322 гк рф: ГК РФ Статья 322. Солидарные обязательства / КонсультантПлюс

Содержание

Статья 322 ГК РФ. Солидарные обязательства

Статья 322 ГК РФ. Солидарные обязательства

Актуально на:

07 марта 2022 г.

Гражданский кодекс, N 51-ФЗ | ст. 322 ГК РФ

1. Солидарная обязанность (ответственность) или солидарное требование возникает, если солидарность обязанности или требования предусмотрена договором или установлена законом, в частности при неделимости предмета обязательства.

2. Обязанности нескольких должников по обязательству, связанному с предпринимательской деятельностью, равно как и требования нескольких кредиторов в таком обязательстве, являются солидарными, если законом, иными правовыми актами или условиями обязательства не предусмотрено иное.

Постоянная ссылка на документ

  • URL
  • HTML
  • BB-код
  • Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Скачать документ в формате

Судебная практика по статье 322 ГК РФ:

  • Решение Верховного суда: Определение N 305-ЭС14-6511, Судебная коллегия по экономическим спорам, кассация

    Солидарная ответственность, предусмотренная статьей 322 Гражданского кодекса Российской Федерации, может применяться только в случаях, установленных законом или договором, в частности при неделимости предмета обязательства или при совместном причинении внедоговорного вреда в соответствии со статьей 1080 Гражданского кодекса Российской Федерации.

    ..

  • Решение Верховного суда: Определение N 305-ЭС14-6511, Судебная коллегия по экономическим спорам, кассация

    Согласно пункту 1 статьи 393 Гражданского кодекса Российской Федерации должник обязан возместить кредитору убытки, причиненные неисполнением или ненадлежащим исполнением обязательства. В силу пункта 1 статьи 322 Гражданского кодекса Российской Федерации солидарная обязанность (ответственность) или солидарное требование возникает, если солидарность обязанности или требования предусмотрена договором или установлена законом, в частности при неделимости предмета обязательства…

  • Решение Верховного суда: Определение N 310-ЭС14-8672, Судебная коллегия по экономическим спорам, кассация

    Как полагает иностранная компания, суды не учли принцип свободы договора, закрепленный в статье 421 Гражданского кодекса, не приняли во внимание допустимость заключения соглашений о солидарном принятии долга на основании пункта 1 статьи 322 Гражданского кодекса, неверно отождествили такие соглашения с договорами поручительства (статья 361 Кодекса). Приведенные заявителем кассационной жалобы доводы заслуживают внимания, в связи с чем данную жалобу с делом следует передать на рассмотрение Судебной коллегии по экономическим спорам Верховного Суда Российской Федерации…

+Еще…

Изменения документа

Постоянная ссылка на документ

  • URL
  • HTML
  • BB-код
  • Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Скачать документ в формате

Составить подборку

Анализ текста

Идет загрузка…

Статья 322 ГК РФ 2016-2019. Солидарные обязательства . ЮрИнспекция

Иногда обязанности ООО переходят к его учредителям и гендиру, бухуглаву (Субсидиарная ответственность учредителей (участников) и руководителя должника) . По общему правилу участники ООО не отвечают по его обязательствам и несут риск убытков, связанных с деятельностью общества, только в пределах стоимости внесенных ими вкладов, если иное не установлено учредительными документами общества. Однако, в соответствии с п. 4 ст. 61 ГК РФ, п. 1 ст. 224 Закона № 127-ФЗ в случае, если стоимость имущества должника — юридического лица, в отношении которого принято решение о ликвидации, недостаточна для удовлетворения требований кредиторов, такое юридическое лицо ликвидируется в порядке, предусмотренном Законом № 127-ФЗ. При этом в соответствии с п. 3 ст. 224 Закона № 127-ФЗ при обнаружении недостаточности стоимости имущества после принятия решения о ликвидации юридического лица и до создания ликвидационной комиссии (назначения ликвидатора) заявление о признании должника банкротом должно быть подано в арбитражный суд учредителем (участником) должника или руководителем должника. Учредители (участники) должника, нарушившие эти требования, несут субсидиарную ответственность за неудовлетворенные требования кредиторов по денежным обязательствам и об уплате обязательных платежей должника (п. 2 ст. 226 Закона № 127-ФЗ) . Если денежных средств ликвидируемого общества, в том числе полученных от реализации ее имущества, недостаточно для исполнения в полном объеме обязанности по уплате налогов и сборов, причитающихся пеней и штрафов, остающаяся задолженность должна быть погашена учредителями ООО в пределах и порядке, установленном законодательством РФ (п. 2 ст. 49 НК РФ) . То есть в данной ситуации применяется п.
1 ст. 87 ГК РФ, в соответствии с которым участники ООО погашают задолженность общества в пределах стоимости внесенных ими вкладов. Участники общества , внесшие вклады не полностью, несут солидарную ответственность по его обязательствам в пределах стоимости неоплаченной части вклада каждого из участников. Существо субсидиарной ответственности, о которой неоднократно говорилось выше, раскрыто в ст. 399 ГК РФ. До предъявления требований к лицу, которое в соответствии с законом, иными правовыми актами или условиями обязательства несет ответственность дополнительно к ответственности другого лица, являющегося основным должником (субсидиарную ответственность) , кредитор должен предъявить требование к основному должнику. Если основной должник отказался удовлетворить требование кредитора или кредитор не получил от него в разумный срок ответ на предъявленное требование, это требование может быть предъявлено лицу, несущему субсидиарную ответственность (п. 1 ст. 399 ГК РФ) . Кредитор не вправе требовать удовлетворения своего требования к основному должнику от лица, несущего субсидиарную ответственность, если это требование может быть удовлетворено путем зачета встречного требования к основному должнику либо бесспорного взыскания средств с основного должника (п.
2 ст. 399 ГК РФ) . Лицо, несущее субсидиарную ответственность, должно до удовлетворения требования, предъявленного ему кредитором, предупредить об этом основного должника, а если к такому лицу предъявлен иск, — привлечь основного должника к участию в деле. В противном случае основной должник имеет право выдвинуть против регрессного требования лица, отвечающего субсидиарно, возражения, которые он имел против кредитора (п. 3 ст. 399 ГК РФ) . Таким образом, к учредителю ООО переходят обязанности ООО, т. е. учредители (участники) ООО несут ответственность по долгам ООО перед налоговыми органами и другими кредиторами в случаях, предусмотренных ГК РФ, НК РФ, Законом № 14-ФЗ, Законом № 127-ФЗ (перечисленных выше в данном ответе) либо учредительными документами общества с ограниченной ответственностью.

Калмыцкий филиал «Россети Юг» устраняет в Калмыкии нарушения по заявкам потребителей

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Ахтубинский район

(851-41) 5-22-66

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Володарский район

(851-42) 9-18-04

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» г. Знаменск

(851-40) 9-74-72

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Енотаевский район

(851-43)9-17-25

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Икрянинский район

(851-44) 2-02-01

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Камызякский район

(851-45) 9-14-76

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Кировский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Красноярский район

(851-46)9-16-09

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Ленинский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Лиманский район

(851-47) 2-26-12

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Наримановский район

(851-2)57-45-44

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Приволжский район

(851-2)40-63-79

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Советский район г. Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Трусовский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Харабалинский район

(851-48) 5-74-63

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Черноярский район

(851-49) 2-13-54

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Алексеевский район

(84446)310-96

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Быковский район

8(84495)-315-36

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Волжский район

8(8443)-31-90-44
8(8443) 31-36-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Ворошиловский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Дзержинский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Красноармейский район

8(8442)-67-06-83
8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Дубовский район

8(86377)-518-66

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Краснооктябрьский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Кумылженский район

8(84462)-618-53

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Михайловский район

8(84463)-451-86

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Нехаевский район

(84443)-524-09

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Николаевский район

(84444)-614-90

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Новоаннинский район

(84447)-553-85

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Новониколаевский район

(84444)-614-90

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Октябрьский район

8(86360)-235-14

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Ольховский район

8(84456)-218-71

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Палласовский район

8(84492)-688-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Руднянский район

8(84453)-712-38

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Светлоярский район

8(84472)-567-12
8(8442)-67-06-83

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Серафимовичский район

8(84464)-435-53

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Советский район

8(86363)-232-94

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Среднеахтубинский район

8(84479)-515-84
8(8443)-31-90-44
8(8443) 31-36-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Старополтавский район

8(84493)-436-05

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Суровикинский район

8(84473)-223-48

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Тракторозаводский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Урюпинский район

(84442)-368-00

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Фроловский район

8(84465)-446-60

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Центральный район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Чернышковский район

8(84474)-612-04

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Городовиковский район

8 (84731) 9-11-72

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Ики-Бурульский район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Кетченеровский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Лаганский район

8 (84733) 9-17-13

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Малодербетовский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Октябрьский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Приютненский район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Сарпинский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Целинный район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Черноземельский район

8 (84733) 9-17-13

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Юстинский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Яшалтинский район

8 (84731) 9-11-72

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Яшкульский район

8 (84742) 9-27-97

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Азовский район

8(86342)-447-57

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Аксайский район

8(86350)-322-62

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Белокалитвинский район

8(86383)-269-50

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Боковский район

8(86382)-312-45

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Верхне-Донской район

8(86364)-311-72

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Веселовский район

8(86358)-611-63

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Волгодонский район

8(86394)-703-26

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Егорлыкский район

8(86370)-226-92

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Зерноградский район

8(86359)-311-49

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Зимовниковский район

8(86376)-315-71

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Кагальницкий район

8(86345)-977-04

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Каменский район

8(86365)-941-35

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Кашарский район

8(86388)-214-25

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Константиновский район

8(86393)-217-48

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Красносулинский район

8(86367)-500-08

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Куйбышевский район

8(86348)-315-79

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Мартыновский район

8(86395)-216-34

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Миллеровский район

8(86385)-206-73

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Милютинский район

8(86389)-217-52

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Мясниковский район

8(86349)-224-34

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Неклиновский район

8(86347)-525-39
8(86347)-563-04

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Новочеркасск район

8(86352)-659-95

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Обливский район

8(86396)-210-36

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Орловский район

8(86375)-360-23

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Песчанокопский район

8(86373)-919-52

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Пролетарский район

8(86374)-950-65

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Ремонтненский район

8(86379)-316-86

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Родионово-Несветайский район

