Фз 218 п 1 ст 25: Ст 25 Закон О Государственной Регистрации Недвижимости N 218-ФЗ

Содержание

Ст 25 Закон О Государственной Регистрации Недвижимости N 218-ФЗ

Статья 25. Основания для возврата заявления и документов, представленных для осуществления государственного кадастрового учета и государственной регистрации прав, без рассмотрения

Заявление о государственном кадастровом учете и (или) государственной регистрации прав и документы, прилагаемые к нему, возвращаются без рассмотрения, если:

1) такие заявление и документы представлены в форме электронных документов, электронных образов документов в формате, не соответствующем формату, установленному органом нормативно-правового регулирования;

1.1) заявление о государственной регистрации перехода, прекращения права собственности на объект недвижимости, принадлежащий физическому лицу, и прилагаемые к нему документы представлены в форме электронных документов и (или) электронных образов документов, подписанных усиленной квалифицированной электронной подписью, и при этом не соблюдены требования, установленные статьей 36. 2 настоящего Федерального закона;

2) такие заявление и документы представлены в форме документов на бумажном носителе и имеют подчистки либо приписки, зачеркнутые слова и иные не оговоренные в них исправления, в том числе документы, исполненные карандашом, имеют серьезные повреждения, которые не позволяют однозначно истолковать их содержание;

3) информация об уплате государственной пошлины за осуществление государственной регистрации прав по истечении пяти рабочих дней с даты подачи соответствующего заявления отсутствует в Государственной информационной системе о государственных и муниципальных платежах и документ об уплате государственной пошлины не был представлен заявителем;

4) в Едином государственном реестре недвижимости содержится отметка о невозможности государственной регистрации перехода права, ограничения права и обременения объекта недвижимости без личного участия собственника объекта недвижимости (его законного представителя) и заявление на государственную регистрацию прав представлено иным лицом, за исключением случаев, предусмотренных пунктом 4.

5 части 1 и пунктом 5 части 3 статьи 15, частью 1.1 статьи 19 настоящего Федерального закона, а также случая государственной регистрации прав в порядке наследования;

4.1) в Едином государственном реестре недвижимости содержится отметка о невозможности государственной регистрации перехода, прекращения, ограничения права на земельный участок из земель сельскохозяйственного назначения или об обременении такого земельного участка до завершения рассмотрения судом дела о его изъятии в связи с неиспользованием по целевому назначению или использованием с нарушением законодательства Российской Федерации;

5) заявление о государственном кадастровом учете и (или) государственной регистрации прав не подписано заявителем в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Другие статьи ФЗ «О государственной регистрации недвижимости»

Статья 13. Внесение сведений в Единый государственный реестр недвижимости

Статья 24.1. Требования к карте-плану территории

Статья 22. Требования к межевому плану

Федеральный закон РФ «О государственной регистрации недвижимости» N 218-ФЗ ст 25 (действующая редакция 2021)

требования к документам, представляемым в электронном виде

Вопрос: Хотим зарегистрировать договор аренды путем подачи документов в электронном виде. Какие требования предъявляются к документам, представляемым в электронном виде?

 

Ответ: Необходимые документы нужно представить в форме электронных документов, подписанных усиленной квалифицированной электронной подписью. Договор аренды должны подписать такой подписью обе стороны  в соответствии с требованиями ч. 7, 8 ст. 21 Федерального закона от 13 июля 2015 г. N 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости» Исключение составляют те документы, которые в бумажном виде могут представляться в виде копии (без представления подлинника), например решение органа государственной власти или местного самоуправления о проведении торгов.

Такие документы можно представить в виде электронного образа документа, который подписывается усиленной квалифицированной электронной подписью лица, которое подписывает эти документы в бумажном виде или которое уполномочено заверять их копии  в соответствии с ч. 5, 9 ст. 21Федерального закона от 13 июля 2015 г. N 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости». Сформированный для государственной регистрации комплект электронных документов и образов документов нужно заверить усиленной квалифицированной электронной подписью заявителя. Формат представления документов в электронном виде указан в п. 9 Порядка представления документов. При несоответствии установленному формату документы возвращаются без рассмотрения  в соответствии  с п. 1 ст. 25Федерального закона от 13 июля 2015 г. N 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости».

Пресс-служба Управления Росреестра по РМЭ

424031, г. Йошкар-Ола, ул. Чехова, д. 73а

тел./факс (8362) 68-88-04 e-mail: [email protected] https://rosreestr.ru https://vk.com/rosreestr12

Обращение за возмещением в Фонд защиты прав граждан — «Фонд защиты прав граждан

Законодательством Российской Федерации предусмотрена выплата возмещения участникам строительства при банкротстве застройщика за счет средств компенсационного фонда, сформированного за счет обязательных взносов застройщиков, либо за счет имущества публично-правовой компании «Фонд защиты прав граждан — участников долевого строительства» (далее — Фонд), сформированного за счет имущественного взноса РФ или иных публично-правовых образований (ст. 23.2 Закона № 214-ФЗ; п. п. 1, 3, 3.1 ч. 1 ст. 3, ч. 1 ст. 10, ст. 25 Закона от 29.07.2017 № 218-ФЗ).

Прием заявлений о выплате и выплата возмещения отнесены к ведению Фонда, в том числе через банки-агенты. Решение о выплате возмещения принимается Фондом не позднее шести месяцев со дня принятия судом решения о признании застройщика банкротом и открытии конкурсного производства. Сообщение о дате, месте, времени, форме и порядке приема заявлений размещается на официальном сайте Фонда не позднее трех рабочих дней со дня принятия решения о выплате (п. п. 2, 3, 9 Правил, утв. постановлением Правительства РФ от 07.10.2017 № 1233).

По общему правилу участник долевого строительства вправе обратиться в Фонд за выплатой возмещения с даты принятия Фондом решения о выплате возмещения до даты завершения конкурсного производства в отношении застройщика или даты принятия арбитражным судом определения о передаче имущества и обязательств застройщика другому застройщику (приобретателю) (ч. 1, 1.1 ст. 13 Закона № 218-ФЗ; пп. «а» п. 4 Правил).

Обратиться с заявлением о выплате возмещения можно также с даты принятия Фондом решения о финансировании до даты завершения процедуры конкурсного производства застройщика в случае, если (ч. 1, 1.1, 4 ст. 13, ст. 13.1 Закона № 218-ФЗ; пп. «б», «в» п. 4 Правил):

  • требования участников долевого строительства включены в реестр требований участников строительства после даты принятия Фондом решения о финансировании предусмотренных законом мероприятий и не были переданы приобретателю в составе имущества и обязательств застройщика;
  • после завершения строительства в объекте строительства недостаточно помещений для удовлетворения требований всех участников строительства о передаче им помещений, в том числе при наличии требований нескольких участников строительства о передаче одних и тех же помещений.

Выплата возмещения осуществляется в размере рыночной стоимости жилого помещения на момент выплаты возмещения или в размере уплаченной цены (исполненной части обязательства) договора, предусматривающего передачу машино-мест и нежилых помещений, но не более предельной суммы возмещения, определяемой в соответствующем порядке (ч. 2, 2.1 ст. 13 Закона № 218-ФЗ; п. 8 Правил; Приложение к Правилам).

Выплата возмещения осуществляется в течение 10 рабочих дней со дня представления необходимых документов (п. 8 Правил).

Участник долевого строительства не вправе требовать возмещения за счет средств компенсационного фонда в случае получения им ранее страховой выплаты или выплаты, произведенной поручителем застройщика (ч. 16 ст. 25 Закона № 218-ФЗ; Информационное письмо Банка России от 10.12.2019 № ИН-015-53/90).

Также право на возмещение отсутствует в случае приобретения права требования по договору, предусматривающему передачу жилого помещения, машино-места или нежилого помещения, у юридического лица после возбуждения производства по делу о банкротстве застройщика (ч. 3 ст. 13 Закона № 218-ФЗ).

При определенных условиях правом на выплату возмещения за счет средств Фонда обладают также граждане, требования которых были погашены путем передачи в установленном порядке прав застройщика на объект незавершенного строительства и земельный участок жилищно-строительному или иному специализированному потребительскому кооперативу (далее — кооператив) и которые имеют в отношении этого кооператива требования о передаче жилого помещения, машино-места и (или) нежилого помещения (п. 3.2 ч. 1 ст. 3, ч. 1.2 ст. 13, ст. 13.3 Закона № 218-ФЗ; ст. 201.10 Закона № 127-ФЗ; п. п. 4, 8, 10, 11, 13, 16 Правил, утв. Постановлением Правительства РФ от 14.12.2019 № 1680).

Как успеть оформить квартиру в этом году. Сроки регистрации

(юридически значимых действий)

Государственный кадастровый учет недвижимого имущества

5 рабочих дней

с даты приема документов

ФГБУ «ФКП Росреестра»

7 рабочих дней

с даты приема документов МФЦ

п. п. 3, 4 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Государственная регистрация возникновения, перехода, прекращения права на недвижимое имущество или ограничения такого права и обременения недвижимого имущества

(далее — государственная регистрация прав)

7 рабочих дней

с даты приема документов

ФГБУ «ФКП Росреестра» или МФЦ

п.п.1, 2 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

приказ Управления от 31.08.2017 № П/356 (действующий с 15.09.2017)

Государственный кадастровый учет и государственная регистрация прав, осуществляемые одновременно

7 рабочих дней

с даты приема документов

ФГБУ «ФКП Росреестра» или МФЦ

п. п.5, 6 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»,

приказ Управления от 31.03.2017 № П/132

Государственная регистрация прав на основании:

—       нотариально удостоверенной сделки,

—       свидетельства о праве на наследство,

—       свидетельства о праве собственности на долю в общем имуществе супругов

3 рабочих дня

с даты приема (поступления) документов ФГБУ «ФКП Росреестра»

1 рабочий день,

следующий за днем подачи заявления

в электронной форме

5 рабочих дней

с даты приема документов МФЦ

п.п.9, 10 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости»

Государственная регистрация возникновения, перехода, прекращения прав на недвижимое имущество (за исключением государственной регистрации прав на основании нотариально удостоверенных документов) по заявлениям, поступившим в форме электронных документов, электронных образов документов с использованием информационно-телекоммуника-ционных сетей общего пользования, в том числе сети «Интернет», посредством единого портала государственных и муниципальных услуг или официального сайта Росреестра, если более короткий срок не определен информационной системой, предоставляющей электронный сервис

3 рабочих дней

приказ Управления от 21. 08.2017 № П/341

действующий с 28.08.2017)

Регистрационная запись о законном владельце закладной

1 день

п. 3 ст. 16 Федерального закона

«Об ипотеке (залоге недвижимости)»

Государственная регистрация передачи права по закладной в случае, если права залогодержателя удостоверяются закладной

1 рабочий день

п.10 ст.53

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Государственная регистрация соглашения об изменении содержания закладной

1 день

п. 7 ст. 13 Федерального закона

«Об ипотеке (залоге недвижимости)»

Государственная регистрация ипотеки жилого помещения

5 рабочих дней

с даты приема (поступления)

документов ФГБУ «ФКП Росреестра»

7 рабочих дней

с даты приема документов МФЦ

п. п.11, 12 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Государственная регистрация ипотеки земельного участка, здания, сооружения, нежилого помещения или машино-места, возникающей на основании нотариально удостоверенного договора ипотеки или нотариально удостоверенного договора, влекущего за собой возникновение ипотеки на основании закона, а также ипотеки жилого помещения

5 рабочих дней

п.п. 9, 9.1 ст.53

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Погашение регистрационной записи об ипотеке

3 рабочих дня

п.1 ст.25 Федерального закона

«Об ипотеке (залоге недвижимости)»

Погашение регистрационной записи об ипотеке, возникшей в силу Федерального закона «Об участии в долевом строительстве многоквартирных домов и иных объектов недвижимости и о внесении изменений в некоторые законодательные акты РФ»

5 рабочих дней

п. 1.1 ст.25 Федерального закона

«Об ипотеке (залоге недвижимости)»

Государственная регистрация найма жилого помещения и прекращения найма жилого помещения

5 рабочих дней

п.8 ст.51

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Государственный кадастровый учет и (или) государственная регистрация прав на основании поступившего в орган регистрации прав вступившего в законную силу судебного решения, установившего обязанность осуществить такие действия

5 рабочих дней

п.п.7 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Наложение (снятие) ареста на недвижимое имущество, запрета совершать определенные действия с недвижимым имуществом, или залог, избранный в качестве меры пресечения в соответствии с уголовно-процессуальным законодательством либо о возврате залога залогодателю или об обращении залога в доход государства на основании судебного акта или акта уполномоченного органа

не позднее рабочего дня,

следующего за днем поступления документов в орган регистрации прав

п. п.8 п.1 ст.16

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ «О государственной регистрации недвижимости»

приказ Управления от 14.09.2017 №П/386, действующий с 15.09.2017)

Государственная регистрация возникновения и перехода права собственности на жилые помещения, которые предоставляются гражданам в соответствии с Федеральным законом «О Фонде содействия реформированию жилищно-коммунального хозяйства» (приобретаемые за счет средств Фонда на переселение граждан из аварийного жилищного фонда)

5 рабочих дней

ч.9 ст.16

Федерального закона  от 21.07.2007 № 185-ФЗ

«О Фонде содействия реформированию жилищно-коммунального хозяйства»

Внесение сведений в ЕГРН в уведомительном порядке:

— записи о наличии возражения в отношении зарегистрированного права на объект недвижимости;

—  записи о невозможности государственной регистрации перехода, прекращения, ограничения права и обременения такого объекта недвижимости без личного участия правообладателя;

