Образец выписки из протокола снт образец: Выписка из протокола собрания СНТ, образцы 2023 года

Образец протокола собрания СНТ — порядок его составления

Управление деятельностью садоводческих товариществ осуществляется его участниками. Для того чтобы документально оформить любое принятое решение членами товарищества, составляется протокол собрания, в котором указываются основные обсуждаемые темы и принятые решения.

[sc:docObr id=»https://grazhdaninu.com/wp-content/uploads/2017/12/obrazets-protokola-.docx» mytext=»Скачать образец протокола собрания СНТ»]

Оглавление

• Протокол собрания
  • Обязательные пункты
• Как заполняется
• Выписка
• Обжалование

Протокол собрания

Законодательством России не установлен конкретный бланк такого протокола. Но федеральным законом, который регулирует деятельность СНТ, предусмотрены обязательные требования, предъявляемые к товариществу.

Среди общих требований к документу предъявляется следующее:

1. Заполнение документа осуществляется секретарем собрания, который назначается уставными документами либо дополнительным принятым решением управления товарищества.
2. Заполнение протокола осуществляется в стандартной письменной форме. Возможно применение рукописного варианта либо набор текста с помощью компьютера.
3. Этот документ обязательно должен быть заверен председателем и секретарем. Для заверения достаточно подписи обоих участников и печати товарищества.

Протокол считается определенной формой документооборота для конкретной формы юридического лица. Полномочия по правильному заполнению и ведению данной документации возлагаются на секретаря. А хранение и архивация возложены на председателя.

Обязательные пункты

Структура документа может быть различной, в зависимости от количества обсуждаемых тем и принятых решений. Однако законодательством определены основные пункты, которые должны присутствовать в протоколе:

1. Обязательно должно быть указано название документа, название СНТ и дата проведения заседания.
2. После этого перечисляются все участники, присутствовавшие при этом заседании. Если участвуют в заседании не только члены товарищества, а иные лица, то об этом делается индивидуальная запись.
3. Далее прописываются вынесенные на повестку дня вопросы, которые подлежат обязательному обсуждению и принятию по ним определенных решений.
4. Процесс обсуждения и все выдвинутые предложения фиксируются секретарем в протоколе.
5. После обсуждения всех вопросов записываются принятые по ним решения.
6. Ниже указывается количество голосов «за» и «против» по каждому вопросу.
7. Если к протоколу прилагались документы для обсуждения, то их перечень также указывается.
8. Далее ставятся подписи секретаря и председателя, а также юридическая печать товарищества.

В таком формате обязательно заполняется этот документ. Секретарь может печатать его сразу на компьютере во время заседания либо записывать в распечатанном пустом бланке с обязательными графами.

Как заполняется

Перечисленные обязательные пункты не изменяются, поэтому в ходе заседания удобно использовать готовый бланк документа. Секретарь обязательно должен внимательно заполнять данный документ и не пропускать основных моментов. Также не допускается составление протокола с ошибками.

Секретарь должен уметь быстро и правильно формулировать предложения. Важно, чтобы написанный текст нельзя было трактовать в различных вариантах. Протокол должен иметь четкую конкретную суть.

Секретарь должен быстро и желательно дословно записывать все обсуждения участников. Тогда, изучив протокол, легко будет восстановить ход мыслей участников и их обсуждение. При этом участникам собрания в этом случае сложнее будет оспорить протокол, если там записана дословная речь каждого.

После подписания протокола секретарь должен пронумеровать каждый его лист. Сверху на первый лист прикладывается и вшивается вместе со всеми листами титульный лист, где указывается общее количество страниц. Там же ставят свои подписи секретарь и председатель.

Желательно не оставлять в документе пустых пробелов и свободных мест, чтобы в дальнейшем туда невозможно было что-либо вписать. Вместо них разрешается ставить приписки.

В случае несоблюдения установленных требований по оформлению или составлению протокола он может быть признан недействительным. Что, в свою очередь, повлечет за собой отмену принятых решений.

Выписка

Сам протокол может иметь достаточно много страниц, так как во время обсуждения секретарь должен фиксировать все сказанные участниками слова. Для облегчения изучения данного протокола из него делается краткая выписка, которая содержит только краткую информацию о заседании.