8(86340)-302-39

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Сальский район

8(86372)-508-53

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Семикаракорский район

8(86356)-416-88
8(86356)-419-42

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Таганрог район

8(8634)-38-31-10
8(8634)-62-54-80

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Тарасовский район

8(86386)-314-45

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Тацинский район

8(86397)-303-97

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Усть-Донецкий район

8(86351)-914-69

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Целинский район

8(86371)-917-77

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Цимлянский район

8(86391)-211-96

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Чертковский район

8(86387)-218-11

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Шолоховский район

8(86353)-214-64

«Россети Юг» построят новую электросеть в запаромных селах Астраханской области

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Ахтубинский район

(851-41) 5-22-66

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Володарский район

(851-42) 9-18-04

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» г. Знаменск

(851-40) 9-74-72

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Енотаевский район

(851-43)9-17-25

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Икрянинский район

(851-44) 2-02-01

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Камызякский район

(851-45) 9-14-76

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Кировский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Красноярский район

(851-46)9-16-09

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Ленинский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Лиманский район

(851-47) 2-26-12

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Наримановский район

(851-2)57-45-44

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Приволжский район

(851-2)40-63-79

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Советский район г. Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Трусовский район г.Астрахани

(851-2) 79-31-11

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Харабалинский район

(851-48) 5-74-63

Астраханская область — Филиал «Астраханьэнерго» Черноярский район

(851-49) 2-13-54

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Алексеевский район

(84446)310-96

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Быковский район

8(84495)-315-36

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Волжский район

8(8443)-31-90-44
8(8443) 31-36-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Ворошиловский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Дзержинский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Красноармейский район

8(8442)-67-06-83
8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Дубовский район

8(86377)-518-66

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Краснооктябрьский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Кумылженский район

8(84462)-618-53

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Михайловский район

8(84463)-451-86

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Нехаевский район

(84443)-524-09

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Николаевский район

(84444)-614-90

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Новоаннинский район

(84447)-553-85

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Новониколаевский район

(84444)-614-90

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Октябрьский район

8(86360)-235-14

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Ольховский район

8(84456)-218-71

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Палласовский район

8(84492)-688-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Руднянский район

8(84453)-712-38

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Светлоярский район

8(84472)-567-12
8(8442)-67-06-83

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Серафимовичский район

8(84464)-435-53

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Советский район

8(86363)-232-94

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Среднеахтубинский район

8(84479)-515-84
8(8443)-31-90-44
8(8443) 31-36-20

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Старополтавский район

8(84493)-436-05

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Суровикинский район

8(84473)-223-48

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Тракторозаводский район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Урюпинский район

(84442)-368-00

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Фроловский район

8(84465)-446-60

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Центральный район

8(8442)-41-00-28

Волгоградская область — Филиал «Волгоградэнерго» Чернышковский район

8(84474)-612-04

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Городовиковский район

8 (84731) 9-11-72

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Ики-Бурульский район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Кетченеровский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Лаганский район

8 (84733) 9-17-13

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Малодербетовский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Октябрьский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Приютненский район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Сарпинский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Целинный район

8 (84742) 9-18-48

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Черноземельский район

8 (84733) 9-17-13

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Юстинский район

8 (84741) 2-10-26

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Яшалтинский район

8 (84731) 9-11-72

Республика Калмыкия — Филиал «Калмэнерго» Яшкульский район

8 (84742) 9-27-97

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Азовский район

8(86342)-447-57

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Аксайский район

8(86350)-322-62

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Белокалитвинский район

8(86383)-269-50

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Боковский район

8(86382)-312-45

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Верхне-Донской район

8(86364)-311-72

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Веселовский район

8(86358)-611-63

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Волгодонский район

8(86394)-703-26

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Егорлыкский район

8(86370)-226-92

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Зерноградский район

8(86359)-311-49

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Зимовниковский район

8(86376)-315-71

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Кагальницкий район

8(86345)-977-04

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Каменский район

8(86365)-941-35

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Кашарский район

8(86388)-214-25

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Константиновский район

8(86393)-217-48

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Красносулинский район

8(86367)-500-08

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Куйбышевский район

8(86348)-315-79

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Мартыновский район

8(86395)-216-34

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Миллеровский район

8(86385)-206-73

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Милютинский район

8(86389)-217-52

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Мясниковский район

8(86349)-224-34

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Неклиновский район

8(86347)-525-39
8(86347)-563-04

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Новочеркасск район

8(86352)-659-95

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Обливский район

8(86396)-210-36

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Орловский район

8(86375)-360-23

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Песчанокопский район

8(86373)-919-52

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Пролетарский район

8(86374)-950-65

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Ремонтненский район

8(86379)-316-86

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Родионово-Несветайский район

8(86340)-302-39

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Сальский район

8(86372)-508-53

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Семикаракорский район

8(86356)-416-88
8(86356)-419-42

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Таганрог район

8(8634)-38-31-10
8(8634)-62-54-80

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Тарасовский район

8(86386)-314-45

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Тацинский район

8(86397)-303-97

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Усть-Донецкий район

8(86351)-914-69

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Целинский район

8(86371)-917-77

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Цимлянский район

8(86391)-211-96

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Чертковский район

8(86387)-218-11

Ростовская область — Филиал «Ростовэнерго» Шолоховский район

8(86353)-214-64

Қазақстанда ауыр жүк көліктері үшін уақытша шектеу енгізілді

Сурет: pixabay. com

НҰР-СҰЛТАН. 7 НАУРЫЗ — 2022 жылғы 6 наурыз 23.59-дағы эпидемиологиялық жағдай бойынша Қазақстанда коронавирустық инфекцияның 1 303 848 жағдайы расталды, деп хабарлайды KAZAKHSTAN TODAY. 

Қазақстанда өткен тәулікте 141 адамда коронавирус індеті ПТР арқылы расталып ауырғаны белгілі болды. Аймақтар бойынша: 

Нұр-Сұлтан қаласында — 9; 

Алматы қаласында — 5; 

Шымкент қаласында — 3; 

Ақмола облысында — 4; 

Ақтөбе облысында — 0; 

Алматы облысында — 4; 

Атырау облысында — 0; 

ШҚО-да — 10; 

Жамбыл облысында — 1; 

БҚО-да — 6; 

Қарағанды облысында — 6; 

Қостанай облысында — 11; 

Қызылорда облысында — 0; 

Маңғыстау облысында — 2; 

Павлодар облысында — 6; 

СҚО-да — 24; 

Түркістан облысында — 0. 

Қазақстанда бір тәулік ішінде 535 адам коронавирустық инфекциядан сауығып кетті. Жалпы, елде CОVID-19-дан 1 277 112 адам жазылып кетті, деп хабарлайды CОVID-19 таратпау жөніндегі ВАК.  

7 наурызға КВИ-ден 14 199 адам (13 101 КВИ+ және 1 098 КВИ -) ем алуды жалғастыруда, оның ішінде: 

— стационарларда — 1 449 пациент бар; 

— амбулаториялық деңгейде — 12 750 пациент. 

КВИ+ және КВИ- науқастарының ішінде: 

— ауыр халде – 114 пациент, 

— аса ауыр халде – 42 пациент, 

— ӨЖЖ аппаратында – 28 пациент бар. 

2022 жылдың 6 наурызында коронавирустық инфекция белгілері бар пневмонияның (КВИ -) 17 жағдайы тіркелді, адам қайтыс болған жоқ, 31 адам сауығып кетті. 2020 жылғы 13 наурыздан бастап барлығы: ауру — 88 321, өлім — 5 344, сауыққандар — 81 879. 

2020 жылғы 13 наурыздан бастап 2022 жылғы 6 наурызға дейін ҚР-да КВИ-ден 13 635 өлім жағдайы тіркелді. 5 наурызда 6 адам қайтыс болды. 

Қазақстанда 2022 жылғы 6 наурызға I компонентпен 9 408 338 адам вакцинацияланды, II компонентпен 9 036 763 адам вакцинацияланды

ҚР барлық өңірлері «жасыл» аймақта орналасқан: Нұр-Сұлтан қ. , Алматы қ., Шымкент қ., Алматы, Ақтөбе, Атырау, Ақмола, Батыс Қазақстан, Шығыс Қазақстан, Жамбыл, Қарағанда, Қостанай, Қызылорда, Маңғыстау, Солтүстік Қазақстан, Павлодар, Түркістан облыстары. 

 