— записи о невозможности государственной регистрации перехода, прекращения, ограничения права на земельный участок из земель сельскохозяйственного назначения или обременения такого земельного участка до завершения рассмотрения судом дела о его изъятии в связи с неиспользованием по целевому назначению или использованием с нарушением законодательства в отношении зарегистрированного права на такой земельный участок;

— записи о наличии заявленного в судебном порядке права требования в отношении зарегистрированного права на объект недвижимости

5 рабочих дней

п. 1 ст.35, п.1 ст.36, п.1 ст.36.1, п.2 ст.37 Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Внесение в ЕГРН сведений по заявлению заинтересованного лица об изменении отдельных записей о правообладателе                  (в случае, когда совершение указанного действия не связано с государственной регистрацией прекращения, перехода прав на недвижимое имущество и сделок с ним»), об адресе объекта недвижимости

3 рабочих дня

приказ Управления от 21.08.2017 №П/341, действующий с 28.08.2017)

Внесение в ЕГРН записей о правообладателе, а также отдельных дополнительных сведений об объекте недвижимости:

 

— об адресе электронной почты и (или) о почтовом адресе, по которому осуществляется связь с лицом, чье право на объект недвижимости зарегистрировано, а также лицом, в пользу которого зарегистрировано ограничение права и обременение объекта недвижимости;

— о признании граждан недееспособными или ограниченно дееспособными, а также сведений о проживающих в жилом помещении членах семьи собственника жилого помещения, находящихся под опекой или попечительством, либо несовершеннолетних членах семьи собственника жилого помещения, оставшихся без попечения родителей;

3 рабочих дня

пункты 1, 4 ст. 38

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

-о назначении единого недвижимого комплекса;

— о назначении предприятия как имущественного комплекса

5 рабочих дней

пункты 2, 3 ст.38

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

Исправление технической ошибки (описки, опечатки, грамматической или арифметической ошибки либо подобной ошибки, приведшей к несоответствию сведений, содержащихся в ЕГРН, сведениям, содержащимся в документах, на основании которых вносились такие сведения), реестровой ошибки (воспроизведенной в ЕГРН ошибки, содержащейся в межевом плане, техническом плане, карте-плане территории или акте обследования, возникшей вследствие ошибки, допущенной лицом, выполнившим кадастровые работы, или ошибки, содержащейся в документах, направленных или представленных в орган регистрации прав иными лицами и (или) органами в порядке информационного взаимодействия)

3 рабочих дня

п. п.1, 3 ст.61

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

приказ Управления от 31.03.2017 № П/132

Предоставление сведений, содержащихся в ЕГРН

3 рабочих дня

п.9 ст.62

Федерального закона от 13.07.2015 № 218-ФЗ

«О государственной регистрации недвижимости»

5. Как работать с компаниями-застройщиками по новым правилам 2018 года (на 18-06-2018)

В адрес Ассоциации СОАУ «Меркурий» поступают обращения членов СРО в просьбой разъяснить действие новых положений Закона о банкротстве в части банкротства застройщиков. Предлагаем Вам ознакомиться с позицией Ассоциации по данному вопросу и принять информацию к сведений и использованию в дальнейшей работе.

Федеральным Законом от 29.07.2017 № 218-ФЗ «О публично-правовой компании по защите прав граждан — участников долевого строительства при несостоятельности (банкротстве) застройщиков и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» внесены изменения в Федеральный Закон «О несостоятельности (банкротстве)».

Законом предусмотрено создание Фонда защиты прав граждан – участников долевого строительства (далее – Фонд). Среди прочего на Фонд возложена функция аккредитации арбитражных управляющих в целях осуществления ими полномочий в делах о банкротстве застройщиков.

Согласно п.2.1. ст. 201.1. Закона о банкротстве конкурсными управляющими (внешними управляющими) в деле о банкротстве застройщика, который осуществлял взносы в компенсационный фонд в соответствии с законодательством об участии в долевом строительстве многоквартирных домов и (или) иных объектов недвижимости, утверждаются арбитражные управляющие, соответствующие установленным настоящим Федеральным законом требованиям и аккредитованные Фондом. Пункт  2.1 Закона о банкротстве  введен Федеральным законом от 29.07.2017 № 218-ФЗ.

В соответствии со статьей 25 Федерального закона от 29 июля 2017 г. № 218-ФЗ «О публично-правовой компании по защите прав граждан — участников долевого строительства при несостоятельности (банкротстве) застройщиков и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» (далее — закон № 218-ФЗ) предусмотренная частью 4 статьи 3 Федерального закона от 30 декабря 2004 г.   № 214-ФЗ «Об участии в долевом строительстве многоквартирных домов и иных объектов недвижимости и о внесении изменений в некоторые законодательные акты Российской Федерации» (далее — закон  № 214-ФЗ) обязанность застройщика по уплате обязательных отчислений (взносов) в компенсационный фонд возникает в отношении многоквартирного дома и (или) жилого дома блокированной застройки, состоящего из трех и более блоков, если договор участия в долевом строительстве с первым участником долевого строительства такого объекта недвижимости представлен на государственную регистрацию после даты государственной регистрации публично-правовой компании «Фонд защиты прав граждан — участников долевого строительства».

Датой государственной регистрации публично-правовой компании «Фонд защиты прав граждан — участников долевого строительства» (далее — Фонд) является 20 октября 2017 г. Таким образом, начиная с 21 октября 2017 года регистрация первого договора участия в долевом строительстве без уплаты обязательных отчислений (взносов) в Фонд не допускается.

Согласно п. 13. ст. 25 Закона № 218 новые положения Закона о банкротстве (в редакции закона № 218-ФЗ) применяется арбитражными судами при рассмотрении дел о банкротстве, производство по которым возбуждено после 1 января 2018 года.

В соответствии с абз. 3 части 3 ст. 201.1. Закона о банкротстве если сведения о том, что должник является застройщиком, становятся известны арбитражному суду после возбуждения дела о банкротстве, арбитражный суд:

принимает по ходатайству лица, участвующего в деле о банкротстве, или по собственной инициативе решение о признании должника банкротом и об открытии конкурсного производства либо выносит определение в случае, если указанные сведения стали известны после признания должника банкротом, в которых указывает на применение при банкротстве должника правил настоящего параграфа;

освобождает арбитражного управляющего от исполнения возложенных на него обязанностей в деле о банкротстве застройщика, если такой арбитражный управляющий не аккредитован Фондом. В указанном случае лицо, заявление которого о признании должника банкротом было признано обоснованным, представляет в арбитражный суд кандидатуру арбитражного управляющего, аккредитованного Фондом.

Аккредитация арбитражного управляющего в качестве конкурсного управляющего (внешнего управляющего) при банкротстве застройщиков осуществляется Фондом на основании заявления арбитражного управляющего в течение тридцати дней со дня его поступления. К указанному заявлению прилагаются документы, подтверждающие соответствие заявителя требованиям к аккредитации, установленным параграфом 7 Закона о банкротстве. Вместе с тем, Правительством Российской Федерации могут быть установлены дополнительные требования к условиям аккредитации арбитражных управляющих в качестве конкурсных управляющих (внешних управляющих) при банкротстве застройщиков (п.2.3 ст.201.1. Закона о банкротстве).

Порядок рассмотрения заявлений об аккредитации арбитражных управляющих в качестве конкурсных управляющих (внешних управляющих) при банкротстве застройщиков, аккредитации, аннулирования аккредитации, отказа в продлении аккредитации определяется регулирующим органом.

С учетом изложенного, после 1 января 2018 года арбитражным управляющим, желающим быть утвержденными в процедурах банкротства компаний-застройщиков, необходимо аккредитоваться при Фонде.

На сегодняшний день аккредитация арбитражных управляющих при Фонде все еще не осуществляется. На Федеральном портале проектов нормативных правовых актов опубликован Проект Приказа Минэкономразвития России об утверждении Порядка аккредитации арбитражных управляющих в целях осуществления ‎ими полномочий конкурсного управляющего (внешнего управляющего) ‎в деле о банкротстве застройщика в соответствии с Федеральным законом «О несостоятельности (банкротстве)» (http://regulation.gov.ru/p/73551). Согласно пояснениям службы поддержки Фонда проведение процедуры аккредитации при Фонде будет начато со вступлением в силу вышеуказанного Порядка.

В настоящее время при возбуждении дел о банкротстве компаний-застройщиков судами применяются нормы Закона о банкротстве с учетом невозможности предоставления сведений об аккредитации арбитражных управляющих при Фонде. Судебные акты, поступающие в адрес Ассоциации, не содержат дополнительных (новых) требований к кандидатурам арбитражных управляющих для утверждения в делах о банкротстве компаний-застройщиков.

После вступления в силу указанного Приказа об утверждении Порядка аккредитации Ассоциация планирует выпустить подробную инструкцию, содержащую описание порядка действий арбитражного управляющего для его аккредитации при Фонде.

Для оперативного получения информации по вопросам аккредитации предлагаем Вам дополнительно самостоятельно обращаться в Фонд по следующим контактам:

 

Веб-сайт:                   https://фонд214.рф/

Телефон:                   8 (800) 7007-214

Эл. почта:                  [email protected]

Адрес:                       125009, г. Москва, ул. Воздвиженка, 10

СКАЧАТЬ ИНФОРМАЦИОННОЕ ПИСЬМО СРО В ФОРМАТЕ .PDF

Создана: 18.06.2018 11:49, обновление 29. 06.2018 13:12

Статья 25 [ФЗ от 13.07.2015 N 218-ФЗ] — последняя редакция

Статья 25. Основания для возврата заявления и документов, представленных для осуществления государственного кадастрового учета и государственной регистрации прав, без рассмотрения

Заявление о государственном кадастровом учете и (или) государственной регистрации прав и документы, прилагаемые к нему, возвращаются без рассмотрения, если:

1) такие заявление и документы представлены в форме электронных документов, электронных образов документов в формате, не соответствующем формату, установленному органом нормативно-правового регулирования;

1.1) заявление о государственной регистрации перехода, прекращения права собственности на объект недвижимости, принадлежащий физическому лицу, и прилагаемые к нему документы представлены в форме электронных документов и (или) электронных образов документов, подписанных усиленной квалифицированной электронной подписью, и при этом не соблюдены требования, установленные статьей 36. 2 настоящего Федерального закона;

2) такие заявление и документы представлены в форме документов на бумажном носителе и имеют подчистки либо приписки, зачеркнутые слова и иные не оговоренные в них исправления, в том числе документы, исполненные карандашом, имеют серьезные повреждения, которые не позволяют однозначно истолковать их содержание;

3) информация об уплате государственной пошлины за осуществление государственной регистрации прав по истечении пяти рабочих дней с даты подачи соответствующего заявления отсутствует в Государственной информационной системе о государственных и муниципальных платежах и документ об уплате государственной пошлины не был представлен заявителем;

4) в Едином государственном реестре недвижимости содержится отметка о невозможности государственной регистрации перехода права, ограничения права и обременения объекта недвижимости без личного участия собственника объекта недвижимости (его законного представителя) и заявление на государственную регистрацию прав представлено иным лицом, за исключением случаев, предусмотренных пунктом 4. 5 части 1 и пунктом 5 части 3 статьи 15, частью 1.1 статьи 19 настоящего Федерального закона, а также случая государственной регистрации прав в порядке наследования;

4.1) в Едином государственном реестре недвижимости содержится отметка о невозможности государственной регистрации перехода, прекращения, ограничения права на земельный участок из земель сельскохозяйственного назначения или об обременении такого земельного участка до завершения рассмотрения судом дела о его изъятии в связи с неиспользованием по целевому назначению или использованием с нарушением законодательства Российской Федерации;

5) заявление о государственном кадастровом учете и (или) государственной регистрации прав не подписано заявителем в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Блог — Домашняя школа InternetUrok.ru

Внимательно ознакомьтесь с условиями пользования ресурсами сайта Домашняя школа InternetUrok.ru https://home-school.interneturok.ru/ (далее – Сайт). Пользуясь Сайтом ООО «ИНТЕРДА» (123317, г. Москва, Пресненская набережная, д. 8, стр. 1, этаж 8, помещение 17), Вы подтверждаете, что полностью принимаете следующие условия:

1. Под термином «содержание» в рамках настоящего Соглашения подразумеваются любые материалы, документы, изображения, схемы, аудиовидеоматериалы и любая другая информация, полученная на данном Сайте или размещенная на нем.

2. Данный Сайт представляет собой программное средство, позволяющее хранить, систематизировать и транслировать содержание научно-образовательного характера.

3. Сайт Домашняя школа InternetUrok.ru предоставляет возможность доступа к имеющимся на нем ресурсам исключительно в ознакомительных целях.

4. Информация, размещенная на Сайте, не является справочной и предоставляется исключительно в научно-образовательных целях.

5. Размещение видео и других материалов с сайта Домашняя школа InternetUrok.ru на сторонних ресурсах запрещено.

6. Администрация сайта Домашняя школа InternetUrok.ru оставляет за собой право в любой момент изменить содержание материалов (видео, тексты, задания и т.п.), размещенных на Сайте, без уведомления пользователей.

7. Администрация сайта Домашняя школа InternetUrok.ru не несет никакой ответственности за действия пользователей, связанные с использованием представленной на Сайте информации, и не возмещает убытков.

8. Информация на Сайте предоставляется также путем подключения третьих сторон к содержанию – предоставлением гиперссылок, указателей на другие сайты, поддерживаемые третьими лицами, предоставлением содержания сторонних сайтов обрамлением (фреймингом) и другими методами.

