СК: в 90% расследований в отношении врачей подтверждается их невиновность — Общество
МОСКВА, 19 июля. /ТАСС/. Лишь 10% уголовных дел, расследуемых в РФ в отношении врачей, доходят до суда, в 90% случаев следователи доказывают их невиновность. Об этом сообщила журналистам на пресс-конференции в Москве официальный представитель Следственного комитета РФ Светлана Петренко.
Она напомнила, что число обращений в Следственный комитет на ошибки или ненадлежащие действия врачей и медработников за шесть лет выросло более чем втрое. «Если в 2012 году их было чуть более 2 тыс. по всей стране, то к 2017 году количество таких обращений выросло более чем в три раза и составило более 6 тыс.», — сказала она.
«По каждому обращению мы обязаны провести проверку. Но далеко не по каждому случаю по результатам проверки возбуждается уголовное дело», — отметила Петренко.
«Более того, из общего объема уголовных дел, которые были возбуждены, в суд уходят лишь 10%. То есть в 90% случаев прекращаются уголовные дела. То есть в большинстве случаев мы доказываем невиновность врачей и медработников», — подчеркнула она, в ответ на обеспокоенность, прозвучавшую в выступлении Леонида Рошаля относительно перспектив уголовного преследования в отношении врачей.
Светлана Петренко признала, что медицина — «это очень тонкая тема». «Возбуждается уголовное дело с целью установления истины, и при расследовании уголовного дела мы полностью полагаемся на выводы представителей медицинского сообщества. Именно заключение медицинской экспертизы позволяет сделать вывод о виновности или невиновности [медработника]», — отметила представитель СК.
«В ходе расследования мы защищаем как права врачей, так и права пациентов», — добавила она, напомнив, что и пациенты заинтересованы в результатах расследования.
Статистика уголовных дел
Медицинские работники чаще предстают перед судом в России по статье о причинении смерти по неосторожности (ст. 109 УК РФ). Об этом говорилось в материалах презентации Следственного комитета на пресс-конференции.
Согласно данным СК, «из направленных в суд в 2017 году уголовных дел в отношении врачей и других медицинских работников 74,7% — по ст. 109 УК РФ; по статье 238 УК РФ («Ненадлежащее оказание услуг») — 10,9%; по ст. 118 УК РФ («Причинение тяжкого вреда здоровью по неосторожности») — 6,3%; по ст. 293 УК РФ («Халатность») — 5,8%; по ст. 124 УК РФ («Неоказание помощи больному») — 2,3%».
В настоящее время представителями СК и Национальной медицинской палаты разрабатывается ст. 124.1 УК РФ («Ненадлежащее оказание медицинской помощи (медицинской услуги)», которая должна заменить применение к врачам статей 109, 118, 238 и других общих статей Уголовного кодекса.
Неоказание помощи больному — комментарии Федерального Судьи / Юргруппа МИП
Юридическая энциклопедия МИП онлайн — задать вопрос юристу » Уголовные дела — комментарии Федерального Судьи / Юргруппа МИП » Список статей по преступлениям » Неоказание помощи больному — комментарии Федерального Судьи / Юргруппа МИП Запишись на консультацию к руководителю отдела по уголовным делам. Специализируемся по статье 124 УК РФ.Профессиональные разъяснения. Неограниченное время консультации
Записаться на консультациюНеоказание помощи больному – бесплатные ответы юристов онлайн
Виды неоказания помощи больному
Законодательство, регламентирующее нормы об оказании медицинской помощи лицам, страдающим заболеваниями, легло в основу нормы УК, предусматривающей наказание за неоказание соответствующих действий медицинского характера.
По своему виду, неоказание помощи больному, выражается в бездействии. При таких обстоятельствах, значения не имеет тот вид заболевания, которым болеет нуждающийся.
Положения Основ законодательства РФ «Об охране здоровья граждан», которые были приняты 22.06.1993 г., определили перечень основных видов оказания больным помощи медицинского направления. Так, меры первичной медико-санитарной помощи, являются основными, доступными и бесплатными. Способы ее выполнения определены нормативными актами, издаваемыми Министерством здравоохранения и государственными комитетами, работающими в этой сфере.
Такая помощь должна быть оказана лицам, требующим безотлагательного вмешательства, необходимого для того, чтобы жизнь и здоровье больного были сохранены.
В отдельные статьи внесены положения о порядке и способах оказания помощи тем лицам, которые имеют заболевания, несущие опасность для общества. Лица, которые в силу своего профессионального долга не оказали помощь медицинского направления нуждающемуся, могут быть подвергнуты уголовному наказанию. Преступное деяние и наказание за него отражены в ст. 124 УК.
Состав преступления
Преступное деяние, характеризующееся, как неоказание больному помощи, закреплено в ст. 124 УК. В качестве объекта, на который оказывается преступное влияние, выступает жизнь и здоровье людей, их безопасность.
Деяние выражается в форме бездействия. Для объективной стороны характерно отсутствие уважительных причин для такого бездействия. На квалификацию не может повлиять ни заболевание, которым болен человек, ни стадия болезни.
Фактически, преступление представляет собой недобросовестное или несвоевременное исполнение лицо, являющимся медицинским работником, собственных профессиональных обязанностей.
Основная особенность состава состоит именно в наличии у лица правовой обязанности оказывать медицинскую помощь лицам. Для квалификации деяния важно установить отсутствие причин, которые могут быть признаны уважительными, по причине которых необходимые действия медицинского направления были не выполнены. Причиной правомерного бездействия могут стать исключительно обстоятельства, которые имеют признаки форс-мажора.
Рассматриваемое преступление имеет материальный состав. Это означает, что основанием назначения преступления может выступить только наличие последствий. К квалифицированному составу относятся деяния, повлекшие смерть лица, нуждающегося в помощи, а равно и те, которые причинили тяжкий вред состоянию его здоровья.
В каждой конкретной ситуации должна иметь место причинная связь, которая дает возможность говорить о том, что конкретные последствия могли возникнуть лишь в результате конкретного деяния.
Неоказание помощи больному характеризуется с субъективной стороны как в форме умысла, так и не осторожности. Ответственность может иметь место лишь в том случае, когда лицо, являющееся субъектом преступного деяния, будет относиться с умыслом, как к исполнению возложенного профессионального долга, так и к последствиям. При этом в отношении последствий лицо, совершившее преступление, может иметь и неосторожную форму вины. Легкомыслие и преступная небрежность, являющиеся выражением неосторожности, имеющиеся в отношении преступных последствий, отражены в ч. 1,2 ст. 124 УК.
В качестве лиц, совершающих преступление данного вида, могут выступать исключительно специальные субъекты. К таким относятся лица старше 16 лет, которые в силу законодательных норм или специальных правил, обязаны оказать медицинскую помощь людям, страдающим заболеваниями разного рода и длительности.
Так, субъектами деяния могут выступить врачи, фельдшера и иные медицинские работники, имеющие специальные знания. Сходным преступлением является деяние, характеризующееся, как оставление лиц в опасности.
Ответственность за неоказание помощи больному
Уровень уголовной ответственности за неоказание помощи больному, страдающему заболеваниями, определен ст. 124 УК. Преступление, указанное в ст. 124 УК, выражаются в причинении вреда здоровью, причем степень такого причинения должна быть средней или тяжкой. Наиболее весомым является последствие, которое выражается в смерти потерпевшего. Поводом для наступления ответственности является только отсутствие уважительных причин, которыми может быть обосновано неприменение медицинских мер, требующихся лицам.
К ответственности не могут быть привлечены лица, которые не являются носителями профессионального долга по оказанию помощи медицинского характера. Таким образом, круг субъектов деяния сужается и является специальным.
Привлечь к ответственности за совершение деяния, предусмотренного ст. 124 УК, можно только лицо, которое достигло 16 лет и является носителем обязанностей по оказанию медицинской помощи. Такая обязанность должна быть вменена ему нормой закона или специализированными правилами.
Правом назначения вида и меры уголовной ответственности, за деяние, квалифицированное по ст. 124 УК, обладают исключительно органы правосудия. По результатам рассмотрения имеющихся материалов, лицо может быть оправдано или осуждено к 4 годам лишения прав на занятие определенных должностей, к 3 годам лишения прав на осуществление определенной деятельности, к 4 годам лишения свободы.
Суд может установить виновному основное и дополнительное наказание одновременно.
Исключить ответственность могут форс-мажорные обстоятельства, не позволяющие обязанному лицу оказать медицинскую помощь нуждающемуся. К таким обстоятельствам могут относиться природные условия, болезнь самого медицинского работника, а также иные, исключающие возможность исполнения профессионального долга причины.
Объем ответственности определяется судом в результате изучения ряда квалифицирующих признаков, влияющих на уровень опасности бездействия и последствия, повлеченные им.
Автор статьи
Кузнецов Федор Николаевич
Опыт работы в юридической сфере более 15 лет; Специализация — разрешение семейных споров, наследство, сделки с имуществом, споры о правах потребителей, уголовные дела, арбитражные процессы.Статья 124 .1 УК РФ
Тех, кто препятствует оказанию медицинской помощи, ждет уголовное наказание. Статья 124 1 УК РФ рассматривает действия, которые подпадают под такое правонарушение.
Действия, что подпадают под статью о воспрепятствовании оказанию медицинской помощи
Нарушением является любое воспрепятствование действиям медработника, находящегося на службе. Преступник может не впустить медика в помещение, в котором находится больной или мешать оказанию помощи. Результатом таких действий нередко становятся серьезные последствия для здоровья.
Жертва теряет трудоспособность. Вследствие деяний человек может лишиться зрения, слуха или какого-либо органа. Возможны серьезные осложнения давно существующего хронического заболевания. Во втором пункте описаны ситуации, когда неосторожность нарушителя стала причиной смертельного исхода.
Какое наказание предусматривает статья 124. 1?
Наказание за преступление будет зависеть от обстоятельств. Вердиктом может стать лишение свободы. Его максимальная продолжительность составляет два года.
В некоторых случаях обвиняемого ждет штраф:
- до 80 000;
- соответствующий зарплате или другой прибыли до полугода.
Преступнику могут присудить труды принудительного характера до 24 месяцев. Некоторых ждет ограничение свободы до трех лет. Иногда вердиктом становится арест до полугода.
В судебной практике часто встречаются случаи, когда неосторожные действия нарушителя стали причиной смертельного исхода жертвы. В таком случае наказание будет более суровым. Продолжительность заключения увеличится вдвое. Такие же и максимальные сроки ограничения свободы или принудительных работ.
Человеку, которому инкриминируют правонарушение, потребуется надежная защита. Опытный адвокат изучит все детали дела. Он проверит правомерность действий следствия и расскажет клиенту, как себя вести во время разбирательства. Он будет присутствовать на слушаниях и допросах, защищая интересы подзащитного.
Не всегда получается снять все обвинения с клиента. В таком случае правозащитник добьется максимально мягкого приговора. Не стоит пытаться защищаться самостоятельно. Подобные действия могут отрицательно отразиться на положении. Чем раньше к процессу подключится опытный адвокат, тем выше будет вероятность благоприятного исхода для обвиняемого.
В нашей компании работают правозащитники, специализирующиеся на статье 124.1. Многолетний опыт является нашим преимуществом. К каждому делу мы подходим индивидуально, поэтому большинство разбирательств завершилось для клиентов успешно.
Получить квалифицированную помощь вы можете, связавшись с нами по телефону. Контактный номер указан на сайте. Чтобы начать работу, потребуется обсудить детали и подписать договор.
Статья 124. Умышленное причинение тяжких телесных повреждений в случае превышения границ необходимой обороны или в случае превышения мер, необходимых для задержания лица, совершившего уголовное правонарушение
Новая редакция ст. 124 УКУ с комментариями.
Умышленное причинение тяжких телесных повреждений, совершенное в случае превышения пределов необходимой обороны или в случае превышения мер, необходимых для задержания лица, совершившего уголовное правонарушение, –
наказывается общественными работами на срок от ста пятидесяти до двухсот сорока часов или исправительными работами на срок до двух лет, или арестом на срок до шести месяцев, или ограничением свободы на срок до двух лет, или лишением свободы на тот же срок.
Комментарий к ст. 124 УК Украины
1. Согласно закона, превышением пределов необходимой обороны признается явное несоответствие защиты характеру и опасности посягательства.
2. Пленум Верховного Суда Украины в постановлении от 28 июня 1991 г. «О практике применения судами законодательства, обеспечивающего право на необходимую оборону от общественное опасных посягательств» указал, что при решении вопроса о превышении или непревышении пределов необходимой обороны должны учитываться не только несоответствие орудия защиты и нападения, но и характер опасности, угрожавшей лицу, которое защищалось, обстоятельства, которые могли повлиять на реальное соотношение сил нападающих и тех, кто защищается, их физические (возраст, пол, инвалидность, состояние здоровья) и другие обстоятельства. Решая вопрос о правомерности причиненного вреда, предстоит установить, защищалось ли лицо от реального, уже начатого и еще не законченного общественного опасного посягательства. Лишь при наличии состояния необходимой обороны или нет.
3. Причинение умышленного тяжкого телесного повреждения при превышении пределов необходимой обороны квалифицируется по ст. 124 УК и в тех случаях, когда оно было совершено при отягчающих ответственность обстоятельствах (особо опасным рецидивистом, произошла смерть нападающего).
4. Если тяжкие телесные повреждения были причинены при превышении пределов необходимой обороны и винный одновременно находился в состоянии сильного душевного волнения, которое внезапно возникло, то действия надлежит квалифицировать по ст. 124 УК, то есть по более мягким законом, а не по статье 123 УК (п. 10 постановления Пленума Верховного Суда от 28 июня 1991 г. // Постановления Пленума.- С. 223).
5. Ответственности по ст. 124 УК подлежат те лица, которые защищали себя от нападения, а также и те, которые защищали от нападения других граждан, интересы общества или государства, если они, защищаясь, превысил пределы необходимой обороны и причинил нападающему лишний для такого случая ущерб.
Другой комментарий к статье 124 Уголовного кодекса Украины
1. О признаки тяжких телесных повреждений см. пп.3-8 комментария к ст. 121.
2. о превышении пределов необходимой обороны см. Комментарий к ч. 3 ст. 36.
3. о превышении мер, необходимых для задержания преступника, см. Комментарий к ч. 2 ст. 38.
4. Объективная сторона преступления предусматривает причинение тяжких телесных повреждений лишь в случаях, когда виновный осуществляет свою защиту или защиту других граждан от нападения, а также во время задержания преступника. При этом предполагается, что действия сопровождались превышением пределов необходимой обороны или превышением мер, необходимых для задержания преступника.
Для решения вопроса о наличии или отсутствии признаков превышения пределов необходимой обороны должны учитываться не только соответствие или несоответствие орудий защиты и нападения, но и характер опасности, угрожавшей лицу, которое защищалось, обстоятельства, которые могли повлиять на реальное соотношение сил нападающих и тех, кто защищался, их физические данные (возраст, пол, инвалидность, состояние здоровья), внезапность нападения, неготовность к его отражению и другие факторы.
Решая вопрос о правомерности причиненного вреда, предстоит установить, защищалось ли лицо от реального, уже начатого и еще не законченного общественно опасного посягательства.
Аналогично решается вопрос, не допущено ли явное несоответствие мер задержания характеру и степени общественной опасности содеянного и обстоятельствам задержания преступника.
Ответственность по ст. 124 наступает лишь при условии, что осуществленная виновным защита явно не соответствовала опасности посягательства или обстановке, которая сложилась.
5. Причинение умышленного тяжкого телесного повреждения при превышении пределов необходимой обороны или превышении пределов мер, необходимых для задержания преступника, квалифицируется по ст.124 и в тех случаях, когда произошла смерть нападающего.
Умышленное причинение тяжких телесных повреждений, совершенное должностным лицом при превышении пределов необходимой обороны, квалифицируется по ст. 124.
6. если тяжкие телесные повреждения были причинены при таких обстоятельствах и виновный одновременно находился в состоянии сильного душевного волнения, то его действия надлежит квалифицировать по ст. 124, а не по ст. 123.
7. Субъектом преступления является лицо, которому исполнилось 16 лет.
Chlamydomonas reinhardtii Штамм CC-124 очень чувствителен к синему свету в дополнение к зеленому и красному свету при переустановке своих циркадных часов, при этом фоторецепторный криптохром синего света, вероятно, действует как отрицательный модулятор
Abstract
Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii долгое время служил модельным организмом для изучения циркадных часов. Эти часы присутствуют у всех эукариот и некоторых прокариот, что позволяет им предвидеть и использовать ежедневные колебания в окружающей среде.Хотя многое известно о циркадных часах C. reinhardtii , фоторецепторы, обеспечивающие увлечение часов ежедневными изменениями освещенности, остаются неясными. Основываясь на его циркадном ритме фототаксиса в качестве репортера фазы часов, мы показываем здесь, что штамм CC-124 C. reinhardtii очень чувствителен к синему свету с длиной волны 440 нм при сбросе своих циркадных часов на световые импульсы. Таким образом, CC-124 отличается в этом отношении от того, что ранее сообщалось для штамма с дефицитом клеточной стенки.Анализ спектра действия показал, что CC-124 также реагирует с высокой чувствительностью на зеленый (540 нм), красный (640–660 нм) и, возможно, УФ-A (≤400 нм) свет, и, следовательно, демонстрирует сходство с тем, что имеет сообщалось для штамма с дефицитом клеточной стенки. Мы также исследовали два штамма РНК-интерференции со снижением уровня криптохрома растений фоторецепторов синего света (CPh2). Один из них, деформация с большим снижением, неожиданно продемонстрировал повышенную чувствительность при сбросе часов при импульсах синего света с длиной волны 440 нм.Это повышение чувствительности вернулось к уровням дикого типа, когда штамм РНК-интерференции вернулся к уровням белка дикого типа. Это предполагает, что растительный криптохром в C. reinhardtii может действовать как отрицательный, а не положительный модулятор сброса суточных часов.
Ключевые слова: Циркадные часы, сброс, криптохром, Chlamydomonas , CC-124, синий свет, увлечение
1. Введение
Циркадные часы — это биохимический эндогенный таймер почти всех эукариот и некоторых прокариот.Часы синхронизируют многие метаболические, физиологические и поведенческие процессы с дневными циклами света и температуры окружающей среды. Процессы сохраняют свой примерно 24-часовой ритм даже при отсутствии временных ориентиров окружающей среды. Самоподдерживающаяся ритмичность циркадных часов позволяет организму предвидеть ежедневные изменения, чтобы он мог как преодолеть, так и воспользоваться периодическим характером окружающей среды. Например, фотосинтетическая фиксация углерода значительно увеличивается у растений с правильными циркадными часами [1].Поскольку необходимо, чтобы часы оставались синхронными с ежедневными колебаниями окружающей среды, они могут быть увлечены на основе временных ориентиров окружающей среды, таких как ежедневные смены света / темноты.
Chlamydomonas reinhardtii — одноклеточная эукариотическая зеленая водоросль, которая долгое время служила модельным организмом для множества клеточных процессов [2], в том числе циркадных часов [3,4]. Он показывает многие хорошо охарактеризованные циркадные ритмы поведения, физиологии и экспрессии генов [5–7].Измерение его ритма фототаксиса (плавание к свету или от него) в форме ритма накопления было автоматизировано [8,9], как и измерение ритма экспрессии генов, основанное на сообщении люциферазы светлячка [ 10]. Недавно мы построили нашу собственную машину для автоматизированных измерений ритма фототаксиса, основанную на ранее применявшемся принципе, но с некоторыми оптимизациями [11].
Хотя многое уже известно о циркадных часах у C. reinhardtii [3,4], включая некоторые механизмы передачи сигнала, участвующие в их сбросе [12], фоторецепторы, которые участвуют в дневных циклах света / темноты, остаются затемнять.Многообещающим кандидатом на эту функцию является недавно описанный растительный криптохром водорослей (CPh2) [13]. Роль растительного криптохрома в C. reinhardtii до сих пор неизвестна, но предполагалось участие в перезагрузке циркадных часов, так как это также функция криптохромов растений у высших растений [14]. Роль, которую растительный криптохром играет в C. reinhardtii , стала еще более интересной после недавнего открытия дополнительного криптохрома животного типа в геноме водоросли [15].Было обнаружено, что этот криптохром животных опосредует регулируемую светом экспрессию нескольких генов [16]. Как эти два криптохрома в C. reinhardtii могут или не могут совпадать по своей функции, и может ли один из них или, возможно, даже оба опосредовать индуцированный светом сброс циркадных часов, теперь особенно интригующие вопросы.
Тем не менее, есть одно открытие, которое указывает на другой основной фоторецептор для захвата циркадных часов у C. reinhardtii , чем у криптохрома растений или животных.Анализ спектра действия показал, что адаптированные к темноте клетки очень чувствительны к зеленому и красному свету в их ответной реакции восстановления, но только мало чувствительны к синему свету [9]. Хотя животный криптохром в C. reinhardtii также может реагировать на свет с длинами волн, отличными от синего, он, как и криптохром растений, активируются синим светом [16,17]. Поскольку эксперименты по спектру действия проводились с штаммом с дефицитом клеточной стенки и в условиях, которые мы смогли улучшить при использовании штамма CC-124 [11], мы проверили реакцию сброса CC-124 на импульсы синего света.
Мы обнаружили, что в наших условиях C. reinhardtii CC-124 хорошо реагирует на 15-минутные импульсы низкой интенсивности синего света с длиной волны 440 нм, сбрасывая свои циркадные часы. При определении всего спектра действия между длинами волн 400 и 700 нм с интервалами 20 нм мы также обнаружили, что штамм также реагирует на зеленый (540 нм) и красный (640–660 нм) свет с почти такой же высокой чувствительностью. для синего света. Мы дополнительно исследовали, участвует ли криптохром растений в ответе на синий свет, используя мутант CC-48, требующий аргинина, для создания двух штаммов РНК-интерференции (РНКи).Мы обнаружили, что только штамм RNAi с более сильным восстановлением показал значительное отличие от родительского штамма в его ответной реакции на синий свет. Удивительно, но уменьшение криптохрома растений вызвало более высокую чувствительность к синему свету, которая была потеряна после того, как штамм вернулся к уровням белка дикого типа. Это говорит о том, что у растения C. reinhardtii CC-48 криптохром имеет ингибирующую, а не активирующую функцию при сбросе циркадных часов синим светом.
2. Результаты
2.1 Синий свет сбрасывает циркадные часы
C. reinhardtii CC-124 с высокой эффективностьюКогда C. reinhardtii штамм CC-124 получает 15-минутный импульс синего света с длиной волны 440 нм при Примерно в середине ночи (7 часов в фазе темноты из цикла 12 часов света / 12 часов темноты) он реагирует, сбрасывая свои циркадные часы, о чем свидетельствует сдвиг фазы его ритма циркадного фототаксиса (). Это приведет к задержке ритма, поскольку пики и спады возникают позже по сравнению с контрольными культурами, которые не получали световой импульс.Степень задержки зависит от интенсивности импульса синего света с максимальным смещением от 3 до 4 единиц CT. Единица CT (циркадного времени) равна 1/24 периода свободного ритма и, следовательно, примерно 1 час. Сдвиг специфичен для синего светового импульса и не вызван обращением с культурами или некоторым возможным световым загрязнением комнаты, потому что имитируют контрольные культуры, с которыми обращаются идентично, за исключением того, что заслонка светового импульсного устройства не открывается во время 15-минутный световой импульс не показывает этот фазовый сдвиг ().Дисперсионный анализ подтверждает, что нет значительной разницы в фазовом сдвиге между имитирующими контрольными культурами, которые были помещены в разные слоты устройства светового импульса, но есть значительная разница в фазовом сдвиге между культурами, подвергшимися воздействию света с разной интенсивностью 440 нм. (α = 0,05). Наши результаты показывают, что CC-124 очень чувствителен к импульсам синего света с длиной волны 440 нм в своей реакции на перезагрузку циркадных часов. Это отличается от того, что было описано для штамма CW15 с дефицитом клеточной стенки [9], который не особенно чувствителен к синему свету, а скорее реагирует на зеленый и красный свет с высокой эффективностью.
Синий свет специально сбрасывает циркадные часы в штамме C. reinhardtii CC-124Через 7 часов темноты цикла 12 часов света / 12 часов темноты культуральным аликвотам штамма CC-124 давали 15 Затем были определены импульс синего света длиной 440 нм с различной интенсивностью (сплошная черная линия) и их циркадные ритмы фототаксиса. Образцы контрольных культур (серая пунктирная линия) помещали в соответствующие гнезда устройства светового импульса в идентичных условиях, за исключением того, что заслонка не открывалась.Фазовые сдвиги выражены относительно культур, которые хранились в темном ящике. Блок ТТ представляет 1/24 периода в режиме автономной работы. Каждая точка данных представляет собой среднее значение от двух до пяти независимых экспериментов. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего. Дисперсионный анализ показал, что существует значительная разница в фазовом сдвиге между культурами, подвергшимися воздействию света с разной интенсивностью 440 нм (α = 0,05), но нет значительной разницы в фазовом сдвиге между имитирующими культурами в разных слотах устройства светового импульса.
2.2 Зеленый и красный свет также эффективно сбрасывают циркадные часы у
C. reinhardtii CC-124Поскольку штамм CC-124 был чрезвычайно чувствителен к синему свету с длиной волны 440 нм в своей реакции на перезагрузку циркадных ритмов, мы решили также проверить другие длины волн для такой же высокой чувствительности. Мы протестировали световые импульсы с длинами волн от 400 до 700 нм с интервалом 20 нм, всего 16 различных длин волн. Как показано на фиг.2, кривые зависимости интенсивности света для фазового сдвига ритма циркадного фототаксиса различаются для разных длин волн.Для некоторых длин волн, например 440 нм, 540 нм, 640 нм и 660 нм, кривые расположены дальше влево на графике в сторону более низкой интенсивности света, что указывает на то, что C. reinhardtii CC-124 имеет большую чувствительность к свету на этих длинах волн. , в то время как для других длин волн, таких как 460 нм, 500 нм и 680 нм, кривые идут дальше вправо в сторону более высоких интенсивностей света и, следовательно, указывают на значительно пониженную чувствительность. Мы не наблюдали сдвига по фазе для света с длиной волны 700 нм даже при максимальной испытанной интенсивности.Формы кривых более или менее похожи с аналогичными наклонами около половины максимального фазового сдвига, а также с аналогичной степенью фазового сдвига при световом насыщении, по крайней мере, для тех длин волн, на которых было достигнуто насыщение. Заметным исключением из общей формы является кривая для 420 нм, которая показывает значительно меньший наклон.
Кривые зависимости интенсивности света для сброса суточных часов на различных длинах волнКультуры облучали 15-минутными световыми импульсами, как описано, за исключением того, что испытывали длины волн каждые 20 нм между 400 и 700 нм.Фазовые сдвиги ритма фототаксиса выражены по отношению к культурам, хранящимся в темноте. Точки данных представляют собой среднее значение от 2 до 5 независимых экспериментов. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего.
Чтобы количественно оценить чувствительность C. reinhardtii CC-124 к свету с различными длинами волн, мы создали модель для каждой длины волны, определив наиболее подходящую кривую в соответствии с уравнением y = c / (1 + b ∗ e — kx ), где c — максимальный фазовый сдвиг при интенсивности насыщающего света.Поскольку для нескольких длин волн интенсивность света, которую мы использовали, была недостаточно высокой, чтобы вызвать насыщение, и поскольку наклоны были примерно одинаковыми почти во всех случаях, мы установили в уравнении c равным –4 единиц CT. Как показано для трех наиболее эффективных длин волн, модели довольно точно соответствуют фактическим данным со значениями R 2 0,963, 0,982 и 0,983 для 440, 540 и 660 нм соответственно. также показана модель для 420 нм, где наклон кривой фактических данных был меньше, что отражено в модели.Стоимость 2 рэнд для этой модели составляет 0,961.
Моделирование кривых зависимости интенсивности света для анализа чувствительностиТочки данных на графиках являются теми же точками данных для этих длин волн, что и в, и представляют фактические данные фазового сдвига, которые были экспериментально определены для циркадного ритма фототаксиса. Эти данные были использованы для разработки наиболее подходящего уравнения формы, указанной на графике 420 нм, где c — фазовый сдвиг при интенсивности насыщающего света, который был установлен на уровне -4 единицы CT.Модель может быть использована для расчета интенсивности света, необходимой, чтобы вызвать фазовый сдвиг на -2 единицы CT. R 2 модели 420 нм: 0,961, R 2 модели 440 нм: 0,963, R 2 модели 540 нм: 0,982, R 2 модели 660 нм: 0,983.
На основе модели, которую мы создали для каждой из 16 длин волн, мы вычислили интенсивность света, необходимую для сдвига фазы на -2 единицы CT или половину максимального сдвига. Обратное значение этого значения является относительной мерой чувствительности, причем большее число указывает на более высокую чувствительность для конкретной длины волны.Следовательно, в спектре действия, полученном из этих данных, пики указывают на спектральные области высокой чувствительности. Как показано на, спектр действия для сброса суточных часов C. reinhardtii CC-124 показывает четыре области высокой чувствительности: в красном с пиком между 640 и 660 нм, в зеленом с пиком на 540 нм, в синий с пиком при 440 нм и, вероятно, в области УФ-А, на что указывает заметное увеличение чувствительности от 420 до 400 нм. Разница в эффективности между этими областями незначительна: 440 нм — самый сильный, 540 нм — примерно 75% от 440 нм, 400 нм — примерно 50% и 660 нм — примерно 40%.Интересно, что ранее опубликованный спектр действия штамма CW15 с дефицитом клеточной стенки [9] также показывает высокую чувствительность в красном (пик при 660 нм) и зеленом (пик при 520-540 нм), а также заметное увеличение чувствительность от 420 до 400 нм. Это означает, что сильная реакция на синий свет с длиной волны 440 нм — единственное существенное отличие, которое отличает наши экспериментальные результаты с CC-124 от результатов, описанных для CW15.
Спектр действия для сброса суточных часов на C.reinhardtii штамм CC-124Сброс циркадных часов определяли путем измерения степени фазового сдвига ритма циркадного фототаксиса, проявляемого C. reinhardtii CC-124. Интенсивность света, необходимая для того, чтобы вызвать фазовую задержку в 2 единицы CT, была рассчитана на основе моделей кривой отклика, как показано на примере. Величину, обратную этой интенсивности света, нормализовали относительно максимального отклика при 440 нм, который был установлен на 1, и наносили на график в логарифмическом масштабе в зависимости от длины волны.
2.3 Растительный криптохром, вероятно, подавляет сброс циркадных часов синим светом у
C. reinhardtiiЧтобы проверить нашу гипотезу о том, что ранее описанный фоторецепторный растительный криптохром в C. reinhardtii опосредует сброс циркадных часов, вызванный синим светом, мы выделили два Штаммы РНК-интерференции, cryRNAi # 16 и cryRNAi # 18, с примерно 75% и 50% снижением, соответственно (). Штаммы РНКи происходят от мутанта CC-48, требующего аргинина, который был выбран из-за гена ARG7 в нашей конструкции, который служил C.Reinhardtii за счет восстановления способности трансформантов расти без экзогенного аргинина и потому, что CC-48 демонстрирует устойчивый циркадный ритм фототаксиса в наших условиях. При тестировании способности двух штаммов РНКи сдвигать фазу своего ритма фототаксиса при импульсе синего света 440 нм мы были удивлены, обнаружив, что ни один из них не показал снижения этой способности. Напротив, один из двух штаммов, с более высоким восстановлением криптохрома, показал сильное повышение чувствительности к синему свету по сравнению с родительским штаммом CC-48.Как показано на фиг.4, кривая интенсивности света штамма cryRNAi # 16 для фазового сдвига ритма циркадного фототаксиса лежит левее кривой для родительского штамма и, следовательно, в сторону более низкой интенсивности света. С другой стороны, кривая для штамма cryRNAi # 18 намного ближе к кривой для родительского штамма. Дисперсионный анализ показал, что кривая cryRNAi # 16 значительно отличается от кривой родительского штамма (α = 0,05), что не относится к кривой cryRNAi # 18.
Индуцированные синим светом фазовые сдвиги штаммов РНКи с отключенным фоторецепторным растительным криптохромом по сравнению с родительским штаммом CC-48Верхняя левая панель: Пример вестерн-блоттинга с использованием антитела против криптохрома растений и не охарактеризованной полосы белка ~ 55 кДа мембраны, окрашенной Ponceau S, которая служила в качестве контроля нагрузки для нормализации.Разделение белков было достигнуто на 7,5% -ном полиакриламидном геле. Криптохром растений показывает две ранее описанные полосы с кажущейся молекулярной массой 126 и 143 кДа [13]. Нижняя левая панель: количественная оценка вестерн-блотов относительно мембран, окрашенных по Ponceau S, с исходным штаммом, установленным на 100%. Каждый столбец представляет собой среднее значение 3 или 4 независимых экспериментов с 2 техническими повторами для каждого независимого эксперимента. Среднее значение для cryRNAi № 16 составляет 24,3%, а для cryRNAi № 18 — 45,6%. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего.Правая панель: фазовые сдвиги ритма циркадного фототаксиса после того, как культуры подвергались воздействию световых импульсов 440 нм в течение 15 минут через 5 часов в темную фазу их цикла 12 часов света / 12 часов темноты. Каждая точка данных представляет собой среднее значение по крайней мере 3 независимых экспериментов. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего. Дисперсионный анализ показал, что кривая для штамма cryRNAi # 16 значительно отличается от кривой для родительского штамма CC-48 (α = 0,05), но кривая cryRNAi # 18 — нет.