ОБЩИЕ ВЫБОРЫ - ШТАТ ГАВАЙИ - ОКРУГ МАУИ СТРАНИЦА 001
7 НОЯБРЯ 2000 ГОДА
** Итоговый отчет** Напечатано 08.11.00 в 00:29:52
Номер 1
================================================== ================================================== =========================================
 ПРЕЗИДЕНТ И ВИЦЕ-ПРЕЗИДЕНТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ - [D 12] OHA - SP VAC MAUI (1)
                                42 из 42 100.0 5 из 5 100,0 42 из 42 100,0
 (Г)ГОР\ЛИБЕРМАН 23 484 59,2 (Г)МОРИТА, Хермина М. (Мина) 2 307 75,0 ОТА, Чарльз С. 10 235 25,8
 (R )БУШ\ЧЕЙНИ 12 876 32,5 (NL)ВЕСТ-ТИКЛ, Энн Э. 386 12,6 КАЛАЛАУ, Сэм 5 639 14,2
 (Г)НАДЕР\ЛаДЮК 2499 6.3 НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 382 12.4 ХАО, Луис 4196 10.6
 (L )BROWNE\OLIVIER 182 0,5 БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 0 0,0 РАСТ, Джимми 3033 7,6
 (RF) BUCHANAN\FOSTER 122 0,3======================================== ===== КААХУМАНУ, Лаки П.  2217 5,6
 (C )PHILLIPS\FRAZIER 46 0,1 OHA - SP VAC AT LARGE (3) CLUBB, Genevieve (Lehua) 2 077 5,2
 (NL)HAGELIN\GOLDHABER 39 0,1 42 из 42 100.0 ГРАНТЭМ, Роджер Л. 1794 4,5
   ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 322 0,8 АКАНА, Ровена М.Н. 6 472 5,5 ПЕЛЕКАЙ Эдуард П. 728 1,8
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 95 0,2 ТРАСК, Милилани Б. 6 205 5,2 ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 9 690 24,4
============================================== WAIHE'E , Джон Д., IV 5 648 4,8 БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 56 0,1
 СЕНАТОР США ДЕСОТО А.Франция 4583 3,9 ==============================================
                                42 из 42 100,0 СТЕНДЕР, Освальд К. 4 411 3,7 OHA - НА ВСЕХ (1)
 (D )АКАКА, Даниэль К. 27 695 69,8 БРАНДТ, Нани Г. 3 129 2,6 42 из 42 100,0
 (R)КЭРОЛЛ, Джон 8 808 22,2 КАМАЛИ'И, Кина'у Бойд 2 612 2,2 АПОЛИОНА, Хаунани 6 600 16,7
 (NL)КЛЭГГ, Лаури А.500 1,3 ЛИ, Ричард 2 340 2,0 КАРПЕНТЕР, Данте Кеала 3 975 10,0
 (L) МАЛЛАН, Ллойд Джеффри 349 0,9 ОЛДС, Налани 2 266 1,9 Айона, Дэрроу Л. Канакануи 2 473 6,3
 (К)ПОРТЕР, Дэвид 179 0,5 КААПУ, Кекоа Дэвид мл.  1 773 1,5 ЛИ, Брайан Акана 1 398 3,5
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 2099 5.3 МАКГРЕГОР, Боб 1709 1.4 КААУВАИ-ИВАМОТО, Линда 1355 3,4
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 35 0,1
=============================================== БЕЙТС, Беверли 1 687 р. 1,4 АКАУ, Люси 1 183 3,0
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ США - [D 2] ТУНГПАЛАН, Элоиза Улулани Д 1 675 1,4 РОБИНСОН, Терстон 1 169 3,0
                                42 из 42 100.0 ДЕ КОСТА, Дениз Махилани 1 567 1,3 КОНКЛИН, Кеннет Р. 1 142 2,9
 (D )МИНК, Пэтси Такемото 24 288 61,2 ПИБОДИ, Джордж (Алоха) 1 348 1,1 СТОУН, Нэнси (Похаку) 1 111 2,8
 (R)ФРЭНСИС, Русс 12 109 30,5 АКИНА, Крейн Кауахи 1 317 1,1 КАМА, Питер 824 2,1
 (L) ДЮКЕН, Лоуренс Г.К. 831 2.1 ХАНАЛЕЙ Ральф (Хана) 1 278 1.1 КЛАРК Кауила 519 1.3
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 2 424 6,1 КОТОМОРИ, Джанет 1 203 1,0 ХАУПУ, Волна 474 1,2
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 13 0,0 ДЖАЙЛС, Джейсон К. 1101 0,9 НАЛУАЙ, Д. Кеала (Дотти) 422 1,1
============================================== ВОНГ, Джимми 1 082 0,9 СРЕДИ Лесь А. 356 0,9
 СЕНАТОР ШТАТА - [D 5] КЕЛИЙХОЛОКАЙ, Дженнифер 1079 0. 9 КАЛУА, В. Халемано 351 0,9
                                15 из 15 100,0 ЭВАНС, Кимо Киану 962 0,8 КАХУИ, Крейг (Бо) 317 0,8
 (D )ENGLISH, J. Kalani 8 300 53,7 KAUHANE, Mike 937 0,8 KAPELE, Jay Jay (Jeff) 305 0,8
 (R )ШИШИДО, Аллен Т. 6 547 42,4 ПАРК, Бернадетт (Акиона) 909 0,8 АМСТЕРДАМ, Кауи Джоханан 220 0,6
   ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 594 3.8 РОУЗ, Чарльз (Кале Локе) 908 0,8 КИПИЛИИ, Франклин 123 0,3
   ЗА ГОЛОСОВ 7 0,0 ХАББАРД, Лела Малина 897 0,8 ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 13 598 34,4
============================================== ГРИНВУД, Элис У. Оупнуи 849 0,7 БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 316 0,8
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГОСУДАРСТВА - [D 7] КАНЭКОА, Митчелл III 846 0,7 ==================================== ==========
                                  9 из 9 100.0 МОРРИСОН, Харриет Илима 819 0,7 OHA — ГАВАЙИ (1)
 (R)ДЭВИС, Рон 3 114 51,8 ВОНГ, Эдвина А.Л. 809 0,7 42 из 42 100,0
 (D)КАХО'ОХАЛАХАЛА, Сол П. 2 594 43,2 КАЛЕИКИНИ, Ловелл Ф. 677 0,6 ДЕЛА КРУЗ, Линда К. 8 799 22,2
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 301 5,0 ПАДЕКЕН, Чармейн Х. 650 0,5 СПРИНГЕР, Ханна (Кихалани) 5 052 12,8
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 2 0. 0 ГОРА, Фрэнсис Кеуа 605 0,5 КУАМО'О, Эйлин М. 3774 9,5
=============================================== HAIA, Томас АК 604 0,5 ХОК, Артур А. 3 381 8,5
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГОСУДАРСТВА - [D 8] КАИР, Гордон Кона 581 0,5 ХОЛЛ, Кайноа Дж. 3 219 8,1
                                  6 из 6 100,0 EBISU, Tulane E. 565 0,5 ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 15 303 38.7
 (D)СОУКИ, Джо 3 586 51,6 БЕРК, Джин П. К. (Кини) 529 0,4 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 27 0,1
 (R) ПЕТЕРСОН, Пэтти (Нагасако) 3018 43,4 КУПАУ, О. 506 0,4 ================================ ==============
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 341 4,9 EBEL, Bud 467 0,4 OHA - КАУАИ (1)
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 4 0,1 ШНАЙДЕР, Лойсон Эрлл 465 0,4 42 из 42 100.0
============================================== FINA'I , Чарл Калейалохаона 454 0,4 ​​КАТАЛУНА, Дон 11 667 29,5
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГОСУДАРСТВА - [D 9] ПАЛЧИЧ, Майкл (Большой Майк) 348 0,3 БЕНИАМИНА, Джин Илей Кил 4 346 11,0
                                  7 из 7 100,0 КЕЛИЙХОЛОКАЙ, Демитриус 271 0,2 РЕГО, Рэнди С. Наукана 2 587 6,5
 (D) НАКАСОНЕ, Боб 5793 76,7 ТОЛЕР, Дастин 267 0. 2 ТОРИО, Джеймс Капуле 2566 6,5
 (R )ГЕНРИ, Джон Ф. 1332 17,6 ЙИН, Томас М. 247 0,2 ОКЛИТ, Элоиза Канеакуа Туту 2320 5,9
   БЕСПЛАТНЫЕ ГОЛОСЫ 427 5,7 ПЕЛЬТЬЕ, Виктор (Уми) 234 0,2 БЕСПЛАТНЫЕ ГОЛОСЫ 16 057 40,6
   БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 1 0,0 САБЕЙ, Джон Л. 208 0,2 БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 12 0,0
============================================== ТИВАНАК, Эрик Кууалоха 175 0.1 ==============================================
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГОСУДАРСТВА - [D 10] СТАРЕЙШИЕ, Мейтленд П. К. 153 0,1 OHA - МОЛОКАИ (1)
                                  8 из 8 100,0 МАЛЬТЕРРЕ, Вальтер Г. 143 0,1 42 из 42 100,0
 (R )БУКОСКИ, Кика 3 374 43,2 ПРИ ГОЛОСОВАНИЯХ 46 089 38,9 КЕАЛОХА, Сэмюэл Л., мл. 12 021 30,4
 (D )VROOM, JJ 2889 37,0 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 211 0.2 МАЧАДО, Колетт Ю. Пийпии 11 393 28,8
 (А) ГИБСОН, Малия 1076 13,8======================================== ===== ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 16 137 40,8
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 476 6.1 OHA - SP VAC OAHU (1) БОЛЬШЕ ГОЛОСОВ 4 0.0
   ЗА ГОЛОСОВ 3 0,0 42 из 42 100,0 ========================================= =====
============================================== HEE, Клейтон 15 401 38. 8 ЧЛЕН СОВЕТА - ВОСТОК МАУИ
 ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГОСУДАРСТВА - [D 11] ТАКАМИНЕ, Вики Холт 5 769 14,5 41 из 41 100,0
                                  7 из 7 100,0 ТОМПСОН, Ричард 4 455 11,2 КЭРРОЛЛ, Роберт (Боб) 23 099 58,3
 (R)ХАЛФОРД, Крис 4 361 52,8 Мурата, Тодд 1 715 4,3 НИКХИЛАНАНДА, Ник 9 731 24,6
 (D)СТАРР, Джонатан 3 244 39.3 ВОНГЭМ, Грег 903 2,3 ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 6 782 17,1
 (G )СТЕНШОЛ, Шон 241 2,9 ПРОПУСКА ГОЛОСОВ 11 392 28,7 ПРЕВЫШЕНИЕ ГОЛОСОВ 6 0,0
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 405 4,9 ЗА ГОЛОСА 30 0,1 ========================================= =====
   ЗА ГОЛОСОВ 8 0,1============================================= знак равно
===============================================



   (A ) = ALOHA 'AINA (C ) = КОНСТИТУЦИЯ (G ) = HAWAII GREEN (NL) = ЕСТЕСТВЕННЫЙ ЗАКОН (RF) = РЕФОРМА
   (D) = ДЕМОКРАТ (L) = ЛИБЕРТАРИАНТ (N) = БЕСПАРТИЗАНСКИЙ (R) = РЕСПУБЛИКАНСКИЙ

