Таблица 1.
Число нейронов полосатого тела у мышей YAC128. Стереологическое программное обеспечение использовали для оценки количества нейронов полосатого тела, окрашенных NeuN, в серийных срезах YAC128s по сравнению с контролем. YAC128s показал уменьшение количества нейронов в возрасте 12 месяцев, но не в возрасте 9 месяцев. Результаты через 12 месяцев были повторены на другой группе животных.
± 1506 .01
Возраст (мес.) . Вт . YAC128 . n . Уменьшение в процентах . Значение .
9 1507000 ± 68530 1365000 ± 33580 3 9 NS, P = 0,16
12 (i) 150000
00 ± 7 15 P = 0,004
12 (ii) 1682000 ± 71870 1375000 ± 65360 5 18
± 150
Возраст (мес.) . Вт . YAC128 . n . Уменьшение в процентах . Значение .
9 1507000 ± 68530 1365000 ± 33580 3 9 NS, P = 0,16
12 (i) 150000
00 ± 7 15 P = 0.004
12 (ii) 1682000 ± 71870 1375000 ± 65360 5 18 P P = 0,01
Таблица 1. Число нейронов 9000 Стереологическое программное обеспечение использовали для оценки количества нейронов полосатого тела, окрашенных NeuN, в серийных срезах YAC128s по сравнению с контролем. YAC128s показал уменьшение количества нейронов в возрасте 12 месяцев, но не в возрасте 9 месяцев. Результаты через 12 месяцев были повторены на другой группе животных.
± 150
Возраст (мес.) . Вт . YAC128 . n . Уменьшение в процентах . Значение .
9 1507000 ± 68530 1365000 ± 33580 3 9 NS, P = 0,16
12 (i) 150000
00 ± 7 15 P = 0.004
12 (ii) 1682000 ± 71870 1375000 ± 65360 5 18 P = 0,01
12 месяцев (мес.) . ± 71296
Вт . YAC128 . n . Уменьшение в процентах . Значение .
9 1507000 ± 68530 1365000 ± 33580 3 9 NS, P = 0.16
12 (i) 1724000 ± 50270 1504000 ± 23640 7 15 P = 0,004
12 (ii) 70 70 168 5 18 P = 0,01
Таблица 2.
Анализ перекрытия и мощности для количественных фенотипов у отдельных мышей YAC128. Показано количество мышей YAC128 с измерениями, которые перекрывают измерения в группе дикого типа.Анализ мощности определяет количество животных YAC128, необходимое для обнаружения существенной ( P <0,05) разницы между обработанными и необработанными животными, если вы прогнозируете 80% -ную вероятность выявления 33, 50 или 66% спасения различных количественных фенотипов
12
Фенотип . Возраст (мес.) . Количество перекрытий . Мощность .
. . . 33% спасение . 50% спасение . 66% спасение .
Стриарный объем 9 0 8 4 2
Размер полосатого нейрона 12 01292 1 вес 12 1/3 27 12 7
Число стриатарных нейронов 12 1/8 30
13 7 0 35 15 9
Ротарод 6 1/2 99 43 25
P1278 . Возраст (мес.) . Количество перекрытий . Мощность . . . . 33% спасение . 50% спасение . 66% спасение . Стриарный объем 9 0 8 4 2 Размер полосатого нейрона 12 01292 1 вес 12 1/3 27 12 7 Число стриатарных нейронов 12 1/8 30 13 7 12 0 35 15 9 Rotarod 6 1/2 99 43 25 Таблица 2.
Анализ перекрытия и мощности для количественных фенотипов у отдельных мышей YAC128. Показано количество мышей YAC128 с измерениями, которые перекрывают измерения в группе дикого типа. Анализ мощности определяет количество животных YAC128, необходимое для обнаружения существенной ( P <0,05) разницы между обработанными и необработанными животными, если вы прогнозируете 80% -ную вероятность выявления 33, 50 или 66% спасения различных количественных фенотипов
12
Фенотип . Возраст (мес.) . Количество перекрытий . Мощность .
. . . 33% спасение . 50% спасение . 66% спасение .
Стриарный объем 9 0 8 4 2
Размер полосатого нейрона 12 01292 1 вес 12 1/3 27 12 7
Число стриатарных нейронов 12 1/8 30
13 7 0 35 15 9
Ротарод 6 1/2 99 43 25
P1278 . Возраст (мес.) . Количество перекрытий . Мощность . . . . 33% спасение . 50% спасение . 66% спасение . Стриарный объем 9 0 8 4 2 Размер полосатого нейрона 12 01292 1 вес 12 1/3 27 12 7 Количество стриатальных нейронов 12 1/8 30 13 7 12 0 35 15 9 Rotarod 6 1/2 99 43 25
Ссылки 1
Группа совместных исследований болезни Хантингтона (
1993
) Новый ген, содержащий тринуклеотидный повтор, который размножается и нестабилен на хромосомах болезни Хантингтона.
Cell
,
72
,
971
–983,2
Mangiarini, L., Sathasivam, K., Seller, M., Cozens, B., Harper, A., Hetherington, C., Lawton, M., Trottier , Ю., Лехрах, Х., Дэвис, С. и Бейтс, Г. (
1996
) Экзон 1 гена HD с увеличенным повторением CAG достаточен для того, чтобы вызвать прогрессирующий неврологический фенотип у трансгенных мышей.
Cell
,
87
,
493
–506,3
Шиллинг, Г., Бехер, М.В., Шарп, А.Х., Джинна, Х.A., Duan, K., Kotzuk, J.A., Slunt, H.H., Ratovitski, T., Cooper, J.K., Jenkins, N.A. et al. (
1999
) Внутриядерные включения и нейритные агрегаты у трансгенных мышей, экспрессирующих мутантный N-концевой фрагмент хантингтина.
Hum. Мол. Genet.
,
8
,
397
–407,4
Лафорет, Джорджия, Сапп, Э., Чейз, К., Макинтайр, К., Бойс, Ф.М., Кэмпбелл, М., Кэдиган, Б.А., Варжеки, Л., Тагле , DA, Reddy, PH, Cepeda, C. et al. (
2001
) Изменения в нейронах коры и полосатого тела позволяют прогнозировать поведенческие и электрофизиологические аномалии в модели болезни Хантингтона на трансгенных мышах.
J. Neurosci.
,
21
,
9112
–9123,5
Шелборн, П.Ф., Киллин, Н., Хевнер, Р.Ф., Джонстон, Х.М., Текотт, Л., Левандоски, М., Эннис, М., Рамирес, Л., Ли , Z., Iannicola, C. et al. (
1999
) Экспансия CAG при болезни Хантингтона в локусе Hdh мышей нестабильна и связана с поведенческими аномалиями у мышей.
Hum. Мол. Genet.
,
8
,
763
–774,6
Уиллер, В.К., Уайт, Дж. К., Гутекунст, К.A., Vrbanac, V., Weaver, M., Li, X.J., Li, S.H., Yi, H., Vonsattel, J.P., Gusella, J.F. et al. (
2000
) Длинные глютаминовые тракты вызывают ядерную локализацию новой формы хантингтина в нейронах полосатого тела со средними шипами у мышей с нокаутом HdhQ92 и HdhQ111.
Hum. Мол. Genet.
,
9
,
503
–513,7
Лин, С.Х., Таллаксен-Грин, С., Чиен, В.М., Сирли, Дж. А., Джексон, В.С., Кроуз, А.Б., Рен, С., Ли, XJ, Альбин, Р.Л., Детлофф П.J. (
2001
) Неврологические аномалии в модели болезни Хантингтона у мышей.
Hum. Мол. Genet.
,
10
,
137
–144,8
Menalled, L.B., Sison, J.D., Wu, Y., Olivieri, M., Li, X.J., Li, H., Zeitlin, S. и Chesselet, M.F. (
2002
) Ранняя моторная дисфункция и стриосомное распределение микроагрегатов хантингтина у мышей, пораженных болезнью Хантингтона.
J. Neurosci.
,
22
,
8266
–8276.9
Ходжсон, Дж. Г., Смит, Д. Дж., Маккатчеон, К., Коид, Х. Б., Нишияма, К., Динулос, М. Б., Стивенс, М. Е., Бисада, Н., Насир, Дж., Канадзава, И. и др. (
1996
) Человеческий хантингтин, полученный из трансгенов YAC, компенсирует потерю мышиного хантингтина путем восстановления летального эмбрионального фенотипа.
Hum. Мол. Genet.
,
5
,
1875
–1885,10
Ходжсон, Дж. Г., Агопян, Н., Гутекунст, К. А., Ливитт, Б. Р., Лепиан, Ф., Сингараджа, Р., Смит, Д.J., Bissada, N., McCutcheon, K., Nasir, J. et al. (
1999
) Модель YAC на мышах для болезни Хантингтона с полноразмерным мутантным гентингтином, цитоплазматической токсичностью и селективной нейродегенерацией полосатого тела.
Neuron
,
23
,
181
–192,11
Сепеда, К., Ариано, М.А., Калверт, К.Р., Флорес-Эрнандес, Дж., Чандлер, С.Х., Ливитт, Б.Р., Хайден, М.Р. и Левин, М.С. (
2001
) Функция рецептора NMDA в мышиных моделях болезни Хантингтона.
J. Neurosci. Res.
,
66
,
525
–539,12
Zeron, MM, Chen, N., Moshaver, A., Lee, AT, Wellington, CL, Hayden, MR и Raymond, LA (
2001
) Охота на мутантов эксайтотоксическая гибель клеток.
Мол. Cell Neurosci.
,
17
,
41
–53,13
Зерон, М.М., Ханссон, О., Чен, Н., Веллингтон, Калифорния, Ливитт, Б.Р., Брандин, П., Хайден, М.Р. и Раймонд, Луизиана (
2002
) Повышенная чувствительность к опосредованной рецептором N -метил-D-аспартата эксайтотоксичности на мышиной модели болезни Хантингтона.
Neuron
,
33
,
849
–860,14
Zuccato, C., Ciammola, A., Rigamonti, D., Leavitt, BR, Goffredo, D., Conti, L., MacDonald, ME, Friedlander, RM , Силани В., Хайден MR и др. (
2001
) Потеря опосредованной хантингтином транскрипции гена BDNF при болезни Гентингтона.
Science
,
293
,
493
–498,15
Панов, А.В., Гутекунст, К.А., Ливитт, Б.Р., Хайден, М.Р., Берк, Дж. Р., Стритматтер, В.Дж. И Гринамир, Дж. Т. (
2002
) Ранние митохондриальные дефекты кальция при болезни Хантингтона являются прямым эффектом полиглутаминов.
Nat. Neurosci.
,
5
,
731
–736,16
Ливитт, Б.Р., Гуттман, Дж. А., Ходжсон, Дж. Г., Кимел, Г. Х., Сингараджа, Р., Фогл, А. У. и Hayden, M.R. (
2001
) Хантингтин дикого типа снижает клеточную токсичность мутантного гентингтина in vivo .
г. J. Hum. Genet.
,
68
,
313
–324.17
Brinkman, R.R., Mezei, M.M., Theilmann, J., Almqvist, E. and Hayden, M.R. (
1997
) Вероятность заражения болезнью Хантингтона в определенном возрасте для определенного размера CAG.
г. J. Hum. Genet.
,
60
,
1202
–1210,18
Дафф, К., МакГиган, А., Хаксли, К., Шульц, Ф. и Харди, Дж. (
1994
) Внедрение патогенной мутации в дрожжи искусственная хромосома, содержащая ген белка-предшественника амилоида человека.
Gene Ther.
,
1
,
70
–75,19
Харпер, П. (
1991
)
Болезнь Хантингтона.
W.B. Сондерс, Лондон. 20
Хайден, М.Р. (
1981
)
Хорея Хантингтона.
Springer, New York.21
Vonsattel, J.P., Myers, R.H., Stevens, T.J., Ferrante, R.J., Bird, E.D. и Ричардсон, Э. Jr (
1985
) Невропатологическая классификация болезни Хантингтона.
J. Neuropathol. Exp. Neurol.
,
44
,
559
–577.22
Mullen, R.J., Buck, C.R., Smith, A.M. (
1992
) NeuN, нейрональный специфический ядерный белок позвоночных.
Development
,
116
,
201
–211,23
Ouimet, C.C., Langley-Guillon, K.C. и Greengard, P. (
1998
) Количественный иммуноцитохимический анализ нейронов, экспрессирующих DARPP-32, в хвостатопутамене крысы.
Brain Res.
,
808
,
8
–12,24
Ферранте, Р.Дж., Андреассен, О.А., Дженкинс, Б.G., Dedeoglu, A., Kuemmerle, S., Kubilus, J.K., Kaddurah-Daouk, R., Hersch, S.M. и Бил, М.Ф. (
2000
). Нейропротективные эффекты креатина в модели трансгенной мыши с болезнью Хантингтона.
J. Neurosci.
,
20
,
4389
–4397,25
Левин, М.С., Клапштайн, Г.Дж., Коппель, А., Груэн, Э., Сепеда, К., Варгас, М.Э., Джокель, Э.С., Карпентер, Е.М., Занджани, Х. ., Hurst, RS, et al. (
1999
) Повышенная чувствительность к активации рецептора N-метил-D-аспартата в моделях болезни Хантингтона у трансгенных и нокин-мышей.
J. Neurosci. Res.
,
58
,
515
–532,26
Драгацис И., Левин М.С. и Zeitlin, S. (
2000
). Инактивация Hdh в мозге и семенниках приводит к прогрессирующей нейродегенерации и бесплодию у мышей.
Nat. Genet.
,
26
,
300
–306,27
Люсс, Х.Г., Шифер, Дж., Спруенкен, А., Пульс, К., Блок, Ф. и Косински, К.М. (
2001
) Оценка трансгенных мышей R6 / 2 HD для терапевтических исследований при болезни Хантингтона: поведенческое тестирование и влияние сахарного диабета.
Behav. Brain Res.
,
126
,
185
–195,28
Gutekunst, CA, Li, SH, Yi, H., Mulroy, JS, Kuemmerle, S., Jones, R., Rye, D., Ferrante, RJ, Hersch, SM и Ли, X.J. (
1999
) Ядерные и нейропильные агрегаты при болезни Хантингтона: связь с невропатологией.
J. Neurosci.
,
19
,
2522
–2534,29
Росас, Х.Д., Гудман, Дж., Чен, Ю.И., Дженкинс, Б.Г., Кеннеди, Д.Н., Макрис, Н., Патти, М., Сейдман, Л.Дж., Бил, М.Ф. и Koroshetz, W.J. (
2001
) Потеря объема полосатого тела при HD, измеренная с помощью МРТ, и влияние повтора CAG.
Неврология
,
57
,
1025
–1028,30
Картер, Р.Дж., Лайон, Л.А., Хамби, Т., Манджиарини, Л., Махал, А., Бейтс, Г.П., Даннет, С.Б. и Мортон, А.Дж. (
1999
) Характеристика прогрессирующих моторных дефицитов у мышей, трансгенных по мутации болезни Гентингтона человека.
J. Neurosci.
,
19
,
3248
–3257.31
Кин, C.D., Родригес, C.M.P., Eich, T., Chhabra, M.S., Steer, C.J. and Low, W.C. (
2002
) Тауроурсодезоксихолевая кислота, желчная кислота, оказывает нейропротекторное действие в модели болезни Хантингтона на трансгенных животных.
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
99
,
10671
–10676,32