В него не входят те пункты, где фиксировалось обсуждение. К этой бумаге законодательством также установлены строгие требования, которые должны обязательно соблюдаться. Обязательными пунктами являются:

• название документа с указанием номера самого протокола, места его составления и датой;
• указывается количество человек, которые присутствовали на заседании;
• вопросы повестки дня;
• принятые решения по каждому вопросу;
• персональные данные председателя и секретаря и их подписи;
• печать организации.

С помощью этого документа можно быстро получить необходимую информацию. Изучая его, не придется листать большое количество страниц в поисках принятого решения данным заседанием.

Обжалование

Как и большинство соглашений, протокол является таким документом, который можно обжаловать при желании. Важно только знать, в каких случаях это допускается. Существует 2 типа оспаривания:

• признание ничтожным;
• оспаривание в суде.

В первом случае он изначально считается не вступившим в действие. Во втором случае договор считается заключенным, но с определенными нарушениями, которые и привели его к признанию в качестве оспоренного.

Существуют следующие обстоятельства, когда протокол может быть оспорен:

1. Принятое собранием решение противоречит нормам законодательства.
2. Решение принято недостаточным числом голосов.
3. Принятие такого решения находится не в компетенции данного собрания.
4. Вопрос не был обозначен повесткой дня. Но в этом случае допускается принятие решения, если на собрании присутствовали все члены товарищества.

По данным основаниям протокол будет считаться ничтожным. Оспорить в суде его можно в следующих случаях:

• был нарушен порядок организации собрания;
• участники находились не в равных правах при обсуждении вопросов повестки;
• лицо, которое выступало от имени товарищества, не имело данных полномочий;
• составление самого протокола было с нарушениями установленных правил и норм законодательства.

Российскими законами устанавливается исковой срок для оспаривания любых документов. Для протокола собрания предусмотрены следующие сроки:

• полгода, если обращается в суд человек, чьи права были ущемлены;
• 2 года для всех участников товарищества.

Данные сроки исчисляются с момента, когда правление товарищества официально представило свое решение членам СНТ либо другим заинтересованным лицам стало о нем известно.

Поэтому важно соблюдать установленные требования при составлении протокола собрания и выписки из него.

Обобщение судебной практики рассмотрения гражданских дел по спорам с участием садоводческих товариществ / Портал мировой юстиции Оренбургской области

В связи с поступившим из Оренбургского областного суда запросом проведено обобщение практики разрешения мировыми судьями Дзержинского района г. Оренбурга гражданских дел, связанных с разрешением споров с участием садоводческих товариществ (далее – СНТ), рассмотренных в период с 2010 года по 2012 год.

Судебная практика мировых судей в этой сфере в основном сводится к разрешению споров между СНТ и  его членами по вопросам, связанным с членством и пользованием земельными участками, а именно: взыскание членских и целевых взносов. Именно данная категория дел подсудна мировым судьям в соответствии с действующим гражданским законодательством.

Так, за 2010-2012 г.г. мировыми судьями Дзержинского района г. Оренбурга рассмотрено  181 гражданское дело по искам СНТ о взыскании членских и целевых взносов, из них:

— с вынесением решения – 112, из которых:

исковые требования удовлетворены в полном объеме- 106,

исковые требования удовлетворены частично – 5,

отказано в удовлетворении исковых требований — 1

— прекращено (в связи с отказом от иска, заключением мирового соглашения) – 46,

— оставлено без рассмотрения – 23.

Кроме того, мировым судьей судебного участка № 5 Дзержинского района                г. Оренбурга в 2011 году рассмотрено 1 гражданское дело по иску о возмещении ущерба.