Существует вероятность того, что повышенная чувствительность штамма cryRNAi # 16 к синему свету для сброса суточных часов связана с непреднамеренным побочным эффектом метода RNAi, а не непосредственно с эффектом нокдауна растительного криптохрома.Двухцепочечная РНК, экспрессируемая из нашей конструкции РНКи, могла вызывать нецелевые эффекты, также подавляя молчание другого гена с некоторым сходством последовательности с криптохромом растений [18]. В качестве альтернативы трансформация с помощью конструкции РНКи могла привести к мутации из-за интеграции трансгена в геном или из-за некоторой делеции генома. Мы смогли исследовать последние возможности, потому что cryRNAi # 16 со временем вернулась к уровням криптохрома растений дикого типа (). О реверсии индуцированных РНКи нокдаунов обычно сообщалось для C.reinhardtii и обычно обусловлены его способностью подавлять трансгены [19]. Как показано, потеря растительного нокдауна криптохрома коррелирует со снижением чувствительности к синему свету при сбросе циркадных часов примерно до уровня родительского штамма. Это предполагает, что наблюдаемая ранее повышенная чувствительность, скорее всего, была связана с низким уровнем белка криптохрома растений и что, следовательно, криптохром растений, скорее всего, участвует в индуцированном синим светом сбросе циркадных часов при температуре ° C.reinhardtii , однако, с тормозящей, а не активирующей функцией.
Индуцированные синим светом фазовые сдвиги ревертантного штамма cryRNAi # 16 с примерно уровнями криптохрома растений дикого типаВерхняя левая панель: Пример вестерн-блоттинга с использованием антитела против криптохрома растений и не охарактеризованной белковой полосы Понсо ~ 55 кДа S-окрашенная мембрана, которая служила контролем нагрузки для нормализации. Разделение белков достигалось на 5–15% геле с градиентом акриламида. Нижняя левая панель: количественная оценка вестерн-блотов относительно мембран, окрашенных по Ponceau S, с исходным штаммом, установленным на 100%.Каждый столбец представляет собой среднее значение 3 независимых экспериментов. Среднее значение для ревертанта cryRNAi # 16 составляет 94,7%. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего. Правая панель: фазовые сдвиги ритма циркадного фототаксиса после того, как культуры подвергались воздействию световых импульсов 440 нм в течение 15 минут через 5 часов в темную фазу их цикла 12 часов света / 12 часов темноты. Каждая точка данных представляет собой среднее значение по крайней мере 3 независимых экспериментов. Столбцы указывают на стандартную ошибку среднего. Дисперсионный анализ показал, что кривая для ревертантного штамма cryRNAi # 16 существенно не отличается от кривой для родительского штамма CC-48.
3. Обсуждение
3.1 Длины волн света, эффективные для сброса циркадных часов
C. reinhardtii CC-124Описанные здесь эксперименты демонстрируют, что штамм CC-124 C. reinhardtii очень чувствителен к синему при 440 нм. light в его способности сбрасывать циркадные часы при световых импульсах (). Мы также демонстрируем, что фиктивные контрольные культуры не показывают этого сброса, хотя с ними манипулировали точно так же, за исключением того, что заслонка нашего светового импульсного устройства оставалась закрытой.Это показывает, что сброс полностью происходит из-за импульса синего света, а не из-за каких-то других экспериментальных условий.
Наши результаты контрастируют с предыдущими сообщениями для штамма CW15 с дефицитом клеточной стенки [9], который не показал высокой чувствительности к синему свету для сброса циркадных часов в адаптированных к темноте клетках. Только когда клетки были адаптированы к постоянному тусклому свету [20], наблюдалась реакция сброса с преобладанием синего света. Было показано, что в этих условиях перезагрузка опосредуется фотосинтезом и требует импульсов света с интенсивностью примерно в 1000 раз выше и длительностью в 24 раза большей (6 часов против 15 минут), чем эффективные световые импульсы для адаптированных к темноте клеток.
Интересно, что длины волн света, которые действительно показали высокую эффективность в сбросе циркадных часов адаптированного к темноте CW15 [9], также особенно эффективны для штамма CC-124 (), т.е. зеленый (520–540 нм), красный ( 640–660 нм) и потенциально УФ-A (≤400 нм). Это поднимает вопрос о том, что может вызвать разницу между штаммами в их реакции на синий свет. Как правило, разница может быть связана либо с некоторыми конкретными различиями между штаммами, либо с различиями в условиях эксперимента.
Оба штамма различаются по своему генетическому фону, хотя они также обнаруживают сходство. Например, хотя CC-124 часто называют одним из штаммов «дикого типа», на самом деле он несет мутацию в генах nit1 и nit 2 , что делает его неспособным расти на нитрате в качестве источника азота [2 ]. Эти две мутации также распространены во многих других лабораторных штаммах C. reinhardtii , включая CW15 [2]. Одно различие в генетическом фоне между штаммами заключается в их локусе типа спаривания (mt — для CC-124, mt + для CW15).Другое отличие состоит в том, что CW15 несет не полностью охарактеризованную мутацию, которая приводит к дефициту клеточной стенки [2], тогда как CC-124 имеет клеточную стенку дикого типа. Третье отличие состоит в том, что штамм CC-124 несет аллель agg1 – [21], аллель «модифицированной фототаксической агрегации», который, как полагают, представляет естественный генетический полиморфизм, тогда как CW15 несет аллель agg1 + . Аллель agg1 — заставляет CC-124 демонстрировать отрицательный фототаксис (плыть в сторону от источника света) во всех исследованных до сих пор условиях окружающей среды, включая условия, когда штаммы с аллелем agg1 + будут демонстрировать положительный фототаксис (плыть по направлению к источнику света). источник света).Примечательно, что, как мы продемонстрировали ранее [11] и подтвердили в этом отчете, наш штамм CC-124 показывает картину накопления в машине фототаксиса, которая аналогична картине, описанной для штаммов agg1 + , в том, что она показывает все характеристики истинный циркадный ритм с постоянной ритмичностью в условиях автономной работы и сбросом на временные ориентиры окружающей среды, такие как световые импульсы. Фаза ритма также аналогична с максимальным накоплением в середине субъективного дня ().Молекулярная основа agg1 неизвестна, кроме того, что она локализована в группе сцепления XIV [22]. Интересно, что недавно сообщалось, что CC-124 демонстрирует положительный фототаксис после обработки реактивными формами кислорода, которые, как полагают, представляют собой промежуточные сигнальные продукты, которые позволяют регулировать знак фототаксиса скоростью фотосинтеза [23].
Таблица 1
Параметры циркадного ритма фототаксиса в условиях автономной работы, демонстрируемые различными штаммами Chlamydomonas reinhardtii , использованными в этом исследованииПараметры приведены для образцов культур, которые не получали световой импульс, но служили темными контролирует.Акрофаза (фаза относительно пика фототаксиса) выражается в CT (циркадное время), где CT 0 обозначает начало субъективного дня, а CT 12 — начало субъективной ночи. Каждое значение периода и фазы представляет собой среднее значение по крайней мере трех независимых экспериментов с по крайней мере тремя техническими повторами для каждого эксперимента. Также указывается ± стандартное отклонение для каждого периода и значения фазы.
| Штамм | Период [ч] | Акрофаза [CT] |
|---|---|---|
| CC-48 | 26.4 ± 0,9 | 7,3 ± 0,9 |
| CryRNAi # 16 | 26,2 ± 0,6 | 6,9 ± 0,8 |
| CryRNAi # 16-ревертант | 26,4 ± 0,4 | 6,6 ± 0,6200 | 25,5 ± 0,6 | 7,1 ± 0,8 |
| CC-124 | 25,6 ± 0,6 | 6,3 ± 0,7 |
Основываясь на этих генетических различиях между CW15 и CC-124, одна из возможных причин их различная чувствительность к синему свету при сбросе суточных часов может быть разницей в их клеточных стенках.Правильный сброс может зависеть от правильной клеточной стенки дикого типа, как обнаружено в CC-124. Потребность в клеточной стенке дикого типа может быть основана на необходимом взаимодействии между фоторецептором и клеточной стенкой, возможно, из-за локализации фоторецептора в плазматической мембране. Другой потенциальной причиной разной реакции сброса, основанной на их генетических различиях, является различный аллель agg1, который они содержат. Возможно, что аллель agg1 — в CC-124 придает большую чувствительность к синему свету, что приводит как к отрицательному фототаксису, так и к сбросу циркадных часов при уже более низкой интенсивности света, тогда как аллель agg1 + в CW15 заставляет штамм требовать более высоких значений. интенсивности для этих двух ответов.В качестве третьей возможности, еще не обнаруженное генетическое различие могло быть причиной разной реакции штаммов на сброс синего света.
Различия в дизайне экспериментов, которые использовались с каждым штаммом, — еще одна возможная причина разной чувствительности к синему свету. Сброс циркадных часов для штамма CW15 с дефицитом клеточной стенки также отслеживался по его ритму фототаксиса, как мы сделали здесь для CC-124, но для CW15 между измерениями фототаксиса использовался белый фон [9].Фоновый свет был необходим для CW15, чтобы показать постоянный ритм фототаксиса. Как показано в исследовании, процесс помещения культур в машину для фототаксиса сам по себе уже может привести к фазовому сдвигу [9]. Таким образом, сброс циркадных часов был потенциально связан с комбинированным эффектом светового импульса, приложенного до измерения ритма, и эффектом помещения клеток из темной среды в машину фототаксиса с ее белым фоном через некоторое время после импульса [9] .Мы не использовали белый фоновый свет между измерениями фототаксиса и ранее показали, что размещение наших культур в машине фототаксиса в наших условиях не вызывает значительных фазовых сдвигов [11]. Интересно, что из-за комбинации двух возможных событий фазового сдвига для CW15 другой возможной причиной низкой чувствительности этой деформации к сбросу, вызванному синим светом, может быть то, что в этом конкретном случае фазовый сдвиг из-за светового импульса и из-за размещения культур, помещенных в машину для фототаксиса, нейтрализовали друг друга, но в случае зеленого и красного света отмены не произошло.
Как правило, реакция CC-124 на сброс циркадных ритмов на синий свет не представляет собой простой картины. С одной стороны, спектр действия в этой области (400–500 нм) не показывает широкой «трехпальцевой» кривой, обычно обнаруживаемой для ответов, опосредованных либо фотосинтезом, либо двумя типами фоторецепторов синего света, о которых сообщается для C. reinhardtii , т.е. фототропины и криптохромы. Кривая вместо этого показывает более узкий узор с центром на длине волны 440 нм ().С другой стороны, крутизна кривой зависимости интенсивности света варьируется для разных длин волн синего света (). В частности, кривая зависимости интенсивности для света 420 нм намного мельче. Это предполагает, что реакция на этой длине волны может быть связана с взаимодействием двух или более фоторецепторов и, следовательно, реакция на синий свет может быть неожиданно сложной.
3.2 Растительный криптохром как возможный отрицательный модулятор сброса часов, индуцированного синим светом
При тестировании на участие криптохрома растения фоторецепторов синего света в сбросе суточных часов на C.reinhardtii на импульсы синего света, мы были удивлены, обнаружив, что этот криптохром, похоже, препятствует, а не способствует сбросу. Из двух штаммов РНКи с пониженными уровнями криптохрома в растениях, тот с более высоким снижением был значительно более чувствителен к синему свету 440 нм, чем родительский штамм ().
RNAi — мощный метод исследований обратной генетики, но он также может приводить к результатам, которые оказываются артефактами. Одна из проблем заключается в том, что трансформация с помощью конструкции РНКи может приводить к мутациям.Следовательно, наблюдаемый эффект может быть результатом вторичной мутации, а не специфического нокдауна. Это особенно характерно для C. reinhardtii , поскольку интеграция трансгенов в его геном в подавляющем большинстве случаев происходит посредством случайных интеграций, а не гомологичных рекомбинаций [24]. Следовательно, мутации могут возникать из-за конкретного сайта интеграции или из-за дополнительных делеций геномной ДНК во время процесса интеграции. Мы смогли проверить эту конкретную возможность, поскольку наш штамм РНКи со временем вернулся к уровням криптохрома растений дикого типа ().Реверсии штаммов РНКи — явление, обычно описываемое для C. reinhardtii , обычно связано со способностью водорослей заглушать трансгены [19]. Из-за возможности реверсии мы собирали образец для анализа уровней криптохрома растений каждый раз, когда наши культуры РНКи получали световой импульс, взяв образец непосредственно из аликвотной культуры во время импульса (см. Раздел «Материалы и методы»). Если реверсия РНКи происходит из-за сайленсинга трансгена, последовательность ДНК генома, включая любую возможную мутацию, не изменяется, только скорость экспрессии трансгена.Следовательно, поскольку наш реверсированный штамм РНКи также показал реверсию своей повышенной чувствительности к синему свету (), это предполагает, что исходная чувствительность к синему свету не была связана с дополнительной непреднамеренной мутацией в штамме РНКи.
Другая возможная проблема с техникой RNAi заключается в том, что она может вызывать нецелевые эффекты [18]. Небольшие интерферирующие РНК, полученные из двухцепочечной РНК в организме, могут сбивать с толку и другие гены из-за некоторых идентичностей последовательностей.Здесь мы не можем исключить нецелевые эффекты. Для этого потребуются дополнительные штаммы РНКи с различными двухцепочечными РНК, которые представляют другие области гена криптохрома растений. В качестве альтернативы, использование недавно разработанных методов искусственной микроРНК для C. reinhardtii [25,26] также снизило бы вероятность нецелевых эффектов.
Один интересный аспект, который мы смогли определить, однако, заключается в том, отличаются ли штаммы RNAi от родительского штамма по параметрам их циркадного ритма фототаксиса.Как показано в, не было серьезных различий между ритмом родительского штамма CC-48 и производных от него штаммов РНКи ни в период, ни в фазу для контрольных культур, которые не получали световой импульс со сдвигом фазы. Это говорит о том, что снижение уровня криптохрома растений или вообще наши манипуляции с РНКи не повлияли на то, как фототаксис регулируется циркадными часами в наших условиях автономной работы.
В заключение, наши данные позволяют предположить, что криптохром растений, вероятно, действует как отрицательный модулятор циркадных часов, сбрасываемых при импульсах синего света при температуре ° C.reinhardtii CC-48, хотя это еще не полностью проверено.
Штамм C. reinhardtii , который мы использовали для наших исследований криптохрома растений (CC-48), не был таким же, как тот, который мы использовали для наших исследований спектра действия (CC-124), из-за маркера Chlamydomonas , который был частью нашей конструкции РНКи. Интересно, что сравнение двух штаммов в их ответе на восстановление циркадных ритмов на синий свет 440 нм показывает, что CC-48 гораздо менее чувствителен к синему свету, чем CC-124.При анализе отклика CC-48 так же, как и для CC-124, интенсивность, необходимая для полумаксимального сдвига, почти в 50 раз выше в случае CC-48 по сравнению с CC-124. Однако неясно, связано ли это с более низкой чувствительностью к синему свету в частности или к свету в целом. Поскольку CC-48 имеет клеточную стенку дикого типа, как CC-124, но предположительно имеет аллель agg1 + , возникает соблазн предположить, что аллель agg1 — CC-124 может не только обеспечивать его более высокую чувствительность к синему свету, но он мог бы даже достичь этого за счет ослабленной тормозной функции криптохрома растений.Хотя ген ag1 не может быть идентичен самому гену криптохрома растения, поскольку криптохром растения расположен на хромосоме 6, а ag1 — на хромосоме 13 (группа сцепления XIV), ag1 может кодировать промежуточный сигнальный продукт в функции криптохрома растения.
Фоторецептор, действующий как отрицательный модулятор сброса суточных часов, был описан ранее на примере фоторецептора синего света VIVID в Neurospora [27]. У этого гриба КОМПЛЕКС БЕЛОГО ОШЕЙНИКА (WCC) действует как положительный элемент в петле обратной связи транскрипции / трансляции центрального осциллятора, основанной на его функции активатора транскрипции.WCC также действует как фоторецептор синего света для сброса суточных часов и многих других процессов, индуцированных синим светом, через свою субъединицу WHITE COLLAR-1 (WC-1) [28]. VIVID, когда активируется синим светом, будет ингибировать WCC, конкурируя за связывание двух субъединиц WCC и, таким образом, путем образования альтернативных гетеродимеров [29]. Поскольку ген, кодирующий VIVID, индуцируется светом, высокие уровни VIVID образуются только через некоторое время, тем самым задерживая его репрессивное действие на свет [30]. Эта задержка является основой для фотоадаптации в Neurospora , в результате чего индуцируемые светом процессы становятся преходящими, несмотря на продолжающееся освещение, и позволяя организму реагировать на дальнейшее увеличение интенсивности света.Поскольку экспрессия гена, кодирующего VIVID, демонстрирует циркадный ритм и его способность к светоиндукции регулируется циркадными часами [27,30], VIVID вызывает особую чувствительность Neurospora к свету на рассвете и предотвращает сброс циркадных часов путем лунный свет [29].
Биология криптохрома растений C. reinhardtii еще недостаточно изучена, но то, что известно, демонстрирует некоторые интересные отличия от VIVID Neurospora . В условиях цикла 12 часов света / 12 часов темноты уровни белка растительного криптохрома колеблются с максимальными количествами к концу темного периода [13], в то время как VIVID демонстрирует максимальное количество в период раннего светового периода [30].Колебательный паттерн криптохрома растений, по крайней мере частично, обусловлен его быстрой деградацией на свету [13], тогда как паттерн VIVID — световой индукцией его гена [30]. Это различие по сравнению с VIVID предполагает, что можно ожидать, что криптохром растений будет помогать организму несколько иначе в его реакции на окружающую среду.
В общем, функция растительного криптохрома в C. reinhardtii может заключаться в том, чтобы позволить водорослям точно настраивать свою реакцию в зависимости от времени суток, а также спектрального количества и качества падающего света.Это может также относиться к другим процессам, регулируемым светом, помимо переустановки циркадных часов, как сообщалось для высших растений, где этот тип фоторецепторов дополнительно регулирует такие действия, как удлинение гипокотилей, время цветения, производство антоцианов и открытие устьиц [31 ].
3.3 Другие фоторецепторы, возможно, участвующие в сбросе циркадных часов
C. reinhardtiiРезультаты, представленные здесь, демонстрируют, что C. reinhardtii штамм CC-124 особенно чувствителен к синему (440 нм), зеленому (540 нм) и красный (640–660 нм) свет и, возможно, УФ-А (≤400 нм) при сбросе его циркадных часов ().Эта чувствительность может быть опосредована некоторыми из известных фоторецепторов у C. reinhardtii , некоторыми еще не обнаруженными фоторецепторами или фотосинтезом. Хотя мы не проверяли это напрямую, мы считаем маловероятным, что фотосинтез опосредует реакцию на синий и красный свет по трем причинам: (1) требуемая интенсивность света очень низкая (1,5 × 10 −9 и 3,9 × 10 ). −9 моль фотонов м −2 с −1 в течение 15 мин для 440 нм и 660 нм, соответственно, для достижения максимального сдвига 50%), (2) кривая спектра действия отличается от кривой для фотосинтеза ( синяя область, в частности, иначе была бы намного шире) и (3) было показано, что реакция адаптированного к темноте CW15 не зависит от ингибитора фотосинтеза [9].
Известные фоторецепторы в C. reinhardtii относятся к типам фототропина, криптохрома и родопсина [32]. В геноме C. reinhardtii , кодирующем родопсины, имеется по крайней мере шесть генов [32], два из которых, как было показано, опосредуют фототаксис [33]. Эти два маловероятных кандидата на сброс часов, так как, как сообщалось, они вызывают максимальное действие примерно при 470 и 507 нм. Однако один или несколько других, еще не охарактеризованных родопсинов могут быть ответственны за сброс часов при импульсах зеленого (540 нм) света.Интересно, что недавнее спектроскопическое исследование одного из этих родопсинов показало, что темная форма поглощает УФ-А с максимумом 380 нм, превращая его в стабильную форму, которую можно снова переключить в темную форму с помощью синего света [34]. Это показывает, что родопсины могут даже быть кандидатами на реакцию на УФ-А и синий свет.
Два других класса фоторецепторов, фототропины и криптохромы, обычно считались рецепторами синего света, хотя для некоторых криптохромов это может быть слишком узким взглядом.Существует единственный фототропин, кодируемый в C. reinhardtii , который, как было показано, опосредует несколько эффектов синего света, например, регулирующих сексуальный жизненный цикл [35] и экспрессию некоторых генов, участвующих в биосинтезе хлорофилла и каротиноидов [36]. Фототропины высших растений, скорее всего, не участвуют в перезагрузке циркадных часов, поскольку мутанты фототропина не проявляют наблюдаемых циркадных дефектов. Кроме того, спектры поглощения / действия фототропинов обычно показывают характерную широкую «трехпальцевую» картину в области 400–500 нм, что не относится к представленному здесь спектру действия.
Существует второй криптохром в дополнение к криптохрому растений, кодируемый в геноме C. reinhardtii , который, как было показано, также действует как фоторецептор [16]. Последовательность этого криптохрома наиболее близка к криптохромам животных [15]. Недавний анализ этого животного криптохрома в C. reinhardtii неожиданно выявил паттерн абсорбции и действия, совершенно отличный от такового у растительных криптохромов [16]. В дополнение к типичному широкому и «трехпалому» рисунку в синем, криптохром животных C.reinhardtii также показал максимум поглощения и физиологический ответ в красном (633 нм) и желтом (585 нм) диапазоне. Сообщалось, что физическая основа этого различия лежит в особой степени окисления хромофора в темной форме фоторецептора. В то время как FAD в криптохроме растений C. reinhardtii находится в полностью окисленном состоянии [18], FAD криптохрома животных находится в нейтральном радикальном состоянии [16].
Криптохром животных в C. reinhardtii , как сообщается, опосредует световую индукцию ряда генов, в том числе некоторых, которые участвуют в циркадных часах [16].Еще предстоит определить, опосредует ли фоторецептор сброс циркадных часов. Он мог быть ответственным за эффекты синего и красного света, хотя тогда неясно, почему не наблюдалось значительного эффекта в желтом.
Таким образом, наши данные показывают, что вовлечение циркадных часов C. reinhardtii в суточные колебания света в окружающей среде довольно сложно, чего, возможно, и следует ожидать от организма, для которого свет имеет первостепенное значение для выживания. , но необходимы дополнительные исследования в этой интересной области восприятия.
4. Материалы и методы
4.1 Штаммы и условия роста
Chlamydomonas reinhardtii Штамм CC-124 (137c mt –) был получен от Christoph Beck (Университет Альберта-Людвига, Фрайбург, Германия) и штамм CC- 48 (arg2, mt + ) из коллекции культур Центра хламидомонады (chlamycollection.org). Поскольку штамм CC-48 является ауксотрофным по аргинину, все питательные среды для этого штамма также содержат L-аргинин в концентрации 0.2 мг / мл. Для всех экспериментов со световым импульсом клетки выращивали, как описано [11]. Вкратце, 10 4 клеток / мл инокулировали во флаконы емкостью 1 л и выращивали фотоавтотрофно в 0,3 HSM в светонепроницаемом инкубаторе с регулируемой температурой в течение не менее четырех циклов 12 часов света / 12 часов темноты с темной фазой, происходящей во время рабочий день. Как только культуры достигли концентрации 1-2 × 10 6 клеток / мл, аликвоты по 3 мл переносили в чашки Петри диаметром 35 мм (Corning) и помещали в темный ящик на время начала темной фазы.Концентрацию клеток определяли с помощью гемацитометра [37]. Для вестерн-блоттинга клетки собирали в полной темноте во время светового импульса от аликвотных культур. Для этой цели 50 мл инкубаторной культуры объемом 1 л переносили в колбу Эрленмейера на 125 мл и заворачивали в алюминиевую фольгу во время начала темной фазы, во время которой подавался световой импульс. Колбу помещали на шейкер со скоростью 150 об / мин в температурных условиях, таких же, как в инкубаторе, которая составляла 20 ° C.
4.2 Применение световых импульсов
Световые импульсы подавали от имитатора солнечного излучения Oriel 150 Вт (Ньюпорт) с дихроичным холодным зеркалом (Ньюпорт), которое отражало только видимую часть света на образцы культур. Прежде чем коллимированный световой луч достиг культур, он прошел через серию из семи светоделителей (Melles Griot Optics Group), каждый из которых отражает примерно 70% светового луча на культуру через 30-градусный диффузор (Edmund Optics), а остальные 30%. был передан на следующий светоделитель.Таким образом, один и тот же световой луч мог одновременно осветить 7 культур с разной интенсивностью. Ровность светового поля подтверждена с помощью фотобумаги. Между холодным зеркалом и первым светоделителем были вставлены узкополосные интерференционные фильтры с центральной длиной волны от 400 до 700 нм с шагом 20 нм (Newport). Эти фильтры показали полную ширину полосы пропускания 10 нм при половинном максимальном коэффициенте пропускания. Также был вставлен фильтр с нейтральной плотностью поглощения 2,0 или 1,0 для уменьшения общей интенсивности света.
Экспериментальные культуры в чашках Петри извлекали из темного бокса и помещали в прорези светового импульсного устройства в полной темноте. Прорези закрывали крышкой и включали устройство световых импульсов для разогрева. Затем открывали заслонку для экспонирования культур ровно на 15 мин, начиная с момента обозначенного импульса. Для штамма CC-124 световые импульсы подавались через 7 часов в темную фазу, а для штамма CC-48 и его производных штаммов RNAi через 5 часов в темную фазу.По окончании светового импульса устройство выключили, и культуры вернули в темный ящик. Наконец, все культуры, включая контрольные, которые не получали световой импульс, помещали в машину для фототаксиса в полной темноте через 23 часа после их первого помещения в темный ящик.
4.3 Мониторинг и анализ ритмов циркадного фототаксиса
Фототаксис контролировали в автоматическом режиме в течение не менее пяти дней, как описано ранее [11]. Контрольная лампа должна была включаться каждый час в течение 15 минут.Данные для этих циркадных ритмов фототаксиса были проанализированы в отношении периода и фазы с использованием алгоритма, описанного ранее [11]. Алгоритм был настроен так, чтобы вычислить фазу во время светового импульса и выразить ее в единицах CT (циркадного времени), а не в абсолютных часах. Блок ТТ эквивалентен 1/24 периода автономной работы. КТ — это обычно используемая единица, поскольку она позволяет лучше сравнивать фазы между ритмами, которые различаются по своему периоду. Фазовый сдвиг культур, получивших световой импульс, выражается относительно фазы контрольных культур, которые не получали световой импульс.
4.4 Определение интенсивности света
Квантовый датчик LI-190SA, подключенный к люксметру LI-250 (LI-COR, Lincoln), использовался для измерения интенсивности света, который достиг культур от устройства светового импульса. Поскольку чувствительность квантового датчика была ограничена, при использовании узкополосных интерференционных фильтров необходимо было экстраполировать некоторые из более низких значений интенсивности света. Интенсивность света либо без фильтра нейтральной плотности, либо с фильтром нейтральной плотности 1,0 или 2,0 можно было напрямую измерить с помощью экспонометра, когда не использовался узкополосный интерференционный фильтр.Интенсивности света для этого белого света давали прямолинейный отклик, когда логарифм интенсивности был нанесен на график зависимости либо от номера щели, либо от силы фильтра нейтральной плотности. При использовании узкополосных интерференционных фильтров, интенсивности можно было непосредственно измерить в первых пяти слотах для света, который не прошел без фильтра нейтральной плотности, и для некоторых слотов с более высокой интенсивностью света с установленными фильтрами нейтральной плотности 1,0 и 2,0. Было определено, что эти интенсивности дают такой же линейный отклик, что и белый свет для измерений выше порога 0.02 мкмоль фотон м −2 с −1 .
На основе этих результатов линейности была разработана модель, которая учитывала уменьшение из-за фильтра нейтральной плотности и из-за положения слота: Log [Intensity] = a * slot + b * ndf + c , где слот — позиция уменьшения интенсивности света в устройстве световых импульсов (с 1 по 7), ndf — уменьшение интенсивности света через фильтр нейтральной плотности (0, 1 или 2), а a, b и c — константы .На основе имеющихся данных об интенсивности света наиболее подходящее решение этой модели было рассчитано в Mathematica® (Wolfram) для каждого узкополосного интерференционного фильтра и использовано для экстраполяции интенсивностей света, которые были слишком низкими для прямого измерения. Затем измеренные и смоделированные значения были масштабированы, чтобы скорректировать характеристики измерения экспонометра на каждой длине волны, которые были определены производителем во время калибровки. В конечном итоге экстраполированные значения были масштабированы до светового отклика на длине волны 650 нм, потому что на этой длине волны измерения люксметра отражают идеальный квантовый отклик.
4.5 Анализ спектра действия
Поскольку физиологические реакции на свет не имеют линейной зависимости с интенсивностью света из-за насыщения при высокой интенсивности света, сигмоидальные функции обычно используются для моделирования кривых отклика на изменения интенсивности света. Фазовые сдвиги были нанесены на график зависимости от отрицательного логарифма интенсивности света и уравнения наилучшего соответствия y = c / (1 + b ∗ e — kx ) использовалось для моделирования кривой, где y — степень фазового сдвига, c — максимальный отклик, при котором интенсивность света находится в насыщении, b — коэффициент горизонтального переноса кривой, k — скорость реакции на интенсивность света, также называемая «крутизной кривой», и x — это коэффициент отрицательный логарифм силы света.В анализе c , максимальный отклик при светонасыщении, был установлен на -4 единиц CT. Затем рассчитывались интенсивности света, необходимые для вызова сдвига единичной фазы -2 CT по уравнениям наилучшего соответствия путем взятия отрицательного антилогарифма значения x, полученного для значения y, равного -2. Статистический анализ проводился с использованием функций ANOVA и хи-квадрат в системе Mathematica®.
4.6 Клонирование конструкции РНКи и трансформация
C. reinhardtiiПлазмида pCB740 [38] содержит ген HSP70B ниже промотора слияния HSP70A / RBCS2 и ген ARG7 в качестве маркера для C.Reinhardtii . pCB740 был переварен с помощью NheI и EcoRV для удаления гена HSP70B, поскольку уникальный сайт NheI находится непосредственно в стартовом сайте транскрипции, а уникальный сайт EcoRV находится за 3′-концом гена, всего на несколько оснований перед уникальным сайтом EcoRI. Фрагмент геномной ДНК криптохрома растений размером ~ 2,0 т.п.н. был удален из pGDS200 [39] путем расщепления с помощью ScaI и SpeI. Криптохром растений первоначально был назван CPh2 ( Chlamydomonas photolyase homologue 1, {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «AAC37438», «term_id»: «21327675», «term_text»: «AAC37438»}} AAC37438).Он идентичен аннотированному белку {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «XP_001701553», «term_id»: «15
Трансформацию штамма CC-48 C. reinhardtii проводили методом стеклянных шариков [40]. Клетки выращивали в среде TAP с аргинином до концентрации от 1 до 2 × 10 6 клеток / мл.Клетки из объема культуры 40 мл ресуспендировали в 1,6 мл раствора автолизина, приготовленного по Харрису [37], и инкубировали 45 мин при комнатной температуре при легком встряхивании. Клетки промывали один раз 1 мл ТАР и ресуспендировали в 0,4 мл ТАР. К 1,6 мкг плазмиды pMY2, которая была линеаризована с помощью XmnI перед трансформацией, добавляли 300 мг стеклянных шариков, 0,3 мл клеток и 0,1 мл 20% PEG 8000 и перемешивали на вортексе в течение 13 секунд при максимальной скорости. Немедленно добавляли среду TAP в объеме 0,3 мл и раствор распределяли по двум планшетам TAP.Трансформанты были идентифицированы по их способности образовывать колонии на этих чашках без аргинина.
4.7 Вестерн-блот-анализ
Образцы культур для всех вестерн-блот-анализов собирали в полной темноте в то время, когда также подавался световой импульс. Для каждого сбора 13,5 мл культуры переносили в пробирку Corning на 15 мл, вращали в клинической центрифуге в течение 90 секунд и сливали супернатант. Четыреста мкл конечного буфера для образцов Лэммли (62,5 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 50 мМ дитиотреитола, 10% глицерина, 0,001% бромфенолсинего) добавляли в каждую пробирку, кратковременно перемешивали на вортексе и мгновенно замораживали в жидком азоте перед включением освещения в помещении и переносом образцов до температуры -80 ° C. ° C морозильная камера. Клетки размораживали и немедленно лизировали с помощью ультразвукового устройства (Vibra-Cell VCX130, Sonics and Materials, Inc.) при 40% амплитуде в течение пяти 10-секундных импульсов. Обработанные ультразвуком образцы кипятили в течение 1 мин, центрифугировали в течение 2 мин и супернатант использовали для вестерн-блоттинга.Концентрации белка определяли спектрофотометрически по формуле: Общая концентрация белка (мг / мл) = (1,55 ∗ A 280 ) — (0,76 ∗ A 260 ).
Равные количества общего растворимого белка разделяли на полиакриламидных гелях SDS (Mini-PROTEAN 3, Bio-Rad) и переносили на мембрану Hybond-C (Amersham Biosciences). Мембраны окрашивали на общий белок с помощью Ponceau S (0,2% Ponceau S, 1% уксусная кислота). После блокирования 3% сухим обезжиренным молоком мембраны инкубировали с антисывороткой к криптохрому растений, полученной от Gary Small [13], в разведении 1: 5000.Конъюгированная с пероксидазой сыворотка против кроликов (Sigma) была использована для обнаружения первичных антител посредством хемилюминесценции (100 мМ Трис-HCl pH 8,5, 1,25 мМ люминол, 0,2 мМ п-кумаровая кислота, 0,0000915% перекиси водорода) с использованием системы цифровой визуализации ( FluorChem HD2, Alpha Innotech). Количественный анализ сигналов хемилюминесценции, а также сигналов Ponceau S был выполнен с использованием инструмента «полосового анализа» в программном обеспечении FluorChem HD2.
Возможные решения для скрининга, сортировки и оценки тяжести пациентов с подозрением на COVID-19 в условиях ограниченных ресурсов: обзорный обзор
Сильные и слабые стороны этого исследования
Мы представляем первый обзор скрининга на COVID-19 инструменты, сортировка и оценка степени тяжести как предложенные, так и реализованные при первичном обращении пациентов в систему здравоохранения.
Было предложено и реализовано множество инструментов скрининга, сортировки и оценки серьезности, но ни один из них не является специфичным для настроек с низким уровнем ресурсов (LRS).
Мы определили 51 инструмент — 31 скрининг, 5 сортировок и 15 баллов по степени серьезности — которые имеют переменные, которые можно собрать в LRS.
Осуществимость, однако, не предсказывает, что инструмент будет точным или эффективным, и никакие инструменты из этого обзора не были проверены в LRS.
Вероятно, что многие инструменты, используемые в системах здравоохранения по всему миру, не опубликованы и поэтому не могут быть описаны в этом обзоре.
