Ст 185 гк п 2 ст: Ст. 185 ГК РФ Доверенность ФЗ 51 от 30.11.1994 Гражданский Кодекс Российской Федерации Статья 185 (ГКРФ, ГК России)

Содержание

Ст. 185 ГК РФ Доверенность ФЗ 51 от 30.11.1994 Гражданский Кодекс Российской Федерации Статья 185 (ГКРФ, ГК России)

 1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу для представительства перед третьими лицами. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу.

 

2. Доверенность на совершение сделок, требующих нотариальной формы, должна быть нотариально удостоверена, за исключением случаев, предусмотренных законом.

 

3. К нотариально удостоверенным доверенностям приравниваются:

 

1) доверенности военнослужащих и других лиц, находящихся на излечении в госпиталях, санаториях и других военно-лечебных учреждениях, удостоверенные начальником такого учреждения, его заместителем по медицинской части, старшим или дежурным врачом;

 

2) доверенности военнослужащих, а в пунктах дислокации воинских частей, соединений, учреждений и военно-учебных заведений, где нет нотариальных контор и других органов, совершающих нотариальные действия, также доверенности рабочих и служащих, членов их семей и членов семей военнослужащих, удостоверенные командиром (начальником) этих части, соединения, учреждения или заведения;

 

3) доверенности лиц, находящихся в местах лишения свободы, удостоверенные начальником соответствующего места лишения свободы;

 

4) доверенности совершеннолетних дееспособных граждан, находящихся в учреждениях социальной защиты населения, удостоверенные администрацией этого учреждения или руководителем (его заместителем) соответствующего органа социальной защиты населения.

 

4. Доверенность на получение заработной платы и иных платежей, связанных с трудовыми отношениями, на получение вознаграждения авторов и изобретателей, пенсий, пособий и стипендий, вкладов граждан в банках и на получение корреспонденции, в том числе денежной и посылочной, может быть удостоверена также организацией, в которой доверитель работает или учится, жилищно-эксплуатационной организацией по месту его жительства и администрацией стационарного лечебного учреждения, в котором он находится на излечении.

 

Доверенность на получение представителем гражданина его вклада в банке, денежных средств с его банковского счета, адресованной ему корреспонденции в организациях связи, а также на совершение от имени гражданина иных сделок, указанных в абзаце первом настоящего пункта, может быть удостоверена соответствующими банком или организацией связи. Такая доверенность удостоверяется бесплатно (абзац введен Федеральным законом от 12 августа 1996 г. N 111-ФЗ — Собрание законодательства Российской Федерации, 1996, N 34, ст. 4026).

 

5. Доверенность от имени юридического лица выдается за подписью его руководителя или иного лица, уполномоченного на это его учредительными документами, с приложением печати этой организации.

 

Доверенность от имени юридического лица, основанного на государственной или муниципальной собственности, на получение или выдачу денег и других имущественных ценностей должна быть подписана также главным (старшим) бухгалтером этой организации.

Добавить комментарий к ст.185 ГК РФ ФЗ 51 от 30.11.1994

Статья 185 ГК РФ с комментариями

Полный текст ст. 185 ГК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 185 ГК РФ.

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами.

2. Доверенности от имени малолетних (статья 28) и от имени недееспособных граждан (статья 29) выдают их законные представители.

3. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу, которое вправе удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя.

Письменное уполномочие на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в том числе получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи может быть представлено представляемым непосредственно банку или организации связи.

4. Правила настоящего Кодекса о доверенности применяются также в случаях, когда полномочия представителя содержатся в договоре, в том числе в договоре между представителем и представляемым, между представляемым и третьим лицом, либо в решении собрания, если иное не установлено законом или не противоречит существу отношений.

5. В случае выдачи доверенности нескольким представителям каждый из них обладает полномочиями, указанными в доверенности, если в доверенности не предусмотрено, что представители осуществляют их совместно.

6. Правила настоящей статьи соответственно применяются также в случаях, если доверенность выдана несколькими лицами совместно.

(Статья в редакции, введенной в действие с 1 сентября 2013 года Федеральным законом от 7 мая 2013 года N 100-ФЗ.

Комментарий к статье 185 ГК РФ

1. В п.1 комментируемой статьи определено понятие доверенности — ей признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами. Таким образом, следует различать доверенность — письменный документ, и выдачу доверенности — одностороннюю сделку. Сам по себе факт оформления письменного документа правовых последствий не порождает.

В отношении видов доверенностей необходимо отметить следующее:
— доверенность может иметь разовый характер, т. е. в ней могут быть предусмотрены полномочия на совершение представителем разового действия, например, получить причитающуюся представляемому денежную сумму;
— доверенность может иметь специальный характер, содержать полномочия на совершение нескольких совокупных или длящихся действий, неразрывно связанных общей целью, общим предметом и (или) общей процедурой и направленных на достижение одного юридического результата, например, доверенность на распоряжение автомобилем;
— доверенность может иметь общий характер и содержать полномочия по пользованию и распоряжению всем имуществом представляемого и осуществлению его прав и обязанностей, в т.ч. на представительство перед любыми третьими лицами по всем вопросам и на ведение любых дел от имени представляемого, т.н. генеральная доверенность.

2. Пункт 2 комментируемой статьи устанавливает, что доверенности от имени малолетних (т.е. несовершеннолетних, не достигших 14 лет) и от имени недееспособных граждан выдают их законные представители. Это положение является законодательной новеллой, введенной ФЗ от 07.05.2013 N 100-ФЗ.

3. Установлено, что при представлении представляемым письменного уполномочия на совершение сделки представителем непосредственно соответствующему третьему лицу это третьему лицу предоставляются права удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя (п.3 комментируемой статьи). Следует подчеркнуть, что речь идет о правах, а не об обязанностях соответствующего третьего лица, т.е. представляемый не может требовать от третьего лица совершения указанных действий. Также не конкретизируется содержание указанной отметки.

Статья предусматривает возможность представления письменного уполномочия на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в т.ч. получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи представляемым непосредственно банку или организации связи. Предусмотренная законом возможность не исключает выдачи доверенности представителю.

4. В соответствии с п.4 комментируемой статьи правила ГК РФ о доверенности подлежат применению также в случаях, когда:
1) полномочия представителя содержатся в договоре; причем прямо указано, что может быть договор между представителем и представляемым, договор между представляемым и третьим лицом;
2) полномочия представителя содержатся в решении собрания. При этом предусмотрено, что данные правила применяются, если иное не установлено законом или не противоречит существу отношений (под законом понимается ГК РФ и принятые в соответствии с ним федеральные законы, регулирующие гражданско-правовые отношения).

5. В п.5 комментируемой статьи регламентировано осуществление полномочий в случае выдачи доверенности нескольким представителям: в качестве общего правила установлено, что каждый из представителей обладает полномочиями, указанными в доверенности, но при этом предусмотрено, что доверенностью может быть определено совместное осуществление представителями полномочий. При осуществлении полномочий совместно требуется согласование воль всех представителей. В первом случае имеется несколько представителей, во втором на стороне представителя — несколько лиц.

6. Пункт 6 комментируемой статьи устанавливает, что правила данной статьи соответственно применяются также в случаях, если доверенность выдана несколькими лицами совместно. Это правило также является законодательной новеллой.

Каждый из субъектов, которые выдают одну доверенность, выражает свою волю, каждый из них может выдать доверенность представителю отдельно. Но поскольку речь идет об однородных действиях представителя от имени каждого из представляемых, постольку технически может быть удобнее оформить наделение представителя полномочиями каждым из представляемых одной доверенностью (от имени представляемых). В данном случае составляется один документ, в котором изъявляется воля нескольких лиц на наделение кого-либо действовать от имени каждого из этих лиц. Как правило, в таких случаях интересы представляемых совпадают, воли согласованы, действия, которые должен совершить представитель, однородны.

7. Судебная практика:
— постановление Шестнадцатого арбитражного апелляционного суда от 12.02.2014 по делу N А63-1550/2013;

— постановление ФАС Поволжского округа от 14.01.2014 по делу N А72-7929/2012;
— апелляционное определение Верховного суда Республики Бурятия от 18.12.2013 по делу N 33-3721;
— постановление Двадцатого арбитражного апелляционного суда от 01.11.2013 по делу N А68-2082/2013.

Консультации и комментарии юристов по ст 185 ГК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 185 ГК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Как оформить доверенность | Время бухгалтера

Доверенность согласно пункту 1 ст. 185 Гражданского кодекса РФ — это письменное уполномочие, которое одно лицо выдает другому для представительства перед третьими лицами. Лицо, выдающее доверенность, – это представляемый или доверитель. Лицо, которому поручено выполнить представительские функции – это представитель, поверенный или доверенное лицо. В данном документе фиксируются полномочия поверенного для того, чтобы он мог их подтвердить перед третьими лицами.

Поверенный всегда действует от имени представляемого. Все права и обязанности, в том числе по сделкам, заключенным доверенным лицом, возникают у доверителя – лица, выдавшего доверенность.

Выдача доверенности является односторонней сделкой, а не договором, ведь для ее совершения достаточно воли только одной стороны – представляемого (п. 2 ст. 154 ГК РФ). Согласие поверенного для этого не потребуется. Но исполнять поручение против собственной воли представитель вовсе не обязан. Он вполне может отказаться от переданных полномочий или попросту бездействовать. Для того чтобы последнее не произошло, помимо выдачи доверенности, с поверенным заключают договор, где нужно прописать все его обязательства и ответственность за их невыполнение. К примеру, это может быть договор поручения.

Поскольку доверенность — это односторонняя сделка, к ней применимы общие положения об обязательствах и договорах, если это не противоречит закону, характеру и существу сделки (ст. 156 ГК РФ). Поэтому выданное уполномочие может быть признано недействительным по общим правилам о недействительности сделок. А если значение какого-то полномочия не вполне ясно, то суд может применить ст. 431 ГК РФ и определить его исходя из других условий и общего смысла документа.

Представителем может быть как физическое, так и юридическое лицо — в данном отношении ограничений нет. При этом человек обязательно должен быть дееспособным, в том числе совершеннолетним (п. 1 ст. 185, п. 1 ст. 21 ГК РФ). Доверенность можно выдать как одному, так и нескольким поверенным (п. 5 ст. 185 ГК РФ).

Директору фирмы доверенность не нужна, поскольку он является законным представителем соответствующего юридического лица. Руководитель выдает уполномочие от имени компании ее представителю. Но его может выдать и другое лицо – исполняющий обязанности руководителя или его заместитель, если он уполномочен на это в соответствии с законом и учредительными документами (п. 4 ст. 185.1 ГК РФ). Иначе и.о. директора или его заместитель может выписывать доверенности, только если у него самого есть документальное уполномочие от юридического лица с правом передоверия. Если же доверенность, выданная исполняющему обязанности, не предусматривает передоверия, но и не запрещает его, он может передоверить полномочия лишь для охраны интересов организации, если его вынудят к этому обстоятельства (п. 1 ст. 187 ГК РФ).

Представителем компании обычно является ее сотрудник – бухгалтер, юрист, руководитель филиала. Но уполномочие может быть выдано и человеку, который в фирме не работает. Если для разрешения возникшей ситуации компании нужен человек, обладающий специальными знаниями, то, выдав доверенность, организация привлечет на свою сторону соответствующего специалиста.

Более подробно вопросы выдачи уполномочия от имени компании рассмотрены в нашей статье «Доверенность на представление интересов юридического лица».

Также документальное уполномочие может быть выдано организации, а действовать по нему сможет руководитель юридического лица. Причем право выписать такой документ есть и у фирмы, и у физлица.

В некоторых случаях законодатель устанавливает ограничения для лиц, выступающих поверенными. Так, согласно пункту 3 ст. 59 Арбитражного процессуального кодекса РФ (далее — АПК РФ) в арбитражном суде представителями граждан, индивидуальных предпринимателей и компаний могут быть адвокаты или иные, оказывающие юридическую помощь лица, имеющие высшее юридическое образование либо ученую степень по юридической специальности. При этом согласно пункту 1 ст. 60 АПК РФ в арбитражном суде не могут быть представителями судьи, арбитражные заседатели, следователи, прокуроры, помощники судей и работники аппарата суда.

Поверенному могут быть предоставлены самые разнообразные полномочия: право на получение денежных средств, в том числе на пенсию, оформление договора купли-продажи на квартиру или другое имущество, представление интересов в налоговых, судебных органах и многое другое. Даже на получение почтовых отправлений можно выдать уполномочие. На своем официальной сайте «Почта России» предлагает оформить такую доверенность онлайн в электронном виде, что упрощает весь процесс.

Перечень, а также пределы полномочий представляемый должен подробно определить в доверенности, чтобы не возникало споров о выходе за пределы предоставленных поверенному полномочий. Можно отдельно указать право на передоверие, тогда доверенное лицо сможет поручить совершить те действия, на которые оно уполномочено, другому лицу. И напротив, если доверитель не приемлет передоверия, нужно указать: «Без права передоверия».

Но отнюдь не любые действия могут передаваться путем выдачи доверенности. За редким исключением представитель не может заключать сделки от имени представляемого в отношении себя лично, а также в отношении другого лица, поверенным которого он в то же время является. Кроме того, отдельные действия, ввиду их тесной связи с личностью, в силу указаний закона или характера совершаемых действий не могут быть совершены никем иным, кроме правообладателя (пп. 3, 4 ст. 182, п. 3 ст. 1118 ГК РФ). 

Доверенность. Общие положения о доверенности.

В соответствии с пунктом 1 статьи  9  Гражданского кодекса Российской Федерации (далее — ГК РФ) физические и юридические лица по своему усмотрению осуществляют принадлежащие им гражданские права, которые могут быть реализованы ими лично либо через представителей. Нередко в силу различных обстоятельств, граждане или организации не могут самостоятельно совершить то или иное юридически значимое действие или реализовать то или иное право — заключить сделку, совершить регистрационные действия, получить товарно-материальные ценности, выступить в защиту своих интересов в суде. В этих случаях одно лицо (представляемый) может передать другому лицу (представителю) право участвовать в юрисдикционных процедурах и совершать иные действия, имеющие юридическое значение, от имени и в интересах представляемого. Полномочие представителя может быть основано на доверенности, указании закона либо акте уполномоченного на то государственного органа или органа местного самоуправления. Как правило, в большинстве случаев юридическим основанием для представительства одного лица другим выступает доверенность.

Согласно пункта 1 статьи 185  ГК РФ  доверенностью признается  письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу для представительства перед третьими лицами.

Представляемыми могут выступать как физические, так и юридические лица, и выдавать доверенности в пределах своих прав и обязанностей. Кроме того, представляемыми по доверенности могут выступать публично-правовые образования.

При этом не допускается выдача доверенности на совершение через представителя сделки, которая по своему характеру может быть совершена только лично, а равно других сделок, указанных в законе (пункт 4 статьи 182 ГК РФ). К таким случаям, например, относятся совершение завещания, его отмена или изменение (пункт 3 статьи 1118 ГК РФ), заключение наймодателем договоров найма жилых помещений жилищного фонда социального использования (пункт 3 статьи 91. 2 Жилищного кодекса Российской Федерации).

Физические лица вправе выдавать доверенности, если они обладают дееспособностью в полном объеме (полной дееспособностью обладают лица, достигшие восемнадцатилетнего возраста).

Кроме того, правом совершения доверенности обладают несовершеннолетние граждане в возрасте от 14 до 18 лет, приобретшие полную дееспособность в установленных законом случаях: при вступлении в брак и в случае расторжения брака до 18 лет; при объявлении в установленном порядке несовершеннолетнего полностью дееспособным решением органа опеки и попечительства или решением суда (статьи 21, 27 ГК РФ).

Несовершеннолетние в возрасте от 14 до 18 лет, обладающие дееспособностью не в полном объеме, также могут выдавать доверенности, но только в пределах своих прав по совершению сделок.

От имени малолетних (не достигших возраста 14 лет) доверенности выдают их родители, усыновители или опекуны (пункт 1 статьи 28 ГК РФ). Граждане, ограниченные в дееспособности, могут выдавать доверенности только с согласия своих попечителей (статья 30 ГК РФ). От имени граждан, признанных недееспособными, доверенности совершаются их опекунами (статья 32 ГК РФ).

Юридические лица вправе выдавать доверенности в пределах своей правоспособности.
Представителями по доверенности могут выступать как физические, так и юридические лица. Представитель не вправе совершать сделки от имени представляемого в отношении себя лично, а также в отношении другого лица, представителем которого он одновременно является, за исключением случаев, предусмотренных законом. Сделка, которая совершена с нарушением данного правила и на которую представляемый не дал согласия, может быть признана судом недействительной по иску представляемого, если она нарушает его интересы.

Законом допускается выдача доверенности от имени одного или нескольких лицна имя одного или нескольких лиц (пункты 5,6 статьи 185 ГК РФ). В случае выдачи доверенности нескольким представителям каждый из них обладает полномочиями, указанными в доверенности, если в ней не предусмотрено, что представители осуществляют полномочия совместно (пункт 5 статьи 185 ГК РФ). Это означает, что если доверенность выдана нескольким представителям, то при отсутствии прямо выраженной оговорки о совместном представительстве, представители осуществляют полномочия раздельно. При раздельном осуществлении полномочий несколькими представителями каждый из них наделяется полным перечнем полномочий, указанных в доверенности. При совместном осуществлении полномочий представители должны совершать их только вместе.

При выдаче доверенности представляемый вправе установить любой срок ее действия,

При установлении срока действия доверенности он может быть определен календарной датой или истечением периода времени, который исчисляется годами, месяцами, неделями, днями. Срок может определяться также указанием на событие, которое должно неизбежно наступить (статья 190 ГК РФ).

Если в доверенности содержится несколько различных полномочий, представляемый вправе указать вместо единого срока действия доверенности срок действия каждого полномочия в отдельности.

По общему правилу, если в доверенности не указан срок ее действия, она сохраняет силу в течение года со дня ее совершения ( пункт 1 статьи 186 ГК РФ). Доверенность, предназначенная для совершения действий за границей и не содержащая указания о сроке ее действия, сохраняет силу до ее отмены лицом, выдавшим доверенность (пункт 2 статьи 186 ГК РФ).

Доверенность должна быть оформлена письменно (имеется в виду простая письменная форма), однако в определенных случаях требуется ее нотариальное удостоверение. Из пункта 1 статьи 185.1 следует, что доверенность на совершение сделок, требующих нотариальной формы, на подачу заявлений о государственной регистрации прав или сделок, а также на распоряжение зарегистрированными в государственных реестрах правами должна быть нотариально удостоверена, за исключением случаев, предусмотренных законом.

Представитель может наделяться различным кругом полномочий. Не забывайте, что перечень полномочий должен быть четко определен. Ведь доверенность не только дает право действовать от имени другого лица, но и определяет границы, в рамках которых такое представительство возможно.

Обратите внимание, что Гражданским Кодексом РФ отдельно выделены положения о доверенности на дарение, а именно, согласно пункта 5 статьи 576 ГК РФ доверенность на совершение дарения представителем, в которой не назван одаряемый и не указан предмет дарения, ничтожна.

В заключении, еще раз акцентируем Ваше внимание на то, что нужно быть предельно внимательными доверяя свои полномочия другим лицам. Проверяйте перечень прав, которым Вы их наделяете, не забывайте о форме и сроках действия доверенности.

Начальник Суздальского отдела Управления Росреестра по Владимирской области
О.В. Мануилова

Комментарии к Закону о внесении изменений в часть первую ГК РФ

Комментарии к Закону о внесении изменений в часть первую ГК РФ

Приводим обзор вступивших в законную силу некоторых изменений в Гражданский кодекс РФ с 01 сентября 2013 года, которые на наш взгляд, наиболее существенны и затрагивают права большого количества лиц:

В части о доверенности:

Доверенность может выдаваться как от нескольких, так и нескольким лицам.

В случае выдачи доверенности нескольким представителям, каждый из них обладает полномочиями, указанными в доверенности, если в доверенности не предусмотрено, что представители осуществляют их совместно (ст. 185 ГК РФ).

ГК РФ больше не содержит императивного положения о необходимости наличия печати организации, выдавшей доверенность.

Исключением является случай выдачи доверенности на представительство в Суде (ст. 53 ГПК РФ и ст. 61 АПК РФ).

Между тем, расширен перечень доверенностей, требующих нотариальной формы, теперь Доверенность на совершение сделок, требующих нотариальной формы, на подачу заявлений о государственной регистрации прав или сделок, а также на распоряжение зарегистрированными в государственных реестрах правами должна быть нотариально удостоверена, за исключением случаев, предусмотренных законом (ст. 185.1. ГК РФ).

Отменен максимальный срок действия доверенности, при этом, по прежнему, если в доверенности срок действия не определен, она сохраняет силу в течение года со дня ее совершения (ст. 186 ГК РФ).

Вводится понятие безотзывной доверенности.

В целях исполнения или обеспечения исполнения обязательства представляемого перед представителем или лицами, от имени или в интересах которых действует представитель, в случаях, если такое обязательство связано с осуществлением предпринимательской деятельности, представляемый может указать в доверенности, выданной представителю, на то, что эта доверенность не может быть отменена до окончания срока ее действия либо может быть отменена только в предусмотренных в доверенности случаях (например, в случае выдачи доверенности на представительство на общем собрании акционеров/участников).
Такая доверенность должна быть нотариально удостоверена (ст. 188.1. ГК РФ).

Положения о последствиях отмены доверенности дополнены и теперь, лицом, отменившем доверенность может быть сделана публикация в официальном издании, в котором опубликовываются сведения о банкротстве (на сегодняшний день — ЗАО «Коммерсантъ. Издательский Дом»). Третьи лица считаются извещенными об отмене доверенности по истечении месяца со дня указанной публикации, если они не были извещены об отмене доверенности ранее (ст. 189 ГК РФ).

В части сроков исковой давности:

Устанавливается максимальный срок исковой давности – 10 лет, со дня нарушения права, для защиты которого этот срок установлен, при этом общий срок остается – 3 года. (ст. 196 ГК РФ).

Существенные изменения внесены в положения о начале течения срока исковой давности, так, течение срока начинается со дня, когда лицо не только узнало или должно было узнать о нарушении своего права, но и узнало о том, кто является надлежащим ответчиком по иску о защите этого права.
Кроме того, по обязательствам с определенным сроком исполнения, течение срока исковой давности начинается по окончании срока исполнения. То есть, не с момента заключения какого-либо гражданско-правового договора, а с момента когда одна из сторон должна была исполнить свое обязательство, но не сделала этого (например оплатить услуги или работы) (ст. 200 ГК РФ).

В части корпоративных отношений:

Вводится новая глава 9.1. «Решения собраний».

В указанной главе императивно приведен перечень сведений, которые указываются в протоколе собраний (в том числе общих собраний акционеров/участников).

В протоколе о результатах очного голосования должны быть указаны:

1) дата, время и место проведения собрания;

2) сведения о лицах, принявших участие в собрании;

3) результаты голосования по каждому вопросу повестки дня;

4) сведения о лицах, проводивших подсчет голосов;

5) сведения о лицах, голосовавших против принятия решения собрания и потребовавших внести запись об этом в протокол.

В протоколе о результатах заочного голосования должны быть указаны:

1) дата, до которой принимались документы, содержащие сведения о голосовании членов гражданско-правового сообщества;

2) сведения о лицах, принявших участие в голосовании;

3) результаты голосования по каждому вопросу повестки дня;

4) сведения о лицах, проводивших подсчет голосов;

5) сведения о лицах, подписавших протокол.

Протокол подписывается председательствующим на собрании и секретарем собрания (ст. 181.2. ГК РФ).
Не указание существенных условий в протоколе, в том числе, является основанием для признания судом таких решений собрания недействительными (ст. 181.4. ГК РФ).

Нужно, также отметить, что с 01.10.2013 года вступают поправки согласно которым, акционерные общества, которые ведут реестр акционеров самостоятельно, должны передать ведение такого реестра специализированному регистратору в течение 1 года.

  • ‹ Срок в договоре оказания услуг
  • Что такое НКО? ›

Статья 185. Доверенность

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу для представительства перед третьими лицами. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу.

2. Доверенность на совершение сделок, требующих нотариальной формы, должна быть нотариально удостоверена, за исключением случаев, предусмотренных законом.

3. К нотариально удостоверенным доверенностям приравниваются:

1) доверенности военнослужащих и других лиц, находящихся на излечении в госпиталях, санаториях и других военно-лечебных учреждениях, удостоверенные начальником такого учреждения, его заместителем по медицинской части, старшим или дежурным врачом;

2) доверенности военнослужащих, а в пунктах дислокации воинских частей, соединений, учреждений и военно-учебных заведений, где нет нотариальных контор и других органов, совершающих нотариальные действия, также доверенности рабочих и служащих, членов их семей и членов семей военнослужащих, удостоверенные командиром (начальником) этих части, соединения, учреждения или заведения;

3) доверенности лиц, находящихся в местах лишения свободы, удостоверенные начальником соответствующего места лишения свободы;

4) доверенности совершеннолетних дееспособных граждан, находящихся в учреждениях социальной защиты населения, удостоверенные администрацией этого учреждения или руководителем (его заместителем) соответствующего органа социальной защиты населения.

4. Доверенность на получение заработной платы и иных платежей, связанных с трудовыми отношениями, на получение вознаграждения авторов и изобретателей, пенсий, пособий и стипендий, вкладов граждан в банках и на получение корреспонденции, в том числе денежной и посылочной, может быть удостоверена также организацией, в которой доверитель работает или учится, жилищно-эксплуатационной организацией по месту его жительства и администрацией стационарного лечебного учреждения, в котором он находится на излечении.

Доверенность на получение представителем гражданина его вклада в банке, денежных средств с его банковского счета, адресованной ему корреспонденции в организациях связи, а также на совершение от имени гражданина иных сделок, указанных в абзаце первом настоящего пункта, может быть удостоверена соответствующими банком или организацией связи. Такая доверенность удостоверяется бесплатно.

5. Доверенность от имени юридического лица выдается за подписью его руководителя или иного лица, уполномоченного на это его учредительными документами, с приложением печати этой организации.

Доверенность от имени юридического лица, основанного на государственной или муниципальной собственности, на получение или выдачу денег и других имущественных ценностей должна быть подписана также главным (старшим) бухгалтером этой организации.

Статья 185 гк рф доверенность новая редакция. Гражданский кодекс Российской Федерации (ГК РФ)

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами.

2. Доверенности от имени малолетних (статья 28) и от имени недееспособных граждан (статья 29) выдают их законные представители.

3. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу, которое вправе удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя.

Письменное уполномочие на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в том числе получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи может быть представлено представляемым непосредственно банку или организации связи.

Комментарий к статье 185

1. Статья традиционно определяет доверенность как письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом (представляемым, доверителем) другому (представителю) для представительства перед третьими лицами. Доверенность является документом, который подтверждает наличие у представителя прав действовать от чужого имени, определяет условия и границы реализации этих прав. Доверенность адресуется третьим лицам, с которыми предполагается заключение сделок, а потому должна быть им предъявлена либо представителем, либо непосредственно самим представляемым.