СНТ «***» обратилось в суд с иском к С** о взыскании суммы, указав, что ответчик является членом СНТ «***» и имеет земельный участок в данном СНТ. При этом в нарушение Устава СНТ не уплачивает  взносы за пользование электроэнергией, принадлежащей СНТ, а также санкции (пени за несвоевременную уплату взноса, штрафы за самовольное подключение дома к электроопоре, за самовольное использование электроэнергии). Истец просил взыскать с  ответчика С**  взнос по оплате за пользование электроэнергией, пени за несвоевременную уплату взноса, штраф за самовольное подключение и использование электроэнергии с опоры, штраф за взлом замка и вскрытие шкафа с электрооборудованием, сумму ущерба за испорченный замок. Судом при установлении обстоятельств дела были изучены документы, подтверждающие членство ответчика в СНТ «***», принадлежность ему земельного участка в СНТ, протоколы общего собрания СНТ, которыми были утверждены размеры взносов за пользование электроэнергией, сметы расходов на обслуживание электроустановок и электролинии. Были приняты во внимание показания свидетелей относительно факта взлома замка на шкафу с электрооборудованием. По результатам рассмотрения данного дела суд удовлетворил исковые требования частично, взыскав с ответчика С**  задолженность за потребленную электроэнергию (снизив при этом сумму задолженности, исходя из представленных документов), штраф за самовольное подключение к электролинии и использование электроэнергии, (что сам ответчик не отрицал в судебном заседании). В удовлетворении исковых требований в части взыскания  суммы ущерба за испорченный замок и штраф за взлом замка СТН было отказано в связи с недоказанностью факта порчи замка ответчиком.

Решение мирового судьи было предметом рассмотрения в суде апелляционной инстанции, по результатам которого решение оставлено без изменения, а жалоба ответчика — без удовлетворения.

Анализируя категорию дел о взыскании задолженности по членским и целевым взносам, необходимо отметить следующие моменты.

В соответствии с Федеральным законом № 66-ФЗ «О садоводческих, огороднических и дачных некоммерческих объединений граждан»

членские взносы в СНТ – это денежные средства, периодически вносимые членами садоводческого, огороднического или дачного некоммерческого объединения на оплату труда работников, заключивших трудовые договоры с таким объединением, и другие текущие расходы такого объединения;

целевые взносы – денежные средства, внесенные членами садоводческого, огороднического или дачного некоммерческого товарищества либо садоводческого, огороднического или дачного некоммерческого партнерства на приобретение (создание) объектов общего пользования.

Согласно действующему законодательству РФ порядок взимания членских и иных взносов в некоммерческих организациях является правом и внутренним делом юридического лица — самой некоммерческой организации и определяется ее Уставом и решениями органов управления некоммерческой организации.

Статья 21 ФЗ РФ «О садоводческих, огороднических и дачных объединениях граждан» от 15.05.1998 в этой связи дает широкие полномочия общему собранию членов СНТ, не устанавливая никаких ограничений для компетенции общего собрания:

п. 10 ч. 1 ст. 21 ФЗ РФ «О садоводческих, огороднических и дачных объединениях граждан» от 15.05.1998 устанавливает, что к исключительной компетенции общего собрания СНТ относится принятие решений о формировании и об использовании имущества такого объединения, о создании и развитии объектов инфраструктуры, а также установление размеров целевых фондов и соответствующих взносов. Ч.2 ст. 21 ФЗ РФ «О садоводческих, огороднических и дачных объединениях граждан» от 15.05. 1998 г. управомочивает общее собрание (собрание уполномоченных) рассматривать любые вопросы деятельности такого объединения и принимать по ним решения.

Таким образом:

• установление принципов (порядка) взимания взносов в СНТ — это внутреннее дело СНТ как юридического лица и его право;
• принятие решения касательно принципа взимания взносов относится к исключительной компетенции общего собрания СНТ и решается большинством членов СНТ в соответствии с общими принципами гражданского законодательства, в том числе принципами разумности и справедливости, разумного хозяйствования;
• суды не являются органами, имеющими полномочия вмешиваться в хозяйственную деятельность СНТ, и не вправе императивно навязывать СНТ тот или иной порядок взимания взносов.

СНТ и его члены вправе самостоятельно решать, какой принцип взимания членских и целевых взносов больше подходит для конкретного садового товарищества. Главное — чтобы общее собрание (собрание уполномоченных) СНТ:

— проводилось с соблюдением требований ФЗ «О садоводческих, огороднических и дачных некоммерческих объединениях граждан» и Устава СНТ,

— имело кворум и правильно оформленный протокол, составленный управомоченными лицами.

При рассмотрении исковых заявлений СНТ о взыскании членских и целевых взносов, следует обращать внимание на представляемые в суд документы. Для правильного разрешения дела необходимо наличие следующих документов:

—    протоколы общего собрания с установленной суммой взносов за конкретные периоды времени;

—     устав СНТ;

—    свидетельство о постановке на учет в налоговом органе;

—    протокол о назначении председателя СНТ;

— документы на землю, которая выделялась самому СНТ или его членам;

—  справка о том, что ответчик является членом СНТ и ему на праве собственности принадлежит земельный участок в границах СНТ;

—   справка о задолженности по членским взносам.