9. Подключение к содержанию сторонних сайтов предоставляется исключительно для удобства и информирования. Ответственность за содержание сторонних сайтов лежит на их создателях.

10. Если иное не указано в описании или титрах к видеоматериалу, все исключительные права на видеоматериал, размещенный на сайте Домашняя школа InternetUrok. ru (в том числе и конспект к нему), принадлежат ООО «ИНТЕРДА». Все исключительные права на записи онлайн-консультаций, домашние задания в виде вопросов, тестов, упражнений, задач, примеров принадлежат ЧОУ «Первая народная школа», если иное не указано в описании.

11. Если иное не указано прямо, услуги сайта предоставляются только для целей личного некоммерческого использования. Это означает, что без письменного разрешения Администрации сайта запрещается любое изменение, копирование, распространение, републикация, создание производных произведений, пересылка, продажа, лицензирование материалов сайта, за исключением трансляции материалов сайта исключительно в учебных учреждениях путём показа (трансляции) материалов или их частей напрямую с сайта Домашняя школа InternetUrok.ru.

12. Администрация Сайта приветствует гипертекстовые ссылки на сайт.

13. Запрещено использовать материалы и сервисы Сайта для любых целей, которые противоречат нормам морали и нравственности, целям создания данного Сайта, и/или нарушают (могут нарушить) запреты, предусмотренные настоящим Соглашением, и/или нарушают (могут нарушить) действующее законодательство РФ об авторских правах.

14. Запрещено использовать услуги Сайта любым способом, служащим для целей нанесения ущерба нормальному функционированию Сайта (включая флудинг, DOS-атаки, ограничение доступа к сайту третьих лиц, но не ограничиваясь ими).

15. Запрещено предпринимать попытки завладения чужими учетными записями (аккаунтами) на Сайте любыми способами (включая взлом пароля перебором, хакерство, фишинг, социальную инженерию, но не ограничиваясь ими).

16. Запрещена пропаганда наркотических средств, психотропных веществ. Не допускаются пропаганда или агитация, возбуждающие социальную, расовую, национальную или религиозную ненависть и вражду, пропаганда наркотических средств, психотропных веществ, а также иные виды пропаганды, запрещенные законами Российской Федерации. Запрещается пропаганда социального, расового, национального, религиозного или языкового превосходства.

17. Запрещено использование в сообщениях на Сайте и в данных при регистрации (логин, имя) ненормативной лексики, а также любых выражений, оскорбляющих личность собеседника или третьего лица (в том числе криптованный мат – латиницей, с использованием звёздочек, математических и иных символов). Администрация сайта имеет право блокировать любого Пользователя в случаях написания им нецензурной лексики или оскорблений во всех возможных каналах связи на сайте. Администрация сайта самостоятельно устанавливает срок блокировки конкретного Пользователя, нарушившего настоящий пункт Соглашения, в пределах периода от 1 до 7 дней, период блокировки компенсации не подлежит (продление доступа, возврат денежных средств).

18. Регистрируясь на Сайте, Пользователь дает свое согласие на участие в сборе диагностической информации, сведений об использовании Сайта, а также на обработку персональных данных, указанных на Сайте (ФИО, адрес электронной почты, пароль, возраст, место проживания, роль на Сайте), на любое действие (операцию) или совокупность действий (операций), совершаемых с персональными данными, включая сбор, запись, систематизацию, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передачу (в т.ч. трансграничную и третьим лицам — партнерам), обезличивание, блокирование, удаление, уничтожение персональных данных с использованием средств автоматизации в целях информирования об услугах, предоставления и улучшения качества услуг, облегчения доставки обновлений ПО, поддержки Сайта и оказания других услуг, а также для проверки соблюдения условий настоящего Соглашения. Согласие вступает в силу с момента регистрации на Сайте и действует в течение сроков, установленных действующим законодательством РФ.

19. Администрация Сайта имеет право самостоятельно и без предварительного уведомления менять контент Сайта, в том числе транслируемые видеоуроки и условия настоящего Соглашения.

20. Администрация Сайта имеет право в одностороннем порядке менять политику использования своего контента Пользователем и партнерами, в том числе вводить платные Услуги.

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент и включив в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected]

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.5dfd733e.1640027614.5a3b5c3a

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период. Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

SARS-CoV-2 RBD-антител, которые увеличивают ширину и устойчивость к побегу

Клеточные линии млекопитающих

Клеточные линии были получены от ATCC (Vero E6, Vero, BHK-21, CHO-K1, HEK293T / 17), Takara (Lenti -X 293T) и Thermo Fisher Scientific (ExpiCHO-S, Expi293F и Freestyle 293-F). Клетки MA104 были подарком от Х. Б. Гринберга (Стэнфордская школа медицины). Ячейки 293T-ACE2 описаны в ссылках 31,43 . Линии клеток Vero и MA104 дали отрицательный результат на контаминацию микоплазмой.Другие клеточные линии не тестировались. За пределами стандартов производителя аутентификация не выполнялась.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы и сывороток

Образцы от трех человек, выздоровевших от SARS-CoV-2, обозначенных как доноры S2H (возраст 36 лет, мужчина), S2D (возраст 70 лет, мужчина) и S2X (возраст 52, мужчина) были получены в соответствии с протоколами исследований, утвержденными местным институциональным наблюдательным советом (Комитет по этике кантона Тичино, Швейцария). Все доноры предоставили письменное информированное согласие на использование крови и компонентов крови (таких как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), сыворотки или плазма).Кровь, взятая у донора S2X, была получена на 48-й день (антитела S2X16, S2X35 и S2X58) и на 75-й день (S2X227) после появления симптомов. Кровь от донора S2H была взята на 17 день (S2h23 и S2h24), на 45 день (S2H58) и на 81 день (S2H97) после появления симптомов. Кровь от донора S2D была взята на 98 день (S2D106) после появления симптомов.

PBMC выделяли из крови, выполненной с использованием пробирок, предварительно заполненных гепарином, с последующим центрифугированием в градиенте плотности фиколла. PBMC либо использовались в свежем виде для сортировки B-клеток памяти, специфичных для белка SARS-CoV-2 Spike, либо хранились в жидком азоте для дальнейшего использования.Сыворотки получали из крови, собранной с использованием пробирок, содержащих активатор сгустка, с последующим центрифугированием и хранением при -80 ° C.

Сыворотки для блокады связывания серологических тестов были получены от 3 когорт выздоравливающих SARS-CoV-2 (средний возраст 52 года, диапазон 25–78, 55% мужчин) или вакцинированных (средний возраст 49 лет, диапазон 28–69, 65% мужчин ) лиц, проходящих исследования по протоколам, утвержденным местными институциональными наблюдательными советами (Комитет по этике кантона Тичино, Швейцария, Комитет по этике больницы Луиджи Сакко, Милан, Италия, и WCG North America, Принстон, штат Нью-Джерси, США). Все доноры предоставили письменное информированное согласие на использование крови и компонентов крови (таких как PBMC, сыворотки или плазма) и были набраны в больницах или амбулаторно.

Выделение В-клеток и производство рекомбинантных моноклональных антител

Об открытии и первоначальной характеристике шести антител в нашей панели уже сообщалось (S309 и S304, ссылки 4,15 ; S2X35, S2h23 и S2h24, ссылка 15 ; и S2E12, исх. 8 ), а остальные шесть (S2H97, S2X16, S2H58, S2D106, S2X58 и S2X227) описываются впервые в этой статье.Начиная со свежевыделенных PBMC или после оттаивания клеток, B-клетки обогащали путем окрашивания CD19 PE-Cy7 (BD Bioscience 557835, 1:50) и инкубации с анти-PE MicroBeads (Miltenyi Biotec 130-048-801, 1: 100) с последующим положительным отбором с использованием колонок LS (Miltenyi Biotec). Обогащенные В-клетки окрашивали анти-IgM (BioLegend 314508, 1:20), анти-IgD (BD Bioscience 555779, 1:40), анти-CD14 (BD Bioscience 562691, 1:50) и анти-IgA (Southern Biotech 2050-09, 1: 400), все меченые PE, и SARS-CoV-2 S перед слиянием с биотинилированной Avi-меткой (производимой в домашних условиях), конъюгированной со стрептавидином-Alexa-Fluor 647 (Life Technologies S21374, 1:40). SARS-CoV-2 S-специфические В-клетки памяти IgG + были отсортированы с помощью проточной цитометрии с помощью стробирования на PE-отрицательные и Alexa-Fluor 647-положительные клетки. Клетки культивировали для скрининга положительных супернатантов. Последовательности VH и VL антител были получены с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (RT – PCR), а моноклональные антитела были экспрессированы как рекомбинантный фрагмент Fab человека или как IgG1 (аллотип G1m3), несущие увеличивающую период полужизни мутацию M428L / N434S (LS) в Fc регион. Клетки ExpiCHO-S (Thermo Fisher Scientific) временно трансфицировали векторами экспрессии тяжелой и легкой цепей, как описано ранее 4 .Аффинную очистку выполняли на Äkta Xpress FPLC (Cytiva) под управлением программного обеспечения Unicorn версии 5.11 (Build 407) с использованием колонок HiTrap Protein A (Cytiva) для полноразмерных человеческих моноклональных антител и колонок CaptureSelect Ch2-XL MiniChrom (Thermo Fisher Scientific) для Fab-фрагментов. , используя PBS в качестве подвижной фазы. Замену буфера на соответствующий буфер для композиции проводили с помощью обессоливающей колонки HiTrap Fast (Cytiva). Конечные продукты стерилизовали фильтрованием через фильтры 0,22 мкм и хранили при 4 ° C.

Используя базу данных IMGT (http://www.imgt.org), семейство генов зародышевой линии Vh и Vl и количество соматических мутаций определяли путем анализа гомологии последовательностей Vh и V1 с известным человеческим V , Гены D и J . Последовательности Vh и V1 с обратной зародышевой линией были сконструированы с использованием IMGT / V-QUEST. Антитела S2E12 и S2H97 с реверсией зародышевой линии (аллотип G1m17) были произведены ATUM. Fab-фрагменты с обратной зародышевой линией были получены путем переваривания соответствующих IgG.

Классы эпитопов, показанные на рис. 1a, 2g определены как у Piccoli et al. 15 . Вкратце, классификация этих классов эпитопов является результатом экспериментов по объединению октетов с использованием структурно охарактеризованных антител, структурных представлений для определения распознавания только открытого RBD и способности антител препятствовать связыванию RBD с ACE2. В частности, сайт Ia доступен только в открытом состоянии RBD и в значительной степени перекрывает след ACE2; сайт Ib доступен как в открытом, так и в закрытом состоянии RBD и частично перекрывает след ACE2; сайт IIa находится в ядре RBD (доступен только в открытом состоянии RBD), и антитела, связывающиеся с этим сайтом, препятствуют связыванию с ACE2, сайт IIc также находится в ядре RBD, но нацелен на антитела, которые не мешают связыванию с ACE2; сайт IV полностью доступен как для открытых, так и для закрытых RBD и определяется следом антитела S309.

Нейтрализация аутентичного SARS-CoV-2 методом ингибирования проникновения

Нейтрализация определялась с использованием SARS-CoV-2-Nluc, инфекционного клона SARS-CoV-2 (на основе штамма 2019-nCoV / USA_WA1 / 2020) который кодирует нанолюциферазу вместо вирусной ORF7 и демонстрирует кинетику роста, сопоставимую с вирусом дикого типа 44 . Клетки Vero E6 (ATCC, CRL-1586) высевали в 96-луночные планшеты с черными стенками и прозрачным дном из расчета 2 × 10 4 клеток на лунку и культивировали в течение ночи при 37 ° C. На следующий день готовили 9-точечные четырехкратные серийные разведения моноклональных антител в инфекционной среде (DMEM + 10% FBS). SARS-CoV-2-Nluc разводили в инфекционной среде до конечной множественности инфицирования (MOI) 0,01 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку, добавляли к разведениям моноклональных антител и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C. Среду удаляли из клеток Vero E6, добавляли комплексы моноклональное антитело-вирус и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Среду удаляли из клеток, добавляли субстрат люциферазы Nano-Glo (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и количественно определяли сигнал люциферазы на планшет-ридере Victor Nivo (Perkin Elmer).

Анализ генерации и нейтрализации VSV с псевдотипом SARS-CoV-2 со спайком

Псевдовирусы VSV с дефектом репликации 45 , экспрессирующие спайковый белок SARS-CoV-2, были получены, как описано ранее. 46 с некоторыми модификациями. Плазмиды, кодирующие одиночные мутантные спайковые варианты SARS-CoV-2, были созданы посредством сайт-направленного мутагенеза плазмиды дикого типа pcDNA3.1 (+) — spike-D19 47 и плазмид, кодирующих многократно мутантный SARS-CoV-2 вызывающие озабоченность варианты были созданы с использованием протокола многоступенчатой ​​ПЦР с перекрывающимся расширением 23,48 , в котором последовательные перекрывающиеся фрагменты были разработаны для введения всех мутаций, которые были собраны с помощью ПЦР и клонированы в pcDNA3.1 с использованием набора для клонирования Takara In-fusion HD, следуя инструкциям производителя.