Введение
SARS-CoV-2 был объявлен глобальной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения 30 января 2020 года.1 С тех пор более 153 миллионов человек были инфицированы и более 3,2 миллиона умерли2. Страны со средним уровнем дохода (СНСД) относительно избавлены от высоких показателей смертности, меры общественного здравоохранения по сдерживанию распространения вируса создают огромную нагрузку на системы здравоохранения и способность стран справляться с существующим бременем болезней3–5. Приток пациентов с COVID. -19 оказали давление на системы здравоохранения во всем мире из-за растущего спроса на средства индивидуальной защиты (СИЗ), средства диагностики, кислород и аппараты искусственной вентиляции легких.6 Страны с ограниченными ресурсами (LRS) имеют ограниченный доступ к этим ресурсам и остаются непропорционально сложной задачей во время пандемии COVID-19.7 8 Даже в регионах, где передача вируса остается низкой, пациенты с подозрением на COVID-19 требуют мер предосторожности, а подтвержденные случаи требуют больших затрат лечение и уход. По мере продолжения пандемии постоянная потребность в ресурсах может перегрузить системы здравоохранения LRS3.
Раннее выявление и лечение острых состояний являются неотъемлемой частью снижения общей смертности в LRS.9 Предыдущие данные свидетельствуют о том, что три конкретных процесса — скрининг, сортировка и оценка степени тяжести пациентов — улучшают исходы для пациентов в LRS.10 11 Эти методы сокращают использование ресурсов в различных условиях и информируют текущее ведение пациентов, 12 но соответствующее внедрение во время чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения может быть сложно. Необходимость в инструментах скрининга, сортировки и оценки серьезности в реальном времени может привести к использованию как непроверенных, так и потенциально неэффективных протоколов.
Хотя неотложная помощь быстро развивалась в СНСУД за последние два десятилетия, во многих регионах, особенно за пределами городских районов, она остается неразвитой.13 Во многих системах здравоохранения отсутствуют официальные отделения неотложной помощи (ЕС), а те, в которых есть специальные помещения для оказания неотложной и неотложной помощи, могут не проводить регулярный скрининг или сортировку пациентов. Внедрение этих инструментов может быть сложной задачей в LRS, где не хватает оборудования, персонала и систем.7 Несмотря на ограничения, исключительные риски COVID-19 выдвинули на первый план процедуры скрининга и сортировки: практические протоколы скрининга и сортировки максимально используют ограниченные доступные ресурсы и обеспечить безопасность пациентов и медицинских работников.
Скрининг относится к процессу выявления и изоляции пациентов с факторами риска COVID-19 при первоначальном обращении в систему здравоохранения, например в амбулаторные клиники и ЕС.9 Это быстрый процесс оценки потенциального риска заражения, обычно с использованием основных клиническая и историческая информация. Чтобы быть успешным, оно должно основываться на легко понятных определениях случая, поскольку оно часто выполняется не медицинским персоналом (например, охранниками). При скрининге высокая чувствительность обычно имеет приоритет перед специфичностью, поэтому все случаи выявляются.Этот процесс принципиально отличается от диагностического тестирования, которое в некоторой литературе также называется скринингом. Сортировка — систематический метод сортировки пациентов по приоритетным группам на основе тяжести их клинического синдрома и сопоставление этих групп с имеющимися ресурсами — обычно проводится после скрининга14. Сортировка рассматривается как фундаментальный компонент эффективной неотложной помощи15: для того, чтобы При сортировке для улучшения результатов для пациентов протокол сортировки должен эффективно отдавать приоритет наиболее тяжелым пациентам для оказания неотложной помощи и направлять пациентов на соответствующий уровень медицинской помощи.16 Шкала тяжести стратифицирует пациентов с диагнозом (например, подтвержденным или подозреваемым COVID-19) на основе риска неблагоприятных исходов, таких как смертность или госпитализация в отделение интенсивной терапии, и может дополнять процесс сортировки и дополнительно информировать о распределении ресурсов.
На сегодняшний день не опубликовано ни одного обзора, подробно описывающего доступные инструменты для выявления и сортировки пациентов с COVID-19. Этот обзор был направлен на выявление предлагаемых и / или реализованных в настоящее время методов скрининга, сортировки и ранней оценки степени тяжести пациентов с подозрением на COVID-19 при первоначальном обращении в систему здравоохранения, а также на оценку полезности этих инструментов в LRS.
Методы
Стратегия поиска
Был проведен систематический поиск для выявления литературы, описывающей методы скрининга, сортировки и оценки степени тяжести, которые были внедрены или предложены для использования с пациентами с подозрением на COVID-19 при первом обращении в учреждения неотложной или неотложной помощи .
В четырех электронных базах данных (Embase, Ovid / Medline, PubMed и Web of Science) был проведен поиск по ключевым словам, с изменениями, сделанными на основе стандартов контролируемой лексики для каждой базы данных.Первоначальные поисковые запросы включали «COVID», «COVID» и «SARS-CoV-2» вместе с «скринингом», «сортировкой», «серьезностью», «риском» и «стратификацией», «прогнозом», «инструментом, »« Индекс »и« оценка »(дополнительное онлайн-приложение 1). Вторичный поиск был завершен после комментариев рецензента с включением условий поиска для чрезвычайных ситуаций, чтобы помочь уточнить поиск, учитывая подавляющий рост опубликованной литературы по темам, связанным с COVID-19. Целевые поиски проводились для выявления «серой» литературы через Google Scholar и Open Gray.Также был проведен поиск на веб-сайтах ключевых региональных и международных организаций здравоохранения, в том числе Европейского центра профилактики и контроля заболеваний, Африканской сети инфекционного контроля, Международного комитета Красного Креста, Medecins Sans Frontières, ЮНИСЕФ, Агентства США по международному развитию, Центров США по болезням. Контроль и профилактика и ВОЗ.
Критерии включения и исключения
Все исследования, опубликованные на английском языке в период с 1 декабря 2019 г. по 1 апреля 2021 г., соответствовали критериям включения.Были рассмотрены различные формы литературы, включая опубликованные и препринтные рукописи, переписку, отчеты и опубликованные руководства. Исследования были необходимы для описания скрининга, сортировки и / или оценки тяжести подозреваемых положительных или подтвержденных пациентов с COVID-19, проводимых терапевтами или поставщиками неотложной помощи на догоспитальном, больничном или клиническом уровне. Подходили для включения как ранее существовавшие инструменты, применяемые к пациентам с COVID-19, так и новые инструменты, разработанные специально для ответа на COVID-19.Требовалось описание инструмента, включая входные данные (например, гипоксия) и любые соответствующие параметры (например, входные значения, такие как сатурация кислорода <93%). Поскольку этот обзор направлен на описание всех инструментов, которые могут использоваться, данные о результатах исследований внедрения и / или валидации не требовались. Инструменты могут быть предложены или используются, с валидацией или без нее. Не было никаких ограничений в отношении групп населения, в которых могут использоваться инструменты.
Исследования на языках, отличных от английского, или опубликованные до 1 декабря 2019 года, были исключены.Исследования, описывающие скрининг, сортировку и / или оценку тяжести только врачами-специалистами, а также исследования, в которых отсутствует полное описание инструмента, не были включены. Были исключены усилия по скринингу на уровне общины и населения, проводимые поставщиками медицинских услуг или иным образом, как и инструменты самопроверки на дому. Описания инфраструктуры физического скрининга или сортировки (например, места для обхода или проезда на автомобиле) и методов проведения скрининга (например, телездравоохранение) не были включены.
Извлечение и анализ данных
Несколько рецензентов (SH, JLP, CB и AVN) независимо оценили исследования на соответствие критериям на уровне заголовка, аннотации и полнотекстового содержания.Любые несоответствия устранялись путем обсуждения с привлечением третьего независимого рецензента (AVN, EJCH и CB), где это было необходимо. Соответствующие данные были извлечены из подходящих текстов, включая год публикации, страну и условия, в которых инструмент был предложен или внедрен, статус инструмента в том виде, в каком он был предложен или внедрен, и любые входные данные инструмента (например, сопутствующие заболевания, клинические симптомы и результаты и диагностические данные). и результаты лабораторных исследований). Второй исследователь проверил все извлеченные данные, чтобы убедиться в их точности.
Был проведен описательный анализ, и контрольный список «Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и мета-анализов — расширение для обзорных обзоров» использовался для руководства анализом и составлением отчетов по этим результатам.17 Возможность использования исходных данных для использования в LRS была определена на основе изучения ключевой литературы, включая Приоритеты Всемирного банка по контролю за заболеваниями, третье издание и заявление о консенсусе Африканской федерации экстренной медицины 2013 года, в котором описываются ожидаемые возможности для оказания неотложной помощи на уровне учреждений на континенте.18 19 Как и в любом другом месте, в LRS есть медицинские учреждения разной вместимости. В этом обзоре осуществимость была нацелена на больницы районного уровня, так как именно в этих учреждениях большинство населения LRS, вероятно, первоначально будет обращаться.18 Кроме того, поскольку полностью обеспеченные ресурсами медицинские учреждения боролись с всплеском COVID-19, эти данные технико-экономического обоснования также могут применяться, когда избыточный объем пациентов потребляет критические ресурсы или затрудняет визуализацию.
Участие пациентов и общественности
Учитывая характер этого обзора, было неуместно привлекать пациентов или общественность к разработке или проведению этого исследования.
Результаты
В результате поисковой стратегии было найдено 15 232 статей (рисунок 1).После удаления дубликатов на предмет включения было оценено 11 091 уникальное название. После просмотра названий и аннотаций осталось 472 статьи. В результате полнотекстового обзора было создано 124 статьи для полного включения и извлечения данных (онлайн-приложение 2, таблицы 1–3).
Рис. 1Блок-схема PRISMA для выбранных исследований.
На момент включения большинство статей прошли рецензирование (n = 99, 79,8%) или препринты (n = 9, 7,3%). В обзор также были включены три статьи из «серой» литературы, в которых рассказывается о трех инструментах.Статьи были написаны из 27 стран, при этом большинство из них было опубликовано или опубликовано в Китае (n = 41, 33,1%), за ним следуют США (n = 23, 18,5%) и Италия (n = 10, 8,1%). Международные рекомендации описаны в трех статьях (2,4%).
В большинстве доступной литературы описаны инструменты оценки серьезности (n = 54 статьи, 43,5%). Инструменты скрининга описаны у 48 (38,7%), а сортировка — у 12 (9,7%). В некоторых исследованиях описывалось несколько инструментов для сортировки или оценки степени тяжести. В 10 исследованиях были описаны как скрининг, так и сортировка.Всего было описано 57 инструментов скрининга, 23 сортировки и 54 инструмента оценки тяжести (таблица 1).
Таблица 1Обзор инструментов, используемых для скрининга, сортировки и оценки степени тяжести пациентов с COVID-19
Многие инструменты были разработаны для всей больницы (n = 51, 38,1%) или ЕС (n = 19, 14,2%) использовать. Более одной трети (n = 52, 38,8%) не имели определенных настроек и считались предназначенными для широкого использования в системе здравоохранения. Семь инструментов (6,4%) — пять для скрининга и два для сортировки — были специфичны для педиатрических условий; почти все остальные (n = 115, 85.8%) не указали возраст.
Более четверти инструментов (n = 37, 27,6%) предоставили данные валидации, подтверждающие их использование (онлайн-приложение 2, таблица 4), при этом четыре (из 37; 10,8%) валидированы проспективно. Большинство инструментов были проверены по следующим результатам: диагностика тяжелого заболевания COVID-19 (n = 8, 21,6%), подтверждение COVID-19 с помощью RT-PCR (n = 5, 13,5%) или 30-дневная смертность (n = 4. 10,8%). Только четыре инструмента скрининга (7,0%) и два инструмента сортировки (8,7%) имели связанные данные валидации, в то время как 29 инструментов оценки серьезности (53.7%) сделали. Все эти инструменты были проверены в странах с высоким уровнем дохода (n = 18, 48,6%) или уровнем дохода выше среднего (n = 19, 51,4%). Из числа проверенных в странах с уровнем дохода выше среднего (n = 19) 16 были проверены в Китае (84,2%), 2 — в Турции (10,5%) и 1 — в Мексике (5,3%).
Всего в алгоритмы скрининга, сортировки и оценки серьезности было включено 204 уникальных входа (таблица 2 и дополнительное онлайн-приложение 2, таблица 5).
Таблица 2Обзор входных данных в инструментах, используемых для скрининга, сортировки и оценки степени тяжести пациентов с COVID-19
Инструменты скрининга имели в среднем четыре (IQR: 3–7) входных данных.Большинство (n = 36, 63,2%) включали факторы эпидемиологического риска. Лихорадку обычно включали как симптом (n = 31, 54,4%) или измеренный показатель жизненно важных функций (n = 17, 29,8%). Инструменты сортировки имели в среднем восемь входов (IQR: 2,5–13,5). Наиболее часто используемым показателем жизненно важных функций было насыщение кислородом (n = 22, 16,4%), за которым следовало тахипноэ (n = 20, 14,9%). Одновременно диагностированные острые состояния присутствовали в нескольких инструментах сортировки (n = 6, 26,1%). Инструменты оценки серьезности имели медианное значение пяти входных данных (IQR: 1–8,5). Наиболее часто используемые исходные данные в этих инструментах — возраст (n = 22, 40.1%), лактатдегидрогеназа (n = 11, 20,4%), частота дыхания (n = 7, 37,0%) и температура (n = 5, 9,3%).
В нескольких исследованиях использовались уже существующие инструменты для стратификации пациентов с подозрением на положительный статус COVID-19: 11 для сортировки и 19 для оценки степени тяжести (онлайн-приложение 2, таблица 6). Наиболее распространенными инструментами для оценки степени тяжести были баллы qSOFA и CURB-65, которые использовались в пяти и четырех исследованиях соответственно.
Инструменты, которые полагались на визуализацию и почти все лабораторные исследования, были признаны в значительной степени непрактичными для рутинного использования во многих передовых ЕС в LRS.7 8 В контексте этих ограничений чуть более половины инструментов скрининга (n = 31, 54,4%) были пригодны для использования в LRS EUs; меньшее количество (n = 5, 21,7%) инструментов сортировки и оценки тяжести (n = 15, 27,8%) также было возможным. Многие исследования, описывающие инструменты, не подходящие для LRS EU, включали визуализацию: 17 инструментов скрининга (29,8%), 16 инструментов сортировки (69,6%) и 14 инструментов (25,9%) оценки степени тяжести требовали рентгенографии грудной клетки, КТ грудной клетки и / или УЗИ легких. По крайней мере, одно лабораторное значение было включено в семь скринингов (12.2%), шесть (26,0%) инструментов сортировки и 28 инструментов оценки степени тяжести (51,9%). Инструменты проверки были предложены или внедрены в шести СНСД: 19 в Китае, 2 в Индии и по 1 в Мексике, Тиморе-Лешти, Турции и Уганде, причем 16 (55,2%) из этих инструментов были сочтены применимыми для LRS. Инструменты сортировки были предложены или внедрены в четырех СНСД: трех в Китае, трех в Индии и по одному в Тиморе-Лешти и Турции, и только четыре (17,4%) сочтены пригодными для LRS. Из 25 инструментов оценки степени серьезности, предложенных или реализованных в СНСД, 18 были из Китая, 2 из Пакистана и по 1 из Аргентины, Бразилии, Мексики, Турции и Индии; всего три (5.6%) вероятны в LRS.
Обсуждение
В этом обзорном обзоре был выявлен широкий спектр инструментов, используемых для скрининга, сортировки и прогнозирования тяжести подозреваемых положительных пациентов с COVID-19 во всем мире. Непропорционально большая доля инструментов была описана в трех странах: Китае, США и Италии, что является отражением сочетания бремени болезней на ранней стадии и исследовательского потенциала принимающей страны. В то время как более половины инструментов скрининга предоставляли некоторую информацию о реализации, менее половины инструментов сортировки и никакие инструменты оценки серьезности этого не делали.Общее качество рукописей было высоким, почти три четверти из рецензируемых публикаций. Остается неопределенность в отношении точности этих инструментов: только четверть была проверена, а различия в настройках и отчетности затрудняют обобщение и сравнение данных. Почти все исследования, предусматривающие как обучение, так и проспективные проверки, показали значительное снижение точности с предполагаемыми когортами. Также наблюдались расхождения в точности одних и тех же инструментов, таких как Национальный рейтинг раннего предупреждения (NEWS) и NEWS2, в разных странах с высоким уровнем дохода и доходом выше среднего.
Большинство выявленных инструментов предназначались для скрининга с последующей оценкой степени тяжести и сортировкой. Длина инструмента варьировалась, хотя большинство из них были короткими (от четырех до пяти вводов). Выявленные инструменты с меньшим количеством вводимых ресурсов, вероятно, будут более полезными в ЕС, но лишь небольшое количество инструментов было специально разработано для ЕС. Несмотря на влияние инструментов оценки степени тяжести на информирование пациентов о соответствующих вмешательствах и диспозиции, 10 не было доступной литературы, которая могла бы руководствоваться применением инструментов оценки степени тяжести в ЕС.Хотя существует значительная разница в представлениях детей и взрослых 18, очень немногие инструменты указывают целевую возрастную группу для использования. Это, в сочетании с отсутствием специальных педиатрических инструментов, предполагает необходимость дополнительного исследования соответствующих инструментов для выявления и риска неблагоприятных исходов при подозрении на COVID-19 в педиатрической популяции.
Скрининг — важное средство отделения пациентов с подозрением на заболевание от общей популяции при обращении в систему здравоохранения.Это особенно важно в случае LRS, где лабораторные исследования на COVID-19 ограничены19, а СИЗ и другие ресурсы должны быть сохранены на случай положительных результатов. Большинство инструментов скрининга, найденных в этом обзоре, рекомендовали проводить скрининг пациентов с использованием эпидемиологических факторов риска и симптомов, соответствующих определению случая подозрения на COVID-19, таких как кашель и лихорадка. Непроверенное использование таких инструментов может быть проблематичным по нескольким причинам. Во-первых, хорошо задокументировано, что существует плохая, неточная самооценка эпидемиологических факторов риска, включая контакты с другими пациентами и историю поездок.20 Влияние эпидемиологических данных в инструменте также ограничивается установлением широко распространенной передачи инфекции в сообществе, поскольку такая передача указывает на то, что почти все пациенты подвержены риску заражения. Ситуацию усугубляет тот факт, что значительная часть случаев COVID-19 протекает атипично, без обычных симптомов, которые поставщики проверяют на предмет использования этих инструментов.21 Например, одно исследование из 1099 подтвержденных случаев COVID-19 показало, что только 43,8% COVID -19 положительных случаев с лихорадкой.22 Более половины инструментов скрининга включали лихорадку в качестве симптома, и многие из них сочли необходимым соответствовать определению подозреваемого случая. Проблемы, связанные с получением правильных эпидемиологических данных и соответствием «типичным» определениям случаев, предполагают, что многие инструменты скрининга могут не эффективно выявлять пациентов с COVID-19. Кроме того, во многих LRS, где бремя инфекционных заболеваний велико, использование только лихорадки или кашля для идентификации и изоляции может быть недостаточно специфичным и создавать избыточное бремя подозреваемых случаев, что приводит к задержкам в оказании помощи и перекрестному заражению.23 Также вызывает озабоченность то, что, несмотря на намерение скрининга как быстрого метода первого прохождения для выявления пациентов с подозрением на COVID-19, многие опубликованные инструменты скрининга основывались на лабораторных исследованиях. Вероятно, что в ожидании результатов диагностики с этими пациентами должны быть предприняты строгие меры предосторожности, поскольку даже при самых высоких ресурсах получение лабораторных результатов требует времени. Ресурсы для принятия этих мер предосторожности почти повсеместно ограничены, а неточный скрининг может подвергнуть медицинских работников и пациентов ненужному риску.
После скрининга пациенты с подозрением на COVID-19 должны быть отсортированы для определения степени тяжести симптомов с использованием стандартного инструмента сортировки, проверенного контекстом.24 После этого пациенты должны быть дополнительно стратифицированы по риску с использованием инструмента оценки степени тяжести, чтобы руководить клиническим ведением и размещением в больнице. . Как среди инструментов сортировки, так и среди инструментов оценки степени тяжести не было единого мнения о ключевых данных для прогнозирования пациентов с COVID-19. Это неудивительно, учитывая новизну SARS-CoV-2 и многочисленные типичные и атипичные проявления болезни COVID-19.Несмотря на появляющиеся доказательства того, что любая сопутствующая патология, а также ожирение, цереброваскулярные заболевания, хроническая обструктивная болезнь легких, диабет, гипертония и курение в анамнезе коррелируют с вероятностью более тяжелого заболевания COVID-19, 25–27 практически нет согласия относительно того, какие сопутствующие заболевания следует использовать. включить в инструменты. Многие инструменты для сортировки и оценки серьезности включали возраст в качестве входных данных, согласующихся с крупномасштабными данными о том, что возраст является модификатором серьезности. Меньшее количество инструментов включало мужской пол, несмотря на аналогичные доказательства его прогностической ценности.26 27 Одышка, кашель и лихорадка использовались во многих инструментах. Сопутствующий метаанализ показал, что лихорадка и одышка были важными предикторами тяжелого заболевания COVID-19, в то время как кашель — нет27. температура — были замечены в инструментах сортировки и оценки серьезности. Хотя имеются ограниченные данные о полезности психического статуса для прогнозирования тяжести заболевания COVID-19, большинство отчетных исследований действительно указывают на то, что аномальное насыщение кислородом, частота дыхания, систолическое артериальное давление и температура являются важными предикторами плохого исхода.27
Хотя в литературе описано большое количество инструментов для скрининга, сортировки и оценки степени тяжести, использование LRS, вероятно, будет ограничено. Более половины инструментов скрининга, указанных в этом обзоре, вероятно, применимы в LRS, но только небольшое количество инструментов сортировки и оценки серьезности. Из инструментов, предложенных для использования в СНСД, 51–31 для скрининга, 5 для сортировки и 15 для оценки степени тяжести были сочтены возможными в LRS. Наиболее заметным из них был интегрированный процесс скрининга и сортировки, использованный Howitt et al. 28 в Тиморе-Лешти.Алгоритм был адаптирован из Ayebare et al 29 (Уганда) с удалением лабораторных тестов на COVID-19. Он использует хорошо обоснованные данные, включая сатурацию кислорода и респираторные симптомы, для быстрого выявления и прогнозирования потенциально положительных пациентов с COVID-19. Общий недостаток проверенных инструментов, особенно инструментов для оценки степени тяжести, привел к недавней разработке контекстно соответствующей шкалы смертности от COVID-19 для LRS.30 Хотя AFEM-CMS не включена в это исследование из-за исходных параметров поиска, она является прагматичной. инструмент, который использует семь демографических, исторических и клинических данных для оценки потенциального риска смерти у пациентов с COVID-19; второй инструмент включает пульсоксиметрию.Хотя во многих LRS EU отсутствуют пульсоксиметры, необходимые для оценки гипоксии, 8 эти устройства становятся все более доступными. Таким образом, в этом обзоре считалась возможной пульсоксиметрия при LRS.
Ограничения
Выполнимость не предсказывает, что инструмент будет точным или эффективным. Инструменты должны пройти валидацию в условиях предполагаемого использования. Этот обзор не обнаружил инструментов, проверенных в странах с низким доходом и доходом ниже среднего. Из тех, что были утверждены в странах с уровнем дохода выше среднего, почти все были из хорошо обеспеченных ресурсами районов Китая, что существенно ограничивает возможность обобщения для LRS.Без соответствующих контексту данных валидации трудно предсказать, эффективны ли возможные инструменты для выявления и стратификации риска пациентов с COVID-19.
Большинство инструментов, обсуждаемых в этом обзоре, были рецензируемыми публикациями или руководящими принципами авторитетных международных организаций, с меньшим количеством в виде редакционных статей, опубликованной переписки и препринтов. Последние формы публикации часто не рецензируются и могут быть более низкого качества. Кроме того, в этом обзоре, вероятно, отсутствует ряд инструментов.Практически каждая система здравоохранения во всем мире поддерживает те или иные процессы скрининга и сортировки, а также процессы принятия дальнейших решений относительно госпитализации. Хотя эти инструменты использовались как до, так и во время пандемии COVID-19, они не были официально опубликованы и не могут быть описаны здесь. Осуществимость LRS признавалась, если существовал хорошо описанный и мало затратный метод диагностики (например, определение случая в сочетании с аномалиями жизненно важных функций), даже если он не обязательно был золотым стандартом диагностики в условиях высоких ресурсов.Оценка риска предвзятости не могла быть проведена, потому что большинство статей были в форме описательных обзоров, а не представления первичных данных.
Выводы
В LRS, где окончательные диагностические тесты на COVID-19, такие как RT-PCR, могут быть недоступны, критически важны скрининг, сортировка и оценка степени тяжести потенциальных пациентов с COVID-19. Быстрая идентификация и прогнозирование пациентов с подозрением на COVID-19 в странах ЕС с LRS позволит принять соответствующие меры предосторожности и оказать помощь всем пациентам, что приведет к сохранению ресурсов и снижению заболеваемости и смертности.В настоящее время инструменты скрининга, сортировки или оценки степени тяжести специально для LRS не разработаны и не прошли валидацию. Перед лицом устойчивой пандемии крайне важно, чтобы такие инструменты были разработаны, валидированы и предоставлены, чтобы можно было сохранить ограниченные ресурсы для наиболее нуждающихся и предотвратить ненужные человеческие жертвы.
Заявление о доступности данных
Полный набор данных доступен по разумному запросу соответствующему автору.
Заявления по этике
Согласие пациента на публикацию
Не требуется.
Abstract CT124: исследование фазы Ib / II BMS-813160, двойного антагониста CC-хемокиновых рецепторов (CCR) 2/5, в комбинации с химиотерапией или ниволумабом у пациентов (пациентов) с распространенным раком поджелудочной железы или колоректального рака
Abstract
Предпосылки: Во время прогрессирования рака иммуносупрессивные клетки, такие как клетки миелоидного и лимфоидного происхождения, рекрутируются в микроокружение опухоли (TME) через взаимодействия между хемокинами и хемокиновыми рецепторами (CKR).CCR2 и CCR5 представляют собой CKR, экспрессируемые как на миелоидных, так и на Т-клеточных инфильтратах в TME, и было показано, что они опосредуют миграцию супрессорных клеток, происходящих из моноцитов / миелоидов (MDSC) и полиморфно-ядерных MDSC (PMN-MDSC), соответственно, из костного мозга. к крови и ТМЭ. CCR5 может также привлекать регуляторные Т-клетки к TME, усиливать иммуносупрессивную функцию PMN-MDSC через аргиназу-1 и поляризовать ассоциированные с опухолью макрофаги в иммуносупрессивный M2-фенотип. Включение CCR2 или CCR5 способствует созданию иммунодепрессивной среды и предотвращает противоопухолевый иммунитет; это было доклинически подтверждено на множестве типов опухолей, включая поджелудочную и колоректальную.Предварительные данные также подтверждают полезность комбинации с ингибированием PD- (L) 1. Клинически CCR2- и CCR5-селективные антагонисты по отдельности продемонстрировали доказательство механизма в комбинации с химиотерапией у пациентов с раком поджелудочной железы и колоректальным раком соответственно (1, 2). Эти обнадеживающие исследования поддерживают дальнейшие исследования двойного антагонизма CCR2 / 5 в обеспечении большей пользы для пациентов, чем CCR2- или CCR5-селективное ингибирование в сочетании с химиотерапией. Здесь мы описываем дизайн фазы 1b / 2, нерандомизированного открытого исследования BMS-813160 (низкомолекулярного двойного антагониста CCR2 / 5) в качестве монотерапии или в комбинации с химиотерапией или ниволумабом у пациентов с распространенным раком поджелудочной железы или колоректального рака ( NCT03184870).
Методы: Будет зарегистрировано примерно 260 пациентов в возрасте ≥ 18 лет с PS ECOG ≤ 1, адекватной функцией костного мозга и органов, а также возможностью пройти биопсию до и во время лечения. Критерии исключения включают предшествующее лечение ингибиторами CCR2 и / или CCR5, потребность в кортикостероидах / других иммуносупрессивных препаратах, метастазы в ЦНС, аутоиммунные заболевания и симптоматическое интерстициальное заболевание легких. В части 1 пациенты получат вводный курс по безопасности монотерапии BMS-813160 в течение 2 недель с последующей комбинацией с химиотерапией (5-фторурацил + лейковорин + иринотекан [колоректальный рак] или nab -паклитаксел + гемцитабин [рак поджелудочной железы]) или ниволумаб. .В части 2 пациенты будут получать либо те же схемы (без вводной монотерапии), либо монотерапию BMS-813160. Первичные результаты — безопасность, переносимость, частота объективных ответов, средняя продолжительность ответа и выживаемость без прогрессирования через 24 недели. Вторичные результаты — фармакокинетика и фармакодинамика BMS-813160 и иммуногенность ниволумаба.
Ссылки
1. Nywening TM, et al. Ланцет Онкол 2016; 17: 651-662.
2. Halama N, et al. Cancer Cell 2016; 29: 587-601.
Формат цитирования: Дунг Ле, Мартин Э. Гутьеррес, Мансур Салех, Эрик Чен, Атраи Басу Маллик, Майкл Дж. Пишваян, Юрген Краусс, Питер О’Дуайер, Игнасио Гарридо-Лагуна, Цихун Чжао, Анке Киппел, Сяоли Ван, Яли Лю, Эллисон Поллак, Ашвин Сама, Хайнц-Йозеф Ленц. Исследование фазы Ib / II BMS-813160, двойного антагониста CC-хемокиновых рецепторов (CCR) 2/5, в комбинации с химиотерапией или ниволумабом у пациентов (пациентов) с распространенным раком поджелудочной железы или колоректального рака [аннотация].В: Материалы ежегодного собрания Американской ассоциации исследований рака, 2018 г .; 14-18 апреля 2018 г .; Чикаго, штат Иллинойс. Филадельфия (Пенсильвания): AACR; Cancer Res 2018; 78 (13 Suppl): Аннотация № CT124.
CC-122 обладает устойчивой антипролиферативной активностью в модели совместного культивирования первичного хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) и превосходит леналидомид | Кровь
Предпосылки : Фактор транскрипции цинкового пальца семейства Икарос, Aiolos, активируется у более чем 80% пациентов с ХЛЛ, и данные свидетельствуют о том, что он может быть важным фактором выживаемости ХЛЛ и, следовательно, добросовестной целью для терапевтических целей. вмешательство.На сегодняшний день факторы транскрипции, такие как Aiolos, не поддаются лекарственной терапии. Мы и другие показали, что иммуномодулирующие препараты IMiDs ™, такие как леналидомид (LEN), связывают цереблон (CRBN), субстратный рецептор убиквитин-лигазного комплекса Е3 кулинового кольца (CRL4 CRBN ) и способствуют убиквитинизации и последующей протеосомной деградации лимфоидной транскрипции. факторы Икарос и Айолос. Такие идеи сыграли решающую роль в проектировании и разработке аналогов IMiD следующего поколения.CC-122 — это новый нефталимидный, первый в своем классе препарат-модификатор плейотропного пути PPM ™, обладающий антипролиферативными, антиангиогенными и иммуномодулирующими свойствами. CC-122 специфически нацелен на CRBN и способствует деградации Aiolos и Ikaros. В настоящее время мы исследовали влияние LEN и CC-122 на пролиферацию CLL и деградацию Aiolos и Ikaros в когорте первичных случаев CLL с использованием системы совместного культивирования i n vitro , основанной на экспрессирующих CD154 фибробластах мыши и экзогенном IL- 21, который воспроизводит микросреду in vivo CLL.
Результаты: Сорок образцов PBMC первичных пациентов с CLL, отобранных для представления различных прогностических подгрупп, культивировали в средах с добавлением LEN, CC-122 или контроля и оценивали с помощью анализа включения BrdU. Среди этих проанализированных образцов были идентифицированы четыре различных подмножества «ответа». В подгруппе 1 (n = 10, 25% случаев) мы обнаружили, что CC-122 превосходит LEN в ингибировании пролиферации (среднее IC50: LEN 5,7 мкМ; CC-122 1,2 мкМ). Подгруппа 2 (n = 23; 57% случаев) была чувствительна к CC-122, но не реагировала на LEN.В этих случаях CC-122 ингибировал пролиферацию по крайней мере на 50% при концентрации ≤3 мкМ, несмотря на неспособность LEN (IC50:> 10 мкМ) ингибировать пролиферацию, что подчеркивает качественное различие между двумя агентами. В подгруппе 3 антипролиферативная активность CC-122 и LEN была сопоставимой (n = 2,5% случаев). Наконец, и CC-122, и LEN были неактивными (до 10 мкМ) в подмножестве 4 th (n = 5; 12% случаев). Впоследствии мы исследовали связи между активностью CC-122 и известными прогностическими факторами риска ХЛЛ в этих выборках.В 5 из 6 случаев с делецией 17p CC-122 ингибировал пролиферацию (IC50: <0,3-0,8 мМ). Аналогичным образом, в 4 из 6 случаев с дефектом 11q активен CC-122 (IC50: 0,8–3 мкМ). В целом эффективность любого из препаратов в подавлении пролиферации клеток ХЛЛ не зависела от установленных прогностических переменных (например, статус мутации IgVH, цитогенетические аномалии и т. Д.) Или предшествующего лечения (например, хлорамбуцила, флударабина, алемтузумаба и т. Д.). Предварительные исследования клеток CLL демонстрируют широкие различия в исходных уровнях Ikaros, Aiolos и CRBN между отдельными случаями, измеренными с помощью проточной цитометрии и / или вестерн-блоттинга.Мы показываем, что обработка клеток CLL CC-122 или LEN приводит к различной деградации Ikaros (LEN 0-100%; CC-122 55-100%) и Aiolos (LEN 72-100%; CC-122 97-100%). ) по сравнению с необработанными контролями. Следует отметить, что CC-122 неизменно превосходил LEN в способствовании деградации Aiolos и Ikaros. Напротив, уровни CRBN, молекулярной мишени CC-122 и LEN, не были затронуты ни одним из соединений. Прогностическая ценность исходной экспрессии Aiolos, Ikaros и CRBN, а также их деградации под действием CC-122 в отношении клеточного ответа в настоящее время оценивается.
