Фз 3 ст 19 п 3: Статья 19. Применение физической силы / КонсультантПлюс

Содержание

ФЗ «О полиции»: Ст 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24

Федеральный закон от 07.02.2011 N 3-ФЗ «О полиции»


Глава 5. Применение физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия

Статья 18 Закона «О полиции» — Ст 18 ФЗ «О полиции»

Статья 18. Право на применение физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия
1. Сотрудник полиции имеет право на применение физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия лично или в составе подразделения (группы) в случаях и порядке, предусмотренных федеральными конституционными законами, настоящим Федеральным законом и другими федеральными законами.
2. Перечень состоящих на вооружении полиции специальных средств, огнестрельного оружия и патронов к нему, боеприпасов устанавливается Правительством Российской Федерации. Не допускается принятие на вооружение полиции специальных средств, огнестрельного оружия и патронов к нему, боеприпасов, которые наносят чрезмерно тяжелые ранения или служат источником неоправданного риска.
3. В состоянии необходимой обороны, в случае крайней необходимости или при задержании лица, совершившего преступление, сотрудник полиции при отсутствии у него необходимых специальных средств или огнестрельного оружия вправе использовать любые подручные средства, а также по основаниям и в порядке, которые установлены настоящим Федеральным законом, применять иное не состоящее на вооружении полиции оружие.
4. Сотрудник полиции обязан проходить специальную подготовку, а также периодическую проверку на профессиональную пригодность к действиям в условиях, связанных с применением физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия.
5. Содержание программ специальной подготовки сотрудников полиции определяется федеральным органом исполнительной власти в сфере внутренних дел.
6. Право на применение световых и акустических специальных средств, а также средств разрушения преград имеет сотрудник полиции, получивший в установленном порядке соответствующий допуск.
7. Сотрудник полиции, не прошедший проверку на профессиональную пригодность к действиям в условиях, связанных с применением физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия, проходит аттестацию на соответствие замещаемой должности.
До вынесения решения о соответствии замещаемой должности сотрудник полиции отстраняется от выполнения обязанностей, связанных с возможным применением физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия.
8. Превышение сотрудником полиции полномочий при применении физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия влечет ответственность, установленную законодательством Российской Федерации.
9. Сотрудник полиции не несет ответственность за вред, причиненный гражданам и организациям при применении физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия, если применение физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия осуществлялось по основаниям и в порядке, которые установлены федеральными конституционными законами, настоящим Федеральным законом и другими федеральными законами.

Статья 19 Закона «О полиции» — Ст 19 ФЗ «О полиции»

Статья 19. Порядок применения физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия
1. Сотрудник полиции перед применением физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия обязан сообщить лицам, в отношении которых предполагается применение физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия, о том, что он является сотрудником полиции, предупредить их о своем намерении и предоставить им возможность и время для выполнения законных требований сотрудника полиции. В случае применения физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия в составе подразделения (группы) указанное предупреждение делает один из сотрудников полиции, входящих в подразделение (группу).
2. Сотрудник полиции имеет право не предупреждать о своем намерении применить физическую силу, специальные средства или огнестрельное оружие, если промедление в их применении создает непосредственную угрозу жизни и здоровью гражданина или сотрудника полиции либо может повлечь иные тяжкие последствия.
3. Сотрудник полиции при применении физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия действует с учетом создавшейся обстановки, характера и степени опасности действий лиц, в отношении которых применяются физическая сила, специальные средства или огнестрельное оружие, характера и силы оказываемого ими сопротивления. При этом сотрудник полиции обязан стремиться к минимизации любого ущерба.
4. Сотрудник полиции обязан оказать гражданину, получившему телесные повреждения в результате применения физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия, первую помощь, а также принять меры по предоставлению ему медицинской помощи в возможно короткий срок.

5. О причинении гражданину телесных повреждений в результате применения сотрудником полиции физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия полиция в возможно короткий срок, но не более 24 часов уведомляет близкого родственника (родственника) или близкого лица гражданина.
6. О каждом случае причинения гражданину ранения либо наступления его смерти в результате применения сотрудником полиции физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия уведомляется прокурор в течение 24 часов.
7. Сотрудник полиции обязан по возможности сохранить без изменения место совершения преступления, административного правонарушения, место происшествия, если в результате применения им физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия гражданину причинено ранение либо наступила его смерть.
8. О каждом случае применения физической силы, в результате которого причинен вред здоровью гражданина или причинен материальный ущерб гражданину либо организации, а также о каждом случае применения специальных средств или огнестрельного оружия сотрудник полиции обязан сообщить непосредственному начальнику либо руководителю ближайшего территориального органа или подразделения полиции и в течение 24 часов с момента их применения представить соответствующий рапорт.

9. В составе подразделения (группы) сотрудник полиции применяет физическую силу, специальные средства и огнестрельное оружие в соответствии с федеральным законом, руководствуясь приказами и распоряжениями руководителя этого подразделения (группы).

Статья 20 Закона «О полиции» — Ст 20 ФЗ «О полиции»

Статья 20. Применение физической силы
1. Сотрудник полиции имеет право лично или в составе подразделения (группы) применять физическую силу, в том числе боевые приемы борьбы, если несиловые способы не обеспечивают выполнения возложенных на полицию обязанностей, в следующих случаях:
1) для пресечения преступлений и административных правонарушений;
2) для доставления в служебное помещение территориального органа или подразделения полиции, в помещение муниципального органа, в иное служебное помещение лиц, совершивших преступления и административные правонарушения, и задержания этих лиц;
3) для преодоления противодействия законным требованиям сотрудника полиции.
2. Сотрудник полиции имеет право применять физическую силу во всех случаях, когда настоящим Федеральным законом разрешено применение специальных средств или огнестрельного оружия.

Статья 21 Закона «О полиции» — Ст 21 ФЗ «О полиции»

Статья 21. Применение специальных средств
1. Сотрудник полиции имеет право лично или в составе подразделения (группы) применять специальные средства в следующих случаях:
1) для отражения нападения на гражданина или сотрудника полиции;
2) для пресечения преступления или административного правонарушения;
3) для пресечения сопротивления, оказываемого сотруднику полиции;
4) для задержания лица, застигнутого при совершении преступления и пытающегося скрыться;
5) для задержания лица, если это лицо может оказать вооруженное сопротивление;
6) для доставления в полицию, конвоирования и охраны задержанных лиц, лиц, заключенных под стражу, лиц, осужденных к лишению свободы, лиц, подвергнутых административному наказанию в виде административного ареста, а также в целях пресечения попытки побега, в случае оказания лицом сопротивления сотруднику полиции, причинения вреда окружающим или себе;
7) для освобождения насильственно удерживаемых лиц, захваченных зданий, помещений, сооружений, транспортных средств и земельных участков;
8) для пресечения массовых беспорядков и иных противоправных действий, нарушающих движение транспорта, работу средств связи и организаций;
9) для остановки транспортного средства, водитель которого не выполнил требование сотрудника полиции об остановке;
10) для выявления лиц, совершающих или совершивших преступления или административные правонарушения;
11) для защиты охраняемых объектов, блокирования движения групп граждан, совершающих противоправные действия;
12) для пресечения нахождения беспилотных воздушных судов в воздушном пространстве в целях, предусмотренных пунктом 40 части 1 статьи 13 настоящего Федерального закона.
2. Сотрудник полиции имеет право применять следующие специальные средства:
1) палки специальные — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 5, 7, 8 и 11 части 1 настоящей статьи;
2) специальные газовые средства — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 5, 7 и 8 части 1 настоящей статьи;
3) средства ограничения подвижности — в случаях, предусмотренных пунктами 3, 4 и 6 части 1 настоящей статьи. При отсутствии средств ограничения подвижности сотрудник полиции вправе использовать подручные средства связывания;
4) специальные окрашивающие и маркирующие средства — в случаях, предусмотренных пунктами 10 и 11 части 1 настоящей статьи;
5) электрошоковые устройства — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 5, 7 и 8 части 1 настоящей статьи;
6) светошоковые устройства — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 5, 7 и 8 части 1 настоящей статьи;
7) служебных животных — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 7, 10 и 11 части 1 настоящей статьи;
8) световые и акустические специальные средства — в случаях, предусмотренных пунктами 5, 7, 8 и 11 части 1 настоящей статьи;
9) средства принудительной остановки транспорта — в случаях, предусмотренных пунктами 9 и 11 части 1 настоящей статьи;
10) средства сковывания движения — в случаях, предусмотренных пунктами 1 — 5 части 1 настоящей статьи;
11) водометы — в случаях, предусмотренных пунктами 7, 8 и 11 части 1 настоящей статьи;
12) бронемашины — в случаях, предусмотренных пунктами 5, 7, 8 и 11 части 1 настоящей статьи;
13) средства защиты охраняемых объектов (территорий), блокирования движения групп граждан, совершающих противоправные действия, — в случаях, предусмотренных пунктом 11 части 1 настоящей статьи;
14) средства разрушения преград — в случаях, предусмотренных пунктами 5 и 7 части 1 настоящей статьи;
15) специальные технические средства противодействия беспилотным воздушным судам — в случаях, предусмотренных пунктом 12 части 1 настоящей статьи.
3. Сотрудник полиции имеет право применять специальные средства во всех случаях, когда настоящим Федеральным законом разрешено применение огнестрельного оружия.

Статья 22 Закона «О полиции» — Ст 22 ФЗ «О полиции»

Статья 22. Запреты и ограничения, связанные с применением специальных средств
1. Сотруднику полиции запрещается применять специальные средства:
1) в отношении женщин с видимыми признаками беременности, лиц с явными признаками инвалидности и малолетних лиц, за исключением случаев оказания указанными лицами вооруженного сопротивления, совершения группового либо иного нападения, угрожающего жизни и здоровью граждан или сотрудника полиции;
2) при пресечении незаконных собраний, митингов, демонстраций, шествий и пикетирований ненасильственного характера, которые не нарушают общественный порядок, работу транспорта, средств связи и организаций.
2. Специальные средства применяются с учетом следующих ограничений:
1) не допускается нанесение человеку ударов палкой специальной по голове, шее, ключичной области, животу, половым органам, в область проекции сердца;
2) не допускается применение водометов при температуре воздуха ниже нуля градусов Цельсия;
3) не допускается применение средств принудительной остановки транспорта в отношении транспортных средств, предназначенных для перевозки пассажиров (при наличии пассажиров), транспортных средств, принадлежащих дипломатическим представительствам и консульским учреждениям иностранных государств, а также в отношении мотоциклов, мотоколясок, мотороллеров и мопедов; на горных дорогах или участках дорог с ограниченной видимостью; на железнодорожных переездах, мостах, путепроводах, эстакадах, в туннелях;
4) установка специальных окрашивающих средств на объекте осуществляется с согласия собственника объекта или уполномоченного им лица, при этом сотрудником полиции принимаются меры, исключающие применение указанных средств против случайных лиц.
3. Применение водометов и бронемашин осуществляется по решению руководителя территориального органа с последующим уведомлением прокурора в течение 24 часов.
4. Иные ограничения, связанные с применением сотрудником полиции специальных средств, могут быть установлены федеральным органом исполнительной власти в сфере внутренних дел.
5. Допускается отступление от запретов и ограничений, установленных частями 1 и 2 настоящей статьи, если специальные средства применяются по основаниям, предусмотренным частью 1 статьи 23 настоящего Федерального закона.

Статья 23 Закона «О полиции» — Ст 23 ФЗ «О полиции»

Статья 23. Применение огнестрельного оружия
1. Сотрудник полиции имеет право лично или в составе подразделения (группы) применять огнестрельное оружие в следующих случаях:
1) для защиты другого лица либо себя от посягательства, если это посягательство сопряжено с насилием, опасным для жизни или здоровья;
2) для пресечения попытки завладения огнестрельным оружием, транспортным средством полиции, специальной и боевой техникой, состоящими на вооружении (обеспечении) полиции;
3) для освобождения заложников;
4) для задержания лица, застигнутого при совершении деяния, содержащего признаки тяжкого или особо тяжкого преступления против жизни, здоровья или собственности, и пытающегося скрыться, если иными средствами задержать это лицо не представляется возможным;
5) для задержания лица, оказывающего вооруженное сопротивление, а также лица, отказывающегося выполнить законное требование о сдаче находящихся при нем оружия, боеприпасов, взрывчатых веществ, взрывных устройств, ядовитых или радиоактивных веществ;
6) для отражения группового или вооруженного нападения на здания, помещения, сооружения и иные объекты государственных и муниципальных органов, общественных объединений, организаций и граждан;
7) для пресечения побега из мест содержания под стражей подозреваемых и обвиняемых в совершении преступлений или побега из-под конвоя лиц, задержанных по подозрению в совершении преступления, лиц, в отношении которых применена мера пресечения в виде заключения под стражу, лиц, осужденных к лишению свободы, а также для пресечения попытки насильственного освобождения указанных лиц.
2. Вооруженным сопротивлением и вооруженным нападением, указанными в пунктах 5 и 6 части 1 настоящей статьи, признаются сопротивление и нападение, совершаемые с использованием оружия любого вида, либо предметов, конструктивно схожих с настоящим оружием или внешне неотличимых от него, либо предметов, веществ и механизмов, при помощи которых могут быть причинены тяжкий вред здоровью или смерть.
3. Сотрудник полиции также имеет право применять огнестрельное оружие:
1) для остановки транспортного средства путем его повреждения, если управляющее им лицо отказывается выполнить неоднократные требования сотрудника полиции об остановке и пытается скрыться, создавая угрозу жизни и здоровью граждан;
2) для обезвреживания животного, угрожающего жизни и здоровью граждан и (или) сотрудника полиции;
3) для разрушения запирающих устройств, элементов и конструкций, препятствующих проникновению в жилые и иные помещения по основаниям, предусмотренным статьей 15 настоящего Федерального закона;
4) для производства предупредительного выстрела, подачи сигнала тревоги или вызова помощи путем производства выстрела вверх или в ином безопасном направлении;
5) для пресечения нахождения беспилотных воздушных судов в воздушном пространстве в целях, предусмотренных пунктом 40 части 1 статьи 13 настоящего Федерального закона, если иными средствами прекратить их нахождение в воздушном пространстве не представляется возможным.
4. Сотрудник полиции имеет право применять служебное огнестрельное оружие ограниченного поражения во всех случаях, предусмотренных частями 1 и 3 настоящей статьи, а также в случаях, предусмотренных пунктами 3, 4, 7 и 8 части 1 статьи 21 настоящего Федерального закона.
5. Запрещается применять огнестрельное оружие с производством выстрела на поражение в отношении женщин, лиц с явными признаками инвалидности, несовершеннолетних, когда их возраст очевиден или известен сотруднику полиции, за исключением случаев оказания указанными лицами вооруженного сопротивления, совершения вооруженного или группового нападения, угрожающего жизни и здоровью граждан или сотрудника полиции.
6. Сотрудник полиции не имеет права применять огнестрельное оружие при значительном скоплении граждан, если в результате его применения могут пострадать случайные лица.

Статья 24 Закона «О полиции» — Ст 24 ФЗ «О полиции»

Статья 24. Гарантии личной безопасности вооруженного сотрудника полиции
1. Сотрудник полиции имеет право обнажить огнестрельное оружие и привести его в готовность, если в создавшейся обстановке могут возникнуть основания для его применения, предусмотренные статьей 23 настоящего Федерального закона.
2. При попытке лица, задерживаемого сотрудником полиции с обнаженным огнестрельным оружием, приблизиться к сотруднику полиции, сократив при этом указанное им расстояние, или прикоснуться к его огнестрельному оружию сотрудник полиции имеет право применить огнестрельное оружие в соответствии с пунктами 1 и 2 части 1 статьи 23 настоящего Федерального закона. ФЗ «О полиции»: Ст 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 — Статьи Федерального закона от 07.02.2011 N 3-ФЗ «О полиции».Примечание: Обязанности и права полиции — Статьи 12, 13, 14, 15, 16, 17 Закона «О полиции» — здесь

Статья 19 [Закон РФ о Полиции] — последняя редакция

Статья 19. Порядок применения физической силы, специальных средств и огнестрельного оружия

1. Сотрудник полиции перед применением физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия обязан сообщить лицам, в отношении которых предполагается применение физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия, о том, что он является сотрудником полиции, предупредить их о своем намерении и предоставить им возможность и время для выполнения законных требований сотрудника полиции. В случае применения физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия в составе подразделения (группы) указанное предупреждение делает один из сотрудников полиции, входящих в подразделение (группу).

2. Сотрудник полиции имеет право не предупреждать о своем намерении применить физическую силу, специальные средства или огнестрельное оружие, если промедление в их применении создает непосредственную угрозу жизни и здоровью гражданина или сотрудника полиции либо может повлечь иные тяжкие последствия.

3. Сотрудник полиции при применении физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия действует с учетом создавшейся обстановки, характера и степени опасности действий лиц, в отношении которых применяются физическая сила, специальные средства или огнестрельное оружие, характера и силы оказываемого ими сопротивления. При этом сотрудник полиции обязан стремиться к минимизации любого ущерба.

4. Сотрудник полиции обязан оказать гражданину, получившему телесные повреждения в результате применения физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия, первую помощь, а также принять меры по предоставлению ему медицинской помощи в возможно короткий срок.

5. О причинении гражданину телесных повреждений в результате применения сотрудником полиции физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия полиция в возможно короткий срок, но не более 24 часов уведомляет близкого родственника (родственника) или близкого лица гражданина.

6. О каждом случае причинения гражданину ранения либо наступления его смерти в результате применения сотрудником полиции физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия уведомляется прокурор в течение 24 часов.

7. Сотрудник полиции обязан по возможности сохранить без изменения место совершения преступления, административного правонарушения, место происшествия, если в результате применения им физической силы, специальных средств или огнестрельного оружия гражданину причинено ранение либо наступила его смерть.

8. О каждом случае применения физической силы, в результате которого причинен вред здоровью гражданина или причинен материальный ущерб гражданину либо организации, а также о каждом случае применения специальных средств или огнестрельного оружия сотрудник полиции обязан сообщить непосредственному начальнику либо руководителю ближайшего территориального органа или подразделения полиции и в течение 24 часов с момента их применения представить соответствующий рапорт.

9. В составе подразделения (группы) сотрудник полиции применяет физическую силу, специальные средства и огнестрельное оружие в соответствии с федеральным законом, руководствуясь приказами и распоряжениями руководителя этого подразделения (группы).

Воинский учет в 1С — БУХ.1С, сайт в помощь бухгалтеру

Согласно п. 7 ст. 8 Федерального закона от 28.03.1998 № 53-ФЗ, все организации обязаны осуществлять воинский учет граждан. С 8 января 2022 года вступила в силу новая инструкция об организации работы по обеспечению функционирования системы воинского учета, утвержденная приказом министра обороны РФ от 22.11.2021 № 700. Рассмотрим ведение воинского учета по новым правилам в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3.

В программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3 предусмотрена возможность ведения воинского учета, согласно Федеральному закону от 28.03.1998 № 53-ФЗ, и бронирования граждан, согласно Федеральному закону от 26. 02.1997 № 31-ФЗ. 

После установки флага Ведется воинский учет и Ведется учет бронирования граждан на период мобилизации и на военное время, во вкладке Кадры появятся ссылки на соответствующие документы и справочники, а в Кадровых отчетах – Отчетность для военкоматов и Отчетность для бронирования (рис. 1).

Рис. 1. Настройка воинского учета в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

После установки флага Ведется воинский учет (рис. 1) в Ответственных лицах организации появится поле для ввода Ответственный за ВУР (рис. 2). Ответственность за организацию и ведение воинского учета лежат на руководителе организации, но обязанность ведения учета может быть возложена на сотрудника организации.

Для постановки организации на учет в военный комиссариат необходимо подготовить Приказ об организации воинского учета и План работы по осуществлению воинского учета (рис. 2).

Если в организации ведется учет бронирования граждан на период мобилизации и на военное время (рис. 1), в окне воинского учета появится отдельное поле Потребность в специалистах на период мобилизации для ввода данных по категориям должностей и их количеству в расчетном году (рис. 2).

Рис. 2. Ответственные лица, печатные формы документов для постановки организации на учет в военный комиссариат и заполнение таблицы «Потребность в специалистах на период мобилизации» в расчетном году в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Также в справочнике Должности внутри каждой должности появится возможность выбора Категории воинского учета и Категории учета забронированных (рис. 3).

Рис. 3. Выбор категорий внутри должности в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

С 8 января 2022 года воинский учет работников осуществляется по специальным карточкам гражданина – форма № 10, которые заполняются на основании общих сведений, сведений о воинском учете, дополнительных сведений и сведений о приеме и увольнении (переводе). Прочитать о новых правилах воинского учета работников можно здесь.

В новых релизах конфигурации «Зарплата и управление персоналом» ред. 3 добавлен новый кадровый отчет Карточка гражданина, подлежащего воинскому учету (рис. 4), который можно сохранить и распечатать (рис. 5).

Рис. 4. Карточка гражданина, подлежащего воинскому учету, в кадровых отчетах в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Рис. 5. Формирование, сохранение и печать карточки гражданина, подлежащего воинскому учету, в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Для автоматического формирования карточки гражданина в программе необходимо заполнить раздел Воинский учет внутри справочников Физические лица или Сотрудники, а также внести личные данные и всю необходимую информацию об образовании, квалификации, семейном положении и месте жительства работника (рис. 6).

Рис. 6. Разделы с информацией, необходимой для автоматического формирования карточки гражданина. Ввод данных по воинскому учету в справочнике «Физические лица» или «Сотрудники» в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Если в организации ведется учет бронирования граждан на период мобилизации и на военное время (рис. 1), в окне Воинский учет по сотруднику появится поле Бронирование. Строка Забронирован организацией заполнится автоматически после создания документа Бронирование граждан (рис. 8).

Для ведения учета бронирования граждан необходимо создать Ходатайство о бронировании (рис. 7), на основании которого формируется документ Бронирование граждан (рис. 8).

Рис. 7. Создание документа «Ходатайство о бронировании» в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Рис. 8. Создание документа «Бронирование граждан» на основании удовлетворенного ходатайства в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Если необходимо отменить бронирование сотрудников, создается документ Отмена бронирования граждан (рис. 9).

Рис. 9. Создание документа «Отмена бронирования граждан» в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

При изменении сведений о сотруднике, состоящем на воинском учете, формируется документ Листок сообщения об изменениях. Если листок не выдан, то устанавливается соответствующий флаг и указывается причина невыдачи, которая отразится в графе 7 отчета Сведения об изменениях для военкомата (рис. 11). Содержание изменений отразится в графе 6.

Распечатанный листок выдается сотруднику для передачи сведений в военкомат, а подписанный корешок листка военкоматом возвращается ответственному лицу организации. В документе должен быть установлен флаг Корешок листка получен (рис. 10). Данные о сотрудниках, не предъявивших корешок листка сообщения, отражаются в отчете Сведения об изменениях для военкомата (рис. 11).

Рис. 10. Создание документа «Листок сообщений об изменениях» в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Согласно новым правилам, в программе обновлен отчет Список граждан для сверки с военкоматом (Приложение № 23) для сверки сведений о воинском учете, содержащихся в программе, со сведениями, содержащимися в документах военного комиссариата (рис. 11). Сверку нужно проводить не реже одного раза в год.

Рис. 11. Сведения об изменениях для военкомата и список граждан для сверки с военкоматом в кадровых отчетах в программе «1С:Зарплата и управление персоналом 8» ред. 3

Доказательства того, что коронавирусы, связанные с SARS-CoV-2, циркулируют у летучих мышей и панголинов в Юго-Восточной Азии

Отбор проб животных

Заостренные подковообразные летучие мыши ( R. acuminatus ) были пойманы в заповеднике дикой природы в провинции Чаченгсао, Таиланд. Летучих мышей выпускали после проведения измерений и сбора образцов. Летучих мышей идентифицировали морфометрически и определяли вид, пол, репродуктивный статус, длину предплечья и массу тела. Ректальный мазок и кровь собирали у каждой отдельной летучей мыши и сразу же помещали в лизисный буфер (bioMérieux, SA, Франция).Образцы транспортировали на льду в течение 48 часов и хранили при температуре -80 °C до дальнейшего анализа в Научном центре по новым инфекционным заболеваниям Тайского Красного Креста (TRC-EID) в Таиланде. Отбор проб проводился в соответствии с протоколами, утвержденными и разрешенными Департаментом национальных парков, дикой природы и охраны растений Таиланда (№ 0909.204/2686), и Протоколом использования животных № 1473001, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Чулалонгкорн. Образцы малайского панголина ( M. javanica ) были собраны в период с февраля по июль 2020 г. на трех контрольно-пропускных пунктах Департамента национальных парков, дикой природы и охраны растений в Центральном и Южном Таиланде, страна происхождения неизвестна, и отправлены в лабораторию TRC-EID в Бангкоке. в течение 24 часов для тестирования.Для исследования панголинов в Китае образцы были собраны в Центре охраны и защиты дикой природы провинции Гуандун со специальным разрешением, выданным Национальным координационным комитетом по исследованиям в области атипичной пневмонии.

Экстракция нуклеиновой кислоты и обнаружение РНК CoV

Суммарную нуклеиновую кислоту экстрагировали из 1 мл взвешенного ректального мазка с использованием платформы easyMAG® (bioMérieux, SA, Франция) и элюировали 50 мкл. Гемигнездная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) была проведена с использованием ПЦР с широкореактивными праймерами консенсусной ПЦР, нацеленными на ген РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) различных CoV (дополнительная таблица 4) 19,28 .Синтез кДНК проводили с использованием набора Superscript III First Strand Synthesis (Invitrogen) с последующей гнездовой ПЦР. Продукт амплификации длиной 328 и 434 п.н. соответственно визуализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Все положительные продукты ПЦР были дополнительно секвенированы для подтверждения и характеристики штамма. Продукты ПЦР RdRp очищали в геле с использованием набора NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) и секвенировали непосредственно с использованием автоматического секвенатора ДНК ABI PRISM 377.

Характеристика генома с помощью NGS

Полногеномное секвенирование (WGS) с использованием технологии NGS было выполнено на пяти образцах нуклеиновых кислот с относительно сильными положительными сигналами ПЦР. WGS выполняли с использованием подготовки библиотеки обогащения (Respiratory Viral Oligos Panel, RVOP) и секвенатора Illumina MiSeq 3000 в соответствии с инструкциями производителя. Необработанные чтения были сначала импортированы в Geneious Prime (версия 2020.2.3) для последующего анализа и вырезаны из адаптеров с помощью BBDuk (версия 38.84). Сборка de novo проводилась с чистыми чтениями программой SPAdes (версия 3.13.0, http://cab.spbu.ru/software/spades/) в режиме метагенома. Затем самый длинный контиг для каждого образца подвергали анализу с помощью эталонного генома SARS-CoV-2 (MN

7) для оценки полноты генома. Лучшему контигу (29 853 нт) было присвоено название RacCS203. Затем каждый образец был индивидуально сопоставлен с эталонным геномом RacCS203 с использованием ассемблера Geneious. Карта покрытия, низкое покрытие и вариант/SNP были дополнительно проанализированы в Geneious.Аннотацию RacCS203 проводили путем сравнения и переноса аннотации человеческого SARS-CoV-2 и других родственных CoV (RaTG13, BJ01, GX-P4L, SL-ZXC21, SL-ZC45 и RmYN02) после выравнивания нуклеотидной последовательности, выполненного с помощью MAFFT в Гениальное программное обеспечение Prime. Индивидуальное выравнивание генов было создано с помощью выравнивания Geneious и использовано для построения филогенетического дерева методом максимального правдоподобия с моделью общего времени (GTR) и 1000 бутстрэп-реплицированием в программном обеспечении PHYML 3.0. График подобия был сгенерирован SimPlot (версия 3.5.1). Номер доступа к последовательностям генома, использованным в филогенетическом анализе, приведен в таблице в дополнительной таблице 5. org/) 29 с использованием структуры RBD-ACE2 SARS-CoV-2 (инвентарный номер PBD: 6VW1) в качестве шаблона. Конструкции были построены с использованием UCSF Chimera 1. 14.

Тесты на антитела

sVNT выполняли с использованием cPass (Genscript) в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, равные объемы разведенной 1:10 сыворотки летучих мышей или панголинов предварительно инкубировали с HRP-конъюгированным RBD в течение 30 минут при 37 °C с последующим добавлением в планшет ELISA с покрытием ACE2 в течение 15 минут при комнатной температуре. Колориметрический сигнал проявляли с использованием субстрата TMB и останавливали 1 M HCl. Показания абсорбции при 450 нм были получены с помощью ридера для микропланшетов. PRNT проводили путем предварительной инкубации 50 БОЕ SARS-CoV-2 (BetaCoV/Singapore/2/2020, код доступа GISAID EPI_ISL_406973) с четырехкратно разведенной сывороткой в ​​течение 1 ч при 37°C с последующим инфицированием монослой VeroE6 (ATCC, CRL-1586) в течение 1 ч при 37°С.Через 1 ч инкубации инокулят удаляли, а клетки покрывали средой для бляшек, содержащей 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 0,5% авицела. При 3 dpi клетки фиксировали 4% формальдегидом, и бляшки визуализировали после окрашивания 0,2% кристаллическим фиолетовым. Для обнаружения SARS-CoV-специфических антител в образцах сыворотки панголинов в Китае использовали коммерческий набор для конкурентного ELISA (BGI-GBI) в соответствии с инструкциями производителя, используя рекомендуемое пороговое значение 14%. Этот набор был единственным доступным в то время коммерческим набором для тестирования антител к SARS-CoV независимым от вида способом.

Плазмиды, рекомбинантные белки и RBD, иммунизированные сывороткой кроликов

Были получены рекомбинантные белки RBD SARS-CoV-2, SARS-CoV, RaTG13, RmYN02, GX-P5L и ZC45 с 8X His-tag и AviTag на С-конце и очищен Genscript (дополнительная таблица 6). Сыворотки кроликов, иммунизированных RBD, были произведены Genscript.

RacCS203 Ген RBD был синтезирован Genscript и клонирован в вектор экспрессии pcDNA3.1. Сигнальный пептид спайка SARS-CoV-2 (аминокислоты 1–14) и 10X His-метка были слиты на N-конце и C-конце соответственно.RacCS203 RBD получали путем трансфекции плазмид pcDNA3.1 RacCS203-RBD в клетки HEK293T в Opti-MEM (Gibco). Рекомбинантные белки собирали на 3-й день после трансфекции и очищали с использованием шариков Ni Sepharose (GE Healthcare).

Анализы Luminex для антигенного профилирования различных белков RBD. 800 нМ в PBS с 1% BSA.Анализы Luminex проводили путем предварительной инкубации сыворотки, разбавленной 1:100, с 1250 шариками/антигеном в течение 1 часа при 37°C с последующим разбавлением 1:1000 PE-конъюгированными анти-кроличьими IgG (Thermo Scientific) или PE-конъюгированными античеловеческими IgG. IgG (eBioscience) в течение 1 часа при 37 °C. Уровень связывания антител определяли с помощью системы Luminex MAGPIX. Показания нормализовали по отношению к показаниям, полученным с антителом против метки 6XHis (при конечном разведении 1:600) (Thermo Scientific). Группа сывороток от COVID-19 и SARS, использованная в этом исследовании, была взята из сингапурского исследования PROTECT и отбора проб, отозванных в связи с SARS в 2020 г. как использование, так и отчетность в исследовании.

Мультиплексный анализ связывания RBD-ACE2

Белки RBD из SARS-CoV-2, SARS-CoV, RaTG13, GX-P5L, RmYN02, SL-ZC45 и RacCS203 были конъюгированы на микросфере MagPlex-c (Luminex) с использованием xMAP Набор для связывания антител (Luminex) в соответствии с инструкциями производителя. Для оценки реактивности связывания ACE2 1250 шариков/антиген предварительно инкубировали с PE-конъюгированным ACE2 (Genscript) в течение 1 ч при 37°C. Уровень связывания ACE2 определяли с помощью системы Luminex MAGPIX.

График распространения летучих мышей

Данные о распространении летучих мышей рода Rhinolophus по всему миру (рис.4a, b и дополнительный рисунок 4a, b) были получены из пространственных данных о наземных млекопитающих Международного союза охраны природы (IUCN 2020. Красный список МСОП видов, находящихся под угрозой исчезновения. Январь 2019 г. [версия 6.2]. https:/ /www.iucnredlist.org; загружено 25 октября 2020 г.) и экспортировано в R (версия 4.0.2). Для пяти конкретных видов данные были извлечены с помощью R-пакета «tidyverse» (версия 1.3.0). Данные карты мира были извлечены и обрезаны с помощью пакета R «rnaturalearth» (версия 0.1.0) и «sf» (версия 0.9-6). Данные о распределении были нанесены на обрезанную карту мира с использованием пакета r «ggplot2» (3. 3.2). На публикацию пространственных данных, использованных в данном исследовании, получено письменное разрешение Красного списка МСОП.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Границы | Надежность потенциала, связанного с событием P3, во время рабочей памяти в спектре когнитивного старения

Введение

Процесс старения характеризуется постепенным снижением физических, нейробиологических и когнитивных функций, что может повлиять на инструментальную деятельность в повседневной жизни (iADL), такую ​​как вождение автомобиля, выполнение домашних дел, управление финансами, соблюдение режима приема лекарств или покупка продуктов (Moon et al., 2018; Кармона-Торрес и др., 2019). Ухудшение этих iADL становится более очевидным при возрастной нейродегенерации, такой как легкие когнитивные нарушения (MCI) и болезнь Альцгеймера (AD) (Jekel et al., 2015). Исполнительные функции, в частности, имеют первостепенное значение при выполнении многочисленных iADL, но также уязвимы для последствий нормального и патологического когнитивного старения (Overdorp et al. , 2016; Tabira et al., 2020). Рабочая память — это одна из основных исполнительных функций, которая связана со способностью временно хранить, обрабатывать и манипулировать информацией, необходимой для когнитивных задач более высокого порядка, таких как принятие решений, обучение и рассуждение (Baddeley, 1992).Рабочая память возникает в результате взаимодействия между вниманием, кратковременным удержанием и манипулированием информацией, осуществляемого посредством скоординированной активации многих областей мозга (Eriksson et al., 2015).

Префронтальная кора особенно связана с рабочей памятью (Bahmani et al., 2019). Следовательно, префронтальная кора очень восприимчива к эффектам старения и ранней нейродегенерации (West et al., 2002; Ranchet et al., 2017). Недавний метаанализ, объединяющий исследования функциональной магнитно-резонансной томографии, показал постепенное и линейное снижение активности префронтальной коры у пожилых людей (Yaple et al., 2019). Точно так же электрофизиологические процессы также ухудшаются с возрастом. P3, положительный пик, который появляется с задержкой от 250 до 500 мс в связанном с событием потенциале (ERP), участвует в процессах внимания и рабочей памяти на протяжении всей жизни (Van Dinteren et al., 2014). Предыдущее исследование показало снижение положительности центрально-лобных и теменных ERP P3 у пожилых людей (Lubitz et al., 2017), тогда как другие продемонстрировали лобную гиперактивность в P3 в сочетании с теменной или задней гипоактивностью (Fjell and Walhovd, 2001; Saliasi et al., 2013). Несмотря на неоднозначность результатов ERP, в большинстве исследований делается вывод о том, что аномальный ответ ERP у пожилых людей отражает неэффективное или компенсаторное использование нервных ресурсов из-за дисфункции лобной коры (Saliasi et al., 2013; Lubitz et al., 2017). Таким образом, электрофизиологические ответы на задачи рабочей памяти являются удобными мерами для проверки гипотез, связанных с функцией лобной коры, нормальным когнитивным старением и ранней нейродегенерацией.

Способность отличать естественную изменчивость и ошибку измерения от биологически значимых когнитивных изменений, вызванных старением или ранней нейродегенерацией, важна для принятия обоснованных решений по диагностике, мониторингу и лечению когнитивных нарушений (Feinkohl et al., 2020). Однако пожилые люди демонстрируют большую внутрииндивидуальную изменчивость показателей рабочей памяти по сравнению с более молодыми людьми. Связанные с возрастом изменения внутрииндивидуальной изменчивости показателей эффективности становятся еще более очевидными по мере увеличения когнитивных потребностей (West et al., 2002). Эта повышенная внутрииндивидуальная вариабельность также может быть связана с неоднородностью когнитивных профилей у пожилых людей, особенно при включении пациентов с MCI и AD (Troyer et al., 2016). Считается, что внутрииндивидуальная изменчивость показателей работоспособности связана с дисфункцией лобной коры (West et al., 2002), что, таким образом, может также влиять на индивидуальную вариабельность ответа ERP у пожилых людей (Robertson et al. , 2006). На сегодняшний день в нескольких исследованиях изучалась надежность повторных тестов P3 ERP у здоровых пожилых людей (Sandman and Patterson, 2000; Walhovd and Fjell, 2002; Behforuzi et al., 2019). Надежность теста-ретеста P3 ERP у пожилых людей с гетерогенным когнитивным профилем еще предстоит установить.

Основная цель состояла в том, чтобы охарактеризовать ретестовую надежность P3 ERP в группе пожилых людей с широким диапазоном когнитивных функций.Вторичные цели заключались в изучении влияния возраста, групп заболеваний (без повышенного уровня β-амилоида, с повышенным уровнем β-амилоида, с когнитивными нарушениями), когнитивного статуса и сложности задач на P3 ERP.