ОБЩИЕ ВЫБОРЫ - ШТАТ ГАВАЙИ - ОКРУГ МАУИ СТРАНИЦА 002
7 НОЯБРЯ 2000 ГОДА
** Итоговый отчет** Напечатано 08.11.00 в 00:30:00
Номер 1
================================================== ================================================== =========================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - ЗАПАД МАУИ БОЭ 7-Й ОТДЕЛ / КАУАИ (1)
                                41 из 41 100. 0 42 из 42 100,0
 ДЖОНСОН, Джо Энн 16 801 42,4 НАКАШИМА, Мицуги 13 617 34,3
 НАКАМУРА, Деннис Ю. 16 676 42,1 ХАРА, Шервуд 12 391 31,2
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 6 130 15,5 НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 13 653 34,4
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 11 0,0 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 4 0,0
================================================== ============================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - WAILUKU-WAIHEE-WAIKAPU ПОПРАВКА К КОНСТИТУЦИИ: UH САМОУПРАВЛЕНИЕ
                                41 из 41 100.0 42 из 42 100,0
 КЕЙН, Дейн П. 21 146 53,4 ДА 28 101 71,0
 ВИКТОРИНО, Майкл (Майк) 13 381 33,8 НЕТ 8 074 20,4
   ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 5 084 12,8 ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 3 374 8,5
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 7 0.0 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 6 0.0
================================================== ============================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - ПОПРАВКА К КОНСТИТУЦИИ КАХУЛУИ: НАЗНАЧЕНИЕ НАЛОГОВОЙ ПРОВЕРКИ
                                41 из 41 100.0 КОМИССИЯ 42 из 42 100,0
 АРАКАВА, Алан М. 21 169 53,4 ДА 12 564 31,8
 ДЭВИС, Майк 14 143 35,7 НЕТ 22 999 58,1
   ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 4 297 10,8 ПУСТЫЕ ГОЛОСЫ 3 969 10,0
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 9 0,0 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 23 0,1
================================================== ============================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - ПОПРАВКА К КОНСТИТУЦИИ ЮЖНОГО МАУИ: СЕНАТ В ШАХМАТЕ
                                41 из 41 100. 0 ТЕРМИНЫ 42 из 42 100,0
 НИШИКИ, Уэйн К. 18 999 48,0 ДА 26 602 67,3
 БРИТТОН, Линн 17 150 43,3 НЕТ 7 701 19,5
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 3 459 8,7 НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 5 242 13,3
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 10 0.0 БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 10 0.0
================================================== ============================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - MAKAWAO-HAIKU-PAIA РЕГИСТРАЦИЯ И ЯВКА
                                41 из 41 100.0
 МОЛИНА, Майк 18 668 47,1 *******************************
 ЭНРИКЕС, Джон Уэйн 15 603 39,4 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
   ПУСТЫЕ ГОЛОСОВ 5 338 13,5 *******************************
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 9 0.0 ВСЕГО ЗАРЕГИСТРИРОВАННЫХ 73 331
===============================================
 СОВЕТ - ОБЩАЯ ЯВКА 39 665 54,1
                                41 из 41 100,0
 ТАВАРЕС, Чармен 22 870 57.7 ЯВКА НА УЧАСТОК 33 193 45,3
 КАХО'ОХАНОХАНО, Дэвид Э. 11 545 29.1 БАЛЛОТЫ 33 193
   ПУСТЫЕ ГОЛОСОВЫЕ 5 195 13,1 Б БЮЛЛЕТЕНЕЙ 33 139
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 8 0.0
============================================== ЗАОЧНАЯ ЯВКА 6 472 8,8
 ЧЛЕН СОВЕТА - LANAI A ГОЛОСОВАНО 6 472 БЮЛЛЕТЕНЕЙ
                                41 из 41 100. 0 B БЮЛЛЕТЕНЕЙ 6 416
 ХОКАМА, Рики 16 743 42,3
 КАВАМУРА, Джорджина Кауи 15 668 39,5=========================================== ===
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 7 201 18,2
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 6 0.0
===============================================
 ЧЛЕН СОВЕТА - МОЛОКАИ
                                41 из 41 100,0
 КАВАНО, Патрик С. 26 469 66,8
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 13 149 33,2
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 0 0.0
===============================================
 BOE 1-й ОТДЕЛ / ГАВАЙИ (1)
                                42 из 42 100,0
 ВАТАНАБЭ, Герберт С. 16 440 41,4
 КИНТАНА-ДЭВИС, Нани 12 808 32,3
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 10 408 26,2
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 9 0.0
===============================================
 BOE 2-й ОТДЕЛ/МАУИ (1)
                                42 из 42 100,0
 УЕОКА, Мейер М. 11 517 29,0
 МАЙЕРС, Уильям (Билл) 6 308 15.9
 БЛАНДЕЛЛ, Брайан К. 6 218 15,7
 ЛИНАРЕС, Винни 5 308 13,4
 НАКАО, Дуайт 3 548 8,9
   НЕЗАВИСИМЫЕ ГОЛОСЫ 6 721 16,9
   БОЛЕЕ ГОЛОСОВ 45 0,1
===============================================





   (A ) = ALOHA 'AINA (C ) = КОНСТИТУЦИЯ (G ) = HAWAII GREEN (NL) = ЕСТЕСТВЕННЫЙ ЗАКОН (RF) = РЕФОРМА
   (D) = ДЕМОКРАТ (L) = ЛИБЕРТАРИАНТ (N) = БЕСПАРТИЗАНСКИЙ (R) = РЕСПУБЛИКАНСКИЙ

 

процессов | Бесплатный полнотекстовый | Оптимизированная схема очистки для извлечения активных ADAMTS13 из кондиционированных сред

1.

Введение ADAMTS13 (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивом тромбоспондина типа 1, член 13) представляет собой фермент металлопротеазу, в основном продуцируемый и секретируемый звездчатыми клетками печени и эндотелиальными клетками [1,2,3]. Его основная функция заключается в разрушении ультракрупных мультимеров фактора фон Виллебранда (ФВ), которые гиперактивны в спонтанно агглютинирующих тромбоцитах в местах с поврежденным эндотелием [4,5,6,7]. Уровни активности ADAMTS13 в плазме сильно различаются у здоровых людей и зависят от анализа.В целом плазматическая активность ADAMTS13 на уровне 40–170% считается нормальной для здоровых людей [8]. Кроме того, было продемонстрировано, что предполагаемая наследуемость уровней антигена ADAMTS13 составляет от 59,1% до 83,5% [9]. Любое искажение оси ADAMTS13/VWR приводит к дефектам первичного гемостаза. Более высокий уровень ADAMTS13 (на 35%) наблюдается у пациентов с болезнью фон Виллебранда (БВ) 3 типа [10]. Отсутствие или снижение активности ADAMTS13 приводит к персистенции ультракрупных мультимеров фактора Виллебранда (ULVWF) в кровотоке и может иметь серьезные клинические последствия (11,12). Считается, что ТТП вызывается генетическими мутациями в ADAMTS13 или приобретенной этиологией, такой как аутоантитела против ADAMTS13, и при отсутствии надлежащего лечения имеет высокий уровень смертности 85–90% [11,13]. Дефицит ADAMTS13 также влияет на другие патологические тромбозы, такие как инфаркт миокарда и ишемический инсульт [12,14,15,16,17,18]. Кроме того, в последнее время повышенное клиническое внимание было обращено на ADAMTS13 из-за его последствий для COVID-19. Клинические исследования показали, что приобретенная ТТП может возникать одновременно с инфекцией COVID-19, а низкие уровни ADAMTS13 в плазме у пациентов с COVID-19 связаны с повышенной смертностью и тяжестью заболевания [19,20,21].Для этих пациентов с ТТП для лечения острых эпизодов ТТП проводится комплементарная терапия с инфузией плазмы или продукта, полученного из плазмы. В качестве потенциального варианта лечения для повышения уровня ADAMTS13 у пациентов с дефицитом рекомбинантный ADAMTS13 (rADAMTS13) находится в стадии разработки (ClinicalTrials. gov Identifier: NCT02216084 и NCT03997760) [16,22,23]. По сравнению с инфузией плазмы использование rADAMTS13 более эффективно и легче поддается контролю благодаря высокой концентрации и более удобному введению.Использование рекомбинантных белков обеспечивает значительно меньший риск переносимых с кровью патогенов, аллергических реакций или объемной перегрузки [24]. Однако необходимы дальнейшие исследования для полной оценки терапевтической применимости, безопасности и эффективности rADAMTS13 в качестве таргетного антитромботического агента. Хотя большая часть биологической характеристики ADAMTS13 была выяснена, правильная оценка рекомбинантных терапевтических кандидатов требует всестороннего исследования структуры, активности и иммуногенности белка после его получения с помощью систем экспрессии и очистки.Зрелый ADAMTS13 (аминокислоты #75-1427; активная цепь) имеет сложную доменную архитектуру, которая состоит из домена каталитической металлопротеазы, домена дезинтегрина, восьми повторяющихся мотивов тромбоспондинового типа, домена, богатого цистеином, спейсерного домена и двух доменов CUB. 1,4]. Взаимодействие ADAMTS13 с мультимерами VWF опосредовано CUB и спейсерными доменами ADAMTS13, которые претерпевают небольшие конформационные сдвиги, чтобы поддерживать его взаимодействие с VWF [25,26,27,28]. Экзозиты в спейсере ADAMTS13 и доменах, богатых цистеином, распознают домен A2 VWF, который становится открытым, как только повышенные сдвигающие силы вызывают распутывание VWF [25,29].Впоследствии ADAMTS13 связывает ФВ через свой дезинтегриновый домен, и это взаимодействие облегчает аллостерическую активацию металлопротеазного домена, катализирующую расщепление ФВ по пептидной связи Tyr1605-Met1606 в его домене А2 (рис. 1а) [25,27,30,31]. ,32,33]. Благодаря наличию доменов дезинтегрина и каталитической металлопротеазы ADAMTS13 классифицируется как часть семейства адамализинов (ADAM и ADAMTS) [34]. Это семейство далее сгруппировано с другими металлопротеазами, которые представляют собой ферменты, названные соответствующим образом из-за того, что они полагаются на определенные ионы металлов для облегчения своей активности. Для семейства белков ADAMTS каталитическая активность металлопротеазного домена зависит от взаимодействия с цинком и кальцием. Каталитический домен ADAMTS консервативен и состоит из цинксвязывающего мотива HEXXHXXGXXH и метионинового домена («Met-turn»), который структурно поддерживает цинковый каталитический сайт [35,36]. Из-за этого протеолитического механизма металлопротеазы требуют тщательной структурной и функциональной оценки после очистки, особенно когда в их выделении участвуют металлы.Кроме того, ADAMTS13 богат остатками пролина, из которых 108 из 118 всех пролинов находятся в его активной цепи. Для больших белков с большим количеством остатков пролина скорость фолдинга белка становится ограниченной активностью пептидил-пролил-цис-транс-изомераз [37]. Неэффективный процессинг этим ферментом может препятствовать точной укладке ADAMTS13. ADAMTS13 также претерпевает множество посттрансляционных модификаций, включая C-маннозилирование, N-связанное гликозилирование и O-фукозилирование, которые необходимы для его секреции [38,39,40]. Из-за своей сложной структуры и уникального каталитического механизма ADAMTS13 часто рассматривается как белок, который очень трудно выделить в нативной и высокоактивной форме [41]. В настоящее время наиболее распространенные схемы очистки rADAMTS13 основаны на хроматографии с аффинной хроматографией [42, 43]. Типичные выходы этих методов составляют ~0,1 мг/л из-за низкой экспрессии ADAMTS13 [31]. Хотя эти схемы очистки широко используются и действительно являются жизнеспособным методом очистки, существует потребность в дальнейшей оптимизации.В качестве металлопротеаз очищенные белки ADAMTS13, полученные с помощью этих схем очистки, не идеальны для ферментативных анализов, поскольку на их активность могут влиять взаимодействия с иммобилизованными ионами металлов [44,45,46]. При создании оптимальной схемы очистки для извлечения интересующего белка важно учитывать факторы, которые могут специфически изменить нативные характеристики белка. На активность ADAMTS13, включая кинетику связывания, могут влиять такие факторы, как pH и ионная среда [47,48].