Выводы : Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что CC-122 обладает устойчивой антипролиферативной активностью в первичных клетках CLL посредством уникального механизма избирательной деградации факторов транскрипции Aiolos и Ikaros. CC-122 превосходит LEN и активен в нескольких прогностических целях. Кроме того, мы демонстрируем значительную активность CC-122 даже в случаях, которые не реагируют на LEN, что позволяет предположить, что CC-122 нацелен на новый путь в CLL. Эти данные предполагают, что необходимы дальнейшие оценки CC-122 в доклинических и клинических исследованиях в качестве единственного агента или в комбинации с известными или новыми соединениями (такими как ингибиторы Btk и PI3Kd).
Раскрытие информации
Blocksidge: Celgene: Финансирование исследований. Glenn: Celgene: Финансирование исследований. Ганди: Celgene Corp: Занятость, владение акциями. Klippel: Celgene: Занятость, владение акциями. Pourdehnad: Celgene: Занятость, долевое участие. Чопра: Celgene Corp: Занятость, владение акциями. Kalakonda: Celgene: Финансирование исследований.
Структура и функция дрожжевого Lso2 и человеческого CCDC124, связанных с гибернирующими рибосомами
Цитирование: Wells JN, Buschauer R, Mackens-Kiani T, Best K, Kratzat H, Berninghausen O, et al. (2020) Структура и функция дрожжевого Lso2 и человеческого CCDC124, связанных с гибернирующими рибосомами. PLoS Biol 18 (7): e3000780. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780
Академический редактор: Джейми Х. Д. Кейт, Калифорнийский университет, Беркли, США
Поступила: 21 апреля 2020 г .; Принят в печать: 1 июля 2020 г .; Опубликовано: 20 июля 2020 г.
Авторские права: © 2020 Wells et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Все файлы молекулярных моделей доступны в PDB со следующими идентификаторами PDB: родной Lso2-80S: 6Z6J восстановленный Lso2-80S: 6Z6K, CCDC124-80S: 6Z6L, eEF2 / SERBP1-80S: 6Z6M, EBP1 -80S: 6Z6N). Все крио-ЭМ карты доступны в EMD (родной Lso2-80S: EMD-11096, восстановленный Lso2-80S: EMD-11097, CCDC124-80S: EMD-11098, eEF2 / SERBP1-80S: EMD-11099, EBP1-80S : EMD-11100).
Финансирование: Финансирование было предоставлено Немецким исследовательским советом по грантам GRK1721 и FOR1805 (https://www.dfg.de/) для Р. Бекманна. Мы признательны за поддержку Центру комплексных исследований белка в Мюнхене (CiPS-M). Р. Бушауэр поддерживается стипендиатом Boehringer Ingelheim Fonds PhD, а JW является частью Международной школы исследований естественных наук Макса Планка. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Сокращения: А, акцептор; ABC, Кассета связывания АТФ; ABCE1, Член 1 подсемейства E кассеты для связывания АТФ; Arx1, связанный с рибосомным экспортным комплексом белок 1; CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; крио-ЭМ, криоэлектронная микроскопия; CTF, функция передачи контраста; РЕЗЮМЕ, объем колонки; Дом34, дупликация мультилокусной области; Д.м., Drosophila melanogaster ; E, выход; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; eEF2, фактор элонгации эукариот 2; eIF6, фактор инициации эукариот 6; ePAR-CLIP, Сшивание и иммунопреципитация, усиленные фотоактивируемыми рибонуклеозидами, с улучшенным методом приготовления библиотеки CLIP; GAC, Центр активации GTPase; Hbs1, Супрессор подсемейства B Hsp70; HEK, эмбриональная почка человека; HPF, фактор, способствующий гибернации; ЧАС.с., Homo sapiens ; IFRD2, регулятор развития 2, связанный с интерфероном; LHPF, фактор, способствующий длительной гибернации; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; MetAP, метионинаминопептидаза; NatA, Nα-ацетилтрансфераза A; П, пептидил; pY, белок Y; RAC, комплекс, связанный с рибосомами; RaiA, связанный с рибосомами ингибитор 1; RBF, рибосомальный связывающий фактор; Rli1, Ингибитор РНКазы L 1; RMF, фактор модуляции рибосомы; Sec61, секреторный белок 61; SERBP1, МРНК-связывающий белок 1 SERPINE1; SRP, сигнальная частица распознавания; Стм1, супрессор мишени белка Myb 1; С.с., Saccharomyces cerevisiae ; β-ME, β-меркаптоэтанол
Введение
Рибосомы — это универсально консервативные биологические машины, которые переводят генетическую информацию из матриц мРНК в полипептиды с соответствующей аминокислотной последовательностью. Поддержание функциональности рибосом жизненно важно для выживания клеток при любых обстоятельствах. Следовательно, появились регуляторные механизмы, которые облегчают переход аппарата трансляции между активным и неактивным состояниями.Это позволяет клеткам динамически адаптироваться к изменениям доступности питательных веществ в окружающей среде.
Клеточный стресс, вызванный голоданием по питательным веществам, и обратимая репрессия трансляции особенно хорошо изучены у прокариот. У бактерий было идентифицировано несколько малых факторов связывания рибосом (RBFs), которые ингибируют трансляцию и способствуют обратимому образованию неактивных димеров 100S рибосом [1,2]. Образование димеров 100S позволяет рибосомам переходить в состояние гибернации во время стационарных фаз роста или стресса [3–5].Внутри гибернационных бактериальных рибосом RBF (фактор модуляции рибосомы [RMF], фактор, способствующий гибернации [HPF] и связанный с рибосомой ингибитор A [RaiA]) связываются с центром декодирования, занимают канал связывания мРНК и блокируют акцептор (A) и пептидил ( P) сайты тРНК [6–8]. В результате факторы гибернации бактерий защищают важные активные центры рибосомы и ингибируют связывание как мРНК, так и тРНК, полностью блокируя трансляцию [9].
Несколько типов неактивных или гибернирующих рибосом также наблюдались у эукариот [10,11].В общем, неактивные рибосомы 80S накапливаются в эукариотических клетках после воздействия различных стрессов, таких как нехватка аминокислот [10,12], осмотический стресс [13] или голодание по глюкозе [14,15]. Чтобы перезапустить трансляцию после стресса, эти 80S должны быть диссоциированы, чтобы повторно заселить пул свободных 40S для инициации. Дупликация системы расщепления мультилокусной области 34 (Dom34), содержащей гомологи фактора терминации Dom34 (Pelota у млекопитающих), супрессор 1 подсемейства B Hsp70 (Hbs1) и ингибитор 1 АТФазы РНКазы L типа АТФ-связывающей кассеты (Rli1). ; ATP-связывающая кассета, член подсемейства E [ABCE1] у млекопитающих), как было показано, диссоциирует вакантные рибосомы у дрожжей [15] и млекопитающих [16].Первый фактор гибернации эукариот, супрессор мишени белка Myb 1 (Stm1), был обнаружен в кристаллических структурах дрожжевых рибосом 80S, которые были получены из клеток после 10 мин голодания по глюкозе [17]. Stm1 и его мРНК-связывающий белок 1 (SERBP1), гомолог млекопитающих, скрепляют рибосомные субъединицы вместе и, подобно бактериальным факторам гибернации, связываются в канале входа мРНК, а также в сайтах A и P 40S, тем самым занимая сайты, важные для переводческая деятельность [17].
Было показано, что несущественный белок Stm1 играет защитную роль в Saccharomyces cerevisiae ( S . c .), В котором он поддерживает восстановление трансляции после покоя [18,19] и нокаут Stm1 в дрожжах. подавляет требование системы расщепления Dom34 перезапускать трансляцию после голодания по глюкозе [15]. Это указывает на то, что неактивные 80S, лишенные Stm1, менее стабильны in vivo. Гомологи Metazoan Stm1 также наблюдались связанными с неактивными рибосомами из Drosophila melanogaster ( D . m .) И Homo sapiens ( H . s .), Что свидетельствует о высокой степени функциональной сохранности [20]. Примечательно, что эти рибосомы также содержат тРНК в сайте выхода из рибосом (E) и фактор элонгации эукариот 2 (eEF2) [20]. Присутствие eEF2 и тРНК E-сайта позже было обнаружено также на неактивных рибосомах, полученных из лизатов ретикулоцитов кролика [11]. В той же системе был обнаружен другой тип неактивных рибосом, содержащих плохо охарактеризованный белок-интерферон-связанный регулятор развития 2 (IFRD2) и тРНК в новом определенном положении, рядом с E-сайтом, названном Z-сайтом [11].Однако образование, высвобождение и молекулярная функция задействованных RBFs остаются загадочными для всех типов гибернирующих эукариотических рибосом.
Недавно был открыт другой эукариотический RBF, ответственный за защиту и восстановление трансляции: короткая открытая рамка считывания 2 (Lso2) с поздней аннотацией в S . c ., Который очень гомологичен домену coiled-coil, содержащему короткую открытую рамку считывания 124 (CCDC124) в клетках человека [21]. На основании исследований химического сшивания, Lso2 конститутивно связывается с моносомами 80S и связывается вблизи тРНК и со спиралями рРНК h53 и h54 [21].Это взаимодействие между Lso2 и рибосомами, по-видимому, облегчает реактивацию трансляции при повышении уровня питательных веществ и выходе из стационарной фазы. Отсутствие Lso2, по-видимому, влияет на трансляцию на стадии инициации, о чем свидетельствует глобальное 4-5-кратное снижение ассоциации рибосом с большинством мРНК в LSO2 -нокаутных клетках ( lso2Δ ) во время восстановления. Рибосомы из lso2Δ демонстрируют дополнительные функциональные дефекты, в том числе измененную чувствительность к РНКазе I и измененную аккомодацию тРНК в A-сайте, что определяется увеличением частоты паузы в стартовых кодонах и обогащением 21-мера в рибосомном профиле, что указывает на пустые A-сайты [21, 22].Способ взаимодействия рибосом и, следовательно, молекулярная основа этих эффектов Lso2, не изучены.
Здесь мы структурно охарактеризовали взаимодействие между Lso2 и CCDC124 с 80S рибосомами эукариот с помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), чтобы выяснить, как связывание этих белков может модулировать трансляционную активность во время и после голодания. Мы воссоздали Lso2 с помощью холостых рибосом 80S из очищенных компонентов, а также охарактеризовали нативные холостые рибосомы 80S, полученные из дрожжей, выращенных в условиях ограничения питательных веществ в минимальной среде, и из клеток человека (эмбриональной почки человека [HEK] 293T), собранных при высокой конфлюэнтности.Структуры с высоким разрешением дрожжевых комплексов Lso2–80S и CCDC124–80S человека обнаруживают почти идентичные способы связывания Lso2 и CCDC124 с рибосомами. В холостых рибосомах эти факторы занимают позицию P-сайта субъединицы 40S, включая сайты связывания мРНК и тРНК. Более того, они связывают субъединицу 60S в сайтах A и P и достигают близко к основанию стебля и центру активации GTPase (GAC) [23]. Неожиданно мы обнаружили, что большая часть 80S человека занята ErbB3-связывающим белком 1 (EBP1) — гомологом фактора биогенеза рибосом, «связанного с белком 1 комплекса экспорта рибосом» (Arx1), — связанным с выходом пептидного туннеля из 60S [24].Примечательно, что мы наблюдаем, в дополнение к классу, содержащему невращенный 80S, связанный с CCDC124, ранее описанный неактивный 80S, связанный с SERBP1 и eEF2 в повернутом состоянии. Эти человеческие SERBP1 / eEF2 80S сходны с неактивными Stm1-связанными в кристаллических структурах дрожжевых рибосом [17], предполагая, что у эукариот существует по крайней мере 2 функционально различных пула холостых рибосом. Исследуя их функциональное различие, мы показываем, что только содержащие Lso2, но не содержащие Stm1, неактивные 80S могут быть легко разделены системой разделения Dom34.Это настоятельно предполагает функцию Lso2 в обеспечении пула легко перерабатываемых 80S для быстрого возобновления трансляции после нехватки питательных веществ.
Результаты
Идентификация Lso2, связанного с рибосомами 80S бездействующих дрожжей
Для структурного анализа рибосом, связанных с Lso2, мы реконструировали неактивные 80S рибосомы из S . с . in vitro с 10-кратным молярным избытком очищенного рекомбинантного Lso2 в определенных условиях (см. «Материалы и методы») и выполняли крио-ЭМ с одной частицей.Из трехмерной классификации (S1A рис.) Мы получили 1 класс, демонстрирующий нерибосомную спиралевидную дополнительную плотность между большой и малой субъединицей (рис. 1A). После уточнения мы получили структуру со средним разрешением 3,4 Å и локальным разрешением для Lso2 в диапазоне 3,2–4,5 Å (рис. 1A, слева и S1D рис.), Что позволило нам построить атомную модель для Lso2 (рис. 1A, посередине, S2 Рис и S1 Таблица).
Рис. 1. Идентификация Lso2, связанного с холостыми 80S рибосомами.
(A) Слева: крио-ЭМ-карта с разрешением 3,4 Å восстановленного in vitro дрожжевого комплекса Lso2–80S; α-спиральная дополнительная плотность для Lso2 (красный цвет) обнаружена в межсубъединичном пространстве.В центре: атомная модель комплекса Lso2–80S. Справа: крио-ЭМ карта с разрешением 3,5 Å, полученная из нативного препарата рибосомы 80S из клеток, выращенных в условиях ограничения питательных веществ. (B – D): виды сверху структуры Lso2–80S, наложенной на структуру дрожжей 80S в невращенном состоянии (B) (PDB: 6Q8Y [25]) и дрожжей 80S в состоянии повернутого-2 (C). (PDB: 5JUP [26]), демонстрируя различия между малой субъединицей 18S рРНК в 2 состояниях вращения. (D) Тот же вид, что и C, иллюстрирующий положение аккомодированных тРНК и мРНК A- и P-сайтов (PDB: 5MC6) [27].Все структуры были выровнены по субъединице 60S. Обозначены отличительные черты рибосомы 80S. А — акцептор; ЦП — центральный выступ; крио-ЭМ, крио-электронная микроскопия; GAC, центр активации GTPase; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Р, пептидил; PDB, Банк данных белков.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.g001
Lso2 связан исключительно с неактивным 80S в нерецепторной / невращенной конформации, как, например, наблюдается в рибосомах 80S, застрявших с пустым сайтом A [ 25] (рис. 1B).Это необычно, потому что бездействующие дрожжи 80S обычно наблюдаются в основном в повернутом состоянии (Рис. 1C), независимо от присутствия Stm1 [17,28,29]. В нашей структуре Lso2 состоит из 2 α-спиралей, соединенных короткой петлей (S1 и S2 фиг.). Первая спираль Lso2 расположена в межсубъединичном пространстве между малой и большой субъединицей. Более конкретно, он занимает сайт связывания P-тРНК и канал мРНК в сайтах P и E малой субъединицы. (Рис. 1D). Отсюда Lso2 соединяется с сайтом A субъединицы 60S, посредством чего вторая спираль тянется ниже центрального выступа и простирается к GAC и основанию стебля.В этом положении Lso2 д. Перекрываться с размещенной тРНК A-сайта (Рис. 1D). В заключение, Lso2 занимает сайты связывания мРНК и тРНК на рибосоме, которые должны быть доступны для трансляции, тем самым подтверждая функцию Lso2 как фактора гибернации рибосом.
Подтверждая реконструированную структуру комплекса Lso2–80S, мы определили нативную структуру Lso2-связанных 80S рибосом (рис. 1A, справа), которую мы обнаружили в дрожжевых клетках, культивируемых в минимальной среде. Обширная классификация (S1B Fig) дала структуру комплекса Lso2–80S на уровне 3.Разрешение 5 Å, которое было практически неотличимо от структуры восстановленного комплекса in vitro (рис. S2 и таблица S1). Мы пришли к выводу, что также in vivo Lso2 предпочтительно связывается с пустыми не повернутыми 80S рибосомами в той же конформации, что и при восстановлении in vitro.
Lso2 взаимодействует с сайтами связывания рибосомной тРНК и мРНК
Локальное разрешение в межсубъединичном пространстве позволило нам однозначно идентифицировать Lso2 и описать его взаимодействия с рибосомами на основе разрешения боковой цепи (Figs 2 and S2).Основное взаимодействие Lso2 с субъединицей 40S формируется положительно заряженным N-концом Lso2, который проникает в канал мРНК сайтов P и E (рис. 2A). Здесь остатки Lso2 от G2 до S6 взаимодействуют в щели между спиралями рРНК h34, h38 и h54 (рис. 2A). Более подробно, Lso2 F5 складывается с основаниями G1150 h38 и G1768 h54, взаимодействие, вероятно, поддерживается несколькими солевыми мостиками и водородными связями, образованными между высокообогащенными, положительно заряженными остатками Lso2 (K3, R4, K11, K12) и отрицательно заряженная 18S рРНК (рис. 2В).Таким образом, N-конец Lso2 занимает место, в котором в активной рибосоме будут располагаться последние 2 основания мРНК из кодона E-сайта и первое основание мРНК из кодона P-сайта.
Рис. 2. Взаимодействие Lso2 с рибосомой.
(A) Расположение Lso2 относительно малой субъединицы. (B) Увеличьте масштаб взаимодействия Lso2 в сайтах P и E 40S: N-конец Lso2 проникает в щель между спиралями рРНК h34, h38 и h54 18S рРНК. Все взаимодействия водородной связи и солевого мостика показаны пунктирной линией.(C) Расположение Lso2 относительно большой субъединицы. (D) Lso2 связывается с большой субъединицей рядом с CP через петлю, соединяющую спираль. Во взаимодействиях участвуют рибосомные белки uL5 и eL42, а также H84 и H85 25S рРНК. (E) C-концевая α-спираль Lso2 проходит через большую бороздку h48A и uL16 по направлению к основанию ножки, образованному h53 и h54 (GAC) и P-ножкой. Конечный C-конец Lso2 отсутствует, но может быть расположен очень близко к P-стержню. БК, клюв; ЦП — центральный выступ; DCC, Центр декодирования; E, выход; GAC, центр активации GTPase; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Р, пептидил; PTC, центр пептидилтрансферазы.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.g002
Выступая из сайта 40S P, плотность для первой спирали Lso2 заканчивается около центрального выступа большой субъединицы (Рис. 2C). Соединительная петля представляет собой важный интерфейс с участием рибосомных белков uL5 и eL42, а также 25S рРНК. Более подробно, Lso2 W42 размещается в кармане, образованном R55 и R60 от uL5 и F106 от C-конца eL42 (Рис. 2D). Дальнейшие взаимодействия между остатками Lso2 E38, G45 и R47 с uL5 Y52 и R55, а также между Lso2 N50, K52 и K53 и фосфатным остовом спиралей 25S рРНК H84 и H85 хорошо разрешены (S2C и S2D, фиг.).Вторая прямая спираль Lso2 продолжается вдоль большой бороздки спирали рРНК h48A (также известной как палец A-сайта) и uL16 по направлению к основанию ножки и P-ножке (Fig 2E). Примечательно, что и палец A-сайта, и uL16 являются сайтами контакта для локтевой области тРНК A-сайта во время аккомодации и транслокации [30–32]. В нашей структуре эти контактные сайты заблокированы Lso2. Сшивание и иммунопреципитация с фотоактивируемыми рибонуклеозидами с улучшенным методом приготовления библиотеки CLIP (ePAR-CLIP) предполагают прямое взаимодействие Lso2 со спиралями рРНК h53 / h54 GAC [21].Это взаимодействие, скорее всего, устанавливается конечным C-концом Lso2, который не разрешен на наших картах из-за высокой степени гибкости.
У эукариот присутствуют два различных неактивных вида рибосом.
Поскольку Lso2 законсервирован у высших эукариот [21], мы расширили наши исследования его роли как фактора голода для человеческой системы. С этой целью рибосомы 80S человека получали из культуры HEK293T с высокой плотностью клеток. Масс-спектрометрия подтвердила присутствие гомолога Lso2 CCDC124, а также SERBP1, eEF2 и EBP1.CCDC124 и EBP1 также были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга (S3 фиг.).
Крио-ЭМ анализ этого образца выявил 2 основных класса гибернирующих рибосом 80S (S4A фиг.). Один класс показал спиральную плотность, очень похожую на плотность Lso2 на дрожжевой рибосоме, которая снова приняла невращенное состояние. Как и ожидалось, плотность соответствовала CCDC124. Интересно, что тот же класс также обнаруживал плотность, соответствующую EBP1 в сайте выхода пептида [33–35], а также тРНК в сайте E.Второй класс также содержал тРНК EBP1 и E-сайта, но вместо CCDC124 присутствовали SERBP1 и eEF2, и рибосомы были стабилизированы в повернутом состоянии, как ранее наблюдалось в крио-ЭМ структурах неактивных 80S рибосом из D . м . и H . с . [11,20].
Оба класса, а также объединенный класс всех частиц, содержащих EBP1, были уточнены независимо (S4B – S4D, рис.), И была построена молекулярная модель для человеческого CCDC124 – EBP1–80S, SERBP1 – eEF2 – EBP1–80S. комплекс, и комплекс EBP1–80S, для которого были очищены все частицы, содержащие EBP1 (рис. 3A и 3B, а также таблица S5 и S1).
Рис. 3. Связывание Lso2 и CCDC124 рибосомами эволюционно консервативно.
(A) КриоЭМ-карта с разрешением 3,0 Å рибосомы CCDC124 – EBP1–80S человека. Реконструкция также содержит тРНК E-сайта. Плотность CCDC124 отображается на другом уровне контура, чем карта рибосом. (B) Атомная модель комплекса CCDC124 – EBP1–80S. (C) Консервативные остатки, показанные при выравнивании последовательностей CCDC124 с Lso2. (D) Суперпозиция Lso2–80S с моделями CCDC124–80S на основе 25S рРНК демонстрирует очень похожее расположение, указывая на высококонсервативный режим связывания.CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; ЦП — центральный выступ; крио-ЭМ, крио-электронная микроскопия E, выход; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; GAC, центр активации GTPase; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Р, пептидил; PTC, центр пептидилтрансферазы.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.g003
Режим связывания рибосом Lso2 и CCDC124 высококонсервативен
Что касается дрожжевого комплекса Lso2–80S, локальное разрешение структуры человека было достаточным, чтобы однозначно приписать спиральную плотность CCDC124 и описать его взаимодействия с рибосомами (рис. 3E и S4B-4D и таблица S5 и S1).Положение и ориентация CCDC124 в сайтах A и P 40S была почти идентична по сравнению с гомологом дрожжей, что указывает на консервативный режим связывания (фиг. 3). Связывание рибосом опосредуется остатками, консервативными из S . с . к H . с . (Рис. 3C), включая W39 (W42 в S . c .), Который играет важную роль в установлении основного контакта с 60S в сайте P.
В деталях, N-концевая спираль CCDC124 занимает такое же пространство, как Lso2 в положениях мРНК P- и E-сайтов (Рис. 3D), но электронная плотность для N-концевой спирали была слабее, чем для C-концевой. один, скорее всего, из-за более высокой общей гибкости субъединицы 40S.Разрешение 3.0 Å было достаточным для построения молекулярной модели, начиная с K11. Как и в случае Lso2, первая спираль тянется к субъединице 60S. В соединительной петле W39 из CCDC124 (аналогично W42 в Lso2) размещается на 60S в связывающем кармане, образованном uL5, R58 и R63 (S5C, фиг.). В отличие от дрожжевых контактов Lso2, однако, eL42 не участвует в связывании CCDC124 (рис. 3E). Таким образом, стэкинг-взаимодействие между W42 Lso2 и F106 eL42 не является консервативным в человеческом комплексе.Тем не менее, это компенсируется наложением между Y38 и W39 CCDC124. В общем, петля, соединяющая спираль, использует несколько иной путь, хотя вторая спираль наблюдается в почти таком же положении, как и в Lso2 (Рис. 3D). Аналогично тому, что мы наблюдаем в структурах Lso2, присутствие CCDC124 запрещает аккомодацию тРНК A-сайта, и опять же, удлиненный C-концевой хвост не разрешается (Figs 3D and S5D). В заключение, CCDC124 занимает интерфейсы связывания тРНК A- и P-сайтов, а также мРНК на рибосоме человека, конгруэнтной сайту связывания Lso2 у дрожжей (рис. 3D и 1D).
Второй основной класс гибернирующих рибосом человека, которые мы наблюдали и уточнили до 3,1 Å, согласуется с предыдущими сообщениями о структурах в повернутом состоянии, более конкретно, о «состоянии повернутого-2», которое происходит, когда 80S занят гибридом A / P- и P / E тРНК (рис. 1C) [26]. В дополнение к тРНК типа II, отображающей расширенную V-петлю в сайте E, она содержит eEF2 и SERBP1 (рис. 4). Подобно Stm1, SERBP1 вместе с eEF2 связывается в канале входа мРНК и предотвращает связывание мРНК в сайтах A и P [11,17–20].Важно отметить, что связывание SERBP1 и CCDC124 является взаимоисключающим.
Рис. 4. Спящие рибосомы человека связаны с EBP1 на участке выхода пептида.
(A) Вид сбоку и снизу модели человека eEF2 – SERBP1 – EBP1–80S, построенный на основе криоЭМ карты с разрешением 2,9 Å. (B) EBP1 координирует часть участка экспансии рРНК ES27L ниже выхода пептидного туннеля. Спираль фиктивной РНК использовалась в качестве заполнителя для ES27L. (C) Увеличьте масштаб вставки домена EBP1, достигающего щели между uL23 и H59.крио-ЭМ, крио-электронная микроскопия; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; eEF2, фактор элонгации эукариот 2; SERBP1, мРНК-связывающий белок SERPINE1 1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.g004
EBP1 связывается с сайтом выхода пептида гибернирующих рибосом человека
Мы отмечаем, что в наших условиях рибосомы человека оказываются стабильно связанными с EBP1 на выходе из туннеля (рис. 4 и S6), независимо от состояния рибосом и факторов, занимающих сайты связывания мРНК и тРНК.EBP1 является человеческим гомологом дрожжевого фактора биогенеза рибосом Arx1 [34,36], который также связывается с сайтом выхода из рибосомы и связан с метионинаминопептидазами (MetAP) [36,37]. Кроме того, было описано, что EBP1 участвует в пролиферации клеток [38] и раке человека [39].
Мы получили структуру EBP1–80S при общем разрешении 2,9 Å, показывающую, что EBP1 прикреплен к сайту выхода пептида через рибосомные белки uL23, eL19 и uL29, а также спираль 28S рРНК H59 (рис. 4C и S6).Также подобно Arx1 в дрожжах, он координирует часть гибкого сегмента экспансии рРНК ES27L в определенном положении ниже выхода туннеля. Его ранее описанный домен вставки (остатки 250–305) [36] взаимодействует со спиралью рРНК H59 в перестроенной конформации и проникает в щель между uL23 и H59 (S6A Fig). На кончике спирали рРНК H59 основание U2708 перевернуто и складывается с EBP1 F266 (рис. 4C), в то время как C2709 зажат между R263 EBP1 и Q40 eL19. Эти взаимодействия поддерживаются дополнительными контактами между его MetAP-подобным доменом и uL23 и uL29 (рис. 4B).Интересно, что EBP1 имеет такой же режим взаимодействия с рибосомой, как и возникающие факторы, взаимодействующие с цепью, такие как связанный с рибосомой комплекс (RAC), частица распознавания сигнала (SRP), секреторный белок 61 (Sec61) или N-α-ацетилтрансфераза A ( NatA) [40–43], и присутствие EBP1 не позволило бы одновременное связывание любого из вышеупомянутых факторов (S6C фиг.).
Lso2-связанные, но не связанные с Stm1, 80S разделяются каноническими коэффициентами рециклинга
Наш крио-ЭМ анализ гибернации 80S человека предполагает, что у эукариот существуют по крайней мере 2 четко различимые популяции неактивных, трансляционно репрессированных 80S.Эти 80S связаны либо с Stm1 / SERBP1 вместе с eEF2, либо с Lso2 (CCDC124). Помимо различных составов факторов, их основным отличием является конформация рибосомы: Stm1 / SERBP1-содержащие 80S до сих пор наблюдались исключительно в повернутых состояниях [11,17,20,26], тогда как Lso2- или CCDC124-связанные 80S были обнаружены в невращенном состоянии (рис. 1B и 1C), сходном с посттранслокационным состоянием с тРНК в сайтах P и E и пустом сайте A [25,44]. Таким образом, Lso2 (CCDC124) на 80S занимает положение, которое исключает одновременное присутствие основного аппарата трансляции (тРНК A-сайта, тРНК P-сайта, мРНК) (рис. 1D) и одновременно стабилизирует конформацию невращающейся рибосомы [26].Примечательно, что комплексы Dom34-Hbs1 и Dom34-ABCE1 предпочтительно связываются с рибосомами в невращенном пост-состоянии (Рис. 5A и 5B) [45–49]. В повернутом состоянии, которое стабилизируется с помощью Stm1, эти факторы будут конфликтовать с самой рибосомой (S7 фиг.) И с eEF2, если присутствует. Таким образом, мы предположили, что связанные с Lso2 80S рибосомы являются субстратом для системы расщепления Dom34, и проверили нашу гипотезу с помощью анализа расщепления рибосом in vitro. С этой целью восстановленные комплексы Lso2–80S инкубировали с очищенным Dom34, Hbs1 – GTP, ABCE1 – ATP и эукариотическим фактором инициации 6 (eIF6), фактором, который предотвращает реассоциацию субъединиц [50,51].Реакции расщепления подвергали центрифугированию в градиенте плотности сахарозы, и УФ-профили градиентов получали при 260 нм (фиг. S8 и данные S1).
Рис. 5. Анализ расщепления in vitro с Lso2–80S и Stm1–80S.
(A и B) Lso2–80S в невращенном состоянии (показан как рисунок) был перекрыт факторами восстановления рибосом Dom34 и Hbs1 (PDB: 3IZQ) [45] или Dom34 и ABCE1 (PDB: 3J16) [46]. В обеих конформациях Dom34 может размещаться внутри A сайта 40S и не будет конфликтовать с Lso2, что приводит к гипотезе, что система расщепления Dom34 предпочтительно расщепляет Lso2–80S.(C и D) репрезентативные профили градиента сахарозы из анализов расщепления, проведенных без (C) или с (D) факторами расщепления; необработанные данные можно найти в S1 Data. (E) Количественная оценка относительного расщепления, отображаемого как кратное изменение по сравнению с отрицательными контролями (эксперименты без факторов расщепления), нормализованное к контрольному эксперименту с использованием обработанного пуромицином пустого 80S (см. Также S8 и S9, фиг. И S2 данные). Все эксперименты проводили в трех экземплярах. А — акцептор; Dom34, дупликация мультилокусной области 34; Супрессор подсемейства B Hbs1, Hsp70; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; PDB, банк данных белков; Stm1, супрессор мишени белка Myb 1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.g005
Мы наблюдали, что в почти физиологических буферных условиях восстановленные рибосомы Lso2–80S были почти количественно расщеплены, даже более эффективно, чем обработанные пуромицином / высоким содержанием соли. пустые 80S рибосомы (рис. 5D – 5E и данные S9 и S2).
Расщепление Lso2–80S зависело от присутствия нуклеотидов (1 мМ АТФ, 1 мМ GTP), а также Dom34 и ABCE1 [15,52]. Также согласуется с этими исследованиями наблюдение, что Hbs1, хотя и необходим in vivo [15], не требуется для расщепления рибосом in vitro [16].Это указывает на то, что действительно ферментативная активность ABCE1 во взаимодействии со связыванием Dom34 с сайтом A была необходима для расщепления связанных с Lso2 80S рибосом (фиг. S10 и данные S3). Хотя присутствие eEF2 не позволяет системе Dom34-ABCE1 непосредственно действовать на Stm1 / SERBP1-содержащий 80S, мы задались вопросом, зависит ли расщепление системой Dom34 от невращающейся конформации, индуцированной Lso2. С этой целью мы протестировали Stm1-содержащие дрожжевые 80S рибосомы, полученные после голодания по глюкозе, которые, как известно, находятся в повернутом состоянии и имеют тенденцию терять большую часть связанного eEF2 во время центрифугирования [17].Как и ожидалось, комплексы Stm1–80S оказались по существу устойчивыми к расщеплению системой Dom34, аргументируя это тем, что невращающаяся конформация необходима для эффективного расщепления с помощью Dom34-ABCE1 (Figs 5D-5E and S9 and S1 and S2 Datas). Примечательно, что комплексы Stm1–80S, очищенные после голодания по глюкозе, не могут быть напрямую сопоставимы с восстановленными комплексами Lso2–80S in vitro. Следовательно, мы не можем полностью исключить другие различия, кроме состояния вращения Stm1–80S, способствующего сопротивлению расщеплению.
Таким образом, чтобы проверить, содержит ли устойчивая к расщеплению фракция в популяции Stm1–80S Stm1, соединяющий 40S и 60S в повернутой конформации, мы выполнили крио-ЭМ на фракции Stm1–80S после реакции расщепления с факторами расщепления и без них. В любом случае, мы наблюдали, что подавляющее большинство (> 90%) устойчивых к расщеплению 80S приняли то же «состояние повернутого-2» [26], что и рибосомы, содержащие eEF2 и SERBP1 человека, и в большинстве этих рибосом Stm1 может четко наблюдаться в субъединично-мостиковой конформации, пересекающей канал мРНК (S11 фиг.).В заключение, эти результаты убедительно подтверждают, что в отличие от повернутого Stm1 / SERBP1 (и eEF2) -содержащего 80S, невращенные Lso2 / CCDC124-связанные рибосомы являются субстратами, которые могут эффективно рециклироваться с помощью системы расщепления Dom34–.
Обсуждение
В то время как для бактерий были охарактеризованы многочисленные факторы гибернации (обзор см., Например, [9]), знания об эукариотических эквивалентах до сих пор ограничивались Stm1 в дрожжах и SERBP1 / eEF2, а также недавним обнаружили тРНК IFRD2 / Z-сайта [11,17] у млекопитающих.По аналогии с бактериальными аналогами, как SERBP1 / eEF2, так и IFRD2 / Z-тРНК занимают важные активные сайты на рибосоме [11]. В то время как структурные данные убедительно свидетельствуют о том, что факторы гибернации действуют, поддерживая рибосомы в некомпетентном к трансляции состоянии, механизмы восстановления трансляционно-компетентных рибосом остаются загадочными.