Клетки Lenti-X 293T (Takara, 632180) высевали в чашки диаметром 10 см при плотности 1 × 10 5 клеток на см 2 и на следующий день трансфицировали 5 мкг плазмиды спайковой экспрессии с TransIT- Ленти (Mirus, 6600) согласно инструкции производителя. Для анализов нейтрализации с рассматриваемыми вариантами (рис. 2d, 3b) клетки Lenti-X 293T высевали в чашки диаметром 10 см при плотности 5 × 10 6 клеток на см 2 и трансфицировали на следующий день. с 10 мкг плазмиды спайковой экспрессии.Через день после трансфекции клетки инфицировали VSV (G * ΔG-люцифераза) (Kerafast, Eh2020-p.m) в течение 1 часа, трижды промывали PBS, затем инкубировали еще 24 часа в полной среде при 37 ° C. Клеточный супернатант осветляли центрифугированием, фильтровали (0,45 мкм), разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C.

Для анализов нейтрализации псевдовируса VSV клетки Vero E6 (ATCC, CRL-1586) выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и высевали в 96-луночные планшеты с прозрачным дном белого цвета (Costar, 3903) при плотности 2 × 10 4 клеток на лунку.На следующий день моноклональные антитела серийно разводили в предварительно нагретой полной среде, смешивали в соотношении 1: 1 с псевдовирусом и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C в круглодонных полипропиленовых планшетах. Среду из клеток аспирировали, к клеткам добавляли 50 мкл комплексов вирус-моноклональное антитело, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Затем добавляли дополнительные 100 мкл предварительно нагретой полной среды поверх комплексов, и клетки инкубировали в течение дополнительных 16–24 часов. Условия тестировали в дублированных лунках на каждом планшете, и по крайней мере шесть лунок на планшет содержали неинфицированные, необработанные клетки (имитация) и инфицированные, необработанные клетки («без контроля mAb»).

Затем среду, содержащую комплексы вирус-моноклональное антитело, отсасывали из клеток и к клеткам добавляли 100 мкл разведения 1: 4 Bio-glo (Promega, G7940) в PBS. Для анализов нейтрализации с рассматриваемыми вариантами вместо Bio-glo к клеткам добавляли 50 мкл разведения 1: 2 SteadyLite Plus (Perkin Elmer) в PBS с Ca 2+ и Mg 2+ . Планшеты инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем анализировали на считывающем устройстве для планшетов Envision (PerkinElmer) или на считывающем устройстве Synergy h2 Hybrid Multi-Mode (Biotek) для рассматриваемых вариантов анализа.

Измерения относительных световых единиц (RLU) для инфицированных лунок вычитали на среднее значение RLU для фиктивных лунок (вычитание фона), а затем нормализовали до среднего значения вычтенных фоновых значений RLU «без контроля mAb» в каждом планшете. Процент нейтрализации рассчитывали вычитанием из 1 нормализованного состояния инфицирования моноклональными антителами. Данные были проанализированы и визуализированы с помощью Prism (версия 8.4.3). Значения IC 50 были рассчитаны на основе интерполированного значения из логарифма (ингибитор) в зависимости от наклона кривой отклика (четыре параметра) нелинейной регрессии с верхним ограничением <100.Эксперименты по нейтрализации SARS-CoV-2 S дикого типа и вариантов с одним мутантом проводились в течение трех независимых дней, то есть в биологических повторностях, где каждый биологический дубликат содержит технический дубликат. Значения IC 50 в биологических повторностях представлены как среднее геометрическое. Потерю или усиление нейтрализующей способности между вариантами спайков рассчитывали путем деления IC 50 варианта на исходную IC 50 в каждой биологической повторности. Эксперименты по нейтрализации вызывающих озабоченность вариантов SARS-CoV-2 S были проведены в биологических дубликатах, при этом значения IC 50 нормализованы соответствующими измерениями дикого типа и представлены как среднее арифметическое из дублированных экспериментов.

SARS-CoV-2, псевдотипированная нейтрализация VSV на клетках 293T-ACE2

Для исследования влияния экспрессии ACE2 на нейтрализацию S2H97 клетки Vero E6 высевали по 20 000 клеток на лунку в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном. Клетки 293T-ACE2 31 высевали по 35000 клеток на лунку в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном, которые были предварительно покрыты поли-d-лизином (Gibco). На следующий день, как описано выше, были выполнены псевдотипированные SARS-CoV-2 нейтрализации VSV с помощью S2E12, S309 и S2H97.Нейтрализацию проводили в трех лунках.

Нейтрализация вируса сарбековируса псевдотипом VSV с помощью S2H97

Экспрессионные конструкции млекопитающих (pcDNA3.1 (+) или pTwist-CMV), кодирующие белки-спайки из различных сарбековирусов с С-концевой делецией 19 аминокислот (D19), были синтезированы для SARS -CoV-2 (GenBank: QOU99296.1), SARS-CoV-1 Urbani (GenBank: AAP13441.1), hCoV-19 / pangolin / Guangdong / 1/2019 (GD-pangolin-CoV, GenBank: QLR06867. 1) , коронавирус панголина Guanxi-2017 (GX-pangolin-CoV, GenBank: QIA48623.1) и сарбековирус летучих мышей WIV1 (WIV1, GenBank: AGZ48828.1). Клетки Lenti-X 293T (Takara, 632180) засевали в 15-сантиметровые чашки так, чтобы клетки достигли 80% слияния после культивирования в течение ночи. На следующий день клетки трансфицировали с помощью TransIT-Lenti (Mirus, 6600) в соответствии с инструкциями производителя. Через день после трансфекции клетки инфицировали VSV (G * ΔG-люцифераза) (Kerafast, Eh2020-p.m.). Супернатант, содержащий VSV псевдотипа сарбековируса, собирали через 2 дня после трансфекции, центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут, разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C.

Для анализов нейтрализации клетки, поддерживающие устойчивую псевдовирусную инфекцию, высевали в 96-луночные планшеты с прозрачным дном и белыми стенками из расчета 20000 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды. Клетки Vero E6 использовали для VSV-SARS-CoV-2, VSV-SARS-CoV-1 и VSV-GD-pangolin-CoV. Клетки BHK-21 (ATCC, CCL-10), стабильно экспрессирующие ACE2, использовали для VSV-GX-pangolin-CoV и VSV-WIV1. После культивирования клеток в течение ночи получали серийные разведения антитела 1: 3 в DMEM в трех повторностях. Псевдовирус разводили в DMEM и добавляли к каждому разведению антител так, чтобы конечное разведение псевдовируса составляло 1:20.Смеси псевдовирус – антитело инкубировали 1 ч при 37 ° C. Среду удаляли из клеток и добавляли 50 мкл смеси псевдовирус: антитело. Через час после заражения 50 мкл культуральной среды добавляли в лунки, содержащие смеси псевдовирус: антитело, и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Затем среду удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1: 1 субстрата люциферазы DPBS: Bio-Glo (Promega, G7940). Планшет встряхивали при 300 об / мин при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего считывание RLU снимали на считывающем устройстве для микропланшетов EnSight (Perkin Elmer).Процент нейтрализации определяли, сначала вычитая средний фон (клетки только с субстратом люциферазы) значений RLU для 6 лунок на планшет для всех точек данных. Процент нейтрализации для каждой концентрации антител рассчитывали относительно контрольных лунок без антител для каждого планшета. Данные о процентной нейтрализации были проанализированы и нанесены на график с помощью Prism (GraphPad, v9.0.1). Абсолютные значения IC 50 были рассчитаны путем аппроксимации кривой с использованием модели нелинейной регрессии (переменный наклон, 4 параметра), и значения были интерполированы по кривой при y = 50%.Среднее геометрическое значение по крайней мере из двух независимых экспериментов было рассчитано с использованием Excel (Microsoft, версия 16.45).

Сарбековирусная псевдотипированная нейтрализация VSV с помощью S2E12

Спайки от SARS-CoV-2 (CAD0240757.1), RaTG13 (QHR63300.2), GD-панголин (QLR06867.1), GX-панголин (QIA48623.1), -CoV-1 Tor2 (YP009825051), WIV1 (AGZ48831.1) и WIV16 (ALK02457.1) были использованы для псевдотипа VSV. Для получения псевдотипированных вирусов HEK293T / 17 (ATCC, CRL-11268), засеянный в 10-сантиметровые чашки в DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин трансфицировали плазмидами с использованием липофектамина 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Через день после трансфекции клетки инфицировали VSV (G * ΔG-люцифераза) в течение 2 часов и 4 раза промывали DMEM перед добавлением среды, дополненной антителом против VSV-G (супернатант гибридомы I1-мыши при разведении 1:50. из CRL-2700, ATCC). Псевдотипические частицы собирали через 18 часов после инокуляции, осветляли центрифугированием при 2000 g в течение 5 минут, концентрировали 10 × с помощью мембранного фильтра с отсечкой 30 кДа и хранили при -80 ° C. Для экспериментов по нейтрализации S2E12 клетки 293T, стабильно экспрессирующие ACE2 (BEI # NR-52511) 43 в DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, высевали по 40000 клеток на лунку в 96-луночную ячейку с прозрачным дном и белыми стенками. чашки и культивировали в течение ночи при 37 ° C.Были приготовлены двенадцать трехкратных серийных разведений антитела S2E12 в DMEM, и разведения антител были смешаны 1: 1 с псевдотипированным VSV в присутствии разведенного 1:50 антитела против VSV-G. После 45 мин инкубации при 37 ° C к клеткам добавляли 40 мкл смеси антитело-вирус и через 2 часа после инфицирования добавляли 40 мкл DMEM. Через 17–20 ч к клеткам добавляли 50 мкл субстрата One-Glo-EX (Promega). Клетки инкубировали в темноте в течение 5–10 мин перед считыванием люминесценции на планшет-ридере Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific).Значения относительных единиц люциферазы были преобразованы в процент нейтрализации и нанесены на график с построением кривой нелинейной регрессии в GraphPad Prism. Измерения были выполнены в двух экземплярах с двумя независимыми продуцированиями псевдотипированного вируса.

Продукция рекомбинантного белка

Белок дикого типа SARS-CoV-2 RBD для анализов связывания SPR (с N-концевым сигнальным пептидом и C-концевым сайтом расщепления тромбина-TwinStrep-8 × His-tag) был экспрессирован в Expi293F (Thermo Fisher Scientific) при 37 ° C и 8% CO 2 .Трансфекцию проводили с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific). Супернатанты клеточных культур собирали через три дня после трансфекции и добавляли 10 × PBS до конечной концентрации 2,5 × PBS (342,5 мМ NaCl, 6,75 мМ KCl и 29,75 мМ фосфатов). RBD SARS-CoV-2 очищали с использованием картриджей HisTALON Superflow объемом 1 или 5 мл (Takara Bio), а затем буфер заменяли на 1 × буфер HBS-N (Cytiva) или PBS с использованием Zeba Spin Desalting (Thermo Fisher Scientific) или HiPrep 26 / 10 (Cytiva) обессоливающая колонка.

SARS-CoV-2 RBD дикого типа для кристаллизации (с N-концевым сигнальным пептидом, ETGT и С-концевым 8 × His-меткой) экспрессировали аналогично тому, как описано выше, в присутствии 10 мкМ кифунензина. Супернатант клеточной культуры собирали через четыре дня после трансфекции и добавляли 10 × PBS до конечной концентрации 2,5 × PBS. Белок очищали с использованием картриджа HisTALON Superflow на 5 мл с последующей эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva), уравновешенной 20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl. Для кристаллизации Fab-комплексов RBD-S2X259-S2H97 и RBD-S2E12-S304-S309 RBD дегликозилировали инкубацией в течение ночи с EndoH-гликозидазой при 4 ° C.

RBD из других сарбековирусов для SPR (с N-концевым сигнальным пептидом и C-концевым сайтом расщепления тромбином — TwinStrep-8 × His-tag) были экспрессированы в клетках Expi293F при 37 ° C и 8% CO 2 . Клетки трансфицировали с использованием PEI MAX (Polysciences) при соотношении ДНК: PEI 1: 3,75. В трансфицированные клетки через три дня после трансфекции добавляли 3 г глюкозы -1 (Bioconcept) и 5 ​​г гидролизата сои -1 (Sigma-Aldrich).Супернатант клеточной культуры (423 мл) собирали через 7 дней после трансфекции и добавляли 47 мл 10-кратного связывающего буфера (1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl, 20 мМ EDTA, pH 8,0) и 25 мл BioLock (IBA) и инкубировали лед на 30 мин. Белки очищали с использованием 5-мл картриджа высокой емкости Strep-Tactin XT Superflow (IBA) с последующей заменой буфера на PBS с использованием обессоливающих колонок HiPrep 26/10 (Cytiva).

Стабилизированные префузией шипованные белки SARS-CoV-2 для SPR (остатки 14-1211, D614 или D614G), содержащие мутации сайта расщепления 2P и фурина 49 с сигнальным пептидом мю-фосфатазы и C-концевым Avi -8x His-C-tag или C-концевой 8xHis-Avi-C-tag экспрессировали в клетках Freestyle 293-F (Thermo Fisher Scientific, R79007) при 37 ° C и 8% CO 2 . Трансфекцию проводили с использованием 293fectin в качестве реагента для трансфекции. Супернатант клеточной культуры собирали через три дня и очищали над 5 мл аффинной матрицы C-tag. Фракции элюирования концентрировали и вводили в колонку Superose 6 Increase 10/300 GL (Cytiva) с 50 мМ трис-HCl pH 8,0 и 200 мМ NaCl в качестве рабочего буфера.