Доверенность является односторонней сделкой и к ней применяются общие правила, установленные для сделок такого рода (см. коммент. к ст. ст. 155, 156 ГК). Согласия представителя на ее выдачу не требуется. Однако осуществление полномочий зависит от воли представителя — он вправе использовать доверенность или отказаться от нее.

2. Допускается выдача доверенности от имени нескольких лиц, если предусмотренные ею действия касаются однородных интересов этих же лиц (например, доверенность на ведение дела по иску к нескольким ответчикам). В качестве представителей также может выступать как одно, так и несколько лиц (см. п. 83 Инструкции о порядке совершения нотариальных действий государственными нотариальными конторами РСФСР, утв. Приказом Минюста РСФСР от 6 января 1987 г. N 01/16-01).

В зависимости от характера и объема предоставляемых полномочий принято различать генеральные, специальные и разовые доверенности. Генеральные доверенности выдаются для управления и распоряжения имуществом доверителя, совершения всех возможных сделок, представительства перед любыми третьими лицами (к примеру, такая доверенность на управление имуществом выдается лицом, уезжающим на длительный срок). Специальные — уполномочивают на юридические действия в определенной сфере или для заключения ряда однородных сделок (примером может быть доверенность, выдаваемая на ведение дел в судах). Разовая доверенность выдается на совершение одного юридического действия (подписание договора, получение товара и др.).

3. Доверенность совершается только в письменной форме. Ее составление возможно в виде особого документа, письма, телеграммы и др. При этом соответствующий документ должен содержать данные, необходимые для признания его доверенностью (дату составления, реквизиты представителя и предоставляемого, существо полномочий). Когда доверенность выдается на совершение сделок, требующих нотариальной формы (см. ст. 163 ГК), она удостоверяется нотариально, если иное не предусмотрено законом (см. п. п. 3 — 5 ст. 185 ГК). Специальными актами может быть установлена особая процедура нотариального оформления доверенностей, выдаваемых на совершение определенных действий (см., например, Приказ Минюста РФ и МВД РФ от 9 марта 1995 г. N 19-01-31-95, 65 «О введении бланка нотариальной доверенности на право пользования и распоряжения транспортными средствами» // Нотариус. 1996. N 2. С. 135).

4. Пункт 3 комментируемой статьи определяет случаи, при которых выданные доверенности приравниваются к нотариально удостоверенным. Они оформляются в особом порядке. К примеру, доверенности военнослужащих удостоверяются в соответствии с Инструкцией о порядке удостоверения завещаний и доверенностей командирами (начальниками) воинских частей, соединений, учреждений и военно-учебных заведений, начальниками, их заместителями по медицинской части, старшими и дежурными врачами госпиталей, санаториев и других военно-лечебных учреждений, утв. Минюстом СССР по согласованию с Минобороны СССР 15 марта 1974 г. Порядок выдачи доверенностей в населенных пунктах, где отсутствует нотариус, установлен Инструкцией о порядке совершения нотариальных действий должностными лицами органов исполнительной власти, утв. Минюстом РФ 19 марта 1996 г. (см. Нотариус. 1996. N 2. С. 121, 128).

5. Доверенность на совершение гражданами широко распространенных действий может быть удостоверена организацией по месту работы, учебы или жительства гражданина. Перечень таких действий устанавливается п. 4 комментируемой статьи и является исчерпывающим. Вместе с тем специальные законы могут предусматривать и иные случаи, когда допускается оформление доверенностей таким же образом. В частности, Закон об акционерных обществах определяет, что доверенность на участие в общем собрании акционеров и на голосование может заверяться по месту работы, учебы или жительства акционера, а в случае болезни — администрацией больницы (п. 1 ст. 57).

6. Доверенность, выдаваемая от имени юридического лица, подписывается его руководителем или иным лицом, уполномоченным на это учредительными документами (членом совета директоров, заместителем руководителя и др. ). Подписи заверяются печатью организации. Такой порядок применяется независимо от организационно-правовой формы юридического лица и содержания полномочия. Исключение составляют случаи, когда доверенность на получение или передачу имущественных ценностей выдается от имени унитарного предприятия. Такие доверенности подписываются не только руководителем, но и главным бухгалтером организации.

Иное правило устанавливает Закон о бухгалтерском учете: документы, которыми оформляются хозяйственные операции с денежными средствами, подписываются руководителем организации и главным бухгалтером или уполномоченными ими лицами (ст. 9). Согласно этой норме доверенности на получение и выдачу денежных средств, товара и т.д., выдаваемые любым юридическим лицом, должны скрепляться двумя подписями.

7. Для признания доверенности надлежаще оформленной необходимо, чтобы она была скреплена как подписью, так и печатью. Однако в некоторых случаях доверенность, печать на которой отсутствует, может иметь юридическую силу. Так, при рассмотрении дела ВАС РФ было установлено, что лицо действовало по доверенности (получило товар), печать на которой была поддельной. По мнению суда, этого факта недостаточно для признания представителя неуполномоченным, ибо на доверенности имеются подлинные подписи руководителя и бухгалтера организации (см. Вестник ВАС РФ. 1996. N 6. С. 57). При возникновении подобных ситуаций следует учитывать все обстоятельства в совокупности — статус представителя, наличие трудовых правоотношений между ним и доверителем и др.

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами.

2. Доверенности от имени малолетних () и от имени недееспособных граждан () выдают их законные представители.

3. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу, которое вправе удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя.

Письменное уполномочие на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в том числе получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи может быть представлено представляемым непосредственно банку или организации связи.

4. Правила настоящего Кодекса о доверенности применяются также в случаях, когда полномочия представителя содержатся в договоре, в том числе в договоре между представителем и представляемым, между представляемым и третьим лицом, либо в решении собрания, если иное не установлено законом или не противоречит существу отношений.

5. В случае выдачи доверенности нескольким представителям каждый из них обладает полномочиями, указанными в доверенности, если в доверенности не предусмотрено, что представители осуществляют их совместно.

6. Правила настоящей статьи соответственно применяются также в случаях, если доверенность выдана несколькими лицами совместно.

Комментарий к статье 185 Гражданского Кодекса РФ

1. Статья традиционно определяет доверенность как письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом (представляемым, доверителем) другому (представителю) для представительства перед третьими лицами. Доверенность является документом, который подтверждает наличие у представителя прав действовать от чужого имени, определяет условия и границы реализации этих прав. Доверенность адресуется третьим лицам, с которыми предполагается заключение сделок, а потому должна быть им предъявлена либо представителем, либо непосредственно самим представляемым.

Доверенность является односторонней сделкой и к ней применяются общие правила, установленные для сделок такого рода (см. коммент. к ст. ст. 155, 156 ГК). Согласия представителя на ее выдачу не требуется. Однако осуществление полномочий зависит от воли представителя — он вправе использовать доверенность или отказаться от нее.

2. Допускается выдача доверенности от имени нескольких лиц, если предусмотренные ею действия касаются однородных интересов этих же лиц (например, доверенность на ведение дела по иску к нескольким ответчикам). В качестве представителей также может выступать как одно, так и несколько лиц (см. п. 83 Инструкции о порядке совершения нотариальных действий государственными нотариальными конторами РСФСР, утв. Приказом Минюста РСФСР от 6 января 1987 г. N 01/16-01).

В зависимости от характера и объема предоставляемых полномочий принято различать генеральные, специальные и разовые доверенности. Генеральные доверенности выдаются для управления и распоряжения имуществом доверителя, совершения всех возможных сделок, представительства перед любыми третьими лицами (к примеру, такая доверенность на управление имуществом выдается лицом, уезжающим на длительный срок). Специальные — уполномочивают на юридические действия в определенной сфере или для заключения ряда однородных сделок (примером может быть доверенность, выдаваемая на ведение дел в судах). Разовая доверенность выдается на совершение одного юридического действия (подписание договора, получение товара и др.).

3. Доверенность совершается только в письменной форме. Ее составление возможно в виде особого документа, письма, телеграммы и др. При этом соответствующий документ должен содержать данные, необходимые для признания его доверенностью (дату составления, реквизиты представителя и предоставляемого, существо полномочий). Когда доверенность выдается на совершение сделок, требующих нотариальной формы (см. ст. 163 ГК), она удостоверяется нотариально, если иное не предусмотрено законом (см. п. п. 3 — 5 ст. 185 ГК). Специальными актами может быть установлена особая процедура нотариального оформления доверенностей, выдаваемых на совершение определенных действий (см., например, Приказ Минюста РФ и МВД РФ от 9 марта 1995 г. N 19-01-31-95, 65 «О введении бланка нотариальной доверенности на право пользования и распоряжения транспортными средствами» // Нотариус. 1996. N 2. С. 135).

4. Пункт 3 комментируемой статьи определяет случаи, при которых выданные доверенности приравниваются к нотариально удостоверенным. Они оформляются в особом порядке. К примеру, доверенности военнослужащих удостоверяются в соответствии с Инструкцией о порядке удостоверения завещаний и доверенностей командирами (начальниками) воинских частей, соединений, учреждений и военно-учебных заведений, начальниками, их заместителями по медицинской части, старшими и дежурными врачами госпиталей, санаториев и других военно-лечебных учреждений, утв. Минюстом СССР по согласованию с Минобороны СССР 15 марта 1974 г. Порядок выдачи доверенностей в населенных пунктах, где отсутствует нотариус, установлен Инструкцией о порядке совершения нотариальных действий должностными лицами органов исполнительной власти, утв. Минюстом РФ 19 марта 1996 г. (см. Нотариус. 1996. N 2. С. 121, 128).

5. Доверенность на совершение гражданами широко распространенных действий может быть удостоверена организацией по месту работы, учебы или жительства гражданина. Перечень таких действий устанавливается п. 4 комментируемой статьи и является исчерпывающим. Вместе с тем специальные законы могут предусматривать и иные случаи, когда допускается оформление доверенностей таким же образом. В частности, Закон об акционерных обществах определяет, что доверенность на участие в общем собрании акционеров и на голосование может заверяться по месту работы, учебы или жительства акционера, а в случае болезни — администрацией больницы (п. 1 ст. 57).

6. Доверенность, выдаваемая от имени юридического лица, подписывается его руководителем или иным лицом, уполномоченным на это учредительными документами (членом совета директоров, заместителем руководителя и др. ). Подписи заверяются печатью организации. Такой порядок применяется независимо от организационно-правовой формы юридического лица и содержания полномочия. Исключение составляют случаи, когда доверенность на получение или передачу имущественных ценностей выдается от имени унитарного предприятия. Такие доверенности подписываются не только руководителем, но и главным бухгалтером организации.

Иное правило устанавливает Закон о бухгалтерском учете: документы, которыми оформляются хозяйственные операции с денежными средствами, подписываются руководителем организации и главным бухгалтером или уполномоченными ими лицами (ст. 9). Согласно этой норме доверенности на получение и выдачу денежных средств, товара и т.д., выдаваемые любым юридическим лицом, должны скрепляться двумя подписями.

7. Для признания доверенности надлежаще оформленной необходимо, чтобы она была скреплена как подписью, так и печатью. Однако в некоторых случаях доверенность, печать на которой отсутствует, может иметь юридическую силу. Так, при рассмотрении дела ВАС РФ было установлено, что лицо действовало по доверенности (получило товар), печать на которой была поддельной. По мнению суда, этого факта недостаточно для признания представителя неуполномоченным, ибо на доверенности имеются подлинные подписи руководителя и бухгалтера организации (см. Вестник ВАС РФ. 1996. N 6. С. 57). При возникновении подобных ситуаций следует учитывать все обстоятельства в совокупности — статус представителя, наличие трудовых правоотношений между ним и доверителем и др.

Комментарий к ст. 185 ГК РФ

1. Доверенность есть документ, специально предназначенный для оформления выдачи представителю полномочия. По общему правилу, перед совершением сделки с третьим лицом представитель предъявляет ему доверенность в подтверждение своего полномочия (п. 1 комментируемой статьи).

2. Под выдачей полномочия, или что то же самое, уполномочием, понимается сделка, направленная на установление права одного лица (уполномочиваемого) совершить сделку от имени и с непосредственным действием для другого лица (уполномочивающего). Выдача полномочия в принципе не предполагает согласия уполномочиваемого на приобретение им права быть представителем и, как правило, является односторонней сделкой уполномочивающего. Сказанное объясняется тем, что возникновение у уполномочиваемого этого права не может причинить ему убытки. Однако уполномочиваемый как никто другой заинтересован в том, чтобы знать, что он стал представителем. Поэтому волеизъявление уполномочивающего о выдаче полномочия для своей действительности нуждается в получении уполномочиваемым (подробнее о выдаче полномочия см.: Крашенинников Е. А., Байгушева Ю. В. Обоснование полномочия добровольного представителя // Очерки по торговому праву. Ярославль, 2010. Вып. 17. С. 5–51).

3. В некоторых статьях ГК законодатель называет доверенностью не документ, оформляющий выдачу полномочия, а саму выдачу полномочия или обоснованное ею полномочие (см., напр.: абз. 1 п. 1 ст. 182, ст. 185–189). Но выдача полномочия является сделкой, а полномочие — субъективным гражданским правом; стало быть, они представляют собой явления, качественно отличные от оформляющей выдачу полномочия доверенности, и поэтому не могут обозначаться термином «доверенность». В связи с изложенным в указанных статьях ГК слово «доверенность» следует заменить соответствующим контексту термином «выдача полномочия» («уполномочие») или «полномочие».

4. Полномочие обычно выдается во исполнение договора между уполномочиваемым и уполномочивающим, по которому первый обязуется выступать в качестве представителя второго и которым чаще всего является договор поручения. Наш законодатель отграничивает выдачу полномочия (по неточной терминологии ГК — выдачу доверенности) как основание возникновения права быть представителем (абз. 1 п. 1 ст. 182 ГК) от договора поручения как основания возникновения обязанности поверенного к совершению юридических действий для доверителя в качестве его представителя (п. 1 ст. 971 ГК). Основная цель этого отграничения, предложенного еще P. Labandʼом, состоит в избавлении третьего лица, которое идет на сделку с представителем, от необходимости исследовать его внутренние отношения с представляемым, в частности выяснять вопросы, был ли заключен договор между представителем и представляемым, а если был, то какой именно и не страдает ли он пороком (см. : Laband P. Die Stellvertretung bei dem Abschluss von Rechtsgeschäften nach dem allgemeine Deutschen Handelsgesetzbuch // Zeitschrift für das gesamte Handelsrecht. 1866. Bd. 10. S. 183 ff., 203 ff.). В соответствии с указанной целью выдача полномочия традиционно рассматривается цивилистами как абстрактная сделка, действительность которой не зависит от наличия или действительности лежащего в ее основании договора (см., напр.: Hupka J. Die Vollmacht. Eine civilistische Untersuchung mit besonderer Berücksichtigung des deutschen Bürgerlichen Gesetzbuchs. Leipzig, 1900. S. 155 ff.; Stadler A. Gestaltungsfreiheit und Verkehrsschutz durch Abstraktion: eine rechtsvergleichende Studie zum abstrakten und kausalen Gestaltung rechtsgeschäftlicher Zuwendungen anhand des deutschen, schweizerischen, österreichischen, französischen und US-amerikanischen Rechts. Tübingen, 1996. S. 27).

5. В доверенности определяется объем полномочия уполномоченного, т. е. круг сделок, которые он вправе совершить от имени и с непосредственным действием для уполномочившего. Такие сделки обозначаются через указание их вида, предмета, цены, лиц, с которыми они должны совершаться, места и времени их совершения, а также других признаков. В связи с этим выделяют генеральное и специальное полномочие: генеральное полномочие охватывает все сделки, в отношении которых допускается представительство, специальное — только одну сделку уполномоченного. Так как понятия генерального и специального полномочия являются соотносительными понятиями, одно и то же полномочие может рассматриваться и как генеральное, и как специальное, в зависимости от того, сравнивать ли его с более узким или более широким по объему полномочием. При таком способе рассмотрения полномочие на реализацию продукции, которая производится на принадлежащем уполномочившему предприятии, будет фигурировать в качестве генерального полномочия по отношению к полномочию на заключение отдельного договора поставки продукции и в качестве специального полномочия по отношению к полномочию на управление этим предприятием (см. : Крашенинников Е. А., Байгушева Ю. В. Выдача и объем полномочия // Вестник ВАС. 2011. № 1. С. 78).

Ни генеральное, ни специальное полномочие само по себе не охватывает сделки, нуждающиеся в специальном согласии уполномочившего. Так, уполномоченный, если это специально не разрешено ему в доверенности, не вправе от имени уполномочившего принять наследство (абз. 3 п. 1 ст. 1153 ГК) или заключить мировое соглашение (ст. 54 ГПК).

6. Выдавая полномочие, уполномочивающий может очертить в доверенности круг доверяемых сделок шире, чем он очертил его при заключении договора поручения, обязывающего уполномочиваемого к совершению этих сделок в качестве поверенного. При таких обстоятельствах объем полномочия следует определять без учета содержания договора поручения, ибо третье лицо, как правило, знакомится лишь с текстом доверенности, по которому оно и судит об объеме этого полномочия. Однако если третье лицо знает или должно знать, что сделка уполномоченного хотя и соответствует тексту доверенности, но нарушает лежащую на нем договорную обязанность, то полномочие должно рассматриваться как охватывающее только те сделки, которые указаны в договоре поручения (см. : Kipp Th. Zur Lehre von der Vertretung ohne Vertretungsmacht // Die Reichsgerichtspraxis im deutschen Rechtsleben. Berlin und Leipzig, 1929. Bd. 2. S. 280 ff.).

7. От имени малолетнего гражданина или гражданина, признанного судом недееспособным, полномочие может выдать его законный представитель (п. 2 ст. 185). Если это происходит, то в части доверенной им сделки законный представитель не утрачивает свое полномочие и вправе действовать от имени представляемого наряду с уполномоченным.

8. В большинстве случаев уполномочивающий выдает полномочие через вручение уполномочиваемому составленной на его имя доверенности. При этом выдаваемое полномочие возникает не в момент составления доверенности, а в момент ее поступления во владение уполномочиваемого.

Пункт 3 комментируемой статьи предписывает, что уполномочивающий может вручить доверенность непосредственно третьему лицу, в частности банку или организации связи, как будущему контрагенту по доверенной сделке. В таком случае выдача полномочия также осуществляется в отношении уполномочиваемого, который только и выступает надлежащим получателем волеизъявления уполномочивающего о выдаче полномочия. В зависимости от конкретных обстоятельств выдача полномочия здесь может выражаться в том, что уполномочивающий зачитывает уполномочиваемому текст доверенности перед вручением ее третьему лицу, во владении которого она остается до совершения доверенной сделки, или в том, что уполномочивающий вручает уполномочиваемому доверенность уже после ознакомления с нею третьего лица и выполнения им на доверенности удостоверительной отметки.

9. В соответствии с п. 4 выдача полномочия может подтверждаться не доверенностью, а другим документом, который при этом выполняет функции доверенности и должен отвечать предъявляемым к ней требованиям. Закон допускает оформление выдачи полномочия тем же самым документом, что и договор поручения или иной договор между уполномочивающим и уполномочиваемым, который лежит в основании выдачи полномочия, либо тем же документом, что и договор уполномочивающего с третьим лицом, например, предварительный договор, в силу которого заключение основного договора должно последовать через уполномочиваемого. Однако и при таких способах оформления выдача полномочия не становится частью соответствующего договора, а остается самостоятельной по отношению к нему сделкой. Подтверждением выдачи представителю полномочия также может служить протокол о положительном результате голосования участниками объединения лиц по вопросу о наделении его полномочием.

10. Пункт 5 комментируемой статьи устанавливает презумпцию солидарности полномочия, выдаваемого нескольким лицам на одну и ту же сделку. Эту презумпцию можно опровергнуть через включение в доверенность оговорки, что уполномоченные лица являются совместными (коллективными) представителями (о видах представительства с множественностью представителей см. выше, п. 3 комментария к ст. 182 ГК).

В случае выдачи солидарного или коллективного полномочия волеизъявление уполномочивающего должно быть получено каждым уполномочиваемым, а не кем-то одним из них. Так как при солидарном полномочии каждому уполномоченному принадлежит самостоятельное право выступать в качестве представителя, осуществление которого влечет прекращение совпадающих с ним по содержанию прав других уполномоченных, то выдача солидарного полномочия состоит из нескольких волеизъявлений уполномочивающего, каждое из которых считается полученным в момент его поступления к соответствующему уполномочиваемому. Поскольку при коллективном полномочии речь идет об одном праве быть представителем, принадлежащем нескольким лицам, это полномочие выдается посредством одного волеизъявления, которое считается полученным тогда, когда его получают все уполномочиваемые, а если они получают его не одновременно, то — в момент получения его последним уполномочиваемым (см.: Крашенинников Е. А., Байгушева Ю. В. Обоснование полномочия добровольного представителя. С. 10–12).

Выдача солидарного полномочия обычно оформляется не одной доверенностью, как предписывает п. 5 ст. 185, а несколькими доверенностями, в каждой из которых указывается лишь один из уполномочиваемых, потому что обладатели солидарного полномочия чаще всего выступают от имени уполномочившего изолированно друг от друга. Совместным представителям, как правило, выдается одна доверенность, в которой поименован каждый представитель, ибо в большинстве случаев они действуют вместе (см.: Tuhr A. Op. cit. S. 412 f.).

11. Согласно п. 6 комментируемой статьи выдача полномочия может совершаться несколькими уполномочивающими и представлять собой их одностороннее совместное волеизъявление. Например, А, Б и В, которым на праве общей собственности принадлежит недвижимая вещь, могут выдать Г полномочие на совершение сделок по поводу этой вещи. Особенностью такой выдачи полномочия является то, что она состоит из нескольких параллельных волеизъявлений, обращенных к уполномочиваемому лицу (о понятии совместного волеизъявления см.: Крашенинников Е. А., Байгушева Ю. В. Односторонние и многосторонние сделки // Вестник ВАС. 2012. № 7. С. 32).

Судебная практика по ст. 185 ГК РФ

Позиции высших судов по статье 185 Гражданского кодекса.

Верховный Суд Российской Федерации

Определение от 25 сентября 2019 г. по делу № А35-12808/2017
Определение от 5 августа 2019 г. по делу № А40-100224/2018
Определение от 22 июля 2019 г. по делу № А40-82653/2018
Определение от 18 июля 2019 г. по делу № А83-5148/2017
Определение от 13 июня 2019 г. по делу № А65-24603/2018
Определение от 13 июня 2019 г. по делу № А83-13371/2017
Определение от 30 августа 2019 г. по делу № А67-1380/2019
Определение от 2 апреля 2019 г. по делу № А46-7533/2017
Определение от 1 апреля 2019 г. по делу № А04-1307/2018
Определение от 11 марта 2019 г. по делу № А55-33679/2017

Нотариальные действия представляют собой юридически значимые поведенческие акты определенных лиц. Они совершаются субъектами, имеющими на это полномочия.

Общие сведения о деятельности

К субъектам относят:

  1. Частнопрактикующих и работающих в государственных конторах нотариусов.
  2. Должностных служащих местных исполнительных органов.
  3. Уполномоченных представителей

Они осуществляют оформление завещаний, доверенностей на:

  • Право распоряжения, пользования имуществом иных собственников.
  • Представительство в суде.
  • Получение документов.
  • Представительство в ЖКХ.
  • Бронирование квартиры.
  • Получение ордеров и т.д.

Одним из основных документов, который выдают указанные выше субъекты, выступает доверенность. Ст. 185 ГК РФ разъясняет, что это такое, назначение этой бумаги и порядок ее выдачи. Рассмотрим далее этот документ подробнее.

Ст. 185 ГК РФ (с комментариями 2015 года)

В этой статье предусматривается документальное предоставление полномочий поверенному. Доверенность дает право на совершение сделок либо иных правомерных действий от имени другого гражданина. В качестве этого документа по ст. 185 ГК РФ признается уполномочие в письменной форме, которое выдается одним субъектом другому для представительства последнего перед иными лицами. Наличие этой бумаги подтверждает факт передачи полномочий лицу, осуществляющему те или иные действия. Документ также определяет их содержание и предел.

Особенности предоставления полномочий

Ст. 185 ГК РФ (с комментариями 2015 года) не предусматривает получение обязательного согласия представителя на составление документа о его полномочиях. Бумага оформляет отношения, связанные с добровольным представлением интересов. Необходимость в ней может быть связана с разными причинами. Оформление документа может осуществляться в рамках трудового договора, поручительства и пр. Отличия между объемом полномочий, предусмотренных в доверенности с теми, которые присутствуют в соглашении между лицами, не имеют значения для других людей. Последние руководствуются только тем, что указано в нотариальном документе.

Классификация

Доверенности различаются по объему и содержанию полномочий. В частности, существуют:

Бумага для осуществления действий, требующих обязательного нотариального оформления, должна быть удостоверена уполномоченным лицом, кроме случаев, прямо предусмотренных в законодательстве. Документ может быть выдан на имя одного, двух и более лиц. Представительство также может осуществляться от нескольких граждан.

Доверенность (ст. 185 ГК РФ): образец

Бумага должна оформляться по установленным правилам. В первую очередь, следует сказать, что документ, в соответствии с которым представитель наделяется теми или иными полномочиями, должен быть составлен письменно. Это положение установлено в п. 2 ст. 185 ГК РФ. Порядок предусматривает наличие определенных реквизитов сторон. В частности, должно быть указание ФИО доверителя и представителя, установлен срок, объем и содержание полномочий. Для подтверждения действительности бумаги в случаях, предусмотренных законодательством, необходимо ее визирование определенными органами. В части второй ст. 185 ГК РФ (в новой редакции) устанавливается перечень ситуаций, когда необходимо подтверждение бумаги. В частности, обязательного визирования требуют документы, предоставляющие право совершать необходимо и для доверенностей, которые оформляются для действий, совершаемых в отношении третьих (юридических в том числе) лиц. В ч. 4 рассматриваемой статьи установлены исключения из данных требований. Ст. 185 ГК РФ (с комментариями) разъясняет, что в подтверждении не нуждаются бумаги на совершение сделок, которые выдаются непосредственно юридическими лицами. В числе этих исключений присутствуют и правоотношения, для которых по общему правилу предусматривается обязательная нотариальная форма.