В этой работе мы представляем Lso2 и CCDC124 в клетках дрожжей и человека как новые специфичные для эукариот факторы гибернации рибосом, которые играют активную роль в восстановлении трансляции [21].Наши крио-ЭМ структуры показывают, что Lso2 и CCDC124 занимают сайты связывания мРНК и тРНК, тем самым напоминая механизм действия известных факторов гибернации бактерий. Однако в то время как RMF, HPF, RaiA (также известный как белок Y или pY) или N-концевой домен фактора, способствующего долгой гибернации (LHPF), все нацелены на путь мРНК и центр декодирования малой субъединицы, Lso2 и CCDC124 связываются с субъединицы 40S и 60S и исключительно стабилизируют невращенную конформацию 80S рибосомы.
Независимо от состояния рибосом и связывания факторов гибернации SERBP1 или CCDC124, мы наблюдали, что EBP1 связывается с выходом пептидного туннеля гибернационных рибосом человека.Наша структура EBP1–80S во многом напоминает недавно опубликованные структуры EBP1, связанного с обработанными пуромицином рибосомами 80S [53], и EBP1-связанных рибосом из неокортекса мыши [54]. Наблюдаемый нами режим связывания аналогичен режиму связывания других белков, связывающих сайт выхода, которые взаимодействуют с формирующейся цепью. В результате этот способ связывания исключает взаимодействие большинства ко-трансляционно действующих факторов с рибосомами, что согласуется с их ролью в качестве фактора гибернации, который предотвращает непродуктивную секвестрацию этих факторов в холостые рибосомы.Интересно, что исследование Kraushar с коллегами показало, что EBP1 связывается не только с idle 80S, но также с транслирующимися полисомами [54]. Здесь было обнаружено, что EBP1 высоко обогащен цитозолем ранних нейрональных стволовых клеток неокортекса мыши, в которых предполагается, что он играет роль в модуляции гомеостаза белка, возможно, конкурируя с другими факторами места выхода. В этом контексте любопытно, что EBP стабилизирует в остальном гибкий сегмент экспансии рРНК ES27 в конформации, обращенной к сайту выхода.В то время как данные о системе человека отсутствуют, ES27 важен для дрожжей и, как было показано, непосредственно координирует и позиционирует возникающие факторы взаимодействия с цепью, такие как NatA [43], на сайте выхода. Другая потенциальная роль EBP1 может заключаться в предотвращении убиквитинирования рибосомного белка uL29 неактивной рибосомы, тем самым способствуя координации его склонности к рибофагии [55]. Тем не менее, точные обстоятельства и механизм того, как EBP1 рекрутируется в спящие, а также транслирующие рибосомы, и что запускает его диссоциацию до или во время цикла трансляции, еще предстоит выяснить.
Мы пришли к выводу, что поддержание спящих рибосом в невращенном состоянии может быть предпосылкой для предпочтительной реактивации системой расщепления Dom34. Действительно, используя анализы расщепления in vitro, мы могли показать, что Lso2-связанные 80S очень восприимчивы к рециклингу. Напротив, 80S, обогащенный Stm1, как это происходит после короткого голодания по глюкозе [17], не может быть расщеплен, что объясняется нашими структурами Stm1-80S, напоминающими отчетливое состояние rotated-2 [26]. Более того, присутствие SERBP1 на рибосоме в значительной степени приводит к стабильной ассоциации eEF2 у млекопитающих [11,20].Аналогичное обогащение eEF2 на Stm1-связанных рибосомах было показано, по крайней мере, in vitro, у дрожжей [56]. Это д. Дополнительно блокировать доступ Dom34 к сайту рибосомы A и делать эти рибосомы устойчивыми к расщеплению этой системой.
Эти находки также хорошо согласуются с первоначальным наблюдением, что отсутствие Lso2 задерживает восстановление трансляции после голодания [21]. Более того, Lso2-истощенные клетки накапливают холостые 80S рибосомы и их глобальная инициация снижается в 5 раз, как анализируется с помощью профилирования рибосом [21].Интересно, что исследование продемонстрировало, что делеция Dom34 и Hbs1 имеет сходные эффекты на восстановление после истощения глюкозы у дрожжей, как и делеция Lso2, и что холостые рибосомы, изолированные из голодных по глюкозе дрожжей, были субстратами для расщепления системой Dom34 [15]. Аналогичным образом, удаление стабилизирующего Stm1 подавляет потребность Dom34 и Hbs1 в восстановлении трансляции [15]. Здесь вероятное объяснение состоит в том, что в отсутствие Stm1 существует больший пул холостых рибосом, которые нестабильны и могут быть легко переработаны.Таким образом, восстановление трансляции зависит в меньшей степени от рециклинга рибосом, которые строго нуждаются в системе Dom34 для расщепления. В подтверждение этого антагонизма между Stm1 и Dom34 сверхэкспрессия Stm1 в штамме dom34Δ приводит к дефекту роста [19], вероятно, из-за накопления Stm1–80S и неспособности расщепить оставшийся пул 80S с помощью Dom34. система. В сочетании с этими данными наши находки убедительно подтверждают, что Stm1–80S представляют собой пул спящих рибосом, который, скорее всего, нелегко расщепляется системой Dom34.Взятые вместе, мы заключаем, что Lso2 действует в защите неактивных 80S рибосом как фактор гибернации, но в отличие от Stm1, Lso2 стабилизирует их в состоянии быстрого повторного цикла для своевременного повторного входа в активный цикл трансляции.
До сих пор остается неясным, каковы фактические сигналы как для Stm1, так и для Lso2, чтобы взаимодействовать с idle 80S в их трансляционных репрессивных конформациях зажима субъединицы. Правдоподобно предположить, что оба белка могут конститутивно связываться с рибосомами в альтернативном пермиссивном режиме связывания, потому что Stm1, например, наблюдался в активно трансляционных полисомах [57].Однако, Stm1, как полагают, запускает репрессию трансляции у дрожжей, возможно, за счет модуляции доступа фактора элонгации трансляции eEF3 [18,56], и играет роль в деаденилировании мРНК [19]. Сходным образом роль в раннем удлинении также приписывалась Lso2 [21]. Т.о., в случае остановки трансляции, вызванной голоданием, оба потенциально уже связанных с рибосомами (пре-) фактора могут быстро генерировать пул защищенных спящих 80S, принимая свою репрессивную конформацию на одной и той же рибосоме.Тем не менее, молекулярные сигналы, необходимые для генерации или разборки этих отдельных неактивных популяций 80S, неизвестны. Одна возможность состоит в том, что относительный размер популяции бездействующих 80S рибосом в определенных стрессовых условиях уже достаточен. С другой стороны, Lso2–80S должен быть защищен от повторного использования, чтобы избежать повторения холостых циклов расщепления и преобразования этих 80S. Регулируется ли это уровнями энергии в клетке или более конкретными сигналами, должно быть предметом дальнейших исследований.
Материалы и методы
Очистка рекомбинантного Lso2
Для сверхэкспрессии рекомбинантного Lso2 ген LSO2 был клонирован из геномной ДНК дрожжей в модифицированный вектор pRSF Duet1 – SUMO, расположенный ниже кодирующей последовательности SUMO. Полученную плазмиду, кодирующую слитый белок SUMO-Lso2, трансфицировали в Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) и выращивали в среде LB с добавлением ампициллина. Клетки инокулировали при OD 600 0.05 и выращивали при 37 ° C до середины логарифмической фазы, в этот момент экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG. Клетки собирали через 2 часа экспрессии белка при 37 ° C путем центрифугирования при 3500 × g в течение 10 минут. Осадки клеток ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 300 мМ NaCl, 2 мМ β-меркаптоэтанол [β-ME]) и лизировали с использованием микрофлюидизатора Microfluidics M-110L (Hyland Scientific, Stanwood, WA, США. ). Мембранную фракцию удаляли центрифугированием при 34000 × g в течение 45 мин.Затем осветленные лизаты загружали на никелевую смолу, уравновешенную 5 объемами колонки (CV) промывочного буфера (30 мМ трис-HCl [pH 8,0], 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 2 мМ β-ME). Lso2 расщепляли в периодическом режиме добавлением деубиквитин-протеазы Ulp1 в течение ночи при 4 ° C и элюировали промывочным буфером без имидазола. Элюат концентрировали до 1 мл и наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex 75 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 2 мМ β-ME, с получением 1,1 мг очищенного Lso2 из 0.5 л культуры в концентрации 3 мг / мл.
Очистка субъединиц рибосом
Осветленные цитоплазматические лизаты, полученные из изогенного S . с . Клетки S288C (MATα, HIS3, LEU2, ura3–52, TRP1, GAL2) центрифугировали через сахарозную подушку (1 М сахароза, 30 мМ трис-HCl [pH 7,0], 500 мМ KOAc, 25 мМ Mg (OAc) 2 , 5 мМ β-ME, 0,1% никкол, 10 мкг / мл циклогексимида) при 2
×
г в течение 45 мин. Осадок рибосом ресуспендировали в буфере (50 мМ Трис-HCl [pH 7.4], 500 мМ KOAc, 2 мМ MgCl 2 , 2 мМ DTT) и обрабатывали пуромицином (конечная концентрация 1 мМ) в течение 15 минут на льду и 10 минут при 37 ° C. Затем образцы загружали в градиенты 10-40% сахарозы (50 мМ HEPES [pH 7,4], 500 мМ KOAc, 5 мМ MgCl 2 , 0,1 мМ EGTA, 2 мМ DTT) и центрифугировали в течение 3 часов при 284000 × g. . Выполняли градиентное фракционирование, фракции 40 / 60S субъединиц объединяли и концентрировали до 0,5 мл в сетчатом буфере (20 мМ HEPES [pH 7,4], 100 мМ KOAc, 2.5 мМ Mg (OAc) 2 , 250 мМ сахарозы, 2 мМ DTT).Реконструкция комплекса ЛСО2–80С
Очищенные рибосомные субъединицы смешивали в молярном соотношении 1: 1 и инкубировали в условиях реассоциации в сетчатом буфере, содержащем 10 мМ Mg (OAc) 2 , 0,1% Nikkol, в течение 10 мин. После этого за 10 мин до блоттинга добавляли 10-кратный молярный избыток очищенного Lso2.
Нативные комплексы Lso2–80S из
S . с .Мы идентифицировали Lso2-содержащие рибосомы с помощью крио-ЭМ в нескольких образцах, в которых рибосомные комплексы были очищены из дрожжевых клеток, выращенных в минимальной среде и сверхэкспрессирующих различные целевые белки на плазмидах.Анализируемый здесь образец изначально был нацелен на получение Upf1-содержащих рибосомных комплексов из дрожжевых клеток BY4741 ( MATα; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; YMR080c :: kanMX4 ), несущих плазмиды pKB510, гиперэкспрессирующие несенсорную репортер и pKB607, сверхэкспрессирующие FLAG-меченый АТФ-дефицитный мутант Upf1. Крио-ЭМ-анализ фракций элюирования выявил подавляющее большинство свободных 80S рибосом, лишенных какой-либо плотности для Upf1, но вместо этого выявив подкласс рибосом, связанных с Lso2.
Более подробно, клетки выращивали в минимальной среде (азотное основание дрожжей; -Leu -Ura выпадающая среда и 2% глюкозы) при 30 ° C до OD 600 около 0,75. Клетки лизировали с использованием морозильной мельницы (SPEX 6970 / EFM; SPEX, Metuchen, NJ, USA) перед ресуспендированием в буфере для лизиса (20 мМ HEPES [pH 7,4], 100 мМ KOAc, 10 мМ MgCl 2 , 0,5% тритона. X-100, таблетка с ингибитором протеазы 1: 1000 [Roche: 04-693-132-001; Базель, Швейцария]). Для приготовления использовали 40 г порошка лизированных клеток и получали цитозольную фракцию S100.Сначала мембранные фракции удаляли центрифугированием при 28 714 × g в течение 15 минут, затем цитозольные фракции осветляли центрифугированием при 92 387 × g в течение 20 минут. «S100» добавляли к 300 мкл магнитных шариков FLAG (Sigma-M8823; Sigma-Aldrich), уравновешенных буфером для лизиса, и инкубировали в течение 2 часов при 4 ° C. После трехкратной промывки лизирующим буфером без Тритона Х-100 образец элюировали пептидом FLAG (Sigma F4799; Sigma-Aldrich). Рибосомный элюат центрифугировали через подушку из сахарозы 750 мМ, приготовленную в буфере для элюирования, в течение 45 мин при 2
×
г .Гранулы ресуспендировали в буфере для элюирования и доводили до конечной концентрации приблизительно 4 A 260 мл -1 для приготовления крио-ЭМ образцов. Как упоминалось выше, только Lso2 может быть визуализирован в этом образце как дополнительное связующее рибосомы. Аналогичные наблюдения были сделаны при использовании того же протокола для получения рибосомных комплексов с другими мечеными белками, что указывает на то, что присутствие Lso2 на свободных рибосомах не зависит от природы меченого белка-приманки.Нативные комплексы гибернации человека
Пять планшетов по 15 см с клетками HEK293 Flp-In T-REx (Thermo Fisher Scientific, R78007; Waltham, MA, USA) при 80% конфлюэнтности собирали в 15 мл среды DMEM путем трипсинизации и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 150 ° C. × г . Клетки промывали ледяным PBS и снова осаждали перед ресуспендированием в 0,75 мл буфера для лизиса (20 мМ HEPES / NaOH [pH 7,4], 100 мМ KOAc, 10 мМ Mg (OAc) 2 , 125 мМ сахароза, 1 мМ DTT. , 0.5 мМ PMSF, 0,5% IGEPAL, таблетка ингибитора протеазы). Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4 ° C перед осаждением клеточного дебриса в течение 15 минут при 21000 × г . Осветленный лизат распределяли поверх градиентов 10-50% сахарозы, приготовленных с буфером для лизиса без IGEPAL, и центрифугировали в течение 3 часов при 284000 × g . Фракции 80S собирали, объединяли и осаждали через 1 М сахарозную подушку лизисного буфера, не содержащего IGEPAL, центрифугированием в течение 1 ч при 540 000 × g . Гранулы ресуспендировали в 20 мкл буфера для лизиса без IGEPAL, в результате чего конечная концентрация составляла 130 A 260 мл -1 .Для приготовления криосеток концентрацию доводили до 4 A 260 мл -1 .
Очистка неактивных рибосом 80S с помощью Stm1
Дикий тип BY4741 S . с . клетки получали точно так же, как описано ранее [17]. Короче говоря, клетки выращивали до середины логарифмической фазы в YPD перед осаждением при 30 ° C и инкубированием в YP в течение следующих 10 минут при 30 ° C. Клетки осаждали и промывали 3 раза промывочным буфером (30 мМ HEPES [pH 7.4], 50 мМ KCl, 2,5 мМ Mg (OAc) 2 , 0,5 мМ EDTA, 2 мМ DTT, таблетка ингибитора протеазы, 10% глицерин). После промывания клетки мгновенно замораживали в жидком азоте и лизировали с использованием морозильной мельницы (SPEX 6970 / EFM), а порошок лизированных клеток хранили при -80 ° C. Осветленные лизаты, ресуспендированные в промывочном буфере, загружали на градиенты 10-50% сахарозы в промывочном буфере без глицерина. После градиентного фракционирования пики 80S осаждали через 1-М сахарозную подушку, приготовленную в промывочном буфере, центрифугированием при 417000 × g в течение 45 минут.Наконец, очищенные осадки рибосом ресуспендировали в буфере для хранения (20 мМ HEPES [pH 7,5], 100 мМ KOAc, 5 мМ Mg (OAc) 2 , 1 мМ DTT). Аликвоты мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C.
Очистка обработанных пуромицином рибосом 80S
S . с . Клетки BY4741 выращивали до середины логарифмической фазы в YPD при 30 ° C и собирали при конечной OD 600 , равной 2,5. Клетки осаждали и промывали один раз водой и один раз 1% KCl перед ресуспендированием в 100 мМ Трис-HCl (pH 8), 10 мМ DTT и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут.После заключительного этапа осаждения клетки ресуспендировали в буфере для лизиса (10 мМ HEPES [pH 7,5], 100 мМ KOAc, 7,5 мМ Mg (OAc) 2 , 125 мМ сахароза, 1 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF, таблетка с ингибитором протеазы. ) перед лизированием с использованием микрофлюидизатора Microfluidics M-110L. Лизаты осветляли центрифугированием при 4 ° C, сначала при 27000 × g в течение 15 минут и снова при 150000 × g в течение 30 минут. Затем рибосомные фракции выделяли центрифугированием через двухслойную подушку из сахарозы 1,5 М / 2 М (20 мМ HEPES [pH 7.5], 500 мМ KOAc, 5 мМ Mg (OAc) 2 , 1 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF) при 246 500 × г в течение 21 часа. Фракции супернатанта отбрасывали, а осадки рибосом ресуспендировали в воде, свободной от нуклеаз. Рибосомы смешивали в соотношении 1: 1 с 2-кратным пуромициновым буфером (40 мМ HEPES [pH 7,5], 1 М KOAc, 25 мМ Mg (OAc) 2 , 2 мМ пуромицин, 2 мМ DTT и Amicon против РНКазы [AM2692; Sigma-Aldrich]) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Обработанные пуромицином рибосомы загружали на градиенты 10-40% сахарозы в буферных условиях, соответствующих предыдущей подушке из сахарозы, и подвергали ультрацентрифугированию при 4 ° C, 21000 × г в течение 20 часов.Фракции 80S собирали вручную из градиентов путем мониторинга поглощения при 260 нм, и рибосомы осаждали при 417000 × г при 4 ° C в течение 45 минут. Наконец, обработанные пуромицином осадки 80S ресуспендировали в буфере для хранения (20 мМ HEPES [pH 7,5], 100 мМ KOAc, 5 мМ Mg (OAc) 2 , 1 мМ DTT). Аликвоты мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C.
Очистка факторов расщепления
S . с . Dom34 экспрессировался с С-концевой меткой His в векторе pET21a (+) и был очищен от Rosetta2 (DE3) E . coli с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA, как сообщалось ранее [45].
S . с . Hbs1 экспрессировался с помощью N-концевой метки His в векторе pET28b (+) и был очищен из Rosetta2 (DE3) E . coli с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA, как описано ранее [45]. Оба белка, Dom34 и Hbs1, очищали в конечном буфере, состоящем из 20 мМ Трис (pH 7,5), 200 мМ NaCl, 5 мМ β-ME, 0,1 мМ PMSF, а аликвоты мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C.
S . с . Rli1p (ABCE1) в высококопийном векторе pYES2Rli1 сверхэкспрессируется в S . с . штамм WCGα. Клетки выращивали в среде YP -ura, 2% галактозы, 1% раффинозы при 30 ° C до середины логарифмической фазы и собирали при конечной OD 600 , равной 1,0. Осадки клеток промывали водой перед быстрой заморозкой и хранили при -80 ° C. Для лизиса осадок клеток оттаивали и один раз промывали 1% KCl для дестабилизации клеточной стенки перед ресуспендированием в 100 мМ Трис (pH 8.0), 14 мМ β-ME и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса (75 мМ HEPES [pH 8,0], 300 мМ NaCl, 5 мМ β-ME, 1% твин, 20 мМ имидазол, 2 мМ MgCl 2 , 10% глицерин) и лизировали. с использованием микрофлюидизатора Microfluidics M-110L. Лизаты осветляли центрифугированием при 25000 × g в течение 10 минут и фильтровали через фильтр 0,45 мкм перед загрузкой в аффинную колонку HisTrap-HP 5 мл с использованием системы ÄKTA pure (Cytiva, Мальборо, Массачусетс, США).Колонку промывали промывочным буфером 8 CV (50 мМ HEPES [pH 8,0], 500 мМ NaCl, 5 мМ β-ME, 20 мМ имидазол, 2 мМ MgCl 2 , 10% глицерин) перед элюированием 8 CV в течение 0% –100% градиент от промывочного буфера до элюирующего буфера (промывочный буфер с 300 мМ имидазолом). Пиковые фракции концентрировали до 1 мл перед загрузкой в Superdex 200 (Sigma-Aldrich) для эксклюзионной хроматографии. Аликвоты чистого ABCE1 в 20 мМ Трис (pH 7,5), 200 мМ NaCl, 5 мМ β-ME и 5% глицерине мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C.
S . с . eIF6 был клонирован в p7XC3GH (Addgene # 47066; Watertown, MA, USA), слитый на C-конце с сайтом расщепления протеазой 3C, GFP и 10 × His. Плазмиду трансформировали в E . coli BL21 (DE3), который выращивали при 37 ° C до середины логарифмической фазы. Температуру снижали до 16 ° C, и сверхэкспрессию белка индуцировали с помощью IPTG для экспрессии в течение ночи. Клетки собирали (4400 × г , 4 ° C, 8 мин), промывали фосфатно-солевым буфером и ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ трис-HCl [pH 8.0], 300 мМ NaCl, 2 мМ β-ME и таблетка ингибитора протеазы) перед лизированием с помощью микрофлюидизатора Microfluidics M-110L. Лизаты осветляли центрифугированием при 30,596 × g при 4 ° C в течение 20 мин. Супернатант загружали на металл-аффинную смолу TALON (Takara Bio, Mountain View, CA, USA), уравновешенную лизисным буфером, и инкубировали на вращающемся колесе при 4 ° C в течение 40 минут. Проходящий поток собирали, и смолу промывали 3 раза буфером для лизиса + 10 мМ имидазола перед инкубацией с буфером для элюирования (буфер для лизиса, 10 мМ имидазол, 0.25 мг / мл 3C протеазы) в течение 30 мин при 4 ° C. Элюированный белок концентрировали до 1 мл перед загрузкой в Superdex 200 (Sigma-Aldrich) для эксклюзионной хроматографии в конечном буфере (50 мМ HEPES [pH 7,5], 500 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2 , 2 мМ β- МЕНЯ). Аликвоты мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C.
Анализ расщепления
Анализы расщепления были собраны в реакциях объемом 50 мкл в конечном буфере SA (20 мМ Трис [pH 7,5], 100 мМ KOAc, 4 мМ Mg (OAc) 2 , 5 мМ β-ME) с 5 пмоль очищенными рибосомами. (Stm1-связанный, Lso2-связанный или обработанный пуромицином) и 5-кратный молярный избыток каждого фактора, включенного в реакцию.Контрольные реакции были собраны с рибосомами и eIF6. Реакции расщепления включали рибосомы eIF6, 1 мМ АТФ, 1 мМ GTP и факторы расщепления (Dom34, Hbs1 и ABCE1). Реакции инкубировали на льду в течение 30 минут перед загрузкой в градиенты 10-50% сахарозы SA-буфера и подвергали ультрацентрифугированию в течение 3 часов при 284000 × g . Градиенты плотности сахарозы подвергали механическому фракционированию и УФ-спектроскопии. Количественная оценка пиков проводилась путем оценки интеграла с использованием правила трапеций [58].Пусть (x n | A n ) будет записанными точками данных, где x — расстояние вдоль градиента, а A — поглощение на 260 нм. Площадь S ab под одним пиком от x a до x b была аппроксимирована как Относительные эффективности расщепления рассчитывались как отношения площадей пиков и усреднялись по экспериментам. Ошибки, показанные в нормированных результатах, оценивались в предположении линейного распространения статистических неопределенностей.
Крио-ЭМ анализ
Для всех образцов дрожжей примерно 2.5–6 A 260 мл –1 рибосомы наносили на 2-нм предварительно покрытые дырчатые углеродные опорные решетки Quantifoil R3 / 3. Данные были собраны на TEM Titan Krios (Thermo Fisher Scientifc), оборудованном прямым детектором Falcon II на 300 кэВ в условиях низкой дозы с использованием приблизительно 28 электронов на 2 для 10 кадров в целом (таблица S1). Диапазон расфокусировки составлял от -1,1 до -2,3 мкм, и для полуавтоматического сбора данных использовалось программное обеспечение EM-TOOLS (TVIPS).Установки увеличения привели к размеру пикселя 1,084 Å -1 пикселя. Исходные стопки изображений были суммированы и скорректированы с учетом дрейфа и движения луча на уровне микрофотографии с помощью MotionCorr2 [59]. Оценка передаточной функции контраста (CTF) и диапазона разрешения каждой микрофотографии была выполнена с помощью Gctf [60].
Для образца человека 4 A 260 мл -1 рибосом наносили на 2-нм предварительно покрытые углеродные решетки Quantifoil R3 / 3 с предварительно нанесенным покрытием.Данные собирали на TEM Titan Krios (Thermo Fisher Scientific), оборудованном прямым детектором Falcon III на 300 кэВ (таблица S1). Диапазон расфокусировки составлял от -0,8 до -3,2 мкм, и для полуавтоматического сбора данных использовалось программное обеспечение EPU (Thermo Fisher Scientific). Выравнивание кадров выполнялось с помощью MotionCorr2 [59]. Оценка CTF проводилась с помощью Gctf [60].
Структура восстановленного in vitro дрожжевого комплекса Lso2–80S
После ручного скрининга качества льда 10313 микрофотографий были использованы для автоматического сбора частиц в Gautomatch (https: // www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/locally-developed-software/zhang-software/), что дает 1,413,783 начальных частиц. После двухмерной классификации в RELION 3.0 781 257 частиц были выбраны для согласованного трехмерного уточнения. После трехмерной классификации был получен и уточнен класс, содержащий Lso2 (88 523 частицы), включая уточнение CTF, до среднего разрешения 3,4 Å с локальным разрешением в диапазоне 3–7 Å (3,2–4,5 для Lso2). Все остальные классы содержали только 80S рибосомы без дополнительных факторов, тРНК или мРНК.Схема классификации отображается на S1A рис.
.Структура комплекса нативных дрожжей Lso2–80S
После ручного скрининга качества льда 8600 микрофотографий были использованы для автоматического отбора частиц в Gautomatch, что дало 585 801 исходную частицу. После двухмерной классификации в RELION 3.0 486 383 частицы были выбраны для согласованного трехмерного уточнения. Два раунда трехмерной классификации и трехмерного уточнения привели к реконструкции комплекса Lso2–80S с низким разрешением из 29 735 частиц.Этот набор данных был позже объединен с последующим набором данных, в котором 8400 микрофотографий прошли автоматический сбор частиц в Gautomatch, что дало 381 233 исходных частицы. После двухмерной классификации в RELION 3.0 163 303 частицы были выбраны для согласованного трехмерного уточнения. Трехмерная классификация и трехмерное уточнение привели к реконструкции комплекса Lso2–80S с низким разрешением из 24 085 частиц. Полученный объединенный набор данных из 53 820 частиц прошел согласованное трехмерное уточнение перед сфокусированной сортировкой в межсубъединичном пространстве (положения тРНК A- и P-сайтов), в результате чего была получена одна тРНК, содержащая класс 18 869 частиц и один Lso2-содержащий класс 34 951 частицу.Класс, содержащий Lso2, прошел 1 заключительный раунд 3D-уточнения и уточнения CTF, в результате чего была получена комплексная реконструкция Lso2–80S при 3,5 Å. Отброшенные классы содержали 80S рибосомы без дополнительных факторов, тРНК или мРНК. Схема классификации отображается на S1B рис.
.Структура спящего комплекса человека
После ручного скрининга качества льда 6145 микрофотографий были использованы для автоматического отбора частиц в Gautomatch, что дало 332 890 исходных частиц.После двухмерной классификации в RELION 3.0 было выбрано 156 750 частиц для согласованного трехмерного уточнения. Обширная трехмерная классификация с последующим трехмерным уточнением и уточнением CTF привело к реконструкции комплекса SERBP1 – eEF2–80S, комплекса CCDC124–80S и комплекса EBP1–80S при 3,1 Å, 3,0 Å и 2,9 Å, соответственно. Схема классификации представлена на S4 рис.
.Молекулярные модели дрожжей и гибернационных рибосом человека
Кристаллическая структура S . с . (Protein Data Bank [PDB]: 5NDG) крио-ЭМ-структуры человека (PDB: 6EK0 и 4V6X) [20] и кристаллическая структура EBP1 человека (PDB: 2Q8K) [36] были использованы в качестве исходных моделей для построения 80S рибосомы и EBP1 соответственно. В общем, модели рибосомы / EBP1 были жестко подогнаны к нашим крио-ЭМ картам в Chimera [61] с последующей ручной корректировкой в Coot в соответствии с плотностями [62].
Из-за гибкости C-конец как Lso2, так и CCDC124, а также N-конец CCDC124 отсутствуют в нашей окончательной модели, но все остальные области были de novo построены в Coot.Модель гомологии eEF2 человека была создана с использованием сервера Swiss-Model [63] на основе модели Sus scrofa (PDB: 3J7P) [64]. Модель SERBP1 человека была скорректирована на основе структуры рибосом человека (PDB: 4V6X) [20].
Все окончательные модели (S2, S5 Figs и S1 Table) были уточнены в реальном пространстве с ограничениями вторичной структуры с использованием пакета PHENIX [65], а окончательная оценка модели была выполнена с помощью MolProbity [66]. Карты и модели были визуализированы, а фигуры созданы с помощью системы молекулярной графики PyMOL (версия 1.7.4, Schrödinger, LLC) и ChimeraX [67].
Стандартные проверки соответствия модели и карты были выполнены в соответствии с [68], чтобы гарантировать, что модели не переоборудованы.
Вспомогательная информация
S1 Рис. Трехмерная классификационная схема и локальное разрешение реконструкций Lso2–80S.
(A – B) Схемы сортировки для восстановленных (A) и нативных (B) реконструкций Lso2–80S. Для нативной структуры Lso2–80S частицы, содержащие Lso2, были объединены из 2 отдельных коллекций после трехмерной классификации из-за относительно низкой степени заполнения Lso2 (5% и 16% всех частиц, соответственно).И для восстановленных, и для нативных комплексов классы, содержащие Lso2, были локально классифицированы с использованием эллипсоидной маски, покрывающей сайты связывания тРНК A- и P-сайтов 80S. Классы, содержащие Lso2, были уточнены до общего разрешения 3,5 Å и 3,4 Å соответственно. (C) Указан диапазон локального разрешения для рибосомы 80S и изолированного Lso2. А — акцептор; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Р, пептидил.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s001
(TIF)
S2 Рис.Валидация модели Lso2–80S.
(A) Вид, выделяющий модель N-конца Lso2, взаимодействующего со спиралью рРНК h38 (G1150) и h55 (G1768), соответствующие плотности (прозрачная серая сетка). (B) Вид с фокусом на Lso2 N-терминал R4, взаимодействующий с h54. (C) Просмотр фокусировки на укладке Lso2 шарнирного остатка W42 внутри щели, образованной белками большой субъединицы eL42 и uL5. (D) Просмотр с акцентом на взаимодействия между шарнирной областью Lso2 (R47) и остатками uL5. (E) Подгонка всей модели Lso2 к изолированной плотности.(F) Общие кривые FSC, сопоставление с модельными кривыми FSC и полу-карта с модельными кривыми FSC для проверки соответствия модели Lso2–80S восстановленным и нативным реконструкциям Lso2–80S. FSC, корреляция Фурье-оболочки; Lso2, короткая открытая рамка считывания с поздними аннотациями 2
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s002
(TIF)
S3 Рис. CCDC124 и EBP1 ассоциированы с рибосомами в лизатах клеток человека.
Лизаты клеток HEK293T фракционировали с использованием градиентов сахарозы 10-40%.Собирали фракции и проводили вестерн-блоттинг с использованием антител против CCDC124 и EBP1. Было обнаружено, что оба фактора связаны с рибосомами 80S. CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; HEK, эмбриональная почка человека.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s003
(TIF)
S4 Рис. 3D-схема классификации и локальное разрешение для естественных холостых рибосом человека.
(A) В первом раунде трехмерной классификации частицы были разделены, содержащие тРНК E-сайта и EBP1 и либо CCDC124 (в невращенном состоянии), либо SERBP1 и eEF2 (в повернутом-2) состоянии.Затем были выполнены независимые подклассификации с использованием региональной маски с использованием эллипсоидных масок, покрывающих сайты связывания тРНК A- и P (для CCDC124 и eEF2 / SERBP1, соответственно) или на сайте выхода пептида (для EBP1). Это давало гомогенные классы рибосом, содержащие исключительно либо CCDC124 и EBP1, либо SERBP1 / eEF2 и EBP1. Классы, отображающие CCDC124–80S, SERBP1 / eEF2–80S и обогащенный EBP1 SERBP1 / eEF2–80S, были улучшены до общего разрешения 3,0, 3,1 и 2,9 Å. (B – D) Указаны диапазоны местного разрешения для CCDC124–80S (B), EBP1–80S (C) и eEF2 / SERPB1–80S (D) и изолированных CCDC124 и EBP1.А — акцептор; CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; eEF2, фактор элонгации эукариот 2; Р, пептидил; SERBP1, мРНК-связывающий белок SERPINE1 1
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s004
(TIFF)
S5 Рис. Проверка моделей CCDC124–80S, SERBP1 – eEF2–80S и EBP1–80S человека.
(A – B) Вид, на котором выделена шарнирная область CCDC124, взаимодействующая с H85 (A) и H84 (B) 28S рРНК.(C) Рассмотрение сосредоточения внимания на взаимодействии стэкинга CCDC124 W39 с остатками uL5 способом, отличным от Lso2, где eL42 также участвует в стабилизации Lso2 W42. (D) Подходит для всех моделей CCDC124 и EBP1 в соответствующие изолированные плотности. (E) Общие кривые FSC, сопоставление с модельными кривыми FSC и полу-карта с модельными кривыми FSC для проверки окончательных моделей CCDC124–80S, eEF2 / SERPB1–80S и EBP1–80S, соответствующих соответствующим плотностям. CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; FSC, корреляция Фурье-оболочки; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; SERPB1, мРНК-связывающий белок SERPINE1 1
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000780.s005
(TIF)
S6 Рис. Связывание EBP1 возле выхода из туннеля на 60S.