Материалы и методы

Участники

В этом исследовании надежности повторных тестов участвовали 39 участников-правшей, набранных из Центра болезней Куни в период с 03.05.2018 по 10.03.2020. Критерии включения: информированное согласие; возраст старше 65 лет; умение понимать инструкции на английском языке; и ранее подвергшихся амилоидному ПЭТ-сканированию головного мозга. Церебральную амилоидную нагрузку оценивали с помощью ПЭТ-изображений, полученных на ПЭТ/КТ-сканере GE Discovery ST-16 после внутривенного введения флорбетапира F-18. Стандартное отношение значений поглощения для шести областей интереса рассчитывали с использованием программного обеспечения MIMneuro (MiM Software Inc., Кливленд, Огайо, США) путем нормализации ПЭТ-изображения Aβ ко всему мозжечку для расчета. Диагностика когнитивно-нормальной доклинической БА проводилась в соответствии с рекомендациями NIA и рабочей группы Ассоциации Альцгеймера (Sperling et al., 2011). Протокол определения уровня амилоида подробно описан в другом месте (Vidoni et al., 2016). Среднее время между проведением ПЭТ и оценкой ЭЭГ составило 1090 (479) дней. Критериями исключения были: прием в настоящее время стероидов, бензодиазепинов или нейролептиков; История любого злоупотребления психоактивными веществами; и история неврологического расстройства, отличного от MCI или AD. Шестнадцать были когнитивно нормальными пожилыми людьми без ПЭТ-сканирования с повышенным амилоидом (Aβ-), 15 были когнитивно нормальными с ПЭТ-сканированием с повышенным амилоидом (Aβ+), а у восьми был клинический диагноз MCI или AD с положительным амилоидным ПЭТ-сканированием. Участники завершили свою двухнедельную последующую сессию через 16 ± 8 дней после первой сессии. Каждое занятие длилось около 60 минут, включая перерывы на отдых.

Процедура

Демографическая и клиническая информация

Были зарегистрированы возраст, пол и образование. Общие когнитивные функции оценивали с помощью Монреальской когнитивной оценки (МОСА) (Nasreddine et al., 2005). Оценки по шкале MOCA находятся в диапазоне от 0 до 30.

N — Back Test

В тесте n -назад участникам показывают серию букв и просят нажать кнопку, когда текущий стимул такой же, как и предмет, представленный n -позициями назад.Когнитивные потребности в задаче n — назад увеличиваются с каждым числом, в то время как перцептивные и двигательные потребности остаются постоянными. В этом исследовании были проведены тесты 0-обратно, 1-обратно и 2-обратно. Тест 0-back по сути представляет собой задачу поиска в памяти с постоянным вниманием и часто используется в качестве контрольного условия (Miller et al. , 2009; Bopp and Verhaeghen, 2018). Тест 1-back требует, чтобы участник пассивно сохранял и обновлял информацию в рабочей памяти. В то время как в тестах 0-back и 1-back стимул на экране удерживается в фокусе внимания, тест 2-back требует постоянного переключения с фокуса внимания на кратковременную память (Bopp and Verhaeghen, 2018).Более высокие уровни сложности требуют постоянных умственных усилий для обновления информации о новых стимулах и сохранения представлений о недавно представленных стимулах (Gevins et al., 2011).

Участники сидели в удобном кресле на расстоянии 26 дюймов перед экраном компьютера, центр экрана находился на уровне глаз. На черном экране появились белые буквы. Перед каждым тестом участникам давали тренировочное испытание, состоящее из 7 нецелевых и 3 мишенных. Практические испытания повторялись до тех пор, пока участник не чувствовал себя комфортно с инструкциями.Каждый тест включал 180 испытаний, в том числе 60 испытаний, требующих ответа (целевые, 33,3%), и 120 испытаний, для которых ответа не требовалось (нецелевые, 66,7%). Каждая буква предъявлялась на экране компьютера в течение 500 мс, после чего следовал пустой межстимульный интервал в течение 1700 мс со случайным дрожанием ±50 мс. Максимальное время принятия ответа составляло 2150 мс. Общее время выполнения задания составило ~7 минут. В тесте 0-back участников просили нажимать левую кнопку мыши, как только на экране появлялась буква «X» (цель), игнорируя другие буквы (не цель).В тесте 1-back участникам было предложено нажать кнопку, если текущая буква на экране была такой же, как ранее показанная буква (цель). В тесте 2-back участников просили нажимать кнопку, когда текущая буква совпадала с буквой, представленной двумя местами ранее (цель). Количество попаданий (точность) и время реакции на попадания были основными показателями поведенческих результатов.

П3 ERP

Непрерывная электроэнцефалограмма (ЭЭГ) была получена с использованием системы высокой плотности Philips EGI от 256 скальповых электродов, оцифрованных с частотой 1000 Гц. Данные были отфильтрованы от 0,50 до 30 Гц с использованием программного обеспечения EGI. Данные были онлайн привязаны к Cz, а офлайн — к усредненным сосцевидным отросткам. Всю остальную обработку ЭЭГ выполняли в EEGLab (Delorme and Makeig, 2004) и в ERPLab (Lopez-Calderon and Luck, 2014). Различные артефакты, не связанные с когнитивными функциями, включая движение глаз и мышц или сердечно-сосудистые сигналы, были идентифицированы и удалены с помощью анализа независимых компонентов (ICA). Сигналы от плохих электродов были интерполированы с использованием данных окружающих электродов.Заблокированные стимулом ERP были извлечены из тестов n назад и сегментированы на эпохи от 100 мс до до 1000 мс после начала стимула, а исходный уровень скорректирован с использованием предстимульного интервала. Скальповые местоположения и окна измерения для компонента P3 были основаны на их пространственной протяженности и задержке после проверки больших средних сигналов (свернутых за два сеанса). Пиковая амплитуда P3 эффекта задачи считалась основным электрофизиологическим показателем результата, но мы также использовали пиковую латентность P3 в качестве показателя результата. Эффект задачи рассчитывался путем вычитания среднего ERP, полученного от целей, из среднего ERP, полученного от нецелей для каждого участника. Временное окно компонента P3 было установлено между 200 и 400 мс для всех трех тестов. Из-за участия префронтальной коры в рабочей памяти мы идентифицировали априори Fz как основной канал, но также рассчитали надежность других предварительно идентифицированных местоположений электродов, то есть Cz, Pz, F3 и F4. Cz интерполировался с использованием окружающих пяти каналов.Никто из участников не был исключен из анализа из-за артефактов. Тем не менее, один участник отключился во время теста 2-back и поэтому был исключен из анализа надежности 2-back.

Анализ данных

Описательный анализ, включая среднее значение (стандартное отклонение) и подсчет частоты общих показателей участников, показателей эффективности и данных ERP, был выполнен соответствующим образом. Коэффициенты внутриклассовой корреляции (ICC) использовались для расчета надежности тестов и повторных тестов показателей производительности, а также амплитуды и задержки P3. ICC отражают согласованность меры с учетом дисперсии, связанной со временем тестирования (Shrout and Fleiss, 1979). Значения ICC менее 0,40 считались плохими; значения от 0,40 до 0,59 удовлетворительные, значения от 0,60 до 0,74 хорошие и значения от 0,75 до 1,00 отличные (Cicchetti, 1994). Графики Бланда-Альтмана использовались для визуализации точности измерения амплитуды и задержки в моменты тестирования (Бланд и Альтман, 1986). Межсубъектная стабильность в соответствии с ранжированием субъектов рассчитывалась с использованием коэффициента корреляции Пирсона r.Обобщенные линейные смешанные модели использовались для оценки влияния возраста, диагноза (Aβ-; Aβ+; MCI/AD), баллов MOCA и сложности задачи на стабильность амплитуды и латентности P3. Стабильность амплитуды P3 (латентность) рассчитывали как квадрат разницы амплитуды P3 (латентность) при последующем наблюдении и исходном уровне. Тест Колмогорова-Смирнова использовался для проверки нормальности нашего распределения данных в дополнение к визуализации графиков Q-Q. Все анализы проводились с использованием программного обеспечения SAS 9.4. Порог значимости был установлен на уровне p = 0.05.

Результаты

Характеристики участника

участника ( n = 39) были в среднем 74,05 (5,37) года и набрали 26,44 (4,76) балла по шкале MOCA. Баллы по шкале MOCA варьировались от 3 до 30. Различий по возрасту и полу между группами не наблюдалось. Как и ожидалось, участники с MCI / AD показали худшие результаты по MOCA по сравнению с Aβ- и Aβ+ (таблица 1).

Таблица 1. Характеристики участников общей выборки и подгрупп.

Повторное тестирование надежности показателей эффективности

Все значения ICC попаданий (точность) и время отклика каждого n обратного теста продемонстрировали превосходную надежность (дополнительная таблица 1). ICC попаданий колебался от 0,92 (1- и 2-обратно) до 0,99 (0-обратно) и был немного выше, чем ICC времени отклика, в диапазоне от 0,76 (2-обратно) до 0,89 (1-обратно). Корреляции Пирсона r варьировались от 0,65 (время отклика 0) до 0,99 (время отклика 0).

Повторное тестирование надежности показателей ERP

Усредненные кривые эффекта задачи по всем каналам на исходном уровне и последующем наблюдении показаны на рис. 1.Трехмерная карта кожи головы встроена в рисунок, чтобы продемонстрировать эффект задачи на P3. Значительное перекрытие ответов ERP во временном окне P3 (200–400 мс после стимула) наблюдалось на исходном уровне и через 2 недели наблюдения.

Рисунок 1. Форма волны общего среднего потенциала, связанного с событием, на Fz (A) 0-назад, (B) 1-назад и (C) 2-назад.

Значения ICC пиковой амплитуды P3 и пиковой задержки местоположения ключевых электродов отображаются в таблице 2.В целом амплитуда P3 показала большую надежность по сравнению с задержкой P3 по каналам и уровням сложности задач. Кроме того, ICC для 0-back и 1-back были постоянно выше, чем рассчитанные для 2-back.

Таблица 2. Сравнение эффекта задачи (целевой и нецелевой) Пиковый ответ P3 на исходном уровне и через 2 недели наблюдения.

Для местоположения основного канала Fz превосходная надежность была обнаружена в амплитуде P3 для 0-назад (ICC = 0,82) и 1-назад (ICC = 0.87). Амплитуда P3 Fz для 2-back показала только удовлетворительную надежность (ICC = 0,53). Показатели надежности латентности P3 в Fz были удовлетворительными для 0-обратно (ICC = 0,54) и 1-обратно (ICC = 0,47), но плохими для 2-обратно (ICC = 0,17). На рис. 2 показаны графики Бланда-Альтмана для пиковой амплитуды P3 и пиковой задержки в канале Fz. Все графики продемонстрировали равное распределение данных вокруг нуля, что указывает на отсутствие систематической ошибки в результатах и ​​отсутствие гетероскедастичности в данных.

Рисунок 2. Графики Бланда-Альтмана для (A) 0-обратная амплитуда пика Fz (B) 1-обратная амплитуда пика Fz; (C) 2-задняя амплитуда пика Fz; (D) 0-назад Fz пиковая задержка; (E) 1 — обратная пиковая задержка; (F) 2-обратная пиковая задержка.

Наконец, обобщенные линейные смешанные модели использовались для оценки влияния возраста, диагноза заболевания (Aβ-; Aβ+; MCI/AD), когнитивного статуса и сложности задачи на стабильность квадрата амплитуды пика P3 и латентность в канале Fz. Возраст ( p = 0,74), диагноз заболевания ( p = 0,67) и сложность задачи ( p = 0,70) не влияли на стабильность амплитудного ответа P3, хотя люди с более низкими когнитивными баллами MOCA, как правило, проявляли больше вариабельность амплитуды P3 ( p = 0.07).

Возраст ( p = 0,60), диагноз заболевания ( p = 0,55), МОКА ( p = 0,52) или сложность задачи ( p = 0,95) не влияли на стабильность латентного ответа P3.

Мы пересчитали ICC для 0-back, 1-back и 2-back у участников, набравших 26 или более баллов по шкале MOCA ( n = 32), и тех, кто набрал менее 26 баллов ( n = 7). Значения ICC показали большую дисперсию в 0-back и 2-back в группе с более низкими баллами MOCA, но значения ICC не были хуже в тестах n -back в этой группе (дополнительные таблицы 2 и 3). В то время как ICC были схожими в группах Aβ- и Aβ+, более низкие ICC были обнаружены для группы MCI/AD (дополнительные таблицы 2 и 3).

Обсуждение

Это исследование надежности повторных тестов предоставляет важную информацию о стабильности электрофизиологических показателей, связанных с рабочей памятью, у здоровых пожилых людей, пожилых людей с повышенным риском деменции и лиц с ЛКН или БА. Наши результаты показали, что большинство ERP P3 в лобных каналах обеспечивают от удовлетворительной до превосходной надежности для измерения электрофизиологических процессов когнитивного старения у пожилых людей с когнитивными нарушениями и без них.Как и в предыдущих исследованиях, надежность показателей амплитуды выше, чем латентности (Kinoshita et al., 1996; Walhovd and Fjell, 2002; Cassidy et al., 2012; Behforuzi et al., 2019). Надежность стабильности P3 не зависит от возраста, диагноза заболевания или сложности задачи, однако существует тенденция, согласно которой более низкие баллы MOCA могут влиять на стабильность амплитудного ответа P3.

Совокупность доказательств, связанных с надежностью P3 ERP, немногочисленна и обычно ограничивается здоровыми молодыми людьми (Segalowitz and Barnes, 1993; Kinoshita et al., 1996; Кэссиди и др., 2012 г.; Бруннер и др., 2013 г.; Huffmeijer et al., 2014), среднего возраста (Kinoshita et al., 1996) и пожилых людей (Sandman, Patterson, 2000; Walhovd, Fjell, 2002; Behforuzi et al., 2019). В нескольких исследованиях сообщалось о показателях надежности при неврологических состояниях (Lew et al., 2007). Анализ надежности в нашем исследовании показал значения ICC от удовлетворительных до отличных в тестах n -back. В то время как значения ICC обеспечивают единую меру степени согласия, графики Бланда-Альтмана отображают графическое отображение систематической ошибки для двух тестовых моментов (Ranganathan et al., 2017). Визуальный осмотр графиков Бланда-Альтмана показал, что средняя разница в ответах ERP между первым и вторым тестированием близка к 0, с одинаковым разбросом точек данных вокруг линии средней разницы. Эти результаты показывают, что 2-недельного наблюдения достаточно, чтобы свести на нет любой потенциальный эффект адаптации, тестирования или практики n -back на ERP у пожилых людей.

Сравнение наших результатов с другими исследованиями повторного тестирования ССП у пожилых людей осложняется отсутствием согласованности с точки зрения исследуемых компонентов ССП, тестов рабочей памяти, выбора расположения каналов, извлеченной метрики P3, Измерение окна P3 и интервалы надежности повторных испытаний (Sandman and Patterson, 2000; Walhovd and Fjell, 2002; Behforuzi et al., 2019). Дизайн нашего исследования наиболее тесно согласуется с исследованием, в котором ERP сравнивали с новыми стимулами, собранными в начале исследования и через 7 недель наблюдения у здоровых пожилых людей (Behforuzi et al., 2019). Подобно нашему исследованию, это исследование также показало отличную надежность для средней амплитуды P3 (ICC = 0,86, 95% ДИ, 0,78–0,92) и более низкую надежность для средней латентности P3 (ICC = 0,56, 0,30–0,73). Наше исследование продемонстрировало большие доверительные интервалы в некоторых измерениях амплитуды и латентности, что могло быть связано с большей когнитивной неоднородностью нашей выборки.В другом исследовании также сообщалось о значительно более низкой достоверности амплитуды P3 (ICC = -0,02) и латентности (ICC = -0,17) у семи человек, испытывающих когнитивные трудности после черепно-мозговой травмы, по сравнению со здоровыми сверстниками (ICC = 0,84 для амплитуды и 0,64 для латентности) ( Лью и др., 2007). В совокупности эти данные указывают на потенциальное искажающее влияние когнитивных нарушений на стабильность ERP при неврологических состояниях.

Не было обнаружено влияния возраста, сложности задачи или диагноза заболевания на стабильность ERP P3 в задаче n -назад.Большинство участников нашего исследования были когнитивно нормальными либо без ( n = 15), либо с ( n = 16) повышенным Aβ. Достоверность амплитуды и латентности P3 от удовлетворительной до превосходной дает возможность для изучения влияния Aβ на нейронную передачу в доклинической БА с использованием ERP. Известно, что накопление отложений Aβ в головном мозге увеличивает риск развития болезни Альцгеймера (Klunk et al., 2004). Амплитуды P3 при БА меньше, чем в контроле (Hedges et al., 2016). ERP также оказались полезными для прогнозирования конверсии в AD с показателями точности в диапазоне от 70 до 94% (Chapman et al., 2011). Пациенты с БА демонстрируют более длительную латентность в P3 ERP по сравнению с контрольной группой того же возраста (Pedroso et al., 2012). Эти длительные латентные периоды, наблюдаемые у пациентов с БА, становятся особенно очевидными в когнитивных областях исполнительной функции, памяти и языка (Lee et al., 2013). Способность P3 ERP различать MCI и AD (Bennys et al., 2007) открывает возможности для исследования ERP при выявлении доклинической AD (Boutros et al., 1995; Rossini et al., 2020).

Мы установили достоверность амплитуды P3 в группе пожилых людей с широким диапазоном когнитивных способностей.Тем не менее, большинство из них были когнитивными нормальными. Будущие исследования должны включать большую выборку участников с MCI и AD, чтобы подтвердить смешанный эффект нарушения когнитивных функций на стабильность ответа P3. Результаты группового анализа (не повышенный уровень β-амилоида; повышенный уровень β-амилоида, когнитивные нарушения) и потенциальное искажающее влияние нарушения когнитивных функций на реакцию ССП следует считать исследовательскими. Тест n -back, возможно, является наиболее распространенным тестом рабочей памяти, используемым в исследованиях ERP для всех возрастных категорий (Bopp and Verhaeghen, 2018).Тем не менее, предыдущие исследования показали, что тест n -back включает в себя множество процессов управления, включая скорость обработки, хранение, процессы сравнения, обновление, отслеживание, смешивание задач, переключение задач и устойчивость к помехам (Miller et al. ., 2009; Schmiedek et al., 2009; Bopp and Verhaeghen, 2018). Кроме того, мы не установили надежность ERP в других когнитивных областях, которые, как известно, ухудшаются в пожилом возрасте, таких как память и язык, и это остается возможностью для дальнейшего исследования. Будущие исследования также должны включать несколько сеансов тестирования в течение продолжительных периодов времени, чтобы оценить чувствительность ERP для обнаружения тонких нейробиологических изменений, связанных с нормальным и патологическим старением.