Здесь мы сообщаем об оптимизированной схеме очистки для выделения rADAMTS13 с высокой активностью. Мы использовали анионный обмен с последующей аффинной хроматографией с тегом V5 для извлечения rADAMTS13 из кондиционированной среды. rADAMTS13, очищенный с помощью этих методов, сохраняет свою посттрансляционную архитектуру и обладает высокой протеолитической активностью. Этот протокол был оптимизирован для получения активных меченых rADAMTS13 в достаточно больших количествах для проведения лабораторных структурных и биохимических экспериментов.

2.Материалы и методы

2.1. Генерация и рост клеточных линий

ADAMTS13 (NM_139025.5) и систему Flp-In (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) использовали для создания стабильных экспрессионных клеточных линий. В отличие от систем лентивирусной трансфекции, система Flp-In позволяет экспрессировать ADAMTS13 из одной копии, интегрированной в указанное место генома в клеточной линии. ADAMTS13 экспрессируется и секретируется в среду. Последовательность ADAMTS13 была клонирована внутри рамки считывания в вектор сайта-мишени рекомбинации Flp, pcDN5/FRT/V5-His Topo (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) компанией GenScript USA Inc.(Пискауэй, Нью-Джерси, США).

Детальное получение клеток Flp-In HEK293, которые стабильно экспрессируют С-концевой V5-His-меченый ADAMTS13 под контролем промотора CMV, было описано ранее [49]. Вкратце, в соответствии с инструкциями производителя эти клетки котрансфицировали полноразмерной меченой кДНК ADAMTS13, клонированной в вектор pcDNA5/FRT и вектор pOG44, кодирующий фермент Flp-рекомбиназу. Селекцию проводили с использованием 300 мкг/мл гигромицина.

Клетки выращивали и поддерживали в «сывороточной среде», состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD, USA) с добавлением Pen-Strep, L-глютамина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и инкубировали в 5% CO 2 при 37 °C.

2.2. Рост клеток в культуральных флаконах BelloCell System
Параллельно с культивированием в колбах T175 см 2 клеточную линию ADAMTS13-Flp-In HEK293 выращивали в системе BelloCell, состоящей из 500 мл культуральных флаконов, установленных на контрольном BelloStage-3000 ( Chemglass Life Sciences, Вайнленд, Нью-Джерси, США) и помещали в инкубатор CO 2 .Флаконы заполняли 470 мл питательной среды и инкубировали на столике в течение 30 мин. При этом клетки, первоначально выращенные в 3–4 колбах Т75 см 2 , собирали, подсчитывали и разводили в 30 мл питательной среды до концентрации 3,33 × 10 6 клеток/мл. Протокол посева соблюдали в соответствии с инструкциями производителя [50], при этом клетки (100 × 10 6 клеток, суспендированные в 30 мл среды) медленно выбрасывали из стерильной пипетки на матрицу с равномерным распределением и культивировали с частотой колебаний 2 мм −1 вверх и вниз, время удержания вверху 20 с и время удержания внизу 0 с. Через 4 ч скорость колебаний была снижена до 1 мм/с -1 , при этом время выдержки вниз составило 60 с, время выдержки вверху — 10 с для одного биореактора (А) и 0 с для второго биореактора (В). оценить два различных времени удержания для надлежащего переноса кислорода из воздуха в клетки (см. рисунок 2). Через три дня после посева или когда содержание глюкозы в среде было ниже 1 г/л, среду отсасывали из биореактора и заменяли 500 мл свежей среды. После этого среду собирали и заменяли каждые два дня и меняли на среду с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) после 4 циклов сбора (8 дней).Клетки культивировали в среде с пониженным содержанием сыворотки в течение дополнительных 10 дней. За это время среду меняли 5 раз каждые 48 ч (см. рис. 3).
2.3. Сбор клеток и сбор сред

Параллельно с системой бутылей для культивирования BelloCell клеточные линии ADAMTS13-Flp-In HEK293 выращивали в колбах для клеточных культур T175 см 2 при том же графике культивирования и сбора, что и в биореакторах. Клетки высевали с той же плотностью (100 × 10 6 клеток) и поддерживали, пассировали и выращивали в общей сложности до 40 колб Т175 см 2 к 11-му дню культивирования.После 11 дней культивирования сывороточную среду как в культуральных флаконах, так и в колбах заменяли на среду с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Клетки инкубировали в этой среде в течение 48 ч и заменяли свежей средой с восстановленной сывороткой после каждого сбора. Среду собирали с помощью вакуумной системы, фильтровали через 0,2 мкм вакуумные фильтрующие установки Nalgene Rapid-Flow (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Супернатант замораживали и хранили при температуре -80°С до использования.

2.4. rADAMTS13 Purification

Для мелкомасштабной очистки (0,5–2,0 л) супернатант концентрировали и подвергали диафильтрации с 1x буфером PBS с использованием центрифужных фильтров Amicon Ultra-15 (10 кДа) (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) и очищали rADAMTS13. с помощью аффинной очистки V5, как описано ниже.

Для крупномасштабной очистки (4–30 л) надосадочную жидкость сначала доводили до pH 8,0 с помощью 2 М трис-HCl и разбавляли в 3 раза деионизированной водой перед ионообменной хроматографией на Q-сефарозе [31].Для очистки белка из 12 л супернатанта клеточной культуры разбавленный супернатант (36 л) загружали на 300 мл смолы Q Sepharose Fast Flow (Cytiva, Мальборо, Массачусетс, США), упакованной в колонку HiScale 50 (Cytiva, Мальборо, Массачусетс, США). США) уравновешивают 20 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl, pH 8,0 при 4 °C. Колонку промывали уравновешивающим буфером до тех пор, пока поглощение при 280 нм не возвращалось к базовой линии, и белок элюировали 5 объемами колонки 20 мМ Трис-HCl, 0,5 М NaCl, рН 8,0. Общий элюирующий пул (1.1 л) концентрировали (приблизительно в 44 раза) и диафильтровали с 1x буфером PBS с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-15 (10 кДа). После добавления фенилметилсульфонилфторида и бензамидина до конечных концентраций 0,5 и 5 мМ, соответственно, весь диафильтрованный пул (47 мл) затем очищали аффинной очисткой V5 с использованием смолы против метки V5 (MBL International Corporation, Woburn, MA, США) согласно инструкции производителя с небольшими изменениями. Пул был применен к столбцу (2.5 × 20 см), содержащую смолу против V5-tag (7 мл смолы на 12 л супернатанта клеточной культуры), уравновешенную 1x буфером PBS, и колонку осторожно встряхивают в течение ночи при 4 °C. Затем колонку промывали 1× буфером PBS и элюировали rADAMTS13 пептидом V5 (200 мкг/мл) в 1× буфере PBS. Фракции элюции, проанализированные с помощью SDS-PAGE, объединяли (около 6 фракций), концентрировали и подвергали диафильтрации с 1× буфером PBS с использованием центрифужных фильтров Amicon Ultra-15 (10 кДа) для удаления пептидов V5. Концентрацию белка и выход определяли с помощью Nanodrop 2000C (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Крупномасштабная очистка белка была проведена Центром биотехнологических ресурсов FDA.
2.5. rADAMTS13 Оценка
2.5.1. Анализ rADAMTS13 с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга

Анализ экспрессии rADAMTS13 в бессывороточной среде и чистоты белка проводили путем разделения с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (Invitrogen) и/или вестерн-блоттингом. . Вестерн-блоты исследовали мышиным моноклональным антителом против V5 (R960-25, ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в паре со вторичным козьим антимышиным антителом IRDye 800CW (LI-COR, Линкольн, Небраска, США).Мембрану визуализировали с помощью системы визуализации LI-COR Odyssey DLx (LI-COR, Lincoln, NE, USA). Анализ интенсивности полос был выполнен с помощью инструментов анализа системы визуализации LI-COR (LI-COR, Lincoln, NE, USA) и с помощью ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Был проанализирован репрезентативный блот из трех отдельных экспериментов.

2.5.2. rADAMTS13 Antigen Measurement

Количественное определение rADAMTS13 в кондиционированных средах проводили с использованием набора Human ADAMTS13 Quantikine ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) в соответствии с инструкциями производителя.Стандартную кривую строили в диапазоне 50–0,781 нг/мл с использованием стандартов rADAMTS13 человека, входящих в набор. Серийные разведения кондиционированных сред тестировали для подтверждения пропорциональности обнаруженного ответа разбавлению. Концентрацию rADAMTS13 в образцах кондиционированных сред определяли на основе стандартной кривой с поправкой на разведение и выражали в единицах нг/мл.