        При удовлетворении исковых требований о взыскании членских или целевых взносов суду  необходимо установить, является ли гражданин членом садоводческого товарищества и принадлежит ли ему на праве собственности земельный участок, расположенный в границах СНТ.

 Кроме того, для правильного разрешения дела необходимо проверять расчеты, представленные СНТ на основании решений общих собраний членов СНТ.

Так, СТН «***» обратилось в суд с иском к Л** о взыскании суммы задолженности по членским взносам за 2008-2010 г.г., пени, процентов за пользование чужими денежными средствами. Свои требования истец мотивировал тем, что ответчик является членом СНТ, имеет в собственности земельный участок. При этом истцом был представлен расчет задолженности на основании выписок из протоколов общих собраний членов СНТ, а также смет расходов СНТ. Исковые требования СНТ были удовлетворены частично. Суд отказал в удовлетворении исковых требований в части взыскания пени за 2008 г., 2009 г., поскольку истцом не были представлены доказательства, подтверждающие факт принятия решения о начислении пени за просрочку оплаты членских взносов общим собранием членов СНТ. Также суд снизил размер процентов за пользование чужими денежными средствами в связи с тем, что расчет, представленный истцом, был ошибочным.

Таким образом, обобщение судебной практики рассмотрения мировыми судьями Дзержинского района г. Оренбурга гражданских дел по искам садоводческих некоммерческих товариществ показало, что значительную часть таких дел составляет категория исков о взыскании задолженности по членским и целевым взносам. Подавляющее большинство исковых требований удовлетворяются судами в полном объеме. Затруднений в определении подведомственности указанных гражданских дел при принятии исковых заявлений к производству не было. Данная категория дел рассматривалась по месту жительства ответчика. Спорных или неясных вопросов при рассмотрении дел с участием садоводческих товариществ у судей не возникало.

Протокол экстракции и метод масс-спектрометрии для количественного определения доксорубицина, локально высвобождаемого из пролекарств в опухолевой ткани

1. Paridaens R, Biganzoli L, Bruning P, et al. Паклитаксел по сравнению с доксорубицином в качестве химиотерапии с одним агентом первой линии для метастатического рака молочной железы: Европейская организация по исследованию и лечению рака, рандомизированное исследование с перекрестным исследованием. Журнал клинической онкологии. 2000;18(4):724–733. [PubMed] [Google Scholar]

2. Demetri GD, Cesne AL, Chawla SP, et al. Лечение первой линии метастатических или местнораспространенных нерезектабельных сарком мягких тканей конатумумабом в комбинации с доксорубицином или только доксорубицином: открытое и двойное слепое исследование фазы I/II. Европейский журнал рака. 2012 Онлайн. [PubMed] [Академия Google]

3. Паван К., Сингал Н.И. Доксорубицин-индуцированная кардиомиопатия. Медицинский журнал Новой Англии. 1998 г., 24 сентября; 339 (13): 900–905. [PubMed] [Google Scholar]

4. Олсон Р.Д., М.П. Кардиотоксичность доксорубицина: анализ преобладающих гипотез. FASEB J. 1990;4(13):3076–3086. [PubMed] [Google Scholar]

5. Минотти Джорджио, член парламента, Сальваторелли Эмануэла, Каиро Гаэтано, Джанни Лука. Антрациклины: молекулярные достижения и фармакологические разработки в отношении противоопухолевой активности и кардиотоксичности. Фармакол. Ред. 2004; 56:185–229. . [PubMed] [Google Scholar]

6. Ewer MS, Jaffe N, Ried H, Zietz HA, Benjamin RS. Кардиотоксичность доксорубицина у детей: сравнение схемы последовательного введения разделенной суточной дозы с введением однократной (быстрой) инфузии. Медицинская и детская онкология. 1998;31(6):512–515. [PubMed] [Google Scholar]

7. Mertens AC, Yasui Y, Neglia JP, et al. Опыт поздней смертности у пятилетних выживших после рака в детском и подростковом возрасте: исследование выживших после рака в детском возрасте. Журнал клинической онкологии. 2001;19(13): 3163–3172. [PubMed] [Google Scholar]