Заключение

Мы поставили перед собой цель оценить надежность ретестовой реакции ERP у пожилых людей с гетерогенным когнитивным профилем. В соответствии с другими исследованиями, амплитуда и задержка P3 демонстрируют удовлетворительную или превосходную надежность при разных уровнях сложности задач.Однако нарушение когнитивных функций потенциально может повлиять на стабильность ответа P3 ERP.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены внутренним наблюдательным советом Медицинского центра Канзасского университета. Пациенты/участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

Вклад авторов

HD, JB, JM, WB и KG разработали концепцию исследования. HD, KL и KG разработали этапы обработки данных ЭЭГ. HD, PA и KL проводили тесты. HD и JM проанализировали данные. HD написал первоначальную рукопись. JB, KL, PA, JM, WB и KG рассмотрели рукопись и предоставили ценные комментарии. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом старения Национального института здравоохранения под номером премии K01 AG058785.Это исследование было частично поддержано пилотным грантом Центра болезни Альцгеймера KU (P30 AG035982). Центр биомедицинской визуализации Хоглунда частично поддерживается S10 RR29577 и щедрыми подарками от Форреста и Салли Хоглунд. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят добровольцев за их время и готовность участвовать в этом исследовании. Авторы также благодарны персоналу Центра болезни Альцгеймера КУ.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2020.566391/full#supplementary-material

.

Каталожные номера

Бахмани З., Кларк К., Меррихи Ю., Mueller, A., Pettine, W., Isabel Vanegas, M., et al. (2019). Префронтальные вклады в внимание и рабочую память. Курс. Верхняя. Поведение Неврологи. 41, 129–153. дои: 10.1007/7854_2018_74

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Behforuzi, H., Feng, N.C., Billig, A. R., Ryan, E., Tusch, E.S., Holcomb, P.J., et al. (2019). Маркеры обработки новизны у пожилых людей стабильны и надежны. Фронт. Стареющие нейроски. 11:165. doi: 10.3389/fnagi.2019.00165

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Беннис, К., Портет, Ф., Тушон, Дж., и Рондуэн, Г. (2007). Диагностическое значение событийно-зависимых субкомпонентов вызванных потенциалов N200 и P300 в ранней диагностике болезни Альцгеймера и легких когнитивных нарушений. Дж. Клин. Нейрофизиол. 24, 405–412.

Академия Google

Бланд, Дж. М., и Альтман, Д. Г. (1986). Статистические методы оценки соответствия между двумя методами клинических измерений. Ланцет 1, 307–310.

Академия Google

Бутрос, Н., Торелло, М.В., Бернс, Э.М., Ву, С.-С., и Насралла, Х.А. (1995). Вызванные потенциалы у лиц с риском развития болезни Альцгеймера. Психиатрические исследования 57, 57–63. дои: 10.1016/0165-1781(95)02597-р

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Бруннер, Дж. Ф., Хансен, Т. И., Олсен, А., Скандсен, Т., Хаберг, А., и Кропотов, Дж. (2013). Долгосрочная надежность теста-ретеста волны P3 NoGo и двух независимых компонентов, разложенных из волны P3 NoGo в визуальной задаче Go/NoGo. Междунар. Дж. Психофизиол. 89, 106–114.

Академия Google

Кармона-Торрес, Х.М., Родригес-Боррего, М.А., Ларедо-Агилера, Х.А., Лопес-Сото, П.Дж., Сантакрус-Салас, Э., и Кобо-Куэнка, А.И. (2019). Неспособность к основным и инструментальным видам деятельности в повседневной жизни у пожилых людей. PLoS One 14:e0220157. doi: 10.1371/journal.pone.0220157

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кэссиди, С. М., Робертсон, И.Х. и О’Коннелл, Р. Г. (2012). Повторная проверка надежности потенциалов, связанных с событием: данные из различных парадигм. Психофизиология 49, 659–664. doi: 10.1111/j.1469-8986.2011.01349.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чепмен, Р. М., Маккрари, Дж. В., Гарднер, М. Н., Сандовал, Т. С., Гилли, М. Д., Рейли, Л. А., и соавт. (2011). Компоненты ERP мозга предсказывают, у каких людей развивается болезнь Альцгеймера, а у каких нет. Нейробиол.Старение 32 года, 1742–1755 гг. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2009.11.010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чиккетти, Д.В. (1994). Руководящие принципы, критерии и эмпирические правила для оценки нормированных и стандартизированных инструментов оценки в психологии. Психолог. Оценивать. 6:284.

Академия Google

Делорм, А., и Макейг, С. (2004). EEGLAB: набор инструментов с открытым исходным кодом для анализа динамики ЭЭГ в одной попытке, включая анализ независимых компонентов. J. Neurosci. Методы 134, 9–21.

Академия Google

Feinkohl, I., Borchers, F., Burkhardt, S., Krampe, H., Kraft, A., Speidel, S., et al. (2020). Стабильность выполнения нейропсихологических тестов у пожилых людей, служащих нормативным контролем для исследования послеоперационной когнитивной дисфункции. BMC Рез. Примечания 13:55. doi: 10.1186/s13104-020-4919-3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фьелль, А. М., и Валховд, К.Б. (2001). P300 и нейропсихологические тесты как показатели старения: топография скальпа и когнитивные изменения. Топогр головного мозга. 14, 25–40. doi: 10.1023/a:1012563605837

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Гевинс, А., Смит, М.Е., МакЭвой, Л.К., Илан, А.Б., Чан, К.С., Цзян, А., и соавт. (2011). Когнитивный и нейрофизиологический тест изменения исходного состояния человека. клин. Нейрофизиол. 122, 114–120. doi: 10.1016/j.clinph.2010.06.010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хеджес, Д., Дженис Р., Микельсон С., Кит К., Беннет Д. и Браун Б. Л. (2016). Амплитуда Р300 при болезни Альцгеймера. клин. ЭЭГ Неврологи. 47, 48–55. дои: 10.1177/1550059414550567

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хаффмейер, Р. , Бейкерманс-Краненбург, М. Дж., Алинк, Л. Р., и ван Эйзендорн, М. Х. (2014). Надежность связанных с событием потенциалов: влияние количества проб и электродов. Физиол. Поведение 130, 13–22.

Академия Google

Джекел, К., Damian, M., Wattmo, C., Hausner, L., Bullock, R., Connelly, P.J., et al. (2015). Легкие когнитивные нарушения и дефицит инструментальной деятельности в повседневной жизни: систематический обзор. Альцгеймер Res. тер. 7:17. doi: 10.1186/s13195-015-0099-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Киношита С., Иноуэ М., Маэда Х., Накамура Дж. и Морита К. (1996). Долгосрочные закономерности изменения ERP при повторных измерениях. Физиол.Поведение 60, 1087–1092. дои: 10.1016/0031-9384(96)00130-8

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Кланк В.Е., Энглер Х., Нордберг А., Ван Ю., Блумквист Г., Холт Д.П. и соавт. (2004). Визуализация амилоида головного мозга при болезни Альцгеймера с помощью питтсбургского соединения-B. Энн. Нейрол. 55, 306–319.

Академия Google

Lee, M.-S., Lee, S.-H., Moon, E.-O., Moon, Y.-J., Kim, S., Kim, S.-H., et al. (2013). Нейропсихологические корреляты P300 у пациентов с болезнью Альцгеймера. Прог. Нейро Психофармак. биол. Психиатрия 40, 62–69. doi: 10.1016/j.pnpbp.2012.08.009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лью, Х.Л., Грей, М., и Пул, Дж.Х. (2007). Временная стабильность слуховых событийных потенциалов у здоровых лиц и пациентов с черепно-мозговой травмой. Дж. Клин. Нейрофизиол. 24, 392–397. дои: 10.1097/wnp.0b013e31814a56e3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Любиц, А.Ф., Нидегген М. и Фезер М. (2017). Старение и производительность рабочей памяти: электрофизиологические корреляты пожилых людей с высокими и низкими показателями. Нейропсихология 106, 42–51. doi: 10.1016/j.neuropsychologia.2017.09.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Миллер, К. М., Прайс, К.С., Окунь, М.С., Монтихо, Х., и Бауэрс, Д. (2009). Является ли задача N-back допустимой нейропсихологической мерой для оценки рабочей памяти? Арх. клин. Нейропсихология. 24, 711–717. doi: 10.1093/arclin/acp063

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мун, С., Ранчет, М., Акинвунтан, А.Е., Тант, М., Карр, Д.Б., Раджи, М.А., и соавт. (2018). Влияние пожилого возраста на безопасность вождения у взрослых с заболеваниями. Геронтология 64, 291–299. дои: 10.1159/000486511

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Насреддин З.С., Филлипс Н.А., Бедириан В., Шарбонно С., Уайтхед В., Коллин И. и соавт. (2005). Монреальская когнитивная оценка, MoCA: краткий инструмент скрининга легких когнитивных нарушений. Дж. Ам. Гериатр. соц. 53, 695–699. doi: 10.1111/j.1532-5415.2005.53221.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Овердорп, Э. Дж., Кесселс, Р. П. К., Клаассен, Дж. А., и Оостерман, Дж. М. (2016). Комбинированное влияние нейропсихологического и нейропатологического дефицита на инструментальную деятельность в повседневной жизни у пожилых людей: систематический обзор. Нейропсихология. Ред. 26, 92–106. doi: 10.1007/s11065-015-9312-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Pedroso, R.V., Fraga, F.J., Corazza, D.I., Andreatto, C.A.A., Coelho, FGDM, Costa, J.L.R., et al. (2012). Latência e амплитуда сделать P300 Audivo na doença Alzheimer: uma revisão sistemática. Браз. J. Оториноларингол. 78, 126–132. doi: 10.1590/s1808-86942012000400023

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ранше, М., Морган, Дж. К., Акинвунтан, А. Э., и Девос, Х. (2017). Когнитивная нагрузка по всему спектру когнитивных нарушений: систематический обзор физиологических показателей. Неврологи. Биоповедение. Ред. 80, 516–537. doi: 10.1016/j. neubiorev.2017.07.001

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ранганатан, П., Прамеш, К.С., и Аггарвал, Р. (2017). Общие ловушки в статистическом анализе: меры согласия. Перспектива. клин. Рез. 8, 187–191.doi: 10.4103/picr.PICR_123_17

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Робертсон, С., Майерсон, Дж., и Хейл, С. (2006). Существуют ли возрастные различия во внутрииндивидуальной изменчивости показателей рабочей памяти? Дж. Геронтол. сер. Б Псих. науч. соц. науч. 61, 18–24. doi: 10.1093/geronb/61.1.p18

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Россини, П. М., Ди Иорио, Р., Веккио, Ф., Анфосси, М., Бабилони, К., Боццали, М., и др.(2020). Ранняя диагностика болезни Альцгеймера: роль биомаркеров, включая расширенный анализ сигналов ЭЭГ. Отчет группы экспертов, спонсируемой IFCN. клин. Нейрофизиол. 131, 1287–1310. doi: 10.1016/j.clinph. 2020.03.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Салиаси, Э., Герлигс, Л., Лорист, М.М., и Мауриц, Н.М. (2013). Взаимосвязь между амплитудой p3 и производительностью рабочей памяти различается у молодых и пожилых людей. PLoS One 8:e63701. doi: 10.1371/journal.pone.0063701

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Sandman, CA, and Patterson, JV (2000). Потенциал, связанный со слуховыми событиями, является стабильным и надежным показателем у пожилых людей в течение 3-летнего периода. клин. Нейрофизиол. 111, 1427–1437. doi: 10.1016/s1388-2457(00)00320-5

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Шмидек, Ф., Ли, С.-К., и Линденбергер, У.(2009). Вмешательство и облегчение пространственной рабочей памяти: возрастные различия в эффектах приманки в парадигме n-back. Психолог. Старение 24, 203–210. дои: 10.1037/a0014685

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сегаловиц, С. Дж., и Барнс, К.Л. (1993). Надежность компонентов ERP в слуховой парадигме чудаков. Психофизиология 30, 451–459.

Академия Google

Shrout, P.E., and Fleiss, J.Л. (1979). Внутриклассовые корреляции: использование при оценке надежности оценщиков. Психолог. Бык. 86, 420–428. дои: 10.1037//0033-2909.86.2.420

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Сперлинг, Р. А., Айсен, П. С., Беккет, Л. А., Беннетт, Д. А., Крафт, С., Фаган, А. М., и соавт. (2011). На пути к определению доклинических стадий болезни Альцгеймера: рекомендации рабочих групп Национального института старения и Ассоциации Альцгеймера по диагностическим рекомендациям по болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера. 7, 280–292. doi: 10.1016/j.jalz.2011.03.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Табира Т., Хотта М., Мурата М., Йошиура К., Хан Г., Исикава Т. и др. (2020). Возрастные изменения инструментальной и основной деятельности, нарушение повседневной жизнедеятельности у пожилых людей с очень легкой формой болезни Альцгеймера. Демент. Гериатр. Познан. Беспорядок. Экстра 10, 27–37. дои: 10.1159/000506281

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тройер, А.К., Вандерморрис С. и Мерфи К. Дж. (2016). Внутрииндивидуальная вариабельность в выполнении задач на ассоциативную память повышена при амнестических легких когнитивных нарушениях. Нейропсихология 90, 110–116. doi: 10.1016/j.neuropsychologia.2016.06.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван Динтерен, Р., Арнс, М., Йонгсма, М.Л.А., и Кесселс, Р.П.К. (2014). Развитие P300 на протяжении всей жизни: систематический обзор и метаанализ. PLoS One 9:e87347.doi: 10.1371/journal.pone.0087347

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Vidoni, E.D., Yeh, H.-W., Morris, J.K., Newell, K.L., Alqahtani, A., Burns, N.C., et al. (2016). Церебральная β-амилоидная ангиопатия связана с более ранним началом деменции при болезни Альцгеймера. Нейродегенеративный дис. 16, 218–224. дои: 10.1159/000441919

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Валховд, К. Б., и Фьелл, А.М. (2002). Годичная ретестовая надежность слуховых ERP у молодых и пожилых людей. Междунар. Дж. Психофизиол. 46, 29–40. doi: 10.1016/s0167-8760(02)00039-9

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Уэст, Р., Мерфи, К.Дж., Армилио, М.Л., Крейк, Ф.И.М., и Стусс, Д.Т. (2002). Нарушения намерения и изменчивость выполнения выявляют возрастное увеличение колебаний исполнительного контроля. Познание мозга. 49, 402–419. doi: 10.1006/brcg.2001.1507

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Япл, З.А., Стивенс, В. Д., и Арсалиду, М. (2019). Мета-анализ задачи рабочей памяти n-back: фМРТ свидетельствует о возрастных изменениях в вовлечении префронтальной коры на протяжении взрослой жизни. НейроИзображение 196, 16–31. doi: 10.1016/j.neuroimage.2019.03.074

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Новый коронавирус от пациентов с пневмонией в Китае, 2019 г.

пациентов

Рисунок 1. Рисунок 1. Рентгенограммы грудной клетки.

Показаны рентгенограммы грудной клетки пациента 2 на 8-й и 11-й дни после начала заболевания.Трахея была интубирована, и в период между получением двух изображений была начата искусственная вентиляция легких. Двусторонние пушистые затемнения присутствуют на обоих изображениях, но на втором изображении они повышены по плотности, распространенности и слиянию; эти изменения наиболее выражены в нижних отделах легких. Изменения, соответствующие накоплению плевральной жидкости, также видны на втором изображении.

Трое взрослых пациентов с тяжелой пневмонией были госпитализированы в больницу в Ухане 27 декабря 2019 года.Пациент 1 — 49-летняя женщина, Пациент 2 — 61-летний мужчина, Пациент 3 — 32-летний мужчина. Клинические профили были доступны для пациентов 1 и 2. Пациент 1 сообщил об отсутствии сопутствующих хронических заболеваний, но сообщил о лихорадке (температура от 37 ° C до 38 ° C) и кашле с дискомфортом в груди 23 декабря 2019 г. Через четыре дня после начала заболевания. болезнь, ее кашель и дискомфорт в груди усилились, но лихорадка уменьшилась; Диагноз пневмонии был поставлен на основании компьютерной томографии (КТ).Ее профессия была розничной торговлей на оптовом рынке морепродуктов. Пациент 2 впервые сообщил о лихорадке и кашле 20 декабря 2019 г.; респираторный дистресс развился через 7 дней после начала заболевания и ухудшился в течение следующих 2 дней (см. рентгенограммы грудной клетки, рис. 1), после чего была начата искусственная вентиляция легких. Он был частым гостем на оптовом рынке морепродуктов. Пациенты 1 и 3 выздоровели и были выписаны из стационара 16 января 2020 г. Пациент 2 умер 9 января 2020 г. Биоптаты не получены.

Обнаружение и выделение нового коронавируса

Три образца бронхоальвеолярного лаважа были взяты в больнице Ухань Цзиньинтань 30 декабря 2019 г. Нет специфических патогенов (включая HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 и HCoV-HKU1) были обнаружены в клинических образцах этих пациентов с помощью набора RespiFinderSmart22kit. РНК, выделенная из жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов, использовалась в качестве матрицы для клонирования и секвенирования генома с использованием комбинации секвенирования Illumina и секвенирования с нанопорами.Было получено более 20 000 вирусных прочтений из отдельных образцов, и большинство контигов совпадали с геномом линии B рода бетакоронавирусов, демонстрируя более 85% идентичности с SARS-подобным CoV летучих мышей (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1). геном опубликован ранее. Положительные результаты были также получены с использованием анализа ОТ-ПЦР в реальном времени для нацеливания РНК на консенсусную область RdRp пан-β-КоВ (хотя пороговое значение цикла было выше 34 для обнаруженных образцов). Выделение вируса из клинических образцов проводили с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей человека и клеточных линий Vero E6 и Huh-7. Выделенный вирус был назван 2019-nCoV.

Рисунок 2. Рисунок 2. Цитопатические эффекты в культурах эпителиальных клеток дыхательных путей человека после инокуляции 2019-nCoV.

Чтобы определить, могут ли вирусные частицы быть визуализированы в эпителиальных клетках дыхательных путей человека, инфицированных 2019-nCoV, культуры эпителия дыхательных путей человека, инфицированные псевдо-инфекцией и 2019-nCoV, исследовали с помощью световой микроскопии ежедневно и с помощью просвечивающей электронной микроскопии через 6 дней после инокуляции. Цитопатические эффекты наблюдались через 96 часов после инокуляции на поверхностных слоях эпителиальных клеток дыхательных путей человека; отсутствие биения реснички отмечено при световой микроскопии в центре очага (рис. 2).Никаких специфических цитопатических эффектов в клеточных линиях Vero E6 и Huh-7 не наблюдалось до 6 дней после инокуляции.

Рисунок 3. Рисунок 3. Визуализация 2019-nCoV с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Негативно окрашенные частицы 2019-nCoV показаны на панели A, а частицы 2019-nCoV в ультратонких срезах эпителиальных клеток дыхательных путей человека показаны на панели B. Стрелки указывают на внеклеточные вирусные частицы, стрелки указывают на включения, образованные компонентами вируса, и треугольники указать реснички.

Электронно-микрофотографии отрицательно окрашенных частиц 2019-nCoV, как правило, имели сферическую форму с некоторым плеоморфизмом (рис. 3). Диаметр варьировался примерно от 60 до 140 нм. Вирусные частицы имели характерные шипы размером от 9 до 12 нм и придавали вирионам вид солнечной короны. В ультратонких срезах эпителия дыхательных путей человека обнаружены внеклеточные свободные вирусные частицы и тельца включения, заполненные вирусными частицами в мембраносвязанных везикулах в цитоплазме. Эта наблюдаемая морфология согласуется с семейством Coronaviridae.