Мастроберардино, П.Г., Янникола, К., Нардаччи, Р., Бернассола, Ф., Де Лауренци, В., Мелино, Г., Морено, С., Павоне, F., Oliverio, S., Fesus, L. и Piacentini, M. (
2002
) Удаление трансглютаминазы «ткани» снижает гибель нейронов и продлевает выживаемость на мышиной модели болезни Хантингтона.
Cell Death Differ.
,
9
,
873
–880,33
Coyle, J.T. и Schwarcz, R. (
1976
) Поражение нейронов полосатого тела каиновой кислотой представляет собой модель хореи Хантингтона.
Nature
,
263
,
244
–246,34
McGeer, E.G. и McGeer, P.L. (
1976
) Дублирование биохимических изменений хореи Хантингтона интрастриатальными инъекциями глутаминовой и каиновой кислот.
Nature
,
263
,
517
–519.35
Schauwecker, P.E. и Стюард, О. (
1997
) Генетические детерминанты восприимчивости к эксайтотоксической гибели клеток: значение для подходов к нацеливанию на гены.
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
94
,
4103
–4108,36
Schauwecker, P.E. (
2002
) Модуляция гибели клеток генотипом мыши: дифференциальная уязвимость к поражениям, индуцированным возбуждающими аминокислотами.
Exp. Neurol.
,
178
,
219
–235.37
DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K.O., Davies, S.W., Bates, G.P., Vonsattel, J.P. and Aronin, N. (
1997
) Агрегация хантинтина во внутриядерных включениях нейронов и дистрофических нейритах в головном мозге.
Science
,
277
,
1990
–1993,38
Дэвис, С.В., Турмейн, М., Козенс, Б.А., ДиФилья, М., Шарп, А.Х., Росс, Калифорния, Шерзингер, Э., Ванкер, Э.Э., Манджиарини , Л. и Бейтс, врач-терапевт (
1997
) Образование нейрональных внутриядерных включений лежит в основе неврологической дисфункции у мышей, трансгенных по мутации HD.
Cell
,
90
,
537
–548,39
Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D. и Greenberg, ME (
1998
) Хантингтин действует в ядре, вызывая апоптоз, но смерть не коррелируют с образованием внутриядерных включений.
Cell
,
95
,
55
–66,40
Ким, М., Ли, Х.С., Лафорет, Г., Макинтайр, К., Мартин, Э.Дж., Чанг, П., Ким, Т.В., Уильямс, М. , Reddy, PH, Tagle, D. et al. (
1999
) Экспрессия мутантного хантингтина в клональных клетках полосатого тела: диссоциация образования включения и выживание нейронов за счет ингибирования каспаз.
J. Neurosci.
,
19
,
964
–973,41
Wheeler, VC, Gutekunst, CA, Vrbanac, V., Lebel, LA, Schilling, G., Hersch, S., Friedlander, RM, Gusella, JF, Vonsattel, JP , Борчелт, Д.Р. и MacDonald, M.E. (
2002
) Ранние фенотипы, которые предвещают нейродегенеративное заболевание с поздним началом, позволяют тестировать модификаторы у мышей с Hdh CAG.
Hum. Мол. Genet.
,
11
,
633
–640,42
Веллингтон, К.Л., Эллерби, Л.М., Гутекунст, К.А., Роджерс, Д., Варби, С., Грэм, Р.К., Лубсер, О., ван Рамсдонк, Дж., Сингараджа, Р., Янг, Ю.З. et al. (
2002
) Расщепление каспазой мутантного хантингтина предшествует нейродегенерации при болезни Хантингтона.
J. Neurosci.
,
22
,
7862
–7872,43
Ким, Й.Дж., Йи, Й., Сапп, Э., Ван, Й., Куиффо, Б., Кегель, КБ, Цинь, Ж., Аронин, Н. и ДиФилья , M. (
2001
) Расщепленные каспазой 3 N-концевые фрагменты дикого типа и мутантного хантингтина присутствуют в нормальном мозге и мозге при болезни Хантингтона, связываются с мембранами и подвергаются кальпаин-зависимому протеолизу.
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
98
,
12784
–12789,44
Гафни, Дж. И Эллерби, Л.М. (
2002
) Активация кальпаина при болезни Хантингтона.
J. Neurosci.
,
22
,
4842
–4849,45
Лункес, А., Линденберг, К.С., Бен-Хайем, Л., Вебер, К., Девис, Д., Ландвермейер, Великобритания, Мандель, Дж. Л. и Троттье, Ю. (
2002
) Протеазы, действующие на мутантный хантингтин, образуют продукты расщепления, которые по-разному накапливают цитоплазматические и ядерные включения.
Мол. Cell
,
10
,
259
–269,46
Hackam, AS, Singaraja, R., Wellington, CL, Metzler, M., McCutcheon, K., Zhang, T., Kalchman, M. и Hayden, MR (
1998
) Влияние размера белка хантингтина на ядерную локализацию и клеточную токсичность.
J. Cell Biol.
,
141
,
1097
–1105,47
Дэвис, Дж. М., Пеннингтон, Дж. Э., Кублер А. М. and Conscience, J.F. (
1982
) Простой одностадийный метод отбора и клонирования гибридом для получения моноклональных антител.
J. Immunol. Meth.
,
50
,
161
–171,48
Gutekunst, C.A., Li, S.H., Yi, H., Ferrante, R.J., Li, X.J. и Hersch, S.M. (
1998
) Клеточная и субклеточная локализация хантинтин-ассоциированного белка 1 (HAP1): сравнение с хантингтином у крысы и человека.
J. Neurosci.
,
18
,
7674
–7686.
Периодическая таблица элементов по WebElements
7
87
223.02
Франций
88
226,03
Радий
**
103
262,11
Лоуренсий
104
267,12
Резерфордий
105
270.13
Дубний
106
269,13
Сиборгий
107
270,13
Бориум
108
269,13
Калий
109
278,16
Мейтнерий
110
281.17
Дармштадтиум
111
281,17
Рентгений
112
285,18
Копернициум
113
286,18
Нихоний
114
289.19
Флеровий
115
289,20
Московий
116
293,20
Ливерморий
117
293,21
Теннессин
118
294.21
Оганессон
** Актиноиды **
89
227,03
Актиний
90
232,04
Торий
91
231,04
Протактиний
92
238.03
Уран
93
237,05
Нептуний
94
244,06
Плутоний
95
243,06
Америций
96
247,07
Кюрий
97
247.07
Беркелиум
98
251,08
Калифорний
99
252,08
Эйнштейний
100
257,10
Фермий
101
258.10
Менделевий
102
259,10
Нобелий
miR-128 регулирует миграцию нейронов, рост и внутреннюю возбудимость через ген умственной отсталости Phf6
Для аргументации я обращусь к основным моментам в обратном порядке.
3) Доводы авторов относительно послойной специфичности экспрессии miR128-2 в развивающемся неокортексе, особенно в отсутствие тщательного количественного определения уровней флуоресцентного сигнала, далеко не убедительны.Авторы должны измерить уровни экспрессии miR124 и miR128-2 в VZ, SVZ и IZ и нормализовать их уровни экспрессии до уровней кортикальной пластинки, чтобы проверить, будут ли miR124 и miR128-2 по-прежнему значительно отличаться в VS, SVZ и ИЗ .
Чтобы удовлетворить этот запрос, мы теперь сравним колориметрическое окрашивание для pre-miR-128-2, miR-128 и miR-124 на E14.5 и E16.5 более подробно (репрезентативные изображения показаны на рис. 2B и C). Используя этот расширенный набор данных, мы выполнили количественную оценку в соответствии с запросом, и результаты полностью подтверждают нашу первоначальную интерпретацию.
На наш взгляд, критическим моментом для нашей рукописи является несоответствие между паттернами экспрессии pre-miR-128-2 и miR-128 в VZ, SVZ и IZ, задокументированных в исходных Figure 2B, 2C и S3. Эти изображения теперь представлены на рис. 2 — добавление к рисунку 2, где их можно напрямую сравнить с miR-124. Количественная оценка нового набора данных на E14.5 показывает, что средняя интенсивность окрашивания pre-miR-128-2 на выше в VZ / SVZ и в IZ по сравнению с CP (приблизительно 3: 1 и 1.5: 1 соответственно). Обратное верно для miR-128, интенсивность окрашивания по отношению к CP составляет , уменьшенная на в VZ / SVZ и IZ, соответственно (рис. 2B). Аналогичная картина наблюдается на E16.5: интенсивность окрашивания для pre-miR-128-2 в VZ / SVZ и IZ немного снижена по сравнению с CP (приблизительно 08: 1). Напротив, для miR-128 интенсивность окрашивания в VZ / SVZ и IZ сильно снижается по сравнению с CP (приблизительно 01: 1, рис. 2C). Мы также заменили исходные изображения, сравнивая pre-miR-128-2 и miR-128 на E18.5 (Рисунок 3 – рисунок в приложении 1) с улучшенными срезами, чтобы продемонстрировать, что несоответствие в окрашивании предшественников и зрелых miRNA сохраняется в конце эмбрионального кортикального нейрогенеза.
Кроме того, мы постоянно наблюдаем miR-124 положительные клетки в IZ во время кортикогенеза. На наш взгляд, это интересно само по себе, но не является условием для правильности нашей гипотезы. Поэтому мы не документировали этот эффект подробно в первоначальной заявке. По просьбе рецензентов мы теперь включаем miR-124 в новый анализ (рис. 2B-2E).Изображения в светлом поле показывают, в отличие от miR-128, отдельные miR-124 положительные клетки, разбросанные в IZ на E14.5 и E16.5. Количественная оценка этих изображений подтверждает, что относительная интенсивность окрашивания для miR-124 в IZ выше, чем VZ / SVZ на E14.5 и E16.5 (рис. 2D и 2E), что согласуется с исходными данными. Это резко контрастирует с miR-128, для которого интенсивность окрашивания в подкорковых зонах более однородна. Эти результаты подтверждают, что механизм, вовлеченный в задержку биогенеза miR-128, не разделяется miR-124, парадигмой miRNA в регуляции нейрогенеза.
Внутри самой корковой пластинки, по нашему мнению, нейроны верхнего слоя экспрессируют miR-128 на более низких относительных уровнях, чем либо pre-miR-128, либо miR-124. Это визуальное впечатление отражается в количественном анализе, но не является статистически значимым.
Мы надеемся, что этот новый набор данных и улучшенное представление удовлетворит опасения рецензентов.
2) Функциональный анализ miR-128 основан только на экспериментах по усилению функции / сверхэкспрессии. Авт. Необходимо предоставить доказательства потери функции, подавляющие miR-128, чтобы продемонстрировать, что он необходим для фенотипов миграции и ветвления дендритов, описанных .
На мой взгляд, не обязательно самоочевидно, что ингибирование miR-128 во время миграции или роста, как требуется, должно приводить к легко предсказуемому фенотипу. Преждевременное введение miR-128 в предшественники miR-128 ^—, как мы делаем в наших экспериментах, аналогично эксперименту по нокдауну, в нашем случае мишеней miR-128, которые обычно ингибируются на более поздней стадии, но выполняют функцию мигрирующих нейронов. . Обратные эксперименты могут быть неинформативными (в случае нокдауна сверхэкспрессии интересующего гена, в нашем случае ингибирования miRNA).
Тем не менее, мы выполнили предложенные эксперименты и можем выполнить запрос рецензентов, продемонстрировав, что ингибирование miR-128, опосредованное «губкой», приводит к значительной избыточной миграции нейронов верхнего слоя in vivo в тех же экспериментальных условиях, которые мы использовали для показывают, что преждевременный miR-128 нарушает миграцию. Эти новые данные представлены на рис. 3F и 3G. Мы считаем, что этот фенотип «зеркального отображения» в значительной степени удовлетворяет запрос рецензентов и должен привести к интересным механистическим открытиям в будущем.
Мы также выполнили анализ Шолля клеток с нокдауном «губки» на P15. Как видно из изображения ответа автора 1, наблюдаемое нами небольшое увеличение сложности дендритов наводит на размышления, но не является статистически значимым. Есть несколько возможных объяснений отсутствия фенотипа. Во-первых, постнатальная экспрессия miR-128 во время роста очень высока по сравнению с ситуацией в мигрирующих клетках в начале экспрессии miR-128 (Рисунок 1 и Рисунок 2). Следовательно, миграция может быть более чувствительной к губке, чем рост, из-за высокого, но ограниченного количества сайтов связывания губок, экспрессируемых в каждой клетке (см. Broderick and Zamore, 2014 для обсуждения ограничений конкурентных стратегий).Альтернативно, поскольку фенотип выроста в значительной степени опосредован Phf6 (как видно в экспериментах по спасению), возможно, что несоответствующая избыточная экспрессия Phf6 из-за губки не вызывает очевидного морфологического дефекта.
Реконструированные нейроны, полученные заполнением биоцитином клеток, электропорированных с помощью контроля eGFP (темно-зеленый) или конструкции губки против miR-128 (светло-зеленый), показаны на A и B.Результаты анализа Шолля представлены в C, сравнивая контроль eGFP (темно-зеленый) и губку против miR-128 (светло-зеленый). Планки погрешностей представляют SEM.