8. Денни В.А. Стратегии пролекарств в терапии рака. Eur J Med Chem. 2001; 36: 577–595. [PubMed] [Google Scholar]

9. Денни В.А. Активируемые опухолью пролекарства — новый подход к терапии рака. Исследование рака. 2004;22(4):604–619. [PubMed] [Google Scholar]

10. Tietze Lutz F, N M, Mollers Thomas, Fischer Roland, Glusenkamp Karl-Heinz, Rajewsky Manfred F, Jahde Eckhard. Опосредованное протонами высвобождение альдофосфамида из нетоксичного пролекарства: стратегия избирательной по отношению к опухоли активации цитоцидных препаратов. Исследования рака. 1989;49:4179–4184. [PubMed] [Google Scholar]

11. Martin Brown J, W WR. Использование гипоксии опухоли в лечении рака. Природа рассматривает рак. 2004; 4: 437–447. [PubMed] [Google Scholar]

12. Breistol K, H HR, Berger DP, Langdon SP, Fiebig HH, Fodstad O. Противоопухолевая активность пролекарства N-l-лейцил-доксорубицина и его исходного соединения доксорубицина в ксенотрансплантатах опухолей человека. Европейский журнал рака. 1998;34(10):1602–1606. [PubMed] [Google Scholar]

13. Гопин А., Эбнер С., Аттали Б., Шабат Д. Ферментативная активация дендритных пролекарств второго поколения: конъюгация саморазрушающихся дендримеров с ПЭГ с помощью клик-химии. Биоконъюгат хим. 2006; 17: 1432–1440. [PubMed] [Академия Google]

14. Shamis M, Lode HN, Shabat D. Биоактивация самоуничтожающихся дендритных пролекарств каталитическим антителом 38C2. JACS. 2004; 126:1726–1731. [PubMed] [Google Scholar]

15. Ибсен С., Захави Э., Врасдило В., Бернс М. , Чан М., Эзенер С. Новое пролекарство доксорубицина с контролируемой активацией фотолиза для химиотерапии рака. Фармацевтические исследования. 2010; 27(9):1848–1860. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

16. Лагинья К.М., Ферворт С., Шарруа Г.Р., Аллен Т. Определение уровней доксорубицина в цельной опухоли и ядрах опухоли при раке молочной железы у мышей. Клин Рак Рез. 2005;11(19): 6944–6949. [PubMed] [Google Scholar]

17. Hong RL, Huang CJ, Tseng YL, et al. Прямое сравнение липосомального доксорубицина с покрытием из полиэтиленгликоля или без него у мышей с опухолями C-26: полезно ли покрытие поверхности полиэтиленгликолем? Клинические исследования рака. 1999;5:3645–3652. [PubMed] [Google Scholar]

18. Jong JD, Guerand WS, Schoofs PR. Простая и чувствительная количественная оценка антрациклинов в ткани предсердий мыши с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и флуоресцентного обнаружения. Журнал хроматографии. 1991;570:209–202 I206. [PubMed] [Google Scholar]

19. Hsieh YJ, Chang CH, Huang SP, et al. Влияние циклоспорина А на региональное распределение доксорубицина в головном мозге крыс. Международный фармацевтический журнал. 2008; 350: 265–271. [PubMed] [Google Scholar]

20. Arnold RD, Slack JE, Straubinger RM. Количественное определение доксорубицина и метаболитов в плазме крыс и образцах тканей малого объема с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии с электрораспылением. Журнал хроматографии Б. 2004; 808: 141–152. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

21. DiFrancesco R, Griggs JJ, Donnelly J, DiCenzo R. Одновременный анализ циклофосфамида, доксорубицина и доксорубицинола с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Журнал хроматографии Б. 2007; 852 (1): 545–553. [PubMed] [Google Scholar]

22. Shen S, Ren J, Chen J, Lu X, Deng C, Jiang X. Разработка магнитных многослойных углеродных нанотрубок в сочетании с десорбцией с помощью ближнего инфракрасного излучения для определения распределения в тканях. липосом доксорубицина вводят крысам. Журнал хроматографии А. 2011;1218(29): 4619–4626. [PubMed] [Google Scholar]

23. Ибсен С.Д. Диссертации и тезисы ProQuest. 2011. Отложение энергии в организме из внешних источников для химического запуска клеточных реакций в желаемых локализованных областях. [Google Scholar]