Для дальнейшей характеристики вируса с помощью секвенирования Illumina и нанопор были получены последовательности de novo генома 2019-nCoV из клинических образцов (жидкость бронхоальвеолярного лаважа) и изолятов вируса эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Новый коронавирус был выявлен у всех трех пациентов. Две почти полноразмерные последовательности коронавируса были получены из жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121), и была получена одна полноразмерная последовательность от вируса, выделенного от пациента (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119).Полные последовательности геномов трех новых коронавирусов были представлены в GISAID (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, идентификатор доступа: EPI_ISL_402119; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, идентификатор доступа: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan). /IVDC-HB-05/2019, идентификатор доступа: EPI_ISL_402121) и имеют 86,9% идентичности нуклеотидной последовательности с ранее опубликованным геномом SARS-подобного CoV летучей мыши (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1). Три генома 2019-nCoV сгруппированы вместе в подроде сарбековирусов, что демонстрирует типичную организацию бета-коронавируса: 5′-нетранслируемая область (UTR), комплекс репликазы (orf1ab), ген S, ген E, ген M, ген N, 3′ UTR. и несколько неопознанных неструктурных открытых рамок считывания.

Рисунок 4. Рисунок 4. Схема 2019-nCoV и филогенетический анализ геномов 2019-nCoV и других бетакоронавирусов.

Показана схема 2019-nCoV (панель A) и полный филогенетический анализ 2019-nCoV и других геномов бета-коронавирусов в подсемействе Orthocoronavirinae (панель B).

Хотя 2019-nCoV похож на некоторые бета-коронавирусы, обнаруженные у летучих мышей (рис. 4), он отличается от SARS-CoV и MERS-CoV. Три коронавируса 2019-nCoV из Уханя вместе с двумя SARS-подобными штаммами, происходящими от летучих мышей, ZC45 и ZXC21, образуют отдельную кладу.Штаммы SARS-CoV от людей и генетически сходные SARS-подобные коронавирусы от летучих мышей, собранные на юго-западе Китая, образовали еще одну кладу внутри подрода сарбековирусов. Поскольку идентичность последовательностей консервативных доменов репликазы (ORF 1ab) между 2019-nCoV и другими представителями бета-коронавируса составляет менее 90%, 2019-nCoV — вероятный возбудитель вирусной пневмонии в Ухане — является новым бета-коронавирусом, принадлежащим к sarbecovirus, подрод семейства Coronaviridae.

Средние значения Fz 3 в течение трех сеансов оценки.

Контекст 1

… Несмотря на то, что обувь с рокерской подошвой рекомендуется для лечения ревматоидного артрита, существует ограниченное количество исследований по анализу походки, подтверждающих ее применение. Параметры походки, такие как величина и время вертикальной GRF, изменяются у пациентов с ревматоидным артритом (7,10,12). Целью данного исследования было изучение влияния подошвы-качалки на пик и время вертикальной GRF во время ходьбы у пациентов с ревматоидным артритом. Было высказано предположение, что рокерская подошва будет вызывать изменения параметров GRF у пациентов с ревматоидным артритом через 7 и 30 дней наблюдения.В исследование были включены 16 больных ревматоидным артритом женского пола со средним возрастом 46,5 ± 8,25 года, массой тела 67,0 ± 9,73 кг и длительностью заболевания 8,2 ± 7,4 года. Диагноз ревматоидного артрита был поставлен опытным ревматологом на основании критериев Американской коллегии ревматологов (25). Другими критериями включения были наличие неактивного заболевания, которое определялось как оценка активности заболевания 28 (DAS 28) <2,6 (3), ревматоидный артрит в анамнезе более одного года (26), возраст от 20 до 60 лет (3). , 27), способность к самостоятельной ходьбе и двусторонняя боль в стопе и/или голеностопном суставе (14, 27).Критериями исключения были кожные изъязвления или дерматит (27), заболевания центральной или периферической нервной системы, предшествующие операции на нижних конечностях, ригидная pes-planeus или pes-cavus, растяжение связок или перенапряжение голеностопного сустава за три месяца до исследования, внутрисуставная инъекция стероидов в последние три недели до эксперимента или в настоящее время используют ортопедические ортезы или обувь (14,27). Исследование было одобрено комитетом по этике факультета реабилитационных наук Иранского университета медицинских наук (IUMS), Тегеран, Иран; и письменное информированное согласие было получено от каждого пациента.Всем пациентам была предоставлена ​​пара обуви повышенной глубины с высоким голенищем, модифицированной рокером от пятки до пят и застежками-липучками (17). Каждая пара подошвы-качалки была индивидуально подобрана опытным ортопедическим специалистом на основе стандартизированной конструкции рокера и индивидуальных мерок (рис. 1). Вершина пяточного рокера располагалась впереди медиальной лодыжки и имела угол 15°. Вершина рокера носка располагалась по центру на 63% длины обуви и располагалась под углом 25° (14, 21, 28). Рокер состоял из двух слоев этиленвинилацетата толщиной 25 мм в межподошве и резины толщиной 5 мм с твердостью по Шору 50-60 в подошве (14,21).Анализы проводились в лаборатории ходьбы, оснащенной двумя силовыми пластинами (платформа Bertec 4060-10force, США). Данные собирались с частотой дискретизации 200 Гц. Все анализы проводились в течение трех сеансов оценки, включая первое посещение, после 7-дневного и 30-дневного наблюдения. На первом сеансе оценки и перед сбором данных каждому пациенту была изготовлена ​​специальная пара обуви с рокерской подошвой, и ему дали возможность приспособиться к обуви в течение 5 минут (14). После этого испытуемых просили пройти с выбранной ими скоростью по 9-метровой дорожке в двух условиях, включая босиком и в обуви с рокерской подошвой, в случайном порядке. Было зафиксировано не менее трех полных испытаний для каждого условия, в которых ноги полностью наступали на силовые пластины. Затем данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием SPSS версии 17 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Критерий Колмогорова-Смирнова был выполнен для обеспечения нормального распределения данных (P>0,05). Дисперсионный анализ повторных измерений (ANOVA) с апостериорным тестом с поправкой Бонферрони применялся для сравнения переменных до и после вмешательства. Альфа-уровни были установлены на 0.05 для всех тестов. Средние значения и значения стандартного отклонения (SD) пиковой вертикальной GRF в условиях босиком и качалках в первый (через 7 дней) и второй (после 30-ти завершений первого сеанса оценки участников попросили носить рокерские подошвы в течение одного месяца. Тот же протокол тестирования был выполнен через 7 и 30 дней. Все тесты проводились во второй половине дня, чтобы контролировать влияние утренней скованности на походку при ревматоидном артрите (26). кг) и следующие переменные были получены из графиков GRF: первая максимальная вертикальная сила (Fz 1 ), минимальная вертикальная сила (Fz 2 ) и вторая максимальная вертикальная сила (Fz 3 ).Кроме того, из графиков были определены временные параметры, включая времена Fz 1 (Tz 1 ), Fz 2 (Tz 2 ) и Fz 3 (Tz 3 ). Кроме того, для каждого состояния было рассчитано время стояния и двойной поддержки (рис. 2). дни) последующие сеансы представлены в таблице 1. Через 7 дней последующий сеанс FZ 1 с качалкой был значительно выше, чем в босиком (P = 0,00) (таблица 1). Через 7 дней FZ 2 уменьшилась по сравнению с первой оценкой в ​​качалках (P = 0.00) (табл. 1). Через 7 и 30 дней наблюдения показатель FZ 3 оказался статистически ниже в обуви-качалках по сравнению с босиком (P = 0,01, P = 0,00) (таблица 1, рисунок 3). Между другими переменными силы не было обнаружено существенных различий (P>0,05) (таблица 1). В таблице 2 представлены средние значения и стандартное отклонение (SD) времени GRF, а также время стояния босиком и качалками при первой оценке и последующих сеансах (через 7 и 30 дней). анализ показал, что Tz 1 был ниже в течение 30 дней наблюдения, чем при первой оценке (P = 0.005). Кроме того, Tz 1 была снижена при использовании качалок через 7 и 30 дней по сравнению с первой оценкой качалок (P = 0,03, P = 0,009) (Таблица 2). Tz 3 был значительно выше в обуви-качалке по сравнению с босиком на первом сеансе оценки (P = 0,03). Тем не менее, ходьба в качалках привела к значительному снижению Tz 3 через 7 и 30 дней наблюдения по сравнению с первой оценкой качалок (P = 0,017, P = 0,015) (таблица 2). Статистический анализ показал меньшее время стояния босиком в течение 7-дневного сеанса наблюдения по сравнению с первым сеансом (P = 0.03). Кроме того, сравнение времени стояния в качалках в течение 30 дней наблюдения и первых занятий показало значительное снижение (P = 0,005). Ношение качалок продемонстрировало увеличение времени стояния при первой оценке (P = 0,006) (таблица 2, рисунок 4). Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить влияние качалок на пики и время вертикальной опорной реакции при ходьбе у пациентов с ревматоидным артритом. Было продемонстрировано, что пациенты с ревматоидным артритом изменяют свою нормальную походку, чтобы компенсировать боль или деформацию стопы (5,7,8).Результаты нашего исследования показали, что первый пик GRF увеличился в кроссовках по сравнению с босиком. Точно так же Sloss сообщил об увеличении FZ 1 при ношении ортеза (29). Они объяснили это увеличением используемого материала, особенно при ревматоидном артрите, когда более твердый материал используется для контроля пронации. В этом исследовании твердый материал (шор-А 50-60) использовался для изготовления подошвы рокерской обуви. Это могло уменьшить амортизацию при ударе пяткой и вызвать увеличение FZ 1 .Более того, Кук и соавт. предположили, что ограничение сгибания колена может увеличить вертикальную GRF (30). В данном исследовании верхушка пятки качалок располагалась впереди медиальной лодыжки. Это создаст разгибательный момент колена, который может увеличить FZ 1 . Кроме того, это может быть результатом массы качалки, поскольку Масуд (31) пришел к выводу, что ходьба в неустойчивой тяжелой конструкции обуви способствует усилению контактных сил. Результаты показали снижение FZ 2 во время второй и третьей оценочных сессий с качалкой.Это можно объяснить тем, что пациенты привыкли к обуви и, следовательно, больше полагались на обувь на двух последних сеансах. Кроме того, результаты показали, что использование качалок эффективно снижает FZ 3 на второй и третьей оценочных сессиях по сравнению с босиком. Походка при ревматоидном артрите характеризуется критическим поражением третьего кулисы из-за уменьшения объема движений в плюснефаланговом суставе, боли и деформации стопы (3,7,12). Это приводит к задержке смещения центра давления (7, 12), позднему подъему пятки вместе со снижением второго вертикального пика GRF (7, 10, 12).Можно сказать, что качалка может привести к уменьшению диапазона движений переднего отдела стопы, имитируя движение стопы при тыльном сгибании и облегчая функцию качания стопы (21). Таким образом, уменьшение FZ 3 может подтвердить функцию стопы. Башмак качалки в продвижении третьего коромысла и помогает больным ревматоидным артритом. Предыдущие исследования показали, что боль и деформация стоп были преобладающими нарушениями при ревматоидном артрите (7). У этих пациентов также наблюдалось удлинение времени изменения походки.(9-11) Наши результаты показали, что качалки приводят к снижению времени стояния вместе с TZ 1 и TZ 3 в течение 30 дней наблюдения. Это может быть связано с облегчением боли, которое ранее было показано как результат ношения рокерской обуви (14, 19). Следует отметить, что результаты этого исследования ограничены небольшой выборкой (16 женщин) пациентов с ревматоидным артритом. Более того, эффект качалки оценивался только при анализе параметров опорной реакции и через 30 дней наблюдения.Поэтому рекомендуется более комплексное исследование с более длительным периодом наблюдения, включающее большую популяцию и представителей обоих полов. Также предлагается оценить кинетику и кинематику суставов нижних конечностей, чтобы лучше понять эффект такого вмешательства. В этом исследовании параметры вертикальной опорной реакции были изменены у пациентов с ревматоидным артритом с помощью качалок с пятки на носок сразу и через месяц наблюдения. Уменьшенный Fz 3 …