(A) Увеличенное изображение, показывающее общее расположение EBP1 в месте выхода пептида. (B) Увеличьте масштаб взаимодействия между EBP1 и H59. (C) Сравнение положения EBP1 с другими лигандами сайта выхода. Связывание EBP1 д. Перекрываться с большинством возникающих факторов, взаимодействующих с цепью, таких как NatA [43], RAC [40], SRP [69] или Sec61 [41,42,70]. EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; NatA, N-α-ацетилтрансфераза; RAC, комплекс, связанный с рибосомами; Sec61, секреторный белок 61; SRP, частица распознавания сигнала.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s006
(TIF)
S7 Рис. Наложение Dom34 с 18S рРНК в повернутом-2 и невращенном состояниях.
Dom34 в комплексе с Hbs1 (а также ABCE1) обычно находится в невращенном состоянии. Структура дрожжей 80S в невращенном состоянии (PDB: 6Q8Y; представляет Lso2–80S) [25] была наложена на структуру дрожжей в состоянии повернутого-2 (PDB: 5JUP; представляет Stm1–80S) [26] на основе 60S субъединицы. Мы отмечаем, что N-концевой домен Dom34 (взятый из PDB: 3IZQ) [45] будет конфликтовать со спиралями 18S рРНК h28 и h44 в состоянии rotated-2.Это указывает на то, что повернутая (содержащая Stm1) рибосома 80S не может быть расщеплена системой расщепления Dom34. Dom34, дупликация мультилокусной области 34; Супрессор подсемейства B Hbs1, Hsp70; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; PDB, банк данных белков; Stm1, супрессор мишени белка Myb 1
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s007
(TIF)
S8 Рис. Профили градиента сахарозы для анализов расщепления in vitro.
УФ-профили для анализа расщепления.Анализы содержат 5 пмоль рибосом (обработанных пуромицином или связанных с Lso2 или связанных с Stm1) и 25 пмоль факторов (фактор антиассоциации 60S субъединицы eIF6, Dom34, Hbs1 и ABCE1). 50 мкл реакционной смеси центрифугировали через градиент сахарозы 10-50% и регистрировали профиль поглощения при 260 нм ( A 260 ). Все эксперименты проводились в трех экземплярах (обозначены разными оттенками зеленого). Исходные данные можно найти в S1 Data. Dom34, дупликация мультилокусной области 34; eIF6, фактор инициации эукариот 6; Супрессор подсемейства B Hbs1, Hsp70; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Stm1, супрессор мишени белка Myb 1
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000780.s008
(TIF)
S9 Рис. Количественная оценка анализов расщепления in vitro.
Относительное количество рибосом и субъединиц 80S в анализах расщепления in vitro оценивали путем сравнения площадей под пиками поглощения A 260 субъединиц 40S, 60S и 80S (рассчитанных, как описано в разделе «Методы»). Обратите внимание, что Stm1–80S имеют наибольшее относительное содержание после расщепления, тогда как Lso2–80S показывают наименьшее относительное содержание после расщепления.Расчеты можно найти в S2 Data. Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; Stm1, супрессор мишени белка Myb 1
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s009
(TIF)
S10 Рис. Требования к компонентам для анализа расщепления.
(A) Анализы расщепления in vitro были собраны (материалы и методы) с 80S рибосомами, восстановленными с помощью Lso2, без учета отдельных факторов или нуклеотидов, как аннотировано. УФ-профили для анализов расщепления собирали после разделения в градиенте сахарозы 10-50%; профили поглощения были получены при 260 нм.Расщепление наблюдалось в реакциях, когда присутствовали все компоненты (eIF6, ABCE1, Hbs1, Dom34, 1 мМ АТФ, 1 мМ GTP) или в отсутствие Hbs1. Напротив, расщепление не наблюдалось, когда Dom34, Hbs1 или нуклеотиды были исключены из реакции или в реакциях, содержащих eIF6 и нуклеотиды без других факторов. (B) Процентное расщепление рассчитывали путем сравнения площадей под пиками поглощения A 260 для 40S, 60S и 80S субъединиц (рассчитанных, как описано в разделе «Методы») и сравнения относительной численности 80S рибосом и субъединиц.Исходные данные можно найти в S3 Data. Dom34, дупликация мультилокусной области 34; eIF6, фактор инициации эукариот 6; Супрессор подсемейства B Hbs1, Hsp70; Lso2, короткая открытая рамка считывания с поздними аннотациями 2
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s010
(TIF)
S11 Рис. 3D-классификация рибосом Stm1–80S.
Stm1–80S получали в соответствии с протоколами, о которых ранее сообщалось [17], для обогащения связывания Stm1 и использовали в реакциях расщепления in vitro. Stm1–80S собирали из градиента сахарозы после реакций расщепления in vitro с факторами расщепления и без них (контроль).Эти фракции 80S анализировали с помощью крио-ЭМ, в котором частицы оценивали на вращательные состояния рибосом и присутствие Stm1. (A) Популяция 80S рибосом из контрольного анализа расщепления. (B) Популяция 80S рибосом, остающаяся после инкубации с факторами расщепления. Первоначальная 3D-классификация показала, что подавляющее большинство 80S находятся в повернутом состоянии. Эти частицы были дополнительно подвергнуты локальной классификации с использованием эллипсоидной маски, покрывающей область мРНК-канала 40S, для классификации на частицы, содержащие Stm1 (приблизительно 50%), которые были дополнительно уточнены.Плотность Stm1 отображается оранжевым цветом. крио-ЭМ, крио-электронная микроскопия; Stm1, супрессор мишени белка Myb 1
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s011
(TIF)
S1 Таблица. Сбор, уточнение и проверка статистики крио-ЭМ данных.
Обзор сбора крио-ЭМ данных, обработки данных и параметров подгонки модели для дрожжевых нативных и восстановленных комплексов Lso2–80S и для комплексов CCDC124 – EBP1 и SERBP1 – eEF2 – EBP1 человека. CCDC124, домен спиральной спирали, содержащий короткую открытую рамку считывания 124; крио-ЭМ, крио-электронная микроскопия; EBP1, ErbB3-связывающий белок 1; eEF2, фактор элонгации эукариот 2; Lso2, короткая открытая рамка считывания 2 с поздними аннотациями; SERBP1, мРНК-связывающий белок SERPINE1 1
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000780.s012
(DOCX)
S1 Данные. Профили УФ-поглощения, относящиеся к рисункам 5C – 5D и S8.
Этот файл содержит необработанные данные профилей УФ-поглощения для каждого градиента анализа расщепления на листах 2–19. Анализы на расщепление проводили в трех экземплярах для каждой популяции как для экспериментальных реакций, так и для реакций отрицательного контроля. Таблицы 20–25 содержат выровненные данные, включая выравнивание исходных линий и пиков из трех повторных экспериментов, которые являются основой для кривых, показанных на S8 рис.Для фиг. 5C и 5D показан только один из этих трех экземпляров. На диаграммах 1–6 показаны графики для каждого трехкратного эксперимента.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s013
(XLSX)
S2 Данные. Расчеты, относящиеся к рисункам 5E и S9.
Определение площади пика и расчет полосы погрешности. По профилю УФ-поглощения каждого градиента измеряли площади под каждым пиком, соответствующие рибосомным субъединицам или 80S рибосомам. С этой целью начало и конец каждого пика определяли по профилю визуально, а площадь под кривой между этими двумя точками аппроксимировали по отдельным точкам данных с использованием правила трапеций.Для каждого трехкратного эксперимента усредняли долю общей площади пика (40S + 60S + 80S), занимаемую пиками субъединиц (40S + 60S). Исходя из этого, было рассчитано кратное изменение этой фракции между экспериментами, использующими только eIF6, и экспериментами, использующими полный набор факторов расщепления. Затем эти значения были нормализованы к контрольному эксперименту с использованием рибосом, обработанных пуромицином. Планки погрешностей были рассчитаны с использованием гауссова распространения ошибки для (некоррелированных) неопределенностей усредненных площадей пиков.eIF6, фактор инициации эукариот 6
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000780.s014
(XLSX)
S3 Данные. Профили УФ-поглощения и расчеты, относящиеся к S10 Рис.
Этот файл содержит необработанные данные профилей УФ-поглощения для каждого контрольного эксперимента анализа расщепления, показанного на рис. S10. соответствующая легенда.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000780.s015
(XLSX)
Эндоцитоз отключен: несколько путей проникновения в клетку
Swanson JA. Формирование чашек в фагосомы и макропиносомы. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9 : 639–649.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Groves E, Dart AE, Covarelli V, Caron E. Молекулярные механизмы поглощения фагоцитов клетками млекопитающих. Cell Mol Life Sci 2008; 65 : 1957–1976.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Kinchen JM, Ravichandran KS. Созревание фагосом: прохождение кислотного теста. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9 : 781–795.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Huynh KK, Kay JG, Stow JL, Grinstein S.Слияние, деление и секреция во время фагоцитоза. Physiology (Bethesda) 2007; 22 : 366–372.
CAS Google ученый
Haas A. Фагосома: отсек с лицензией на убийство. Трафик 2007; 8 : 311–330.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Kerr MC, Teasdale RD. Определение макропиноцитоза. Трафик 2009; 10 : 364–371.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Falcone S, Cocucci E, Podini P, Kirchhausen T., Clementi E, Meldolesi J. Макропиноцитоз: регулируемая координация движений эндоцитарных и экзоцитарных мембран. J Cell Sci 2006; 119 (Pt 22): 4758–4769.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Хансен К.Г., Брайт Н.А., Ховард Дж., Николс Б.Дж.SDPR вызывает искривление мембраны и участвует в образовании кавеол. Nat Cell Biol 2009; 11 : 807–814.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Доэрти Г.Дж., МакМахон ХТ. Механизмы эндоцитоза. Annu Rev Biochem 2009; 78 : 857–902
Артикул CAS PubMed Google ученый
Bianco C, Griffin FM Jr, Silverstein SC.Исследования рецептора комплемента макрофагов. Изменение рецепторной функции при активации макрофагов. J Exp Med 1975; 141 : 1278–1290.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Райт С.Д., Мейер, Британская Колумбия. Сложные эфиры форбола вызывают последовательную активацию и дезактивацию рецепторов комплемента на полиморфно-ядерных лейкоцитах. J Immunol 1986; 136 : 1759–1764.
CAS PubMed Google ученый
Caron E, Hall A.Идентификация двух различных механизмов фагоцитоза, контролируемых разными Rho GTPases. Science 1998; 282 : 1717–1721.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Аллен Л.А., Адерем А. Молекулярное определение различных структур цитоскелета, участвующих в фагоцитозе, опосредованном рецептором комплемента и Fc, в макрофагах. J Exp Med 1996; 184 : 627–637.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Пател Дж. К., Галан Дж. Э.Дифференциальная активация и функция Rho GTPases во время взаимодействий Salmonella с клеткой-хозяином. J Cell Biol 2006; 175 : 453–463.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Pizarro-Cerda J, Cossart P. Подрыв клеточных функций Listeria monocytogenes . J Pathol 2006; 208 : 215–223.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Beemiller P, Hoppe AD, Swanson JA.Зависимый от фосфатидилинозитол-3-киназы сигнальный переход регулирует ARF1 и ARF6 во время фагоцитоза, опосредованного рецептором Fcgamma. PLoS Biol 2006; 4 : e162.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Hoppe AD, Swanson JA. Cdc42, Rac1 и Rac2 демонстрируют различные паттерны активации во время фагоцитоза. Mol Biol Cell 2004; 15 : 3509–3519.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Парк Х, Кокс Д. Cdc42 регулирует фагоцитоз, опосредованный рецептором Fc {gamma}, посредством активации и фосфорилирования WASP и N-WASP. Mol Biol Cell 2009; 20 : 4500–4508.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Bittner MA, Holz RW.Фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат: динамика актина и регуляция АТФ-зависимой и -независимой секреции. Mol Pharmacol 2005; 67 : 1089–1098.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Скотт С.К., Добсон В., Ботельо Р.Дж., и др. . Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата направляет ремоделирование актина во время фагоцитоза. J Cell Biol 2005; 169 : 139–149.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Cox D, Tseng CC, Bjekic G, Greenberg S. Потребность в фосфатидилинозитол-3-киназе при удлинении псевдопод. J Biol Chem 1999; 274 : 1240–1247.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Браун В., Дешам С., Рапосо Г., и др. .AP-1 и ARF1 контролируют эндосомную динамику в сайтах опосредованного FcR фагоцитоза. Mol Biol Cell 2007; 18 : 4921–4931.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Гарин Дж., Диц Р., Киффер С., и др. . Протеом фагосомы: понимание функций фагосом. J Cell Biol 2001; 152 : 165–180.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Policard A, Bessis M.[Пиноцитоз (феномен Льюиса и его история).] Rev Hematol 1959; 14 : 487–495.
CAS PubMed Google ученый
West MA, Bretscher MS, Watts C. Определенные пути эндоцитоза в клетках карциномы человека A431, стимулированных эпидермальным фактором роста. J Cell Biol 1989; 109 (6, часть 1): 2731–2739.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Mercanti V, Charette SJ, Bennett N, Ryckewaert JJ, Letourneur F, Cosson P.Избирательное исключение мембран в фагоцитарных и макропиноцитарных чашках. J Cell Sci 2006; 119 (Pt 19): 4079–4087.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Swanson JA. Эфиры форбола стимулируют макропиноцитоз и прохождение растворенных веществ через макрофаги. J Cell Sci 1989; 94 (Pt 1): 135–142.
CAS PubMed Google ученый
Keller HU.Диацилглицерины и ФМА являются особенно эффективными стимуляторами жидкостного пиноцитоза нейтрофилов человека. J. Cell Physiol 1990; 145 : 465–471.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Мерсер Дж., Хелениус А. Проникновение вируса макропиноцитозом. Nat Cell Biol 2009; 11 : 510–520.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Sallusto F, Cella M, Danieli C, Lanzavecchia A.Дендритные клетки используют макропиноцитоз и рецептор маннозы для концентрации макромолекул в компартменте класса II главного комплекса гистосовместимости: подавление цитокинами и бактериальными продуктами. J Exp Med 1995; 182 : 389–400.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Ammendolia MG, Bertuccini L, Minelli F, Meschini S, Baldassarri L. Бактерия Sphingomonas , взаимодействующая с эпителиальными клетками. Res Microbiol 2004; 155 : 636–646.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Лю Н.К., Лосинский А.С., Попик В., и др. . Вирус иммунодефицита человека типа 1 проникает в эндотелий микрососудов головного мозга посредством макропиноцитоза, зависящего от липидных рафтов и сигнального пути митоген-активируемой протеинкиназы. J Virol 2002; 76 : 6689–6700.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Hewlett LJ, Prescott AR, Watts C.Ямка с покрытием и пути макропиноцитов обслуживают разные популяции эндосом. J Cell Biol 1994; 124 : 689–703.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Гарретт В.С., Чен Л.М., Крощевски Р., и др. . Контроль развития эндоцитоза в дендритных клетках с помощью Cdc42. Cell 2000; 102 : 325–334.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Dharmawardhane S, Schürmann A, Sells MA, Chernoff J, Schmid SL, Bokoch GM.Регуляция макропиноцитоза р21-активированной киназой-1. Mol Biol Cell 2000; 11 : 3341–3352.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Либерали П., Какконен Э., Тураккио Г., и др. . Закрытие Pak1-зависимых макропинозом требует фосфорилирования CtBP1 / BARS. EMBO J 2008; 27 : 970–981.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Цао Х., Чен Дж., Авони М., Хенли Дж. Р., МакНивен Массачусетс.Динамин 2 опосредует микропиноцитоз жидкой фазы в эпителиальных клетках. J Cell Sci 2007; 120 (Pt 23): 4167–4177.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Лю Ю.В., Сурка М.С., Шрётер Т., Лукиянчук В., Шмид С.Л. Изоформные и сплайс-варианты специфические функции динамина-2, выявленные при анализе условно-нокаутных клеток. Mol Biol Cell 2008; 19 : 5347–5359.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Schlunck G, Damke H, Kiosses WB, и др. .Модуляция локализации и функции Rac динамином. Mol Biol Cell 2004; 15 : 256–267.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Йунг Т., Гилберт Г.Е., Ши Дж., Сильвиус Дж., Капус А., Гринштейн С. Мембранный фосфатидилсерин регулирует поверхностный заряд и локализацию белка. Наука 2008; 319 : 210–213.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сарасий ЖК, мэр С., Рао М.Вызванное хиральностью почкование: механизм эндоцитоза и морфология кавеол, опосредованный рафтом? Biophys J 2007; 92 : 3140–3158.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Пирс BM. Клатрин: уникальный белок, связанный с внутриклеточным переносом мембраны покрытыми везикулами. Proc Natl Acad Sci USA 1976; 73 : 1255–1259.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Рот ТФ, Портер КР.Поглощение белка желтка ооцитом комара Aedes Aegypti . L. J Cell Biol 1964; 20 : 313–332.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Кирххаузен, Т., Клатрин. Annu Rev Biochem 2000; 69 : 699–727.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Марш М., МакМахон ХТ.Структурная эпоха эндоцитоза. Science 1999; 285 : 215–220.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Эрлих М., Болл В., Ван Ойен А., и др. . Эндоцитоз путем случайного инициирования и стабилизации ямок, покрытых клатрином. Cell 2004; 118 : 591–605.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ungewickell EJ, Hinrichsen L.Эндоцитоз: клатрин-опосредованное почкование мембраны. Curr Opin Cell Biol 2007; 19 : 417–425.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Меррифилд С.Дж., Перре Д., Зенисек Д. В живых клетках наблюдается связь между инвагинацией ямок, покрытых клатрином, рекрутированием кортактина и расслоением мембраны. Cell 2005; 121 : 593–606.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Янг А.Структурное понимание клатринового пальто. Semin Cell Dev Biol 2007; 18 : 448–458.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Кирххаузен Т. Адаптеры для клатрин-опосредованного трафика. Annu Rev Cell Dev Biol 1999; 15 : 705–732.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Хаберманн Б.Семейство белков BAR-домена: случай изгиба и связывания? EMBO Rep 2004; 5 : 250–255.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Blood PD, Voth GA. Прямое наблюдение кривизны мембраны, индуцированной доменом Bin / амфифизин / Rvs (BAR), с помощью моделирования молекулярной динамики. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103 : 15068–15072.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Канасеки Т., Кадота К.«Пузырек в корзине». Морфологическое исследование покрытых оболочкой пузырьков, выделенных из нервных окончаний головного мозга морской свинки, с особым упором на механизм движения мембран. J Cell Biol 1969; 42 : 202–220.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Puthenveedu MA, von Zastrow M. Cargo регулирует динамику ямы с клатриновым покрытием. Cell 2006; 127 : 113–124.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Вулф Б.Л., Трехо Дж. Клатрин-зависимые механизмы эндоцитоза G-белковых рецепторов. Трафик 2007; 8 : 462–470.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Бенмера А, Ламаз С. Ямы, покрытые клатрином: да здравствует разница? Трафик 2007; 8 : 970–982.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Карпентер Г, Коэн С. Фактор эпидермального роста. Annu Rev Biochem 1979; 48 : 193–216.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сигизмунд С., Вулк Т., Пури С., и др. . Клатрин-независимый эндоцитоз убиквитинированных грузов. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102 : 2760–2765.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Марш М., Хелениус А. Запись вируса: открытый кунжут. Cell 2006; 124 : 729–740.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Руст MJ, Lakadamyali M, Zhang F, Zhuang X. Сборка эндоцитарного аппарата вокруг отдельных вирусов гриппа во время проникновения вируса. Nat Struct Mol Biol 2004; 11 : 567–573.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Вейга Э, Коссарт П. Listeria захватывает клатрин-зависимый эндоцитарный аппарат, чтобы проникнуть в клетки млекопитающих. Nat Cell Biol 2005; 7 : 894–900.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Palade GE.Тонкая структура кровеносных капилляров. J Appl Phys 1953; 24 : 1424.
Google ученый
Rothberg KG, Heuser JE, Donzell WC, Ying YS, Glenney JR, Anderson RG. Кавеолин, белковый компонент мембранных оболочек кавеол. Cell 1992; 68 : 673–682.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Чадда Р., Хоус М.Т., Пахарь С.Дж., Хэнкок Дж.Ф., Партон Р.Г., мэр С.Активация Cdc42, чувствительная к холестерину, регулирует полимеризацию актина для эндоцитоза через путь GEEC. Трафик 2007; 8 : 702–717.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Hill MM, Bastiani M, Luetterforst R, et al . PTRF-Cavin, консервативный цитоплазматический белок, необходимый для образования и функционирования кавеол. Cell 2008; 132 : 113–24.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Mirre C, Monlauzeur L, Garcia M, Delgrossi MH, Le Bivic A.Устойчивые к детергентам мембранные микродомены клеток Caco-2 не содержат кавеолина. Am J Physiol 1996; 271 (3, часть 1): C887–894.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Vogel U, Sandvig K, van Deurs B. Экспрессия кавеолина-1 и поляризованное образование инвагинированных кавеол в клетках Caco-2 и MDCK II. J Cell Sci 1998; 111 (Pt 6): 825–832.
CAS PubMed Google ученый
Fra AM, Williamson E, Simons K, Parton RG. De novo Образование кавеол в лимфоцитах в результате экспрессии VIP21-кавеолина. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92 : 8655–8659.
Артикул CAS PubMed Google ученый
McMahon HT, Галлоп JL. Кривизна мембраны и механизмы динамического ремоделирования клеточной мембраны. Nature 2005; 438 : 590–596.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Калия М., Кумари С., Чадда Р., Хилл М.М., Партон Р.Г., мэр С.Arf6-независимые GPI-заякоренные белки, обогащенные ранними эндосомными компартментами, сливаются с сортирующими эндосомами посредством Rab5 / фосфатидилинозитол-3′-киназы-зависимого механизма. Mol Biol Cell 2006; 17 : 3689–3704.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Чадда Р., мэр С. PTRF вызывает обрушение. Cell 2008; 132 : 23–24.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Schnitzer JE, Oh P, Pinney E, Allard J.Филипин-чувствительный кавеол-опосредованный транспорт в эндотелии: снижение трансцитоза, скавенджер-эндоцитоза и капиллярной проницаемости избранных макромолекул. J Cell Biol 1994; 127 : 1217–1232.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Benlimame N, Le PU, Nabi IR. Локализация рецептора аутокринного фактора подвижности в кавеолах и клатрин-независимая интернализация его лиганда для сглаживания эндоплазматического ретикулума. Mol Biol Cell 1998; 9 : 1773–1786.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Herreros J, Ng T, Schiavo G. Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания столбнячного токсина и интернализации в нейронах. Mol Biol Cell 2001; 12 : 2947–2960.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Shogomori H, Futerman AH.Токсин холеры обнаружен в нерастворимых в детергенте рафтах / доменах на клеточной поверхности нейронов гиппокампа, но интернализуется через рафт-независимый механизм. J Biol Chem 2001; 276 : 9182–9188.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Андерсон Х.А., Чен Й., Норкин ЛК. Связанный обезьяний вирус 40 перемещается в обогащенные кавеолином мембранные домены, и его проникновение ингибируется лекарствами, которые избирательно разрушают кавеолы. Mol Biol Cell 1996; 7 : 1825–1834.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Пелкманс Л., Хелениус А. Эндоцитоз через кавеолы. Трафик 2002; 3 : 311–320.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Thomsen P, Roepstorff K, Stahlhut M, van Deurs B. Кавеолы представляют собой очень неподвижные микродомены плазматической мембраны, которые не участвуют в конститутивном эндоцитозном переносе. Mol Biol Cell 2002; 13 : 238–250.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Pelkmans L, Kartenbeck J, Helenius A. Кавеолярный эндоцитоз обезьяньего вируса 40 обнаруживает новый двухступенчатый путь везикулярного транспорта к ER. Nat Cell Biol 2001; 3 : 473–483.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сингх Р.Д., Пури В., Валияветтил Дж. Т., Маркс Д. Л., Биттман Р., Пагано РЭ.Селективный кавеолин-1-зависимый эндоцитоз гликосфинголипидов. Mol Biol Cell 2003; 14 : 3254–3265.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Sharma DK, Brown JC, Cheng Z, Holicky EL, Marks DL, Pagano RE. Гликосфинголипид, лактозилцерамид, регулирует кластеризацию бета1-интегрина и эндоцитоз. Cancer Res 2005; 65 : 8233–8241.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Шарма Д.К., Браун Дж. К., Чоудхури А., и др. .Избирательная стимуляция кавеолярного эндоцитоза гликосфинголипидами и холестерином. Mol Biol Cell 2004; 15 : 3114–3122.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
дель Посо MA, Balasubramanian N, Alderson NB, et al . Фосфокавеолин-1 опосредует интернализацию регулируемого интегрином мембранного домена. Nat Cell Biol 2005; 7 : 901–908.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
дель Посо Массачусетс, Олдерсон Н.Б., Киоссы ВБ, Чианг ХХ, Андерсон Р.Г., Шварц Массачусетс. Интегрины регулируют нацеливание Rac за счет интернализации мембранных доменов. Science 2004; 303 : 839–842.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Agaisse H, Burrack LS, Philips JA, Rubin EJ, Perrimon N, Higgins DE.Полногеномный скрининг РНКи на факторы хозяина, необходимые для внутриклеточной бактериальной инфекции. Science 2005; 309 : 1248–1251.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Разани Б., Энгельман Дж. А., Ван XB, и др. . Нулевые по кавеолину-1 мыши жизнеспособны, но демонстрируют признаки гиперпролиферативных и сосудистых аномалий. J Biol Chem 2001; 276 : 38121–38138.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Damm EM, Pelkmans L, Kartenbeck J, Mezzacasa A, Kurzchalia T, Helenius A.Клатрин- и кавеолин-1-независимый эндоцитоз: проникновение обезьяньего вируса 40 в клетки, лишенные кавеол. J Cell Biol 2005; 168 : 477–488.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Киркхэм М., Фуджита А., Чадда Р., и др. . Ультраструктурная идентификация непокрытых кавеолин-независимых носителей раннего эндоцита. J Cell Biol 2005; 168 : 465–476.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Эрнандес-Девьес DJ, Howes MT, Laval SH, Bushby K, Hancock JF, Parton RG. Кавеолин регулирует эндоцитоз белка восстановления мышц дисферлина. J Biol Chem 2008; 283 : 6476–6488.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Lajoie P, Kojic LD, Nim S, Li L, Dennis JW, Nabi IR.Кавеолин-1 регуляция динамин-зависимого, опосредованного рафтом эндоцитоза b-субъединицы холерного токсина происходит независимо от кавеол. J Cell Mol Med 2009 Mar 6. doi: 10.1111 / j.1582–4934.2009.00732.x
Nevins AK, Thurmond DC, Caveolin-1 действует как новый ингибитор диссоциации гуаниновых нуклеотидов Cdc42 в бета-тестах поджелудочной железы. клетки. J Biol Chem 2006; 281 : 18961–18972.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Кениг Дж. Х., Икеда К.Исчезновение и реформация мембраны синаптических везикул после высвобождения медиатора наблюдается при обратимой блокаде восстановления мембраны. J Neurosci 1989; 9 : 3844–3860.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Косака Т., Икеда К. Обратимая блокировка восстановления мембраны и эндоцитоза в клетке гирлянды термочувствительного мутанта Drosophila melanogaster , shibire ts1 . J Cell Biol 1983; 97 : 499–507.
Артикул CAS PubMed Google ученый
van der Bliek AM, Redelmeier TE, Damke H, Tisdale EJ, Meyerowitz EM, Schmid SL. Мутации в человеческом динамине блокируют промежуточную стадию образования покрытых везикул. J Cell Biol 1993; 122 : 553–563.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Cao H, Garcia F, McNiven MA.Дифференциальное распределение изоформ динамина в клетках млекопитающих. Mol Biol Cell 1998; 9 : 2595–2609.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Шпетнер Х.С., Валле РБ. Идентификация динамина, нового механохимического фермента, который опосредует взаимодействия между микротрубочками. Cell 1989; 59 : 421–432.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Чен М.С., Обар Р.А., Шредер С.К., и др. .Множественные формы динамина кодируются shibire , геном Drosophila , участвующим в эндоцитозе. Nature 1991; 351 : 583–586.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Damke H, Baba T, Warnock DE, Schmid SL. Индукция мутантного динамина специфически блокирует образование везикул, покрытых эндоцитозом. J Cell Biol 1994; 127 : 915–934.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Takei K, McPherson PS, Schmid SL, De Camilli P.Инвагинации трубчатой мембраны, покрытые динаминовыми кольцами, индуцируются GTP-гамма S в нервных окончаниях. Nature 1995; 374 : 186–190.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Слепнев В.И., Очоа Г.К., Батлер М.Х., Де Камилли П. Тандемное расположение клатриновых и AP-2 связывающих доменов в амфифизине 1 и нарушение функции клатриновой оболочки фрагментами амфифизина, содержащими эти сайты. J Biol Chem 2000; 275 : 17583–17589.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Takei K, Yoshida Y, Yamada H. Регуляторные механизмы динамин-зависимого эндоцитоза. J Biochem 2005; 137 : 243–247.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Thompson HM и McNiven MA. Dynamin: переключение или увлечение? Curr Biol 2001; 11 : R850.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Ру А, Уйхази К., Фрост А, Де Камилли П. GTP-зависимое скручивание динамина подразумевает сжатие и напряжение в делении мембран. Nature 2006; 441 : 528–531.
Артикул CAS Google ученый
Пукадил Т.Дж., Шмид С.Л. Визуализация в реальном времени деления мембраны, катализируемого динамином, и высвобождения везикул. Cell 2008; 135 : 1263–1275.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Башкиров П.В., Акимов С.А., Евсеев А.И., Шмид С.Л., Циммерберг Дж., Фролов В.А. ГТФазный цикл динамина связан со сжатием и высвобождением мембраны, что приводит к спонтанному делению. Cell 2008; 135 : 1276–1286.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ру А., Антонни Б., Длинная и короткая части мембранного деления. Cell 2008; 135 : 3.
Артикул CAS Google ученый
Хенли Дж. Р., Крюгер Е. В., Освальд Б. Дж., МакНивен Массачусетс. Опосредованная динамином интернализация кавеол. J Cell Biol 1998; 141 : 85–99.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Колпак А.Л., Цзян Дж., Го Д., и др. .Макропиноцитоз, индуцированный отрицательным фактором наведения, в конусе роста играет критическую роль в отталкивающем повороте аксонов. J Neurosci 2009; 29 : 10488–10498.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Lamaze C, Dujeancourt A, Baba T, Lo CG, Benmerah A, Dautry-Varsat A. Рецепторы интерлейкина 2 и устойчивые к детергентам мембранные домены определяют клатрин-независимый путь эндоцитов. Mol Cell 2001; 7 : 661–671.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сааведра Л., Мохамед А., Ма В., Кар С., де Шавес Е.П. Интернализация бета-амилоидного пептида первичными нейронами в отсутствие аполипопротеина E. J Biol Chem 2007; 282 : 35722–35732.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Орт Дж. Д., Крюгер Е. В., Веллер С. Г., МакНивен Массачусетс.Новый эндоцитарный механизм секвестрации и интернализации рецепторов эпидермального фактора роста. Cancer Res 2006; 66 : 3603–3610.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Doxsey SJ, Brodsky FM, Blank GS, Helenius A. Подавление эндоцитоза антиклатриновыми антителами. Cell 1987; 50 : 453–463.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Моя М, Даутри-Варсат А, Гоуд Б, Лувард D, Боке П.Ингибирование образования покрытых ямок в клетках Hep2 блокирует цитотоксичность токсина дифтерии, но не токсина рицина. J Cell Biol 1985; 101 : 548–559.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Коннер С.Д., Шмид С.Л. Регулируемые порталы входа в камеру. Nature 2003; 422 : 37–44.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Ченг З.Дж., Сингх Р.Д., Шарма Д.К., и др. .Четкие механизмы клатрин-независимого эндоцитоза имеют уникальные потребности в сфинголипидах. Mol Biol Cell 2006; 17 : 3197–3210.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Зонку Р., Перера Р.М., Себастьян Р., и др. . Потеря эндоцитарных ямок, покрытых клатрином, при остром истощении фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104 : 3793–3798.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Römer W, Berland L, Chambon V, и др. . Токсин шига вызывает инвагинации канальцевых мембран для его поглощения клетками. Nature 2007; 450 : 670–675.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сабхаранджак С., мэр С. Эндоцитоз и трафик фолатных рецепторов. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56 : 1099–1109.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Сабхаранджак С., Шарма П., Партон Р.Г., мэр С. GPI-заякоренные белки доставляются в рециркулирующие эндосомы через отдельный регулируемый cdc42, клатрин-независимый пиноцитарный путь. Dev Cell 2002; 2 : 411–423.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Spoden G, Freitag K, Husmann M, и др. .Клатрин- и кавеолин-независимое проникновение вируса папилломы человека типа 16 — участие микродоменов, обогащенных тетраспанином (ТЕМ). PLoS ONE 2008; 3 : e3313.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Faire K, Trent F, Tepper JM, Bonder EM. Анализ изоформ динамина в мозге млекопитающих: экспрессия динамина-1 пространственно и временно регулируется во время постнатального развития. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89 : 8376–8380.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Кук Т., Меса К., Уррутия Р. Три гена, кодирующие динамин, по-разному экспрессируются в развивающемся мозге крысы. J Neurochem 1996; 67 : 927–931.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Гуха А., Шрирам В., Кришнан К.С., мэр С. Мутации Shibire выявляют различные динамин-независимые и -зависимые эндоцитарные пути в первичных культурах гемоцитов дрозофилы . J Cell Sci 2003; 116 (Pt 16): 3373–3386.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Грант Д., Унадкат С., Катцен А., Кришнан К.С., Рамасвами М. Вероятные механизмы, лежащие в основе межараллельной комплементации и температурной чувствительности мутаций в локусе shibire Drosophila melanogaster . Genetics 1998; 149 : 1019–1030.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Grassart A, Dujeancourt A, Lazarow PB, Dautry-Varsat A, Sauvonnet N. Клатрин-независимый эндоцитоз, используемый рецептором IL-2, регулируется Rac1, Pak1 и Pak2. EMBO Rep 2008; 9 : 356–362.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Галлетта Б.Дж., Купер Д.А.Актин и эндоцитоз: механизмы и филогения. Curr Opin Cell Biol 2009; 21 : 20–27.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Манн А.Л., Стивенсон Б.Дж., Гели М.И., Рицман Х. end5, end6 и end7: мутации, которые вызывают делокализацию актина и блокируют этап интернализации эндоцитоза в Saccharomyces cerevisiae . Mol Biol Cell 1995; 6 : 1721–1742.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Торет С.П., Друбин Д.Г. Эндоцитарный путь почкующихся дрожжей. J Cell Sci 2006; 119 (Pt 22): 4585–4587.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Каксонен М., Сунь Й., Друбин Д.Г. Путь ассоциации рецепторов, адаптеров и актина во время эндоцитарной интернализации. Cell 2003; 115 : 475–487.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Модульная конструкция аппарата эндоцитоза, опосредованного клатрином и актином. Cell 2005; 123 : 305–320.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Лю Дж., Каксонен М., Друбин Д.Г., Остер Дж.Расщепление эндоцитарных пузырьков силами границы липидной фазы. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103 : 10277–10282.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Гели М.И., Рицман Х. Роль миозинов типа I в рецепторно-опосредованном эндоцитозе дрожжей. Science 1996; 272 : 533–535.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Girao H, Geli MI, Idrissi FZ.Актин в пути эндоцитоза: от дрожжей до млекопитающих. FEBS Lett 2008; 582 : 2112–2119.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Каксонен М., Пэн Х.В., Раувала Х. Ассоциация кортактина с динамическим актином в ламеллиподиях и на эндосомальных пузырьках. J Cell Sci 2000; 113 (Pt 24): 4421–4426.