В целом, мы считаем, что новые результаты, полученные в анализе миграции, значительно усиливают аргументы в пользу того, что miR-128 контролирует миграцию. Мы надеемся, что удовлетворили опасения рецензентов.
Фенотипы, возникающие в результате электропорации miR-128, анализируются на двух стадиях: i) в нейронах корковой пластинки, где зрелая miR-128 обычно экспрессируется и где экзогенный miR-128, следовательно, сверхэкспрессируется; ii) в мигрирующих IZ нейронах, где зрелый miR-128 в норме не экспрессируется и где экзогенный miR-128, следовательно, экспрессируется эктопически.Это предполагает, что электропорация pre-miR-128-2 приводит к продукции зрелой miR128, что кажется логичным, поскольку оно имеет биологический эффект, хотя это не показано. Также нет объяснения того, почему экзогенный pre-miR-128-2 проявляет активность в мигрирующих нейронах и, следовательно, предположительно процессируется в зрелую форму, в то время как эндогенный pre-miR-128-2, который также экспрессируется в этих клетках, является не .
Мы указываем, что мы не знаем, запускается ли фенотип отростка преждевременным miR-128 до или после того, как нейроны достигают кортикальной пластинки.В любом случае, авторы обзора правы, что мы молчаливо предполагаем, что ингибирующий механизм, который блокирует процессинг эндогенного pre-miR-128-2, титруется / перегружается, когда мы вводим конструкции экспрессии miR-128 в предшественники. Мы считаем это предположение разумным: в качестве прецедента хорошо известно, что эктопическая экспрессия предшественника let-7 в плюрипотентных клетках приводит к биогенезу зрелого let-7, несмотря на присутствие ингибирующего белка Lin28 (см., Например, Rybak et al. ., 2008). Однако теперь мы обеспечиваем прямую экспериментальную поддержку: мы выполнили гибридизацию in situ для miR-128 в конусе электропораций pre-miR-128-2-RED и можем четко показать, что dsRed-положительные клетки в промежуточной зоне выделяются как miR -128-положительный среди остальных отрицательных клеток IZ. Аналогично расположенные клетки в контрольной электропорации, выполняемой параллельно, не экспрессируют miR-128. Эти данные представлены на рисунке 7 — приложение к рисунку 2. Мы согласны с тем, что эта демонстрация должна значительно укрепить документ, и благодарим рецензентов за указание на это упущение.
1) Исследование не предоставляет убедительных доказательств того, что Phf6 является мишенью miR-128 в развивающейся коре головного мозга. Показано, что miR-128 подавляет экспрессию Phf6 в клетках HEK-293, а Phf6 восстанавливает фенотипы эктопии / сверхэкспрессии miR-128 в корковых нейронах. Однако вопрос о том, регулирует ли miR-128 в норме экспрессию Phf6 в развивающейся коре головного мозга, не рассматривается (и не исследуется, экспрессируется ли и как Phf6). Следовательно, функциональное исследование предполагаемого пути miR-128-Phf6 в кортикальном развитии не имеет твердых оснований .
Мы решили эту законную проблему двумя способами. Во-первых, мы несколько упустили ссылку на опубликованные исследования экспрессии Phf6 , которые документально подтвердили экспрессию Phf6 в желудочковых, субвентрикулярных и промежуточных зонах в соответствующие периоды кортикогенеза (Zhang et al., 2013; Voss et al., 2007). ). Действительно, ранее опубликованные эксперименты по нокдауну, показывающие, что внутриутробная электропорация shРНК, направленная против Phf6 , нарушает миграцию кортикальных нейронов, не имели бы смысла, если бы это было не так (Zhang et al., 2013). Для дальнейшего документирования паттернов экспрессии Phf6 мы предоставляем новые данные in situ для Phf6 с использованием как высокоспецифичного зонда на основе LNA для обнаружения мРНК, так и недавно доступного антитела (теперь включено на рис. 5, A-D). Специфичность антитела подтверждается вестерн-блоттингом (Рисунок 5 — рисунок в приложении 3).
Результаты на уровне мРНК и белка подтверждают ранее опубликованные результаты и показывают заметное окрашивание для Phf6 в VZ / SVZ и IZ в соответствующий период кортикогенеза (E14.5 и E16.5). Эти эксперименты позволяют прямое сравнение с miR-128 в соответствующие моменты времени. Паттерн экспрессии miR-128 является реципрокным (дифференциальная экспрессия miR-128 в каждой корковой зоне описана более подробно и количественно в новой версии рисунка 2). Эти новые данные in situ согласуются и подтверждаются временным профилем мРНК Phf6 (рисунок 5I, qRT-PCR) и зрелого miR-128 (рисунок 1A, нозерн-блоттинг) в развитии мозга и во время созревания нейронов в культуре. (Фигуры 5K и 5L, qRT-PCR).Паттерны экспрессии, задокументированные в пересмотренной версии рисунка 5, поэтому полностью согласуются с нашей гипотезой и с предыдущей работой по роли Phf6 в кортикогенезе (Zhang et al., 2013): Phf6 экспрессируется в соответствующих слоях во время генерации и миграции нейронов верхнего слоя. miR-128 исключен из VZ / SVZ и IZ, с накоплением, ограниченным кортикальной пластинкой (рис. 2). Мы полагаем, что мы убедительно показали, что временная динамика регуляции Phf6, и miR-128 соответствует их предполагаемой роли в миграции и росте нейронов.Результаты также документально подтверждают наличие Phf6 в популяциях клеток, на которые мы нацелены в наших эктопических электропорациях miR-128, подтверждая нашу точку зрения о том, что преждевременная экспрессия miR-128 потенциально может помешать известной потребности в Phf6 во время миграции, как сообщает Чжан. и другие. (Zhang et al., 2013).
Во второй части комментария задается вопрос, сделали ли мы достаточно, чтобы показать, что Phf6 действительно является нормативной мишенью для miR-128. Мы отмечаем, что прямая демонстрация регуляции Phf6 с помощью miR-128 в развивающейся коре технически довольно сложно.Вообще говоря, в весьма аналогичном случае нокдаунов shRNA обычно не требуется доказывать, что конструкция shRNA снижает экспрессию целевого белка in vivo после электропорации in utero. Этого должно быть достаточно, чтобы продемонстрировать эффективность и специфичность shRNA в культуре клеток и что биологический эффект восстанавливается in vivo с помощью конструкции, нечувствительной к shRNA. То, что мы показали, аналогично: мы показываем, что конструкция Phf6 , лишенная последовательностей распознавания miR-128 в 3’UTR, спасает миграцию, рост и электрофизиологические фенотипы, которые мы наблюдаем с эктопическим miR-128.Мы показываем, что три консервативных сайта связывания miR-128 в Phf6 3’UTR (теперь описаны на рисунке 5 — рисунок в приложении 1) распознаются в репортерном анализе (теперь показан на рисунке 5E). Это не является неожиданностью, мы указываем, что Phf6 является шестой по рангу предсказанной целью для miR-128 в базе данных PicTar PicTar (Krek et al., 2005). Мы также показываем, что введение miR-128 в miR-128-отрицательную клеточную линию HEK-293 снижает уровень эндогенного Phf6 на уровне белка (рис. 5G и 5H).Теперь мы показываем результаты того же эксперимента на клетках HeLa, в которых эктопические miR-128, но не нацеленные на контрольные miRNA, явно снижают уровни белка Phf6 (рис. 5F).
В интересах рецензентов мы хотели бы немного расширить эти данные, представив неопубликованные работы из нашей лаборатории.
Первое указание на то, что Phf6 является мишенью miR-128, было получено с помощью алгоритмов предсказания miRNA TargetScan, PicTar и DianaMicroT. Все три идентифицируют три потенциальных сайта связывания, которые присутствуют в 3’UTR мРНК Phf6 человека и мыши (см. Рисунок 5 — рисунок в приложении 2).DianaMicroT распознает один дополнительный сайт связывания с более низким сродством. В TargetScan два сайта обозначены как «плохо сохраняемые». Это связано с тем, что, что интересно, они не присутствуют в мРНК кур или Xenopus. Однако эти три сайта консервативны во всех мРНК млекопитающих.
Эти наблюдения убедительно подтверждают, что Phf6 является эволюционно консервативной мишенью для miR-128 у млекопитающих, при этом наличие множественных сайтов связывания дополнительно указывает на относительно сильный регуляторный эффект.
Ранее мы провели беспристрастный скрининг генов ответа miR-128 в линии клеток эмбриокарциномы P19 (наши неопубликованные данные). Было обнаружено, что регуляция 160 транскриптов снижена (отсечение 0,5 раза). В качестве показателя специфичности нацеливания анализ этого списка для обогащения мишеней miRNA (Web-Gestalt) показывает, что мишени для miR-128 и miR-27 являются единственными miRNA, демонстрирующими значительное обогащение, как и ожидалось (P = 2.3e-08 или 3.2e-08, поправка Бонферонни, соответственно).Затравочные области miR-128 и miR-27 очень похожи, и ожидается, что две miRNA нацелены на перекрывающиеся наборы мРНК. Это указывает на то, что по крайней мере некоторые из мРНК, идентифицированных в этом эксперименте, вероятно, будут прямыми мишенями. Помимо Phf6 , две из наиболее охарактеризованных мРНК-мишеней miR-128 в нервной системе, Casc3 / Mln51 (Bruno et al., 2011) и Szrd1 (Tan et al. 2013), также были обнаружены в этот экран. В эксперименте с микрочипами Phf6 был подавлен на 0.В 441 раз, что очень похоже на степень ингибирования, которую мы обнаруживаем на уровне мРНК и белка в клетках HEK-293, как показано на рис. 5F и 5G, по сравнению с 0,284-кратным для Szrd1 с 4 предсказанными сайтами связывания и 0,478-кратным для Casc3 с двумя предсказанными сайтами. Эти результаты были подтверждены ОТ-ПЦР, а в случае Szrd1 — репортерным анализом с использованием клонированного 3’UTR (наши неопубликованные наблюдения).
Наконец, после представления нашей рукописи, было опубликовано исследование, в котором представлены доказательства нацеливания на Phf6 с помощью miR-128 в Т-клетках, одной из немногих тканей вне нервной системы, демонстрирующих высокие уровни экспрессии miR-128 (Mets et al. ., 2014).
В совокупности мы полагаем, что доказательства регуляции Phf6 с помощью miR-128 убедительны. Однако мы приложили все усилия, чтобы напрямую доказать, что Phf6 подавляется in vivo в наших экспериментальных условиях. Для этой цели мы использовали FACS для выделения контрольных клеток Intron-RED и pre-miR-128-2-RED на E18.5 вскоре после электропорации на E15.5 (изображение ответа автора 2). К сожалению, урожай клеток был низким (≈200000 / помет), что привело к экспериментальной вариабельности в последующей обработке, необходимой для получения кДНК для анализа qRT-PCR.Мы наблюдаем тенденцию к снижению экспрессии Phf6 в электропорированных клетках miR-128-2 по сравнению с контролем. Однако разница в 4 независимых образцах, полученных из клеток, объединенных в результате независимых электропораций, не достигла статистической значимости. Для сравнения мы выбрали мРНК для Szrd1 / C1orf144 в качестве положительного контроля, который, как обсуждалось выше, является экспериментально подтвержденной мишенью miR-128 (Tan et al., 2013), и прогнозируемой мишенью мРНК для miR-128 ( Targetscan, PicTar).Наблюдаемая нами тенденция была сопоставима с Phf6 , но также не была статистически значимой.
qRT-PCR, проведенная на FAC-отсортированных клетках, полученных после электропорации на E15.5 с контрольной плазмидой Intron-RED (черные столбцы) или плазмидой экспрессии miR-128-2 pre-miR-128-1-RED (серые столбцы) . Были собраны dsRed-положительные клетки, выделена РНК и проведена qRT-PCR с использованием Oaz1 в качестве эталонной мРНК. PHf6 , Szrd1 были легко обнаружены, количественное определение показано. Szrd1 в качестве известной мишени miR-128 является положительным контролем, β -актин — отрицательным контролем. Хотя наблюдается четкая тенденция, снижение мРНК PHf6 в ответ на эктопический miR-128 не является статистически значимым (непарный t-критерий).