SARS-CoV-2 Спайковый белок HexaPro для криоЭМ-анализа был получен в клетках Freestyle 293-F, выращенных в суспензии с использованием экспрессионной среды FreeStyle 293 (Life Technologies) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 8% CO 2 , вращающемся при 130 ° C. об / мин.Культуры трансфицировали с использованием PEI (9 мкг мл -1 ) клетками, выращенными до плотности 2,5 миллиона клеток на мл, и культивировали в течение трех дней. Супернатанты собирали, и клетки ресуспендировали еще в течение трех дней, получая две коллекции из каждой такой культуры. Спайковые белки очищали из осветленных супернатантов с использованием 5 мл кобальтовой аффинной колонки (Cytiva, HiTrap TALON rawde), концентрировали и мгновенно замораживали в буфере, содержащем 20 мМ Tris pH 8,0 и 150 мМ NaCl перед анализом.

SARS-CoV-2 Тример S нативного эктодомена для анализов рефолдинга был сконструирован с сигнальным пептидом мю-фосфатазы, начинающимся с 14Q, мутированным сайтом расщепления S1 / S2 (SGAR) и мотивом тримеризации сворачивания расщепления TEV и 8x His-тег, присоединенный к концу C (K1211). Нативно-подобный спайк экспрессировали и очищали, как описано выше для спайка SARS-CoV-2 HexaPro.

Рекомбинантный hACE2 для SPR (остатки 19-615 из Uniprot Q9BYF1 с C-концевой меткой AviTag-10 × His-GGG и N-концевым сигнальным пептидом) был получен ATUM.Белок очищали с помощью смолы Ni-Sepharose с последующим выделением мономерного hACE2 эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva), предварительно уравновешенной PBS.

Анализы связывания SPR

Измерения связывания SPR проводили с использованием прибора Biacore T200 с сенсорным чипом CM5, ковалентно иммобилизованным StrepTactin XT для захвата рекомбинантных белков RBD (данные на рис. 1a, расширенные данные на рис. 1c, 4f, i, l) . Рабочий буфер представлял собой Cytiva HBS-EP + (pH 7.4). Все измерения проводились при 25 ° C. Концентрации анализируемого вещества Fab (или hACE2) составляли 11, 33, 100 и 300 нМ, при одноцикловой кинетике. Данные с двойным вычитанием контрольных значений соответствовали модели связывания 1: 1 с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation (версия 3.1) или Biacore Insight Evaluation (версия 2.0.15). K D Значения выше 1 мкМ были определены из подгонок, где максимальный сигнал SPR при насыщении ( R max ) был установлен как константа, определенная из результатов для связывания аналитов с более высокой аффинностью с тем же RBD на той же поверхности. плотность.Данные, в которых не приводятся средние значения, являются репрезентативными для повторяющихся или трехкратных измерений (за исключением измерений с Fabs зародышевой линии, которые были измерениями одиночных образцов).

Чтобы подтвердить измерения связывания RBD SARS-CoV-2, эксперименты также были выполнены в двух дополнительных форматах, оба с моновалентными аналитами (данные в таблице расширенных данных 1): (1) связывание Fab с эктодоменом шипа SARS-CoV-2 измеряли с использованием сенсорных чипов CM5, иммобилизованных анти-AviTag pAb (Genscript, A00674-40) для захвата S, другие параметры эксперимента такие же, как указано выше, и (2) связывание RBD с IgG измеряли с использованием сенсорных чипов CM5, иммобилизованных античеловеческим Fc pAb (Southern Biotech, 2014-01) для улавливания IgG с концентрацией аналита RBD 3. 1, 12,5 и 50 нМ, другие параметры эксперимента такие же, как указано выше. Результаты подгонки дают очевидное значение K D для экспериментов по связыванию спайков, поскольку кинетика также отражает конформационную динамику спайков. Спайковый эктодомен представлял собой D614G с C-концевой 8xHis-Avi-C-меткой для всех измерений, кроме S2X58. Связывание выполняли с помощью спайка D614 с C-концевой меткой Avi-8x His-C. Для сравнения связывания зрелых антител и антител с реверсией зародышевой линии с RaTG13 представлены данные из формата эксперимента (2) с IgG в качестве лиганда.Эти данные (и другие данные, указанные в таблице расширенных данных 1 как «двухфазная кинетика») соответствовали модели гетерогенного лиганда из-за артефактной кинетической фазы с очень медленной диссоциацией, которая часто возникает, когда RBD является аналитом; меньшее сродство двух значений K D , сообщаемых при подборе, дается как K D (два значения K D разделены по крайней мере на один порядок величины).

Глубокое мутационное сканирование профилей ускользания мутантов

Мы использовали ранее описанный подход глубокого мутационного сканирования 3 для всесторонней идентификации мутаций RBD, которые избегают связывания каждым антителом.В этом подходе используются дублированные библиотеки мутантов RBD 26 , которые содержат практически все из 3819 возможных аминокислотных мутаций на фоне последовательности Wuhan-Hu-1 RBD. Варианты библиотеки ранее были связаны с последовательностями штрих-кода с коротким идентификатором и отсортированы для очистки библиотеки от вариантов, которые сильно снижают аффинность связывания ACE2 или экспрессию свернутого RBD 3 .

Сначала мы использовали изогенный штамм дрожжей, экспрессирующий немутантный SARS-CoV-2 RBD, и проточную цитометрию, чтобы идентифицировать EC90 связывания каждого антитела с отображаемым дрожжами SARS-CoV-2 RBD.Затем мы выполнили отбор библиотек, как описано ранее 3,20 , помечая библиотеки концентрацией антитела ЕС90 для стандартизации чувствительности к избеганию мутаций при отборе. Вкратце, библиотеки дрожжей индуцировали для поверхностной экспрессии, промывали и метили первичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки промывали и вторично метили конъюгированными с PE козьими антителами против IgG человека (Jackson ImmunoResearch 109-115-098) 1: 200 для мечения связанных антител и 1: 100 FITC-конъюгированными куриными анти-Myc-метками ( Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) для маркировки поверхностной экспрессии RBD.Мы подготовили контроли для установки селекционных ворот FACS, пометив дрожжи, экспрессирующие немутантный SARS-CoV-2 RBD, с той же концентрацией антител, что и выбранные библиотеки (1 ×), 100-кратно уменьшенная концентрация антител, чтобы проиллюстрировать эффект мутаций со 100-кратно сниженной аффинностью. и 0 нг / мл антитела -1 , чтобы проиллюстрировать полную потерю связывания антитела. Репрезентативные ворота выбора показаны на рис. 2b с расширенными данными. Установка ворот и сортировка выполнялись с помощью программного обеспечения FACSDiva (версия 6. 1.3). Мы отсортировали приблизительно 7,5 × 10 6 RBD + клеток на библиотеку на BD FACSAria II, собирая дрожжевые клетки из корзины сортировки для ускользания антител (фракции библиотеки, попадающие в корзину для ускользания антител, приведены на рис. 2c с расширенными данными). Отсортированные клетки извлекали в течение ночи, плазмиды извлекали из предварительно отсортированных популяций и популяций, ускользнувших от антител, и последовательности штрих-кода идентификатора варианта были амплифицированы с помощью ПЦР и секвенированы на Illumina HiSeq 2500 3,26 .

Как описано ранее 3,20 , подсчеты секвенирования до и после отбора использовались для оценки «фракции ускользания» для каждого варианта библиотеки, которая отражает фракцию дрожжей, экспрессирующих вариант, попадающий в FACS для ускользания антител. мусорное ведро.Вкратце, мы использовали пакет dms_variants (https://jbloomlab.github.io/dms_variants/, версия 0.8.2) для преобразования последовательностей Illumina в количество вариантов до и после выбора с использованием таблицы поиска вариантов штрих-кода / RBD от Starr. и другие. 26 . Затем мы вычислили для каждого варианта фракцию ускользания варианта v ( E v ) как: \ ({E} _ {v} = F \ times ({n} _ {{v} _ {{ \ rm {p}} {\ rm {o}} {\ rm {s}} {\ rm {t}}}} / {N} _ {{\ rm {p}} {\ rm {o}} { \ rm {s}} {\ rm {t}}}) / ({n} _ {{v} _ {{\ rm {p}} {\ rm {r}} {\ rm {e}}}} / {N} _ {{\ rm {p}} {\ rm {r}} {\ rm {e}}}) \), где F — общая доля библиотеки, которая избегает связывания антител (Расширенные данные Инжир.2c), \ ({n} _ {{v} _ {{\ rm {p}} {\ rm {o}} {\ rm {s}} {\ rm {t}}}} \) и \ ( {n} _ {{v} _ {{\ rm {p}} {\ rm {r}} {\ rm {e}}}} \) — счетчики секвенирования варианта v в библиотеке RBD после и перед выбором FACS, соответственно (с псевдосчетом 0,5, добавленным ко всем подсчетам), и N после и N до — это общее количество всех вариантов после и до выбора FACS, соответственно. Затем мы применили вычислительные фильтры для удаления вариантов с низкими показателями секвенирования перед сортировкой или очень вредными мутациями, которые могут вызвать артефактное ускользание антител из-за глобального разворачивания или потери экспрессии RBD на поверхности клетки. В частности, мы отфильтровали варианты, у которых количество предвыборных секвенирований было ниже, чем количество 99-го процентиля вариантов, содержащих преждевременные стоп-кодоны, которые были в значительной степени очищены предыдущими сортами для экспрессирующих RBD и ACE2-связывающих вариантов RBD. Мы также удалили варианты с оценкой связывания ACE2 ниже -2,35 или оценкой экспрессии RBD ниже -1, а также варианты, содержащие отдельные мутации с эффектами ниже этих пороговых значений, используя измерения глубокого мутационного сканирования на уровне вариантов и мутаций Starr et al. 26 . Мы также отфильтровали редкие мутации с низким охватом в библиотеках, сохранив мутации, которые были отобраны как минимум на одном варианте со штрих-кодом с одним мутантом или как минимум на двух вариантах с множественными мутациями в каждой реплике. Наконец, чтобы разложить фракции ускользания с одной мутацией для каждого антитела, мы реализовали глобальные модели эпистаза 50 с использованием пакета dms_variants для оценки эффекта каждой отдельной аминокислотной мутации, точно так, как описано в исх. 20 .

Отбор ускользнувших антител проводили в полном дубликате с использованием независимо созданных и проанализированных мутантных библиотек SARS-CoV-2 (см. Корреляции в расширенных данных, рис. 2e, f). Сообщенные фракции ускользания по всему документу являются средними для двух повторностей, и эти окончательные фракции ускользания на мутацию представлены на GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_Vir_mAbs/blob/main/ результаты / supp_data / vir_antibodies_raw_data.csv). Интерактивная визуализация карт выхода антител (https: // jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_Vir_mAbs) были созданы с использованием dms-view 51 .

Анализы связывания библиотеки сарбековируса

Был собран тщательно подобранный набор всех уникальных аминокислотных последовательностей RBD сарбековируса, включая набор последовательностей RBD сарбековируса, описанный Letko et al. 7 , наряду с дополнительными уникальными последовательностями RBD среди эпидемических штаммов SARS-CoV-1, о которых сообщают Song et al. 52 , BtKY72 53 и новые последовательности сарбековируса RmYN02 54 , GD-pangolin-CoV (консенсус RBD, представленный на рисунке 3a у Lam et al. 55 ) и GX-pangolin-CoV 55 (P2V, неоднозначный нуклеотид в кодоне 515 (спайковая нумерация SARS-CoV-2), разрешенный для сохранения F515, который сохраняется во всех других сарбековирусах). Список всех RBD и порядковых номеров доступа доступен на GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARSr-CoV_RBD_MAP/blob/main/data/RBD_accessions.csv).

Для определения кладов RBD сарбековируса было произведено выравнивание аминокислотных последовательностей RBD с использованием mafft 56 со штрафом за раскрытие гэпа 4.5 (выравнивание доступно на GitHub: https://github.com/jbloomlab/SARSr-CoV_RBD_MAP/blob/main/data/RBD_aa_aligned.fasta). Соответствующее выравнивание нуклеотидной последовательности получали из выравнивания аминокислот с использованием PAL2NAL 57 . Филогения генной последовательности была выведена с использованием RAxML версии 8. 2.12 58 , с моделью замены GTRGAMMA и моделью разделения с отдельными параметрами для положений первого, второго и третьего кодона. Последовательность RBD хибековируса Hp-Zhejiang2013 (GenBank: KF636752) использовалась в качестве внешней группы для укоренения филогении сарбековируса.

Все уникальные кодирующие белок RBD последовательности сарбековируса были заказаны у IDT, Twist или Genscript и клонированы в наш дрожжевой дисплей-вектор 26 . Последовательности объединяли и добавляли к последовательностям штрих-кода из 16 нуклеотидов в соответствии с протоколом, описанным у Starr et al. 26 . Длинночитаемые кольцевые консенсусные последовательности, охватывающие 16-нуклеотидный штрих-код и генотип RBD, собирали на PacBio Sequel v2.0 и обрабатывали точно так, как описано у Starr et al. 26 .В результате была получена таблица поиска вариантов штрих-кода для библиотеки RBD сарбековируса, аналогичная той, которая использовалась для мутантных библиотек SARS-CoV-2. Эта таблица доступна на GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARSr-CoV_RBD_MAP/blob/main/data/barcode_variant_table.csv).

Объединенная библиотека RBD сарбековируса была помечена, отсортирована и количественно определена, как описано выше для мутантных библиотек SARS-CoV-2, за исключением того, что мы отсортировали только около 1 миллиона клеток RBD + из-за уменьшенного размера библиотеки. Секвенирование и количественная оценка ускользания по варианту антитела проводили, как описано выше.Данные для HKU3-8 RBD не показаны, так как этот RBD не был успешно выражен в нашей платформе дрожжевого дисплея. Для нескольких антител мы провели вторичный эксперимент, выбрав библиотеку RBD сарбековируса с более строгими воротами «полного выхода», чтобы выбрать только варианты, демонстрирующие полную потерю связывания (расширенные данные, рис. 2b, c).