CAS PubMed Google ученый
Кумари С., Боррони В., Чаудри А., и др. .Никотиновый ацетилхолиновый рецептор интернализуется через Rac-зависимый, динамин-независимый эндоцитотический путь. J Cell Biol 2008; 181 : 1179–1193.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Sokac AM, Co C, Taunton J, Bement W. Cdc42-зависимая полимеризация актина во время компенсаторного эндоцитоза в яйцах Xenopus . Nat Cell Biol 2003; 5 : 727–732.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Шарма П., Варма Р., Сарасий Р.С., и др. . Наноразмерная организация множественных GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Cell 2004; 116 : 577–589.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Бхагатджи П., Левентис Р., Комо Дж., Рефаэй М., Сильвиус Дж. Р.Стерические, а не структурно-специфические факторы определяют эндоцитотический механизм гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных белков. J Cell Biol 2009; 186 : 615–628.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Lundmark R, Doherty GJ, Howes MT, и др. . Белок, активирующий GTPase, GRAF1 регулирует эндоцитозный путь CLIC / GEEC. Curr Biol 2008; 18 : 1802–1808.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Риттер Т.Э., Фахардо О., Мацуэ Х., Андерсон Р.Г., Лейси СВ. Рецепторы фолиевой кислоты, нацеленные на ямки, покрытые клатрином, не могут регулировать усвоение витаминов. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92 : 3824–3828.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Готье NC, Monzo P, Kaddai V, Doye A, Ricci V, Boquet P. Helicobacter pylori Цитотоксин VacA: зонд для клатрин-независимого и Cdc42-зависимого пиноцитарного пути, направляемого к поздним эндосомам. Mol Biol Cell 2005; 16 : 4852–4866.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ярар Д., Уотерман-Сторер К.М., Шмид С.Л. SNX9 связывает сборку актина с сигналами фосфоинозитидов и необходим для ремоделирования мембран во время эндоцитоза. Dev Cell 2007; 13 : 43–56.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Наславский Н., Вейгерт Р., Дональдсон Дж. Конвергенция эндосом, не связанных с клатрином, и эндосом, происходящих из клатрина, включает инактивацию Arf6 и изменения фосфоинозитидов. Mol Biol Cell 2003; 14 : 417–431.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Donaldson JG, Porat-Shliom N, Cohen LA.Клатрин-независимый эндоцитоз: уникальная платформа для передачи сигналов клеток и ремоделирования PM. Cell Signal 2009; 21 : 1–6.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Радхакришна Х, Дональдсон Дж. Фактор ADP-рибозилирования 6 регулирует новый путь рециркуляции плазматической мембраны. J Cell Biol 1997; 139 : 49–61.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Eyster CA, Higginson JD, Huebner R, и др. .Открытие новых грузовых белков, которые проникают в клетки посредством клатриннезависимого эндоцитоза. Трафик 2009; 10 : 590–599.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ниси К., Сайго К. Клеточная интернализация зеленого флуоресцентного белка, слитого с белком VP22 вируса простого герпеса, посредством эндоцитарного пути, опосредованного липидными рафтами, не зависит от кавеол и GTPases семейства Rho, но зависит от динамина и Arf6. J Biol Chem 2007; 282 : 15.
Артикул Google ученый
Balasubramanian N, Scott D, Castle JD, Casanova JE, Schwartz MA. Arf6 и микротрубочки в зависимой от адгезии транспортировке липидных рафтов. Nat Cell Biol 2007; 9 : 11.
Артикул Google ученый
Santy LC, Casanova JE. Активация ARF6 с помощью ARNO стимулирует миграцию эпителиальных клеток за счет последующей активации как Rac1, так и фосфолипазы D. J Cell Biol 2001; 154 : 599–610.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Арнаутова И., Джексон К.Л., Аль-Авар О.С., Дональдсон Дж. Г., Ло Ю.П. Рециклинг Raft-ассоциированного рецептора сортировки прогормонов карбоксипептидазы E требует взаимодействия с ARF6. Mol Biol Cell 2003; 14 : 4448–4457.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Глебов О.О., Брайт Н.А., Николс Б.Дж.Флотилин-1 определяет клатрин-независимый путь эндоцитоза в клетках млекопитающих. Nat Cell Biol 2006; 8 : 46–54.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Бабуке Т., Тикканен Р. Анализ молекулярной функции белков реджи / флотилина. евро J Cell Biol 2007; 86 : 525–532.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Фрик М., Брайт Н.А., Риенто К., Брей А., Меррифид С., Николс Б.Дж.Совместная сборка флотилинов вызывает образование микродоменов мембран, кривизну мембран и отрастание пузырьков. Curr Biol 2007; 17 : 1151–1156.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Волонте Д., Галбиати Ф., Ли С., Нишияма К., Окамото Т., Лисанти М.П. Флотилины / кавателлины по-разному экспрессируются в клетках и тканях и образуют гетеро-олигомерный комплекс с кавеолинами in vivo .Характеристика и эпитопное картирование нового зонда моноклонального антитела флотиллин-1. J Biol Chem 1999; 274 : 12702–12709.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Хансен К.Г., Николс Б.Дж. Молекулярные механизмы клатриннезависимого эндоцитоза. J Cell Sci 2009; 122 (Pt 11): 1713–1721.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Киркхэм М., Никсон С.Дж., Хоус М.Т., и др. .Эволюционный анализ и молекулярное расчленение биогенеза кавеол. J Cell Sci 2008; 121 (Pt 12): 2075–2086.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Гири Б., Диксит В.Д., Гош М.С., и др. . CXCL12-индуцированное разделение флотилина-1 липидными рафтами играет роль в функции CXCR4. Eur J Immunol 2007; 37 : 2104–2116.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Riento K, Frick M, Schafer I, Nichols BJ.Эндоцитоз флотилина-1 и флотилина-2 регулируется киназой Fyn. J Cell Sci 2009; 122 (Pt 7): 912–918.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Xu C, Zhang YH, Thangavel M, и др. . Эндоцитоз CD82 и холестерин-зависимая реорганизация тетраспаниновых сетей и липидных рафтов. FASEB J 2009; 23 : 3273–3288.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Borroni V, Baier CJ, Lang T, и др. .Истощение запасов холестерина активирует быструю интернализацию субмикронных доменов рецепторов ацетилхолина на клеточной мембране. Mol Membr Biol 2007; 24 : 1–15.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Mayor S, Pagano RE. Пути клатриннезависимого эндоцитоза. Nat Rev Mol Cell Biol 2007; 8 : 603–612.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Sandvig K, Torgersen ML, Raa HA, van Deurs B.Клатриннезависимый эндоцитоз: от несуществующего до крайней степени сложности. Histochem Cell Biol 2008; 129 : 267–276.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Komeili A, Li Z, Newman DK, Jensen GJ. Магнитосомы представляют собой инвагинации клеточной мембраны, организованные актин-подобным белком MamK. Science 2006; 311 : 242–245.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Field MC, Габерне-Кастелло C, Dacks JB.Реконструкция эволюции эндоцитарной системы: выводы из геномики и молекулярной клеточной биологии. Adv Exp Med Biol 2007; 607 : 84–96.
Артикул PubMed Google ученый
D’Hondt K, Heese-Peck A, Riezman H. Потребность в белках и липидах для эндоцитоза. Annu Rev Genet 2000; 34 : 255–295.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Wendland B, McCaffery JM, Xiao Q, Emr SD.Новый скрининг на основе клеточного сортировщика с активацией флуоресценции на мутанты эндоцитоза дрожжей идентифицирует дрожжевой гомолог eps15 млекопитающих. J Cell Biol 1996; 135 : 16.
Артикул Google ученый
Burston HE, Maldonado-Báez L, Davey M, et al . Регуляторы эндоцитоза дрожжей выявлены с помощью систематического количественного анализа. J Cell Biol 2009; 185 : 1097–1110.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Fuchs U, Steinberg G.Эндоцитоз у растений-патогенных грибов Ustilago maydis . Protoplasma 2005; 226 : 75–80.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Steinberg G, Schliwa M, Lehmler C, Bölker M, Kahmann R, McIntosh JR. Кинезин патогенного гриба растений Ustilago maydis участвует в образовании вакуолей и миграции цитоплазмы. J Cell Sci 1998; 111 (Pt 15): 2235–2246.
CAS PubMed Google ученый
Lee SC, Schmidtke SN, Dangott LJ, Shaw BD. Aspergillus nidulans ArfB играет роль в эндоцитозе и поляризованном росте. Eukaryot Cell 2008; 7 : 1278–1288.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Хуанг К.Ф., Лю Ю.В., Тунг Л., Линь С.Х., Ли Ф.Дж.Роль Arf3p в развитии полярности, но не в эндоцитозе, у Saccharomyces cerevisiae . Mol Biol Cell 2003; 14 : 3834–3847.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Фишер Дж. А., Ын Ш., Дулан БТ. Эндоцитоз, перенос эндосом и регуляция развития Drosophila . Annu Rev Cell Dev Biol 2006; 22 : 181–206.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Дас Д., Арадхья Р., Ашока Д., Инамдар М. Поглощение макромолекул в перикардиальных клетках Drosophila требует функции рудхиры. Exp Cell Res 2008; 314 : 1804–1810.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Stroschein-Stevenson SL, Foley E, O’Farrell PH, Johnson AD.Фагоцитоз Candida albicans обработанными РНКи клетками S2 Drosophila . Методы Мол Биол 2009; 470 : 347–358.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Balklava Z, Pant S, Fares H, Grant BD. Полногеномный анализ определяет общую потребность в белках полярности в эндоцитарном трафике. Nat Cell Biol 2007; 9 : 1066–1073.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Saxton MJ, Breidenbach RW.Рецептор-опосредованный эндоцитоз у растений энергетически возможен. Plant Physiol 1988; 86 : 993–995.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Эманс Н., Циммерманн С., Фишер Р. Поглощение флуоресцентного маркера в растительных клетках чувствительно к брефельдину А и вортманнину. Plant Cell 2002; 14 : 71–86.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Müller J, Mettbach U, Menzel D, Samaj J.Молекулярное рассечение эндосомных компартментов у растений. Plant Physiol 2007; 145 : 293–304.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Балуска Ф, Самай Дж., Хлавацка А., Кендрик-Джонс Дж., Фолькманн Д. Актин-зависимый эндоцитоз жидкой фазы во внутренних клетках коры верхушек корней кукурузы. J Exp Bot 2004; 55 : 463–473.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Etxeberria E, Baroja-Fernandez E, Muñoz FJ, Pozueta-Romero J.Эндоцитоз, индуцируемый сахарозой, как механизм поглощения питательных веществ в гетеротрофных растительных клетках. Physiol растительных клеток 2005; 46 : 474–481.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Москателли А., Чамполини Ф, Родигьеро С., и др. . Четкие пути эндоцитоза, идентифицированные в трубках пыльцы табака с использованием заряженного нанозолота. J Cell Sci 2007; 120 (Pt 21): 3804–3819.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Dhonukshe P, Aniento F, Hwang I, et al . Клатрин-опосредованный конститутивный эндоцитоз переносчиков оттока ауксина PIN у Arabidopsis. Curr Biol 2007; 17 : 520–527.
Артикул CAS PubMed Google ученый
Dacks JB, Poon PP, Field MC. Филогения эндоцитарных компонентов позволяет понять процесс эволюции неэндосимбиотических органелл. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105 : 588–593.
Артикул PubMed Google ученый
| A / RES / 72/1-A / RES / 72 / … (числовая последовательность в обратном порядке) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Постановление № | Пленарное заседание или Cttee. | Пункт повестки дня № | Протокол встречи / Дата / Пресс-релиз / Голосование | Осадка | Тема |
| Ссылки на документы будут работать после публикации документа в Системе официальной документации. | |||||
| A / RES / 72/313 | Плен. | 121 | A / 72 / PV.116 17 сентября 2018 г. GA / 12051 без голосования | A / 72/896 | Активизация работы Генеральной Ассамблеи |
| A / RES / 72/312 | Плен. | 131 | A / 72 / PV.115 13 сентября 2018 г. GA / 12050 без голоса | А / 72 / L.69 | Действия Организации Объединенных Наций по борьбе с сексуальной эксплуатацией и надругательством |
| A / RES / 72/311 | Плен. | 66 (б) | A / 72 / PV.113 10 сентября 2018 г. GA / 12048 158-1-0 | A / 72 / L.59 / Rev.1 | Выполнение рекомендаций, содержащихся в докладе Генерального секретаря о причинах конфликтов и поощрении прочного мира и устойчивого развития в Африке |
| A / RES / 72/310 | Плен. | 66 (а) | A / 72 / PV.113 10 сентября 2018 г. GA / 12048 159-2-0 | A / 72 / L.57 / Rev.1 | Новое партнерство в интересах развития Африки: прогресс в реализации и международная поддержка |
| A / RES / 72/309 | Плен. | 13 | A / 72 / PV.113 10 сентября 2018 г. GA / 12048 без голоса | A / 72 / L.68 | Консолидация достижений и активизация усилий по борьбе с малярией и ее ликвидации в развивающихся странах, особенно в Африке, к 2030 году |
| A / RES / 72/308 | Плен. | 14 и 117 | A / 72 / PV.110 6 августа 2018 г. GA / 12044 без голоса | A / 72 / L.67 | Условия межправительственной конференции по принятию Глобального договора о безопасной, упорядоченной и легальной миграции |
| A / RES / 72/307 | Плен. | 19 (б) | A / 72 / PV.109 27 июля 2018 г. GA / 12043 без голоса | А / 72 / L.60 / Rev.1 & Corr.1 & Add.1 | Условия проведения обзора на высоком уровне Программы действий по ускоренному развитию малых островных развивающихся государств (Программа Самоа) |
| A / RES / 72/306 | Плен. | 147 | A / 72 / PV.108 24 июля 2018 г. GA / 12042 без голоса | A / 72 / L.63 & Add.1 | Осуществление Десятилетия действий Организации Объединенных Наций в области питания (2016-2025) |
| A / RES / 72/305 | Плен. | 14 и 117 | A / 72 / PV.107 23 июля 2018 г. GA / 12041 без голоса | A / 72 / L.64 | Обзор осуществления резолюции 68/1 Генеральной Ассамблеи об укреплении Экономического и Социального Совета |
| A / RES / 72/304 | C.4 | 55 | A / 72 / PV.106 13 июля 2018 г. GA / 12040 без голоса | А / 72/449 / Add.1 | Всестороннее рассмотрение всего вопроса об операциях по поддержанию мира во всех их аспектах |
| A / RES / 72/303 | C.5 | 134 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/682 / Add.2 | Прогресс в создании системы подотчетности в Секретариате Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/302 | C.5 | 164 | А / 72 / PV.104 5 июля 2018 GA / 12039 без голоса | A / 72/912 | Финансирование мероприятий, вытекающих из резолюции 1863 (2009) Совета Безопасности |
| A / RES / 72/301 | C.5 | 162 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/910 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по проведению референдума в Западной Сахаре |
| A / RES / 72/300 | С.5 | 161 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/911 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций в Южном Судане |
| A / RES / 72/299 | C.5 | 160 б) | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 125-3-1 | A / 72/905 | Финансирование Временных сил Организации Объединенных Наций в Ливане |
| A / RES / 72/298 | С.5 | 160 (а) | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/906 | Финансирование Сил Организации Объединенных Наций по наблюдению за разъединением |
| A / RES / 72/297 | C.5 | 159 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/907 | Финансирование Многопрофильной комплексной миссии Организации Объединенных Наций по стабилизации в Мали |
| A / RES / 72/296 | С.5 | 158 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/914 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций в Либерии |
| A / RES / 72/295 | C.5 | 157 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/909 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по делам временной администрации в Косово |
| A / RES / 72/294 | С.5 | 156 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/903 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по стабилизации в Гаити |
| A / RES / 72/293 | C.5 | 154 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/908 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по стабилизации в Демократической Республике Конго |
| A / RES / 72/292 | С.5 | 153 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/904 | Финансирование Вооруженных сил Организации Объединенных Наций по поддержанию мира на Кипре |
| A / RES / 72/291 | C.5 | 152 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/915 | Финансирование Операции Организации Объединенных Наций в Кот-д’Ивуаре |
| A / RES / 72/290 | С.5 | 151 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/916 | Финансирование Многопрофильной комплексной миссии Организации Объединенных Наций по стабилизации в Центральноафриканской Республике |
| A / RES / 72/289 | C.5 | 150 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/913 | Финансирование Временных сил Организации Объединенных Наций по безопасности для Абьея |
| A / RES / 72/288 | С.5 | 149 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/917 DR IV | Вспомогательный счет для операций по поддержанию мира |
| A / RES / 72/287 | C.5 | 149 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/917 DR III | Финансирование Базы материально-технического снабжения Организации Объединенных Наций в Бриндизи, Италия |
| A / RES / 72/286 | С.5 | 149 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/917 DR II | Финансирование регионального центра обслуживания в Энтеббе, Уганда |
| A / RES / 72/285 | C.5 | 149 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/917 DR I | Ставки возмещения расходов странам, предоставляющим воинские и полицейские контингенты |
| A / RES / 72/284 | Плен. | 118 | A / 72 / PV.101 26 июня 2018 г. GA / 12035 без голоса | A / 72 / L.62 | Глобальный контртеррористический обзор Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/283 | Плен. | 65 | A / 72 / PV.98 22 июня 2018 г. GA / 12030 без голоса | A / 72 / L.61 & Add.1 | Укрепление регионального и международного сотрудничества для обеспечения мира, стабильности и устойчивого развития в регионе Центральной Азии |
| A / RES / 72/282 | Плен. | 35 | A / 72 / PV.98 22 июня 2018 г. GA / 12030 64-15-83 | A / 72 / L.58 | Полный и безоговорочный вывод иностранных вооруженных сил с территории Республики Молдова |
| A / RES / 72/281 | Плен. | 14 | A / 72 / PV.95 12 июня 2018 г. GA / 12025 без голоса | A / 72 / L.56 & Add.1 | Международный день семейных переводов |
| A / RES / 72/280 | Плен. | 35 | A / 72 / PV.95 12 июня 2018 г. GA / 12025 81-16-62 | A / 72 / L.55 | Статус внутренне перемещенных лиц и беженцев из Абхазии, Грузия, и Цхинвальского региона / Южной Осетии, Грузия |
| A / RES / 72/279 | Плен. | 24 (а) | A / 72 / PV.91 31 мая 2018 г. GA / 12020 без голоса | А / 72 / L.52 | Перемещение системы развития Организации Объединенных Наций в контексте четырехгодичного всеобъемлющего обзора политики оперативной деятельности в целях развития системы Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/278 | Плен. | 126 | A / 72 / PV.89 22 мая 2018 г. GA / 12016 без голоса | A / 72 / L.54 & Add.1 | Взаимодействие между Организацией Объединенных Наций, национальными парламентами и Межпарламентским союзом |
| A / RES / 72/277 | Плен. | 14 | A / 72 / PV.88 10 мая 2018 г. GA / 12015 143-6-6 | A / 72 / L.51 & Add.1 (с поправками, внесенными документом A / 72 / L.53) | На пути к глобальному пакту об окружающей среде |
| A / RES / 72/276 | Плен. | 65 | A / 72 / PV.87 26 апреля 2018 г. GA / 12014 без голоса | A / 72 / L.49 | Последующие меры в связи с докладом Генерального секретаря о миростроительстве и поддержании мира |
| A / RES / 72/275 | Плен. | 123 | A / 72 / PV.82 12 апреля 2018 г. GA / 12008 без голоса | A / 72 / L.45 & Add.1 | Международная ассоциация постоянных представителей при Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/274 | Плен. | 117 | A / 72 / PV.82 12 апреля 2018 г. GA / 12008 без голоса | A / 72 / L.46 | Рамки, условия, формат и организация третьего заседания Генеральной Ассамблеи высокого уровня по предупреждению и борьба с неинфекционными заболеваниями |
| A / RES / 72/273 | Плен. | 19 | A / 72 / PV.82 12 апреля 2018 г. GA / 12008 без голоса | A / 72 / L.42 & Add.1 | Сотрудничество между ООН и Международным фондом спасения Арала |
| A / RES / 72/272 | Плен. | 11 | A / 72 / PV.82 12 апреля 2018 г. GA / 12008 без голоса | A / 72 / L.43 & Add.1 | Всемирный день велосипеда |
| A / RES / 72/271 | Плен. | 12 | A / 72 / PV.82 12 апреля 2018 г. GA / 12008 без голоса | A / 72 / L.48 & Add.1 | Повышение безопасности дорожного движения во всем мире |
| A / RES / 72/270 | C.5 | 148 | A / 72 / PV.81 4 апреля 2018 г. GA / 12007 без голоса | A / 72/669 / Add.1 | Строительство нового помещения для Международного остаточного механизма для уголовных трибуналов, отделение в Аруше |
| A / RES / 72/269 | С.5 | 142 | A / 72 / PV.81 4 апреля 2018 г. GA / 12007 без голоса | A / 72/810 | Объединенная инспекционная группа |
| A / RES / 72/268 | Плен. | 127 | A / 72 / PV.81 4 апреля 2018 г. GA / 12007 без голоса | A / 72 / L.40 | Объем, условия, формат и организация встречи высокого уровня по борьбе с туберкулезом Заявление о финансовых последствиях (A / 72/811) |
| A / RES / 72/267 | Плен. | 33 | A / 72 / PV.78 7 марта 2018 г. GA / 12002 без голоса | A / 72 / L.41 | Роль алмазов в разжигании конфликтов: разрыв связи между незаконными сделками с алмазным сырьем алмазы и вооруженные конфликты как вклад в предотвращение и урегулирование конфликтов |
| A / RES / 72/266 B | C.5 | 134 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/682 / Add.2 | Изменение парадигмы управления в Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/266 | C.5 | 134 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/682 | Изменение парадигмы управления в Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/265 | C.5 | 136 | А / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/681 DR V | Фонд оборотных средств на двухгодичный период 2018-2019 гг. |
| A / RES / 72/264 | C.5 | 136 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/681 DR IV | Непредвиденные чрезвычайные расходы на двухгодичный период 2018-2019 гг. |
| A / RES / 72/263 A-C | С.5 | 136 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/681 DR III | Бюджет по программам на двухгодичный период 2018-2019 гг. |
| A / RES / 72/262 C | C.5 | 136 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/681 / Add.2 | Специальные вопросы, касающиеся предлагаемого бюджета по программам на двухгодичный период 2018-2019 годов |
| A / RES / 72/262 B | С.5 | 136 | A / 72 / PV.81 4 апреля 2018 г. GA / 12007 без голоса | A / 72/681 / Add.1 | Специальные вопросы, касающиеся предлагаемого бюджета по программам на двухгодичный период 2018-2019 годов |
| A / RES / 72/262 | C.5 | 136 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/681 DR II | Специальные вопросы, касающиеся предлагаемого бюджета по программам на двухгодичный период 2018-2019 годов |
| A / RES / 72/261 | С.5 | 136 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/681 DR I | Вопросы, касающиеся предлагаемого бюджета по программам на двухгодичный период 2018-2019 гг. |
| A / RES / 72/260 B | C.5 | 165 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/670 / Add.1 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по поддержке правосудия в Гаити |
| A / RES / 72/260 | С.5 | 165 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/670 | Финансирование Миссии Организации Объединенных Наций по поддержке правосудия в Гаити |
| A / RES / 72/259 B | C.5 | 163 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/671 / Add.1 | Финансирование Смешанной операции Африканского союза-Организации Объединенных Наций в Дарфуре |
| A / RES / 72/259 | С.5 | 163 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/671 | Финансирование Смешанной операции Африканского союза-Организации Объединенных Наций в Дарфуре |
| A / RES / 72/258 B | C.5 | 148 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/669 / Add.2 | Финансирование Международного остаточного механизма для уголовных трибуналов |
| A / RES / 72/258 | С.5 | 148 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/669 | Финансирование Международного остаточного механизма для уголовных трибуналов |
| A / RES / 72/257 | C.5 | 147 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/664 | Финансирование Международного трибунала для судебного преследования лиц, ответственных за серьезные нарушения международного гуманитарного права, совершенные на территории бывшей Югославии с 1991 года |
| A / RES / 72/256 | С.5 | 146 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/665 | Отправление правосудия в Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/255 | C.5 | 143 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/666 | Общая система ООН |
| A / RES / 72/254 | С.5 | 141 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/667 | Управление людскими ресурсами |
| A / RES / 72/253 A-B | C.5 | 135 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72/668 | Бюджет по программам на двухгодичный период 2016-2017 гг. |
| A / RES / 72/252 | Плен. | 130 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72 / L.19 | Расследование условий и обстоятельств, приведших к трагической гибели Дага Хаммаршельда и членов сопровождающей его партии Заявление о финансовых последствиях (A / 72/678) |
| A / RES / 72/251 | C.1 | 99 | А / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 114-30-14 | A / 72/409 DR XXVIII | Последующие меры по итогам заседания Генеральной Ассамблеи высокого уровня 2013 года по ядерному разоружению Заявление о финансовых последствиях (A / 72/673) |
| A / RES / 72/250 | C.1 | 97 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 108-5-47 | A / 72/407 DR III | Дальнейшие практические меры по предотвращению гонки вооружений в космическом пространстве Заявление о финансовых последствиях (A / 72/679) |
| A / RES / 72/249 | Плен. | 77 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72 / L.7 | Международный юридически обязательный документ в соответствии с Конвенцией Организации Объединенных Наций по морскому праву о сохранении и устойчивом использовании морского биологического разнообразия за пределами действия национальной юрисдикции Заявление о финансовых последствиях (A / 72/677) |
| A / RES / 72/248 | С.3 | 72 (в) | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 122-10-24 | A / 72/439 / Add.3 DR V | Положение с правами человека в Мьянме Заявление о финансовых последствиях (A / 72/674) |
| A / RES / 72/247 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | А / 72/439 / Add.2 DR XXII | Двадцатая годовщина и продвижение Декларации о праве и обязанности отдельных лиц, групп и органов общества поощрять и защищать общепризнанные права человека и основные свободы Заявление о финансовых последствиях (A / 72/675) |
| A / RES / 72/246 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 95-1-58 | А / 72/439 / Add.2 ДР XXI | Последствия терроризма для осуществления прав человека Заявление о финансовых последствиях (A / 72/680) |
| A / RES / 72/245 | C.3 | 68 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 162-0-1 | А / 72/435 DR II | Права ребенка Заявление о финансовых последствиях (A / 72/672) |
| A / RES / 72/244 | Плен. | 14 и 117 | A / 72 / PV.76 24 декабря 2017 г. GA / 11997 без голоса | A / 72 / L.9 | Условия для межправительственных конференций по принятию Глобального договора о безопасной, упорядоченной и легальной миграции Заявление о финансовых последствиях (A / 72/676) |
| A / RES / 72/243 | Плен. | 65 | A / 72 / PV.75 22 декабря 2017 г. GA / 11996 без голоса | А / 72 / L.39 | Саммит мира Нельсона Манделы |
| A / RES / 72/242 | Плен. | 177 | A / 72 / PV.75 22 декабря 2017 г. GA / 11996 без голоса | A / 72 / L.38 & Add.1 | Влияние быстрых технологических изменений на достижение целей в области устойчивого развития |
| A / RES / 72/241 | Плен. | 15 | А / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72 / L.32 | Мир против насилия и насильственного экстремизма |
| A / RES / 72/240 | C.2 | 63 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 163-6-11 | A / 72/428 | Постоянный суверенитет палестинского народа на оккупированной палестинской территории, включая Восточный Иерусалим, и арабского населения на оккупированных сирийских Голанах над своими природными ресурсами |
| A / RES / 72/239 | С.2 | 25 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | A / 72/426 DR II | Десятилетие семейных фермерских хозяйств Организации Объединенных Наций (2019-2028) |
| A / RES / 72/238 | C.2 | 25 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 185-1-0 | A / 72/426 DR I | Развитие сельского хозяйства, продовольственная безопасность и питание |
| A / RES / 72/237 | С.2 | 24 (б) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/425 / Add.2 | Сотрудничество Юг-Юг |
| A / RES / 72/236 | C.2 | 24 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/425 / Add.1 | Оперативная деятельность в целях развития системы Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/235 | С.2 | 23 (в) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/424 / Add.3 | Развитие человеческих ресурсов |
| A / RES / 72/234 | C.2 | 23б | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/424 / Add.2 | Женщины в развитии |
| A / RES / 72/233 | С.2 | 23 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/424 / Add.1 | Проведение второго Десятилетия Организации Объединенных Наций по борьбе за ликвидацию нищеты (2008–2017 годы) |
| A / RES / 72/232 | C.2 | 22 б) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | А / 72/423 / Add.2 | Последующие меры по итогам второй Конференции Организации Объединенных Наций по развивающимся странам, не имеющим выхода к морю |
| A / RES / 72/231 | C.2 | 22 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/423 / Add.1 | Последующие меры по итогам четвертой Конференции Организации Объединенных Наций по наименее развитым странам |
| A / RES / 72/230 | С.2 | 21 (г) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/422 / Add.4 | Сотрудничество в целях развития со странами со средним уровнем дохода |
| A / RES / 72/229 | C.2 | 21 (в) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 185-2-0 | A / 72/422 / Add.3 | Культура и устойчивое развитие |
| A / RES / 72/228 | С.2 | 21б | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/422 / Add.2 | Наука, технологии и инновации в целях развития |
| A / RES / 72/227 | C.2 | 21 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 184-2-0 | A / 72/422 / Add.1 | Роль Организации Объединенных Наций в содействии развитию в условиях глобализации и взаимозависимости |
| A / RES / 72/226 | С.2 | 20 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/421 | Осуществление решений конференций Организации Объединенных Наций по населенным пунктам и жилью и устойчивому развитию Городское развитие и укрепление Программы Организации Объединенных Наций по населенным пунктам (ООН-Хабитат) |
| A / RES / 72/225 | C.2 | 19 (к) | А / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 / Add.10 | Борьба с песчаными и пыльными бурями |
| A / RES / 72/224 | C.2 | 19 (я) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 183-2-1 | A / 72/420 / Add.9 | Обеспечение доступа к доступной, надежной, устойчивой и современной энергии для всех |
| A / RES / 72/223 | С.2 | 19 (в) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 / Add.8 | В гармонии с природой |
| A / RES / 72/222 | C.2 | 19 (г) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 / Add.7 | Образование в интересах устойчивого развития в рамках Повестки дня в области устойчивого развития на период до 2030 года |
| A / RES / 72/221 | С.2 | 19 (ж) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | A / 72/420 / Add.6 | Осуществление Конвенции о биологическом разнообразии и ее вклад в устойчивое развитие |
| A / RES / 72/220 | C.2 | 19 (д) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | А / 72/420 / Add.5 | Осуществление Конвенции Организации Объединенных Наций по борьбе с опустыниванием в тех странах, которые переживают серьезный кризис Засуха и / или опустынивание, особенно в Африке |
| A / RES / 72/219 | C.2 | 19 (г) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | A / 72/420 / Add.4 | Защита глобального климата для нынешнего и будущих поколений человечества |
| A / RES / 72/218 | С.2 | 19 (в) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | A / 72/420 / Add.3 | Снижение риска бедствий |
| A / RES / 72/217 | C.2 | 19 (б) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голосования | A / 72/420 / Add.2 | Последующие меры и реализация Программы действий по ускоренному развитию малых островных развивающихся государств (Путь Самоа) и Маврикийской стратегии по дальнейшему осуществлению Программы действий по устойчивому развитию малых островных развивающихся государств |
| A / RES / 72/216 | С.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 131-48-4 | A / 72/420 / Add.1 | Осуществление Повестки дня на XXI век, Программы действий по дальнейшему осуществлению Повестки дня на XXI век и результатов Всемирный саммит по устойчивому развитию и Конференция Организации Объединенных Наций по устойчивому развитию |
| A / RES / 72/215 | C.2 | 19 | А / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 152-1-29 | A / 72/420 DR VII | Сельскохозяйственные технологии для устойчивого развития |
| A / RES / 72/214 | C.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 DR VI | Устойчивый туризм и устойчивое развитие в Центральной Америке |
| A / RES / 72/213 | С.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 DR V | Международное сотрудничество и координация в целях реабилитации человека и окружающей среды и экономического развития Семипалатинской области Казахстана |
| A / RES / 72/212 | C.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 DR IV | Укрепление связей между всеми видами транспорта для достижения целей в области устойчивого развития |
| A / RES / 72/211 | С.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 DR III | Всемирный день пчел |
| A / RES / 72/210 | C.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/420 DR II | Международный год верблюдовых 2024 |
| A / RES / 72/209 | С.2 | 19 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 163-7-9 | А / 72/420 DR I | Нефтяное пятно на берегу Ливана |
| A / RES / 72/208 | C.2 | 18 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/419 | Последующая деятельность по итогам Международных конференций по финансированию развития и осуществление их решений |
| A / RES / 72/207 | С.2 | 17 (ж) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/418 / Add.6 | Содействие международному сотрудничеству в борьбе с незаконными финансовыми потоками в целях содействия устойчивому развитию |
| A / RES / 72/206 | C.2 | 17 (д) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | А / 72/418 / Add.5 | Доступность финансовых услуг для устойчивого развития |
| A / RES / 72/205 | C.2 | 17 (г) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 182-2-0 | A / 72/418 / Add.4 | Товары |
| A / RES / 72/204 | C.2 | 17 (в) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | А / 72/418 / Add.3 | Устойчивость внешнего долга и развитие |
| A / RES / 72/203 | C.2 | 17б | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 180-2-0 | A / 72/418 / Add.2 | Международная финансовая система и развитие |
| A / RES / 72/202 | C.2 | 17 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 182-2-0 | А / 72/418 / Add.1 DR II | Международная торговля и развитие |
| A / RES / 72/201 | C.2 | 17 (а) | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 130-2-48 | A / 72/418 / Add.1 DR I | Односторонние экономические меры как средство политического и экономического принуждения развивающихся стран |
| A / RES / 72/200 | C.2 | 16 | А / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72/417 | Информационные и коммуникационные технологии для устойчивого развития |
| A / RES / 72/199 | Плен. | 123 и 124 | A / 72 / PV.74 20 декабря 2017 г. GA / 11994 без голоса | A / 72 / L.33 | Реструктуризация компонента мира и безопасности Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/198 | С.3 | 108 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/441 DR II | Международное сотрудничество в решении мировой проблемы наркотиков и борьбе с ней |
| A / RES / 72/197 | C.3 | 108 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/441 DR I | Содействие осуществлению Руководящих принципов альтернативного развития Организации Объединенных Наций и связанных с ними обязательства по альтернативному развитию и региональному, межрегиональному и международному сотрудничеству в целях развития, сбалансированная политика контроля над наркотиками, направленная на решение социально-экономических проблем |
| A / RES / 72/196 | С.3 | 107 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/440 DR V | Укрепление программы Организации Объединенных Наций в области предупреждения преступности и уголовного правосудия, в частности ее потенциала в области технического сотрудничества |
| A / RES / 72/195 | C.3 | 107 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/440 DR IV | Улучшение координации усилий по борьбе с торговлей людьми |
| A / RES / 72/194 | С.3 | 107 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/440 DR III | Техническая помощь в реализации международных конвенций и протоколов, касающихся борьбы с терроризмом |
| A / RES / 72/193 | C.3 | 107 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/440 DR II | Содействие практическому применению Минимальных стандартных правил обращения с Заключенные (Правила Нельсона Манделы) |
| A / RES / 72/192 | С.3 | 107 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/440 DR I | Последующие меры по итогам тринадцатого Конгресса Организации Объединенных Наций по предупреждению преступности и уголовному правосудию и подготовка к Четырнадцатый Конгресс Организации Объединенных Наций по предупреждению преступности и уголовному правосудию |
| A / RES / 72/191 | C.3 | 72 (в) | А / 72 / PV.73 19 декабря 2017 GA / 11993 109-17-58 | A / 72/439 / Add.3 DR IV | Положение в области прав человека в Сирийской Арабской Республике |
| A / RES / 72/190 | C.3 | 72 (в) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 70-26-76 | A / 72/439 / Add.3 DR III | Положение с правами человека в Автономной Республике Крым и городе Севастополе, Украина |
| A / RES / 72/189 | С.3 | 72 (в) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 81-30-70 | A / 72/439 / Add.3 DR II | Положение в области прав человека в Исламской Республике Иран |
| A / RES / 72/188 | C.3 | 72 (в) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.3 DR I | Положение в области прав человека в Корейской Народно-Демократической Республике |
| A / RES / 72/187 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XXVI | Субрегиональный центр по правам человека и демократии в Центральной Африке |
| A / RES / 72/186 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XXV | Роль омбудсмена, посредника и других национальных правозащитных учреждений в поощрении и защите прав человека |
| A / RES / 72/185 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 129-53-3 | A / 72/439 / Add.2 DR XXIV | Глобализация и ее влияние на полное осуществление всех прав человека |
| A / RES / 72/184 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XXIII | Эффективное продвижение Декларации о правах лиц, принадлежащих к национальной или этнической принадлежности, Религиозные и языковые меньшинства |
| A / RES / 72/183 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XX | Международная конвенция для защиты всех лиц от насильственных исчезновений |
| A / RES / 72/182 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XIX | Защита внутренне перемещенных лиц и оказание им помощи |
| A / RES / 72/181 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XVIII | Национальные учреждения по поощрению и защите прав человека |
| A / RES / 72/180 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XVII | Защита прав человека и основных свобод в условиях противодействия терроризму |
| A / RES / 72/179 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XVI | Защита мигрантов |
| A / RES / 72/178 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 183-1-2 | A / 72/439 / Add.2 DR XV | Права человека на безопасную питьевую воду и санитарию |
| A / RES / 72/177 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XIV | Свобода религии или убеждений |
| A / RES / 72/176 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XIII | Борьба с нетерпимостью, формированием негативных стереотипов, стигматизацией, дискриминацией, подстрекательством к насилию и насилие в отношении лиц на основе религии или убеждений |
| A / RES / 72/175 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR XII | Безопасность журналистов и проблема безнаказанности |
| A / RES / 72/174 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 134-52-0 | A / 72/439 / Add.2 DR XI | Содействие справедливому географическому распределению членского состава договорных органов по правам человека |
| A / RES / 72/173 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 187-2-0 | A / 72/439 / Add.2 DR X | Право на питание |
| A / RES / 72/172 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 129-54-5 | A / 72/439 / Add.2 DR IX | Поощрение демократического и справедливого международного порядка |
| A / RES / 72/171 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR VIII | Укрепление деятельности Организации Объединенных Наций в области прав человека посредством развития международного сотрудничества и важность неизбирательности, беспристрастности и объективности |
| A / RES / 72/170 | C.3 | 72 (б) | А / 72 / PV.73 19 декабря 2017 GA / 11993 136-53-0 | A / 72/439 / Add.2 DR VII | Права человека и культурное разнообразие |
| A / RES / 72/169 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.2 DR VI | Расширение международного сотрудничества в области прав человека |
| A / RES / 72/168 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 134-53-0 | A / 72/439 / Add.2 DR V | Права человека и односторонние принудительные меры |
| A / RES / 72/167 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 140-10-38 | A / 72/439 / Add.2 DR IV | Право на развитие |
| A / RES / 72/166 | С.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 188-0-1 | A / 72/439 / Add.2 DR III | Центр Организации Объединенных Наций по обучению и документации в области прав человека для Юго-Западной Азии и арабского региона |
| A / RES / 72/165 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | А / 72/439 / Add.2 DR II | Международный день памяти жертв терроризма |
| A / RES / 72/164 | C.3 | 72 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 175-0-13 | A / 72/439 / Add.2 DR I | Усиление роли Организации Объединенных Наций в повышении периодической и подлинной выборы и содействие демократизации |
| A / RES / 72/163 | С.3 | 72 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 / Add.1 DR II | Пытки и другие жестокие, бесчеловечные или унижающие достоинство виды обращения и наказания |
| A / RES / 72/162 | C.3 | 72 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 187-0-0 | A / 72/439 / Add.1 DR I | Осуществление Конвенции о правах инвалидов и Факультативный протокол к нему: положение женщин и девочек-инвалидов |
| A / RES / 72/161 | С.3 | 72 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/439 | Международный день жестовых языков |
| A / RES / 72/160 | C.3 | 71 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 176-7-4 | A / 72/438 DR III | Право палестинского народа на самоопределение |
| A / RES / 72/159 | С.3 | 71 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/438 DR II | Всеобщее осуществление права народов на самоопределение |
| A / RES / 72/158 | C.3 | 71 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 128-51-6 | А / 72/438 DR I | Использование наемников как средство нарушения прав человека и противодействия осуществлению права народов на самоопределение |
| A / RES / 72/157 | С.3 | 70 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 133-10-43 | A / 72/437 DR II | Глобальный призыв к конкретным действиям для полной ликвидации расизма, расовой дискриминации, ксенофобии и связанных с ними нетерпимость и всеобъемлющее осуществление Дурбанской декларации и Программы действий | и последующие меры.