2.5.3. Измерение активности rADAMTS13
Активность измеряли с использованием субстрата FRETS-VWF73 (Vivitide, Gardner, MA, USA), как описано ранее [44].Субстрат и среда rADAMTS13, собранные из культур или очищенного белка rADAMTS13, сначала инкубировали по отдельности при 37 °C в течение 5 мин. После объединения было получено 60 показаний общей флуоресценции с интервалом в 1 минуту с помощью планшетного ридера Victor X3 (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Активность rADAMTS13 определяли как наклон за первые 40 циклов (флуоресценция/время). Стандартная кривая была построена из стандартов Technozym ELISA ADAMTS13 (0–1 МЕ/мл) и использовалась для преобразования наклона в МЕ. Данные нормированы на объем анализируемых образцов (мл). Удельную активность (МЕ/нг) определяли как активность (МЕ/мл), деленную на уровни антигена (нг/мл), измеренные с помощью анализа ELISA. Были проанализированы три набора очищенных rADAMTS13 и сред из коллекций культур. Мы использовали внутреннюю единицу (IU) для измерения активности ADAMTS13. Одна внутренняя единица (МЕ) соответствует 100% активности ADAMTS13 для нормальной объединенной плазмы (около 1,0 мкг/мл) [51].
2.5.4. Анализ гликозилирования
Очищенные белки rADAMTS13 (4 мкг) в 25 мМ буфере бикарбоната аммония восстанавливали с использованием DTT (при 56 °C, 30 мин), алкилировали с использованием йодацетамида (комнатная температура в темноте, 30 мин) и расщепляли трипсином в течение ночи.Триптические пептиды анализировали с помощью нано-ЖХ/МС/МС с использованием Ultimate LC и Fusion Orbitrap MS (ThermoFisher, Сан-Хосе, Калифорния) с настройками, адаптированными из наших предыдущих гликопротеомных исследований [52,53]. Вкратце, пептиды сначала загружали в наноловушку (ThermoFisher PepMap C18, 5 мкм, 100 Å, 20 мм × 100 мкм), затем элюировали на колонку Easy-Spray с обращенной фазой (ThermoFisher PepMap C18, 3 мкм, 100 Å, 15). см × внутренний диаметр 75 мкм) с использованием линейного 120-минутного градиента ацетонитрила (2–50%), содержащего 0,1% муравьиной кислоты, при скорости потока 300 нл/мин.Элюированные пептиды распыляли в Fusion Orbitrap при напряжении распыления и температуре трубки для переноса ионов, установленных на 1,8 кВ и 250 °C соответственно. Был включен режим сбора данных, зависящий от данных (DDA), и за каждым сканированием массы предшественника с преобразованием Фурье (FT) MS1 (разрешение 60 000) следовали сканирования FT DDA-MS2 (разрешение 15 000) (время цикла 3 с). Для идентификации O-фукозилирования и C-маннозилирования DDA-MS2 чередовал HCD (ступенчатая энергия столкновения 20, 30, 40) и EThcD (с дополнительной активацией ETD с энергией столкновения SA 25).Для идентификации N-связанного гликозилирования, DDA-MS2 HCD (ступенчатая энергия столкновения 20, 30, 40) с последующим целевым массовым триггером (204,0867 и 366,1396 в пределах допустимого отклонения по массе ±15 ppm и среди 20 наиболее распространенных ионов) с последующим EThcD (с Дополнительная активация ETD с энергией столкновения SA 25). Цели автоматической регулировки усиления (АРУ) и максимальное время впрыска были установлены как «стандартный» и «автоматический» соответственно.

спектров ЖХ/МС/МС были обработаны с использованием программного обеспечения Byonic и дополнительно проанализированы с помощью программного обеспечения Byologic (PMI-Suite 3.8.11, Protein Metrics, Купертино, Калифорния, США). Параметры бионического/биологического поиска были установлены в соответствии с используемыми параметрами: сайты расщепления трипсином @K/R (полностью специфичные), допускаются два ошибочных расщепления, допуск по массе 25 ppm, обычная модификация окисления @M, фиксированная модификация карбамидометилирования @C, белковая база данных ATS13_HUMAN, и показатель PEP 2D/Score/Delta Mod Score составляет ≤0,01, ≥100, ≥10 соответственно. Для идентификации O-фукозилирования и C-маннозилирования дополнительно была добавлена ​​обычная модификация маннозилирования @W, а база данных гликанов состоит из Fuc(1), Fuc(1)Hex(1), HexNAc(1)Hex(1)NeuAc. (2) и HexNAc(2)Hex(2)NeuAc(2).Для идентификации N-связанного гликозилирования использовали базу данных гликанов Byonic «N-гликан 182 человека без множественной фукозы.txt».

4. Обсуждение

ADAMTS13 представляет собой фермент металлопротеазу, важный для деградации сверхкрупных протромботических мультимеров фактора Виллебранда для предотвращения спонтанной агглютинации тромбоцитов. С этой целью ADAMTS13 рассматривается как один из важных медиаторов гемостаза и потенциальная мишень для разработки рекомбинантного терапевтического средства для лечения тромботических нарушений.Для оценки эффективности, безопасности и характеристик rADAMTS13 необходимо провести всестороннее тестирование, которое можно провести в лабораторных условиях.

Однако для правильной оценки структуры и функции rADAMTS13 требуется значительное количество очищенного rADAMTS13, что является сложной задачей. rADAMTS13 создает много проблем для очистки из-за его относительно большого размера и низкой экспрессии в клетках. Он также подвергается сложным посттрансляционным модификациям, включая экстенсивное гликозилирование, а его аминокислотная последовательность богата пролинами.Кроме того, из-за своей природы как металлопротеазы, благодаря которой его каталитическая активность зависит от взаимодействия с ионами металлов, rADAMTS13 должен быть идеально очищен методами, которые исключают потенциальные хелатирующие агенты и ионы металлов, поскольку они могут нарушить протеолитическую активность белка. Для успешной очистки rADAMTS13 эти аспекты должны быть тщательно учтены в схеме очистки и систематически оценены после очистки, чтобы убедиться, что rADAMTS13 сохраняет свою нативную структуру и функцию.

Здесь мы рассмотрели эти факторы и оптимизировали схему очистки для выделения активного rADAMTS13, меченного как His, так и V5-эпитопом, для эффективного использования в лабораторных исследованиях. Мы обнаружили, что использование эпитопа V5 для очистки приводит к получению белка с высокой специфической активностью. Выход белка rADAMTS13 был выше (~0,68 мг/л), чем при очистке традиционными методами аффинной хроматографии с никелем (~0,1 мг/л) [31]. Чистота rADAMTS13 подтверждалась полосой ~190 кДа, идентифицированной с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси.Мы предполагаем, что более высокая активность может быть результатом использования неметаллов для элюирования rADAMTS13. Многие металлопротеазы были элюированы с помощью аффинной хроматографии с никелем [58, 59], но были разработаны и другие методы, в которых используются альтернативные методы хроматографии, не основанные на схемах очистки аффинными ионами металлов [60]. Очищенные металлопротеазные белки, полученные с помощью этих альтернативных методов, могут быть более подходящими для проведения ферментативного анализа этих белков. Мы также протестировали два отдельных метода культивирования клеток.Один из них был сосредоточен на использовании системы культуральных флаконов BelloCell, которой можно было эффективно и легко управлять для периодического сбора кондиционированных сред для очистки. Эта система при использовании с максимальной производительностью обеспечивает площадь поверхности 15 600 см 2 для роста клеток и имеет автоматизированную систему для поддержания постоянной скорости потока через клеточные матрицы. Система представляет собой мощный инструмент для достижения высокой плотности клеток и высокой продуктивности, но требует дальнейшей оптимизации в бессывороточных условиях, чтобы обеспечить высокий перенос питательных веществ и кислорода при минимальном напряжении сдвига.Другой метод, который мы тестировали параллельно, заключался в использовании системы колб, которая при использовании в течение того же периода времени культивирования, что и биореакторы, соответствовала общей площади поверхности 7000 см 2 . Хотя известно, что колбы являются отличными сосудами для культивирования клеток, в количествах, необходимых для сбора достаточного количества rADAMTS13 для лабораторных экспериментов, управление колбами становится трудным и трудоемким. Из нашего анализа мы определили, что оба метода пригодны для сбора сред, содержащих rADAMTS13 с высокой специфической активностью.Однако среда из биореакторной системы давала примерно на ~ 65–80% меньше белка в коллекциях 2–4, в то время как стабильно высокий уровень экспрессии rADAMTS13 поддерживался в последовательных коллекциях колб. Для клеток, выращенных в биореакторах, мы использовали оптимизированный протокол экспрессии белка в клетках HEK293, культивируемых в полных средах с добавлением FBS [61]. В отсутствие FBS клетки HEK293 очень чувствительны и легко отделяются. Таким образом, мы постулируем, что снижение экспрессии белка в значительной степени связано с диссоциацией клеток Flp-In HEK293 из матриц биореактора при культивировании с течением времени в среде с пониженным содержанием сыворотки.В зависимости от типа клеток и их характеристик прилипания система биореактора требует адаптации для повышения выхода белка. Мы предлагаем реализовать дополнительные соображения оптимизации, которые включают увеличение времени культивирования клеток в сыворотке и снижение скорости потока после перехода на среды с пониженным содержанием сыворотки, особенно для сбора кондиционированных сред из культур слабо прикрепленных клеток. С помощью этих корректировок отделение клеток может быть уменьшено, а выход улучшен в системе биореактора.Тем не менее, обе системы были способны производить кондиционированные среды, содержащие rADAMTS13 с высокой специфической активностью, в нескольких последовательных коллекциях. Для очистки кондиционированных сред мы использовали и оптимизировали две стратегии очистки rADAMTS13, меченные V5, на основе масштаба очистки. Для мелкомасштабной очистки мы использовали одноэтапный процесс извлечения rADAMTS13 посредством аффинной очистки V5. Этот метод дал ~ 0,13 мг / л очищенного rADAMTS13 с активностью 1,37 МЕ / мл для белка, полученного из колбы.Для сравнения, для крупномасштабной очистки с кондиционированной средой объемом 4–12 л мы оптимизировали двухэтапный процесс, состоящий из проточной среды через систему QFF, за которой следует система очистки V5-affinity. С дополнительным этапом системы QFF крупномасштабная очистка обеспечила выход 0,67 мг/л из среды, полученной в колбах, и активность 1,24 МЕ/мл. Независимо от метода очистки активность rADAMTS13 находится в пределах нормы (выше 1 МЕ) [8]. Значительное увеличение выхода очистки при крупномасштабной очистке предполагает, что добавление стадии QFF существенно улучшает качество и количество белка.Фактически, мы наблюдали, что при использовании центрифужного фильтра для концентрирования клеточного супернатанта в мелкомасштабной очистке вязкость образца также увеличивалась из-за присутствия сыворотки и других компонентов среды для культивирования клеток. В результате его последующая обработка и масштабирование были затруднены. Кроме того, специфические компоненты среды, оставшиеся в образце, также могли влиять на процесс очистки, активность и другие свойства белка. Колонка QFF, позволяющая удалить феноловый красный, сыворотку и другие компоненты среды, одновременно концентрируя образец и заменяя буферный раствор.Мы выбрали колонку QFF, так как она также ранее использовалась для очистки ADAMTS13 с помощью His-метки [31], но возможно, что другая ионообменная колонка будет столь же эффективной. Далее мы подтвердили, что посттрансляционные модификации сохранялись в колбе. полученный очищенный меченный V5 rADAMTS13. Мы обнаружили, что семь хорошо известных сайтов N-гликозилирования присутствуют в нашем очищенном белке rADAMTS13, меченном V5, и большинство сайтов фукозилирования и маннозилирования, идентифицированных в предыдущих исследованиях [40], также сохранились.Кроме того, наша конструкция не включает сайт протеолитического расщепления. Удаление метки V5 потребует дополнительной стадии очистки, что приведет к дополнительной потере очищенного белка. Поскольку очищенный белок сохраняет свою активность в присутствии дополнительного линкера, мы решили, что удаление метки V5 не является критичным. Чтобы удалить V5 и His-метки с помощью протеаз, спейсерный линкер должен быть модифицирован для включения мотива сайта протеолитического расщепления. В конструкцию ADAMTS13 можно ввести сайт распознавания фермента между открытой рамкой считывания rADAMTS13 и последовательностью метки для стандартного ферментативного удаления меченого элемента. Этот метод был эффективно реализован для удаления различных типов аффинных меток из представляющих интерес белков [62]. В некоторых случаях удаление метки может быть полезным или критически важным, поскольку оно предотвратит любое потенциальное вмешательство метки в аналитические анализы. Кроме того, уровень экспрессии ADAMTS13 в системах культивирования клеток млекопитающих очень низок. Хотя существуют различные методы, которые можно использовать для достижения более высоких скоростей экспрессии, в том числе оптимизация кодонов или пар кодонов, которая часто используется при производстве рекомбинантных белков [63,64] или изменение типа клеток на один с более эффективной системой , таких как клетки CHO [65,66], нашим приоритетом было сохранение нативной последовательности гена, структуры и функции белка, а также экспрессия белка в клеточных линиях человека.Здесь мы оптимизировали экспрессию и очистку ADAMTS13 с использованием клеточной системы, аналогичной тем, которые ранее использовались для очистки ADAMTS13 с помощью методов с His-меткой [31]. Тем не менее, было бы интересно узнать, будут ли некоторые суспензионные клетки, такие как бессывороточные клеточные линии, полученные из HEK293 (в частности, Expi293 или PER.C6) или других клеточных систем с высокой степенью трансфецируемости, еще больше улучшить выход экспрессии ADAMTS13. Более того, мы выбрали стабильной по сравнению с временной экспрессией с помощью вектора Flp-In, чтобы получить преимущество строго контролируемой системы экспрессии для ADAMTS13.Мы оценили ряд условий культивирования клеток HEK293 и провели очистку белка, используя различные стратегии для достижения максимальной эффективности экспрессии. Мы продемонстрировали, что даже ADAMTS13, белок с низкой экспрессией, может продуцироваться с высоким выходом, когда условия культивирования хорошо оптимизированы. В сочетании с очисткой белка с помощью колонок QFF и V5-affinity мы смогли получить выход белка почти в семь раз выше, чем ранее сообщавшиеся системы очистки [31]. Следовательно, система аффинной очистки QFF и V5 обеспечивает оптимальные средства для получения больших выходов rADAMTS13 высокой чистоты и активности. Эта система может быть успешно адаптирована для очистки других металлопротеаз, на которые могут оказывать вредное воздействие стандартные методы аффинной очистки с ионами металлов.