24. Murdter TE, Sperker B, Bosslet K, Fritz P, Kroemer HK. Одновременное высокоэффективное жидкостно-хроматографическое определение глюкуронилового пролекарства доксорубицина, доксорубицина и его метаболитов в легочной ткани человека. Журнал хроматографии Б. 1998;709:289–295. [PubMed] [Google Scholar]

25. Maessen PA, Pinedo HM, Mross KB, Vijh WJFVD. Новый метод определения доксорубицина, 4′-эпидоксорубицина и всех известных метаболитов в сердечной ткани. Журнал хроматографии. 1988; 424: 103–110. [PubMed] [Google Scholar]

26. Альварес-Седрон Л., Саялеро М.Л., Ланао Дж.М. Подтвержденный высокоэффективной жидкостной хроматографией анализ доксорубицина в плазме и тканях крыс. Журнал хроматографии Б. 1999; 721: 271–278. [PubMed] [Академия Google]

27. Ibsen S, Zahavy E, Wrasidlo W, et al. Локализованная активация in-vivo фотоактивируемого пролекарства доксорубицина в глубокой ткани опухоли. В представлении [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

28. Какламани В.Г., Градишар В.Дж. Эпирубицин против доксорубицина: какой антрациклин является предпочтительным для лечения рака молочной железы? Клинический рак молочной железы. 2003; 4: 26–33. [PubMed] [Google Scholar]

29. Sleno L, Campagna-Slater Vr, Volmer DA. Реакции диссоциации протонированных антрациклиновых антибиотиков после тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Международный журнал масс-спектрометрии. 2006; 255:130–138. [Академия Google]

14 советов по успешному выделению РНК

Даже самый опытный молекулярный биолог выкрикивает свое любимое ругательство во время выделения РНК. Для человека, не являющегося ученым, может показаться, что этот бедняга сходит с ума, вопит на невинную трубку, наполненную прозрачной, невзрачной жидкостью.

Но тем ученым, которые испытали на себе множество неприятностей при выделении РНК, легко сопереживать. Излияния гнева (также известные как РНК гнева) являются естественным и распространенным побочным эффектом работы с РНК. И это понятно: низкий выход экстракции и деградация РНК могут случиться с самыми высокопоставленными учеными.

Получение высококачественной РНК из типов образцов стало фундаментальной частью очень многих протоколов, включая секвенирование следующего поколения (NGS), количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR), нозерн-блоттинг и синтез кДНК, и многие ученые выполнять его регулярно. Низкокачественная РНК может существенно повлиять на последующий анализ, что приведет к потере времени и денег.

Так быть не должно. Многих проблем с экстракцией РНК можно избежать и решить. Чтобы помочь вам на пути к победе в извлечении РНК, у нас есть 14 советов, как превратить ваш РНК-ангер в РНК-аккумен.

Выберите правильный набор для выделения РНК

Существует множество наборов и реагентов для выделения РНК. Но некоторые протоколы или форматы могут лучше подходить для ваших целей. Тщательно изучите каждый набор или реагент и рассмотрите тип образца, из которого вы будете извлекать РНК, начальное количество этого образца, метод последующего анализа, требуемую производительность и тип анализируемой РНК.

Например, если вам нужен высокопроизводительный метод очистки тотальной РНК, вы можете рассмотреть масштабируемые наборы MagMAX™ вместо экстракции РНК TRIzol. Но если у вас небольшое количество образцов и вы хотите использовать метод золотого стандарта для получения высококачественной РНК, вы, вероятно, каждый раз будете выбирать TRIzol.

Обратите внимание на суммы ввода

Больше не всегда лучше. Большинство наборов для выделения РНК и реагентов содержат рекомендуемое количество исходного материала для данного типа образца. Добавление большего количества, чем рекомендуется, может препятствовать эффективному лизису или отделению РНК от других клеточных компонентов. Для протоколов на основе столбцов вы можете перегрузить емкость связывания столбца, что может снизить общую производительность.

Имейте в виду, что содержание РНК может значительно различаться в различных тканях животных: клетки сердца и мышц имеют меньше общей РНК, чем клетки селезенки и тимуса, которые, как правило, богаты нуклеиновыми кислотами. Эти ткани также могут вносить дополнительные искажающие факторы , которые могут усложнить экстракцию, и могут потребоваться модификации протокола для экстракции высококачественной РНК.