Приравненные документы

Изменения ст. 185 ГК РФ предусматривают случаи, в которых в качестве документа, наделяющего определенными полномочиями, признается бумага, выданная:

  1. Военнослужащим или иным лицом, находящимся на лечении в госпитале и прочих военно-медицинских учреждениях. Такой документ имеет юридическую силу при удостоверении начальником заведения, заместителем по медчасти, дежурным либо старшим врачом.
  2. Военнослужащим, рабочим и служащим, их родственникам в пунктах дислокации частей, военно-учебных заведений и учреждений, соединений, где отсутствуют государственные нотариальные конторы и прочие органы, уполномоченные на оформление таких документов. Доверенности, выданные в таких условиях, удостоверяются начальниками (командирами) указанных структур.
  3. Гражданами, пребывающими в местах заключения. Действительность таких бумаг подтверждается начальником учреждения, в котором находится осужденный.
  4. Совершеннолетними дееспособными гражданами, пребывающими в учреждениях соцзащиты населения. Такие доверенности удостоверяются руководителем соответствующего органа либо администрацией непосредственно самого заведения.

Эти дополнения приведены в ст. 185.1 ГК РФ. Корректировки, указанные в ней, вступили в свое действие 1-го сентября 2013-го года.

Особые случаи

В качестве исключений из общего правила для осуществления физлицами наиболее распространенных действий в отношении организаций предусматривается возможность визирования документа не в нотариальном порядке. Удостоверение в этом случае может осуществлять любое предприятие по месту учебы, жительства либо работы, а также администрация стационара, в котором гражданин проходит лечение. В части четвертой ст. 185 ГК РФ установлен перечень таких действий. В частности, к ним относят получение:

  1. Зарплаты и других платежей, которые касаются трудовых правоотношений.
  2. Вознаграждения изобретателей и авторов.
  3. Пенсий.
  4. Стипендий.
  5. Пособий.
  6. Вкладов в банках на счетах физлиц.
  7. Корреспонденции (посылочной и денежной).

Данный список считается исчерпывающим и расширенному толкованию не подлежит.

Специфика выдачи

Наделять представителя теми или иными полномочиями по ст. 185 ГК РФ могут граждане с 18-ти лет, юрлица, которые не ограничены в правах в силу установленного законодательством порядка. Документ от имени организации должен быть выдан с подписью руководителя либо другого Последний должен быть официально наделен соответствующими полномочиями учредительными бумагами. Доверенность юрлица также удостоверяется его печатью. В случае, если бумага выдается организацией, основанной на муниципальной/государственной собственности, для выдачи/получения денежных средств и прочих ценностей имущественного характера, она должна содержать подпись старшего (главного) бухгалтера учреждения. Порядок, в соответствии с которым выдаются доверенности на совершение тех или иных банковских операций, регламентируется в Инструкциях ЦБ. В картотеке банка должна присутствовать карточка с примерами подписей представителей юрлица, в соответствии с чем другим сотрудникам организации, которые предъявили соответствующие документы, осуществляется выдача необходимых сумм со счета. Ст. 185 ГК РФ устанавливает также, что документы о полномочиях на совершение внешнеторговых операций должны подписываться единолично руководителями компаний, правомочных на их выполнение. Такие бумаги должны в обязательном порядке удостоверяться в Первой нотариальной государственной конторе Москвы.

Срок действия

Доверенность выступает в качестве срочного документа. В этой связи в части первой ст. 186 установлено признание недействительности той бумаги, в которой не указана дата ее выдачи. Максимальный — три года. Документ, который выдан без указания длительности его действия, имеет силу в течение года с даты составления. Это правило не касается которые выдаются лицам для осуществления ими юридических действий за пределами РФ. Такие бумаги обладают силой до момента их отмены субъектом, передавшим полномочия. Дата оформления документа, а также его срок (при его указании) обозначаются прописью.

Случаи прекращение действия

Они приведены в ст. 188 ГК РФ. Доверенность прекращает свое действие при:

  1. Истечении установленного в ней срока.
  2. Отмены ее действия выдавшим субъектом.
  3. Отказа лица от полномочий, которыми он наделяется документом.
  4. Ликвидации юрлица, от имени которого был выдан документ или которому он был выдан.
  5. Смерти, признании полностью либо частично недееспособным, безвестно отсутствующим представителя или доверителя.

Лицо, которое получило доверенность, может в любое время отказаться от полномочий, равно как и субъект, выдавший ее, отменить документ. Соглашение об отказе от указанных прав считается ничтожным.

Последствия прекращения действия документа

Они устанавливаются в ст. 189 ГК РФ. Лицо, которое выдало и впоследствии отменило доверенность, обязано известить о своих действиях представителя, а также известных третьих лиц, для представления интересов перед которыми, собственно, бумага была составлена. Аналогичным образом должны поступить и его правопреемники при прекращении действия документа по ст. 188 (п. 1, пп. 4 и 6). Обязанности и права, которые возникли в результате действий представителя до того, как он был или должен был быть извещен об отмене доверенности, сохраняют силу для доверителя и его наследников относительно третьих лиц. Данное правило не может применяться в случае, если лицо знало либо должно было знать, что действие выданного ему документа о полномочиях прекратилось. При отмене данного документа субъект, которому он был предоставлен, а также его правопреемники обязаны вернуть бумагу незамедлительно.

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу для представительства перед третьими лицами. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу. 2. Доверенность на совершение сделок, требующих нотариальной формы, должна быть нотариально удостоверена, за исключением случаев, предусмотренных законом. 3. К нотариально удостоверенным доверенностям приравниваются: 1) доверенности военнослужащих и других лиц, находящихся на излечении в госпиталях, санаториях и других военно-лечебных учреждениях, удостоверенные начальником такого учреждения, его заместителем по медицинской части, старшим или дежурным врачом; 2) доверенности военнослужащих, а в пунктах дислокации воинских частей, соединений, учреждений и военно-учебных заведений, где нет нотариальных контор и других органов, совершающих нотариальные действия, также доверенности рабочих и служащих, членов их семей и членов семей военнослужащих, удостоверенные командиром (начальником) этих части, соединения, учреждения или заведения; 3) доверенности лиц, находящихся в местах лишения свободы, удостоверенные начальником соответствующего места лишения свободы; 4) доверенности совершеннолетних дееспособных граждан, находящихся в учреждениях социальной защиты населения, удостоверенные администрацией этого учреждения или руководителем (его заместителем) соответствующего органа социальной защиты населения. 4. Доверенность на получение заработной платы и иных платежей, связанных с трудовыми отношениями, на получение вознаграждения авторов и изобретателей, пенсий, пособий и стипендий, вкладов граждан в банках и на получение корреспонденции, в том числе денежной и посылочной, может быть удостоверена также организацией, в которой доверитель работает или учится, жилищно-эксплуатационной организацией по месту его жительства и администрацией стационарного лечебного учреждения, в котором он находится на излечении. Доверенность на получение представителем гражданина его вклада в банке, денежных средств с его банковского счета, адресованной ему корреспонденции в организациях связи, а также на совершение от имени гражданина иных сделок, указанных в абзаце первом настоящего пункта, может быть удостоверена соответствующими банком или организацией связи. Такая доверенность удостоверяется бесплатно. 5. Доверенность от имени юридического лица выдается за подписью его руководителя или иного лица, уполномоченного на это его учредительными документами, с приложением печати этой организации. Доверенность от имени юридического лица, основанного на государственной или муниципальной собственности, на получение или выдачу денег и других имущественных ценностей должна быть подписана также главным (старшим) бухгалтером этой организации.

Комментарии к ст 185 ГК РФ. Доверенность:

1. Дмитрий:
Добрый день!
жена сбербанке оформила кредит, я (муж) хотел его досрочно погасить по рукописной доверенности, но в банке отказали, ссылаясь что нужна нотариальная доверенность, законно ли это?

2. Надежда:
Банк отказывается выдавать(удостоверять) доверенность на вклад в банке, ссылаясь на изменение в законодательстве, с сентября 2013г.требующих удостоверение таких доверенностей только нотариально. Прав ли банк?
Зарание благодарна.

3. Владимир ХАрлампьевич:
Насчет доверенности все ясно. Ho y меня вот какая ситуация. Я из Мурманска переехал в Калининградскую область (г Пионерский). По закону Мурманской области я имею право на получение денежных выплат как ветеран Мурманской области. Для этого я должен наряду с заявлением и всякими разными справками выслать заверенную ксерокопию паспорта с нового места жительства. В отделе соц. поддержки и в администрации города мне в этом отказали, а у нотариуса во-первых необходимо сделать полную ксерокопию паспорта(включая пустые страницы) , а во-вторых стоит денег. Для пенсионера это не лучший вариант. Правы ли вышеуказанные организации отказавшие мне заверить ксерокопию моего паспорта?

4. :
ч.4 185 «может быть удостоверена соответствующими банком или организацией связи. Такая доверенность удостоверяется бесплатно.»
Но никто не запрещает у нотариуса. Так что теоретически можно заверить и у нотариуса. Но зачем, если можно в этом же банке?

5. Расима Блинова:
Добрый день. Я председатель жилищного кооператива. Жилец, который судится со мной, попросил подписать меня доверенность на представление его интересов его адвокатом сроком на 3 года. При чем в доверенности не указано в каком суде. Через месяц свою квартиру они продают. Я отказываюсь подписывать доверенность, где не указана конкретная дата и со сроком на 3 года. Подскажите, пожалуйста, превышаю ли я свои полномочия? В Гражданском Кодексе о представлении в суде ничего не написано. В нашем уставе написано, что я могу подписывать доверенности в необходимых случаях.

6. :

владимир писал:
мы с женой обратились в фонд право матери оказать помощь в суде по невыплате пенсии по случаю потери кормильца сын погиб в чечне.для оформления доверенности на 4 юристов фонда от нас с женой мы обратились в нотариус который нам в оформлении одной доверенности отказал. рекомендовал оформить 8 доверенностей что противоречит ст. 59 закона о Нотариате. убедительно прошу оказать помощь. заранее благодарю

7. владимир:
мы с женой обратились в фонд право матери оказать помощь в суде по невыплате пенсии по случаю потери кормильца сын погиб в чечне.для оформления доверенности на 4 юристов фонда от нас с женой мы обратились в нотариус который нам в оформлении одной доверенности отказал. рекомендовал оформить 8 доверенностей что противоречит ст. 59 закона о Нотариате. убедительно прошу оказать помощь. заранее благодарю

8. Мира:
Моему отцу 94 года и его пенсию по карте Виза получаю я. Карта провалилась в банкомат деньги я не получила.Оформила доверенность в ЖЕУ на, но сбербанк ее не принял и требует нотариальную. А нотариус считает, ссылаясь на ст.185, что Сбербанк не прав.
Можно ли переоформить карту по доверенности ЖЭУ?

9. Людмила:
Ребенку 16 лет. едет за границу на месяц на обучение. нужно согласие от обоих родителей на выезд ребенка за рубеж,без сопровождения.муж находится в командировке за границей на судне. может ли капитан подписать это согласие,т.к. консультва Росии там нет. Если — да, то на какой закон и его статью я могу сослаться в случае проблем прохождения таможни

и получите бесплатную консультацию в течение 5 минут.

Пример: Дом оформлен на меня, но я там жить не буду, в нем будет проживать и прописан мой дед постоянно. Как оформить коммунальные услуги на него и кто будет их оплачивать??

Конфиденциально

Быстро

Заполните форму, и уже через 5 минут с вами свяжется юрист.

Задать вопрос

Конфиденциально

Все данные будут переданы по защищенному каналу.

Полный текст ст. 185 ГК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2020 год. Консультации юристов по статье 185 ГК РФ.

1. Доверенностью признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами.

2. Доверенности от имени малолетних (статья 28) и от имени недееспособных граждан (статья 29) выдают их законные представители.

3. Письменное уполномочие на совершение сделки представителем может быть представлено представляемым непосредственно соответствующему третьему лицу, которое вправе удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя.

Письменное уполномочие на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в том числе получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи может быть представлено представляемым непосредственно банку или организации связи.

4. Правила настоящего Кодекса о доверенности применяются также в случаях, когда полномочия представителя содержатся в договоре, в том числе в договоре между представителем и представляемым, между представляемым и третьим лицом, либо в решении собрания, если иное не установлено законом или не противоречит существу отношений.

5. В случае выдачи доверенности нескольким представителям каждый из них обладает полномочиями, указанными в доверенности, если в доверенности не предусмотрено, что представители осуществляют их совместно.

6. Правила настоящей статьи соответственно применяются также в случаях, если доверенность выдана несколькими лицами совместно.

(Статья в редакции, введенной в действие с 1 сентября 2013 года Федеральным законом от 7 мая 2013 года N 100-ФЗ.

Комментарий к статье 185 ГК РФ

1. В п.1 комментируемой статьи определено понятие доверенности — ей признается письменное уполномочие, выдаваемое одним лицом другому лицу или другим лицам для представительства перед третьими лицами. Таким образом, следует различать доверенность — письменный документ, и выдачу доверенности — одностороннюю сделку. Сам по себе факт оформления письменного документа правовых последствий не порождает.

В отношении видов доверенностей необходимо отметить следующее:
— доверенность может иметь разовый характер, т.е. в ней могут быть предусмотрены полномочия на совершение представителем разового действия, например, получить причитающуюся представляемому денежную сумму;
— доверенность может иметь специальный характер, содержать полномочия на совершение нескольких совокупных или длящихся действий, неразрывно связанных общей целью, общим предметом и (или) общей процедурой и направленных на достижение одного юридического результата, например, доверенность на распоряжение автомобилем;
— доверенность может иметь общий характер и содержать полномочия по пользованию и распоряжению всем имуществом представляемого и осуществлению его прав и обязанностей, в т. ч. на представительство перед любыми третьими лицами по всем вопросам и на ведение любых дел от имени представляемого, т.н. генеральная доверенность.

2. Пункт 2 комментируемой статьи устанавливает, что доверенности от имени малолетних (т.е. несовершеннолетних, не достигших 14 лет) и от имени недееспособных граждан выдают их законные представители. Это положение является законодательной новеллой, введенной ФЗ от 07.05.2013 N 100-ФЗ.

3. Установлено, что при представлении представляемым письменного уполномочия на совершение сделки представителем непосредственно соответствующему третьему лицу это третьему лицу предоставляются права удостовериться в личности представляемого и сделать об этом отметку на документе, подтверждающем полномочия представителя (п.3 комментируемой статьи). Следует подчеркнуть, что речь идет о правах, а не об обязанностях соответствующего третьего лица, т.е. представляемый не может требовать от третьего лица совершения указанных действий. Также не конкретизируется содержание указанной отметки.

Статья предусматривает возможность представления письменного уполномочия на получение представителем гражданина его вклада в банке, внесение денежных средств на его счет по вкладу, на совершение операций по его банковскому счету, в т.ч. получение денежных средств с его банковского счета, а также на получение адресованной ему корреспонденции в организации связи представляемым непосредственно банку или организации связи. Предусмотренная законом возможность не исключает выдачи доверенности представителю.

4. В соответствии с п.4 комментируемой статьи правила ГК РФ о доверенности подлежат применению также в случаях, когда:
1) полномочия представителя содержатся в договоре; причем прямо указано, что может быть договор между представителем и представляемым, договор между представляемым и третьим лицом;
2) полномочия представителя содержатся в решении собрания. При этом предусмотрено, что данные правила применяются, если иное не установлено законом или не противоречит существу отношений (под законом понимается ГК РФ и принятые в соответствии с ним федеральные законы, регулирующие гражданско-правовые отношения).

5. В п.5 комментируемой статьи регламентировано осуществление полномочий в случае выдачи доверенности нескольким представителям: в качестве общего правила установлено, что каждый из представителей обладает полномочиями, указанными в доверенности, но при этом предусмотрено, что доверенностью может быть определено совместное осуществление представителями полномочий. При осуществлении полномочий совместно требуется согласование воль всех представителей. В первом случае имеется несколько представителей, во втором на стороне представителя — несколько лиц.

6. Пункт 6 комментируемой статьи устанавливает, что правила данной статьи соответственно применяются также в случаях, если доверенность выдана несколькими лицами совместно. Это правило также является законодательной новеллой.

Каждый из субъектов, которые выдают одну доверенность, выражает свою волю, каждый из них может выдать доверенность представителю отдельно. Но поскольку речь идет об однородных действиях представителя от имени каждого из представляемых, постольку технически может быть удобнее оформить наделение представителя полномочиями каждым из представляемых одной доверенностью (от имени представляемых). В данном случае составляется один документ, в котором изъявляется воля нескольких лиц на наделение кого-либо действовать от имени каждого из этих лиц. Как правило, в таких случаях интересы представляемых совпадают, воли согласованы, действия, которые должен совершить представитель, однородны.

7. Судебная практика:
— постановление Шестнадцатого арбитражного апелляционного суда от 12.02.2014 по делу N А63-1550/2013;
— постановление ФАС Поволжского округа от 14.01.2014 по делу N А72-7929/2012;
— апелляционное определение Верховного суда Республики Бурятия от 18.12.2013 по делу N 33-3721;
— постановление Двадцатого арбитражного апелляционного суда от 01.11.2013 по делу N А68-2082/2013.

Консультации и комментарии юристов по ст 185 ГК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 185 ГК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Статья 185 | NYS CPL

Уголовно-процессуальный закон

Свод законов штата Нью-Йорк, CPL, код

.

Статья 185 Уголовно-процессуального закона штата Нью-Йорк

* АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД ПРИГОВОРЕНИЯ

185.10 Определение терминов.
185.20 Электронное обвинение.
185.30 Условия и ограничения электронного предъявления обвинения.
185.40 Утверждение главного администратора судов.
* NB Срок действия истек 1 сентября 1983 г.

 * S 185.10 Определение терминов.
  Как используется в этой статье:
  1. "Независимая аудиовизуальная система" означает электронную систему
для передачи и приема звуковых и визуальных сигналов,
включая кодированные сигналы, мультиплексирование в частотной области или другие
подходящие средства для предотвращения несанкционированного приема и декодирования
сигналы коммерчески доступными телевизионными приемниками, канал
конвертеры или другие доступные приемные устройства. 
  2. "Электронное обвинение" означает предъявление обвинения, в котором различные
участники, в том числе ответчик, лично не присутствуют в
суда, но в котором все участники одновременно могут
видеть и слышать репродукции голосов и изображений судьи,
адвокаты, ответчик, сотрудник полиции и любые другие соответствующие
участника с помощью независимой аудиовизуальной системы.* Срок действия истек 1 сентября 1983 г.

* S 185.20 Электронное обвинение.
  Несмотря на положения подраздела девять раздела 1.20,
сечения 110.10, 120.10, 120.40, 120.90, 140.20, 140.27, 140.40, 170.10
и 180.10 настоящей главы или любое другое положение закона, если они относятся
личное присутствие подсудимого на предъявлении обвинения в графстве Саффолк,
суд по своему усмотрению может отказаться от личной
явка на допрос и проведение электронного допроса,
при условии, что:
  1.Ответчик в письменной форме отказался от своего права на личное присутствие
при его предъявлении обвинения и согласился быть привлеченным к суду электронным
процесс предъявления обвинения;
  2.  Окружной прокурор дал согласие на предъявление обвинения в электронном виде.
процесс для ответчика;
  3. Личное присутствие подсудимого на предъявлении обвинения
привести к необоснованной задержке предварительного производства; а также
  4. Главный администратор судов разрешил использование
электронные документы для суда, в соответствии с положениями
раздел 185.40 этой статьи.
* Срок действия истек 1 сентября 1983 г.

* S 185.30 Условия и ограничения электронного предъявления обвинения.
  Всякий раз, когда лицо привлечено к ответственности с помощью электронного обвинения,
применяются следующие условия и ограничения:
  1. Подсудимый не может заявить о признании вины;
  2. Электронный процесс предъявления обвинения может использоваться только тогда, когда
обвинительный акт не обвиняет в уголовном преступлении;
  3. Электронная запись электронного обвинения не может быть сделана,
просматриваться или инспектироваться, за исключением случаев, когда это разрешено правилами начальника
администратор судов; а также
  4. Стенографическая запись обвинения должна быть сделана в
такой же степени, как если бы это было обычное обвинение, а не
электронное взыскание.
* Срок действия истек 1 сентября 1983 г.

* S 185.40 Утверждение главного администратора судов.
  1. Соответствующий административный судья представляет начальнику
администратору судов письменное предложение об использовании электронной
предъявления обвинений конкретному суду и участкам под
юрисдикции этого суда. Если главный администратор судов
одобряет предложение, установка независимого аудиовизуального
система может начаться.2. По завершении установки независимого аудиовизуального
системы, комиссия по кабельному телевидению проверяет, испытывает и
проверить независимую аудиовизуальную систему и заверить начальника
администратором судов, соответствует ли система
определение независимой аудиовизуальной системы и технически
подходит для проведения электронных обвинений по назначению.
  3. Использование судом утвержденной независимой аудиовизуальной системы
для целей санкционированного электронного предъявления обвинений, должно быть
в течение двух лет с момента получения разрешения начальника
администратор судов. 4. Главный администратор судов может отозвать утверждение
авторизация в любое время.
* Срок действия истек 1 сентября 1983 г.

Верх страницы
 

Законы штата Нью-Йорк постоянно изменяются, отменяются и/или полностью переписываются. Этот сайт стремится публиковать действующие законы; тем не менее, следует консультироваться с официальными репортерами для получения самой последней версии закона. Мы не даем никаких гарантий, явных или подразумеваемых, или заявлений относительно точности содержания на этом веб-сайте.Этот веб-сайт и его владельцы не несут ответственности за любые ошибки или упущения в информации, содержащейся на веб-сайте, или в работе веб-сайта.

Статья 185 | Европейское банковское управление

Учреждения должны подтверждать свои внутренние оценки с учетом следующих требований:

(a) учреждения должны иметь надежные системы для проверки точности и согласованности рейтинговых систем, процессов и оценки всех соответствующих параметров риска. Процесс внутренней валидации должен позволять учреждению последовательно и осмысленно оценивать эффективность внутренних рейтингов и систем оценки рисков;

(b) учреждения должны регулярно сравнивать реализованные уровни дефолтов с оценочными PD для каждого класса, и, если фактические уровни дефолтов выходят за пределы ожидаемого диапазона для этого класса, учреждения должны специально анализировать причины отклонения. Учреждения, использующие собственные оценки УД и коэффициентов пересчета, должны также проводить аналогичный анализ для этих оценок.В таких сравнениях должны использоваться исторические данные, охватывающие как можно более длительный период. Учреждение должно документировать методы и данные, использованные в таких сравнениях. Этот анализ и документация должны обновляться не реже одного раза в год;

(c) учреждения также должны использовать другие инструменты количественной проверки и сравнения с соответствующими внешними источниками данных. Анализ должен основываться на данных, которые соответствуют портфелю, регулярно обновляются и охватывают соответствующий период наблюдения. Внутренние оценки Учреждениями эффективности их рейтинговых систем должны основываться на как можно более длительном периоде;

(d) методы и данные, используемые для количественной проверки, должны быть постоянными во времени. Изменения в методах и данных оценки и проверки (как источников данных, так и охватываемых периодов) должны быть задокументированы;

(e) учреждения должны иметь надежные внутренние стандарты для ситуаций, когда отклонения реализованных PD, LGD, коэффициентов пересчета и общих убытков, где используется EL, от ожиданий становятся достаточно значительными, чтобы поставить под сомнение достоверность оценок.Эти стандарты должны учитывать деловые циклы и аналогичную систематическую изменчивость опыта невыполнения обязательств. Если реализованные значения продолжают превышать ожидаемые значения, учреждения должны пересматривать оценки в сторону повышения, чтобы отразить свой опыт дефолтов и убытков;

Тест на антитела к ЦЦП позволяет прогнозировать течение заболевания в течение 3 лет при раннем ревматоидном артрите (Шведский проект TIRA) , С-реактивный белок

  • DAS28, 28 подсчет суставов оценка активности заболевания
  • DMARD, противоревматический препарат, модифицирующий заболевание
  • ИФА, иммуноферментный анализ
  • СОЭ, скорость оседания эритроцитов
  • HAQ, Health Assessment Questionnaire

    4 Global Assessment Questionnaire

  • 4
  • РА, ревматоидный артрит
  • РФ, ревматоидный фактор
  • Помимо болей и функциональных нарушений, ревматоидный артрит (РА) ассоциируется с повышенной коморбидностью и смертностью, в основном за счет ишемической болезни сердца. 1– , 3 Современная стратегия лечения заключается в назначении раннего агрессивного лечения противоревматическими препаратами, модифицирующими заболевание (БМАРП), которые улучшают исход заболевания по сравнению со старым «пирамидным подходом». 4– , 7 Однако оптимизация ранней агрессивной терапии DMARD требует быстрой и точной диагностики, а также информации, имеющей прогностическое значение. Ревматоидный фактор (РФ) широко используется для обеих целей, хотя предоставленная диагностическая и прогностическая информация является спорной. 8, 9 Другие воспалительные состояния и пожилой возраст считаются «факторами риска» ложноположительного RF; сообщалось, что чувствительность диагностики РА составляет 50–80%, а специфичность — 70–80%. 10, 11

    В таких белках, как (про)филаггрин, 12 фибрин, 13 и виментин, 14 антициклический цитруллиновый пептид распознает антитело, модифицированное аргинином (анти-CCP) деиминазы. 15 Anti-CCP принадлежит к семейству аутоантител против филаггрина, сопровождаемых антителами против кератина и антиперинуклеарным фактором. 16 Для выявления антител к ЦЦП разработан коммерческий иммуноферментный анализ (ИФА), содержащий синтетический цитруллинированный пептид. 17 Тест ССР2 второго поколения, который использовался в этом исследовании, оказался столь же специфичным (90–99%), но более чувствительным (66–88%) для РА. 18– , 23 Чрезвычайная диагностическая специфичность анти-ЦЦП для РА ставит вопрос об этиопатогенетической связи.Сравнение прогностического значения RF и анти-CCP, измеренного как рентгенологическое прогрессирование, показало разные результаты, хотя большинство исследований относится к менее чувствительному тесту CCP1. 24– , 26 Мало что было сделано для изучения связи положительности анти-ЦЦП антител и клинического течения заболевания во времени на ранних стадиях РА. Также, насколько нам известно, не были опубликованы последующие результаты по анти-ЦЦП антителам для «сероконверсии» или изменения уровней в сыворотке. Это исследование было проведено для изучения клинических и лабораторных показателей активности заболевания у пациентов с недавно начавшимся РА в отношении серопозитивности на антитела к ЦЦП, а также для изучения изменений уровней анти-ЦЦП между включением в исследование и 3-летним наблюдением.

    ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

    Пациенты и контрольная группа

    Триста двадцать пациентов с ранним РА были включены в проспективную когорту, обозначенную как TIRA (шведская аббревиатура от «раннее вмешательство при ревматоидном артрите») в течение 27 месяцев в 1996-98 гг. 27 В исследовании приняли участие десять ревматологических центров на юго-востоке Швеции. Все пациенты имели продолжительность симптомов не менее 6 недель, но менее 12 месяцев. На момент включения пациенты соответствовали либо четырем из семи критериев Американской коллегии ревматологов (ACR), либо следующим: утренняя скованность ⩾60 минут, симметричный артрит и артрит мелких суставов (пястно-/плюсне-фаланговые суставы/запястья). Образцы сыворотки были доступны для анализа анти-ЦЦП от 242 пациентов с TIRA на момент включения (166 женщин и 76 мужчин, средний возраст 55,1 года) и от 121 через 36 месяцев. Контролем служили образцы сыворотки от 80 здоровых доноров крови (40 женщин, 40 мужчин). Пациентов лечили БПВП, кортикостероидами, нестероидными противовоспалительными препаратами и анальгетиками по усмотрению врача. 27 Двести тридцать пять (97%) пациентов соответствовали четырем или более из семи критериев ACR на момент включения.

    Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и С-реактивный белок плазмы (СРБ) измеряли при включении и через 6, 12, 24 и 36 месяцев. Общая врачебная оценка активности заболевания (PGA) оценивалась без знания статуса анти-CCP по пятибалльной шкале (0–4), где 0 соответствует отсутствию активности, а 4 представляет высокую активность. Всем пациентам рассчитывали 28 баллов активности заболевания суставов (DAS28). 28 Пациенты оценивали функциональные способности с помощью шведской версии Опросника оценки состояния здоровья (HAQ). 29

    Лабораторные анализы

    Антитела к ЦЦП анализировали с помощью ИФА (Immunoscan RA CCP2, Euro-Diagnostica, Арнем, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя. Все сыворотки тестировали в двух повторностях и представляли средние результаты. Сыворотки хранили при -72°С до использования. Пороговое значение для положительной реакции было установлено на уровне 25 ЕД/мл, как было предложено производителем. Вариация внутри анализа составила 13,6% с «сывороткой высокого уровня» (1360 ЕД/мл) и 6,6% с «сывороткой низкого уровня» (79 ЕД/мл), а вариация между анализами составила 10.5% и 7,8% соответственно.

    РФ, агглютинирующий частицы латекса, был проанализирован в лабораториях при больницах по месту жительства. РФ класса IgM и IgA анализировали с помощью ИФА (Autozyme RF IgM и IgA соответственно, Cambridge Life Sciences, Кембридж, Великобритания). Пороговые уровни для RF-тестов были установлены с использованием 95-го центиля эталонного материала 100 здоровых доноров крови. Положительными считались РФ IgM >34 ЕД/мл и РФ IgA >15 ЕД/мл.

    Хрящевой олигомерный белок (COMP) измеряли методом ИФА с захватом (Anamar Medical, Лунд, Швеция).

    Статистический анализ

    Статистический анализ был выполнен с использованием статистического программного обеспечения SPSS. Связь между РФ и анти-ЦЦП (как положительными, так и отрицательными), сравнение частоты результатов анти-ЦЦП в подгруппах пациентов с TIRA и различия в лечении DMARD были проанализированы с помощью точного критерия Фишера. Корреляцию между уровнями анти-ЦЦП-антител и IgM RF, IgA RF и COMP тестировали с использованием коэффициента корреляции Спирмена. U-критерий Манна-Уитни использовали для определения статистических различий между анти-ЦЦП-позитивными и анти-ЦЦП-отрицательными пациентами в СОЭ, СРБ, HAQ, DAS28 и PGA.Разницу между уровнем антител к ЦЦП при включении и через 3 года наблюдения проверяли с помощью парного теста t . Значения p<0,05 считались значимыми.

    Этические соображения

    Пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен локальными комитетами по этике участвующих больниц.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    На рис. 1⇓ показаны результаты определения антител к ЦЦП у пациентов при включении в исследование TIRA и через 3 года, а также у здоровых доноров крови.Для всей группы пациентов с РА чувствительность теста на антитела к ЦЦП составила 64% при включении и 59% через 3 года, разница не была статистически значимой. Рисунок 2⇓ показывает, что доля пациентов с положительным результатом на антитела к ЦЦП увеличивается с увеличением количества критериев ACR. Из 97% пациентов с РА, отвечающих ⩾4/7 классификационным критериям ACR для РА, 67% были анти-ЦЦП положительными на момент включения по сравнению с 25% анти-ЦЦП-позитивными пациентами в оставшихся 3% (p<0,0.05). Лечение DMARD значительно чаще начинали у пациентов с положительным результатом на антитела к ЦЦП на момент включения, чем у пациентов с отрицательным результатом на антитела к ЦЦП. Разница была достоверной на всех визитах в течение исследования. В таблице 1⇓ представлены подробности лечения DMARD и различия в частоте назначений. Примечательно, что хотя лечение DMARD в целом чаще назначалось пациентам с положительным результатом на антитела к ЦЦП, противомалярийные препараты чаще назначались пациентам из группы с отрицательным результатом на антитела к ЦЦП (таблица 1⇓).

    Стол 1

     Доля пациентов (%) с положительным или отрицательным тестом на анти-ЦЦП на исходном уровне в связи с продолжающимся или назначенным лечением во время исследования

    Рисунок 1

     Уровни антител к ЦЦП в популяции TIRA в начале исследования и через 3 года, а также у здоровых доноров крови.

    Рисунок 2

     Частотное распределение количества выполненных критериев классификации РА (ACR 1987) по отношению к доле положительных анти-ЦЦП антител на исходном уровне.**р<0,01; ***р<0,001.

    Через 3 года образцы сыворотки от 96 пациентов были доступны для сравнения с образцами, полученными при включении в исследование. В 18 (19%) случаях уровень антител к ЦЦП повысился >15%, в 34 (35%) снизился >15%, а у 44 (46%) пациентов уровень анти-ЦЦП остался неизменным ±15%. Два из изначально отрицательных пациентов с антителами к ЦЦП (2%) превратились в положительных по антителам к ЦЦП, а в трех случаях (3%) серопозитивные пациенты превратились в отрицательные по антителам.Пациенты, у которых положительный результат изменился на отрицательный, все получали лечение DMARD при включении, тогда как ни одному из двух пациентов, у которых отрицательный результат стал положительным, не назначали DMARD в течение первых 3 месяцев, хотя оба получали DMARD в течение первого года. Средний уровень антител к ЦЦП снизился (p<0,01) на 131 ЕД/мл в течение 3 лет наблюдения (95% доверительный интервал (ДИ) от 34 до 228 ЕД/мл).

    Таблица 2⇓ иллюстрирует результаты тестов на агглютинирующий RF и антитела против CCP соответственно.Чувствительность агглютинирующего RF и анти-CCP составляла 64% (таблица 2⇓). Оба теста были положительными у 50% пациентов (таблица 2⇓). Пациенты с положительным результатом на анти-CCP-антитела имели значительную склонность быть положительным также и на RF (p<0,001). Семьдесят восемь процентов RF-положительных и 40% RF-отрицательных пациентов с TIRA были положительными на антитела к CCP. Не было существенной разницы между полами по результатам аутоантител (данные не показаны).

    Стол 2

     Перекрестная таблица встречаемости антител IgG к ЦЦП и результатов агглютинирующих РФ при недавно начавшемся РА

    Анализ РФ с помощью ИФА показал, что РФ IgM встречается у 74%, РФ IgA – у 72%, а оба изотипа – у 64% пациентов.Коэффициенты корреляции Спирмена для корреляции уровней анти-ЦЦП-антител с IgM RF и IgA RF, соответственно, составляли 0,52 в обоих случаях, но с R 2 <0,1, предполагая, что только несколько точек данных способствовали корреляции.

    На рис. 3⇓ показаны различия между анти-ЦЦП-позитивными и анти-ЦЦП-отрицательными пациентами в показателях активности заболевания (СОЭ, СРБ, DAS28, количество опухших суставов и АПГ), измеренных при включении и через 6, 12, 24 и 36 месяцев наблюдения. СОЭ была значительно выше в анти-ЦЦП-позитивной группе (n = 103), чем в анти-ЦЦП-негативной группе (n = 63) с p<0,05 при включении и через 36 месяцев, p<0,01 через 6, 12 и 24 месяца. месяцы. СРБ был значительно выше у анти-ЦЦП-позитивных пациентов (n = 109), чем в анти-ЦЦП-негативной группе (n = 62) через 6 (p<0,001) и через 12 и 24 месяца (p<0,01). DAS28 был значительно выше в анти-ЦЦП-позитивной группе (n = 86), чем в анти-ЦЦП-негативной (n = 50) через 12 месяцев (p<0,0.05). Показатели PGA были значительно выше среди анти-ЦЦП-позитивных пациентов (n = 88), чем среди анти-ЦЦП-негативных пациентов в начале исследования, а также через 6, 12 и 24 месяца (р<0,05 во всех случаях), тогда как через 36 месяцев разница не достигла достоверности (p = 0,06). Показатели HAQ не показали существенных различий между группами (данные не показаны). Попытки сравнить течение заболевания в течение 3 лет (СОЭ, СРБ, DAS28, количество суставов и АПГ) между подгруппами пациентов с повышающимся, неизмененным и снижающимся уровнем анти-СРБ не дали результатов.

    Рисунок 3

     Измерение активности заболевания в течение 3 лет у пациентов с ранним артритом, у которых на момент постановки диагноза был положительный или отрицательный результат на анти-ЦЦП.

    Различия в показателях активности заболевания между IgM RF или IgA RF положительными и отрицательными пациентами показали ту же тенденцию, что и при анти-CCP. Значительно более высокие показатели активности заболевания были обнаружены у IgM RF-положительных пациентов, чем у IgM RF-отрицательных пациентов для СОЭ через 6 и 12 месяцев (p<0,0.05 и р<0,01 соответственно), а также для СРБ через 6, 12 и 24 мес (р<0,05, <0,01 и <0,05). Не было никаких существенных различий между IgM RF-положительными и отрицательными пациентами для PGA, DAS28 или HAQ. У пациентов с положительным РФ IgA СОЭ была достоверно выше через 6 мес (p<0,05), СРБ через 6 и 12 мес (p<0,01 и p<0,05) и PGA при включении (p<0,01). Не было никаких существенных различий между IgA RF положительными/отрицательными пациентами для DAS28 или HAQ.

    Корреляции между уровнями анти-CCP-антител или RF и концентрацией COMP в сыворотке крови при включении обнаружено не было.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Это исследование подтверждает, что диагностическая чувствительность анти-ЦЦП-антител у пациентов с недавно развившимся РА такая же, как и у агглютинирующего РФ (64% для обоих), и что серопозитивность для двух тестов значительно коррелирует. В недавнем проспективном популяционном исследовании артрита с очень недавним началом (<3 месяцев) мы также смогли подтвердить, что тест анти-ЦЦП имел диагностическую специфичность 96% для РА по сравнению с другими артритами. 30 Доля пациентов с положительным результатом на антитела к ЦЦП увеличивалась параллельно с увеличением числа критериев классификации ACR.Мы также обнаружили, что готовность к назначению БПВП (без знания анти-ЦЦП-статуса) была значительно выше в группе анти-ЦЦП-позитивных пациентов, вероятно, отражая более агрессивное заболевание в этой группе пациентов, чем в группе анти-ЦЦП. Группа, отрицательная по антителам к ССР. Интересно, что, хотя использование БПВП в целом было выше в группе пациентов с положительным результатом на антитела к ЦЦП, использование противомалярийных препаратов в качестве единственного БПВП (что можно рассматривать как «робкую» стратегию БПВП) было более распространенным в группе пациентов. группа пациентов с отрицательным результатом на антитела к ЦЦП.Сходная доля положительных результатов на антитела к ЦЦП была обнаружена через 3 года после постановки диагноза РА (59%) по сравнению с исходным уровнем (64%), но в среднем на значительно сниженном уровне. Однако количество пациентов, не получавших БПВП в течение этих лет, было слишком мало, чтобы оценить какое-либо влияние лечения БПВП на уровни анти-ЦЦП-антител.

    Интересным открытием было то, что положительный результат на антитела к ЦЦП при постановке диагноза предсказывал более высокую активность заболевания в течение 3 последующих лет после недавнего начала РА (рис. 3⇑).Аналогичная тенденция была обнаружена как для IgM RF, так и для IgA RF, хотя и не в одинаковой степени. Несмотря на споры, 8 было заявлено, что РФ IgA, направленная против IgG человека 31, 32 или IgG кролика, 33 , является лучшим предиктором агрессивного течения заболевания при РА, чем РФ IgM, но это не могло быть подтверждены в нашем исследовании. Однако Houssien et al. указали, что IgG кролика является предпочтительным источником антигена. 34

    Динамика шкалы HAQ пациентов не показала существенных различий между серопозитивными/негативными случаями антител к ЦЦП во время исследования.Это может показаться противоречащим важным выводам, связанным с маркерами активности заболевания СОЭ, СРБ, DAS28 и PGA. Однако мы полагаем, что это объясняется тем, что HAQ отражает другой аспект заболевания — функциональную способность. Wolfe и Pincus сообщили, что когда пациенты с ревматоидным артритом длительностью менее 2 лет классифицировались в соответствии с квартилями их СОЭ, эти квартили сохранялись с течением времени. 35 Они предположили, что воспалительная активность «устанавливается» на ранней стадии РА и остается стабильной в течение длительного времени.В свете этого мы находим интересным тот факт, что СОЭ была постоянно выше (как и уровни СРБ и PGA активности заболевания) у пациентов с положительным результатом на антитела к ЦЦП, чем у пациентов с отрицательным результатом на антитела к ЦЦП. В настоящее время общепризнано, что РА следует диагностировать как можно раньше и начинать как можно раньше мощное противоревматическое модифицирующее лечение. 6, 7 Однако в идеале терапевтическая стратегия должна подбираться индивидуально, например, путем различения случаев с легким течением заболевания и хорошим прогнозом от случаев тяжелого заболевания с плохим прогнозом, чтобы избежать чрезмерного лечения потенциально токсичными противоревматическими препаратами. и начать наиболее агрессивное (и дорогостоящее) лечение пациентов, которым это принесет наибольшую пользу. 36 Чтобы определить «нужного пациента для правильной стратегии лечения», необходимы хорошие предикторы. До недавнего времени RF был наиболее известным лабораторным предиктором активности заболевания и прогрессирования эрозивного РА. 37, 38 Недавно описанный анализ антител к ЦЦП уже зарекомендовал себя как чувствительный и высоко специфичный диагностический маркер РА. В нашем исследовании мы также обнаружили, что он лучше, чем РФ, как предиктор активности заболевания в течение 3 лет после постановки диагноза недавнего начала РА.

    Мы пришли к выводу, что статус антител к ЦЦП на момент постановки диагноза раннего РА является ценным предиктором течения заболевания при раннем РА. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить полезность анализа антител к ЦЦП для разработки индивидуальных терапевтических стратегий при раннем РА.

    Благодарности

    Мы благодарим г-жу Илву Биллинг и всех партнеров TIRA в Эскильстуне, Йёнчепинге, Кальмаре, Линдесберге, Линчёпинге, Мотале, Норрчёпинге, Оскарсхамне, Вестервике и Эребру за прекрасное сотрудничество.

    Грантовая поддержка: Шведская ассоциация ревматологов, Медицинский исследовательский совет Юго-Восточной Швеции (FORSS), Шведский исследовательский совет (проект K2003-74VX-14594-01A), Совет графства Эстергётланд, король Густав V, 80 лет Фонд, Национальный совет здравоохранения и социального обеспечения.

    ССЫЛКИ

    1. Pincus T , Callahan LF. Какова естественная история ревматоидного артрита? Rheum Dis Clin North Am1993; 19: 123–51.

    2. Гудсон Н .Ишемическая болезнь сердца и ревматоидный артрит. Curr Opin Rheumatol2002;14:115–20.

    3. Вулф Ф. , Мишо К., Гефеллер О., Чой Х.К. Прогнозирование летальности у больных ревматоидным артритом. Arthritis Rheum2003;48:1530–42.

    4. Буры М . Ревматоидный артрит, лечение раннего заболевания. Rheum Clin Dis North Am2001; 27: 405–14.

    5. Möttönen T , Hannonen P, Korpela M, Nissila M, Kautiainen H, Ilonen J, et al. Отсрочка начала терапии и индукция ремиссии с использованием монотерапии или комбинированной противоревматической лекарственной терапии при раннем ревматоидном артрите. Артрит Реум2002;46:894–8.

    6. Ферстаппен С.М. , Джейкобс Дж.В., Бийлсма Дж.В., Хёркенс А.Х., ван Бума-Франкфорт С., Борг Э.Дж., и др. Пятилетнее наблюдение за пациентами с ревматоидным артритом после раннего лечения противоревматическими препаратами, модифицирующими болезнь, по сравнению с лечением в соответствии с подходом пирамиды в первый год.Артрит Реум2003;48:1797-807.

    7. Эмери П . Доказательства, подтверждающие пользу раннего вмешательства при ревматоидном артрите. Дж. Ревматол, 2002; 66:3–8.

    8. Visser H , Gelinck LB, Kampfraath AH, Breedveld FC, Hazes JM. Диагностическая и прогностическая характеристика иммуноферментного определения ревматоидного фактора при ревматоидном артрите. Энн Реум Дис1996; 55: 157–61.

    9. Schmerling RH , Delblanco TL.Насколько полезен ревматоидный фактор? Анализ чувствительности, специфичности и прогностической ценности. Arch Intern Med1992;152:2417–20.

    10. Гольдбах-Мански Р. , Ли Дж., Маккой А., Хоксворт Дж., Ярборо С., Смолен Дж.С., и др. Аутоантитела, ассоциированные с ревматоидным артритом, у пациентов с недавним синовитом. Артрит Res2000;2:236–43.

    11. Bas S , Genevay S, Meyer O, Gabay C. Диагностические тесты на ревматоидный артрит: сравнение антител к циклическому цитруллинированному пептиду, антител к кератину и ревматоидных факторов IgM.Ревматология (Оксфорд) 2002;41:809–14.

    12. Girbal-Neuhauser E , Durieux JJ, Arnaud M, Dalbon P, Sebbag M, Vincent C, et al. Эпитопы, на которые нацелены связанные с ревматоидным артритом аутоантитела против филаггрина, посттрансляционно генерируются на различных участках (про)филаггрина путем деиминирования остатков аргинина. J Immunol1999;162:585–94.

    13. Masson-Bessiere C , Sebbag M, Girbal-Neuhauser E, Nogueira L, Vincent C, Senshu T, et al. Основными синовиальными мишенями аутоантител против филаггрина, специфичных для ревматоидного артрита, являются деиминированные формы альфа- и бета-цепей фибрина. J Immunol2001;166:4177–84.

    14. Menard HA , Lapointe E, Rochdi MD, Zhou ZJ. Взгляд на ревматоидный артрит, полученный из иммунной системы Са. Артрит Res2000;2:429–32.

    15. Шеллекенс Г.А. , де Йонг Б.А., ван ден Хуген Ф.Х., ван де Путте Л.Б., ван Венройдж В.Дж.Цитруллин является важным компонентом антигенных детерминант, распознаваемых специфическими для ревматоидного артрита аутоантителами. J Clin Invest1998;101:273–81.

    16. Sebbag M , Simon M, Vincent C, Masson-Bessiere C, Girbal E, Durieux JJ, et al. Антиперинуклеарный фактор и так называемые антикератиновые антитела представляют собой одни и те же специфичные для ревматоидного артрита аутоантитела. J Clin Invest1995;95:2672–9.

    17. Шеллекенс Г.А. , Виссер Х., де Йонг Б.А., ван ден Хуген Ф.Х., Хейз Дж.М., Бридвельд Ф.К., и др. Диагностические свойства антител против ревматоидного артрита, распознающих циклический цитруллинированный пептид. Arthritis Rheum2000;43:155–63.

    18. Lee DM , Schur PH. Клиническая польза анализа анти-ЦЦП у пациентов с ревматическими заболеваниями. Энн Реум Дис2003;62:870–4.

    19. Судзуки К. , Савада Т., Мураками А., Мацуи Т., Тома С., Наказоно К., и др. Высокая диагностическая эффективность ИФА для выявления антител к цитруллинированным антигенам при ревматоидном артрите.Scand J Rheumatol 2003;32:197–204.

    20. Васишта А . Диагностика ревматоидного артрита с ранним началом: роль антител к ЦЦП. Am Clin Lab2002; 21:34–6.

    21. Pinheiro GC , Scheinberg MA, Aparecida da Silva M, Maciel S. Антициклические цитруллинированные пептидные антитела при прогрессирующем ревматоидном артрите. Ann Intern Med2003;139:234–5.

    22. Rantapää-Dahlqvist S , de Jong BA, Berglin E, Hallmans G, Wadell G, Stenlund H, et al. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду и IgA ревматоидному фактору позволяют прогнозировать развитие ревматоидного артрита. Артрит Реум2003;48:2741–9.

    23. van Venrooij WJ , Hazes JM, Visser H. Антицитруллиновые антитела к белкам/пептидам и их роль в диагностике и прогнозировании раннего ревматоидного артрита. Neth J Med2002;60:383–8.

    24. Крут Э.Дж. , де Йонг Б.А., ван Леувен М.А., Свинкелс Х., ван ден Хуген Ф. Х., Вант Хоф М., и др. Прогностическое значение антител к циклическому цитруллинированному пептиду у пациентов с недавно возникшим ревматоидным артритом. Arthritis Rheum2000;43:1831–5.

    25. Бухари М. , Лант М., Харрисон Б.Дж., Скотт Д.Г., Симмонс Д.П., Силман А.Дж. Ревматоидный фактор является основным предиктором увеличения тяжести рентгенологических эрозий при ревматоидном артрите: результаты исследования Norfolk Arthritis Register Study, большой начальной когорты. Артрит Реум2002;46:906–12.

    26. Венцовский Дж. , Махачек С., Седова Л., Кафкова Дж., Гаттерова Дж., Песакова В., и др. Аутоантитела могут быть прогностическими маркерами эрозивного заболевания при раннем ревматоидном артрите. Энн Реум Дис2003; 62: 427–30.

    27. Hallert E , Thyberg I, Hass U, Skargren E, Skogh T. Сравнение между женщинами и мужчинами с недавним началом ревматоидного артрита по активности заболевания и функциональной способности в течение двух лет (проект TIRA). Энн Реум Дис2003; 62: 667–70.

    28. Prevoo ML , van’t Hof MA, Kuper HH, van Leeuwen MA, van de Putte LB, van Riel PL.Модифицированные показатели активности заболевания, которые включают двадцать восемь суставов. Разработка и проверка в проспективном лонгитюдном исследовании пациентов с ревматоидным артритом. Артрит Реум1995;38:44–8.

    29. Ekdahl C , Eberhardt K, Andersson SI, Svensson B. Оценка инвалидности у пациентов с ревматоидным артритом. Использование шведской версии Стэнфордского опросника для оценки состояния здоровья. Scand J Rheumatol1988;17:263–71.

    30. Сёдерлин М.К. , Кастбом А., Страндберг Г., Каутиайнен Х., Лейрисало-Репо М., Скох Т.Антитела против циклического цитруллинированного пептида (CCP) и уровни белка олигомерного матрикса хряща (COMP) в связи с активностью заболевания и эрозиями в проспективном популяционном исследовании очень раннего артрита. Scand J Rheumatol 2004;33:185–8.

    31. ван Зебен Д , Хейз Дж.М., Звиндерман А.Х., Кошки А., ван дер Воорт Э.А., Бридвелт ФК. Клиническое значение ревматоидных факторов при раннем ревматоидном артрите: результаты последующего исследования. Энн Реум Дис1992;51:1029–35.

    32. Päi S , Päi L, Birkenfeldt R. Корреляция уровней ревматоидного фактора IgA в сыворотке крови с тяжестью заболевания при ревматоидном артрите. Scand J Rheumatol1998;27:252–6.

    33. Jonsson T , Thorsteinsson J, Kolbeinsson A, Jonasdottir E, Sigufsson N, Vaaldimarsson H. Популяционное исследование важности изотипов ревматоидного фактора у взрослых. Энн Реум Дис1992;51:863–8.

    34. Хуссьен Д.А. , Йонссон Т., Дэвис Э., Скотт Д.Л.Изотипы ревматоидного фактора, активность заболевания и исход ревматоидного артрита: сравнительные эффекты различных антигенов. Scand J Rheumatol1998;27:46–53.

    35. Wolfe F , Pincus T. Уровень воспаления при ревматоидном артрите определяется рано и остается стабильным на протяжении длительного течения болезни. Дж. Ревматол, 2001; 28:1817–24.

    36. Emery P , Marzo H, Proudman S. Ведение пациентов с недавно диагностированным ревматоидным артритом.Ревматология (Оксфорд) 1999; 38 (дополнение 2): 27–31.

    37. Пападопулос И. , Кастимбри П., Катсараки А., Темеконидис Т., Георгиадис А., Дросос А. Клиническое течение и исход раннего ревматоидного артрита. Rheumatol Int2001;20:205–10.

    38. Rau R , Herborn G, Menninger H, Sangha O. Рентгенологические результаты после трех лет лечения пациентов с ранним эрозивным ревматоидным артритом внутримышечным введением метотрексата или парентеральным введением золота.Продление годичного двойного слепого исследования с участием 174 пациентов. Ревматология (Оксфорд) 2002; 41: 196–204.

    Геномный надзор за SARS-CoV-2 отслеживает раннюю межгосударственную передачу линии P.1 и диверсификацию внутри клады P.2 в Бразилии

    Abstract

    Резкий рост числа случаев COVID-19 в конце 2020 года сделал Бразилию новым эпицентром продолжающейся пандемии SARS-CoV-2. Новые вирусные линии P.1 (Variant of Concern Gamma) и P.2, соответственно выявленные в бразильских штатах Амазонас и Рио-де-Жанейро, связаны с потенциально более высокой скоростью передачи и ускользанием нейтрализации антител.В этом исследовании мы выполнили полногеномное секвенирование 185 образцов, выделенных из трех из пяти регионов Бразилии, включая Амазонас (северный регион), Риу-Гранди-ду-Норти, Параиба и Баия (северо-восточный регион) и Рио-де-Жанейро (юго-восточный регион). регион) для мониторинга распространения линий SARS-CoV-2 в Бразилии в первые месяцы 2021 года. Здесь мы показали широкое распространение P.1 и P. 2 по регионам Бразилии и, за исключением Амазонаса, P. 2 была преобладающей родословной, идентифицированной в выборочных состояниях.Мы оценили происхождение линии P.2 в феврале 2020 г. и определили, что она дифференцировалась в новые клады. Межгосударственная передача P.2 была обнаружена с марта, но достигла своего пика в декабре 2020 г. и январе 2021 г. Передача P.1 также была высокой в ​​декабре, и предполагается, что ее происхождение произошло в августе 2020 г. Мы также подтвердили присутствие линии P.7, недавно описанной в самом южном регионе Бразилии, распространилось по северо-восточным штатам.P.1, P.2 и P.7 происходят от древнего штамма B.1.1.28, который доминировал на первой фазе пандемии в Бразилии со штаммом B.1.1.33. Мы также выявили возникновение новой линии, происходящей от B.1.1.33, которая конвергентно несет мутацию E484K, N.9. Действительно, повторяющиеся сообщения о многих новых генетических вариантах SARS-CoV-2 в Бразилии могут быть связаны с отсутствием эффективных мер контроля, что приводит к высокой скорости передачи SARS-CoV2. В целом, наши результаты представили картину критического состояния SARS-CoV-2 в Бразилии и подтвердили необходимость непрерывного секвенирования изолятов SARS-CoV-2 во всем мире для выявления новых представляющих интерес вариантов и мониторинга эффективности вакцины.