Chosen Home Inspections, Inc. — Качественная и тщательная проверка — Гарантия!

Мы являемся лицензированными домашними инспекторами в штате Северная Каролина.
Наши инспекторы являются членами NACHI — (Национальная ассоциация сертифицированных домашних инспекторов).
Мы придерживаемся NACHI Кодекс этики и Стандарт практики.
Мы встречаем и превосходим Стандарты NC и мы всегда не торопитесь, чтобы объяснить и ответить на вопросы во время и после вашего осмотра.
NC Home Inspectors не обязаны проверять все видимые и доступные компоненты.Однако » Избранный » будет!
У нас есть важнейшие элементы Практический опыт и образование. Это важно в индустрии домашней инспекции, и мы превышают образовательные требования.
Мы используем новейшие технологии и современное оборудование, чтобы предоставить вам точный и качественный контроль.
Запись на прием осуществляется 7 дней в неделю по телефону, а также через наш веб-сайт. Мы приложим все усилия чтобы обойти свой плотный график, чтобы удовлетворить ваши потребности.
Хотя это и не требуется штатом Северная Каролина, мы осуществляем страхование ошибок и упущений и страхование общей ответственности — 1 000 000 долларов каждый.
Отчеты об инспекциях генерируются компьютером, являются подробными и легко читаемыми. Фотографии включены в отчет И Резюме . Для обеспечения точности и качества проверка отчеты при проверке не печатаются. Ваш отчет будет отправлен вам по электронной почте или по почте в течение 24 часов после проверки . КЛИКНИТЕ СЮДА для просмотра примера отчета.
Мы предлагаем гарантию возврата денег. Если вы не удовлетворены отчетом об инспекции дома или инспекцией в течение 30 дней мы вернем вам деньги.
Мы ставим наших клиентов на первое место и обеспечиваем вам конфиденциальность.
Осуществляем последующую поддержку.Обслуживание не заканчивается сразу после осмотра. Вопросы и проблемы всегда приветствуются.

LQW18AN30NJ00D,LQW18AN30NJ00D

O05E.pdf

28 апреля 2017 г.

Чип-индукторы (чип-катушки)

!Примечание

• Пожалуйста, ознакомьтесь с рейтингом и

!ВНИМАНИЕ

(для хранения, эксплуатации, оценки, пайки, монтажа и обращения) в этом каталоге для предотвращения дыма и/или возгорания и т. д.

• В этом каталоге представлены только типовые спецификации. Поэтому, пожалуйста, подтвердите наши спецификации продукта или передайте заказ в листе утверждения для спецификаций продукта.

O05E.pdf

28 апреля 2017 г.

Соответствует RoHS ЕС

Для

р о у р

Из-за различий в условиях измерения графики электрических характеристик в этом каталоге могут иметь некоторые отличия от значений официальной спецификации.

!Примечание

• Пожалуйста, ознакомьтесь с рейтингом и

!ВНИМАНИЕ

(для хранения, эксплуатации, оценки, пайки, монтажа и обращения) в этом каталоге для предотвращения дыма и/или возгорания и т. д.

• В этом каталоге представлены только типовые спецификации. Поэтому, пожалуйста, подтвердите наши спецификации продукта или передайте заказ в листе утверждения для спецификаций продукта.

O05E.pdf

28 апреля 2017 г.

Содержимое

Руководство по продукту

Технические характеристики продукта соответствуют

.

ноябрь 2016 г.

.

стр.2

Катушки индуктивности для линий электропередач

Описание продукта

!Внимание/Примечание

Пайка и монтаж

Упаковка

стр. 10

р151

р153

р158

Катушки индуктивности для общих цепей

Продукция ТОКО

Катушки индуктивности для общих цепей

Продукция ТОКО

Катушки индуктивности для линий электропередач

ВЧ катушки индуктивности

Номер детали

стр.8

Катушки индуктивности для общих цепей

Номер детали

Описание продукта

!Внимание/Примечание

Пайка и монтаж

Упаковка

р164

р165

р190

р192

р196

ВЧ катушки индуктивности

Номер детали

Описание продукта

!Внимание/Примечание

Пайка и монтаж

Упаковка

р200

р201

р292

р294

р298

Продукция ТОКО

Катушки индуктивности для линий электропередач

Описание продукта

!Внимание/Примечание

Пайка и монтаж

Упаковка

р302

р415

р416

р419

Продукция ТОКО

Катушки индуктивности для общих цепей

Описание продукта

!Внимание/Примечание

Пайка и монтаж

Упаковка

р422

р427

р428

р430

Посетите веб-сайт MURATA (http://www. murata.com/)

, если вы не можете найти номер детали в этом каталоге.

Катушки индуктивности для линий электропередач

!Примечание

• Пожалуйста, ознакомьтесь с рейтингом и

!ВНИМАНИЕ

(для хранения, эксплуатации, оценки, пайки, монтажа и обращения) в этом каталоге для предотвращения курения и/или возгорания и т. д.

• В этом каталоге представлены только типовые спецификации. Поэтому, пожалуйста, подтвердите наши спецификации продукта или передайте заказ в листе утверждения для спецификаций продукта.

O05E.pdf

28 апреля 2017 г.