Создать среду, свободную от РНКаз

РНКазы? Никогда не слышал о них, верно?

Они враги номер один при извлечении РНК. Их может быть трудно деактивировать или избавиться от них. РНКазы семейства РНКаз А стабилизированы несколькими дисульфидными связями и могут сохранять активность даже после денатурации. ^1,2

Чтобы свести к минимуму случайное попадание РНКаз во время выделения РНК, создайте настольный святилище без РНКаз. Это может быть часть вашего стола, отмеченная лентой отдельно от того места, где вы проводите экстракцию ДНК или белка. Храните в этой зоне реагенты, расходные материалы, пипетки и перчатки, предназначенные для вашей работы по извлечению РНК.

Носите СИЗ

Вы являетесь основным источником РНКаз. Ваш пот и кожное сало являются богатым источником загрязнения РНКазой.3,4 По этой причине крайне важно носить перчатки, чтобы предотвратить загрязнение рук. И если вам случится использовать перчатки, которые вы носите, для прикосновения к поверхности, на которой могут быть РНКазы (например, к дверной ручке, вашему лицу или другим поверхностям за пределами зоны, свободной от РНКазы, которую вы создали выше), обязательно измените свои перчатки. перчатки. Вы также можете надеть лабораторный халат, чтобы убедиться, что никакие другие части вашей кожи не соприкасаются с вашими образцами.

Используйте реагенты и расходные материалы, не содержащие РНКазы

В соответствии с вышеуказанным пунктом вы также можете приобрести чистящие средства, расходные материалы и другие реагенты, которые могут помочь держать РНКазы в страхе, чтобы они не приближались к вашей РНК. Растворы для обеззараживания поверхностей могут помочь удалить РНКазы со стеклянной посуды, столешниц и пипеток.

Вы можете предположить, что все пробирки и наконечники пипеток изначально не содержат РНКаз, но во многие из них РНКазы могли быть введены во время производства. Убедитесь, что ваши расходные материалы сертифицированы как не содержащие РНКазы, и что вы используете наконечники с фильтром для предотвращения загрязнения наконечником пипетки или перекрестного загрязнения образцов.

RNaseZap и лабораторные моющие средства помогают поддерживать лабораторию без РНКазы

Проведите пилотный эксперимент

Вы можете не осознавать, что потенциальное действие подвергает вашу РНК загрязнению РНКазой или что набор, который вы планируете использовать, не подходит для тип образца, пока вы не начнете экстракцию R NA NA . Чтобы не растратить ценные образцы, проведите пилотный эксперимент с менее ценными образцами, чтобы вы могли устранить перегибы в своем протоколе извлечения РНК. Это может сэкономить на дорогостоящей доработке или повторном сборе образцов.

Стабилизируйте свою РНК

Биохимическая природа РНК делает ее нестабильной по своей природе, а некоторые РНК имеют короткий период полураспада. как можно быстрее после взятия образца. Это можно сделать путем лизиса клеток с помощью тризола или буфера для лизиса из нашего мини-набора PureLink™ RNA и замораживания образцов при температуре -80 °C для последующей обработки. Вы также можете извлечь РНК сразу после ресуспендирования в лизирующем буфере. Кроме того, мгновенное замораживание образцов в жидком азоте может предотвратить деградацию РНК после сбора образцов.

Если вы не хотите сталкиваться с трудностями, связанными с жидким азотом, вы можете использовать реагенты для стабилизации РНК, такие как RNAlater. Он немедленно инактивирует РНКазы и дает вам возможность извлекать РНК, когда у вас есть время, не беспокоясь о деградации РНК.

Добавление этапов механического или ферментативного лизиса

Известно, что из образцов FFPE, образцов крови и некоторых микробов сложно извлечь достаточное количество высококачественной РНК, и могут потребоваться дополнительные этапы для обеспечения полного лизиса. Они могут включать в себя механический лизис с использованием бисерного взбивания или ферментативную предварительную обработку с использованием лизоцима или протеиназы К. Как упоминалось ранее, неполный лизис может вызвать проблемы при использовании методов экстракции на основе колонки. Прежде чем извлекать РНК из сложного образца, внимательно просмотрите протокол, чтобы узнать, включают ли они конкретные шаги протокола для сложных образцов.