Для последующих количественных анализов связывания выбранные RBD сарбековируса были клонированы в платформу дрожжевого дисплея в качестве изогенных исходных материалов. Анализы связывания проводили в серии титрований антител в 96-луночных планшетах, и связывание при каждой концентрации антитела (средняя геометрическая интенсивность флуоресценции в канале PE среди клеток RBD + (FITC + )) определяли с помощью проточной цитометрии и соответствовать четырехпараметрической кривой Хилла для определения EC 50 (средняя точка).

Анализ мутаций в природных последовательностях SARS-CoV-2

Все спайковые последовательности на GISAID 59 по состоянию на 2 мая 2021 года были загружены и выровнены с использованием mafft 56 . Последовательности нечеловеческого происхождения, последовательности с пробелами или неоднозначными символами в RBD и последовательности с более чем восемью аминокислотными отличиями от эталонной последовательности Wuhan-Hu-1 (GenBank MN908947, остатки N331-T531) были удалены. Мы определили частоты мутаций по сравнению с эталоном Wuhan-Hu-1 из этого окончательного выравнивания 1 190 241 последовательностей. Мы благодарим всех участников базы данных GISAID EpiCoV за их обмен данными о последовательностях. Участники GISAID EpiCoV перечислены на https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_Vir_mAbs/blob/main/data/gisaid_hcov-19_acknowledgement_table_2021_03_04.pdf.

Суммарные количественные показатели свойств антител

Относительный размер эпитопа антитела был рассчитан как сумма фракций ускользания на мутант, которые как минимум в пять раз превышают глобальную медианную фракцию ускользания (чтобы минимизировать влияние вариаций фонового шума на суммирование).Для этого суммирования фракции ускользания были нормализованы к максимальной фракции ускользания на мутацию, чтобы учесть небольшое изменение в самой большой фракции ускользания на мутацию, измеренную между выборками.

Относительную способность к ускользанию антитела рассчитывали так же, как относительный размер эпитопа, но каждую мутацию умножали на два весовых фактора, масштабируемых от 0 до 1, которые отражают влияние этой мутации на аффинность связывания ACE2 и экспрессию RBD, как измерено в нашем исследовании. предварительное глубокое мутационное сканирование 26 .Взаимосвязь между весовыми коэффициентами и влиянием мутации на каждое свойство показано на рис. 3a с расширенными данными. Мутации с эффектом <–1 на любое свойство эффективно обнуляются при суммировании ускользающей способности. Мутации с эффектами от –1 до 0 имеют промежуточный вес, а мутациям с 0 или положительным эффектом присваиваются весовые коэффициенты 1.

Чувствительность антител к ускользанию в результате естественных мутаций SARS-CoV-2 рассчитывалась как сумма частот GISAID всех случаев ускользания. мутации, при которых мутации ускользают (все метки в расширенных данных рис.3c) определяются как те, у которых фракция ускользания более чем в пять раз превышает медианную фракцию ускользания, как указано выше. Эти суммарные частоты собственных колебаний приведены в таблицах в заголовках графиков на рис. 3c с расширенными данными.

Суммарная ширина антитела была рассчитана на основе выбора ускользания библиотеки RBD сарбековируса с использованием только стандартного стробирования (расширенные данные, рис. 4b). Хотя у нас есть различные данные по последующему связыванию, иллюстрирующие снижение аффинности связывания для некоторых «ускользнувших» RBD сарбековируса, эти последующие эксперименты не проводились систематически для всех комбинаций антитело-RBD, и, следовательно, будут искажать оценки ширины.Ширину связывания рассчитывали как частоту всех RBD сарбековируса, которые связаны с аффинностью в пределах порога селекции FACS, взвешенную по представлению клады. Ширина была нормализована, чтобы дать равное представление каждой из четырех клад сарбековируса, чтобы учесть различную глубину отбора проб. В кладе SARS-CoV-1 все штаммы человека 02/03 и штаммы циветты и человека 03/04 были одинаково понижены, чтобы каждый из них представлял 1/8 возможной ширины в кладе SARS-CoV-1 (вместе с шесть сарбековирусов летучих мышей в этой кладе).Например, ширина для S304 рассчитывается как [4/4 + ([6/6] + [6/6] + 5) / 8 + 2/2 + 0/21] / 4 = 0,72, на основе данных показано в расширенных данных рис. 4b.

Проекция многомерного масштабирования эпитопов антител

Проекция многомерного масштабирования на рис. 4 была выполнена с использованием пакета Python scikit-learn. Сначала мы вычислили сходство и различие в местах ускользания между каждой парой антител, точно так, как описано в Greaney et al. 3 , и выполнили метрическое многомерное масштабирование с двумя компонентами на матрице различий между всеми парами антител.Антитела в этом макете были раскрашены круговыми диаграммами, пропорциональными общему квадрату ускользания по сайтам, которое попадает в помеченные структурные области (RBM, остатки 437-508, контакт ACE2, определенный как отсечение 4 Å на основе кристаллической структуры 6M0J 60 , и основной RBD в противном случае). В этот макет мы включили все наши ранее опубликованные антитела, для которых мы выполнили картирование ускользания с помощью того же подхода. Эти антитела и их ссылки включают: S2X259 37 ; LY-CoV555 21 ; COV2-2196 и COV2-2130 36 ; REGN10933, REGN10987 и LY-CoV016 20 ; и все другие антитела COV2 и CR3022 3 .

Для рис. 4b – d и расширенных данных на рис. 7c мы раскрасили антитела в этом макете в соответствии с различными свойствами антител. При необходимости мы также окрашивали эти ранее исследованные антитела, как описано ниже. Расширенные данные Рис. 7d и диаграммы разброса на рис. 4e – g показывают взаимосвязь между свойствами антител, конкретно в этом исследовании (и S2X259) для наиболее прямого сравнения.

Эффективность нейтрализации антител, показанная на рис. 4b, включает достоверные значения IC 50 нейтрализации SARS-CoV-2, указанные в этом исследовании (рис.1a), вместе с живыми значениями IC 50 нейтрализации SARS-CoV-2 для антител COV2, сообщенными Zost et al. 10 . Мы признаем, что сравнивать эффективность нейтрализации, полученную в разных лабораториях для разных партий антител, несовершенно, хотя в данном случае оба набора действительно представляют собой эффективности нейтрализации с подлинным вирусом. Поэтому мы не сравниваем эти два набора измерений напрямую количественно, но мы отмечаем, что их совместное включение на рис. 4b подтверждает дихотомию между нейтрализующей способностью ядра RBD и антителами RBM, которая подтверждается одной только панелью нейтрализации.

Размах сарбековируса, показанный на рис. 4c, включает измерения ширины пан-сарбековируса, представленные в текущем исследовании, вместе с более ограниченными измерениями ширины антител, о которых сообщалось в предыдущих публикациях. В этих ранее опубликованных экспериментах было определено связывание с более ограниченным набором RBD сарбековируса, присутствующим в наших библиотеках (SARS-CoV-2, RaTG13, GD-pangolin, SARS-CoV-1 (Urbani), LYRa11 и WIV1).Мы рассчитали ширину из этого неполного набора последовательностей сарбековируса для сравнения, но обратите внимание, что эти антитела ограничены относительной шириной 0,5, потому что не были включены RBD из Африки / Европы или не использующие ACE2 клады Азии. Однако, как и в случае с нейтрализацией, включение этих антител, тем не менее, подчеркивает основную дихотомию RBD – RBM в широте сарбековируса, установленную нашей основной панелью.

Для иллюстрации размера эпитопа и возможности ускользания на рис. 4d и расширенных данных на рис.7c, мы рассчитали эти количества для наших ранее профилированных антител, как описано выше. Мы исключили антитела, представленные в Greaney et al. 3 , поскольку эти анализы были выполнены на предыдущей версии нашей мутантной библиотеки SARS-CoV-2, которая демонстрировала различные количественные характеристики абсолютного ускользания, что усложняло его количественное сравнение степени ускользания для антител, профилированных в этом и других наших исследованиях, которые все используют одну и ту же библиотеку.

Структурные отображения по периметру рис.4a были созданы путем сопоставления полного побега по сайту с столбцом B-фактора структур PDB. Следы определялись как остатки в пределах 5 Å отсечки тяжелых атомов антитела. Использовались структуры, описанные в этой статье, или ранее опубликованные структуры: RBD, связанный с ACE2 (6M0J) 60 , RBD, связанный с CR3022 (6W41) 61 , RBD, связанный с REGN10987 и REGN10933 (6XDG) 62 , CB6- (LY-CoV016) связывает RBD (7C01) 63 и S304, S309 и S2h24-связанный RBD (7JX3) 15 .

RBD ELISA

Девяносто шесть лунок с половинной площадью (Corning, 3690) покрывали в течение ночи при 4 ° C 25 мкл белков RBD сарбековирусов в концентрации 5 мкг / мл -1 в PBS pH 7,2. Планшеты блокировали PBS 1% BSA (Sigma-Aldrich, A3059) и затем инкубировали с серийными разведениями моноклональных антител в течение 1 часа при комнатной температуре. После 4 стадий промывки с помощью 0,05% Твин 20 (PBS-T) (Sigma-Aldrich, 93773) добавляли козьи вторичные антитела против человеческого IgG (Southern Biotech, 2040-04) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.Затем планшеты промывали 4 раза PBS-T и добавляли субстрат 4-нитрофенилфосфат (pNPP, Sigma-Aldrich, 71768). После 30 мин инкубации оптическую плотность при 405 нм измеряли планшет-ридером (Biotek), и данные наносили на график с помощью GraphPad Prism.

Связывание с белками сарбековируса S, экспрессируемыми на клеточной поверхности, методом проточной цитометрии

Клетки ExpiCHO-S высевали из расчета 6 × 10 6 клеток на мл в объеме 5 мл в 50-мл биореакторе. Плазмиды, кодирующие спайк, разводили в холодной OptiPRO SFM, смешивали с реагентом ExpiFectamine CHO (Life Technologies) и добавляли к клеткам.Затем трансфицированные клетки инкубировали при 37 ° C с 8% CO 2 со скоростью орбитального встряхивания 120 об / мин (диаметр орбиты 25 мм) в течение 42 часов. Кратковременно трансфицированные клетки ExpiCHO-S собирали и дважды промывали промывочным буфером (PBS, 1% BSA, 2 мМ EDTA). Клетки подсчитывали и распределяли по круглодонным 96-луночным планшетам (Corning) и инкубировали с 10 мкг мл -1 S2H97, S2X35 или S309 моноклональных антител. Меченные Alexa Fluor647 вторичные Ab козьих антител против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch 109-607-003) получали на 1.5 мкг мл -1 и добавляли к клеткам после двух стадий промывки. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в промывочном буфере для сбора данных на цитометре ZE5 (Bio-Rad).

Кристаллизация, сбор данных, определение структуры и анализ

Для образования комплексов RBD – Fab для кристаллизации RBD SARS-CoV-2 смешивали с 1,3-кратным молярным избытком каждого Fab и инкубировали на льду в течение 20–60 мин. Комплексы очищали на колонке Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva), предварительно уравновешенной 20 мМ трис-HCl pH 7.5 и 150 мМ NaCl. Кристаллы комплексов RBD – Fab были получены при 20 ° C методом диффузии пара сидя-капля.

Для комплекса SARS-CoV-2 RBD – S2X35 – S309 в общей сложности 200 нл комплекса при 5,4 мг / мл -1 были смешаны с 100 нл маточного раствора, содержащего 1,85 М сульфата аммония, 0,1 М Трис pH 8,17, 0,8% (мас. / Об.) Поливинилового спирта, 1% (об. / Об.) 1-пропанола и 0,01 M HEPES pH 7. Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте с использованием маточного раствора с добавлением 20% глицерина для криозащиты.Данные были собраны на Beamline 9-2 Стэнфордского источника синхротронного излучения в Стэнфорде, Калифорния, и обработаны с помощью программного пакета XDS (версия 31 января 2020 г.) 64 до 1,83 Å в пространственной группе C 222. RBD – S2X35 Структура комплекса –S309 Fab была решена путем молекулярной замены с использованием фазера 65 из исходной модели, состоящей из SARS-CoV-2 RBD – S309 Fab (PDB 7JX3) и модели гомологии для S2X35 Fab, построенной с использованием молекулярной операционной среды (MOE). ) программный комплекс от компании Chemical Computing Group (https: // www.chemcomp.com).

Для комплекса SARS-CoV-2 RBD-S2H97-S2X259 Fab 200 нл комплекса при 5,7 мг / мл -1 смешивали с 200 нл маточного раствора, содержащего 0,12 M смесь моносахаридов, 20% (об. / Об.) Этилена. гликоль, 10% (мас. / об.) ПЭГ 8000, 0,1 М трис (основание) / бицин, pH 8,5, 0,02 М хлорид натрия, 0,01 М MES pH 6 и 3% (об. / об.) Jeffamine ED-2003. Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте. Данные были собраны на линии 9-2 Стэнфордского источника синхротронного излучения в Стэнфорде, Калифорния.Данные были обработаны с помощью программного пакета XDS (версия 31 января 2020 г.) 64 для окончательного набора данных 2,65 Å в пространственной группе P 2 1 . Структура комплекса RBD – S2H97 – S2X259 Fab была решена путем молекулярного замещения с использованием фазера из исходной модели, состоящей из SARS-CoV-2 RBD (PDB 7JX3) и моделей гомологии для Fab S2H97 и S2X259, построенных с использованием программного пакета MOE.