| A / RES / 72/156 | C.3 | 70 (а) | А / 72 / PV.73 19 декабря 2017 GA / 11993 133-2-49 | A / 72/437 DR I | Борьба с прославлением нацизма, неонацизма и других практик, способствующих разжиганию современные формы расизма, расовой дискриминации, ксенофобии и связанной с ними нетерпимости |
| A / RES / 72/155 | C.3 | 69 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/436 | Права коренных народов |
| A / RES / 72/154 | С.3 | 68 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | А / 72/435 DR I | Девочки |
| A / RES / 72/153 | C.3 | 67 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 123-2-58 | A / 72/434 | Доклад Совета по правам человека |
| A / RES / 72/152 | С.3 | 64 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/433 DR III | Помощь беженцам, репатриантам и перемещенным лицам в Африке |
| A / RES / 72/151 | C.3 | 64 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/433 DR II | Расширение Исполнительного комитета Программы Верховного комиссара Организации Объединенных Наций по делам беженцев |
| A / RES / 72/150 | С.3 | 64 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/433 DR I | Управление Верховного комиссара Организации Объединенных Наций по делам беженцев |
| A / RES / 72/149 | C.3 | 28 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/432 DR III | Насилие в отношении трудящихся женщин-мигрантов |
| A / RES / 72/148 | С.3 | 28 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/432 DR II | Улучшение положения женщин и девочек в сельской местности |
| A / RES / 72/147 | C.3 | 28 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | А / 72/432 DR I | Последующие меры по итогам четвертой Всемирной конференции по положению женщин и полное выполнение Пекинской Декларация и Платформа действий и итоги двадцать третьей специальной сессии Генеральной Ассамблеи |
| A / RES / 72/146 | С.3 | 27 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/431 DR VII | Политика и программы с участием молодежи |
| A / RES / 72/145 | C.3 | 27 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/431 DR VI | Последующие меры в связи с двадцатой годовщиной Международного года семьи и в последующий период |
| A / RES / 72/144 | С.3 | 27 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/431 DR V | Последующие меры по итогам Второй Всемирной ассамблеи по проблемам старения |
| A / RES / 72/143 | C.3 | 27 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | А / 72/431 DR IV | Кооперативы в социальном развитии |
| A / RES / 72/142 | С.3 | 27 (б) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/431 DR III | Содействие социальной интеграции через социальную интеграцию |
| A / RES / 72/141 | C.3 | 27 (а) | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 184-2-0 | A / 72/431 DR II | Осуществление решений Всемирной встречи на высшем уровне в интересах социального развития и двадцать четвертой специальной сессия Генеральной Ассамблеи |
| A / RES / 72/140 | С.3 | 27 | A / 72 / PV.73 19 декабря 2017 г. GA / 11993 без голоса | A / 72/431 DR I | Лица с альбинизмом |
| A / RES / 72/139 | Плен. | 127 | A / 72 / PV.72 12 декабря 2017 г. GA / 11992 без голоса | A / 72 / L.28 & Add.1 | Здоровье населения мира и внешняя политика: забота о здоровье наиболее уязвимых в инклюзивном обществе |
| A / RES / 72/138 | Плен. | 127 | A / 72 / PV.72 12 декабря 2017 г. GA / 11992 без голоса | A / 72 / L.27 & Add.1 | Международный день всеобщего охвата услугами здравоохранения |
| A / RES / 72/137 | Плен. | 15 | A / 72 / PV.71 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72 / L.30 & Add.1 | Последующие меры в связи с Декларацией и Программой действий в области культуры мира |
| A / RES / 72/136 | Плен. | 15 | A / 72 / PV.71 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72 / L.29 & Add.1 | Содействие межрелигиозному и межкультурному диалогу, взаимопониманию и сотрудничеству на благо мира |
| A / RES / 72/135 | CC. | 3 б) | A / 72 / PV.71 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72/601 | Полномочия представителей на семьдесят второй сессии Генеральной Ассамблеи |
| A / RES / 72/134 | Плен. | 73 (б) | A / 72 / PV.70 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72 / L.25 & Add.1 | Помощь палестинскому народу |
| A / RES / 72/133 | Плен. | 73 (а) | A / 72 / PV.70 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72 / L.24 & Add.1 | Укрепление координации чрезвычайной гуманитарной помощи ООН |
| A / RES / 72/132 | Плен. | 73 (а) | A / 72 / PV.70 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | A / 72 / L.23 & Add.1 | Международное сотрудничество по гуманитарной помощи в случае стихийных бедствий: от оказания помощи до развития |
| A / RES / 72/131 | Плен. | 73 (а) | A / 72 / PV.70 11 декабря 2017 г. GA / 11991 без голоса | А / 72 / L.22 и Add.1 | Безопасность и защита гуманитарного персонала и защита персонала Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/130 | Плен. | 15 | A / 72 / PV.68 8 декабря 2017 г. GA / 11989 без голоса | A / 72 / L.26 & Add.1 | Международный день совместной жизни в мире |
| A / RES / 72/129 | Плен. | 15 | А / 72 / PV.68 8 декабря 2017 GA / 11989 135-2-0 | A / 72 / L.21 & Add.1 | Модерация |
| A / RES / 72/128 | C.6 | 175 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/468 | Статус наблюдателя для Фонда развития коренных народов Латинской Америки и Карибского бассейна в Генеральной Ассамблее |
| A / RES / 72/127 | С.6 | 172 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/475 | Статус наблюдателя Евразийской группы по противодействию легализации преступных доходов и финансированию терроризма в Генеральной Ассамблее |
| A / RES / 72/126 | C.6 | 171 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/474 | Статус наблюдателя для Управления макроэкономических исследований АСЕАН + 3 в Генеральной Ассамблее |
| A / RES / 72/125 | С.6 | 170 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/473 | Статус наблюдателя Международной сети по бамбуку и ротангу в Генеральной Ассамблее |
| A / RES / 72/124 | C.6 | 166 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/469 | Отчет Комитета по сношениям со страной пребывания |
| A / RES / 72/123 | С.6 | 109 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/467 | Меры по ликвидации международного терроризма |
| A / RES / 72/122 | C.6 | 87 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/466 | Ответственность международных организаций |
| A / RES / 72/121 | С.6 | 86 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/465 | Последствия вооруженных конфликтов для договоров |
| A / RES / 72/120 | C.6 | 85 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/464 | Объем и применение принципа универсальной юрисдикции |
| A / RES / 72/119 | С.6 | 84 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/463 | Верховенство закона на национальном и международном уровнях |
| A / RES / 72/118 | C.6 | 83 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/462 | Доклад Специального комитета по Уставу Организации Объединенных Наций об усилении роли организации |
| A / RES / 72/117 | С.6 | 82 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/461 | Высылка иностранцев |
| A / RES / 72/116 | C.6 | 81 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/460 | Доклад Комиссии международного права о работе ее шестьдесят девятой сессии |
| A / RES / 72/115 | С.6 | 80 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/459 | Программа помощи Организации Объединенных Наций в области преподавания, распространения и более широкого признания международного права |
| A / RES / 72/114 | C.6 | 79 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/458 DR II | Типовой закон Комиссии Организации Объединенных Наций по праву международной торговли об электронных передаваемых записях |
| A / RES / 72/113 | С.6 | 79 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | А / 72/458 DR I | Доклад Комиссии Организации Объединенных Наций по праву международной торговли о работе ее пятидесятой сессии |
| A / RES / 72/112 | C.6 | 78 | A / 72 / PV.67 7 декабря 2017 г. GA / 11988 без голосования | A / 72/457 | Уголовная ответственность должностных лиц и экспертов в командировках Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/111 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 128-7-40 | А / 72/456 DR XVII | Осуществление Декларации о предоставлении независимости колониальным странам и народам |
| A / RES / 72/110 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 172-3-2 | A / 72/456 DR XVI | Распространение информации о деколонизации |
| A / RES / 72/109 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | А / 72/456 DR XV | Вопрос о Виргинских островах Соединенных Штатов |
| A / RES / 72/108 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR XIV | Вопрос об островах Теркс и Кайкос |
| A / RES / 72/107 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR XIII | Вопрос о Токелау |
| A / RES / 72/106 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | А / 72/456 DR XII | Вопрос Святой Елены |
| A / RES / 72/105 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR XI | Вопрос о Питкэрне |
| A / RES / 72/104 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR X | Вопрос о Новой Каледонии |
| A / RES / 72/103 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR IX | Вопрос о Монтсеррате |
| A / RES / 72/102 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 93-8-65 | A / 72/456 DR VIII | Вопрос о Гуаме |
| A / RES / 72/101 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR VII | Вопрос о Французской Полинезии |
| A / RES / 72/100 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR VI | Вопрос о Каймановых островах |
| A / RES / 72/99 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR V | Вопрос о Британских Виргинских островах |
| A / RES / 72/98 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | А / 72/456 DR IV | Вопрос о Бермудских островах |
| A / RES / 72/97 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR III | Вопрос об Ангилье |
| A / RES / 72/96 | C.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR II | Вопрос об Американском Самоа |
| A / RES / 72/95 | С.4 | 62 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/456 DR I | Вопрос о Западной Сахаре |
| A / RES / 72/94 | C.4 | 61 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/455 | Предоставление государствами-членами условий для учебы и профессиональной подготовки жителей несамоуправляющихся территорий |
| A / RES / 72/93 | С.4 | 60 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 118-2-54 | A / 72/454 | Осуществление Декларации о предоставлении независимости колониальным странам и народам специализированными агентства и международные организации, связанные с Организацией Объединенных Наций |
| A / RES / 72/92 | C.4 | 59 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 173-2-2 | A / 72/453 | Экономическая и другая деятельность, затрагивающая интересы народов несамоуправляющихся территорий |
| A / RES / 72/91 | С.4 | 58 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 173-2-2 | A / 72/452 | Информация о несамоуправляющихся территориях, передаваемая согласно статье 73 e Устава Организации Объединенных Наций |
| A / RES / 72/90 B | C.4 | 57 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/451 DR B | Политика и деятельность Организации Объединенных Наций в области общественной информации |
| A / RES / 72/90 A | С.4 | 57 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/451 DR A | Информация на службе человечества |
| A / RES / 72/89 | C.4 | 56 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/450 | Всеобъемлющий обзор специальных политических миссий |
| A / RES / 72/88 | С.4 | 54 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 151-2-20 | A / 72/448 DR V | Оккупированные сирийские Голаны |
| A / RES / 72/87 | C.4 | 54 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 153-8-10 | А / 72/448 DR IV | Действия Израиля, затрагивающие права человека палестинского народа в Оккупированная палестинская территория, включая Восточный Иерусалим |
| A / RES / 72/86 | С.4 | 54 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 155-7-12 | A / 72/448 DR III | Израильские поселения на оккупированной палестинской территории, включая Восточный Иерусалим, и оккупированных сирийских Голанах |
| A / RES / 72/85 | C.4 | 54 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 157-7-10 | A / 72/448 DR II | Применимость Женевской конвенции о защите гражданского населения во время войны от 12 августа 1949 г., на оккупированную палестинскую территорию, включая Восточный Иерусалим, и другие оккупированные арабские территории |
| A / RES / 72/84 | С.4 | 54 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 83-10-77 | A / 72/448 DR I | Работа Специального комитета по расследованию затрагивающих права человека действий Израиля в отношении палестинского народа и другие арабы оккупированных территорий |
| A / RES / 72/83 | C.4 | 53 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 159-7-9 | А / 72/447 DR IV | Имущество палестинских беженцев и доходы от них |
| A / RES / 72/82 | С.4 | 53 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 162-6-7 | A / 72/447 DR III | Операции Ближневосточного агентства Организации Объединенных Наций для помощи палестинским беженцам и организации работ |
| A / RES / 72/81 | C.4 | 53 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 158-7-10 | A / 72/447 DR II | Лица, перемещенные в результате боевых действий в июне 1967 года и последующих военных действий |
| A / RES / 72/80 | С.4 | 53 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 162-1-12 | A / 72/447 DR I | Помощь палестинским беженцам |
| A / RES / 72/79 | C.4 | 52 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/446 DR III | Обсуждение пятидесятой годовщины Конференции Организации Объединенных Наций по Исследование и использование космического пространства в мирных целях |
| A / RES / 72/78 | С.4 | 52 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/446 DR II | Декларация о пятидесятой годовщине Договора о принципах деятельности государств по разведке и использование космического пространства, включая Луну и другие небесные тела |
| A / RES / 72/77 | C.4 | 52 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/446 DR I | Международное сотрудничество в использовании космического пространства в мирных целях |
| A / RES / 72/76 | С.4 | 51 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/445 | Действие атомной радиации |
| A / RES / 72/75 | C.4 | 50 | A / 72 / PV.66 7 декабря 2017 г. GA / 11987 без голоса | A / 72/444 | Содействие разминированию |
| A / RES / 72/74 | Плен. | 176 | A / 72 / PV.65 6 декабря 2017 г. GA / 11986 92-0-4 | A / 72 / L.10 & Add.1 | Сотрудничество между Организацией Объединенных Наций и Организацией исламского сотрудничества |
| A / RES / 72/73 | Плен. | 77 (а) | A / 72 / PV.64 5 декабря 2017 г. GA / 11985 128-1-3 | A / 72 / L.18 & Add.1 | Мировой океан и морское право |
| A / RES / 72/72 | С.1 | 77 (б) | A / 72 / PV.64 5 декабря 2017 г. GA / 11985 126-1-3 | A / 72 / L.12 & Add.1 | Устойчивое рыболовство, в том числе в рамках Соглашения 1995 г. о выполнении положений Конвенция Организации Объединенных Наций по морскому праву от 10 декабря 1982 г., касающаяся сохранения и управления по трансграничным рыбным запасам и запасам далеко мигрирующих рыб и относящиеся к ним инструменты |
| A / RES / 72/71 | С.1 | 106 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/416 | Конвенция о запрещении развития, Производство и накопление бактериологического (биологического) и токсинного оружия и их уничтожение |
| A / RES / 72/70 | C.1 | 105 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 180-1-4 | A / 72/415 | Договор о всеобъемлющем запрещении ядерных испытаний |
| A / RES / 72/69 | С.1 | 104 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/414 | Укрепление безопасности и сотрудничества в районе Средиземноморья |
| A / RES / 72/68 | C.1 | 103 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/413 | Конвенция о запрещении или ограничении применения определенных видов обычного оружия, которые могут считаться причинять чрезмерные травмы или оказывать неизбирательное действие |
| A / RES / 72/67 | С.1 | 102 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 157-5-20 | A / 72/412 | Опасность распространения ядерного оружия на Ближнем Востоке |
| A / RES / 72/66 | C.1 | 101 (б) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/411 DR II | Доклад Комиссии по разоружению |
| A / RES / 72/65 | С.1 | 101 (а) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/411 DR I | Доклад Конференции по разоружению |
| A / RES / 72/64 | C.1 | 100 (ж) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/410 DR VI | Региональные центры Организации Объединенных Наций по вопросам мира и разоружения |
| A / RES / 72/63 | С.1 | 100 (д) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/410 DR V | Меры укрепления доверия на региональном уровне: деятельность Постоянного консультативного совета Организации Объединенных Наций Комитет по вопросам безопасности в Центральной Африке |
| A / RES / 72/62 | C.1 | 100 (г) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/410 DR IV | Региональный центр Организации Объединенных Наций по вопросам мира и разоружения в Азиатско-Тихоокеанском регионе |
| A / RES / 72/61 | С.1 | 100 (в) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/410 DR III | Региональный центр Организации Объединенных Наций по вопросам мира, разоружения и развития в Латинской Америке и Карибском бассейне |
| A / RES / 72/60 | C.1 | 100 (б) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/410 DR II | Региональный центр Организации Объединенных Наций по вопросам мира и разоружения в Африке |
| A / RES / 72/59 | С.1 | 100 (а) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 123-50-10 | A / 72/410 DR I | Конвенция о запрещении применения ядерного оружия |
| A / RES / 72/58 | C.1 | 99 (к) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 131-31-18 | A / 72/409 DR XXXI | Последующие меры в связи с консультативным заключением Международного Суда относительно законности угроза ядерным оружием или его применение |
| A / RES / 72/57 | С.1 | 99 (п) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XXX | Незаконная торговля стрелковым оружием и легкими вооружениями во всех ее аспектах |
| A / RES / 72/56 | C.1 | 99 (в) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XXIX | Меры транспарентности и доверия в космической деятельности |
| A / RES / 72/55 | С.1 | 99 (u) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XXVII | Проблемы, связанные с накоплением избыточных запасов обычных боеприпасов |
| A / RES / 72/54 | C.1 | 99 (чч) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 142-2-36 | A / 72/409 DR XXVI | Осуществление Конвенции по кассетным боеприпасам |
| A / RES / 72/53 | С.1 | 99 (м) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 167-0-17 | А / 72/409 ДР XXV | Осуществление Конвенции о запрещении использования, накопления запасов, Производство и передача противопехотных мин и их уничтожение |
| A / RES / 72/52 | C.1 | 99 (д) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XXIV | Запрет на сброс радиоактивных отходов |
| A / RES / 72/51 | С.1 | 99 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XXIII | Международный день действий против ядерных испытаний |
| A / RES / 72/50 | C.1 | 99 (z) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 156-4-24 | A / 72/409 DR XXII | Совместные действия с новой решимостью в направлении полной ликвидации ядерного оружия |
| A / RES / 72/49 | С.1 | 99 (высота) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 181-0-3 | A / 72/409 DR XXI | Созыв четвертой специальной сессии Генеральной Ассамблеи, посвященной разоружению |
| A / RES / 72/48 | C.1 | 99 (п) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 130-4-51 | A / 72/409 DR XX | Содействие многосторонности в области разоружения и нераспространения |
| A / RES / 72/47 | С.1 | 99 (j) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | А / 72/409 ДР XIX | Соблюдение экологических норм при разработке и выполнении соглашений о разоружении и контроле над вооружениями |
| A / RES / 72/46 | C.1 | 99 (г) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR XVIII | Взаимосвязь между разоружением и развитием |
| A / RES / 72/45 | С.1 | 99 (i) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 149-5-29 | A / 72/409 DR XVII | Южное полушарие и прилегающие районы, свободные от ядерного оружия |
| A / RES / 72/44 | C.1 | 99 (х) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 155-0-29 | A / 72/409 DR XVI | Договор о торговле оружием |
| A / RES / 72/43 | С.1 | 99 (л) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 159-7-14 | А / 72/409 DR XV | Осуществление Конвенции о запрещении разработки, производства, Накопление и применение химического оружия и его уничтожение |
| A / RES / 72/42 | C.1 | 99 (т) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голосования | A / 72/409 DR XIV | Меры по недопущению приобретения террористами оружия массового поражения |
| A / RES / 72/41 | С.1 | 99 (о) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 124-49-11 | A / 72/409 DR XIII | Снижение ядерной опасности |
| A / RES / 72/40 | C.1 | 99 (п) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голосования | А / 72/409 DR XII | Помощь государствам в пресечении незаконного оборота стрелкового оружия и легких вооружений и их сбор |
| A / RES / 72/39 | С.1 | 99 (кв) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 137-31-16 | A / 72/409 DR XI | На пути к миру, свободному от ядерного оружия: ускорение выполнения обязательств по ядерному разоружению |
| A / RES / 72/38 | C.1 | 99 (б) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 119-41-20 | A / 72/409 DR X | Ядерное разоружение |
| A / RES / 72/37 | С.1 | 99 (гг) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 130-36-15 | A / 72/409 DR IX | Этические императивы мира, свободного от ядерного оружия |
| A / RES / 72/36 | C.1 | 99 (дд) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/409 DR VIII | Противодействие угрозе самодельных взрывных устройств |
| A / RES / 72/35 | С.1 | 99 (г) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 184-1-2 | A / 72/409 DR VII | Контроль над обычными вооружениями на региональном и субрегиональном уровнях |
| A / RES / 72/34 | C.1 | 99 (ж) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голосования | A / 72/409 DR VI | Региональное разоружение |
| A / RES / 72/33 | С.1 | 99 (т) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голосования | A / 72/409 DR V | Меры доверия в региональном и субрегиональном контексте |
| A / RES / 72/32 | C.1 | 99 (а.о.) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 173-1-11 | А / 72/409 DR IV | Соблюдение соглашений и обязательств в области нераспространения, ограничения вооружений и разоружения |
| A / RES / 72/31 | С.1 | 99 (бб) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 125-39-14 | A / 72/409 DR III | Продвижение многосторонних переговоров по ядерному разоружению |
| A / RES / 72/30 | C.1 | 99 (ее) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 141-15-27 | A / 72/409 DR II | Гуманитарные последствия применения ядерного оружия |
| A / RES / 72/29 | С.1 | 99 (ширина) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 118-44-17 | A / 72/409 DR I | Последующие меры в связи с обязательствами в области ядерного разоружения, согласованными на конференциях 1995, 2000 и 2010 годов по рассмотрению действия Договора. Участники Договора о нераспространении ядерного оружия |
| A / RES / 72/28 | C.1 | 98 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/408 | Роль науки и техники в контексте международной безопасности и разоружения |
| A / RES / 72/27 | С.1 | 97 (б) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 131-4-48 | A / 72/407 DR II | Запрет первого размещения оружия в космическом пространстве |
| A / RES / 72/26 | C.1 | 97 (а) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 182-0-3 | А / 72/407 DR I | Предотвращение гонки вооружений в космическом пространстве |
| A / RES / 72/25 | С.1 | 96 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 125-0-62 | A / 72/406 | Заключение эффективных международных соглашений о гарантиях государствам, не обладающим ядерным оружием, против применения или угрозы применение ядерного оружия |
| A / RES / 72/24 | C.1 | 95 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/405 | Создание зоны, свободной от ядерного оружия, в районе Ближнего Востока |
| A / RES / 72/23 | С.1 | 93 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 180-3-0 | A / 72/403 | Запрещение разработки и производства новых видов оружия массового поражения и новые системы такого оружия: доклад Конференции по разоружению |
| A / RES / 72/22 | C.1 | 92 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/402 | Договор о зоне, свободной от ядерного оружия, в Африке |
| A / RES / 72/21 | С.1 | 91 | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 132-3-46 | A / 72/401 | Осуществление Декларации об объявлении Индийского океана зоной мира |
| A / RES / 72/20 | C.1 | 90 б) | A / 72 / PV.62 4 декабря 2017 г. GA / 11984 без голоса | A / 72/400 | Объективная информация по военным вопросам, включая прозрачность военных расходов |
| A / RES / 72/19 | С.5 | 139 | A / 72 / PV.61 1 декабря 2017 г. GA / 11983 без голоса | A / 72/611 | План конференций |
| A / RES / 72/18 | C.5 | 134 и 145 | A / 72 / PV.61 1 декабря 2017 г. GA / 11983 без голоса | A / 72/610 | Отчет о деятельности Управления служб внутреннего надзора |
| A / RES / 72/17 | Плен. | 15 | A / 72 / PV.61 1 декабря 2017 г. GA / 11983 без голоса | A / 72 / L.20 & Add.1 | Последствия террористических актов, направленных против религиозных объектов, на культуру мира |
| A / RES / 72/16 | Плен. | 37 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 105-6-58 | A / 72 / L.17 & Add.1 | Сирийские Голаны |
| A / RES / 72/15 | Плен. | 37 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 151-6-9 | A / 72 / L.11 & Add.1 | Иерусалим |
| A / RES / 72/14 | Плен. | 38 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 157-7-8 | A / 72 / L.16 & Add.1 | Мирное урегулирование вопроса о Палестине |
| A / RES / 72/13 | Плен. | 38 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 103-10-57 | A / 72 / L.15 & Add.1 | Комитет по осуществлению неотъемлемых прав палестинского народа |
| A / RES / 72/12 | Плен. | 38 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 155-8-8 | A / 72 / L.14 & Add.1 | Специальная информационная программа по вопросу о Палестине Департамента общественной информации Секретариата |
| A / RES / 72/11 | Плен. | 38 | A / 72 / PV.60 30 ноября 2017 г. GA / 11982 100-10-59 | A / 72 / L.13 и Add.1 | Отдел по правам палестинцев Секретариата |
| A / RES / 72/10 | Плен. | 39 | A / 72 / PV.58 21 ноября 2017 г. GA / 11979 без голоса | A / 72 / L.8 & Add.1 | Положение в Афганистане |
| A / RES / 72/9 | С.5 | 137 | A / 72 / PV.55 17 ноября 2017 г. GA / 11976 без голоса | A / 72/524 | Планирование программ |
| A / RES / 72/8 B | C.5 | 133 | A / 72 / PV.104 5 июля 2018 г. GA / 12039 без голоса | A / 72/572 / Add.1 | Финансовые отчеты и проверенные финансовые отчеты, а также отчеты Комиссии ревизоров |
| A / RES / 72/8 | С.5 | 133 | A / 72 / PV.55 17 ноября 2017 г. GA / 11976 без голоса | A / 72/572 | Финансовые отчеты и проверенные финансовые отчеты, а также отчеты Комиссии ревизоров |
| A / RES / 72/7 | Плен. | 65 | A / 72 / PV.55 17 ноября 2017 г. GA / 11976 без голоса | A / 72 / L.4 & Add.1 | Роль Регионального центра ООН по превентивной дипломатии для Центральной Азии |
| A / RES / 72/6 | Плен. | 11 | A / 72 / PV.48 13 ноября 2017 г. GA / 11973 без голоса | A / 72 / L.5 & Add.1 | Построение мирного и лучшего мира с помощью спорта и олимпийских идеалов |
| A / RES / 72/5 | Плен. | 89 | A / 72 / PV.47 10 ноября 2017 г. GA / 11972 без голоса | A / 72 / L.6 & Add.1 | Отчет Международного агентства по атомной энергии |
| A / RES / 72/4 | Плен. | 42 | A / 72 / PV.38 1 ноября 2017 г. GA / 11967 191-2-0 | A / 72 / L.2 | Необходимость прекращения экономической, торговой и финансовой блокады, введенной Соединенными Штатами Америки против Кубы |
| A / RES / 72/3 | Плен. | ||||