Держите вещи в холоде

Из-за нестабильности РНК очень важно сохранять образцы холодными во время обработки. Если вы уже сталкивались с проблемами, связанными с РНКазами, подумайте о том, чтобы держать растворы для экстракции холодными, проводить экстракцию в холодной комнате или использовать предварительно охлажденную центрифугу для этапов центрифугирования.

Удаление загрязнений ДНК

Большинство наборов и реагентов для выделения РНК эффективно удаляют загрязнение геномной или плазмидной ДНК. Но некоторые последующие методы количественной оценки, такие как NanoDrop, или приложения, такие как qRT-PCR, могут обнаруживать даже незначительные количества ДНК и усложнять анализ.

Чтобы исправить это, многие методы очистки на основе колонок включают ДНКазу I, например PureLink™ DNase Set, которую можно использовать для обработки на колонке. Вы также можете использовать ДНКазу I для расщепления после экстракции.

Количественное определение РНК и контроль качества

Существует несколько методов контроля качества очищенной РНК и получения точных количественных оценок. Вы можете использовать УФ-поглощение при длинах волн 260 нм (для нуклеиновых кислот), 280 нм (для загрязняющих белков) и 230 нм (для других загрязнителей, таких как изотиоцианат гуанидина). Чистоту РНК можно оценить, взглянув на соотношение A260 / A280 (цель между 1,8 и 2,2) и A260 / A230 (цель > 1,7).

Флуорометры, такие как флуорометр Qubit, также могут определять количество РНК и являются более чувствительными, чем методы, основанные на поглощении УФ-излучения. Методы на основе микрофлюидики также полезны для количественной оценки РНК и определения качества. Образцы метят флуоресцентным красителем и подвергают электрофорезу через гелевую матрицу. Различные виды РНК мигрируют через матрицу в зависимости от размера, и целостность РНК можно оценить, глядя на полный след флуоресценции. Этот метод может обнаруживать загрязнители ДНК или продукты деградации РНК и формулировать их в виде числа целостности РНК (RIN) по шкале от 1 до 10, где 10 указывает на наилучшую целостность РНК.

Храните очищенную РНК

Многие наборы на основе колонок или шариков содержат элюирующие буферы, не содержащие РНКазы, которые могут защитить целостность РНК в течение длительного времени. Для выделения РНК TRIzol вы можете ресуспендировать высушенные гранулы в воде, не содержащей РНКаз, или в других специальных растворах для хранения. После количественного определения разделите РНК на аликвоты в одноразовые пробирки, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания (которые могут привести к деградации) или случайное загрязнение РНКазой. Если вы планируете использовать свою РНК в краткосрочной перспективе, храните ее при температуре -20°C. В противном случае храните ее при температуре -80°C для более длительного хранения.

Автоматизируйте экстракцию

Несколько доступных наборов для экстракции РНК (включая наборы MagMAX, упомянутые ранее) можно использовать с автоматизированными системами экстракции и очистки, такими как KingFisher™. Автоматизация помогает избежать одной из основных проблем при выделении РНК — загрязнения РНКазой при контакте с человеком. Он также обеспечивает воспроизводимую очистку РНК и сокращает время, затрачиваемое на ручное вмешательство, на 75 % по сравнению с подготовкой образцов вручную.

Прокачивайте каждый шаг выделения РНК

Обратитесь за помощью

Некоторые проблемы слишком серьезны, чтобы решать их самостоятельно. Если вам нужна дополнительная поддержка и помощь в извлечении РНК, посетите наш центр поддержки сбора образцов РНК, защиты и выделения. Существуют руководства, базовые руководства, советы по устранению неполадок, обучение и многое другое, что поможет вам пройти путь к успешному извлечению РНК.

Чтобы продолжить обучение, у нас есть дополнительные онлайн-ресурсы:

• Справочное руководство по РНК
• Что можно и что нельзя делать при выделении РНК
Сравнение комплекта PureLink
• и комплекта Qiagen. Примечание по применению

Эта статья предназначена только для исследовательских целей. Не для использования в диагностических процедурах.

___________________________________________________________________________________________________

 

Список литературы

1. Работа с РНК: основы. Веб-сайт Thermo Fisher Scientific: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.