Для комплекса SARS-CoV-2 RBD – S2E12 – S304 – S309 Fab 200 нл комплекса при 4,5 мг / мл –1 смешивали со 100 нл 0.09 M фосфат / цитрат pH 5,5, 27% (об. / Об.) PEG мазок низкий, 4% (об.) Полипропиленгликоль 400 и 0,02 M имидазол pH 7 или 100 нл 0,09 M фосфат / цитрат pH 5,5, 27% ( об. / об.) Мазок ПЭГ низкий, 0,01 M фосфат калия / натрия pH 7, 1% (об. / об.) PPGBA 230 и 1,5% (об. / об.) PPGBA 400. Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте. Данные были собраны в пучке 4.2.2 Консорциума молекулярной биологии на синхротронном объекте Advanced Light Source в Беркли, Калифорния. Наборы данных из двух кристаллов из двух условий были индивидуально обработаны, а затем объединены с программным пакетом XDS (версия 31 января 2020 г.) 64 для получения окончательного набора данных из 2.93 Å в пространственной группе I 4 1 22. Структура комплекса RBD – S2E12 – S304 – S309 Fab была решена путем молекулярной замены с использованием фазера из исходных моделей, состоящего из SARS-CoV-2 RBD – S304 – S309 Fab (PDB 7JX3) и S2E12 (PDB 7K3Q).

Для всех конструкций было выполнено несколько последующих раундов построения и уточнения модели с помощью Coot (версия 0.9.5) 66 , ISOLDE (ChimeraX версия 1.1 / ISOLDE версия 1.1) 67 , Refmac5 (версия 5.8.0267) 68 и MOE (версия 2019.0102) (https://www.chemcomp.com), чтобы прийти к окончательным моделям. Для всех комплексов эпитопы на белке RBD определяли путем идентификации всех остатков RBD в пределах расстояния 5,0 Å от любых атомов Fab. Анализ был выполнен с использованием программного пакета MOE, и результаты были подтверждены вручную.

Криоэлектронная микроскопия

SARS-CoV-2 HexaPro S 69 при 1,2 мг мл -1 инкубировали с 1,2-кратным молярным избытком рекомбинантно очищенного S2D106 или S2H97 при 4 ° C перед нанесением на свежее свечение разряжен 2.0 / 2.0 Сетка UltrAuFoil (200 меш). При погружном замораживании использовали vitrobot MarkIV (Thermo Fisher Scientific), используя силу блоттинга 0 и время блоттинга 6,5 с при 100% влажности и 23 ° C.

Для набора данных S / S2D106 данные были получены с использованием просвечивающего электронного микроскопа FEI Titan Krios, работающего при 300 кВ и оснащенного прямым детектором Gatan K2 Summit и энергетическим фильтром Gatan Quantum GIF, работающим в режиме нулевых потерь с шириной щели. 20 эВ. Автоматический сбор данных проводился с использованием Leginon 70 при номинальном увеличении 130000 × с размером пикселя 0.525 Å. Мощность дозы была отрегулирована до 8 отсчетов на пиксель в секунду, и каждый фильм был получен в режиме сверхвысокого разрешения, разделенный на 50 кадров по 200 мс. Всего было собрано 2166 микрофотографий с диапазоном расфокусировки от -0,5 до -2,5 мкм. Выравнивание кадров фильма, оценка параметров функции передачи контраста микроскопа, сбор и извлечение частиц выполнялись с помощью Warp 71 . Изображения частиц были извлечены с размером ящика 800 с интервалом 400 пикселей 2 , что дало размер пикселя, равный 1.05 Å.

Для набора данных S / S2H97 данные были получены на просвечивающем электронном микроскопе FEI Glacios, работающем при 200 кВ, оборудованном прямым детектором Gatan K2 Summit. Автоматический сбор данных проводился с использованием Leginon 70 при номинальном увеличении 36000 × с размером пикселя 1,16 Å. Мощность дозы была отрегулирована до 8 отсчетов на пиксель в секунду, и каждый фильм был получен в режиме подсчета, разделенный на 50 кадров по 200 мс. Всего за один сеанс было собрано 3138 микрофотографий с диапазоном расфокусировки от -0.5 и −3,0 мкм. Предварительная обработка была выполнена с использованием Warp 71 , и изображения частиц были извлечены с размером окна 400 пикселей 2 .

Для наборов данных S / S2D106 и S / S2H97 было выполнено два цикла безреференсной 2D-классификации с использованием CryoSPARC для выбора четко определенных изображений частиц 72 . Эти отобранные частицы были подвергнуты двум раундам 3D-классификации по 50 итераций каждый (угловая выборка 7,5 ° для 25 итераций и 1,8 ° с локальным поиском для 25 итераций) с использованием нашей ранее сообщенной закрытой структуры SARS-CoV-2 S в качестве исходной модели 49 (PDB 6VXX) в Relion 73 . Уточнения 3D были выполнены с использованием неравномерного уточнения 74 наряду с уточнением дефокусировки по частицам в CryoSPARC. Отобранные изображения частиц были подвергнуты байесовской процедуре полировки 75 , реализованной в Relion3.0, перед выполнением еще одного раунда неоднородного уточнения в CryoSPARC с последующим уточнением дефокусировки по частицам и снова неравномерным уточнением.

Для дальнейшего повышения плотности S2D106 Fab, частицы затем подвергали фокусировке 3D-классификации без уточнения углов и сдвигов с использованием мягкой маски на переменных доменах RBD и Fab со значением тау 60 в Relion.Частицы, принадлежащие к классам с наилучшим разрешением локальной плотности, были отобраны и подверглись локальному уточнению с использованием CryoSPARC. Оценка местного разрешения, фильтрация и повышение резкости выполнялись с помощью CryoSPARC. Заявленные разрешения основаны на золотом стандарте корреляции оболочки Фурье (FSC) критерия 0,143, а кривые корреляции оболочки Фурье были скорректированы с учетом эффектов мягкой маскировки с помощью замены шума высокого разрешения 76 . UCSF Chimera 77 и Coot 78 были использованы для сопоставления атомных моделей с криоЭМ-картами.Модель Spike-RBD / S2D106 Fab была доработана и ослаблена с помощью Rosetta с использованием заостренных и нерезких карт 79 .

S2H97-индуцированный рефолдинг спайков

Десять микромолярных нативных SARS-CoV-2 S инкубировали с 13 мкМ S2H97 Fab в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы разбавляли до 0,01 мг / мл -1 непосредственно перед адсорбцией на медных решетках, покрытых углем, покрытых тлеющим разрядом, в течение ~ 30 с перед окрашиванием 2% уранилформиатом. Микрофотографии были записаны с использованием программного обеспечения Leginon 70 на 120 кВ FEI Tecnai G2 Spirit с камерой Gatan Ultrascan 4000 4k × 4k CCD при номинальном увеличении 67000 ×.Расфокусировка составляла от -1,0 до -2,0 мкм, а размер пикселя составлял 1,6 Å.

Отложение S1, опосредованное антителами на клеточной поверхности.

Клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие прототипный спайковый белок SARS-CoV-2, собирали, промывали в промывочном буфере (PBS, 1% BSA, 2 мМ EDTA) и ресуспендировали в PBS. Девяносто тысяч клеток на лунку распределяли в 96-луночные планшеты с круглым дном (Corning) и обрабатывали 10 мкг мл -1 TPCK-трипсина (Worthington Biochem) в течение 30 минут при 37 ° C. Клетки промывали и инкубировали с 15 мкг мл антитела -1 через 5, 30, 60, 120 и 180 минут при 37 ° C.Клетки промывали ледяным промывочным буфером и окрашивали 1,5 мкг мл -1 Alexa Fluor647-конъюгированных вторичных антител козы против человеческого IgG (Jackson Immunoresearch) в течение 30 минут на льду в темноте. Клетки дважды промывали холодным промывочным буфером и анализировали с использованием цитометра ZE5 (Bio-Rad) с камерой для сбора данных при 4 ° C. Связывание в каждый момент времени измеряли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), нормированную на MFI в 5-минутный момент времени мечения. Данные были проанализированы и нанесены на график с помощью GraphPad Prism v.9.0.1.

Слияние клеток CHO-S между клетками

Слияние клеток с S-экспрессирующими клетками CHO-K1 проводили, как описано Lempp et al. 31 . Клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие прототипный спайковый белок SARS-CoV-2, высевали в 96-луночные планшеты (Thermo Fisher Scientific) по 12500 клеток на лунку. На следующий день к клеткам добавляли антитела и ядерный маркер Hoechst (конечное разведение 1: 1000) и инкубировали в течение 24 часов. Слияние клетки с клеткой визуализировали с помощью Cytation 5 Imager (BioTek), и протокол обнаружения объектов использовался для обнаружения ядер и измерения их размера.Ядра слитых клеток (синцитии) агрегированы в центре синцитии и распознаются как уникально большой объект, закрытый в соответствии с его размером. Для количественной оценки слияния ячеек мы сообщаем площадь объектов в слитых ячейках, деленную на общую площадь всех объектов, умноженную на 100%, чтобы представить ее в процентах.

Блокаду антителом связывания RBD с ACE2

Блокаду ACE2 ELISA выполняли, как описано Piccoli et al. 15 . Немеченые антитела серийно разводили, смешивали с мышиным Fc-меченным антигеном RBD (Sino Biological, конечная концентрация 20 нг / мл -1 ) и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C. Смесь добавляли на 30 мин в 96-луночные планшеты для ELISA (Corning), предварительно покрытые в течение ночи при 4 ° C 2 мкг мл -1 человеческого ACE2 в PBS. Планшеты промывали и связывание RBD выявляли с использованием вторичных козьих антимышиных IgG (Southern Biotech 1030-04). После промывки добавляли субстрат pNPP и считывали планшеты при 405 нм. Процент ингибирования рассчитывали как: (1 — (OD образец — OD отрицательный контроль ) / (OD положительный контроль — OD отрицательный контроль )) × 100%, где OD образец , OD neg ctrl и OD pos ctrl представляют собой оптические плотности образца, отрицательного контроля и положительного контроля, соответственно.

Ингибирование опосредованного спайком клеточно-клеточного слияния

Анализы ингибирования клеточно-клеточного слияния выполняли, как описано McCallum et al. 80 . Клетки Vero E6 высевали в 96-луночные планшеты по 15000 клеток на лунку в 70 мкл DMEM с высоким содержанием глюкозы и 2,4% FBS (Hyclone). Через 16 часов при 37 ° C с 8% CO 2 клетки трансфицировали следующим образом: на 10 лунок 0,57 мкг плазмиды SARS-CoV-2-S-D19_pcDNA3.1 смешивали с 1,68 мкл X-tremeGENE HP в 30 мкл OPTIMEM. После 15 мин инкубации смесь разбавляли 1:10 в среде DMEM и добавляли 30 мкл на лунку.Готовили четырехкратные серийные разведения антител и добавляли к клеткам с начальной концентрацией 20 мкг мл -1 . На следующий день 30 мкл 5x-концентрированного DRAQ5 в DMEM добавляли на лунку и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. Для анализа было получено девять изображений каждой лунки с помощью оборудования Cytation 5.

Профилактическая защита S2H97 у сирийских хомяков

Мы использовали подтвержденную модель заражения сирийского золотого хомяка SARS-CoV-2 81,82 для проверки профилактической эффективности S2H97.Эксперименты проводились на объектах A3 и BSL3 + с высокой степенью защиты в институте KU Leuven Rega (3CAPS) по лицензиям AMV 30112018 SBB 219 2018 0892 и AMV 23102017 SBB 219 20170589 в соответствии с инструкциями учреждения.

Сирийских хомяков ( Mesocricetus auratus ) были приобретены в лабораториях Жанвье. Хомяков содержали по двое в вентилируемых изоляторах (система IsoCage N Biocontainment System, Tecniplast) с неограниченным доступом к пище, воде и обогатительным материалам клетки (деревянный блок).Условия содержания и порядок проведения экспериментов были одобрены этическим комитетом экспериментов на животных KU Leuven (лицензия P065-2020). Размер выборки из 6 хомяков был определен для того, чтобы иметь значительную разницу не менее 1 log (уровень вирусной РНК) (размер эффекта d = 2,004) между контрольной и экспериментальной группами, с использованием двустороннего теста t . с мощностью 80% и коэффициентом альфа 0,05, рассчитанным с помощью программного обеспечения G * Power 3.1. Самок хомячков в возрасте от шести до десяти недель рандомизировали для введения 25 мг / кг антитела -1 S2H97 или 20 мг / кг антитела -1 для контроля изотипа человека посредством внутрибрюшинной инъекции. Приблизительно за 5 ч до заражения животных анестезировали изофлураном, чтобы дать возможность взять образец крови из яремной вены для количественного определения антител. Через 48 часов после инъекции антитела хомяков интраназально инфицировали 1,89 × 10 6 TCID 50 вирусом SARS-CoV-2 в 50 мкл инокулята. Заражающий вирус представлял собой уханьский изолят SARS-CoV-2 от февраля 2020 г. (EPI_ISL_407976), пассированный на клетках Vero E6. Исходный титр пассажа 6 определяли разбавлением конечной точки на клетках Vero E6 по методу Рида и Мюнча 83 , выраженного как 50% инфекционная доза для культуры ткани (TCID 50 ).