    Резюме автора

    С момента своего первого обнаружения в декабре 2019 года SARS-CoV-2 эволюционировал в более чем тысячу признанных линий. Известно, что некоторые из этих линий имеют более высокую трансмиссивность или лучше ускользают от иммунной системы. Одной из них является линейка P.1, также известная как вариант концерна Gamma. Впервые он был обнаружен в Бразилии в декабре 2020 года и быстро заменил предыдущую линию, доминирующую в стране, P.2. Мы использовали геномные данные из образцов SARS-CoV-2, собранных в первые месяцы 2021 года, чтобы проанализировать, как P.1, P.2 и другие линии распространились по Бразилии. Наше исследование показало, что линия P.1 уже присутствовала в нескольких штатах Бразилии почти за два месяца до ее первого обнаружения в штате Амазонас. Наша работа проливает свет на важность постоянного мониторинга линий SARS-CoV-2 в исторически малоизученных регионах для раннего обнаружения и контроля распространения новых вариантов, вызывающих озабоченность.

    Образец цитирования: Lamarca AP, de Almeida LGP, Francisco RdS Jr, Lima LFA, Scotecci KC, Perez VP, et al.(2021) Геномный надзор за SARS-CoV-2 отслеживает раннюю межгосударственную передачу линии P.1 и диверсификацию внутри клады P.2 в Бразилии. PLoS Negl Trop Dis 15(10): e0009835. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835

    Редактор: Colleen B. Jonsson, Центр медицинских наук Университета Теннесси, Медицинский колледж, Мемфис, США

    Получено: 11 марта 2021 г.; Принято: 23 сентября 2021 г .; Опубликовано: 13 октября 2021 г.

    Авторское право: © 2021 Lamarca et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все собранные геномы доступны в базе данных GISAID после регистрации. Идентификаторы доступа указаны в таблице S1. Файлы RAW были депонированы в базе данных NCBI под идентификатором BioProject ID PRJNA752057.

    Финансирование: Эта работа была разработана в рамках Corona-ômica-RJ (FAPERJ = E-26/210.179/2020 http://www.faperj.br/) и Rede Corona-ômica BR MCTI/FINEP (FINEP = 01.20.0029.000462/20 http://www.finep.gov.br/; CNPq = 404096/2020- 4 https://www.gov.br/cnpq/pt-br). A.T.R.V поддерживается Conselho Nacional de Desenvolvimento Scientífico e Tecnológico — CNPq (303170/2017-4) и FAPERJ (E-26/202.903/20). RSFJ получил стипендию для выпускников CNPq. APL получает постдокторскую стипендию (DTI-A) от CNPq. SMBJ был поддержан Ministério da Educação https://www.gov.br/mec/pt-br (UFRN Covid Task Force), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (440893/2016-0) и JBS https:// джбском.бр/. ESS была поддержана Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Paraíba – FAPESQ http://fapesq. rpp.br/ (003/2020) и Laboratorios de Campanha MCTI/FINEP (0494/20 – 01.20.0026.00). L.F.A.L был поддержан Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior https://www.gov.br/capes/pt-br. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Более чем через год после первого случая заражения SARS-CoV-2 в Бразилии страна находится в катастрофической ситуации с 19 миллионами случаев COVID-19 и 550 000 смертей (https://coronavirus.jhu.edu /карта.html). Первоначально доминирующие линии B.1.1.28 и B.1.1.33 [1] были заменены сначала вариантом P.2, а затем новым вариантом концерна P.1 (Гамма) [2–4]. Впервые о P.2 сообщили в ноябре 2020 г. в выборках из штата Рио-де-Жанейро, и, по оценкам, первое отклонение произошло в конце июля [5]. К декабрю 2020 года он уже преобладал в образцах из бразильских штатов Риу-Гранди-ду-Сул-Амазонас и Рио-де-Жанейро [3,6,7]. P.1 был впервые обнаружен в штате Амазонас в середине декабря 2020 г. с предполагаемым появлением примерно в ноябре [3,4]. Обе линии эволюционировали в пределах клады B.1.1.28 и конвергентно несли мутацию E484K в рецептор-связывающем домене (RBD) белка Spike.Помимо E484K, P.1 содержит мутации N501Y и K417T в области RBD. Предполагается, что эти три мутации позволяют SARS-CoV-2 лучше избегать иммунного ответа хозяина [8–10]. Эта гипотеза подтверждается взрывным распространением случаев P.1 по Бразилии и сообщениями о повторном заражении, затрагивающими как линии P.1, так и P.2 [11,12].

    Во время первой фазы пандемии COVID-19 в Бразилии дальние поездки между крупными городскими городами в юго-восточных штатах и ​​менее населенными штатами из северных и северо-восточных регионов сыграли важную роль в резком росте числа случаев заболевания по всей стране [1,13]. ,14].С середины ноября в Бразилии произошел новый всплеск случаев заболевания COVID-19, что привело к установлению границ второй фазы пандемии в стране. Этот резкий рост числа случаев объясняется появлением линии P.1, о которой сообщалось в нескольких городах Бразилии с декабря [15–20]. К сожалению, распространенность родословных и геномное разнообразие до сих пор неизвестны или устарели в нескольких бразильских штатах. Если вышеупомянутые мутации в P.1 и P.2 действительно способствуют ускользанию от иммунного ответа хозяина, эта информация имеет решающее значение для разработки мер по замедлению распространения в национальном и глобальном масштабах.

    Мониторинг линии P.1 в Бразилии в основном осуществляется с помощью скрининга положительной ПЦР с праймерами, нацеленными на мутацию [18,21–23]. Хотя эта стратегия ценна для оценки относительной частоты выбранного варианта в скрининговой популяции, она терпит неудачу, если мутирует мишень праймера. Кроме того, исключительное использование целевого скрининга препятствует мониторингу рассредоточения и распространенности других линий. В этом контексте секвенирование геномов SARS-CoV-2, систематически отобранных из населения, имеет решающее значение для выявления новых вариантов.Чтобы сократить пробел в знаниях о наследственном распределении в Бразилии во время второго всплеска случаев COVID-19, мы провели эпидемиологическое и геномное исследование, секвенировав 185 новых геномов SARS-CoV-2 из трех регионов Бразилии, включая штаты Амазонас (Северная регион), Риу-Гранди-ду-Норти, Параиба, Баия (все три в северо-восточном регионе) и Рио-де-Жанейро (юго-восточный регион). Образцы были собраны в период с декабря 2020 г. по февраль 2021 г.

    Материалы и методы

    Заявление об этике

    Настоящее исследование было одобрено Советом по этике/Бразильской комиссией по этическим исследованиям (Комитет по этике исследований: Федеральный университет Риу-Гранди-ду-Норте — CAAE 36287120.2.0000.5537, CAAE 32049320.3.0000.5537, Universidade Federal Da Paraíba-caae 30658920.4.3004.5183, Универсад, Универсад, Универсад, Универсад Do Rio de janeiro-Caae 30135320. 0.0000.5259 and Universidade ashazeual de santa cruz-caee 39142720.5.0000.5526). Протокол исследования был одобрен без информированного согласия в соответствии с резолюцией 510/2016 Национального совета Бразилии по здравоохранению. Все образцы представляли собой остаточные клинические диагностические образцы COVID-19, деидентифицированные перед получением исследователями.

    Коллекция образцов

    В этой работе было отобрано в общей сложности 185 участников из штатов Амазонас (4), Риу-Гранди-ду-Норти (44), Параиба (43), Баия (58) и Рио-де-Жанейро (36), представляющих север Бразилии, Северо-восточный и юго-восточный регионы.Образцы из Амазонаса) были получены от четырех пациентов, переведенных в Параибу в конце января 2021 года, а образцы из Рио-де-Жанейро, Риу-Гранди-ду-Норти, Параибы и Баии были случайным образом выбраны среди положительных случаев COVID-19. Эти образцы были собраны с 1 декабря 2020 г. по 15 февраля 2021 г. Участники были разделены на 92 мужчины и 93 женщины в возрасте от 11 до 90 лет и со значениями КТ от 8,70 до 29,00 (таблица S1). У каждого участника были взяты мазки из носоглотки, и инфекция SARS-CoV-2 была диагностирована с помощью RT-PCR с использованием протокола CDC/EUA [24], OneStep/COVID-19 (IBMP, Бразилия), Allplex 2019-nCoV (Seegene, Южная Корея) или Наборы nCoVqRT-PCR (Biomanguinhos, Fiocruz, Rio de Janeiro).

    Секвенирование нового поколения и биоинформатический анализ

    Синтез кДНК

    и полногеномную амплификацию вируса проводили в соответствии с протоколом Artic Network (https://artic.network/ncov-2019). Библиотеки ампликонов готовили с использованием набора Nextera DNA Flex (Illumina, США). Секвенирование проводили в системе MiSeq с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, США). Биоинформатический анализ был выполнен с использованием внутреннего конвейера для предварительной обработки данных NGS, вызова вариантов и сборки генома, как описано ранее [5,6,25].Вкратце, мы сначала проверили контроль качества необработанных считанных файлов NGS в формате FASTQ с помощью FastQC (https://www. bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) и удалили некачественные, плохо сформированные и оптические дубликаты. в последовательностях 5′-праймеров с Trimmomatic v0.39 (параметры AVGQUAL = 25 и MINLEN = 100) [26], cutadapt v2.1 и clumpify v38.41 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) соответственно . После этого оставшиеся чтения были сопоставлены с эталонным геномом Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) с использованием BWA v0.7.17 [27]. Файлы BAM, сгенерированные на предыдущем шаге, были отсортированы и проиндексированы с помощью samtools v.1.11 [28]. Мы также использовали GATK v4.1.7.0 для выполнения вызова и фильтрации вариантов [29] и snpEff/SnpSiff v5.0e для аннотации VCF. Затем мы объединили список вариантов, идентифицированных в каждом образце, для создания консенсусных последовательностей с bcftools v.1.9 и bedtools v2.29.2 [30–32]. Необработанные файлы секвенирования и собранные геномы были отправлены в общедоступные базы данных NCBI и GISAID (идентификатор биопроекта NCBI: PRJNA752057, таблица S1)

    .

    Филогенетические анализы

    Эволюционное положение вновь секвенированных геномов было установлено с использованием 1441 последовательности из Бразилии и 70 из других стран, все они были получены из базы данных GISAID 25 февраля 2021 года.Бразильские фоновые последовательности были выбраны в соответствии со стратегией, описанной Paiva et al. [33]. Мы модифицировали этот протокол, кластеризовав выровненные последовательности со сходством 0,99985 с CD-попаданием [34], сохранив только самые старые записи каждого кластера и убрав ограничения по странам. Глобальные последовательности были добавлены путем выбора последовательности с самой старой датой отбора проб в GISAID для каждой линии, найденной в бразильском фоновом наборе данных. Затем в качестве внешней группы была добавлена ​​последовательность генома из образца Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2).Все этапы выравнивания последовательностей проводились с использованием MAFFT с параметрами —auto и —addfragments [35]. Мы использовали IQ-TREE2 [16], чтобы сделать вывод о филогении окончательного выравнивания. Модель замены GTR+F+I была выбрана с помощью ModelFinder [36] с использованием глобальных последовательностей в качестве показателя геномного разнообразия в пределах большего выравнивания. Поддержка клады оценивалась с использованием 1000 повторов начальной загрузки. Чтобы подтвердить монофилию клад P.7 и N.9, мы также реконструировали их филогении с расширенным набором данных, чтобы включить все доступные последовательности в GISAID, которые имеют их характерные мутации.Модели замещения для этих реконструкций представляли собой GTR+F+I для клады P.7 и TIM2+F+I для N.9, обе также выбраны с помощью ModelFinder в IQ-TREE2.

    Мы извлекли клады P.1 и P.2 из полной филогении максимального правдоподобия, чтобы сделать вывод о датах расхождения и пространственной дисперсии предков обеих линий с помощью BEAST v1.10.4 [37]. После оценки с помощью TempEst [38] корреляции между расстояниями от корня до кончика и датами выборки (рис. S1) мы выбрали модель строгих часов на дату P.1 расходимость и логнормальные некоррелированные часы для P. 2 [39]. Модели, используемые в обоих анализах, представляли собой расслабленное случайное блуждание Коши для географических координат [40,41], модель замещения GTR+F+I и экспоненциальное срастающееся дерево априорного роста. Все модели использовались с параметрами по умолчанию. MCMC выполнялся через 10 000 000 шагов с выборкой каждые 10 000 и 10% выжиганием апостериорных результатов. Мы извлекли координаты местоположения предков, используя пакет SERAPHIM [42] в программном обеспечении R. Данные векторной и растровой карты, используемые для построения маршрутов расселения, были получены от Natural Earth с использованием пакета R rnaturalearth , и их можно найти на https://naturalearth.s3.amazonaws.com/10m_culture/ne_10m_admin_1_states_provinces.zip.

    Чтобы учесть влияние систематической ошибки выборки в разных штатах Бразилии на вывод о путях расселения, мы создали десять повторов предыдущих анализов путем повторной выборки доступных P.2 (новые n = 150) и P. 1 (50). ) геномы, взвешенные по соотношению между количеством случаев в каждом штате и количеством доступных геномов в GISAID из каждого штата. Поскольку мы использовали только внутригрупповые последовательности, строгая модель часов использовалась для обоих наборов данных, чтобы сделать вывод о датах их расхождения.За исключением этой разницы, байесовский анализ проводился с той же моделью и параметрами, которые были описаны ранее.

    Результаты

    185 новых секвенированных геномов были отнесены к 11 различным линиям (рис. 1 и S2), причем большинство из них принадлежало линиям P.1 (15,68%) и P.2 (64,32%). Другими обнаруженными линиями были B.1.1.143 (4,32%), B.1.1.33 (3,24%), B.1.1.28 (2,70%), B.1.1.29 (2,70%), P.7 (2,16%). ), Б.1 (1,62%), Н.9 (1,08%), Б.1.1.306 (0,54%), Б.1.1.314 (0,54%), Б.1.1.34 (0,54%) и Б.1,212 (0,54%). Относительная частота родословных внутри штата показала, что P.2 была наиболее распространенной родословной в северо-восточных и юго-восточных регионах (рис. S3). Среди северо-восточных штатов Риу-Гранди-ду-Норти продемонстрировал наибольшую распространенность линии P1 (34,1% полученных последовательностей). Принимая во внимание, что в соседнем штате Параиба P.2 была наиболее частой линией (51,2% в этом исследовании) с конца ноября 2020 г. [9], а P1 была зарегистрирована только в начале января 2021 г. (9,3%). Три линии описываются впервые в государстве (Б.1.1.29, В.1.1.34 и В.1.212).

    Рис. 1. Филогенез 1696 геномов SARS-CoV-2.

    Новые секвенированные образцы обозначены черной точкой на конце, а линии P.1 и P.2 обозначены изогнутыми полосами. В частности, клада N.9 произошла от B.1.1.33 (синие ветви в большем дереве), а клада P.7 произошла от B.1.1.28 (зеленая). Цвета небольших деревьев указывают на штат Бразилии, в котором были собраны образцы (AM: Амазонас, BA: Баия, PA: Пара, PB: Параиба, PI: Пиауи, RJ: Рио-де-Жанейро, RN: Риу-Гранди-ду-Норти, RS: Риу-Гранди-ду-Сул, SP: Сан-Паулу).Ящики под деревьями содержат характерные мутации каждой линии.

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.g001

    Мы идентифицировали 794 однонуклеотидных варианта (SNV) в 185 секвенированных геномах, из которых 49% были миссенс-заменами, 45% синонимами и 6% в некодирующие области генома (S4 рис.). Мы обнаружили три нонсенс-мутации в ORF8 (n = 2) и ORF7a (n = 1) в геномах из Рио-де-Жанейро, Риу-Гранди-ду-Норти и Параиба.Мы наблюдали повышенное накопление мутаций в 3’UTR генома, в основном нацеленных на ORF3 (субъединицы a, c и d), ORF9 (b и c), ORF8 и ORF7a (таблица S2). Белок нуклеокапсида (N) и субъединица S1 белка Spike показали наибольшее накопление среди структурных белков генома SARS-CoV-2. Мы обнаружили 16 SNV, нацеленных на рецептор-связывающий домен (RBD) в S1, восемь из которых были миссенс-вариантами, включая K417T, N439K, L452R, S477R, E484K, N501Y, L518I, A522V.

    Недавно секвенированный образец из штата Рио-де-Жанейро был обнаружен как первая дивергенция внутри P.1 линия (рис. 2А). Примечательно, что в этом геноме обнаружены следы промежуточной эволюции между B. 1.1.28 и P.1, содержащие 13 из 15 определяющих родословную мутаций согласно Панго (https://cov-lineages.org/global_report_P.1.html). . Мы не наблюдали двух мутаций (T20N, E92K), характерных для клады P.1. Эволюционное положение этого нового образца было подтверждено повторением филогенетического анализа вывода с более высокой выборкой P.1 и получением тех же результатов, которые описаны здесь. Это недавно наблюдаемое расхождение сближает предполагаемое происхождение P.1 до середины августа 2020 г. Соответственно, межгосударственное расселение начинается в сентябре, когда P.1 покидает штат Амазонас в северо-восточные штаты Риу-Гранди-ду-Норте и Параиба (рис. 2B). Расхождение между ранее секвенированным P.1 произойдет в середине октября, что приведет к наиболее распространенному варианту. К ноябрю эта линия уже была широко распространена по стране, передача произошла в нескольких штатах, включая реинтродукции из Риу-Гранди-ду-Норти в Амазонас. Передача между штатами достигает своего пика в декабре, с новыми маршрутами рассредоточения и обслуживанием старых. Повторная выборка проанализированных последовательностей восстанавливает маршруты, аналогичные полученным для всего набора данных (S5 Fig).

    Рис. 2.

    Время расхождения внутри линии P.1 (A) и пути ее расселения (B) . Цвета вершин дерева указывают на происхождение образцов P.1 (AM: Амазонас, BA: Баия, GO: Гояс, PB: Параиба, RJ: Рио-де-Жанейро, RN: Риу-Гранди-ду-Норти, RR: Рорайма, RS : Rio Grande do Sul, SP: São Paulo), а подсказки без точки — это последовательности из других родословных.Цвета стрелок на карте указывают дату начала каждого маршрута передачи между штатами. Данные векторной и растровой карты были получены из Natural Earth, и их можно найти по адресу https://naturalearth.s3.amazonaws.com/10m_culture/ne_10m_admin_1_states_provinces.zip).

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.g002

    Хотя последовательности P.1 очень похожи из-за их недавнего происхождения, мы наблюдали четкую эволюционную дифференциацию внутри линии P. 2. По оценкам, первая диверсификация внутри клады произошла в конце февраля, и линия не сообщалась до декабря [2], что привело к неконтролируемой передаче по стране (рис. 2B).Первая интродукция происходит одновременно в Сан-Паулу и Рио-де-Жанейро, после чего происходит передача в самый южный штат Бразилии Риу-Гранди-ду-Сул. С этого момента между штатами наблюдается множество путей расселения. Отражая поведение P.1, межгосударственная передача P.2 также была наиболее интенсивной в декабре и продолжалась до января 2021 года. И снова повторная выборка последовательностей привела к маршрутам, аналогичным тем, которые были выведены с помощью полного набора данных (рис. S5).

    Мы идентифицировали монофилетическую кладу из 15 последовательностей, содержащих характерные мутации линии N.9, включая мутацию E484K. Чтобы подтвердить его монофилию, мы реконструировали филогению этой клады, дополнительно увеличив выборку последовательностей N.9, чтобы она содержала все геномы с E484K, доступные в GISAID (рис. 1). Все эти дополнительные образцы попадают в описанную кладу. Таким образом, монофилия группы не была нарушена ни обширной выборкой внешней группы B.1.1.33, используемой на более крупном дереве (бутстрап-поддержка 64%), ни увеличением предполагаемой внутренней группы (86%). Также следует отметить, что одним из недавно секвенированных образцов от Bahia до этой клады является единственный B.1.1.306, описанный в этой работе, и, кроме того, несет в себе ранее неописанную мутацию N501Y в этой линии. Мы предположили, что эта новая комбинация мутаций в B.1.1.33 может быть связана с неправильной классификацией этого образца Pango. Мы также подтвердили монофилетический статус (99% бутстрап-поддержки) предложенной линии P.7 [6], которая произошла от B.1.1.28 в самом южном штате Бразилии и теперь также распространена в северо-восточном регионе. Этот результат снова был восстановлен даже после увеличения групповой выборки с дополнительными последовательностями, доступными в GISAID.Наконец, мы сообщаем о появлении единственного образца из штата Риу-Гранди-ду-Норти, классифицированного как B. 1.1.29, который содержит как E484K, так и N429K, нехарактерные мутации в родословной.

    Обсуждение

    Продолжающийся всплеск SARS-CoV-2 в Бразилии с конца 2020 года превратил страну в эпицентр очень быстрого распространения новых вариантов [3,4]. В настоящей работе мы провели геномное наблюдение за распространением и эволюцией SARS-CoV-2 в регионах Бразилии, где выборка исторически была недостаточной.Мы реконструировали прошлые пути передачи между штатами через Бразилию с помощью филодинамического анализа линий P.1 и P.2. Мы также сделали вывод о происхождении P.1, который, как предполагается, стал причиной резкого повторного всплеска случаев COVID-19 [43], произошедшего примерно в августе. Напротив, филогенетический анализ P.2 показывает, что линия возникла в феврале 2020 г., когда вирус был впервые зарегистрирован в стране, и эволюционирует в дифференцированные клады.

    Наше геномное наблюдение оценило частоту родословных, циркулирующих в настоящее время в каждом штате выборки. Как и ожидалось, близость к штату Амазонас, по-видимому, коррелирует с распространенностью линии P.1, о чем свидетельствуют различия, наблюдаемые между Риу-Гранди-ду-Норти, Параиба и Рио-де-Жанейро. Относительно низкая частота P.1 и высокая частота P.2 в нашей выборке с юга штата Баия, региона, удаленного от крупных аэропортов, могут пролить свет на гораздо более сложную связь между путешествиями и вирусной динамикой, а не чувство вины по ассоциации (т. е. простое соседство). Действительно, предыдущие работы предполагают, что распространение вируса в небольших или отдаленных городах может происходить по принципу «первым пришел — первым получил», когда одна линия опережает население [44–46].За пределами городов южной Баии это можно увидеть на Амазонасе, где все четыре образца были из линии P.1. Низкое вирусное разнообразие снижает вероятность рекомбинации между линиями во время коинфекции, что может привести к новым комбинациям мутаций и более агрессивным вариантам [6]. Эти результаты подчеркивают важность местных и международных ограничений на поездки в качестве превентивной меры для замедления распространения вируса [47], меры, которые до сих пор не применяются в Бразилии и многих других странах. В качестве альтернативы такие меры, как социальное дистанцирование и раннее выявление более патогенных вариантов, могли бы ограничить распространение P.1 и P.2 по штатам и разгрузить систему общественного здравоохранения [48–50].

    Некоторые линии, проанализированные в этой работе, требуют внимания из-за их эволюционной динамики. Во-первых, мы заметили, что линия P.2 дифференцировалась в несколько субкладов в период с апреля по сентябрь 2020 года (рис. 3), все из которых присутствуют во многих штатах. Появление субкладов P.2 на практике означает, что ожидаемый эволюционный курс для этих субкладов состоит в том, чтобы развиться в совершенно новые линии с исключительными мутациями.Если не контролировать, эпидемиологические параметры, такие как скорость передачи, летальность и уклонение от иммунного ответа, могут варьироваться в пределах линии, что затрудняет ее сдерживание [51]. Во-вторых, мы подтвердили распространение с декабря P.7 [6] на Параибу и штаты Баия, возможно, из Риу-Гранди-ду-Сул. Мало того, что он пересек континентальное расстояние, но P.7 также был обнаружен в Англии, Японии и Нидерландах. Необходимо срочно провести более тщательный отбор проб и изучить прошлые и настоящие пути передачи, чтобы остановить дальнейшее распространение.

    Рис. 3.

    Время расхождения внутри линии P.2 (A) и пути ее расселения (B) . Цвета вершин дерева указывают на происхождение образцов P.2 (AL: Алагоас, AM: Амасонас, AP: Амапа, BA: Баия, CE: Сеара, DF: Федеральный округ, GO: Гояс, PA: Пара, PB : Параиба, PR: Парана, RJ: Рио-де-Жанейро, RN: Риу-Гранди-ду-Норти, RS: Риу-Гранди-ду-Сул, SP: Сан-Паулу, TO: Токантинс), в то время как подсказки без точки являются последовательностями из других родословных. Цвета стрелок на карте указывают дату начала каждого маршрута передачи между штатами.Данные векторной и растровой карты были получены из Natural Earth, и их можно найти по адресу https://naturalearth.s3.amazonaws.com/10m_culture/ne_10m_admin_1_states_provinces. zip.

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.g003

    Также было продемонстрировано появление линии N.9, происходящей от B.1.1.33, на северо-востоке Бразилии. Согласно нашему эволюционному выводу, эта линия могла возникнуть в Рио-де-Жанейро и распространиться по Бразилии. Этот вариант также был обнаружен в образцах из США, Ирландии и Сингапура.Примечательно, что мы наблюдали конвергентное появление мутации E484K в этой новой кладе. Эта мутация была впервые обнаружена в последовательностях B.1.351 из Южной Африки [52], но в настоящее время независимо появилась в нескольких глобальных линиях, включая P.1 и P.2 [3–5]. Другим примером конвергентной эволюции является единственная последовательность, классифицированная как B.1.1.306, которая несет не только мутацию E484K, унаследованную от N.9, но и вариант N501Y гена белка Spike. Мутация N501Y была впервые обнаружена у B.1.1.7 в Соединенном Королевстве [53] и недавно обнаруженный в линии P.1 [3,4]. Наконец, третье недавно обнаруженное конвергентное событие, описанное в этой работе, — это варианты E484K и N439K в образце B. 1.1.29 из Риу-Гранди-ду-Норти. Мутация N439K также была впервые обнаружена в образцах B.1.1.7 из Соединенного Королевства.