Руководство по продукту

Серия

Структура

р141

с52

с53

с55

с56

стр.58

с59

с.61

с.63

р65

р143

с145

р147

р149

с.67

стр.69

стр.71

стр.73

стр.75

стр.77

стр. 79

стр.81

стр.83

р102

р104

р106

Код размера

в дюймах (в мм)

Диапазон индуктивности (Гн)

0.1н

10n 100n 1 мкм

1 мкГн

1,5 мкГн

470 нГн

2,5 мкГн

2,2 мкГн

1 мкГн

470 нГн

220 нГн

1 мкГн

1 мкГн

1 мкГн

1 мкГн

4,7 мкГн

4,7 мкГн

470 нГн

2,2 мкГн

470 нГн

240 нГн

470 нГн

1 мкГн

470 нГн

1 мкГн

2,2 мкГн

2.2 мкГн

240 нГн

470 нГн

160 нГн

240 нГн

560 нГн

240 нГн

470 нГн

1 мкГн

240 нГн

2,2 мкГн

1 мкГн

470 нГн

470 нГн

1 мкГн

1 мкГн

18нГн

20 нГн

4,9 нГн

200 нГн

3,3 мкГн

650 нГн

1 мкГн

1 мкГн

330 нГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

680 нГн

1 мкГн

82 мкГн

22 мкГн

82 мкГн

100 мкГн

22 мкГн

12 мкГн

15 мкГн

12 мкГн

250 мкГн

47 мкГн

100 мкГн

2. 2 мкГн

4,7 мкГн

4,7 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

3,3 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

3,3 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

4,7 мкГн

4,7 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

3,3 мкГн

2,5 мкГн

47 мкГн

47 мкГн

10 мкГн

10 мкГн

7 мА

7 мА

2.2 мкГн

Номинальный ток (А)

10 м 100 м 1

50 мА

150 мА

10 мкм 100 мкм 1 м 10 м

10 мкГн

10

100

LQM18FN_00

LQM18PN_B0

LQM18PN_C0

LQM18PN_D0

ЛКМ18ПН_ДХ

LQM18PN_F0

ЛКМ18ПН_ФХ

LQM18PN_FR

ЛКМ18ПН_ГХ

LQM18PW_CH

LQM21DN_00

LQM21FN_00

LQM21FN_70

LQM21FN_80

LQM21PN_C0

LQM21PN_CA

LQM21PN_CH

LQM21PN_EH

LQM21PN_G0

LQM21PN_GC

ЛКМ21ПН_ГХ

Катушки индуктивности для линий электропередач

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0603 (1608)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

Многослойный Тип 0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1008 (2520)

1206 (3216)

1210 (3225)

1210 (3225)

0402 (1005)

0402 (1005)

0603 (1608)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

Проволочная обмотка

Ферритовый сердечник

Тип

1008 (2520)

1008 (2520)

1211 (3028)

1211 (3028)

1211 (3028)

1212 (3030)

1212 (3030)

1212 (3030)

600 мА

700 мА 850 мА

700 мА

650 мА

600 мА

700 мА

620 мА

1. 05А

750 мА 950 мА

60 мА

220 мА

100 мА 120 мА

100 мА 120 мА

600 мА

1.05А

1,05 А 1,6 А

1.1А

800 мА

2,8 А

1,3 А

1.1А

1.4А

1,25 А

2,2 мкГн

800 мА 900 мА

800 мА

2.4А

1,3 А

LQM21PN_GR

ЛКМ21ПН_ГС

LQM2MPN_DH

LQM2MPN_EH

LQM2MPN_G0

750 мА 950 мА

1.27А

1.1А

4.1А

1.1А 1.6А

1,3 А

850 мА

1,5 А

1,3 А

1.1А

800 мА

1,5 А

4,5 А

1,8 А

1,5 А

2,55 А

LQM2MPN_GH

р108

LQM2HPN_CH

LQM2HPN_E0

LQM2HPN_EH

LQM2HPN_G0

LQM2HPN_GC

LQM2HPN_GH

ЛКМ2ХПН_ГС

LQM2HPN_J0

LQM2HPN_JH

LQM31PN_00

LQM32PN_G0

LQM32PN_GC

LQW15CN_00

LQW15CN_10

LQW18CN_00

LQh3MCN_02

LQh3MCN_52

LQh3MPN_GR

LQh3HPN_GR

LQh3HPN_JR

ДЭМ2812К

ДЭМ2815К

ДЭМ2818К

LQh4NPN_GR

LQh4NPN_JR

LQh4NPN_ME

с. 85

с.87

стр.88

р90

р92

с94

с.96

р98

р100

р110

с112

с113

с115

с117

р119

стр.14

стр.16

стр.18

стр.10

стр.12

р388

р389

р390

стр.28

стр.30

стр.32

1А 1.1А

1А 1,5А

1,5 А

700 мА

1,8 А

2.2А

390 мА

130 мА

430 мА

90 мА

130 мА

210 мА

210 мА

540 мА

760 мА

800 мА

140 мА

570 мА

430 мА

1.4А

2.2А

2,6 А

485 мА

595 мА

2.2А

2.9А

3,5 А

3.1А

3,9 А

4,7 А

2,82 А

2,86 А

3.2А

1.4А

2

Продолжение на следующей странице.

!Примечание

• Пожалуйста, ознакомьтесь с рейтингом и

!ВНИМАНИЕ

(для хранения, эксплуатации, оценки, пайки, монтажа и обращения) в этом каталоге для предотвращения курения и/или возгорания и т. д.

• В этом каталоге представлены только типовые спецификации.Поэтому, пожалуйста, подтвердите наши спецификации продукта или передайте заказ в листе утверждения для спецификаций продукта.

O05E.pdf

28 апреля 2017 г.

Серия

Структура

стр.34

с121

р123

с125

с127

р129

р131

стр.20

стр.22

стр.24

стр.26

р391

р392

с40

с42

стр.44

р133

с135

стр.36

стр.38

р393

стр.46

стр.48

с50

р394

Код размера

в дюймах (в мм)

Диапазон индуктивности (Гн)

0.

10n 100n 1 мкм

1 мкГн

120 нГн

1 мкГн

150 нГн

1 мкГн

1 мкГн

1 мкГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

470 нГн

680 нГн

560 нГн

680 нГн

1 мкГн

1 мкГн

1 мкГн

560 нГн

1 мкГн

1 мкГн

1,2 мкГн

470 нГн

1 мкГн

470 нГн

1.2 мкГн

1,1 мкГн

4,7 мкГн

120 нГн

1 мкГн

1,2 мкГн

1 мкГн

270 нГн

1 мкГн

1,5 мкГн

1,5 мкГн

1,5 мкГн

1 мкГн

1,5 мкГн

1,1 мкГн

1,2 мкГн

1,7 мкГн

470 нГн

470 нГн

240 нГн

560 нГн

240 нГн

240 нГн

470 нГн

470 нГн

330 нГн

240 нГн

470 нГн

470 нГн

2. 2 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

10 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

2,2 мкГн

2,2 мкГн

4,7 мкГн

47 мкГн

33 мкГн

47 мкГн

100 мкГн

33 мкГн

120 мкГн

330 мкГн

680 мкГн

470 мкГн

100 мкГн

100 мкГн

150 мкГн

10 мГн

22 мкГн

100 мкГн

100 мкГн

220 мкГн

10 мГн

22 мкГн

22 мкГн

150 мкГн

3.9 мкГн

220 мкГн

220 мкГн

10 мкГн

100 мкГн

560 мкГн

100 мкГн

120 мкГн

22 мкГн

120 мкГн

22 мкГн

22 мкГн

22 мкГн

47 мкГн

47 мкГн

22 мкГн

470 мкГн

Номинальный ток (А)

10 м 100 м 1

460 мА

80 мА

60 мА

450 мА

100 мА

60 мА

100 мА

200 мА

650 мА

200 мА

650 мА

530 мА

880 мА

410 мА

380 мА

800 мА

90 мА

10 мкм 100 мкм 1 м 10 м

47 мкГн

100 мкГн

560 мкГн

10

2. 15А

100

LQh4NPN_MR

LQh41CN_03

LQh42CN_23

LQh42CN_33

LQh42CN_53

LQh42DN_23

LQh42DN_53

LQh42PB_N0

LQh42PB_NC

LQh42PN_N0

LQh42PN_NC

ДЭМ3512К

ДЭМ3518К

LQh54PN_GR

LQh54PN_J0

LQh54PN_P0

LQh53CN_03

LQh53CN_33

LQh53PB_26

LQh53PN_26

ДЭМ4518К

LQH5BPB_T0

Катушки индуктивности для линий электропередач

1212 (3030)

1206 (3216)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1210 (3225)

1514 (3735)

1514 (3735)

1515 (4040)

1515 (4040)

1515 (4040)

1812 (4532)

1812 (4532)

1812 (4532)

Проволочная обмотка

Ферритовый сердечник

Тип

1812 (4532)

1818 (4745)

2020 (5050)

2020 (5050)

2020 (5050)

2020 (5252)

2020 (5252)

2020 (5252)

2220 (5750)

2424 (6060)

2424 (6060)

2524 (6362)

2525 (6363)

2929 (7373)

3131 (8080)

3131 (8080)

3131 (8080)

3131 (8080)

3939 (100100)

4040 (101101)

4040 (101101)

4949 (125125)

0805 (2012)

0805 (2012)

0805 (2012)

0806 (2016)

0806 (2016)

Проволочная обмотка

Металлический сплав

Основной тип

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

0806 (2016)

1008 (2520)

970 мА

800 мА

1. 45А

800 мА

3.4А

4.4А

3.4А

4.4А

2,5 А

3.4А

2,5 А

2,95 А

1.08А

1,6 А

2,95 А

3.4А

3.4А

1.4А

3,5 А

7,7 А

7,7 А

2,44 А

3,87 А

2.31А

240 мА

240 мА

LQH5BPN_38

LQH5BPN_T0

Д52ЛК

Д53ЛК

Д53ЛК

Высокий

Текущий

Низкий

Рдк

650 мА

1.4А

260 мА

460 мА

350 мА

50 мА

900 мА

1.2А

440 мА

50 мА

430 мА

1,3 А

2.4А

2.1А

1,3 А

3,5 А

970 мА

690 мА

580 мА

1,8 А

2.1А

1,5 А

1,6 А

1,6 А

1,8 А

2.

1,7 А

1.2А

р395

р396

р137

р399

р401

р397

с139

р402

р405

р406

р407

р404

р408

р409

р411

р413

р302

р304

р340

р306

р336

р328

р320

р308

р338

р330

р322

р342

LQH55DN_03

ДГ6045К

ДГ6050К

Д63ЛКБ

LQH66SN_03

ДС75ЛК

ДЭМ8030К

ДЭМ8040К

ДЭМ8045К

ДГ8040К

ДЭМ10050К

ДС104К2

ДС106К2

ДС126К2

ДФЭ201208С

ДФЭ201210С

ДФЭ201210У

ДФЭ201610К

ДФЭ201610Э

ДФЭ201610П

ДФЭ201610Р

ДФЭ201612К

ДФЭ201612Э

ДФЭ201612П

ДФЭ201612Р

ДФЭ252007Ф

9.5А

9,8А

4,52 А

9.

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.