Мы отмечаем, что, в отличие от siRNA, для miRNA qRT-PCR, вероятно, недооценивает степень репрессии на уровне белка.Мы считаем, что техническая сложность эксперимента и сопутствующая вариабельность затрудняют достижение значимости, учитывая относительно скромный эффект, который мы пытаемся зафиксировать: в идеальных условиях примерно на 50% снижение репортерного анализа (рис. 5E) и уровней белка. в клетках HEK-293 (рис. 5G). Мы надеемся, что рецензенты согласны с тем, что этот эксперимент подвержен ошибкам типа II. Мы также хотели бы сказать, что мы считаем анализ FACS довольно героическим усилием и надеемся, что он не станет золотым стандартом, поскольку требует значительных экспериментов на животных и наличия отличного оборудования FACS.
Мы рассмотрели альтернативные подходы: мы не видим возможности выполнить количественный вестерн-блоттинг на ограниченном количестве клеток, полученных с помощью FACS. Основываясь на нашем опыте с другими miRNA, мы не считаем, что окрашивание miR-128 положительных или дефицитных клеток на Phf6 будет количественно строгим, особенно потому, что все доступные антитела Phf6 требуют амплификации с использованием системы TSA.
Таким образом, Phf6 является предсказанной и подтвержденной регуляторной мишенью для miR-128, как показано в нескольких анализах.Паттерны в значительной степени реципрокной экспрессии Phf6 и miR-128 согласуются с ролью miR-128 в регуляции Phf6 во время радиальной миграции кортикальных нейронов. Мы впервые показываем, что избыток miR-128 во время развития нарушает миграцию, рост и внутреннюю активность нейронов коры верхнего слоя. Мы показываем, что экзогенный Phf6 может спасти эти фенотипы. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами об активности Phf6 в миграции и расширяют влияние Phf6 на рост и сопутствующие показатели активности.Мы надеемся, что доказательства этого регуляторного взаимодействия теперь имеют гораздо более прочную основу.
https://doi.org/10.7554/eLife.04263.025
MiRNA-128 регулирует пролиферацию и нейрогенез нервных предшественников, воздействуя на PCM1 в развивающейся коре головного мозга
[Примечание редакции: ответы автора на первый раунд рецензирования приводятся ниже.]
Получив комментарии и предложения рецензентов, мы внимательно изучили наши рукописи и обнаружили, что ни один из рецензентов не указал на отсутствие новизны в нашем исследовании или на концептуальные и экспериментальные недостатки.Один из рецензентов нашел наше исследование довольно «интересным», и все рецензенты предложили лучше прояснить используемые методологии и требуемые для новых данных, выполнив дополнительные эксперименты. Поэтому, чтобы устранить опасения, высказанные рецензентами, мы выполнили запрошенные дополнительные эксперименты и отредактировали нашу рукопись, которая теперь включает обширные новые данные и пояснения. Наши конкретные, точные ответы рецензентам перечислены ниже:
• Мы включили новые данные, показывающие эффект отключения miR-128 с использованием антисмысловой короткой шпильки, нацеленной на miR-128 (miR-ZIP-128), как в культуре NPC in vitro, так и in vivo после электропорации in utero.Мы обнаружили, что потеря функции в miR-128 имеет противоположный эффект на нейрогенез in vitro (рис. 2D, E, I, J, N и O) и in vivo (рис. 3A, C, F, G, J, K, N, O, R, S, V и W).
• Мы включили новые данные, демонстрирующие изменения ориентации митотического веретена после сверхэкспрессии miR-128 и нокдауна in vivo (рис. 3A, B и C). Мы обнаружили, что сверхэкспрессия miR-128 увеличивает нейрогенез за счет усиления непрямого нейрогенеза из базальных клеток-предшественников нейронов
• Мы повторили эксперименты по пролиферации клеток in vivo с использованием EdU, чтобы дополнить наши предыдущие результаты с Ph4 и Ki67.Мы получили результаты in vivo, которые согласовывались с нашими предыдущими результатами in vitro (Рисунок 3D — G; Рисунок 3P — S).
• Мы включили новые данные количественной ПЦР с использованием образцов ткани, полученных в результате микродиссекции с помощью лазерного захвата мозга мышей E14.5, показывающие уровни экспрессии miR-128 в отдельных участках ткани (рис. 4G).
• Мы повторили эксперименты in vitro NPC с лентивирусной доставкой генов miR-128 и miR-ZIP-128. Мы продемонстрировали, что по сравнению с методом электропорации эффективность трансфекции повышается, хотя общий эффект на нейрогенез остается неизменным.
• Мы повторили анализ целевого гена miR-128 для увеличения статистической мощности. Мы включили результаты в исправленную рукопись.
• Мы внесли изменения в раздел «Материалы и методы», как и требовалось.
• Мы отредактировали разделы результатов и обсуждения, как и требовалось.
Рецензент № 1:
Рецензент №1 рекомендовал провести дополнительные эксперименты и уточнить интерпретацию данных, а также экспериментальные процедуры.Мы благодарим рецензента за его / ее комментарии и рассмотрели следующие вопросы:
1) Вывод первого абзаца: «кПЦР подтвердила наблюдаемую экспрессию miR-128, специфичную для нервной ткани». Но ни один из предыдущих данных не предполагает специфичности. Например, «miR-128 экспрессировалась на низких уровнях в субвентрикулярной зоне (SVZ) и в кортикальной пластинке (CP) на E14.5…» и «… мы провели количественную ПЦР в реальном времени (qPCR) и обнаружили аналогичный временное обогащение miR-128 в переднем мозге, которое содержит как SVZ, так и CP ».Кроме того, «… miR-128, как было обнаружено, преимущественно экспрессируется в головном и спинном мозге мышей E14.5…». Рецензенту это не кажется конкретным.
Рецензент здесь прав. Мы отредактировали основной текст (Результаты).
2) Авторы утверждают: «Изображения с большим увеличением кортикальных срезов на E14.5 выявили экспрессию miR-128 в клетках в пределах SVZ и CP, но не в промежуточной зоне (IZ) (Рисунок 1C)». Обогащение маркировки выглядит убедительно для КП, но очевидной разницы между СВЗ и ИЗ нет.
Чтобы решить эту проблему, мы выполнили микродиссекцию с помощью лазерного захвата для выделения клеток в трех областях мозга (VZ / SVZ, IZ, CP) и измерили уровни эндогенной экспрессии miR-128 с помощью кПЦР. Мы подтвердили, что эндогенный miR-128 обогащен в области CP, и нет никакой разницы между VZ / SVZ и IZ (рис. 4G). В дополнение к подтверждению экспрессии miR-128 в VZ / SVZ, мы включили новый ISH и Данные совместной локализации IHC, чтобы показать, что miR-128 экспрессируется в нестин-положительных NPC в VZ / SVZ на E14.5 (рисунок 1 — приложение к рисунку 1). Мы отредактировали основной текст, чтобы отразить эти новые открытия (подраздел «miR-128 экспрессируется в NPC в развивающейся коре головного мозга мыши»).
3) Процедура изоляции NPC требует более подробной информации относительно ее эффективности.
Мы пересмотрели описание процедур изоляции, включив в него количество рассеченных корковых слоев, количество NPC после культивирования суспензии и количество NPC, используемых для электропорации (материалы и методы).Мы также включили схематические изображения, чтобы проиллюстрировать экспериментальные процедуры пролиферации клеток in vitro, выхода из клеточного цикла и дифференцировки нейронов (рис. 2A, F, K).
4) Авторы заявляют: «Процент BrdU-положительных, но Ki67-отрицательных клеток был увеличен на 350% в NPC, сверхэкспрессирующих miR-128 (Рисунок 2C, D, стрелки для BrdU-положительных, Ki67-отрицательных клеток), что указывает на что эктопическая экспрессия miR-128 стимулировала NPC к выходу из клеточного цикла ». Вывод о выходе из клеточного цикла не следует из BrdU-положительных / Ki67-отрицательных клеток.
Мы согласны с тем, что заявление в оригинальной рукописи было неясным, и мы хотели бы уточнить наш анализ выхода из клеточного цикла. Во-первых, все NPC, прошедшие S-фазу клеточного цикла, были помечены BrdU путем импульсной маркировки электропорированных клеток в течение 24 часов. Затем мы использовали Ki67 (обозначения G1, S, G2 и M-фазы) в качестве отрицательного маркера для клеток, вышедших из клеточного цикла. Короче говоря, NPC, которые вышли из клеточного цикла после S-фазы, были идентифицированы как клетки, которые были положительными по GFP и BrdU, но отрицательными по Ki67.Наши результаты показали, что процент клеток, вышедших из клеточного цикла, увеличился на 350% в NPC, сверхэкспрессирующих miR-128, по сравнению с miR-миметиками (рис. 2G-H). Чтобы исключить гибель клеток как причину, мы выполнили как анализ TUNEL, так и окрашивание антител против расщепленной каспазы-3, чтобы показать, что miR-128 не влияет на апоптоз (рисунок 2 — рисунок в приложении 2). Итак, мы пришли к выводу, что эктопическая экспрессия miR-128 индуцирует выход из клеточного цикла в NPCs.
5) TUNEL — относительно нечувствительный способ обнаружения апоптоза, и его следует дополнять другими, более убедительными методами.
Мы согласны с рецензентом и хотели бы уточнить, что мы уже проводили иммуноокрашивание для анализа расщепленной каспазы-3, маркера апоптоза, в нашей исходной рукописи (подраздел «miR-128 регулирует пролиферацию и дифференцировку NPC in vitro», третий абзац) (рисунок 2 — приложение к рисунку 2).
6) Какова была эффективность трансфекции с управляемой CMV экспрессией предшественника miR-128-1 мыши и управляемой промотором EF1α конструкций copGFP?
Мы использовали конструкцию экспрессии с двумя промоторами, содержащую CMV-промотор, который управляет экспрессией предшественника miR-128, и промотор EF1α, который управляет copGFP при экспрессии одного плазмидного вектора.Эффективность трансфекции для двух элементов (miR-128 и copGFP) всегда будет одинаковой. Мы отредактировали основной текст (подраздел «miR-128 регулирует пролиферацию и дифференцировку NPC in vitro») и включили графическое представление конструкций, чтобы выделить двойное расположение промоторов (рисунок 2 — рисунок в приложении 1).
Изображение ответа автора 1 иллюстрирует эффективность трансфекции после электропорации NPC in vitro с использованием вышеупомянутых конструкций, что указывает на то, что 50% клеток экспрессируют GFP через 24 часа.
Эффективность трансфекции констуктов экспрессии.
NPC подвергали электропорации с указанными плазмидами, и ядра контрастировали с DAPI. Белые контуры указывают на клетки GFP ₊, а красные контуры указывают на то, что клетки имеют пограничную экспрессию GFP и считаются GFP-отрицательными. Белая стрелка указывает на GFP-отрицательную клетку.Количественная оценка соотношения GFP-положительных клеток к общему количеству клеток, окрашенных DAPI, показывает, что эффективность трансфекции согласована между конструкцией сверхэкспрессии miR-128 и ее соответствующим контролем. Для каждого состояния подсчитывали более 1500 GFP-положительных клеток. Было проведено не менее трех серий независимых экспериментов. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. (n = 3). Тест Стьюдента t , различия считались значимыми при *** P <0,001 .
https: // doi.org / 10.7554 / eLife.11324.035
7) Заявление о влиянии на дифференцировку нейронов — хорошее начало, но их исследование требует более подробных подробностей относительно того, как именно влияет на дифференцировку и на определенные типы клеток. Документ в его нынешнем виде читается как изолированное наблюдение без более глубокого концептуального понимания, вытекающего из представленных данных.