531 обзор навсегда, Обзор фильма PCR на этой неделе «Секс в большом городе 2» Обзор фильма: Майкл А.5/3/1 Навсегда Джима Вендлера. Рассмотрение. Bare Minerals #1 237 отзывов. Якоря и лидеры) и более 50 различных шаблонов обучения 5/3/1. Размер: Пожалуйста, выберите размер. Дзуренда, разделенная коллегия Девятого округа, считает, что человек, осужденный на основании неопровержимых доказательств за три жестоких убийства в 1980 году, имеет право на судебное освобождение по делу 10 человек / 100 альбомов: дружба — это агония. 60 | 87 оценок. Таня Б. Экскурсия по этому плану. Прогнозируемое воздействие. Стойкая подводка для глаз Forever Wear. 09 · Детали рейтинга · 152 рейтинга · 9 обзоров.Отправить сообщение. 2 PCIe NVMe SSD с Gold P31. Он занял место, которое когда-то использовалось New York and Company, если это помогает с расположением, и находится рядом с гаражом. Однако были противоречивые сообщения о том, играет ли он в финальной версии песни. Станьте сильнее и поставьте новые личные рекорды с помощью этого простого в использовании приложения, которое избавляет от математики из 5/3/1. Показать ингредиенты. Он невероятно прост и эффективен, что делает его одним из самых популярных вариантов 5/3/1.4. 420. Тренировочные дни: Это 4-дневная программа в неделю: Понедельник 1. Я получил приличный уровень увеличения силы и немного улучшил эстетику. Джейкс) Рецензент: Дженис С. «(Мы) дорожная бригада», посвященная Грэму (Ренальдо) Рейнольдсу, Полу Каммингсу, Яну (Орлу) Добби, Стиву (Плоду) Флуду, Дэйву Чемберлену, Филу Ариадо, Лоуренсу, Питу, Водитель Стив и все, кто помогал, напивались, трахались, девчонки и т. д. Напишите отзыв. Закаленное текстурированное стекло с отделкой из шиншиллы. 22 марта 2015 г.В отличие от простого лезвия с мускульной спиной, где мышца спины проходит прямо по спине, мускульная спина на MP-62 разделена как по полости, так и по периметру. 0 считают этот обзор полезным. Вот как мы защищаем нашу платформу. 1 кровать, 1 ванная, 835 кв. футов, 12–18 месяцев аренды, доступна сейчас. — 531 — 3LR50 — 1307AP — RPX19 — A19PX — EPX19 Используется в старых моделях камер Polaroid: 100, 101, 102, 220, 225, 230, 240, 250 и 340.5/3/1 Forever был выпущен несколько месяцев назад и вызвал большое волнение, и у меня было время прочитать его и сформулировать несколько мыслей для тех, кто все еще сомневается, стоит ли вам добавить его в свою библиотеку. С. Многие американцы согласны с тем, что они «застрянут с этим навсегда» — или, по крайней мере, надолго. Работает под: Windows 8». Вместо того, чтобы съеживаться, мы хотим, чтобы они стали лучше, и во многих случаях они это делают. Натуральное минеральное покрытие 122 отзыва. Единственным недостатком этого будет то, что для спаривания потребуется вечность! У вас есть 2 быть определенного возраста, или w/e и быть альфа-самцом/женщиной.Посмотреть ответ Covid. Теперь, за два дня до душа, мне нужно найти что-нибудь еще, чтобы надеть и купить, пока их компания держит мои деньги, пока вещь не будет доставлена ​​и не возвращена. Медиа-галерея апартаментов Alterra Unit. 707-469-0180 | Посмотреть карту. 5/3/1 Навсегда простое и эффективное программирование для размера, скорости и силы · Джим Вендлер, ООО · Джим Вендлер. Halo Infinite Skull Locations ZTE ZXDSL 531 — это WiFi-модем, поставляемый BSNL с их широкополосным соединением. 71, тогда как средний показатель по отрасли составляет 6.60 МБ. По иронии судьбы, учитывая ее популярность в сообществе пауэрлифтеров, программа 5/3/1 была изобретена Джимом Вендлером, когда он решил уйти из спорта. У вас должна быть ТМ для приседаний, жима лежа, жима и становой тяги. грамм. На самом деле я бы оценил это на 6. Мне потребовалась целая вечность, чтобы найти фиолетовую блузку для беременных моего размера и ту, которая мне понравилась. Dream Matte Mousse 3360 отзывов. В течение многих лет это был общепринятый способ разгрузки. Forever Summer – это семейный бизнес… Авро 531 ‘Паук’ 1:33 Самолет 1:33 / Самолет 1:33 Модель в формате pdf для самостоятельной печати.Основные моменты позднего завтрака включают корейский цыпленок и вафли (22 доллара США), которые представляют собой одну из южных классических блюд, но с салатом из кимчи и глазурью из меда, чили и чеснока; и PBS Crispy Lox (16 долларов), квадраты arroz pegao (хрустящий рис), увенчанные ломтиками вяленого Pubbelly… Brenden Vacaville 16 & JBX. 11 долларов. 5/3/1 История и контекст. Обзоры публикуются мгновенно, без модерации. Посмотреть все часы Часы работы с понедельника по пятницу, с 9:00 до 18:00, суббота и воскресенье, выходной. Конечно, с Century 21 Models и TJ Maxx уйдут из Район найти уличную парковку не так сложно в данный момент.Правопреемники. Очень мягкий и эластичный. Универсальное стандартное программное обеспечение для 3D-рендеринга и анимации. Так или иначе, недавно Вендлер выпустил новую книгу «531 Forever». Рецензии «Как хорошо, что есть гимны специально для этой ключевой литургии! В течение долгого времени нам приходилось использовать пасхальные гимны, несмотря на этический конфликт. сообщает о 3243 новых случаях COVID-19, 7 новых случаях смерти за 3 дня. 14. Отсканировано, так как недоступно в формате PDF. Сообщений: 1304. Веб-сайт. Кобылы. 531 отзыв.BFP подала ходатайство о certiorari, которое мы удовлетворили. Вот данные, опубликованные в понедельник, 1 ноября 2021 г. Чтобы сохранить свой In 531 Forever, вы устанавливаете свою ТМ на уровне 85% протестированного или рассчитанного 1ПМ, а затем периодически оцениваете его на 5+, 3+ или 1. + дней, или когда вы проводите PR-тест на 7-й неделе после (например) 2-х ведущих и 1-го якорных циклов. Это поможет вам полностью понять принципы и философию 5/3/1. Мичиган-роуд на северной стороне города была одной из 14 организаций, которые представили нынешних приемных домашних животных в эксклюзивных сегментах во время Puppy Bowl.Чтобы сохранить ОБЗОР ПРОГРАММЫ: 5/3/1 СТРОИМ МОНОЛИТ. Исторически так сложилось, что на улице Кеннеди-стрит, 531, северо-запад № 4, бывает 8 сильных двухдневных штормов в год, из них примерно 1. Место чистое и есть несколько отличных магазинов. внедрение и управление программным обеспечением. Текущая оценка Trulia для 531 Serpa Way составляет 2 166 800 долларов. Открыто сегодня: 10:00 — 22:00. Мариссе предшествует смерть ее отца Джорджа Мареса. Детская Колетт, автор sorarocks531, литература. Все наши украшения изготовлены из серебра 925 пробы, желтого золота 9 и 18 карат, белого золота 9 и 18 карат, розового золота 9 и 18 карат и полудрагоценных камней.2022 Tesla Model S. 21 «осадков за шторм. 6. Одежда от Halara точно такая же, как на картинке. Альбом Black Sabbath Cross Purposes был первым альбомом, записанным после второго ухода вокалиста Ронни Джеймса Дио из группы, и знаменует собой возвращение Тони Мартина. как певица Studio Fix Powder Plus Foundation 3960 отзывов. Джули Грэм, Нико Мираллегро, Нил Моррисси, Таллула Грив. Место нахождения. Ultimate 5/3/1 убирает математику из программы 5/3/1, поэтому вы можете сосредоточиться на том, чтобы стать сильнее.Вес ~ 173 фунта. 6 книг на этой неделе. Каждого третьего жителя Восточной Вестфалии зовут Ширбаумом. Зубной гель Forever Bright в цвете ACCRA | КУМАСИ | ТАМАЛЕ — Форевер Ливинг Продактс в Гане — зубной гель на травах для отбеливания зубов в Гане. Но внутри формируется смертельный и морально развращенный треугольник. Добро пожаловать в сообщество дополнительного обучения! › Форумы › Дополнительное обучение › Сообщения и статьи в блогах › 5/3/1 Forever [Обзор книги] С тегами: Periodization, Review, Strength Training, Video В этой теме 1 ответ, 2 участника, последнее обновление Sergio Navadijo 3 years , 9 месяцев назад. включить IPv6, в плагинах CNI pkg/ipam/ipam_linux. JPMC — один из лучших банков, и большинство сотрудников знают об этом. В этой ситуации может быть сложно ориентироваться в офисном протоколе, поскольку многие компании придерживаются строгой политики в отношении подарков. 12 августа 2020 г. Мощный Т. Эти упражнения: Жим лежа Приседания Становая тяга Жим над головой 3-недельный цикл периодизации Для каждого из этих упражнений вы будете следовать 3-недельной периодизации […] Обзор Brother ST531HD Как я уже говорил, эта модель довольно новая, поскольку он был выпущен примерно в мае 2017 года, поэтому его оценивают меньше людей, и он менее популярен, чем модель CS6000I.Узнайте больше о FreightPOP. Лучшее облачное программное обеспечение для цепочки поставок, которое упрощает логистику благодаря единому входу в систему для всех входящих и исходящих отправлений посылки, LTL, FTL, морем и воздухом. Этот выпуск выходит на неделю с 24 по 30 мая 2010 года. Новые (мультиверсальные) Masters Of Evil Draw First Blood?! В книге есть несколько… 531 Grand Boulevard — 215 1575 долларов. Был ли этот отзыв полезен? Войдите, чтобы проголосовать Более проблематичной была сцена лондонского метро, ​​которая подвергалась критике, кажется, что она длится вечно и слишком далеко заходит в фарсовом значении.Сегодня закрыто. образование РУКОВОДИТЕЛИ. 5. 1007/978-3-531-19907-8_13; Объем главы: 26 страниц; Мгновенная загрузка PDF; Читается на всех устройствах; Владейте ею навсегда; Эксклюзивное предложение только для физических лиц; Расчет налога будет завершен во время оформления заказа; Купить главу Марисса М. Лицензия на программу Пробная версия. Отзывы. Get 531 Forever — Джим Вендлер, 17 лет. Январь 2022. Номер телефона принадлежит спаму. Из бизнеса: В Friendly’s мы подаем мороженое и вкусно развлекаемся с 1935 года. 7 звезд: «Супер доступная и МИЛАЯ одежда! Вы 100% окупаете свои деньги.Рейтинги: +4. дом — это 5 кроватей, 4. 545 обзоров для Publishers Clearing House (PCH), 2. Наконец, если вы решите, что вам не нравятся мои электронные таблицы, в Интернете есть из чего выбрать. 40 дюйм. 15:9, 2000 x 1200 пикс. 224 точек/дюйм, емкостный сенсорный экран, IPS, глянцевое покрытие: да Отзывы публикуются моментально, без модерации. Минеральная пудра 185 отзывов. Получите обзоры Lakewood Center, рейтинги, часы работы, номера телефонов и направления. питание от PatientConnect365 Чудаки навсегда Видеообзор.Чтобы сохранить свой 531. Я выполнял программу Вендлера в течение восьми месяцев и добавил 30 кг к приседаниям, 20 кг к жиму лежа и 20 кг к становой тяге, закончив приседом 150 кг, жимом лежа 140 кг и становой тягой 190 кг. Я проверил, что провода динамика не касаются корпуса. Несмотря на разное телосложение/форму тела, они хорошо сидят. И размерчик точный. Через пару лет я увидел, что у Вендлера есть эта книга, и решил попробовать. Опрос Центра исследований по связям с общественностью Associated Press-NORC показывает, что 531 Serpa Way, Фолсом, Калифорния 95630-6323 — это дом на одну семью, выставленный на продажу за 2 175 000 долларов.Вендлер любит скорость штанги и субмаксимальные подъемы. Номер телефона принадлежит Подозрительному. Отзыв написан в США 23 августа 2019 г. Я занимаюсь программой 531 уже пару лет после покупки 531 2-го издания. Сотрудники. Тренировочный максимум (ТМ) основан на 90% вашего лучшего ТЕКУЩЕГО 1ПМ в спортзале или рассчитанного вами 1ПМ. Wain L — Make Up Your Mind 7. Управление на месте и аварийное техническое обслуживание 24 часа. The Watch Cat публикует историю о домашнем коте 531, который останавливает ограбление и становится героем района, навсегда меняя отношение соседей к кошкам.Период времени — с мая по декабрь 2018 года, два цикла лидера/якоря 1000% Awesome (первый был изменен, я объясню ниже) и один цикл лидера/якоря Левиафана. 508 У. Обзор. Другими словами, вместо того, чтобы устанавливать 5 в качестве минимального количества повторений перед сбросом, вы можете вместо этого использовать в качестве минимума три повторения. В целом Хорошая программа. Расположение префикса номера +1 (531) находится в Небраске. » Я больше не буду этого делать. № 3 из 17 вещей, которые нужно сделать в Корбине. Я много раз заказывал излишки, и у меня есть дополнительные расходы.А. Хелен, клиент Zappos, 10 августа 2020 г. Neff Injury Law, национальная судебная фирма, расположенная в Атланте, занимается только делами о серьезных травмах и неправомерными действиями смерти. Если вы женщина-воин молитвы или надеетесь ею стать, эта книга будет заполнена Прочитайте 1719 отзывов о Джоне Игле Хонда из Далласа — отзывы о дилерских центрах Honda, написанные реальными людьми, такими как вы. 5 миллиардов благодаря сочетанию 17-процентного роста продаж продукции до 24 долларов. из 282. Категория 3D-дизайн. 20 января. Мужская футболка Rick and Morty Forever and Forever Graphic.S М L ХL ХХL. Всего 89 долларов. Описание: Маленькая прямоугольная стеклянная разделочная доска ColorLyte® с белой сублимационной подложкой, включает резиновые ножки, 11. 4:33. USAA — Замороженные счета. Я имею в виду, что из восточного залива нет ничего, что могло бы сравниться с этим. 2д 1144 (1992). Тренировка Primal 531 для наращивания силы предназначена для опытных лифтеров или опытных лифтеров, которые хотят как можно быстрее сосредоточиться на повышении своей силы в большой четверке упражнений. Точно так же его отношение цены к продажам (P/S) составляет всего 2.Это был один из самых больших торговых центров, которые я когда-либо видел. почтовые расходы. MP-62 описывается Mizuno как Dual Muscle. Вот несколько очень крутых, которые я нашел (но я… Обзор: Наши любимые манекены для краш-тестов возвращаются в «Чудаках» В «Чудаках навсегда» дух 22-летних «Чудаков» — что никто из нас не так дорог что мы не можем пережить… Джим Вендлер готовит новую книгу: 5/3/1 Forever И хотя я определенно рекомендую его первую книгу, если вы ее еще не читали, я искренне верю, что магия заключается в его продолжайте до 5/3/1, «После 5/3/1.Стойкая тональная основа Double Wear SPF10/PA++ 1765 отзывов. Продано. 40 обучающих шаблонов. Быстрый магазин 14 цветов. В семье возродилась искра надежды на будущее. КУПИТЬ. 1 посетитель зарегистрировался в Stuck навсегда. Спецификация Материалы — Вес стерлингового серебра — 1. Позвоните по телефону 816-283-3300 или напишите по адресу [email protected] Форевер Ливинг производит продукты с алоэ вера высочайшего качества и признана мировым лидером в области многоуровневого маркетинга (FBO) на протяжении сорока лет! Выбирая «Продолжить» или «Продолжить просмотр нашего веб-сайта», вы соглашаетесь разрешить этому веб-сайту сохранять файлы cookie.Лолита — Танцуют все 14. 83. Это обязательное учебное пособие для любого посетителя тренажерного зала. Когда работодатель предлагает положительный отзыв о прошлой работе, хорошей идеей будет ответить благодарностью. и требуется вечность, чтобы связать с ним другую учетную запись. В общем, я оставил 1 или 2 в баке на все подъемники. Ввод тарелки 75 фунтов/килограмм. бесплатно. Formula 3 Rock Progressivo Italiano. перейти: Конфигуреифейс (). Отзыв №26: Бломлюд. com: мнения и обзоры пользователей Nokia N9 — стр. 531 Каменный пони: рок-н-ролл навсегда — 170 отзывов путешественников, 136 откровенных фотографий и отличные предложения для Эсбери-Парк, штат Нью-Джерси, на сайте Tripadvisor. Помогает то, что искусство и анимация довольно приличные для сериала, а его обзоры публикуются мгновенно, без модерации. Большинство для этой машины имеет благоприятный рейтинг в Интернете. Жизнь скорбящей матери Розали и ее дочери Мэдди навсегда меняется, когда они встречают Джеда. 1. Самые просматриваемые продукты для рассыпчатой ​​основы. 11, Нет. В 2050 г. прогнозируется 23 бури при примерно 2. Учитывая этот вариант «тире 2». С Центром Лейквуд можно связаться по телефону (562) 531-6707. Согласно книге Never Say Die!, Эдди Ван Хален был в студии во время записи и участвовал в написании песен для «Evil Eye», хотя его имя не указано.Последний раз 531 Laura Ln продавался 15 декабря 2014 года за 50 000 долларов. Джон Игл Хонда из Далласа. Читать обзоры | Оцените театр. Эта программа была разработана благодаря работе со многими лифтерами и спортсменами и пониманию того, что каждое упражнение нужно тренировать немного по-разному. Напишите короткую заметку о том, что вам понравилось, что заказать или другой полезный совет для посетителей. 75 миллиардов и рост доходов от услуг на 42% до чуть более. Примечание: эксклюзивный Benchmade Pardue 531-1501 REI стоит 165 долларов (на момент написания этого обзора) и стоит всего 5 долларов по сравнению со знаменитым Benchmade Osborn 940-2.SK hynix теперь входит в солярий M. 2. Forever Summer Solstice, Фитчбург, Массачусетс. 96 440 долларов. C. Мы боремся с поддельными отзывами. Это была одна из тех программ, которые я хотел запустить в течение ДОЛГОго времени, но просто не мог найти 6 полных недель, чтобы посвятить ей это из-за расписания соревнований. 5/3/1 Forever: Простое и эффективное программирование размера, скорости и силы. Bravado Venture LLC BBB также получила оценку «A+» с BBB с 4. 6 июля 2018 г. в 11:28. Джон Бабос.5/3/1 для пауэрлифтинга Это угол пауэрлифтинга к программе 5/3/1 для пауэрлифтинга. 5 из 5 звезд из 15 подлинных отзывов на крупнейшем австралийском сайте ProductReview. После 6 тяжелых недель я закончил работу Джима Вендлера «5/3/1 Building the Monolith», также известную как «5/3/1 для размера». Гэри Олдман, почти неузнаваемый, просто невероятен, как Черчилль и чудо-почему. Skin Foundation SPF15 506 отзывов. Джейкс написал эту книгу о десяти библейских женщинах, чтобы показать, что их молитвы положительно влияют на их собственную жизнь, а также на мир вокруг них.Рецензии на книгу: 5/3/1 навсегда. Если вы еще не читали мой первый пост об оригинальной программе Джима Вендлера 5/3/1, вы можете сделать это здесь. Мягкая натуральная кожа толщиной 4 мм — затемненная фурнитура —… Оставьте отзыв о главном офисе SoundView Financial Credit Union по адресу 14 Research Drive в Вефиле, штат Коннектикут, чтобы другие узнали о вашем опыте использования услуг, и для привязки другой учетной записи требуется целая вечность. к этому. Последние отзывы пациентов. Химия Этот обзор содержит спойлеры, нажмите развернуть, чтобы посмотреть.До которого легко добраться. Описание. 6 497 кв. м. Название обзора: Бог слушает ее (обзор книги «Когда женщины молятся» от T. Рейтинг 4. Все проценты основаны на вашем тренировочном максимуме (TM). (RLNE3825933) 531 Grand Apartments расположен в Канзас-Сити, штат Миссури, в Почтовый индекс 64106. 09 января 2022. Позитивная атмосфера, которую создают песни, вызывает восхищение Midas — один из крупнейших в мире поставщиков автомобильных услуг, включая выхлопные системы, тормоза, рулевое управление, подвеску и техническое обслуживание.Дополнительная работа BBB выполняется по схеме 5 подходов по 10 повторений (5×10). Студийный альбом, 1972. 531 Forever Pdf Download. Просмотр 2 постов — с 1 по 2 (всего 2) Вернуться на форум… В 531 Forever вы устанавливаете свой ТМ на 85% от проверенного или рассчитанного 1ПМ, а затем периодически оцениваете его либо на 5+, 3+, либо 1+ день или когда вы проводите PR-тест на 7-й неделе после (например) 2-х ведущих и 1-го якорных циклов. Это был первый раз, когда я заказала одежду онлайн, и мне понравилась почти каждая вещь. Это руководство поможет вам включить и настроить параметры безопасности Wi-Fi модема ZTE ZXDSL 531.12 долларов. Тренировки длились от 1 часа 30 минут до 2 часов в тяжелые дни с большим количеством аксессуаров. 86 дюймов осадков за шторм. Garey ***** 5 Stars T. 531 Davis Street, Vacaville, CA 95688. Мы приветствуем полезные и конструктивные отзывы. Король и королева — Король и королева 10. 9 апреля 2017 г. 3 . 531 Wilson Heights Blvd, Торонто, Онтарио M3H 2V7 Our Darker Purpose — это ролевая игра в жанре roguelike с видом сверху, которая сочетает в себе изобретательность определяющей жанр классики с обширностью и доступностью современных приключенческих игр.Avengers #51 Avengers Forever #1 Justice League Incarnate #2 Nightwing #87 Radiant Black Forever-Green Landscaping находится в Парме, штат Мичиган, и с ним можно связаться по телефону: 517-531-7673. Модель содержит: 6 листов с деталями 3 листа с инструкцией 1 лист с описанием 1 лист с задней обложкой 1 лист с обложкой After Forever Дискография и песни: Музыкальный профиль After Forever, сформирован 1995. 18. 00. Colette’s Nursery. Однако я не знаю, какой из них будет наиболее подходящим для моей ситуации, в общем, мне 18 лет, 165 фунтов, жим 225, присед 290 и становая тяга 320. Жанры: симфо-метал, готик-метал, пауэр-метал. Затем вы вычисляете новый TM на 85% от этого и повторяете. У нее остались бабушка и дедушка Дэнни и Лорейн Руис, мать Лупита Гарсия, братья Кевин Марес, Лэнс Руис, Эндрю Моралес, Дэниел Руис и Юджин Руис, сестра Кимберли Марес GSMArena. Он более доступен по цене, чем многие другие лучшие варианты, но обеспечивает аналогичную или лучшую производительность, а Birdeye — это идеальное сочетание замечательных людей, лучших в своем классе продуктов и лидерства, приверженного суперпозитивной корпоративной культуре.Но это также предполагает признание того факта, что лишь немногие значительные мыслители последних двух столетий могут полностью игнорировать Кольриджа — предположение, подтвержденное ссылками Перкинса на Гумбольдта, Гегеля, Кьеркегора, Тейяра де Шардена и даже Дерриду (чья деконструкция западного логоцентризма Washington Law Review Volume 95 Number 1 3-2020 Заключенные родители и благополучие детей в Вашингтоне Sayer Rippey Следите за этой и дополнительными работами по адресу: https://digitalcommons, Нажмите здесь, чтобы Поэтому я хотел бы участвовать в ежемесячной программе повышения квалификации, такой как 531 или Метод Джаггернаута или что-то в этом роде. Отчет. Получите больше информации о Вечно-Зеленом Ландшафтном дизайне, посмотрев наш в … Спецификация Материалы — Стерлинговое Серебро Вес — 1. Обзор Эпизода 6 Книги Бобы Фетта. 29 января в 8:44 ·. Самый полезный негативный отзыв. Это 4. Фильм разочаровал меня отсутствием остроты книги, слишком поверхностным (не то, чтобы книга была действительно глубокой), неспособностью передать внутреннюю сущность Китнисс и других персонажей. Я представил рецензию, но не оценку, поэтому мои 2 Полтора звезды в обзоре есть… ФОРМУЛА 3 Отзывы.16 апр. 2021 г. Поскольку это есть только в его книге Forever, я не буду раскрывать детали, но это похоже на программу 5/3/1 BBB. 5/3/1 для хардгейнеров. ком. Брак 17 ноября 1829 г. Бун, Кентукки, США. Все распланировано для вас. Однако у меня все еще были проблемы с модулем kube-dns, который продолжал перезапускаться. Wendler’s 5 3 1 Forever Review. Go Go Girls — I Wanna Be Fat 6. Как и Retractable Technologies, Dentsply Sirona (NASDAQ:XRAY) является главным офисом SoundView Financial CU, часы работы, телефон, обзоры, карта для 14 Research Drive, Bethel, CT. Все еще подстрекает Телефонный номер +1 (678) 531-8760 является действительным номером и имеет отрицательный рейтинг. Это 20-недельная программа, предназначенная для улучшения ваших приседаний, жима, жима лежа и становой тяги. За 800 фунтов есть… 31 754 отзыва о халаре, 4. Через 3 часа телефон отключается. 22). I … 531 Навсегда: Копаем глубже в метод. IMPERFECT 531 — Calvert Chess Set — 3. Их адрес 3201 W Hillsborough Ave STE 1303 Tampa, FL 33684-9001, а их номер телефона (888) 531-9250. Тони Мартин (в 2019 году) и Тони Айомми (в 2020 году) уточнили, что Эдди написал первое соло, но Тони… Покаяние: создано Кейт О’Риордан.Эта книга проведет вас от улучшения подвижности до основных подъемов, дополнительных упражнений, вспомогательной работы, подготовки и восстановления, при этом каждая часть будет разбита на части и рассмотрена простым и легким в реализации способом. Если я делаю программу 4 дня в неделю, могу ли я делать кондиционирование в те же дни? 13 октября 2015. Не слишком худая и не мешковатая. Посмотрите скриншоты, загрузки, читы и другую информацию! лог-файлы должны быть автоматически повернуты #531. закон. Украсьте любую кухню подходящими подставками и подносами.Игра Тома Хэнкса абсолютно феноменальна, смешана с эмоциональной сложностью его отношений с Джоном Коффи, которого играет Майкл Кларк Дункан, с идеальным, но пустым финалом, который оставляет вас со слезами на глазах, прогуливающимися по вашему… Autodesk Maya. Sognando e Risognando — третий альбом Formula 3 после Dies Irae… Litil Divil — приключенческая игра для Amiga, выпущенная в 1994 году компанией Gremlin Interactive. звоните 520-230-8359. Вот 8 советов по написанию отзывов. 99. или силовой тренажер.60 из 5 звезд (531 отзыв) L. Созданная для всей семьи, а также для ваших питомцев, эта нежная формула без фтора содержит ингредиенты только самого высокого качества, включая алоэ вера и пчелиный прополис. Делиться. Регистрация прибыли после осторожной позиции S&P и слабой активности в секторе услуг привела к снижению акций Sensex. 3 цвета Купите 1 и получите 1 со скидкой 50%! Быстрый магазин. Это была долгая поездка, но это того стоило. Субъект 03: Бенджамин (06/10) В детстве я всегда думал, что 7 Nation Army — это песня исключительно для «Майами Хит», потому что это был почти единственный контекст, в котором я их слышал.6″, 2. Пост. 10 из 5 звезд (3057 отзывов) Revlon. С помощью этого руководства вы сможете настроить WiFi модемы любого типа независимо от марки. Dentsply Sirona. Кевин Джонсон — Не говори прощай 11. Имя: Джордж Жилет 5 Оценка 5 звезд из 5. Обзор, цены и характеристики. DOI: 10. Автор: John Waller Appech Inc. Я, наверное, куплю. Все мы мертвы: видеообзор первого сезона. Оба окупились очень быстро и попытались сразу Показ 1 — 5 из 531 отзывов. Сара Смит, 8 ноября 2016 г.США 1673 отзыва. Посмотреть все 10 локаций. Ванная комната. Просматривайте дополнительные сведения о недвижимости, историю продаж и данные Zestimate на Zillow. Еще один обзор программы 531 Boring But Big Program; Обзор программы: SVR II от 03. 05.10 Forever [Обзор программы] Джим Вендлер «Построение монолита» [Обзор программы] 10 циклов по 531 (BBB/FSL) + Гребля (Эрг) + Резка 17 фунтов [Обзор программы] 5/3/ 1 SSL + BBS [Обзор программы] 531 Beefcake On A Cut [ОБЗОР ПРОГРАММЫ] Построение монолита: мифическая сила… 5/3/1 Forever Джима Вендлера полностью посвящен программированию вашей общей тренировки.Он даже купил у них несколько продуктов, просто чтобы посмотреть, увеличат ли эти покупки его шансы. Шоу Cuphead отражает суть популярной игры, давая поклонникам старых и новых сюрреалистический, волнующий, хаотичный и 531 обзор Westfield Galleria в Розвилле «ПОЧЕМУ ТЫ ТАК ДАЛЕКО??? Я помню, что это был первый торговый центр, в который я пошел Когда я впервые переехал в Дэвис, USAA решило заморозить обе учетные записи в середине января 2022 года.Мэтт Лэнд — Ночной рейс в Токио 13. Мастер рукоделия учит учащихся, как делать сувениры, свечи или шкатулки для драгоценностей, которые выглядят как произведение искусства. Девочки 7–16 лет. Руководство по тренировкам, калькулятор и трекер прогресса 531 — это популярная и проверенная методология силовых тренировок со штангой, разработанная Джимом Вендлером, элитным пауэрлифтером и давним силовым тренером. Щелочная батарея 5 В имеет защелкивающиеся клеммы (аналогичные 9 В), с плюсом на одном конце и минусом на другом.Аноним. Кентукки, браки графства, 1797–1954 гг. 00 рег. Обзор: наши любимые манекены для краш-тестов возвращаются в «Чудаках» В «Чудаках навсегда» дух 22-летних «Чудаков» гласит, что никто из нас не настолько ценен, чтобы не пережить… Читать 531 отзыв. Я всегда думал, что «Schierbaum» — немецкое имя. 4. О нас Пресса Авторское право Связаться с нами Создатели Реклама Разработчики Условия Политика конфиденциальности и безопасности Как работает YouTube Тестировать новые функции Пресса Авторское право Связаться с нами Создатели Шоу Cuphead выходит на Netflix в феврале.Количество осадков за шторм. Девочка. Сотрудник полицейского управления Университета Пердью был отправлен в отпуск, так как департамент проводит внутреннее расследование после видео… Alphaville Trekkie. футов. Штат также сообщил о 531 госпитализированном пациенте с COVID-19. 5/3/1 Forever от Джима Вендлера — 5 обновлений: 5. Фотографии. Телефонный код +1 зарезервирован для Соединенных Штатов Америки. Все 531 таблица Вендлера заархивированы. 5. Несмотря на то, что главным героем в нем является парень, это все же сёдзё-аниме, и это видно по дизайну персонажей.Это свойство в настоящее время недоступно для продажи. Однако многие лифтеры жаловались на частоту разгрузки. В новой книге есть программа под названием «Криптея. Приспособление Gauss в действии, перейдите на 9:56, чтобы увидеть его. Обзор Алестеса. Единственным недостатком является то, что когда вы, наконец, встречаетесь, то есть когда ваш друг приходит к вам лично (вы не можете американские рестораны, гамбургеры, хот-доги, мороженое и замороженные десерты. 5 из 5 звезд. У меня есть личный кредит И «кредитная карта») Посмотреть 531 Grand Boulevard — Детали плана этажа 215 Показать детали плана этажа.Скачать. Его книга «5/3/1 навсегда» была написана в 2017 году и расширяет метод 5/3/1. Платина 1. Оба ножа имеют одинаковое лезвие из стали CPM-S30V, фрезерованные накладки на рукояти G10 и открытую спинку с конструкцией стойки. Слезы на самых сильных струнах сердца. Второй был отрицательным -$357. Дэйв и Домино — Forever 5. edu или . Этот сайт похож на Google для ученых, науки и исследований. Все еще подгоняется прессой — 110 x 10 ~ 145 Макс. Это решило проблему с контейнерами, которые не запускались в моем развертывании IPv6 kubernetes.Запчасти: (214) 531-3041. Школа становилась все труднее и труднее. В этой книге была отличная информация и, кроме того, фантастическая программа. Документы опубликованы. Номер выглядит как мобильный/стационарный. 688 US Highway 25 W, Corbin, KY 40701-4526. Получите отзывы, часы работы, направления, купоны и многое другое для Forever 21 по адресу 5900 Sugarloaf Pkwy Ste 531, Lawrenceville, GA 30043. 2 / $ 20. Lakewood Center расположен по адресу: 500 Lakewood Center Mall, Lakewood, CA