    Конвергентные мутации, по-видимому, играют важную роль в эволюционной динамике SARS-CoV-2. Интенсивное избирательное давление со стороны иммунной системы против длительных инфекций может способствовать развитию внутрихозяинных вариантов с более высокой адаптивной ценностью [25, 54–58].Предыдущие исследования показали, что как N501Y, так и E484K независимо возникают у пациентов с персистирующей инфекцией [54,59]. Действительно, все вышеупомянутые конвергентные мутации каким-то образом связаны с ускользанием вируса от ответа иммунной системы: N439K показал, что ускользает от иммунного ответа как от поликлональных, так и от моноклональных антител [60,61]; E484K был связан с уклонением как от вакцин, так и от предыдущих инфекций [2, 10, 62–64]; и N501Y приводит к повышенной специфичности связывания с рецептором и ассоциируется с высокой трансмиссивностью, а также избеганием иммунного ответа [65,66]. В целом, комбинация этих мутаций повышает приспособленность варианта еще выше и увеличивает вероятность того, что вариантная последовательность станет новой и доминирующей линией [65]. Непрерывный мониторинг описанных здесь конвергентных последовательностей имеет основополагающее значение для отслеживания их развития и предотвращения распространения в наихудшем сценарии.

    Внедрение подходящих подходов к геномному надзору путем секвенирования образцов, отобранных случайным образом из ПЦР-положительных тестов, является мощным инструментом для мониторинга известных и новых вариантов по всей стране.Он может служить ориентиром для разработки эффективной государственной политики, которая позволит избежать коллапса национальной системы здравоохранения, как это произошло в Бразилии в первые месяцы 2021 года. Методы целевого скрининга и случайной выборки дополняют друг друга и соответствуют адекватной оценке текущего статуса пандемии. . Следует отметить, что проводимый здесь анализ в значительной степени зависит от выборки широкой последовательности как во времени, так и в пространстве, что требует как технической, так и кадровой подготовки. Следовательно, геномный надзор осуществляется лишь несколькими лабораториями, что намного меньше, чем необходимо для эффективного охвата страны континентального размера, такой как Бразилия.Это вызывает смещение пространственной выборки, которое удаляет части исторической головоломки, состоящей в реконструкции путей расселения. Более того, недопредставленные государства расположены в исторически недофинансированных регионах, примером которых являются Север и Северо-Восток. Научное сотрудничество, подобное тому, которое проводится здесь, позволяет обойти региональные барьеры, чтобы отслеживать продвижение новых и известных родословных в разных штатах и ​​стимулировать комплексный анализ состояния пандемии в стране в целом.К сожалению, Бразилия стала лабораторией под открытым небом для появления и быстрого распространения новых вариантов SARS-CoV-2. Общенациональный геномный надзор является важным шагом к лучшему пониманию происхождения и распространения новых линий.

    Вспомогательная информация

    S1 Рис.

    Корреляция между расстоянием от корня до кончика и датами выборки последовательности.

    Образцы линии P.1 (красные) развивались в соответствии с той же динамикой часов, что и последовательности внешних групп (черные), тогда как P.2 (синие) не подчиняются строгой модели часов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.s001

    (TIF)

    S3 Рис. Распространенность линий SARS-CoV-2 в штатах Бразилии.

    Гистограмма, показывающая относительную частоту 13 родословных, обнаруженных в этом исследовании, в Амазонасе (северный регион), Риу-Гранди-ду-Норти, Параиба, Баия (все три в северо-восточном регионе) и Рио-де-Жанейро (юго-восточный регион).

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.s003

    (TIF)

    S4 Рис. Геномная характеристика выявленных мутаций SARS-CoV-2.

    Распределение однонуклеотидных вариантов (SNV), обнаруженных в 185 геномах, секвенированных в этом исследовании. Каждая вертикальная линия представляет относительную частоту вариантов в общем числе секвенированных геномов и их целевых белковых продуктов. Рецептор-связывающий домен (RBD), выделенный красным цветом, показывает основные мутации, связанные с P.2 и вызывающим озабоченность вариантом P.1. График плотности показывает накопление мутаций в геноме SARS-CoV-2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009835.s004

    (ТИФ)

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить всех авторов и администраторов базы данных GISAID, позволивших правильно провести это геномно-эпидемиологическое исследование. Полный список подтверждений доступен в таблице S3. Ниже приводится список лиц из разных учреждений, принявших участие в этом исследовании:

    .

    Члены рабочей группы

    ЛАБИМОЛ/ЭНДЕМИЯС/УФПБ

    Алиссон Эманнуэль Франко Алвес, Ана Беатрис Родригес душ Сантуш, Брена Феррейра душ Сантуш, Бруно Энрике Андраде Гальвао, Даниэла Летисия Торрес да Силва, Фабио Марсель да Силва Сантуш, Фабрин Фелипе Иларио, Габриэль Родригес Мартинс де Фрейтас, Марилия Габриэла душ Сантуш Кавальканти, Маяра Карла душ Сантуш Нуньес, Мойзес Данташ Карташо де Абреу Перейра, Наиара Найана Дехани, Сандрелли Меридиана де Фатима Рамос душ Сантуш Медейрос, Серхио Диаш да Кошта Жуниор, Талита Наяра Безерра Линс, Уоллес Фелипе Блоэм Пессоа

    ЛАФЕМ/УЭСК

    Милен де Мело Силва, Ренато Фонтана, Рената Сантьяго Альберто Карлос, Галилеу Барбоза Коста, Хллитчайкра Феррас Фельберг, Аманда Тейшейра Сампайо Лопес, Ирис Терезинья Сантос де Сантана, Фабрицио Барбоса Феррейра, Лучано Кардозу Сантос, Луан Этьен Баррето, Перола Родригес душ Сантуш, Лайне Лопес Силва де Хесус, Тьяго Силва Гонсалвеш, Габриэла Андраде Коэльо Диас

    ПОЛИКЛИНИКА PIQUET CARNEIRO/UERJ

    Кеннеди Мартинс Кирк, Клаудия Энрике да Коста, Рожерио Руфино, Клаудия Энрике да Коста, Рената Саллес Миральди Оливейра, Габриэлла да Силва Алвеш, Аллан Мотта Леал Понтес, Сандра Перейра С. Вилас Боаш, Вания Мария Алмейда де Соуза, Винисиус Миранда Порту, Жан де Соуза Ногейра.

    ДАКТ/КЦС/ЦБ/ИМТ/УФРН

    Игорь де Фариас Домингос, Антония Клаудия Х. Камара, Иванис М. Моретти Ребекки, Ана Клаудия Г. Фрейре, Марсела А. Гальван Урураи, Вивиан Н. Силбигер, Андре Д. Лучесси, Антонньо П.Д. Лима, Тиала С.Ж. да Силва Паренте, Карлос Р. ду Насименту Бриту, Катя Кастаньо Скортеччи, Сусана М. Гомеш Морейра, Даниэлла Р.А. Мартинс Салха, Леонардо К. Феррейра, Валеска Р.Д.Б. Медейрос, Дайсе Сантос Ариматея, Артур Р. де Араужо Оливейра, Фернанда М. де Азеведу, Жоао Ф. Родригес Нету, Глория Регина де Гуаш Монтейро, Паулу Рикардо П. ду Насименту, Ингрид Камара Мораис, Франсиско Паулу Фрейре Нету, Элиана Л. Томаш Насименту, Яра Маркес Медейрос, Ана Рафаэла де Соуза Тимотео.

    LNCC/MCTI

    Лучан Приоли Чапина, Ранхель Селсо Соуза, Эллен душ Сантуш Корреа, Гильерме Корденонси да Фонсека, Винисиус Прата Клох, Эдуардо Вагнер.

    Каталожные номера

    1. 1. Кандидо Д.С., Кларо И.М., де Хесус Дж.Г., Соуза В.М., Морейра Ф.Р.Р., Делликур С. и др. Эволюция и эпидемическое распространение SARS-CoV-2 в Бразилии. Наука. 2020; 369: 1255–1260. пмид:32703910
    2. 2. Voloch CM, da Silva Francisco R Jr, de Almeida LGP, Cardoso CC, Brustolini OJ, Gerber AL, et al. Геномная характеристика новой линии SARS-CoV-2 из Рио-де-Жанейро, Бразилия. Дж Вирол. 2021. пмид:33649194
    3. 3. Фариа Н.Р., Меллан Т.А., Уиттакер С., Кларо И.М., Кандидо Д. да С., Мишра С. и др.Геномика и эпидемиология линии P.1 SARS-CoV-2 в Манаусе, Бразилия. Наука. 2021; 372: 815–821. пмид:33853970
    4. 4. Навека Ф.Г., Насименто В., де Соуза В.К., Корадо А. де Л., Насименто Ф., Силва Г. и др. COVID-19 в Амазонасе, Бразилия, был вызван сохранением эндемичных линий и появлением P.1. Нат Мед. 2021; 27: 1230–1238. пмид:34035535
    5. 5. Voloch CM, da Silva Francisco R Jr, de Almeida LGP, Cardoso CC, Brustolini OJ, Gerber AL, et al. Геномная характеристика новой линии SARS-CoV-2 из Рио-де-Жанейро, Бразилия.Дж Вирол. 2021. пмид:33649194
    6. 6. Франсиско Р да С младший, Бенитес Л.Ф., Ламарка А.П., де Алмейда ЛГП, Хансен А.В., Гуларте Дж.С. и др. Повсеместная передача E484K и появление VUI-NP13L с признаками коинфекции SARS-CoV-2 двумя разными линиями в Риу-Гранди-ду-Сул, Бразилия. Вирус Рез. 2021;296:198345. pmid:33631222
    7. 7. Франсиско Джуниор Р да С, Ламарка А.П., де Алмейда ЛГП, Кавальканте Л., Мачадо Д.Т., Мартинс Ю. и др. Оборот линий SARS-CoV-2 сформировал пандемию и способствовал появлению новых вариантов в штате Рио-де-Жанейро, Бразилия.bioRxiv. medRxiv; 2021.
    8. 8. Vasques Nonaka CK, Miranda Franco M, Gräf T, Almeida Mendes AV, Santana de Aguiar R, Giovanetti M, et al. Геномные доказательства случая повторного заражения SARS-CoV-2 с шипообразной мутацией E484K в Бразилии. Препринты. 2021.
    9. 9. Resende PC, Bezerra JF, de Vasconcelos RHT, Arantes I, Appolinario L, Mendonça AC, et al. Мутация Spike E484K в первом случае повторного заражения SARS-CoV-2, подтвержденном в Бразилии, 2020 г. В: Вирусологический [Интернет].10 января 2021 г. [по состоянию на 8 марта 2021 г.]. Доступно: https://virological.org/t/spike-e484k-mutation-in-the-first-sars-cov-2-reinfection-case-confirmed-in-brazil-2020/584
    10. 10. Greaney AJ, Starr TN, Gilchuk P, Zost SJ, Binshtein E, Loes AN, et al. Полное картирование мутаций в домене связывания спайкового рецептора SARS-CoV-2, которые не распознаются антителами. Клеточный микроб-хозяин. 2021;29: 44–57.e9. пмид:33259788
    11. 11. Nonaka CKV, Franco MM, Gräf T, de Lorenzo Barcia CA, de Ávila Mendonça RN, de Sousa KAF и другие.Геномные доказательства реинфекции SARS-CoV-2 с участием мутации E484K Spike, Бразилия. Эмердж Инфекция Дис. 2021; 27: 1522–1524. пмид:33605869
    12. 12. Навека Ф., Коста С. да, Насименто В., Соуза В., Корадо А., Насименто Ф. и др. Три случая повторного заражения SARS-CoV-2 новым вызывающим беспокойство вариантом (VOC) P. 1/501Y.V3. Исследовательская площадь. Исследовательская площадь; 2021.
    13. 13. Николелис МАЛ, Раймундо РЛГ, Пейшото П.С., Андреацци К.С. Влияние городов-суперраспространителей, автомагистралей и доступности интенсивной терапии на ранних стадиях эпидемии COVID-19 в Бразилии.Sci Rep. 2021;11: 13001. pmid:34155241
    14. 14. Рибейро С.П., Кастро Э. Силва А., Даттило В., Рейс А.Б., Гоэс-Нето А., Алькантара Л.С.Дж. и др. Строгий санитарный контроль в аэропортах может замедлить распространение пандемии COVID-19 в Бразилии. Пир Дж. 2020;8: e9446. пмид:32617196
    15. 15. Мартинс А.Ф., Заваски А.П., Винк П.Л., Вольпато Ф.Ц.З., Монтейро Ф.Л., Россет С. и др. Обнаружение линии SARS-CoV-2 P.1 у пациентов из региона с экспоненциально растущим уровнем госпитализации, февраль 2021 г., Риу-Гранди-ду-Сул, Южная Бразилия.Евронаблюдение. 2021;26. пмид:33769251
    16. 16. Salvato RS, Gregianini TS, Campos AAS, Crescente LV, Vallandro MJ, Ranieri TMS и другие. Эпидемиологическое расследование выявило локальную передачу SARS-CoV-2 линии P.1 в Южной Бразилии. Исследовательская площадь. Исследовательская площадь; 2021.
    17. 17. de Siqueira IC, Camelier AA, Maciel EAP, Nonaka CKV, Neves MCLC, Macêdo YSF и др. Раннее обнаружение варианта P.1 SARS-CoV-2 в группе случаев в Сальвадоре, Бразилия.Int J Infect Dis. 2021; 108: 252–255. пмид:33989776
    18. 18. Адамоски Д., де Оливейра Дж. К., Бонатто А. С., Вассем Р., Ногейра М. Б., Рабони С. М. и др. Крупномасштабный скрининг бессимптомных пациентов на вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 и быстрое поглощение P.1, Куритиба, Бразилия. bioRxiv. medRxiv; 2021.
    19. 19. Barbosa GR, Leão Moreira LV, Oliveira Justo AF, Perosa AH, Cunha Chaves AP, Bueno MS, et al. Быстрое распространение и сильное воздействие вызывающего озабоченность варианта P.1 в крупнейшем городе Бразилии.bioRxiv. medRxiv; 2021. пмид:33865897
    20. 20. Тоста С., Джованетти М., Брандао Нарди В., де Оливейра да Силва Л.Р., Гомес МКА, Лима Х.Г. и др. Раннее геномное обнаружение варианта P.1 SARS-CoV-2 на северо-востоке Бразилии. medRxiv; 2021. пмид:34280196
    21. 21. Навека Ф., Насименто В., Соуза В., Корадо А., Насименто Ф., Силва Г. и др. Эпидемия COVID-19 в бразильском штате Амазонас была вызвана долгосрочным сохранением эндемичных линий SARS-CoV-2 и недавним появлением нового вызывающего беспокойство варианта P.1. Площадь Исследований. Исследовательская площадь; 2021.
    22. 22. Vogels CBF, Breban MI, Ott IM, Alpert T, Petrone ME, Watkins AE, et al. Мультиплексная ПЦР различает вызывающие озабоченность варианты для усиления глобального эпиднадзора за SARS-CoV-2. PLoS биол. 2021;19: e3001236. пмид:33961632
    23. 23. Лопес-Ринкон А., Перес-Ромеро К.А., Тонда А., Мендоса-Мальдонадо Л., Клаассен Э., Гарссен Дж. и др. Разработка специальных наборов праймеров для обнаружения B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2 и B.1.1,519 вариантов SARS-CoV-2 с использованием искусственного интеллекта. bioRxiv. 2021. с. 2021.01.20.427043.
    24. 24. CDC. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Диагностическая панель RT-PCR в реальном времени. В: FDA [Интернет]. 2020 [по состоянию на 10 марта 2021 г.]. Доступно: https://www.fda.gov/media/134922/download
    25. 25. Voloch CM, da Silva FR, de Almeida LGP, Brustolini OJ, Cardoso CC, Gerber AL, et al. Эволюция внутри хозяина во время персистирующей инфекции SARS-CoV-2. medRxiv. 2020; 2020.13.11.20231217.
    26. 26. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательности Illumina. Биоинформатика. 2014;30: 2114–2120. пмид:24695404
    27. 27. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное выравнивание коротких считываний с преобразованием Берроуза-Уилера. Биоинформатика. 2009; 25: 1754–1760. пмид:19451168
    28. 28. Ли Х., Хэндсакер Б., Высокер А., Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н. и др. Формат Sequence Alignment/Map и SAMtools. Биоинформатика.2009; 25: 2078–2079. пмид:19505943
    29. 29. ДеПристо М.А., Бэнкс Э., Поплин Р., Гаримелла К.В., Магуайр Дж.Р., Хартл С. и др. Основа для обнаружения вариаций и генотипирования с использованием данных секвенирования ДНК следующего поколения. Нат Жене. 2011; 43: 491–498. пмид:21478889
    30. 30. Куинлан А.Р., Холл И.М. BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных особенностей. Биоинформатика. 2010; 26: 841–842. пмид:20110278
    31. 31. Ли Х. Статистическая основа для определения SNP, обнаружения мутаций, картирования ассоциаций и оценки генетических параметров популяции на основе данных секвенирования.Биоинформатика. 2011. стр. 2987–2993. пмид:217
    32. 32. Ли Х. Улучшение обнаружения SNP за счет качества базового выравнивания. Биоинформатика. 2011; 27: 1157–1158. пмид:21320865
    33. 33. Paiva MHS, Guedes DRD, Docena C, Bezerra MF, Dezordi FZ, Machado LC и др. Многочисленные внедрения, за которыми последовало продолжающееся распространение SARS-CoV-2 среди населения в одном из крупнейших мегаполисов северо-востока Бразилии. Вирусы. 2020;12. пмид:33316947
    34. 34. Фу Л, Ниу Б, Чжу Зи, Ву С, Ли В.CD-HIT: ускорено для кластеризации данных секвенирования следующего поколения. Биоинформатика. 2012; 28: 3150–3152. пмид:23060610
    35. 35. Като К., Стэндли Д.М. Программное обеспечение MAFFT для множественного выравнивания последовательностей, версия 7: улучшения производительности и удобства использования. Мол Биол Эвол. 2013; 30: 772–780. пмид:23329690
    36. 36. Kalyaanamoorthy S, Minh BQ, Wong TKF, von Haeseler A, Jermiin LS. ModelFinder: быстрый выбор модели для точных филогенетических оценок. Нат Методы. 2017; 14: 587–589.пмид:28481363
    37. 37. Сучард М.А., Леми П., Баэле Г., Эйрес Д.Л., Драммонд А.Дж., Рамбо А. Интеграция байесовских филогенетических и филодинамических данных с использованием BEAST 1.10. Вирус Эвол. 2018;4: vey016. пмид:29942656
    38. 38. Rambaut A, Lam TT, Max Carvalho L, Pybus OG. Изучение временной структуры гетерохронных последовательностей с использованием TempEst (ранее Path-O-Gen). Вирус Эвол. 2016;2: vew007. пмид:27774300
    39. 39. Драммонд А.Дж., Хо С.Ю.В., Филлипс М.Дж., Рамбо А.Расслабленная филогенетика и уверенное датирование. PLoS биол. 2006;4: e88. пмид:16683862
    40. 40. Леми П., Рамбо А., Уэлч Дж. Дж., Сушард М. А. Филогеография совершает расслабленное случайное блуждание в непрерывном пространстве и времени. Мол Биол Эвол. 2010; 27: 1877–1885 гг. пмид:20203288
    41. 41. Пайбус О.Г., Сушард М.А., Лемей П., Бернардин Ф.Дж., Рамбо А., Кроуфорд Ф.В. и др. Объединение пространственной эпидемиологии и молекулярной эволюции возникающих эпидемий. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109: 15066–15071.пмид:22927414
    42. 42. Делликур С., Роуз Р., Фариа Н.Р., Лемей П., Пайбус О.Г. СЕРАФИМ: изучение растров окружающей среды и филогенетически обоснованных движений. Биоинформатика. 2016; 32: 3204–3206. пмид:27334476
    43. 43. Sabino EC, Buss LF, Carvalho MPS, Prete CA Jr, Crispim MAE, Fraiji NA, et al. Повторный всплеск COVID-19 в Манаусе, Бразилия, несмотря на высокую серопревалентность. Ланцет. 2021; 397: 452–455. пмид:33515491
    44. 44. Куриба Б., Дюрр А., Рен А., Сангаре А.К., Траоре Б.Ю., Бестехорн-Виллманн М.С. и др.Первый филогенетический анализ последовательностей малийского вируса SARS-CoV-2 дает молекулярное представление о геномном разнообразии Сахельского региона. Вирусы. 2020;12. пмид:33147840
    45. 45. Вьедма Э., Дахдух Э., Гонсалес-Альба Х.М., Гонсалес-Боди С., Мартинес-Гарсия Л., Ласаро-Перона Ф. и др. Геномная эпидемиология SARS-CoV-2 в Мадриде, Испания, во время первой волны пандемии: быстрое распространение и раннее доминирование вариантов D614G. Микроорганизмы. 2021;9. пмид:33671631
    46. 46. Гитинджи Г., де Лоран З.Р., Мохаммед К.С., Омуойо Д.О., Мачария П.М., Моробе Дж.М. и др.Отслеживание внедрения и распространения SARS-CoV-2 в прибрежной Кении. bioRxiv. medRxiv; 2020.
    47. 47. Chang MC, Kahn R, Li YA, Lee CS, Buckee CO, Chang HH. Различия в мобильности людей и их влияние на риск будущих вспышек COVID-19 на Тайване. Общественное здравоохранение BMC. 2021;21: 226. pmid:33504339
    48. 48. Heck TG, Frantz RZ, Frizzo MN, François CHR, Ludwig MS, Mesenburg MA, et al. Недостаточное социальное дистанцирование может способствовать вспышке COVID-19: пример города Ижуи в Бразилии.ПЛОС Один. 2021;16: e0246520. пмид:33596229
    49. 49. Тесля А., Фам Т.М., Годийк Н.Г., Кречмар М.Е., Бутсма М.Дж., Рожнова Г. Влияние самостоятельных профилактических мер и краткосрочного социального дистанцирования, навязанного государством, на смягчение и отсрочку эпидемии COVID-19: модельное исследование. ПЛОС Мед. 2020;17: e1003166. пмид:32692736
    50. 50. МакКомбс А., Каделка С. Модельная оценка эффективности политики социального дистанцирования, тестирования и сортировки в больницах в связи с COVID-19.PLoS Comput Biol. 2020;16: e1008388. пмид:33057438
    51. 51. Кома Т., Адачи С., Дои Н., Адачи А., Номагути М. К пониманию молекулярных основ биологической диверсификации коронавирусов человека: текущее состояние и перспективы на будущее. Фронт микробиол. 2020;11:2016. pmid:32983025
    52. 52. Тегалли Х., Уилкинсон Э., Джованетти М., Иранзаде А., Фонсека В., Джандхари Дж. и др. Обнаружение вызывающего озабоченность варианта SARS-CoV-2 в Южной Африке. Природа. 2021; 592: 438–443.пмид:336

    53. 53. Рамбо А., Ломан Н., Пайбус О., Барклай В., Барретт Дж., Карабелли А. и др. Предварительная геномная характеристика зарождающейся линии SARS-CoV-2 в Великобритании, определяемой новым набором спайковых мутаций. В: Вирусологический [Интернет]. 18 декабря 2020 г. [по состоянию на 10 марта 2021 г.]. Доступно: https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of- спайк-мутации/563
    54. 54. Choi B, Choudhary MC, Regan J, Sparks JA, Padera RF, Qiu X и ​​др.Стойкость и эволюция SARS-CoV-2 у хозяина с ослабленным иммунитетом. N Engl J Med. 2020; 383: 2291–2293. пмид:33176080
    55. 55. Мартин Д.П., Уивер С., Тегалли Х., Сан Э.Дж., Шэнк С.Д., Уилкинсон Э. и др. Появление и продолжающаяся конвергентная эволюция линий N501Y совпадает с крупным глобальным сдвигом в избирательном ландшафте SARS-CoV-2. bioRxiv. medRxiv; 2021. пмид:33688681
    56. 56. Чжан YZ, Холмс EC. Геномный взгляд на происхождение и появление SARS-CoV-2.Клетка. 2020; 181: 223–227. пмид:32220310
    57. 57. Маккарти К.Р., Ренник Л.Дж., Намбулли С., Робинсон-Маккарти Л.Р., Бейн В.Г., Хайдар Г. и др. Повторяющиеся делеции в гликопротеине спайка SARS-CoV-2 вызывают ускользание антител. Наука. 2021. пмид:33536258
    58. 58. Siqueira JD, Goes LR, Alves BM, de Carvalho PS, Cicala C, Arthos J, et al. Геномный анализ SARS-CoV-2 у онкологических больных выявил повышенное генетическое разнообразие внутри хозяина. Вирус Эвол. 2021. пмид:33738124
    59. 59.Кемп С.А., Кольер Д.А., Датир Р.П., Феррейра ИАТМ, Гайед С., Джахун А. и др. Эволюция SARS-CoV-2 при лечении хронической инфекции. Природа. 2021. пмид:33545711
    60. 60. Thomson EC, Rosen LE, Shepherd JG, Spreafico R, da Silva Filipe A, Wojcechowskyj JA, et al. Циркулирующие варианты шипа SARS-CoV-2 N439K сохраняют физическую форму, избегая иммунитета, опосредованного антителами. Клетка. 2021; 184: 1171–1187.e20. пмид:33621484
    61. 61. Li Q, Wu J, Nie J, Zhang L, Hao H, Liu S и др.Влияние мутаций в шипе SARS-CoV-2 на вирусную инфекционность и антигенность. Клетка. 2020;182: 1284–1294.e9. пмид:32730807
    62. 62. Вайсблюм Ю., Шмидт Ф., Чжан Ф., ДаСильва Дж., Постон Д., Лоренци Дж. К. и др. Ускользание от нейтрализующих антител с помощью вариантов шиповидного белка SARS-CoV-2. Элиф. 2020;9. пмид:33112236
    63. 63. Gaebler C, Wang Z, Lorenzi JCC, Muecksch F, Finkin S, Tokuyama M, et al. Эволюция иммунитета антител к SARS-CoV-2. Природа. 2021. пмид:33461210
    64. 64.Wang Z, Schmidt F, Weisblum Y, Muecksch F, Barnes CO, Finkin S, et al. мРНК антител к SARS-CoV-2 и циркулирующим вариантам, вызванные вакциной. bioRxiv. 2021. пмид:33501451
    65. 65. Greaney AJ, Loes AN, Crawford KHD, Starr TN, Malone KD, Chu HY, et al. Всестороннее картирование мутаций в домене, связывающем рецептор SARS-CoV-2, которые влияют на распознавание поликлональными антителами плазмы человека. Клеточный микроб-хозяин. 2021. пмид:33592168
    66. 66. Али Ф., Касри А., Амин М.Новый штамм SARS-CoV-2 демонстрирует более сильную аффинность связывания с ACE2 благодаря мутанту N501Y. Мед Препарат Дисков. 2021; 100086.