Мы уважительно не согласны с рецензентом. В нашей рукописи мы представляем экспериментальные доказательства, подтверждающие, что miR-128 строго регулирует самообновление и дифференцировку нейронов NPCs путем нацеливания на PCM1 во время раннего кортикального развития.Мы дополнительно укрепили это свидетельство, выполнив эксперименты, предложенные авторами обзора. Например: 1) Мы включили новые данные КПЦР с использованием образцов ткани из микродиссекции с лазерным захватом мозга мышей E14.5, показывающие уровни экспрессии miR-128 в различных областях ткани; 2) Мы включили новые данные, показывающие эффект подавления miR-128 с использованием антисмысловой короткой шпильки, нацеленной на miR-128, как в культуре NPC in vitro, так и in vivo после электропорации in utero; 3) Мы включили новые данные, демонстрирующие изменения ориентации веретена после сверхэкспрессии miR-128 и нокдауна in vivo.Мы полагаем, что наши открытия значительно улучшают понимание функциональной роли, которую miR-128 играет в гомеостазе нервных стволовых клеток благодаря множеству уровней точного контроля во время раннего кортикального развития.
Рецензент №2: Развитие коры головного мозга включает тесную координацию пролиферации предшественников, миграции и дифференцировки нейронов. В настоящей работе анализируется функция miR-128 во время развития коры головного мозга, которая представляет собой микроРНК, неправильно регулируемую при расстройстве аутистического спектра.Полученные данные предполагают, что miR-128 экспрессируется корковыми предшественниками, где он контролирует их пролиферацию и дифференцировку, подавляя экспрессию PCM1, белка, ранее описанного как критический для регуляции клеточного цикла. Эктопическая экспрессия miR-128 способствует выходу из клеточного цикла и нейрогенезу in vitro, а также в коре головного мозга in vivo. Этот фенотип устраняется усилением функции PCM1 и имитируется его потерей экспрессии, подтверждая, что PCM1 является нижестоящей мишенью miR-128, критической для кортикального нейрогенеза.Таким образом, miR128 может принадлежать к аппарату, который координирует выход из клеточного цикла с дифференцировкой нейронов.
Рецензент №2 предложил прояснить несоответствие между Franzoni et al. и наши о роли miR-128 в кортикогенезе. Кроме того, он / она предложил провести дополнительные эксперименты с потерей функции, чтобы подтвердить его / ее физиологические комментарии, и рассмотрел эти проблемы следующим образом:
1) В соответствии с его заметным обнаружением в CP, но не в VZ / SVZ, недавно было показано, что miR-128 имеет исключительно важное значение для поздних аспектов кортикогенеза (миграции и дифференцировки проекционных нейронов) (Franzoni et al., 2015). Результаты настоящих находок предполагают раннюю функцию miR-128, и рецензент настоятельно рекомендует прояснить несоответствие, наблюдаемое между обеими работами.
Хотя мы наблюдали, что miR-128 сильно обогащена CP, предполагая, что miR-128 может играть роль в позднем кортикогенезе, мы уважительно не согласны с точкой зрения автора обзора, что miR-128 исключительно важна для поздних аспектов кортикогенеза. В статье Franzoni et al. предоставили недостаточно доказательств, чтобы исключить возможное участие miR-128 во время раннего кортикогенеза, поскольку большинство их результатов было получено при сверхэкспрессии miR-128 во время позднего кортикогенеза, учитывая, что они выполнялись в маточной электропорации на E15.5, на котором в основном завершился ранний нейрогенез (Franzoni E, Booker SA, Parthasarathy, 2015. Более того, они не проводили никакого анализа пролиферации и обновления нейронных предшественников, что не было предметом их исследования.
Кроме того, как упоминалось в нашем ответе на комментарии рецензента №1 (см. Пункт 2 выше), мы включили новые данные совместной локализации ISH и IHC, чтобы показать, что miR-128 экспрессируется в нестин-положительных NPC в VZ / SVZ на E14. 5 с помощью зондов LNA (Рисунок 1 — рисунок в приложении 1).Кроме того, Ge et al. продемонстрировали, что нокдаун PCM1 в NPC приводит к: 1) снижению пролиферации NPC, 2) увеличению выхода NPC из клеточного цикла и 3) избыточной продукции нейронов (Ge et al., 2010), что соответствует нашей сверхэкспрессии miR-128. данные во время раннего коркового нейрогенеза. Было бы интересно изучить функцию Phf6 как потенциальной нижестоящей мишени для miR-128 во время раннего нейрогенеза, но мы думали, что это выходит за рамки нашей текущей рукописи. Взятые вместе, мы утверждаем, что между Franzoni et al. Мало совпадений или расхождений.и наши результаты. Мы включили эти моменты в наше пересмотренное Обсуждение (третий абзац).
2) Авторы утверждают, что miR-128 не экспрессируется в IZ. Низкое увеличение на Рисунке 1C не является окончательным и не позволяет рецензенту сделать вывод. Одним из подходящих экспериментов является анализ с помощью qRT-PCR miR-128 и соответствующего ему pre-miR128 на захваченных лазером областях кортикальной стенки.
Как упоминалось в нашем ответе на комментарии рецензента № 1 (см. Пункт 2 выше), мы выполнили микросекцию лазерным захватом, чтобы изолировать NPC из трех областей (VZ / SV, IZ и CP), и проанализировали уровни экспрессии miR- 128 с помощью кПЦР (рисунок 4G).Мы подтвердили, что эндогенный miR-128 обогащен в области CP, и нет никакой разницы между VZ / SVZ и IZ. Мы отредактировали основной текст, чтобы отразить эти новые результаты.
3) Описанное усиление функциональных фенотипов in vitro (рисунок 2) является неполным и должно включать дополнительную информацию об экспериментальных процедурах в тексте (например, длина импульсов BrdU для выхода из клеточного цикла, время культивирования и т. Д.).
Как упоминалось в нашем ответе на комментарии рецензента № 1 (см. Пункт 2 выше), мы пересмотрели описание процедур изоляции, включив в него количество рассеченных корковых слоев, количество NPC после культивирования суспензии и количество NPC, используемых для электропорации. и методы).Мы также включили схематические изображения, чтобы проиллюстрировать экспериментальные процедуры пролиферации клеток in vitro, выхода из клеточного цикла и дифференцировки нейронов (рис. 2A, F, K).
4) Дополнительные эксперименты по потере функции (с использованием antagomiRs или губок против эндогенного miR-128) должны быть выполнены для поддержки физиологической функции miR-128 в NPC. Это замечание также относится к экспериментам in utero (in vivo).
Мы согласились с составителем обзора и провели эксперимент с потерей функции, используя конструкцию, которая экспрессирует антисмысловые РНК miR-128 с короткими шпильками (miR-Zip-128) (Guibinga et al., 2012). Приведенные ниже отрывки включают отрывки из нашей обновленной рукописи (Результаты), измененные, чтобы выделить результаты экспериментов с потерей функции miR-128:
Во-первых, экспрессия miR-Zip-128 в культивируемых NPC увеличивает включение BrdU, но снижает количество клеток, выходящих из клеточного цикла, что свидетельствует о чистом увеличении пролиферативной способности NPC. Кроме того, экспрессия miR-Zip-128 в NPC снижает нейральную дифференцировку, как измерено с помощью окрашивания Tuj1 (рис. 2).
Затем мы выполнили эксперименты с потерей функции miR-128 in vivo с помощью электропорации miR-Zip-128 на ст. E13.5. Сначала мы отслеживали ориентацию митотического веретена в делящихся апикальных предшественниках (AP) в пределах VZ / SVZ и обнаружили, что нокдаун miR-128 приводит к значительному увеличению горизонтально делящихся клеток (Figure 3A-C).
Наблюдение было дополнительно подтверждено, когда мы обнаружили, что клетки с нокдауном miR-128 показали значительное увеличение включения EdU (рис. 3F, G), значительное увеличение Ki67-положительных клеток (рис. 3 — приложение к рисунку 1C, D) и значительное увеличение количества клеток. более высокий процент клеток, положительных по маркерам AP PAX6 (рис. 3F, G) и SOX2 (рис. 3 — приложение 2 к рисунку), что указывает на увеличение активно пролиферирующих AP в VZ / SVZ.
Затем мы исследовали, является ли значительное уменьшение косо делящихся клеток после нокдауна miR-128 показателем возможного сокращения базальных предшественников (BP) с использованием TBR2 в качестве маркера. Нокдаун miR-128 привел к значительному снижению количества TBR2-положительных клеток (рис. 3N, O). Итак, мы пришли к выводу, что нокдаун miR-128 регулирует популяцию NPC, способствуя пролиферации AP при одновременном ингибировании генерации BP.
Поскольку BPs ответственны за основную часть кортико-нейрогенеза (Tan and Shi, 2013), мы дополнительно спросили, влияет ли miR-128 на дифференцировку NPC.Сначала мы проанализировали изменение количества BP, выходящих из клеточного цикла после нокдауна miR-128. Мы обнаружили, что по сравнению с контролем клетки с нокдауном miR-128 показали значительное снижение количества клеток, которые были GFP- и Edu-положительными, но Ki67-отрицательными, что указывает на снижение выхода из клеточного цикла.
Наконец, мы спросили, привели ли наблюдаемые изменения выхода из клеточного цикла в конечном итоге к различию в нейрогенезе. Мы проанализировали мозг на ст. E17.5, через четыре дня после электропорации, и дифференцировку нейронов оценивали путем иммуноокрашивания специфическим антителом против нейронального маркера NeuN.Интересно, что нокдаун miR-128 значительно уменьшал количество NeuN-положительных нейронов в CP по сравнению с контролем (рис. 3V, W).
Взятые вместе, супрессия эндогенного miR-128 в ранних нейральных предшественниках препятствует их развитию за счет сохранения NPCs в более примитивном и пролиферативном состоянии. Что наиболее интригующе, это раннее распространение NPC не привело к чистому увеличению числа нейронов, предполагая, что существует потенциально критическое временное окно, в котором предшественники должны переключиться в состояние дифференцировки, иначе это окончательно поставит под угрозу их нейрогенную способность.
5) Мониторинг популяций AP (= RGC) и IP-клеток с использованием Pax6 и Tbr2, соответственно, не дает результатов. Другие маркеры должны быть проверены (такие как Sox2 для AP и Insm1 для IP), чтобы исключить потерю специфических маркеров после экспрессии miR-128, а не потерю популяции предшественников.
Мы провели дополнительные эксперименты для мониторинга экспрессии SOX2, что согласуется с нашими предыдущими выводами (рис. 3 — приложение 2). Хотя мы не отслеживали популяции IP-клеток, мы провели альтернативные эксперименты по мониторингу ориентации митотического веретена при делении AP внутри VZ.В этом эксперименте мы продемонстрировали, что экспрессия miR-128 привела к значительному снижению горизонтально делящихся клеток, что соответствует сокращению популяции AP-клеток, но значительному увеличению косо делящихся клеток, что указывало на расширение IP-клеток. популяция клеток (Huttner, Kosodo, 2005; Wang, Lui, Kriegstein, 2011). Кроме того, экспрессия miR-Zip-128 приводила к эффекту, противоположному эффекту экспрессии miR-128. Мы включили эти новые результаты в нашу пересмотренную рукопись (подраздел «miR-128 способствует дифференцировке нейронов в развивающейся коре in vivo») (рис. 3A-C).
6) Авторы утверждают, что сверхэкспрессия miR-128 «ускоряет» выход из клеточного цикла in vivo, однако экспериментально это не продемонстрировано. Кроме того, стимулирование генерации IP на самом деле не совпадает с увеличением выхода из клеточного цикла, поскольку эти предшественники сохраняют способность цикла и генерирования большей части проекционных нейронов. Это следует пояснить и перефразировать в тексте.