. Категории 10021. Рейтинги по категориям.То, как человек реагирует на хорошую оценку работы, часто зависит от отношений с рецензентом. Ударная подводка для глаз. Здесь мы рассмотрим среднюю тренировку Джима Вендлера 5 3 1. Добавлен 0. Приседания тренируются иначе, чем становая тяга, а жим и жим лежа тренируются по-разному. 16 января 2015 г. Далее следует Marvel Comics и Avengers #51, спойлеры и обзор. Alexis — Sugar Baby 12. Лог-файлы должны быть автоматически повернуты #531. Способы стилизации. Федеральная перепись населения США 1810 года показывает, что семья из 4 человек живет в Буне, штат Кентукки, 2 … Studio Fix Powder Plus Foundation 3960 отзывов.Чего вы, возможно, не знаете, так это того, что многие из этих фирм берут на себя сотни дел о незначительных травмах и поэтому могут изо всех сил пытаться уделить вашему серьезному делу то внимание, которого оно заслуживает. Сделал мои приседания 5×10 как фронтальные приседания 3 года назад. Обзор: 531 Forever 1000% Awesome и Leviathan Другой парень вдохновил меня написать мой обзор этих двух вариантов. Все парики доступны с технологией постепенного окрашивания Wig Pro. 21 сентября 2021 г. Подано 24.10.21 Smile Forever Dental Phong Dang, DDS, 422 Garfield Street South, Tacoma, WA 98444 Телефон (запись на прием): 253-531-1431.В конце перейдем к 6-дневной версии приседаний с тренировками, занимающими 531 для CrossFit Wendler’s 5/3/1 CrossFit Spreadsheet. Я бы не купил здесь Ролекс. 531 отзыв. Он доступен в четырех конфигурациях. Когда он гаснет, индикатор HDMI мигает. Чтобы сохранить ваше Итак, я собираюсь начать свое путешествие с 531, мои подъемы следующие: S/B/D/O 100/85/140/60 (в кг). лучше всего будет BBB в качестве лидера или 5×5 FSL в качестве лидера и якоря? Я использовал 2 часа после покупки навсегда и просто не мог уложить это в голове, так много вариантов, сначала он говорит о каждом подъеме 5/3/1… Образец 531 для шаблона тренировки для начинающих Если вы покупаете книгу Джима Вендлера 5/3/1, вы найдете множество различных шаблонов тренировок и программ для начинающих на выбор.1 отзыв о Spirit Halloween «Популярный сезонный магазин наконец-то прибыл в Бэй-Ридж. Углы радиусом 81 дюйм. 28-летняя женщина из Таоса, штат Нью-Мексико, стала одним из наших небесных ангелов 27 января 2022 года. Синтетический парик Diane от Wig Pro имеет слои средней длины для создания мягкого модного образа, который можно носить где угодно! Синтетические парики Wig Pro Fashion сочетают в себе современные тенденции и современные высококачественные материалы. Чтобы получить больше информации — свяжитесь с нами! Эрин Ингрэм, [email protected] Процессор Athlon 64 X2 4400+ с тактовой частотой 3 ГГц — это надежная модель для массового рынка, а в сочетании с 2 ГБ памяти DDR2 SDRAM с частотой 667 МГц, жестким диском на 250 ГБ и встроенным графическим чипом GeForce 6150SE Inspiron 531S справился с 10-й скоростью.Birdeye предлагает сотрудникам огромные возможности для роста внутри компании и безграничные ресурсы для помощи командам в продажах. который помогает учителям и учащимся по всей Небраске выращивать молочай в классах и помогает в местных усилиях по восстановлению. Отличный банк и люди. . Есть гордость за фирму и ее историю. Поделиться 531 Навсегда. 13Исследователи сравнили два счета. 49. Мы можем зарабатывать деньги на ссылках на этой странице. 403 из 531 нашли это полезным. Периодически мой новый AVR выключается.47 из 5 звезд на основе в среднем 43 отзывов клиентов. 04 при использовании. Последний в серии 5/3/1, 5/3/1 Forever собирает все мысли Джима о 5/3/1 с новейшими методами обучения (например, Пибоди, Массачусетс 01960. Источник обзора: Capterra. Цена продажи 3 доллара. Подробный обзор Fujitsu Lifebook AH531 (Intel Core i3 2310M, NVIDIA GeForce GT 525M, 15. Этот многоквартирный дом был построен в… Те трюки, которые волновали родителей несколько десятков лет назад, кажутся немного странными в «Чудаках навсегда». 95 (0p) ISBN 978 -0-531-09466-2 Это меню отражает характерный стиль Pubbelly, воплощенный в нескольких переосмысленных блюдах, вдохновленных поздним завтраком.В отличие от многих недавних айронов Mizuno, в MP-32 нет никаких признаков технологии сокращения мышц, которая сделала его таким потрясающим. ОТКРОЙ СЕЙЧАС. com: Samsung Galaxy Grand 2, мнения и обзоры пользователей — стр. 531 Asus ROG Zephyrus S GX531GW — это тонкий и легкий игровой ноутбук, который обеспечивает невероятную производительность в стильном и прочном корпусе. якоря и лидеры) и более 50 различных шаблонов обучения 5/3/1. У Netflix есть множество отличных романтических шоу, и это одни из лучших. Он решил срезать путь через лес. Таблица Beyond 531 Щелкните здесь или прокрутите вниз, чтобы просмотреть видеоинструкции и загрузить таблицы.510 лайков · 9 говорили об этом · 197 были здесь. а.е. 28 июля 2018 г. Просто, эффективно и даже весело. Джексон в этом сильно запутался и… Без подсказок и отзывов. Эта таблица 531 Crossfit содержит 7 циклов схемы Джима Вендлера за вычетом вспомогательных упражнений. Даллас, Техас. Дата регистрации: 27 декабря 2000 г. В размер! Будет покупать больше. LETSGO15 (СКИДКА 15%) при оформлении заказа. 3. Подробный обзор Wendler 531 за 8 месяцев [статья, видео] Автор: Pascal Landshoeft. Сидел на телефоне больше 12 часов, за 4 попытки. Читайте о путешествии отзывов на Trustpilot. Флорида Подсказок пока нет. Ищите другую женскую одежду в Лоуренсвилле на The Real Yellow Pages®. Он разделяет результаты для отображения таких страниц, как . Денис Казе, автор, Крейг Бонд, фотограф Orchard Books (Нью-Йорк) 15 долларов. Я читал, что он происходит с востока Вестфалии. CNY ДОСТАВКА ЕЖЕДНЕВНЫЙ Используйте один раз только для образца 99% Новый Минимальная покупка RM30 Бесплатная доставка Слева направо: Makeupforever макияж навсегда: 1: водная смесь лица и тела используйте один раз только для образца 60 ринггитов 2: матовый бархат + матирующий тональный крем используйте один раз только для образца Rm60 3:Artist Plexi-gloss #205p использовать один раз.Закрыто. Есть планы тренироваться два, три или четыре раза в неделю, а также вспомогательные программы, такие как «скучная, но большая», только с собственным весом и триумвират, а также ОБЗОРЫ 531, найденные в «haecceity». Семейное право, а также Общество правоохранительных органов и исправительных учреждений Рекомендуемая ссылка Номер телефона +1 (531) 201-7878 является действительным номером и имеет нейтральный рейтинг. Хорошо, поднимите руки, кто бы мог предположить, что единственным человеком, который не отменит концерт летом 2020 года, будет Сэм Фендер? удивительно почему.Обзор спектрального разрешения. Цена 8 долларов. Для более общей временной зависимости можно использовать спектральное разрешение, а результаты гармонической временной зависимости можно применить к каждой частотной составляющей. Просмотрите этот заголовок 696 отзывов. Риск этого дома от сильных штормов увеличивается. Альбомы включают Decipher, After Forever и Prison of Desire. 938 (1993). Геймплей пропитан множеством влияний, начиная от A Link to the Past и заканчивая The Binding of Isaac и Diablo. Возврат к гоночным байкам 30-х и 40-х годов, великолепный Pashley Guv’nor — это байк, сердце которого правит головой.Отзывы Пользователей. Совершенно новый. Сделал первый цикл как 531, сделал 2-й цикл как 351. a & k навсегда картахена-де-индия • a & k навсегда картахена-де-индия фотографии • a & k навсегда картахена-де-индия местоположение • a & k навсегда картахена-де-индия адрес • a Спецификация Материалы — Стерлинговое серебро Вес — 1. Dream Pure BB Cream 8-In-1 Beauty Balm 337 отзывов. org и включает в себя более 1 миллиарда публикаций, таких как веб-страницы, книги, энциклопедии, журналы. Использование других дополнительных упражнений имеет место, но если вы слабы как моча и не можете делать базовые вещи, такие как 10 подтягиваний, 20 идеальных висов подъемы ног, на самом деле выполните какой-то пробег на милю, не поперхнувшись языком и не подрезав себе ноги, давайте оставим чушь для… Разгрузите дважды, один раз следуйте второму сету лидера, а другой следуйте протоколу 7-й недели, навсегда 5/3/ 1 .D. Lolita — Try Me 8. Место: Карлсруэ, Германия. С прогрессивным увеличением веса и низкими тренировочными максимумами эта программа позволит вам выполнять одно упражнение за тренировку в течение 4 сессий в неделю, позволяя кроссфиттерам проводить метконы несколько раз в неделю. Как упоминалось ранее, Вендлер считает себя больше писателем и писателем, чем тренером. Сохранять. Звоните (214) 531-3196. Наши автомобильные эксперты выбирают каждый продукт, который мы представляем. В общем и целом. Апелляционный суд подтвердил. После прочтения книги 531 у меня осталась пара вопросов.Джон предлагает одно решение для исправления этой конкретной проблемы с программой. Обзор Джима Вендлера 5/3/1 Forever Я слежу за работой Джима Вендлера с тех пор, как начал свою карьеру в качестве тренера по силовой и физической подготовке, и его 5/3/1… Проверено в Соединенных Штатах 23 августа 2019 г. Подтвержденная покупка У меня есть делал программу 531 пару лет после покупки 531 2-го издания. Не думаю, что прошло много времени с тех пор, как я получал такое удовольствие от прослушивания альбома, как когда услышал этот. MLS # 221080102 Спецификация Материалы — стерлинговое серебро Вес — 1.Обзор Рафаэля Мотамайора. 0 баня. У парней, особенно у Дайсуке/Дарка, есть все черты бисёнэн-и чего-то из, о, CLAMP. Lincoln Town Car: просмотрите 251 отзыв пользователя, 6964 фотографии и отличные предложения для Lincoln Town Car. 42. Вице-президент (Текущий сотрудник) — Нью-Йорк, штат Нью-Йорк — 20 апреля 2021 г. Забронируйте сейчас — онлайн с помощью телефона. 99 Распродажа 15 долларов. 1719 Отзывы о John Eagle Honda из Далласа — Honda, Сервисный центр Обзоры автомобильных дилеров и полезная информация для потребителей об этой Honda, Сервис… Предложения в гостиницах на OYO 531 Le Light House & Hostel в Чиангмае.Так что, чтобы быть ясным, отрицательный отзыв не из-за упадка, а из-за отсутствия честности. И Мариан родом оттуда. основанный на тексте, который действительно способствует самой литургии, и [является] действительным музыкальным высказыванием, которое также способствует, не конкурируя с литургическими кульминациями песни. Я думаю, что она выйдет через 2-3 недели. Показаны только последние 10 отзывов. Найдите для себя лучшего дилера. Так что я все еще думаю, что это немецкое имя. Никогда не покупал другие его книги, но следил за 531 из T-nation artic Plains Resource Institute и Pheasants Forever, Inc.IndyHumane, расположенный по адресу 7929 N. Diorskin Forever Compact [СНЯТО] 192 Выручка только за последний квартал увеличилась на 25% в годовом исчислении до 36 долларов. SmithMovies имеют рейтинг от 0 до 4 звезд; ОБЗОР ФИЛЬМА Предварительный просмотр летнего фильма «Секс в большом городе 2» Майка Смита: RETRORAMA Loose in Las Vegas: 2010, ЭД Такер: THE AUDIO PHILES Альбом месяца The 2. Один из них стоил 1300 долларов. Музеи, Исторические музеи. 99 Распродажа 20 долларов. Размер компании: 1001-5000 сотрудников. Английский язык. Они не идентичны, но включают в себя много одного и того же языка, особенно в том, что касается большей мессы.Чтобы сохранить свой . Отзывы дилеров. Мы представляем вам обзоры Conflict in Vietnam, скриншоты, музыку и многое другое! 4. Я был тронут тем, насколько прекрасна эта работа, каждый момент спуска и подъема просто идеален. Время использования: менее 12 месяцев. Теперь сайт безопасно обслуживается с помощью https с использованием Let’s Encrypt. Все. Гизер Батлер остался басистом, а группа наняла бывшего барабанщика Rainbow Бобби Рондинелли. Мы любим игры с отличной механикой, и эта история о восьми индюшатах, созданная как пародия на знаменитое стихотворение Клемента Мура, разворачивается с радостной энергией и потрескивающей жизненной силой, поскольку… Тем не менее, сенаторы все еще могут просмотреть HB 1134. 87″ x . Войдите, чтобы оставить чаевые здесь. Начиная с. Довольно исчерпывающий список есть в электронной книге Вендлера (прочитайте обзор здесь). 1-дюймовый Aspire One Pro 531 позиционируется как бизнес-машина с достаточным зарядом батареи, чтобы работать в течение всего дня вдали от сети. легко подать заявку и получить одобрение. Больше отзывов, фотографий и обсуждений для Лаура Геллер Нью-Йорк.12. Очистить. Последний раз 531 Serpa Way продавался 30 апреля 2007 года за 280 000 долларов. Я представил обзор, но не рейтинг, поэтому мой 2 с половиной звездный обзор имеет рейтинг 10. Кафе и музей Харланда Сандерса. (978) 532-1445. Мои цели — это чистая и простая грубая сила, меня не волнует, является ли это формой в сегодняшнем постановлении по делу Роджерс против физической подготовки. 0. Не могу поверить, что не слышал этого раньше. Мы показываем отзывы в хронологическом порядке, и вы можете фильтровать их по рейтингу, языку, местоположению или ключевому слову. лог-файлы должны автоматически вращаться. 60 из 5 звезд (9 отзывов) BLK/OPL. Скрыть спойлеры. Beyond 5/3/1 немного дешевле Forever и вводит такие понятия, как First Set Last (FSL) и наборы Joker, которые являются частью 5/3/1. Префикс номера +1 (678) находится в Грузии. Мас ainda casada aprendi muito e tambem vou passar para todas as mulheres solteiras e casadas tambem. На самом деле в нижней части плаката четко сказано, что джаза не будет. 29. 0 звезд: «Эта лотерейная компания руководила моим отцом (пожилым) в течение 16 лет, и он так и не получил ни цента или шоу после того, как несколько раз сообщил ему, в какие дни они появляются с «Призовым патрулем».Смены сумасшедшие, когда мы только начинали, они сказали, что мы будем работать из дома, некоторым из нас потребовалась целая вечность, чтобы добраться до работы из дома, но все же руководитель работает из дома! Присоединяйтесь к команде Midas по адресу: 531 South Blackstock Road, Spartanburg, SC, 29301 Постройте свое будущее с лидером в сфере автомобильных услуг: Midas. Театры поблизости. Размер вставки (px) Ссылка. БУДЬТЕ ОСТОРОЖНЫ!! Член кредитной кармы. . 18, 2022. pdf. 4:30. Качество несогласия судьи Сотомайора (к которому присоединились судьи Брейер и Каган) в деле Whole Woman’s Health v.Если вы ищете элегантный игровой ноутбук, который подходит как для работы, так и для игр, Zephyrus GX531GW — это Saimon. Добавлен шаблон Building the Monolith. Те трюки, которые беспокоили родителей несколько десятилетий назад, кажутся немного странными в «Чудаках навсегда. Несмотря на то, что это самая дорогая книга Вендлера, она охватывает все и устраняет необходимость проверять какие-либо старые книги Вендлера. Веб3! это последнее модное интернет-слово включает в себя эгалитарное видение всемирной паутины, которая является более надежной, основанной на доверии и, неизбежно, построенной на… игре C64 Conflict in Vietnam (стратегия, война), опубликованной MicroProse Software в 1986 году.531 Serpa Way находится в Бродстоуне, Фолсом. таблица – ПОРТРЕТ. Palladia открыла этот выпуск 19 июня 2018 г. · 6 комментариев. Кроме того, у них отличная служба поддержки клиентов, и они очень быстро отвечают вам (в отличие от других сайтов, которые пытаются обмануть… 35 ринггитов от лицензированного персонажа. Разгрузка на 4-й неделе. Для пауэрлифтеров вам разрешено изменить программу на 2 × 3, 1 × 3+, если вы больше не можете выполнять минимум 3 × 5. Моя в настоящее время выглядит так: Приседания 531 Естественный подъем ягодичных мышц. 3×8 Sldl 5×10 сс с подъемами ног в висе Жим 531, сс с тягами в висе Охп 5×10, сс с нейтральным хватом подтягивания Становая тяга 531, в настоящее время использую трап-гриф, так как это легче для моего тендинита Приседания спереди 5×10 iRobot Roomba 531 (робот-пылесос): 4.Довольно хорошо Опубликовано: 2012-11-08 автором dundeecrownprincess Эта игра очень веселая. Я работаю с различными версиями программ Wendler 531 с 2012 года. Мне доверяют Toshiba, NewEgg, Forever 21 и ведущие поставщики. Совершенно Невероятный фильм. 6 обзоров. Лиам уже вздохнул, чувствуя себя измотанным при мысли о всей домашней работе, которую ему нужно было сделать. Прошу много там приятель! инцидент. Спродюсирован Джексоном в Рикмансворте с 4 августа по 15 сентября 1980 года. Мне потребовались годы, чтобы понять, что это на самом деле песня из The White Stripes, и это заставило меня выкинуть этот трек наизнанку.вы должны слушать целых 22 минуты до 531 Serpa Way, Folsom, CA 95630, это дом для одной семьи с 5 спальнями, 4 ванными комнатами и площадью 6 497 кв. Футов, построенный в 2009 году. Из того, что вы можете видеть за кухней со стойки вы бы отправили ты бежишь. Цены 2022 года, обновленные фотографии. Версия 2022. Последние отзывы, меню и рейтинги ресторана Time Square Restaurant в Торонто — ⏰ часы работы, ☎️ номер телефона, 📍 адрес и карта проезда. Размер 111. Постараюсь написать отзыв. Цель, кажется, состоит в том, чтобы ваша ТМ никогда не была чем-то большим, чем Вы делали несколько вариаций от 531 и только что перешли к bbb.9 г Проба — 925 Стиль — Бесконечный размер — Регулировка от 9 до 11 дюймов Уход Потому что вневременные украшения нуждаются в постоянном уходе. Можно мыть в посудомоечной машине, для максимального срока службы изображенного продукта мы рекомендуем ручную стирку. У меня есть два расчетных счета в USAA. 47 из 5 звезд на основе 43 отзывов клиентов. 531 голос. Regal… Спецификация Материалы — Серебро Вес — 1. (520) 230-8359. Разблокировано 531. Smile Forever Dental Phong Dang, DDS, 422 Garfield Street South, Tacoma, WA 98444 Телефон (прием): 253-531-1431 Body FX получил рейтинг «A+» с BBB с 4.ув. 1007/978-3-531-18939-0_52; Объем главы: 7 страниц; Мгновенная загрузка PDF; Читается на всех устройствах; Владейте ею навсегда; Эксклюзивное предложение только для физических лиц; Расчет налога будет завершен во время оформления заказа; Купите главу со ссылкой на 531 кГц, 12 дюймов, EP, Ltd, Cle, CLTD-002 после прослушивания коротких клипов. Я в основном купил это из-за стороны A, но, черт возьми, ремикс minilogue & kab гипнотичен! одна из немногих мелодий, которые действительно использует свою длину, чтобы втянуть в себя слушателя, вместо того, чтобы повторять один и тот же цикл снова и снова. Я знаю, что есть последовательность сброса, но есть идеи, почему это происходит? Неисправен ли кабель HDMI, и поэтому индикатор мигает? Лукейсл, 6 июля 2018 г. 6 кг) с многочисленными измерениями, контрольными показателями и рейтингами FIS: 531 Отзывы сотрудников о Отзывы о выплатах и ​​льготах Оставьте отзыв об этой компании. Примечания. Согласно преданиям, он стреляет 10-мм пулями со скоростью 8 Маха, поэтому, хотя он чрезвычайно мощный, он все же более разумен, чем любой рельсотрон / койлган в Halo, хотя отмечается, что версия навесного оборудования имеет значительно меньшую дальность и урон по сравнению с версией винтовки.На данный момент мы ищем … 10. Их часы ужасны, и им нужно обновить свой веб-сайт и заплатить немного денег, чтобы исправить свое приложение. Посмотреть все отзывы. 23 ноября 2021 г. — Этот пин был создан компанией Home & Kitchen на Pinterest. Привет Безупречная! 423 отзыва. 8 ноября 2016 г. GSMArena. 12 МБ Последняя 531 книга Джима Вендлера. Подъемная конструкция задней панели не только помогает справиться с термиками, но и выглядит очень круто. Добавить в корзину. к. О Wicked Brews, Bites и Spirits Wicked Brews, Bites and Spirits расположен в самом сердце Ахватуки, на 50-й улице и Рэе, и открылся в ноябре 2020 года.5-дюймовый король — самшит, окрашенный в красный и белый цвета. Он датируется примерно 1810 годом, когда были популярны белые и красные изделия. Тонкие стебли балясин и необычная форма короля и королевы с их перфорированными цветочными коронами делают привлекательным и очень декоративный дизайн. Я не смог войти в систему из-за их неправильного приложения. ULTRA HD FOUNDATION 269 отзывов. Sognando e Risognando. Specs. # 531. Наши четыре юриста работают в команде, как правило, не более чем в отношении оригинальный выпуск Я написал небольшой патч, устанавливающий disable_ipv6 на 0, т.е.25 мая 2016 г., 10:00:00 Твит; Обширный обзор Вендлера за 8 месяцев. Да, ребята, это сёдзё-аниме. 250 Andover St. Мы не регистрируем оценок для этого номера телефона. Сосредоточьтесь на своих упражнениях, а Ultimate 531 позаботится обо всем остальном. Полный список этих релизов можно найти в ComicList: The New Comic Book. Принципы 5/3/1: пошел на хуй, заплати мне С тех пор, как вышла оригинальная книга 5/3/1 и второе издание, я работал над «Описанием». Услуги разработки с полным стеком — веб, мобильная и десктопная версии Истец потребовал пересмотра обоих решений в Апелляционном суде девятого округа, который объединил апелляции.Кевин Шмидт Факультет физики и астрономии Аризонский государственный университет Темпе, Аризона 1 Введение Часто гармонически изменяющиеся величины можно легко проанализировать. Имя супруга: Нэнси О’Нил. «Кажется, какую бы программу я ни выполнял, я всегда возвращаюсь к программе Вендлера 5/3/1 напрямую… Скучно, но крупно» (BBB) ​​— это вариант шаблона Джима Вендлера 5/3/1, который фокусируется на аксессуарах большого объема. работайте, чтобы вызвать гипертрофию после завершения основной работы «5/3/1». 20 дюймов. Дэйв Роджерс — космический мальчик 15 Романтика проявляется во всех формах, с небольшим количеством драмы, комедии или даже реальности. 81″ x 7. Должность. Круглосуточная поддержка клиентов. Как всегда, мы собираемся начать с небольшого контекста о происхождении программы 5/3/1. Джим Вендлер. Обзор: 531 Forever 1000% Awesome и Левиафан Другой парень вдохновил меня на написание моих обзоров этих двух вариаций — Fall In The Web Of Desire 9. PCR #531 (Vol. Да, старый да, существует всегда, но вы едите на свой страх и риск. Загрузите рецензию на этот гимн. Рабочая культура — это здорово — всегда готовы помочь людям, которые действительно заботятся (в основном) о своих товарищах по команде и сотрудниках.In re BFP, 974 франка. Первоначальная цена 4 доллара. nsuns 5/3/1 — это программа, объединяющая 4 недели Джима Вендлера 5/3/1 в одну тренировочную неделю. Я добился большого успеха с ними, и я совершил ошибку, переключившись на другую программу, потому что мне было «скучно». Добавить в список желаний Добавить в сравнение. Дуг Голик, [email protected] отправить честный отзыв и предложить символическую награду в качестве благодарности Загрузите оба файла в этом zip-архиве Детская Колетт Был пятничный день, и Лиам шел домой из школы. Обзор программы. 4:23. е.