    Во время мышечной атрофии толстые, но не тонкие компоненты филаментов деградируют за счет MuRF1-зависимого убиквитилирования | Журнал клеточной биологии

    Потеря миофибриллярных белков является отличительной чертой атрофии мышц. Экспрессия мышечного RING-finger 1 (MuRF1), убиквитинлигазы, заметно индуцируется во время атрофии, а делеция MuRF1 ослабляет атрофию мышц.Мы создали мышей, экспрессирующих мутант MuRF1 с делецией кольца, который связывает, но не может убиквитилировать субстраты. Масс-спектрометрия связанных белков в денервированных мышцах идентифицировала многие миофибриллярные компоненты. При денервации или голодании в атрофированных мышцах наблюдается потеря миозин-связывающего белка С (MyBP-C) и легких цепей миозина 1 и 2 (MyLC1 и MyLC2) из ​​миофибрилл до какого-либо измеримого снижения тяжелой цепи миозина (MyHC). Для их избирательной потери требуется MuRF1. MyHC защищен от убиквитинирования в миофибриллах ассоциированными белками, но со временем подвергается зависимой от MuRF1 деградации.Напротив, MuRF1 убиквитилирует MyBP-C, MyLC1 и MyLC2 даже в миофибриллах. Поскольку эти белки стабилизируют толстые филаменты, их избирательное убиквитилирование может способствовать разборке толстых филаментов. Однако компоненты тонких филаментов уменьшались по механизму, не требующему MuRF1.

    Атрофия скелетных мышц возникает при неиспользовании или денервации и системно при голодании и многих болезненных состояниях, включая раковую кахексию, сепсис, почечную недостаточность и сердечную недостаточность (Lecker et al., 1999, 2006; Джекман и Кандарян, 2004). Эта быстрая потеря мышечной массы во многом связана с ускоренной деградацией белка, хотя при системных катаболических состояниях синтез белка также снижается (Jackman and Kandarian, 2004; Lecker et al., 2006; Sacheck et al., 2007). В норме белки, составляющие миофибриллы, являются одними из самых стабильных в организме. Однако при атрофии миофибриллярный аппарат, состоящий не менее чем на 60% из мышечных белков, уменьшается в массе в большей степени, чем растворимые компоненты (Munoz et al., 1993) и приводит к снижению прочности. Настоящие исследования были предприняты, чтобы понять механизмы, ответственные за ускоренную деградацию миофибриллярных белков.

    Недавние открытия показывают, что эти различные типы атрофии активируют общую серию биохимических и транскрипционных адаптаций (Sacheck et al., 2007), что приводит к усиленной деградации белка как протеасомной, так и лизосомной системами (Mammucari et al., 2007; Чжао и др., 2007). Деградация миофибриллярных компонентов во время атрофии опосредуется убиквитин-протеасомным путем (Solomon and Goldberg, 1996). Несмотря на эту быструю деградацию различных мышечных белков во время атрофии, заметно индуцируются две специфические для мышц убиквитинлигазы (E3s), мышечный RING-finger 1 (MuRF1) и атрогин-1/MAFbx; а у мышей с нокаутом, лишенных любого фермента, быстрая потеря мышечной массы при денервации значительно снижается (Bodine et al., 2001; Gomes et al., 2001). На сегодняшний день неясно, убиквитилируют ли эти E3 многие мышечные компоненты или только ключевые регуляторные, разрушение которых способствует расщеплению др. белков. MuRF1 представляет собой мономер E3, принадлежащий к семейству лигаз с трехчастным мотивом, которые содержат трехчастный домен RING:B-box:coiled-coil, который необходим для конъюгации убиквитина. Два близких гомолога MuRF1 (MuRF2 и MuRF3) присутствуют в нормальных мышцах и, по-видимому, важны для поддержания нормальной сократительной функции (Fielitz et al., 2007; Витт и др., 2008). MuRF1, с другой стороны, необходим для быстрой атрофии, но не для нормального роста мышц.

    В настоящих исследованиях мы использовали мышей, у которых отсутствует RING-домен MuRF1, для выяснения роли его лигазной активности в денервационной атрофии. Хотя для MuRF1 сообщалось о двух субстратах, сердечном тропонине-I (Kedar et al., 2004) и тяжелой цепи миозина (MyHC) (Clarke et al., 2007), роль MuRF1 в деградации специфических миофибриллярных или растворимых белков в скелетных мышца неизвестна.В частности, неясно, может ли MuRF1 или какой-либо E3 действовать на белки внутри миофибриллы, которая представляет собой высокоорганизованную жесткую структуру, или существуют механизмы для высвобождения белков из саркомеров перед убиквитин-зависимой деградацией. Модельные исследования мышечных экстрактов продемонстрировали быстрый гидролиз очищенного актина и миозина убиквитин-протеасомным путем (Solomon and Goldberg, 1996). Однако эти белки были намного более стабильны, когда они были связаны друг с другом в актомиозиновом комплексе или интактных миофибриллах.Эти находки повысили вероятность того, что убиквитин-протеасомная система может сама по себе не быть способна разлагать компоненты интактных миофибрилл, и составляющие ее белки должны высвобождаться каким-то механизмом, чтобы стать субстратами для деградации (Solomon and Goldberg, 1996). Следовательно, несколько групп представили доказательства того, что кальпаин (Tidball and Spencer, 2002) или каспаза (Du et al., 2004) могут изначально расщеплять миофибриллярные компоненты, тем самым ускоряя разборку и деградацию убиквитин-протеасомной системой.Однако прямых доказательств того, что эти модели функционируют в атрофирующихся мышцах, нет. Альтернативно, Е3 может действовать непосредственно на специфические компоненты миофибриллы, способствуя ее разборке и деградации во время атрофии. Здесь мы представляем доказательства такой роли MuRF1.

    Миофибриллы состоят из точно выровненных систем филаментов, организованных в повторяющиеся единицы саркомеров (Clark et al., 2002), первичными составляющими которых являются миозин в толстом филаменте и актин в тонком филаменте.Молекула миозина составляет 50% массы миофибрилл и содержит две тяжелые цепи, две регуляторные легкие цепи (MyLC2) и две незаменимые легкие цепи (MyLC1). Эти легкие цепи связываются с глобулярными головками миозина, которые содержат поперечные мостики, отходящие от толстых филаментов для взаимодействия с актином и создания силы за счет гидролиза АТФ. Несколько наблюдений in vivo и с изолированными миофибриллами указывают на то, что MyLC1 и MyLC2 необходимы для стабилизации толстых филаментов и нормальной сократимости.Потеря MyLC1 или MyLC2 у людей (Rottbauer et al., 2006) или их гомологов у рыбок данио (Chen et al., 2008) приводит к нарушению сократимости и поразительной дезорганизации толстых филаментов.

    Кроме того, саркомер содержит множество структурных и регуляторных белков, которые способствуют целостности и стабильности миофибрилл. Например, миозин-связывающий белок С (MyBP-C) является компонентом толстого филамента и распределяется через каждые 43 нм в С-зоне саркомера, где обнаруживаются поперечные мостики (Offer et al., 1972). Трансгенные мыши, экспрессирующие укороченный MyBP-C, у которого отсутствует сайт связывания миозина в сердечной мышце, обнаруживают значительную дезорганизацию саркомера (Yang et al., 1998). Поскольку MyBP-C, MyLC1 и MyLC2 необходимы для стабильности саркомера, их селективная потеря и быстрое убиквитилирование, которое мы демонстрируем здесь, скорее всего, являются механизмом, способствующим разборке миофибрил во время атрофии.

    В этих исследованиях мы использовали биохимические и генетические подходы для выяснения in vivo вклада лигазной активности MuRF1 в атрофический процесс и для выяснения роли MuRF1 в разборке миофибриллярного аппарата у взрослых мышей.В частности, мы исследовали (1) может ли какой-либо миофибриллярный белок избирательно теряться во время денервационной атрофии, (2) важно ли убиквитилирование MuRF1 для деградации различных миофибриллярных белков, потерянных во время атрофии, (3) может ли MuRF1 убиквитилировать регуляторные белки, чья потеря может способствовать распаду других миофибриллярных компонентов, и (4) могут ли миофибриллярные белки, которые деградируют по MuRF1-зависимому механизму, убиквитилироваться внутри миофибрилл, в экстрагированном актомиозиновом комплексе или только при выделении и очистке.Эти исследования неожиданно демонстрируют, что существуют различные механизмы для деградации компонентов толстых и тонких филаментов, и что определенные белки, ассоциированные с толстыми филаментами, по-разному теряются во время атрофии и селективно убиквитилируются в интактных миофибриллах. Их дифференциальная потеря может представлять собой критический шаг, который способствует дальнейшему убиквитилированию и деградации др. миофибриллярных компонентов.

    Чтобы понять роль MuRF1 в мышечной атрофии, мы стремились идентифицировать его субстраты.Растворимые экстракты икроножных мышц нормальных мышей (3000 г супернатантов) инкубировали с иммобилизованным GST-MuRF1 для выделения мышечных белков, обладающих высоким сродством к MuRF1. Полученные осадки обильно промывали буфером, содержащим 500 мМ NaCl, для удаления неспецифических или слабоассоциированных белков. Белки в осадках анализировали с помощью SDS-PAGE (рис. S1) и масс-спектрометрии. Были идентифицированы многие миофибриллярные компоненты, особенно компоненты толстых филаментов и области М-линии (таблица 1), в том числе миозин-связывающий белок С (MyBP-C, также называемый С-белком), незаменимая легкая цепь миозина (MyLC1) и регуляторный белок. легкая цепь (MyLC2), изоформа II типа тяжелой цепи миозина (MyHC), миомезин 1 и филамин C (также называемый филамином 2, γ-филамином или ABP-L), компонент, локализованный в Z-диске.Это связывание MyLC2 согласуется с результатами скрининга библиотеки мышечной кДНК на MuRF1-связывающие белки с помощью двухгибридного анализа дрожжей (Witt et al., 2005). Кроме того, было показано, что MyHC (Clarke et al., 2007) убиквитилируется очищенным MuRF1. Нам не удалось осадить тропонин-I из экстрактов скелетных мышц с помощью MuRF1, хотя сообщается, что сердечный тропонин-I является субстратом MuRF1 in vivo (Kedar et al., 2004) и легко убиквитилируется очищенным MuRF1 (Kim et al. , 2007).

    Чтобы подтвердить, что эти MuRF1-связывающие белки (таблица I) действительно являются потенциальными субстратами, мы повторили выделение белков вместе с очищенным GST-MuRF1 из нормальных икроножных мышц и впоследствии проверили, могут ли эти связанные компоненты убиквитинироваться после добавления E1, Ubch2 , и His-убиквитин.Полиубиквитилированные His-меченые белки очищали на колонке с никелем, и масс-спектрометрический анализ идентифицировал все эти миофибриллярные белки как виды, убиквитилированные MuRF1 (таблица I).

    Чтобы проанализировать регуляцию экспрессии Myc-MuRF1 и Myc-ΔR-MuRF1 во время атрофии, мы односторонне перерезали седалищный нерв у двух групп мышей. Через 10 дней животных забивали и готовили экстракты икроножных мышц.Заметная индукция белка Myc-MuRF1 в этих лизатах наблюдалась с помощью вестерн-блоттинга и напоминала индукцию MuRF1 у мышей дикого типа (фиг. 1В). Интересно, что содержание Myc-ΔR-MuRF1 в денервированных мышцах было выше, чем содержание MuRF1 у мышей дикого типа (рис. 1D), вероятно, потому, что, как и многие E3, MuRF1 аутоубиквитилируется, и в отсутствие домена кольцевого пальца , белок неактивен и, следовательно, гораздо более стабилен (Qiu and Goldberg, 2002). Несмотря на отсутствие домена RING (55 аминокислот), экспрессированный белок Myc-ΔR-MuRF1 был очень похож по размеру на эндогенный MuRF1, поскольку он содержит метку Myc (36 аминокислот).Как и ожидалось, размер белка Myc-MuRF1 был больше, чем у Myc-ΔR-MuRF1 из-за присутствия домена RING.

    Чтобы определить, является ли активность убиквитинлигазы MuRF1 существенной для атрофии и деградации специфических миофибриллярных белков, мы проанализировали скорость атрофии денервации, чтобы узнать, уменьшает ли делеция кольцевого пальца MuRF1 атрофию таким же образом, как и полная делеция MuRF1 (Bodine et al. ., 2001). Одностороннюю атрофию мышц задней конечности вызывали перерезкой правого седалищного нерва в MuRF1 -/- , MuRF1 myc/myc и ΔR-MuRF1 myc/myc 60 в трех отдельных экспериментах. Однопометники WT из каждой когорты в качестве контроля ( n = 5–8). Икроножные мышцы обеих конечностей рассекали и взвешивали через 14 дней. Как сообщалось ранее (Bodine et al., 2001), эти мышцы в WT потеряли примерно 35% своей массы, но только 20% в MuRF1 -/- (P < 0.001; неопубликованные данные). Масса икроножных мышц мышей, экспрессирующих полноразмерный Myc-MuRF1, уменьшилась в той же степени, что и у WT (36% против 41% соответственно; рис. 1E). Напротив, мышцы, экспрессирующие нефункциональный Myc-ΔR-MuRF1, уменьшились в весе только на 22% (что напоминало снижение на 20% у MuRF1 -/- ) по сравнению с уменьшением на 38% у однопометников дикого типа (P < 0,01; рис. 1 Д). Т.о., домен Ring-finger MuRF1 (т.е. его функция в качестве убиквитинлигазы) необходим для быстрой атрофии после денервации, и потеря этого домена эквивалентна потере всего белка.

    Сообщалось, что MuRF1 ассоциирован с миофибриллами (Centner et al., 2001), хотя иммунофлуоресцентное исследование кардиальных миоцитов выявило MuRF1 также в цитоплазме (McElhinny et al., 2002). После выделения миофибрилл из икроножных мышц мышей MuRF1 myc/myc , ΔR-MuRF1 myc/myc и WT мы обнаружили, к нашему удивлению, что подавляющее большинство Myc-MuRF1 и Myc-ΔR -MuRF1 и эндогенный MuRF1 у мышей дикого типа находились в цитозольной фракции (3000 г супернатанта) (фиг.С3). Следовательно, если MuRF1 действительно связан с миофибриллами, это слабое, легко разрушаемое взаимодействие.

    Чтобы идентифицировать субстраты MuRF1, потерянные при денервации in vivo, мы иммунопреципитировали Myc-ΔR-MuRF1 из икроножных мышц (3000 г супернатанта) от гомозиготных мышей ΔR-MuRF1 myc/myc с использованием антител против его метки Myc, и промывали полученные иммунопреципитаты, как описано выше.Анализ белков, связанных с MuRF1, с помощью масс-спектрометрии выявил тот же набор миофибриллярных белков, которые были осаждены с использованием иммобилизованного GST-MuRF1 (таблица I).

    Чтобы прояснить роль MuRF1 в денервационной атрофии и выяснить, теряется ли какой-либо из этих саркомерных белков по-разному во время этого процесса, мы выделили миофибриллы из икроножных мышц и после SDS-PAGE идентифицировали полосы составляющих белков с помощью окрашивания кумасси голубым и масс-спектрометрии. (Рисунок.С4 А). Затем с помощью SDS-PAGE мы проанализировали равные количества белков из миофибриллярной фракции иннервированных и денервированных мышц мышей MuRF1 myc/myc и ΔR-MuRF1 myc/myc и измерили интенсивность окрашенных специфических полос. с кумасси синим с помощью денситометрии (рис. S4 B). Масса мышц у животных ΔR-MuRF1 myc/myc и MuRF1 myc/myc уменьшилась аналогичным образом (14% [P <0,05] против 18% [P <0,05].001] соответственно) через 10 дней после денервации (неопубликованные данные). Несмотря на потерю белков, относительные концентрации подавляющего большинства миофибриллярных белков при 10-дневной денервации существенно не отличались от таковых в иннервируемых мышцах (рис. 3А).

    Удивительно, но у животных, экспрессирующих Myc-MuRF1, относительные концентрации миофибриллярных MyLC2 и MyBP-C были заметно снижены (на 47% и 28% соответственно; P < 0.05) ниже уровня иннервируемых органов управления (рис. 3 А). Напротив, у мышей ΔR-MuRF1 myc/myc относительное количество этих регуляторных белков существенно не изменилось после денервации (рис. 3А) (это снижение количества MyBP-C не связано с медленным изменение типа волокна на быстрое, которое происходит после денервации [Weydert et al., 1987], поскольку быстрая и медленная изоформы MyBP-C имеют одинаковую молекулярную массу и проявляются в виде одной полосы на гелях, окрашенных кумасси синим). Эта дифференциальная потеря MyLC2 и MyBP-C заслуживает внимания, поскольку концентрации MyHC и актина в миофибриллах не изменились в денервированных мышцах обеих групп.

    Поскольку MyLC1 и тропонин-I мигрируют сходным образом в SDS-PAGE, их концентрации не могут быть измерены этим методом. Вместо этого мы проанализировали их уровни с помощью иммуноблоттинга (рис. 3В). Как и содержание MyLC2 и MyBP-C, уровень MyLC1 был ниже в миофибриллярной фракции денервированной мышцы, чем в иннервированной мышце мышей MuRF1 myc/myc , но не снижался в ΔR-MuRF1 myc/myc животных (рис.3 Б). С помощью иммуноблотинга мы также подтвердили, что относительные концентрации миофибриллярных MyHC и актина не различались в денервированные и иннервированные мышцы в это время (рис. 3В). Напротив, содержание тропонина-I, кардиальная изоформа которого убиквитилируется с помощью MuRF1 и деградирует в культивируемых кардиомиоцитах (Kedar et al., 2004), не изменилось при 10-дневной денервации. Вместе эти данные указывают на то, что миофибриллярные MyLC1, MyLC2 и MyBP-C преимущественно деградируют во время денервационной атрофии по MuRF1-зависимому механизму, но другие потенциальные субстраты MuRF1 (например,г., компонент тонких филаментов, тропонин-I) не являются.

    Чтобы подтвердить, что MyLC1, MyLC2 и MyBP-C являются прямыми субстратами для MuRF1, мы измерили их убиквитилирование рекомбинантным MuRF1 с использованием различных E2 и вестерн-блоттинга (рис. 4). MuRF1 убиквитилировал чистый MyLC1 (рис. 4A), MyLC2 (рис. 4B) и MyBP-C (рис. 4C), а также MyHC (рис. 4D) с тремя протестированными E2, Ubch2, UbcH5, или Ubch23/Uev1, все из которых, как было показано ранее, поддерживают убиквитинирование сердечного тропонина-I с помощью MuRF1 (Kim et al., 2007). Актин в основном моноубиквитилируется MuRF1 и UbcH5 (рис. S5C), хотя in vivo эта цепь может быть удлинена другой убиквитинлигазой, функционирующей как E4 (Koegl et al., 1999) или MuRF1 с другим E2 (как недавно было предложено для мишеней комплекса, способствующего анафазе [Rodrigo-Brenni and Morgan, 2007]).

    Соломон и Голдберг (1996) ранее показали, что, когда актин и миозин находятся в миофибриллах или даже в актомиозиновых комплексах, эти белки весьма устойчивы к убиквитин-зависимому протеолизу, в отличие от свободного актина или миозина (Соломон и Голдберг, 1996).Чтобы узнать, может ли MuRF1 непосредственно убиквитилировать белки в миофибрилле или эта структура должна быть сначала диссоциирована, мы исследовали, являются ли MyLC1 и MyLC2, связанные с комплексами актомиозина, также субстратами для убиквитилирования с помощью MuRF1 (мы не смогли измерить убиквитилирование MyBP-C в актомиозиновых комплексах). поскольку его нет в препарате актомиозина). Мы сравнили убиквитинирование чистых белков и параллельно препарата актомиозина из мышц кролика (который помимо актина, MyHCs и MyLCs может содержать небольшое количество ассоциированных белков, например,г., тропомиозин, тропонин, α-актинин). В реакциях присутствовали одинаковые количества каждого из белков либо в виде чистого белка, либо в ассоциации с актомиозином (с поправкой после того, как мы определили количество каждого белка с помощью окрашивания гелей кумасси синим). MuRF1 убиквитилировал MyLC1 и MyLC2 в актомиозиновом комплексе со скоростью, сравнимой со свободными белками со всеми тремя протестированными E2 (рис. 4, A и B). Напротив, MyHC мог убиквитилироваться только в виде чистого белка, но не в составе актомиозинового комплекса (рис.4 Д).

    Чтобы проверить, эффективно ли MyLC1, MyLC2 и MyBP-C убиквитилируются при связывании с миофибриллой, мы односторонне денервировали икроножные мышцы мышей дикого типа в течение 3 или 10 дней, готовили миофибриллы из этих и контралатеральных нормальных мышц и сравнивали частоту убиквитилирование белков миофибрилл чистым MuRF1. Как наблюдалось у животных MuRF1 myc/myc , MyLC2 и MyBP-C были преимущественно потеряны (по сравнению с актином) из икроножной мышцы через 10 дней после денервации, тогда как относительная концентрация MyHC не изменилась (рис.5А, слева). Кроме того, иммуноблотинг выявил более низкие уровни MyLC1 в миофибриллах денервированных мышц, чем в контроле (рис. 5А, справа).

    Был разработан специфический метод иммунопреципитации для выделения убиквитилированных белков и их анализа с помощью иммуноблоттинга. Для анализа убиквитинирования белков в миофибриллах нормальных или денервированных мышц с помощью MuRF1 мы использовали меченный 6-His убиквитин, Ubch2 и E1.После инкубации при 37°C добавляли 5 М мочевины для разборки миофибрилл и обеспечения эффективной очистки His-убиквитилированного материала с помощью никелевой колонки. Когда изолированные миофибриллы от нормальных мышей инкубировали с MuRF1, с помощью иммуноблоттинга не было продемонстрировано значительного убиквитилирования актина или MyHC (неопубликованные данные). Напротив, MyLC1, MyLC2 и MyBP-C внутри миофибрилл были эффективно убиквитилированы как в контрольных, так и в денервированных мышцах (рис. 5В). Таким образом, в интактной миофибрилле и даже в актомиозиновом комплексе MyHC и актин (в отличие от MyLC1, MyLC2 и MyBP-C) проявляют лишь ограниченную чувствительность к убиквитилированию, т.е.э., значительно меньше, чем очищенные MyHC и актин. Поскольку известно, что MyLC1, MyLC2 и MyBP-C стабилизируют толстые филаменты, их дифференцированное убиквитилирование и деградация могут способствовать убиквитинированию, разборке и деградации других саркомерных компонентов.

    Часто предполагалось, что начальная стадия разборки, такая как протеолитическое расщепление кальпаинами (Goll et al., 1992) или каспазами (Du et al., 2005) может способствовать общей деградации миофибриллярного аппарата. Однако выше мы показали, что MyLC1, MyLC2 и MyBP-C преимущественно теряются во время денервационной атрофии по MuRF1-зависимому механизму (рис. 3) и могут быть убиквитилированы с помощью MuRF1, когда все еще связаны с миофибриллой (рис. 5В). Более того, очищенный растворимый актин и MyHC убиквитилируются с помощью MuRF1 более эффективно, чем когда эти белки связаны с другими компонентами внутри миофибриллы или даже в актомиозиновом комплексе (рис.4). Эти данные повышают вероятность того, что потеря MyLC1, MyLC2 и MyBP-C может повышать восприимчивость других миофибриллярных компонентов к MuRF1-зависимой деградации.

    Для проверки этой гипотезы мы измерили содержание компонентов толстого и тонкого филамента через 14 дней после денервации. Контрольные и денервированные мышцы мышей MuRF1 myc/myc и ΔR-MuRF1 myc/myc гомогенизировали, и изолированные миофибриллы анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим.Измерение интенсивности специфических полос выявило дифференциальную потерю MyHC из миофибрилл при 14-дневной денервации у мышей MuRF1 myc/myc (рис. 6А), которая не проявлялась через 10 дней после денервации (рис. 3 и неопубликованные данные). ). Напротив, количество MyHC и ни одного из компонентов толстых филаментов (т. е. MyLC1, MyLC2 и MyBP-C) уменьшилось у животных ΔR-MuRF1 myc/myc . Эта более медленная потеря MyHC согласуется с гипотезой о том, что начальная селективная деградация стабилизирующих толстые филаменты белков MyLC1, MyLC2 и MyBP-C увеличивает доступность MyHC для убиквитинирования с помощью MuRF1.

    В отличие от этих компонентов толстого филамента, в это время после денервации компоненты тонкого филамента, актин, тропомиозин и α-актинин были потеряны из миофибрилл аналогичным образом в MuRF1 myc/myc и ΔR-MuRF1 myc/ myc животных (рис. 6 А). Т.о., хотя MuRF1 необходим для деградации и разборки толстых филаментов во время денервационной атрофии, тонкие филаменты расщепляются по особому механизму, который не требует MuRF1 или MuRF1-зависимого убиквитинилирования других компонентов, но может включать другую убиквитинлигазу.

    Настоящие результаты проясняют критическую роль, которую MuRF1 играет в мышечной атрофии. Хотя при атрофии индуцируются и другие убиквитинлигазы (например, атрогин-1 [Gomes et al., 2001], который также необходим для быстрой атрофии [Bodine et al., 2001], а также E3α-II [Kwak et al. ., 2004]), MuRF1 необходим для большей части увеличения убиквитиновых конъюгатов при денервационной атрофии (рис. 2).Т.о., MuRF1 либо убиквитилирует большинство белков, деградирующих через 10 дней после денервации, либо ее действия позволяют действовать другим лигазам. В любом случае, MuRF1 явно является очень общей лигазой, влияющей на многие сократительные (Таблица I), растворимые и ядерные белки (неопубликованные данные), как было также предложено в двухгибридных исследованиях (Witt et al., 2005; Hirner et al. , 2008). Более того, наши исследования указывают на убиквитинирование MuRF1 в избирательной потере MyBP-C, MyLC1 и MyLC2, а также в более медленной деградации MyHC и, таким образом, в разборке и деградации миофибриллярных белков, что является определяющей чертой атрофии. обработать.

    Инактивация способности MuRF1 связывать E2s путем делеции его мотива Ring-finger ослабляла атрофию и предотвращала дифференциальную потерю MyBP-C, MyLC1 и MyLC2 из миофибриллы (Fig. 3). Их избирательная потеря является новой особенностью атрофированных мышц и, по-видимому, имеет регулирующее значение. Поскольку эти белки имеют решающее значение для стабилизации миофибрилл (см. ниже), снижение потери MyHC у мышей ΔR-MuRF1 myc/myc может быть прямым следствием сохранения MyLC1, MyLC2 и MyBP- С.Также неожиданными оказались данные о том, что эти компоненты толстых филаментов деградируют раньше и по механизму, отличному от компонентов тонких филаментов, актина, тропомиозина и α-актинина, деградация которых не зависит от MuRF1.