Что касается первого упомянутого пункта, мы согласны с рецензентом в том, что наши данные не предполагают «ускорения» выхода из клеточного цикла.Мы перефразировали наш вывод, чтобы выделить окончательное увеличение BrdU-положительных / Ki67-отрицательных клеток после сверхэкспрессии miR-128 (рис. 3P, Q). Что касается второй точки, то увеличение выхода из клеточного цикла наблюдается у базальных предшественников или IP внутри IZ. Увеличение выхода IP из клеточного цикла согласуется с другими нашими данными о том, что избыточная экспрессия miR-128 ведет к усилению нейрогенеза in vivo (Figure 3T, U). Мы включили эти пункты и соответствующим образом изменили нашу рукопись (подраздел «miR-128 способствует дифференцировке нейронов в развивающейся коре головного мозга in vivo»).
7) Неясно, на какой параметр сверхэкспрессия miR-128 влияет в AP. Это только способствует генерации IP или также вызывает прямой нейрогенез? Это следует решить экспериментальным путем. Более того, эти эксперименты должны быть дополнены исследованиями потери функций, как упоминалось выше. В нынешнем виде рукопись не рассматривает физиологические роли mir-128 в кортикогенезе.
Как упоминалось в нашем ответе на комментарии выше, ориентация митотического веретена AP в VZ / SVZ предполагает, что сверхэкспрессия miR-128 не влияет на прямой нейрогенез, о чем свидетельствует отсутствие изменений в вертикально делящихся (60-90 °) клетках (Shitamukai and Мацузаки, 2012 г.) (Рисунок 3A, B).
8) Хотя нет сомнений в том, что miR-128 может нацеливаться на мРНК PCM1 in vitro, экспрессию PCM и ее нацеливание с помощью эндогенного miR-128 следует оценивать in vivo (иммуномечение и т. Д.). Таким образом, результаты, полученные с помощью функциональных экспериментов, проведенных in vitro с miR-128 или PCM1 (пролиферация и дифференцировка), должны быть подтверждены in vivo. Это важно, потому что культивируемые NPC отличаются от резидентных AP и IP (паттерн экспрессии генов в некоторой степени нарушен).
Что касается первого пункта, мы выполнили две серии экспериментов, чтобы определить, является ли PCM1 эндогенным in vivotarget для miR-128. Во-первых, анализ кПЦР показал, что временная экспрессия miR-128 постепенно увеличивалась в переднем мозге эмбриона на E12,5, 14,5, 17,5 и P0 (Рисунок 4 — приложение к рисунку 2B). Напротив, было обнаружено, что уровень белка PCM1 постепенно снижается в переднем мозге в эти моменты времени (Рисунок 4 — приложение к рисунку 2B). Затем LCM (показал, что miR-128 был высоко экспрессирован в CP-зоне коры головного мозга мыши с помощью qPCR, по сравнению с IZ и SVZ / VZ.Напротив, анализ кПЦР показал, что PCM1 было уменьшено в зоне CP по сравнению с IZ и SVZ / VZ (рис. 4G, H). Эти результаты (а также наша биоинформатика и анализ экспрессии потенциальных мишеней) позволяют предположить, что PCM1 может быть in vivotarget miR-128. Мы включили эти новые открытия и отредактировали наши рукописи (подраздел «PCM1 является прямой мишенью miR-128 в NPC»).
Что касается второго пункта, мы согласны с автором обзора в том, что культивируемые NPC могут отличаться от этих нейральных предшественников in vivo.Имея это в виду, мы первоначально разработали эксперименты для изучения функциональных изменений, возникающих в результате использования miR-128 в культуре NPC в качестве модели in vitrom, с последующими экспериментами in vivo с использованием внутриматочной электропорации эмбрионального мозга. Чтобы отразить это первоначальное намерение, мы тщательно отредактировали рукопись, переставив рисунки и добавив дополнительные данные.
Рецензент # 3: В этой рукописи авторы исследовали функцию miR-128 в дифференцировке корковых нейронов. Они показали, что miR-128 усиливает дифференцировку нейронов и подавляет пролиферацию NPC посредством PCM1.Результаты интересны. Однако данные ограничены, а влияние умеренное. У меня есть несколько серьезных проблем.
Обозреватель № 3 фокусируется на функции miR-128 в корковой нервной дифференцировке. Они показали, что miR-128 усиливает дифференцировку нейронов и подавляет пролиферацию NPC посредством PCM1. Результаты интересны. Однако данные ограничены, а влияние умеренное. Мы благодарим рецензента за его / ее комментарии и рассмотрели поднятые вопросы следующим образом:
Во-первых, эксперименты не завершены.Для функциональных анализов генов или миРНК следует проводить анализы как увеличения, так и потери функции, но не следует. Обоснование связи с ASD основано на предыдущем исследовании, показывающем, что miR-128 является одной из 28 микроРНК, дисрегулируемых по крайней мере у одного человека с ASD (для miR-128 уровень снижен в одном ASD) (Abu-Elneel Neurogenetics 2008). Однако несколько экспериментов показывают влияние только избыточной экспрессии miR-128, но не восстановления, на NPC.
Благодарим рецензента за ценный комментарий.Как упоминалось в нашем ответе на комментарии рецензента №2 (см. Пункт 4 выше), мы использовали конструкцию, которая экспрессирует антисмысловые короткие шпильковые РНК miR-128 (miR-Zip-128) и выполнила потерю функции miR-128 как в vitro и in vivo. Новые результаты были включены в обновленную рукопись (Результаты) (Рисунки 2, 3).
Во-вторых, тесты NPC in vitro были выполнены с использованием электропорации, которая вводит большое количество генетического материала в клетки. Электропорация также приводит к гибели многих клеток, что хорошо известно.Однако они не рассматриваются. Эти эксперименты должны быть проведены или, по крайней мере, подтверждены с использованием лентивирусной инфекции.
Благодарим рецензента за ценный комментарий. Мы повторили эксперименты с NPC in vitro, заменив электропорацию лентивирусными векторами для доставки сверхэкспрессионных и нокдаун-конструкций miR-128. Мы отметили, что эффективность трансфекции повышается, тогда как общий эффект остается неизменным. Мы включили эти пункты в обновленную рукопись (подраздел «miR-128 регулирует пролиферацию и дифференцировку NPC in vitro» и рисунок 2 — приложение к рисунку 4).
В-третьих, документ подготовлен недостаточно хорошо. Подробности отсутствуют как в методах, так и в легендах.
Благодарим рецензента за ценный комментарий. Мы включили дополнительные сведения в раздел «Материалы и методы» и изменили условные обозначения к рисункам.
В-четвертых, во многих экспериментах нет подходящего контроля.
В-пятых, статистический анализ не был проведен правильно.
Благодарим рецензента за ценный комментарий.Мы внесли соответствующие изменения в рукопись. Как упоминалось ниже, мы обновили нашу рукопись и использовали односторонний дисперсионный анализ для проверки наших гипотез там, где это необходимо.
[Примечание редакции: ответы автора на повторную рецензию приводятся ниже.]
Вкратце, рецензенты указали на некоторые неверные толкования, нечеткие описания и технические недостатки и предложили провести еще несколько экспериментов, чтобы прояснить эти проблемы. Что еще более важно, рецензенты выразили обеспокоенность отсутствием данных по нокаутным мышам, хотя мне хорошо известно, что в рукописи у вас уже есть данные о потере функции электропорации in utero (данные полу-in vivo).Для получения этих данных может потребоваться некоторое время, но, возможно, вы уже близки к этим данным или можете рассмотреть возможность использования технологии Crispr для ускорения процессов. Включение этих данных, в дополнение к вышеупомянутым экспериментам по пересмотру, значительно укрепило бы рукопись. Рецензент №2: 1) Они отмечают, что раннее расширение пулов NPC путем нокдауна miR-128 не привело к чистому увеличению числа нейронов. Это любопытный результат, и их объяснение относительно критического временного окна не кажется адекватным объяснением.
Мы согласились с рецензентом в том, что наше объяснение в предыдущей рукописи было просто предположением и не могло быть адекватным объяснением этого явления. Поэтому мы внесли соответствующие изменения в нашу пересмотренную рукопись (подраздел «miR-128 способствует дифференцировке нейронов в развивающейся коре in vivo», пятый параграф).
2) Они провели ряд экспериментов, чтобы подтвердить PCM1 как мишень для miR-128, но им не удалось провести один из наиболее важных экспериментов, т.е.е. показывают, что «анти-miR» может увеличивать эндогенный белок. Они показывают, что сверхэкспрессия miR-128 может уменьшить белок, но эксперименты с избыточной экспрессией никогда не бывают такими сильными, как эксперимент с нокдауном.
Мы согласны с рецензентом в том, что эксперименты по нокдауну имеют решающее значение для подтверждения взаимосвязи между miR-128 и его предполагаемой мишенью, PCM1. Именно по этой причине мы провели эксперимент по нокдауну с использованием анти-miR-128 в первичных мышиных NPC и обнаружили изменение уровня эндогенного белка PCM1 с помощью вестерн-блоттинга в нашей исходной рукописи (рис. 4F).Кроме того, мы использовали анализ люциферазы для проверки специфичности связывания miR-128 с его предполагаемой мишенью, 3-UTR гена Pcm1 . После подтверждения связывания мы провели отдельные эксперименты для мониторинга изменения уровня эндогенного белка в NPC с использованием либо сверхэкспрессии miR-128, либо нокдауна в мышиных NPC (рис. 4D, 4F).
3) Им необходимо пояснить, как они выбирают гены для количественной ПЦР. Просматривали ли они каждый ген в своем списке предполагаемых целей? Какой список? Как был отфильтрован список? Как они поселились на PCM1 среди всех генов, подверженных избыточной экспрессии? Был ли он единственным, на который также воздействовал ингибитор miR-128? Какова роль других генов в списке, которые являются потенциальными мишенями для miR-128?
Мы подготовили диаграмму ниже (изображение ответа автора 2), чтобы прояснить процессы идентификации генов-мишеней miR-128.Кроме того, мы изменили исправленную рукопись, чтобы лучше описать обоснование выбора PCM1 в качестве предполагаемой мишени для miR-128 на основе его функциональной роли (подраздел «miR-128 способствует дифференцировке нейронов в развивающейся коре головного мозга in vivo»).
Принципиальная схема описывает процесс отбора генов.
Две широко используемые в базах данных для прогнозирования мишеней силико-микроРНК (TargetScan и miRanda) (Mi et al., 2013; Witkos et al., 2011) предсказали 800 и 940 потенциальных мишеней для miR-128, соответственно. Из 77 перекрывающихся мишеней только 53 были аннотированы как имеющие известную биологическую функцию, и только 11 из 53 генов показали последовательное снижение уровней мРНК при сверхэкспрессии miR-128 в культивируемых NPC мыши и были дополнительно протестированы на реципрокную активацию при ингибировании miR-128. Наконец, при ингибировании miR-128 у NPC только Pcm1, Nfia, Foxo4 и Fbxl20 постоянно повышались.
https://doi.org/10.7554/eLife.11324.036
Вкратце, среди четырех кандидатов-мишеней, идентифицированных в ходе нескольких раундов валидации, Foxo4 , который кодирует чувствительный к инсулину / IGF-1 фактор транскрипции, который регулирует клеточные циклы (Furukawa-Hibi et al., 2005; Schmidt et al., 2002 ), был исключен, поскольку недавнее исследование показало, что потеря FOXO4 снижает способность эмбриональных стволовых клеток человека дифференцироваться в нейронные клоны (Vilchez et al., 2013), что было противоположно клеточному фенотипу NPC при сверхэкспрессии miR-128. Nfia и Fbox120 были исключены, поскольку белок Nfia функционирует как фактор транскрипции и репликации для репликации ДНК аденовируса (Qian et al., 1995), а белок Fbx120 участвует в синаптической пластичности, которая возникает постнатально (Takagi et al. др., 2012). Поэтому мы стремились сосредоточиться на PCM1 как на нашем основном интересующем гене (рис. 4-7).