Хомяков наблюдали за внешним видом, поведением и весом. На 4 день после инфицирования хомяков умерщвляли внутрибрюшинной инъекцией 500 мкл долетала (200 мг / мл пентобарбитала натрия -1 натрия, Vétoquinol SA). Легкие собирали, гомогенизировали путем разрушения шариков (Precellys) в 350 мкл буфера RLT (RNeasy Mini kit, Qiagen) и центрифугировали (10000 об / мин, 5 мин, 4 ° C) для осаждения остатков клеток. РНК экстрагировали с использованием набора NucleoSpin (Macherey-Nagel) в соответствии с инструкциями производителя.Количественную ПЦР с обратной транскрипцией (RT – qPCR) проводили на платформе LightCycler96 (Roche) с использованием набора iTaq Universal Probes One-Step RT – qPCR (Bio-Rad) с праймерами N2 и зондами, нацеленными на нуклеокапсид 81 . Стандарты кДНК SARS-CoV-2 (IDT) использовали для экспрессии вирусных копий генома на 1 мг ткани. Для количественного определения инфекционных частиц SARS-CoV-2 титрование конечной точки было выполнено на конфлюэнтных клетках Vero E6 в 96-луночных планшетах. Титры вирусов рассчитывали, как указано выше, и выражали как TCID 50 на мг ткани.Уровни циркулирующих антител измеряли с помощью мезомасштабного мостикового ELISA с использованием моноклонального антитела против мутации LS человека в качестве улавливающего и моноклонального антитела против Ch3 человека в качестве обнаружения. Технические специалисты, выполняющие количественную оценку РНК, вирусов и антител, не имели доступа к группам обработки обработанных образцов. Уровни РНК и вируса сравнивали в группе лечения и в контроле с помощью двустороннего теста Манна-Уитни, за исключением двух животных, получавших лечение, с неопределяемыми уровнями S2H97 во время заражения вирусом.

Блокада связывания серологических конкурентных анализов

Сыворотка блокирует связывание антитела, как описано в Piccoli et al. 15 . Вкратце, человеческие антитела IgG1 биотинилировали с использованием набора для твердофазного биотинилирования EZ-link NHS-PEO (Pierce). Каждое меченое антитело тестировали на связывание с RBD с помощью ELISA, и для каждого конкурентного эксперимента антитела выбирали такую ​​концентрацию, чтобы достичь 80% максимального связывания (EC 80 ). 96-луночные планшеты для ELISA (Corning) предварительно покрывали в течение ночи при 4 ° C 1 мкг мл -1 мышиного Fc-меченного антигена RBD (Sino Biological) в PBS.Немеченую сыворотку или плазму серийно разводили и добавляли в планшеты для ELISA на 30 мин с последующим добавлением биотинилированного антитела против RBD в его концентрации EC 80 . После 30 мин инкубации планшеты промывали и связывание антител определяли с использованием стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Jackson ImmunoResearch). Планшеты промывали, добавляли субстрат pNPP (Sigma-Aldrich) и считывали планшеты при 405 нм. Процент ингибирования связывания антител рассчитывали как: (1– (OD , образец — OD негр. Контр. ) / (OD , полож. Контр. — OD , отриц. Контр. )) × 100.

Отбор мутантов устойчивости к моноклональным антителам VSV-SARS-CoV-2

Химера VSV-SARS-CoV-2 S была использована для отбора мутантов, устойчивых к моноклональным антителам SARS-CoV-2 S (MARM), как описано ранее. 1, 84 . Вкратце, MARM выделяли путем выделения бляшек на клетках Vero E6 (ATCC, CRL-1586) с указанным моноклональным антителом в наложении. Концентрацию моноклонального антитела в наложении определяли с помощью анализов нейтрализации при MOI 100. Ускользнувшие клоны очищали бляшками на клетках Vero (ATCC, CCL-81) в присутствии моноклональных антител, а бляшки на агарозных пробках амплифицировали на Клетки MA104 (подарок H. Б. Гринберг (Стэнфордская медицинская школа)) с моноклональным антителом, присутствующим в среде. Исходные вирусы амплифицировали на клетках MA104 при MOI 0,01 в среде 199, содержащей 2% FBS и 20 мМ HEPES pH 7,7 (Millipore Sigma), при 34 ° C. Вирусные супернатанты собирали при обширном цитопатическом эффекте и очищали от клеточного дебриса центрифугированием при 1000 g в течение 5 минут. Аликвоты хранили при -80 ° C. Вирусную РНК экстрагировали из мутантных вирусов VSV-SARS-CoV-2 с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen), а S амплифицировали с помощью набора OneStep RT – PCR Kit (Qiagen).Мутации были идентифицированы секвенированием по Сэнгеру (Genewiz). Их устойчивость подтверждали последующей вирусной инфекцией в присутствии или в отсутствие антител. Вкратце, клетки Vero высевали в 12-луночные планшеты на ночь. Вирус серийно разводили с использованием DMEM, и клетки инфицировали при 37 ° C в течение 1 часа. Клетки культивировали с наложением агарозы в присутствии или в отсутствие моноклональных антител при 34 ° C в течение 2 дней. Планшеты сканировали на биомолекулярном устройстве для визуализации изображений, и экспрессия eGFP показана через 48 часов после заражения.Отобранная S2X58 мутация S494L не показана на фиг. 3a, поскольку ее влияние на экспрессию RBD было ниже вычислительного фильтра глубокого мутационного сканирования.

Анализы пригодности к репликации вирусов

Клетки Vero E6 (ATCC, CRL-1586) высевали из расчета 1 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночные планшеты. Клетки инфицировали MOI 0,02, причем химеры дикого типа и четыре мутантных VSV-SARS-CoV-2 S смешивались с равной (0,20) частотой. После 1 ч инкубации монослои клеток промывали 3 раза HBBS, и культуры инкубировали в течение 72 ч в увлажненных инкубаторах при 34 ° C.Для пассирования потомства вирусов смесь вирусов непрерывно пассировали 4 раза в клетках Vero E6 при MOI 0,02. Образцы клеточной РНК из каждого пассажа экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini (QIAGEN) и подвергали секвенированию следующего поколения, как описано ранее, для подтверждения введения и частоты замен 84 .

Моделирование молекулярной динамики

Полная информация о рабочем процессе и анализе молекулярной динамики доступна на GitHub: https://github.com/choderalab/rbd-ab-contact-analysis.Комплекс RBD – S309 был построен из PDB 7JX3 (цепи A, B и R). 7JX3 был впервые уточнен с использованием ISOLDE 67 . Уточнение включало корректировку нескольких ротамеров, изменение нескольких пептидных связей, фиксацию нескольких слабо разделенных вод и создание недостающей петли из четырех остатков. Хотя гликан N343 N -ацетилглюкозамин (NAG) присутствовал в 7JX3, ISOLDE использовали для создания сложного гликана по N343. Полный образец гликозилирования был определен из ссылок. 85,86 .Структура гликана, используемая для N343 (FA2G2), соответствует наиболее стабильному конформеру, полученному в результате многомикросекундного молекулярно-динамического моделирования совокупной выборки 87 . Базовый остаток NAG в FA2G2 был выровнен с соответствующей заглушкой NAG в модели RBD-S309, и любые возникающие конфликты были уточнены в ISOLDE. Тот же процесс был повторен для кристаллической структуры RBD – S2H97.

Очищенные гликозилированные комплексы RBD-S309 и RBD-S2H97 были приготовлены для моделирования с использованием tleap из AmberTools20 88 .Указаны все соответствующие дисульфидные мостики и ковалентные связи в структурах гликанов. Гликозилированные белки параметризовали с помощью силовых полей Amber ff14SB 89 и GLYCAM_06j-1 90 . Системы были сольватированы с использованием жесткой воды TIP3P, модель 91 в усеченном октаэдрическом боксе с подушкой из растворителя 2,2 нм со всех сторон. Форма и размер контейнера для растворителя были выбраны так, чтобы белковый комплекс не взаимодействовал с его периодическим изображением. Затем сольватированные системы нейтрализовали 0.15 M NaCl с использованием параметров ионов Li / Merz для одновалентных ионов для модели воды TIP3P (12-6 стандартного набора) 92 . Виртуальные связи были добавлены через цепочки, которые должны быть отображены вместе, чтобы облегчить постобработку траекторий.

Энергия каждой системы была минимизирована с допустимым отклонением энергии 10 кДж / моль −1 и пять раз независимо уравновешена с помощью OpenMMTools 0.20.0 (https://github.com/choderalab/openmmtools) BAOAB Интегратор Ланжевена 93 в течение 20 нс в ансамбле NPT ( P = 1 атм, T = 310 K) с шагом по времени 4.0 фс, частота столкновений 1,0 пс −1 и допуск относительного ограничения 1 × 10 −5 . Масса атомов водорода была установлена ​​равной 4,0 а.е.м. путем передачи массы от связанных тяжелых атомов, связи с водородом были ограничены, а движение центра масс не было удалено. Давление контролировалось баростатом Монте-Карло с молекулярным масштабированием с интервалом обновления 25 шагов. Несвязанные взаимодействия обрабатывались методом Particle Mesh Ewald 94 с использованием отсечки в реальном пространстве, равной 1.0 нм и допуск относительной погрешности OpenMM по умолчанию 0,0005 с автоматическим выбором шага сетки. Впоследствии моделирования были упакованы в семена для моделирования производства в Folding @ home 95,96 . Если не указано иное, использовались параметры по умолчанию.

Уравновешенные структуры (пять на комплекс) были использованы для инициирования параллельного распределенного моделирования молекулярной динамики на Folding @ home 95,96 . Моделирование проводилось с помощью OpenMM 7.4.2 (скомпилировано в Folding @ home core22 0.0,13). При моделировании добычи использовался тот же интегратор Ланжевена, что и для уравновешивания NPT, описанного выше. В Folding @ home для RBD – S309 и RBD – S2H97 было создано в общей сложности 5000 и 4985 независимых моделей молекулярной динамики, соответственно. Конформационные снимки (кадры) сохранялись с интервалом 1 нс на кадр для последующего анализа. Окончательные наборы данных содержали 1,1 мс и 623,7 мкс совокупного времени моделирования для RBD – S309 и RBD – S2H97, соответственно. Этот набор данных о траектории (без растворителя) доступен в Центре молекулярной структуры и терапии MolSSI COVID-19 (https: // covid. molssi.org//simulations/#foldinghome-simulations-of-the-sars-cov-2-spike-rbd-bound-to-monoclonal-antibody-s309 и https://covid.molssi.org//simulations/# Foldinghome-simulations-of-sars-cov-2-spike-rbd-связанный-с-моноклональным-антителом-s2h97).

Первые 100 нс каждой траектории были отброшены (чтобы позволить релаксацию от кристаллической структуры), что дало общее время моделирования 644,3 и 262,9 мкс, использованное для анализа систем RBD – S309 и RBD – S2H97, соответственно. Все траектории имели структуры растворенного вещества, выровненные по их первому кадру и центрированные с помощью MDTraj 97 .Остатки считались находящимися на границе раздела, если они находились в пределах 10 Å от любого остатка Fab / RBD антитела (за исключением гликанов RBD N343, где учитывались все гликановые остатки). Минимальное расстояние тяжелых атомов между каждой парой интерфейсных остатков было вычислено для каждого кадра (1 нс) с использованием MDAnalysis 98,99 . Тесный контакт считали, если минимальное расстояние между парой остатков было ниже 3,5 Å (если один из остатков был гидрофобным, использовали отсечение 4,5 Å). Вклад каждого остатка RBD в тесные контакты рассчитывали в виде процента путем суммирования количества тесных контактов для конкретного остатка RBD и нормализации на общее количество тесных контактных взаимодействий по всем кадрам каждого моделирования.

Доступность материалов

Библиотеки мутантов SARS-CoV-2 RBD (№1000000172) и немутантная родительская плазмида (№166782) доступны на Addgene. Другие материалы, созданные в этом исследовании, будут доступны по запросу и могут потребовать соглашения о передаче материала.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этим документом.

% PDF-1.4 % 871 0 объект > эндобдж xref 871 35 0000000016 00000 н. 0000001051 00000 н. 0000001146 00000 н. 0000005359 00000 п. 0000005577 00000 н. 0000005794 00000 н. 0000005865 00000 н. 0000006665 00000 н. 0000006846 00000 н. : Y | {SQ.u_iīOF_% kdo | ז FqѠHXuGP hgFMe {u {Ut 1hJLvz = .; P9i m> s> & = q6l CDiwmPs2r «} 7E`Ɲ: uo0gNw: 0 @:

Haack

  • Карпаччо Труфадо 8 шт.

    8 fatias de salmão fina com azeite trufado, trufa negra, massagô, flor de sal, cebolinha e raspa de limão siciliano.

    84,00 реалов
  • Dupla Foie Gras

    Атум, фуа-гра, териаки, овас де массаго, флора де сал е себолинья.

    49,90 реалов
  • Sanduíche Gold 8 PEAS

    Sanduíche de sashimi de salmão, recheado com cream chesse, empanado e frito.Geléia de rubras, molho branco, molho de maracujá, tarê, gergelim e cebolinha.

    60,00 реалов
  • Barca dos Namorados 30 Peças

    4 Hossomaki de Atum, 4 Uramaki de Salmão e Kani, 2 Dyo Shimeji, 4 Ebitem Especial, 3 Niguiri Salmão, 3 Niguiri Atum, 2 Acelga Grelhada, 4 Sashimi Salmão e 4 Sashimi Atum.

    145 реалов
  • RAIZ FORTE

    Васаби.

    3,90 реалов
  • МОЛХО АГРИДОК

    4,90 реалов
  • КАРНЕ АСЕБОЛАДА 400ГР

    400 граммов картофеля, приготовленного на суше, и особенных молочных продуктов.

  • Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.