    Поскольку MuRF1 необходим для быстрой атрофии, но не для нормального роста или функции мышц, идентификация его субстратов необходима для понимания механизмов потери белка.Мы идентифицировали ряд миофибриллярных компонентов в качестве новых субстратов для MuRF1 in vivo, каждый из которых важен для целостности мышц и сократительной активности. Мутации в каждом из них вызывают серьезные нарушения, характеризующиеся беспорядочными миофибриллами и нарушением сократительной функции (Clark et al., 2002). Хотя ранее сообщалось, что сердечный Troponin-I является субстратом MuRF1 (Kedar et al., 2004), Troponin-I не может быть иммунопреципитирован MuRF1 из этих скелетных мышц и не теряется MuRF1-зависимым механизмом после денервации.Было показано, что MyHC накапливается у мышей, лишенных MuRF1 и MuRF3 (Fielitz et al., 2007), и деградирует MuRF1-зависимым образом при обработке эмбриональных мышечных трубок дексаметазоном (Clarke et al., 2007). Соответственно снижение содержания MyHC по MuRFl-зависимому механизму отчетливо проявлялось при 14-дневной денервации (рис. 6). Однако в миофибриллах иннервируемых мышц MyHC не убиквитилируется MuRF1 и не является предпочтительным субстратом MuRF1 даже через 10 дней после денервации (Fig. 3).

    Следует отметить, что эти различные миофибриллярные белки могут быть преципитированы с помощью GST-MuRF1 из цитозольной фракции и убиквитинированы чистым MuRF1.Растворимые пулы этих миофибриллярных компонентов были обнаружены у кур (Horvath and Gaetjens, 1972) и обнаружены в экстрактах мышц мышей (неопубликованные данные). Возможно, эти растворимые компоненты функционируют либо как предшественники зрелого сократительного аппарата, либо как компоненты, высвобождаемые во время миофибриллярного обновления, либо могут представлять собой фракцию миофибриллярных белков, которые легко высвобождаются при гомогенизации (Etlinger et al., 1975). Однако эти белки не накапливались в цитозоле при атрофии, когда они выпадали из миофибриллы (неопубликованные данные).

    Хотя давно известно, что основные миофибриллярные белки расщепляются убиквитин-протеасомным путем во время атрофии (Solomon and Goldberg, 1996), идентификация MuRF1 как критической лигазы, которая действует на миофибриллярный компартмент (возможно, вместе с другими E3s ) предполагает роль убиквитилирования в разборке миофибрилл. Примечательно, что очищенный мономерный актин и MyHC эффективно убиквитилировались с помощью MuRF1, но не при ассоциации друг с другом в актомиозиновом комплексе или в интактной миофибрилле (рис.4, неопубликованные данные). Ранее Соломон и Голдберг (1996) продемонстрировали на неочищенных гомогенатах, что убиквитин-протеасомная система быстро расщепляет мономерный актин и миозин, но этот процесс нельзя было продемонстрировать в экстрактах, когда эти белки были связаны друг с другом в актомиозиновый комплекс или миофибриллы. . Эти ранние находки позволяют предположить, что во время атрофии может существовать механизм высвобождения этих компонентов из миофибрилл или усиления восприимчивости актина, миозина и др. миофибриллярных белков к убиквитилированию.Однако, исходя из настоящих результатов, больше не представляется необходимым постулировать такую ​​систему высвобождения (см. ниже).

    MuRF1 может убиквитилировать эти субстраты вместе с Ubch2, который образует полиубиквитиновые цепи, связанные с K-48, и Ubch23/Uev1, который формирует процессивно связанные с K-63 цепи, и UbcH5, который образует смешанные цепи (Kim et al., 2007) (рис. 4). Однако неясно, какие E2s функционируют в протеолизе с помощью MuRF1 или какие типы убиквитиновых цепей он образует в нормальных или атрофированных мышцах.Хотя K-63-связанные цепи убиквитина, как полагают, выполняют функции, отличные от протеасомной деградации in vivo, недавние открытия указывают на то, что цепи K63 могут нацеливать субстраты на протеасомы in vitro и in vivo (Saeki et al., 2009). Кроме того, природа и содержание E2 могут влиять на скорость деградации белка и, следовательно, на скорость атрофии.

    Особенно интересно, что MyLC1, MyLC2 и MyBP-C избирательно деградируют MuRF1-зависимым образом после денервации (рис.3), и что эти белки, в отличие от MyHC и актина, эффективно убиквитилируются с помощью MuRF1 внутри миофибриллы (Fig. 5B, неопубликованные данные). Таким образом, эти критические стабилизирующие белки могут быть субстратами внутри миофибриллы без диссоциации или протеолитического процессинга. Более того, восприимчивость MyHC к убиквитилированию и деградации повышается через 14 дней после денервации (Fig. 6A), по-видимому, из-за снижения уровней MyBP-C и MyLCs в миофибриллах. Соответственно, миозин может быть извлечен из толстого филамента сердца только после снижения содержания MyBP-C на 20% (Куликовская и др., 2007). Напротив, компоненты тонких филаментов, актин, тропомиозин и α-актинин, были потеряны из миофибрилл через 14 дней после денервации по механизму, который не требует MuRF1 или MuRF1-зависимой потери MyBP-C и MyLC. Однако также возможно, что MuRF1 может нацеливаться на белки деградации, связанные с решеткой Z-диска, поскольку филамин C осаждался вместе с MuRF1 (таблица I). Альтернативно, другой E3, индуцированный атрофией, может способствовать разборке Z-диска или тонких филаментов и функционировать у животных ΔR-MuRF1.

    Хотя с помощью этих методов не было продемонстрировано снижения абсолютных уровней сократительных белков до 10 дней после денервации, их деградация должна была ускориться гораздо раньше, поскольку потеря белков является результатом интегрированных эффектов усиленного протеолиза с течением времени. Любые небольшие изменения в миофибриллярном составе (например, уменьшение на 10-20%), которые происходят раньше после денервации, вероятно, не могут быть обнаружены с помощью используемых здесь методов.Соответственно, наше открытие, что MuRF1 индуцируется через 3 дня после денервации (рис. 5А), подразумевает, что MuRF1 функционирует максимально рано при атрофии (и до того, как будет обнаружена какая-либо потеря миофибриллярных белков). MuRF1 может способствовать деградации растворимых цитозольных компонентов, многие из которых связаны с MuRF1 (неопубликованные данные).

    Примечательно, что снижение мышечной массы может наблюдаться в течение первой недели после денервации (Furuno et al., 1990) и, по-видимому, не связаны с MuRF1-зависимой потерей миофибриллярных компонентов (рис. 6А). Однако другие Е3 быстро индуцируются во время атрофии (например, атрогин-1) и могут способствовать ускорению деградации. Кроме того, недавние исследования показали, что аутофагия быстро активируется во время денервации-атрофии и, по-видимому, способствует разрушению митохондрий и цитозольных белков, возможно, в течение первой недели после денервации (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007; O’). Leary and Hood, 2009), прежде чем можно будет обнаружить какую-либо потерю миофибриллярного миозина и актина.

    Т.о., во время атрофии MuRF1, по-видимому, функционирует на начальных стадиях разборки толстых филаментов, по-видимому, путем селективного убиквитилирования определенных ключевых регуляторных компонентов, деградация которых должна способствовать разрушению оставшихся компонентов толстых филаментов. Экстракция этих убиквитилированных регуляторных белков из миофибриллы может быть напрямую связана с их деградацией протеасомой 26S, чей компонент 19S катализирует АТФ-зависимое развертывание и транслокацию субстратов в ядро ​​протеасомы 20S (Smith et al., 2005). В качестве альтернативы, АТФ-зависимая экстракция этих белков может катализироваться комплексом p97/VCP, который экстрагирует убиквитин-конъюгированные белки из мембран ЭР в пути связанной с ЭР деградации (Ye et al., 2001) и играет важную роль в миофибриллах. сборки (Janisch et al., 2007). Дополнительным доказательством критической регуляторной роли миофибриллярного MyBP-C является то, что мРНК этого белка также избирательно снижаются во время денервационной атрофии (неопубликованные данные).

    MyBP-C и MyLC2 являются важными модуляторами мышечной сократимости, и их потеря может объяснить некоторые изменения сократительных свойств, наблюдаемые после денервации (Zorzato et al., 1989; Трачес и др., 1990). Экстракция MyBP-C из очищенных от кожи волокон приводит к увеличению чувствительности Ca 2+ развития силы (Hofmann et al., 1991). Удаление миофибриллярного MyLC2 оказывает такое же влияние на кривую натяжения Ca 2+ , как и удаление MyBP-C. Таким образом, оба белка, по-видимому, уменьшают несоответствующие сокращения, уменьшая вероятность связывания миозиновых головок с актином (Moss et al., 1983). Кроме того, в сердце увеличение содержания MyBP-C усиливает АТФазную активность актомиозина, но не в случае удаления MyLC2, и этот эффект вновь появляется при восстановлении MyLC2 (Margossian, 1985).

    Через несколько дней после денервации изменяются сократительные свойства мышцы (т. е. удлиняются периоды сокращения и расслабления), по-видимому, за счет изменения внутриклеточной концентрации Ca 2+ (Zorzato et al., 1989), а также повышенная чувствительность миофибриллярных клеток Ca 2+ (Trachez et al., 1990). Как отмечалось выше, экстракция MyBP-C или MyLC2 также приводит к повышенной чувствительности миофибрилл к Ca 2+ .Поскольку Ca 2+ менее эффективно выкачивается из цитозоля денервированных мышц (Finol et al., 1981), избирательная потеря этих регуляторных компонентов может способствовать изменению их сократительных свойств. Другой характеристикой атрофированных мышц является прогрессирующее снижение силы сокращения. Поскольку MyLC1 необходим для производства полной силы мышечным миозином (VanBuren et al., 1994), его избирательная потеря (а также последующая потеря MyHC) должна способствовать потере напряжения после денервации.

    Хотя убиквитинирование на миофибриллах и селективная деградация важнейших стабилизирующих белков MyBP-C, MyLC1 и MyLC2 с помощью MuRF1 представляет собой привлекательный новый механизм потери толстых филаментов, еще предстоит доказать, что эти последовательные шаги необходимы для потеря MyHC и быстрая атрофия. Также будет важно установить характер последующих стадий, которые приводят к потере тонких филаментов при атрофии, а также при более медленном обороте миофибриллярных компонентов в нормальных мышцах.Этот механизм (убиквитинирование ключевых регуляторных компонентов в миофибриллах) сильно отличается от часто встречающегося предположения, что начальная атака на сократительный аппарат осуществляется эндопротеазами, такими как каспазы (Du et al., 2004) или кальпаины (Tidball and Spencer, 2002). ). Хотя такие механизмы могут функционировать в определенных условиях апоптоза (Du et al., 2004), прямые доказательства того, что эти протеазы играют существенную или основную роль, отсутствуют, и настоящие результаты демонстрируют совершенно другой механизм, зависящий от MuRF1, который, по-видимому, функционирует in vivo. на уровне миофибрилл.

    Мутантный Runx2 регулирует амелогенез и остеогенез через ось miR-185-5p-Dlx2

    Конструирование векторов экспрессии с мутантным Runx2

    Вектор экспрессии pcDNA3.1-Runx2 с эпитопной меткой c-Myc был приобретен у OriGene Technologies, Inc. Сайт-направленный мутагенез in vitro выполняли для конструирования мутантов Runx2 M1 (pcDNA3.1-R197WRunx2), M2 (pcDNA3.1-R232QRunx2) и M3 (pcDNA3.1-A369VRunx2) с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Lightning ( Стратаген Корп., Ла-Хойя, Калифорния, США). Последовательности мутантных конструкций были проверены путем секвенирования целых векторов (дополнительные рисунки).

    Культура клеток, стимуляция и трансфекция

    Клетки LS8 (любезно предоставленные доктором Малкольмом Л. Снидом, Университет Южной Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния) поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) ), содержащий 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37 °C в 5% CO 2 во влажной атмосфере.Дифференцировку амелобластов в клетках LS8 индуцировали добавлением в среду для выращивания 20 мг/мл ретиноевой кислоты (RA, Фармакопея США) и 10 -7  М дексаметазона (DEX, Sigma) 38,39 .

    Клетки MC3T3-E1 были получены из Банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и содержались в α-модификации минимальной основной среды Игла (α-MEM, Invitrogen), содержащей 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицин. Для индукции дифференцировки остеобластов клетки MC3T3-E1 (1 × 10 5 на лунку) культивировали в шестилуночных планшетах в течение ночи и обрабатывали GIBCO ® STEMPRO в течение различной продолжительности (см. раздел «Результаты»).

    Дополнительные эксперименты по дифференцировке остеобластов включали ночную культуру клеток MC3T3-E1 (1 × 10 5 ) в 24-луночных планшетах и ​​трансфекцию 50 или 100 нМ миметиков miR-NC или miR-185-5p (Genepharma) с использованием липофектамина 2000 (Инвитроген). Два дня спустя эти клетки стимулировали с помощью GIBCO ® STEMPRO в течение различного времени. Клетки MC3T3-E1 собирали на белок и мРНК или фиксировали 95% этанолом (об./об.) для гистохимического исследования активности ЩФ.

    Выделение РНК и контроль качества РНК

    Суммарную РНК выделяли из клеток с использованием реагента TRIzol ® (Invitrogen life Technologies) и очищали с помощью набора RNeasy mini kit (Qiagen, Дания) в соответствии с инструкциями производителя.Концентрацию и качество РНК из клеток измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop и подтверждали с помощью гель-электрофореза. Профили экспрессии микроРНК определяли и генерировали для каждой из двух групп (группа дикого типа и группа мутантов).

    Мечение микроРНК и гибридизация массива микроРНК

    РНК достаточного качества из восьми групповых образцов ( n  = 3, всего 24 образца) была отправлена ​​в компанию KangChen-Biotech (Шанхай, Китай). Вышеупомянутые группы РНК с применением платформы микрочипов miRCURY с заблокированными нуклеиновыми кислотами (LNA) (Exiqon, Дания).Все процедуры проводились согласно протоколу производителя. Вкратце, 1 мкг тотальной РНК метили флуорофорами Hy3™ или Hy5™ с использованием набора miRCURY™ Array Power Labeling (Exiqon, Дания). После прекращения мечения реакционную смесь ненадолго раскрутить и оставить при 4 °C. Два образца из реакций мечения Hy3™ и Hy5™ объединяют на льду. Образцы гибридизовали на станции гибридизации с использованием массива микроРНК miRCURY™ LNA (v.18.0), содержащего нормализованные по Tm зонды для 847 человеческих микроРНК.Микрочипы с мечеными образцами гибридизовали при 56 °C в течение ночи в термоусадочном гибридизационном мешке и промывали с использованием буферного набора miRCURY Array Wash (Exiqon, Дания). После гибридизации предметные стекла с чипами промывали, сушили и сразу же сканировали. Каждое пятно микроРНК было воспроизведено четыре раза на одном и том же предметном стекле, и для каждой группы использовали два чипа микрочипа.

    Сканирование и анализ данных

    Сканирование выполняли с помощью микрочипового сканера Axon GenePix 4000B (Axon Instruments, Юнион-Сити, Калифорния, США).Программное обеспечение GenePix Pro 6.0 (Axon) использовалось для считывания необработанной интенсивности изображения. Чтобы добиться наилучшей нормализации внутри предметного стекла, чтобы свести к минимуму зависящие от интенсивности различия между красителями, интенсивность сигнала для каждого пятна сканировали и рассчитывали путем вычитания локального фона (на основе медианной интенсивности области, окружающей каждое пятно) из общей интенсивности с использованием локально взвешенное сглаживание графика рассеяния (Lowess) нормализация (MIDAS, система анализа данных микрочипов TIGR).После нормализации полученные средние значения для каждого пятна микроРНК использовали для статистики. Рассчитывали отношение зеленого сигнала к красному сигналу. Пороговое значение, которое мы использовали для скрининга микроРНК с повышенной и пониженной регуляцией, составляет кратность изменения  > 2,00 и кратность изменения  < 0,50. Иерархическая кластеризация для дифференциально экспрессируемых микроРНК была создана с использованием стандартной корреляции в качестве меры сходства.

    Количественная ПЦР в реальном времени

    Количественная ПЦР в реальном времени была проведена для подтверждения результатов массива.Реакции с обратной транскриптазой содержали 600 нг очищенной тотальной РНК, 20 нМ праймера RT «стебель-петля» (данные не показаны), 1 х RT буфер, 0,125 мМ каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP, 1 ЕД/мкл обратной транскриптазы и 0,6 ЕД/мкл ингибитора РНКазы. С помощью Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) проводили реакции объемом 20 мкл при следующих параметрах термоциклирования: 30 мин при 16°С, 42 мин при 42°С, 5 мин при 85°С, затем выдерживали. при 4 °С. Каждая реакционная смесь для количественной ПЦР в реальном времени содержала 1 × буфера для ПЦР, 1.5 мМ MgCl 2 , по 0,25 мМ каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP, 1 ЕД ДНК-полимеразы, 0,4 мкМ каждого праймера (данные не показаны), 0,25 х SYBR Green I, 1 мкл кДНК и деионизированная вода для общий объем 25 мкл. Реакции проводили при следующих параметрах термоциклирования: 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 95°С в течение 10 с и 60°С в течение 60 с. Пороговый цикл (Ct) определяется как дробный номер цикла, при котором флуоресценция превышает фиксированный порог, и каждый образец нормализовали на основе содержания в нем эндогенной РНК U6.Эксперимент проводился в трехкратной повторности.

    Реагенты

    Антитела: Anti-Dlx2 (номер по каталогу 1649-1) были приобретены у Epitomics, Inc. (Берлингейм, Калифорния). Анти-ALP (номер по каталогу 9516) приобретали у Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Ocn был приобретен у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта-Круз, Калифорния).

    Набор для анализа ALP, LabAssay™ ALP, был приобретен у Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Осака, Япония).

    миметика miR-185-5p, миметический контроль (miR-NC) и ингибитор miR-185-5p были синтезированы в Genepharma (Шанхай, Китай).

    Двойной репортерный анализ люциферазы

    Клетки HEK293 трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) конструкцией WT или мутантной pGL3-Dlx2 (200 нг) и miR-185-5p или miR-NC в течение 48 часов. В качестве положительного контроля использовали модифицированный контрольный вектор pGL3 без вставки 3UTR. Клетки, обработанные только реагентом Lipofectamine 2000, служили отрицательным контролем.

    Для количественного определения сигналов люминесценции с использованием люминометра (Glomax; Promega) использовали систему анализа репортерной системы Dual Luciferase (Promega).Уровни люциферазы светлячка нормализовали по значениям люциферазы Renilla из совместно трансфицированного вектора phRL-null (Promega).

    Конструирование векторов экспрессии Dlx2

    Комплементарные ДНК для мышиных генов Dlx2 были получены методом ОТ-ПЦР с использованием набора реагентов Prime-Script™ PT (TaKaRa). Тотальные РНК, полученные из клеток мыши MC3T3-E1, использовали для ОТ-ПЦР. Продукты ПЦР расщепляли BglII и NotI (Promega), очищали из агарозных гелей и субклонировали в pcDNA3.1 (Клонтех). Каждая кДНК была подтверждена секвенированием ДНК. Плазмидную ДНК трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Для создания мутантных конструкций Dlx2 (MT-pcDNA3.1-Dlx2) использовали специфичные для мутантов праймеры с использованием KOD-Plus (Toyobo Co.).

    Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени

    После индукции дифференцировки клеток LS8 в амелобласты с помощью RA/DEX в течение 48 ч общую клеточную РНК экстрагировали с использованием E.Z.N.A. Набор тотальной РНК ® (OMEGA Bio-Tec, США) согласно протоколу производителя.Качество выделенной РНК оценивали на спектрофотометре Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000C при 260/280 нм. Реагент PrimeScript™ RT Perfect Real Time Kit (TaKaRa Biotechnology, Далянь, Китай) использовали для обратной транскрипции РНК в кДНК. Праймеры для обнаружения амелогенина, эмалина, Klk4 и Mmp20 показаны в таблице 1. Для ПЦР в реальном времени использовали SYBR Premix Ex Taq™II (TaKaRa Biotechnology, Далянь, Китай). Амплификацию и обнаружение проводили с помощью прибора для ПЦР в реальном времени ABI 7500 (Applied Biosystems, Фостер, Калифорния, США) при следующих условиях: 30-секундный горячий старт при 95°C на стадии выдержки; 40 циклов по 15 с при 95 °С, 34 с при 60 °С в стадии циклирования; и 15 с при 95 °С, 1 мин при 60 °С, 30 с при 95 °С и 15 с при 60 °С на стадии кривой плавления.Относительные уровни экспрессии рассчитывали с использованием метода сравнительного порогового цикла (DDCT).

    Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР-анализа в реальном времени . Тотальную РНК экстрагировали с использованием TRIzol (Invitrogen) и подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора реагентов PrimeScript™ PT (TaKaRa). Амплификацию генов-мишеней проводили с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием кДНК в качестве матрицы, специфических праймеров и набора SYBR ® PrimeScript ® RT-PCR (Takara) на системе ПЦР в реальном времени ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems). , Карлсбад, Калифорния).ПЦР-амплификации проводили в двух повторностях при 95°С в течение 15 с и подвергали 40 циклам: 95°С в течение 5 с, 60°С в течение 30 с, 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 95°С. С в течение 15 с. Были использованы следующие праймеры: ALP: 5-CCC TCT CCA AGA CAT ATA ACAC-3′ и 5′-TTG CCC TGA GTG GTG TTG-3′; остеокальцин (Ocn): 5′-GGA CCA TCT TTC TGC TCA CT 3′ и 5′-CGG AGT CTG TTC ACT ACC TTA T-3′; Dlx2: 5′-CCG CTC GAG AAG GAT GGA CAA GTC AGA C-3′ и 5′-ATA GTT TAG CGG CCG CCT GCG AAT AAT GAA CAG AG-3′; и β-актин: 5′-AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC-3′ и 5′-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3′.Относительные уровни экспрессии миР-185-5p по отношению к контрольной мяРНК U6 количественно определяли с использованием анализа экспрессии микроРНК TaqMan (Applied Biosystems). Относительные уровни транскриптов мРНК гена-мишени по отношению к контрольному β-актину определяли с помощью 2 △△ Ct .

    Окрашивание и активность ALP

    Клетки MC3T3-E1 культивировали в течение ночи в шестилуночных планшетах при 3 × 10 5 клеток/лунку. Через два дня после трансфекции клетки обрабатывали STEMPRO в течение 7 дней, затем проводили окрашивание ALP и определение активности.Затем клетки фиксировали 95% этанолом (об./об.), а затем инкубировали с раствором субстрата из набора для окрашивания ALP (Beyotime ® Институт биотехнологии, Шанхай, Китай) в темноте в соответствии с протоколом производителя. Для анализа активности ALP после инкубации обработанные клетки дважды промывали PBS, к клеточному слою добавляли 200 мкл буфера для лизиса и выдерживали на льду в течение 5 минут. Лизат клеток обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин и центрифугировали при 1000× г при 4°С в течение 10 мин.Активность ALP анализировали спектрофотометрическим методом с использованием набора LabAssay™ ALP. Поглощение при 405 нм в каждой лунке измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов в соответствии с инструкцией производителя 40 .

    Окрашивание ализариновым красным

    Для выявления кальцификации во время дифференцировки остеобластов клетки MC3T3-E1, обработанные STEMPRO, через 21 день дважды промывали PBS и фиксировали 500 мкл охлажденного льдом 70% этанола в течение 10 мин. Фиксированные клетки окрашивали 500 мкл раствора ализарина красного (Sigma) в соответствии с инструкциями производителя.Для количественной оценки минерализации матрикса культуры, окрашенные ализариновым красным S, инкубировали в 100 мМ хлориде цетилпиридиния в течение 1 часа при комнатной температуре для растворения связанного с кальцием ализаринового красного S, поглощение которого измеряли при 562 нм и нормализовали по отношению к клеткам без какой-либо обработки. .

    Вестерн-блот-анализ

    Различные группы клеток MC3T3-E1 (2 × 10 6 на пробирку) лизировали в буфере для лизиса и экстракции радиоиммунного анализа преципитации (Thermo Fisher Scientific).Отдельные клеточные лизаты (10 мкг/дорожка) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидную мембрану Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). После блокирования блокирующим буфером SuperBlock T20 PBS (Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания) мембраны инкубировали с моноклональными антителами кролика против Dlx2 (1:1000), поликлональными антителами кролика против ALP (1:1000) и поликлональными антителами козы. против Окна (1:1000) соответственно. Связанные антитела обнаруживали с помощью разбавленных 1:10000 вторичных антител, конъюгированных с HRP, и визуализировали с использованием субстрата для вестерн-блоттинга Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific) с последующим экспонированием на пленке и цифровым изображением.

    Статистический анализ

    Данные выражены как среднее ± S.E. Данные анализировали с помощью одностороннего или двустороннего дисперсионного анализа. Анализ множественных сравнений между группами был выполнен с использованием метода апостериорного теста Бонферрони. P <  0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения StatView 5.0 (SAS Institute, Cary, NC) и программного обеспечения GraphPad Prism 4.0.

    Вирусы | Бесплатный полнотекстовый | Антропогенное заражение кошек во время пандемии COVID-19 2020 г.

    1

    MRC — Центр вирусных исследований Университета Глазго, Глазго G61 1QH, Великобритания

    2

    Клиническая лаборатория, отделение клинической диагностики и услуг, Центр клинических исследований, факультет Ветсюисс, Цюрихский университет, 8057 Цюрих, Швейцария

    3

    Клиника медицины мелких животных, Центр клинической ветеринарии, LMU Мюнхен, 80539 Мюнхен, Германия

    4

    Кафедра биомолекулярных наук о здоровье, Факультет ветеринарной медицины, Утрехтский университет, 3584 CL Утрехт, Нидерланды

    5

    Институт гигиены животных и ветеринарного здравоохранения Лейпцигского университета, 04103 Лейпциг, Германия

    6

    Maison Zabal, 64470 Этчебар, Франция

    7

    Департамент биомедицинских наук и ветеринарного здравоохранения (BVF), Шведский университет сельскохозяйственных наук (SLU), Box 7036, 750 07 Uppsala, Sweden

    8

    Лаборатория Scanelis, 31770 Коломье, Франция

    9

    Отделение болезней мелких животных с клиникой Института ветеринарной медицины Варшавского университета естественных наук — SGGW, 02-787 Варшава, Польша

    10

    Fundació Hospital Clínic Veterinari, Автономный университет Барселоны, Беллатерра, 08193 Барселона, Испания

    11

    Факультет ветеринарной медицины, Università degli Studi di Teramo, 64100 Teramo, Италия

    12

    Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Messina, 98168 Мессина, Италия

    13

    Бристольская ветеринарная школа, Бристольский университет, Бристоль BS40 5DU, Великобритания

    14

    Linnaeus Group, Ширли, Солихалл B90 4BN, Великобритания

    15

    Ветеринарная вирусология и вирусные болезни животных, кафедра инфекционных и паразитарных болезней, Исследовательский центр FARAH, факультет ветеринарной медицины, Льежский университет, B-4000 Льеж, Бельгия

    16

    Институт вирусологии, кафедра патобиологии, Университет ветеринарной медицины, 1210 Вена, Австрия

    *

    Автор, которому должна быть адресована корреспонденция.

    Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.