4) Повлиял ли сбой или избыточная экспрессия PCM1 на ориентацию шпинделя?
Мы провели анализ ориентации веретена после сверхэкспрессии PCM1 с использованием внутриутробной электропорации в E13.5 мышей. Результат все еще был аналогичен результату нокдауна miR-128 (исходная рукопись, рис. 3C). Мы наблюдали увеличение процента горизонтально делящихся клеток и уменьшение процента наклонно делящихся клеток, что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями увеличения количества PAX2-положительных клеток и уменьшения количества TBR2-положительных клеток при сверхэкспрессии PCM1 (исходная рукопись, Рисунок 5 — приложение к рисунку 7C-F). Мы включили эти данные в рисунок 5 — приложение к рисунку 7B и описали эти результаты в исправленной рукописи (подраздел «PCM1 регулирует пролиферацию и дифференциацию NPC», последний абзац).
5) miRNA обычно имеют небольшие эффекты — они имеют тенденцию буферизовать клетки, чтобы гарантировать точный результат. Эта статья наводит на мысль, что miR-128 имеет эффекты в развитии, которые выходят далеко за рамки того, что, вероятно, является ролью этой miRNA in vivo. Система, которую они анализируют, которая контролирует количество нейронных предшественников и ориентацию веретена в предшественниках, вероятно, будет намного сложнее, чем то, что представлено здесь, и, следовательно, статья кажется упрощением гораздо более глубокого биологического вопроса.
Мы согласны с тем, что miRNAs имеют тенденцию функционировать как модуляторы тонкой настройки клеточных процессов (Bartel, 2009; Kawahara et al., 2012; Li and Jin, 2010; Shi et al., 2010). Однако существует множество примеров того, как miRNAs вызывают значительные функциональные изменения при пертурбации (Franzoni et al., 2015; Peruzzi et al., 2013; Tan et al., 2013). Кроме того, хотя в настоящее время мы получаем мышей с двойным нокаутом miR-128-1 и -2, которые были заморожены, от наших сотрудников, мы сожалеем, что потенциальные экспериментальные результаты на этих мышах могут быть включены только в будущее исследование из-за ограничений по времени. .
Рецензент №3: Обновленная версия рукописи включает новый набор данных, которые отвечают на некоторые из моих опасений. Однако у меня есть дополнительные комментарии по поводу рукописи в ее нынешнем виде. 1) Одна из основных проблем связана с интерпретацией данных, полученных in vitro с инкубацией BrdU. Согласно их разъясненной методике эксперимента BrdU. Я заметил неверную интерпретацию данных. Действительно, в отличие от его быстрого выведения из ткани мозга in vivo, BrdU остается довольно стабильным (в течение нескольких часов) в культуральной среде, и его необходимо заменить через короткое время, чтобы правильно оценить одну когорту клеток, подвергающихся S-фазе. .Это проблема, когда дело доходит до мониторинга скорости выхода из клеточного цикла такой когорты (Рисунки 2G – 2J; 5C). В этих биоанализах скорость выхода из клеточного цикла полностью зависит от непрерывного мечения (в течение 24 часов или около того) пролиферативных клеток, претерпевающих S-фазу (которая действительно различается в зависимости от условий). Те же комментарии остаются при оценке S-фазы в анализах пролиферации с 6-часовой инкубацией в среде, содержащей BrdU.
Мы понимаем озабоченность рецензента тем, что длительность воздействия BrdU может повлиять на наши результаты и интерпретацию.Поэтому мы тщательно протестировали различные условия, прежде чем использовать фиксированную продолжительность включения BrdU для различных анализов (6 часов для анализа пролиферации и 24 часа для анализа выхода из клеточного цикла).
Во-первых, мы протестировали скорость включения BrdU, а также скорость выхода из клеточного цикла в нескольких временных точках в нативных NPC перед электропорацией. Учитывая, что повышающая и понижающая регуляция miR-128 будет вызывать противоположные клеточные эффекты, мы определили исходное состояние, которое могло бы четко продемонстрировать изменения, которое было установлено на уровне около 50% BrdU ⁺ / Dapi ⁺ для анализа пролиферации клеток после Через 6 часов после воздействия BrdU.Мы также установили базовый уровень около 50% BrdU ⁺ Ki67 ^— / Dapi ⁺ для анализа выхода из клеточного цикла, который был достигнут через 24 часа воздействия BrdU.
Кроме того, мы включили дополнительные данные во многие моменты времени из анализа пролиферации клеток и анализа выхода из клеточного цикла после электропорации с конструкциями miR-Zip-128. Мы обнаружили, что эффекты нокдауна miR-128 — увеличение пролиферации клеток по сравнению с контролем и снижение выхода из клеточного цикла по сравнению с контролем — можно было наблюдать в большинстве временных точек, что указывает на то, что длительность воздействия BrdU, использованная в исходной рукописи, не соответствовала. диктовать или предвзято относиться к результатам экспериментов.Мы включили эти данные в рисунок 2 — рисунок в приложении 6A-D и описали эти результаты в исправленной рукописи (подраздел «miR-128 регулирует пролиферацию и дифференцировку NPC in vitro», последний параграф).
2) Вывод об ориентации митотического веретена (дорожки 169-17) неверен. Фигуры 3A-3C действительно показывают, что острая модуляция экспрессии miR128 влияет на ориентацию веретена. Невозможно сделать вывод, что нарушение ориентации митотического веретена ведет к нарушению деления APs (симметричное или асимметричное).Это обсуждалось в нескольких недавних публикациях. Клональный анализ необходим, чтобы проследить судьбу потомства AP после модуляции miR-128. Один дополнительный набор экспериментов для расшифровки функционального воздействия модификации ориентации митотического веретена будет заключаться в фокусировке электропорации AP (с помощью miR-128 или miR-Zip-128) и идентификации судьбы потомства через 24 часа (Tbr1 для нейрона, Pax6 для AP и Tbr2 для IP-адресов).
Мы согласны с рецензентом в том, что нельзя сделать вывод о судьбе потомства AP исключительно на основании только изменений в ориентации митотического веретена, и это именно та причина, по которой мы отслеживали результаты ориентации веретена с помощью экспериментов по идентификации судьбы потомков AP.В нашей исходной рукописи мы обнаружили, что манипуляции с miR-128 влияют на баланс между генерацией AP (PAX6 и SOX2-положительные клетки) и IP (TBR2-положительные клетки) (рис. 3H-O).
Мы также признаем, что недавние исследования показали, что ориентация веретена может быть не единственным механизмом, ответственным за определение судьбы у APs (Konno et al., 2008; Noctor et al., 2008; Peyre and Morin, 2012), и не исключили вовлечение других потенциальных механизмов. Мы добавили эти пункты в нашу пересмотренную рукопись (подраздел «miR-128 способствует дифференцировке нейронов в развивающейся коре in vivo»).
Для предлагаемого клонального анализа, учитывая, что более 85% электропорированных AP GFP ⁺ могут быть помечены EdU через 24 часа воздействия (данные не показаны), мы могли бы использовать сигнал GFP в качестве суррогатного маркера для EdU, что сделали анализ включения EdU или BrdU избыточным, когда мы выполняем анализ с использованием иммуноокрашивания PAX2 и TBR2. Кроме того, когда AP были помечены EdU в течение 24 часов сразу после электропорации для традиционного клонального анализа, мы наблюдали, что нокдаун miR-128 увеличивает Pax6-положительные клетки, но снижает Tbr2-положительные клетки в EdU-положительной популяции клеток (Автор изображение ответа 3A-C) способом, который очень точно соответствует нашим предыдущим результатам в нашей первой рукописи (исходная рукопись рис. 3K, O).Взятые вместе, APs, локально подвергнутые электропорации с помощью конструкций нокдауна miR-128, увеличивали AP, но снижали BP.
Однако нам не удалось наблюдать клетки, которые были дважды положительными как для Tbr1, так и для EdU через 24 часа после мечения EdU (изображение ответа автора 3D), что указывает на незначительный прямой нейрогенез от электропорированных AP.
Клональный анализ показывает судьбу потомства, полученного из электропорированных клеток-предшественников.
Внутриутробную электропорацию проводили на эмбрионах E13.5 для введения либо miR-128-ZIP, либо контрольной конструкции в NPC, выстилающие эпендимальный слой. Эпендимные NPC дополнительно метили EdU сразу после электропорации. ( A-C ) На E14.5 срезы тканей получали для обнаружения EdU и иммуноокрашивали антителами против PAX6 ( A ) и TBR2 (не показано). ( B ) Количественная оценка PAX6-EdU-GFP-triple-позитивных клеток по EdU-GFP-double-позитивных клеток показывает значительное увеличение Pax6 -позитивных клеток в потомстве от miR-128-ZIP электропорированных NPC по сравнению с контролем.( C ) Количественная оценка TBR2-EdU-GFP-триположительных клеток по сравнению с EdU-GFP-дважды-позитивными клетками показывает значительное уменьшение TBR2-позитивных клеток в потомстве от miR-128-ZIP электропорированных NPC по сравнению с контролем. ( D ) Срезы ткани, полученные на E14.5 и обработанные для обнаружения EdU и иммуноокрашенные антителами против TBR1, выявили минимальное перекрытие между EdU-положительными клетками и TBR1-положительными клетками. В ( A ) кружки показывают GFP-EdU-дважды-позитивные клетки, синие кружки показывают PAX6-негативные клетки среди GFP-EdU-дважды-позитивных клеток.Шкала шкалы 10 мкм. ( D ) Шкала шкалы, 100 мкм. Для каждого состояния подсчитывали более 500 GFP-положительных клеток. Было проведено не менее трех серий независимых экспериментов. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. (n = 3). Тест Стьюдента t , различия считались значимыми при *** P <0,001.
https://doi.org/10.7554/eLife.11324.037
[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]
Текущая версия рукописи с дополнительными данными значительно улучшена по сравнению с предыдущей версией.
Однако остается еще один момент, который необходимо исправить. Как упоминалось ранее, сохранение BrdU в культуре NPC (которая более стабильна, чем in vivo) для оценки пролиферации — это нормально, если авторы не ссылаются на одну когорту клеток, прошедших S-фазу (в противном случае авторам следовало бы иметь только обработанные клетки. около часа с BrdU).
Что касается скорости выхода из клеточного цикла, мы обычно отслеживаем одну когорту клеток, которые вышли из клеточного цикла. Таким образом, невозможно правильно измерить его, если BrdU хранится в течение 24 часов in vitro (стабильно), потому что несколько когорт клеток будут проходить S-фазу в разное время, что дополнительно приводит к смещению анализов. Однако выход из клеточного цикла должным образом рассматривается in vivo (когда клиренс BrdU происходит быстро). Таким образом, я бы предложил избавиться от данных in vitro, которые плохо выполняются.
Мы согласны с рецензентами и внесли исправления в отредактированную рукопись. Во-первых, мы добавили утверждения (подраздел «miR-128 регулирует пролиферацию и дифференцировку NPC in vitro»), чтобы уточнить, что наш анализ пролиферации in vitro был проведен без синхронизации клеточного цикла NPC, и, следовательно, изменение скорости пролиферации может не представляют одну когорту, а скорее гетерогенную группу из всех фаз клеточного цикла (Bez et al.

Возраст (мес.) .	Вт .	YAC128 .	n .	Уменьшение в процентах .	Значение .
9	1507000 ± 68530	1365000 ± 33580	3	9	NS, P = 0,16
12 (i)	150000 00 ±	7	15	P = 0,004
12 (ii)	1682000 ± 71870	1375000 ± 65360	5	18


Вт .	YAC128 .	n .	Уменьшение в процентах .	Значение .
9	1507000 ± 68530	1365000 ± 33580	3	9	NS, P = 0.16
12 (i)	1724000 ± 50270	1504000 ± 23640	7	15	P = 0,004
12 (ii)			70	70 168	5	18	P = 0,01

Фенотип .	Возраст (мес.) .	Количество перекрытий .	Мощность .
.	.	.	33% спасение .	50% спасение .	66% спасение .
Стриарный объем	9	0	8	4	2
Размер полосатого нейрона	12	01292			1					вес	12	1/3	27	12	7
Число стриатарных нейронов	12	1/8	30
13	7					0	35	15	9
Ротарод	6	1/2	99	43	25

О клевете в уголовном праве

клевета состав преступления 128 1 – Profil – Groupe des Ulis Forum

СМИ о СК — Следственный комитет Российской Федерации

поиск оптимального баланса.

Денежные взыскания (штрафы) | ФНС России

Массовое убийство учащихся в одной из гимназий Казани — Реальный Тагил

Диполярный порядок, опосредованный кросс-поляризацией 1H → 13C для растворения-динамической ядерной поляризации

Диагностика | Бесплатный полнотекстовый | Последние достижения в технологии радиочастотных катушек для птичьей клетки для системы МРТ

1. Введение

5. Выводы

2D гомоядерная корреляция 1H твердотельный ЯМР с помощью wPMLG | Приложения

Артикул:

Избирательная потеря нейронов полосатого тела на мышиной модели болезни Хантингтона YAC128 | Молекулярная генетика человека

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание мышей YAC128

Снижение массы мозга у YAC128, строка 53

У мышей YAC128 объем полосатого тела и коры уменьшен

Потеря и дисфункция нейронов у мышей YAC128

Оценка поведения

Производительность Rotarod коррелирует с серьезностью потери нейронов

Наличие агрегатов

Низкая изменчивость фенотипов мышей YAC128

ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мутагенез YAC и образование мышей

Число копий, анализ РНК и белков

Анализ белков.

Анализ РНК.

Морфологический анализ

Количественный анализ

Оценка агрегатов

Световая микроскопия.

Электронная микроскопия.

Оценка поведения

Анализ Rotarod.

Анализ открытого поля.

Двигательная активность.

Анализ Rotarod — фиксированная скорость.

Статистика

Примечание

БЛАГОДАРНОСТИ

Ссылки 1

Периодическая таблица элементов по WebElements

miR-128 регулирует миграцию нейронов, рост и внутреннюю возбудимость через ген умственной отсталости Phf6

MiRNA-128 регулирует пролиферацию и нейрогенез нервных предшественников, воздействуя на PCM1 в развивающейся коре головного мозга

Эффективность трансфекции констуктов экспрессии.

Принципиальная схема описывает процесс отбора генов.

Клональный анализ показывает судьбу потомства, полученного из электропорированных клеток-предшественников.

Оставить комментарий Отменить ответ