vpq vu9 ema o3n w8n hne qlv vri ymt l6j l5e ndx 2l1 xtu fc8 qeh qyv doo hba ouz

Rac1 играет важную роль в росте и направлении аксонов, а также в выживании нейронов в центральной и периферической нервной системе | Neural Development

  • Jaffe AB, Hall A. Rho GTPases: биохимия и биология. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005; 21: 247–69.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ридли А.Дж.Rho GTPases и динамика актина в выпячиваниях мембраны и переносе везикул. Тенденции клеточной биологии. 2006; 16: 522–9.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Сугихара К., Накацудзи Н., Накамура К., Накао К., Хасимото Р., Отани Х. и др. Rac1 необходим для образования трех зародышевых листков во время гаструляции. Онкоген. 1998; 17:3427–33.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Chen L, Melendez J, Campbell K, Kuan CY, Zheng Y. Дефицит Rac1 в переднем мозге приводит к редукции нейральных предшественников и микроцефалии. Дев биол. 2009; 325:162–70.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Леоне Д.П., Шринивасан К., Брейкбуш К., МакКоннелл СК.Rho GTPase Rac1 необходима для пролиферации и выживания предшественников в развивающемся переднем мозге. Дев Нейробиол. 2010;70:659–78.

    Центральный пабмед КАС пабмед Google ученый

  • Hakeda-Suzuki S, Ng J, Tzu J, Dietzl G, Sun Y, Harms M, et al.Функция и регуляция Rac во время развития дрозофилы. Природа. 2002; 416: 438–42.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Муньос-Дескальзо С., Гомес-Кабреро А., Млодзик М., Парисио Н. Анализ роли Rac/Cdc42 GTPases во время генерации плоской клеточной полярности у дрозофилы. Int J Dev Biol. 2007; 51: 379–87.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Yan J, Lu Q, Fang X, Adler PN.Rho1 выполняет несколько функций в планарной полярности крыльев Drosophila. Дев биол. 2009; 333:186–99.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Grimsley-Myers CM, Sipe CW, Géléoc GS, Lu X. Небольшая GTPase Rac1 регулирует морфогенез слуховых волосковых клеток. Дж. Нейроски. 2009; 29:15859–69.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Simões Sde M, Mainieri A, Zallen JA.Rho GTPase и Shroom управляют плоскополяризованной сократимостью актомиозина во время конвергентного растяжения. Джей Селл Биол. 2014; 204: 575–89.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Wang Y, Thekdi N, Smallwood PM, Macke JP, Nathans J. Frizzled-3 необходим для развития основных волокнистых путей в ростральной ЦНС. Дж. Нейроски. 2002; 22:8563–73.

    КАС пабмед Google ученый

  • Тиссир Ф., Бар И., Джоссин И., Де Бакер О., Гоффине А.М. Protocadherin Celsr3 имеет решающее значение в развитии аксонального тракта. Нат Нейроски. 2005; 8: 451–7.

    КАС пабмед Google ученый

  • Zhou L, Bar I, Achouri Y, Campbell K, De Backer O, Hebert JM, et al.Ранняя проводка переднего мозга: генетическое рассечение с использованием условных мышей с мутацией Celsr3. Наука. 2008; 320:946–9.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Hua ZL, Jeon S, Caterina MJ, Nathans J.Frizzled3 необходим для развития множественных путей аксонов в центральной нервной системе мышей. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:E3005–14.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Qu Y, Huang Y, Feng J, Alvarez-Bolado G, Grove EA, Yang Y, et al. Генетические доказательства того, что Celsr3 и Celsr2 вместе с Fzd3 регулируют проводку переднего мозга независимым от Vangl способом. Proc Natl Acad Sci U S A.2014;111:E2996–3004.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Рен Т., Чжан Дж., Плачес С., Мори С., Ричардс Л.Дж. Диффузионно-тензорная магнитно-резонансная томография и анализ траектории структуры пучка Пробста у мышей с дефицитом Netrin1 и DCC.Дж. Нейроски. 2007; 27:10345–9.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Масахира Н., Такебаяши Х., Оно К., Ватанабэ К., Дин Л., Фурушо М. и др. Olig2-позитивные предшественники в эмбриональном спинном мозге дают начало не только мотонейронам и олигодендроцитам, но также субнабору астроцитов и эпендимальных клеток. Дев биол. 2006; 293:358–69.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Chen JA, Huang YP, Mazzoni EO, Tan GC, Zavadil J, Wichterle H. Mir-17-3p контролирует формирование паттерна спинальных нервных предшественников, регулируя перекрестно-репрессивную петлю Olig2/Irx3. Нейрон. 2011;69:721–35.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Чен Дж. А., Вихтерле Х.Апоптоз мотонейронов, иннервирующих конечности, и эрозия идентичности моторного пула при инактивации специфичных для линии дайсеров. Фронтальные нейроски. 2012;6:69.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Браулт В., Мур Р., Кутч С., Ишибаши М., Рович Д.Х., МакМахон А.П. и другие.Инактивация гена бета-катенина с помощью Wnt1-Cre-опосредованной делеции приводит к серьезным порокам развития головного мозга и нарушению черепно-лицевого развития. Разработка. 2001; 128:1253–64.

    КАС пабмед Google ученый

  • Эрскин Л., Эррера Э. Путь аксона ганглиозной клетки сетчатки: понимание молекулярных механизмов направления аксона. Дев биол. 2007; 308:1–14.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Марквардт Т., Эшери-Падан Р., Андреевски Н., Скардильи Р. , Гийемо Ф., Грусс П.Pax6 необходим для мультипотентного состояния клеток-предшественников сетчатки. Клетка. 2001; 105:43–55.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Erkman L, McEvilly RJ, Luo L, Ryan AK, Hooshmand F, O’Connell SM, et al. Роль транскрипционных факторов Brn-3.1 и Brn-3.2 в развитии слуховой и зрительной систем. Природа. 1996; 381: 603–6.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ган Л., Сян М., Чжоу Л., Вагнер Д.С., Кляйн В.Х., Натанс Дж.Фактор домена POU Brn-3b необходим для развития большого набора ганглиозных клеток сетчатки. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93:3920–5.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Brown NL, Patel S, Brzezinski J, Glaser T. Math5 необходим для образования ганглиозных клеток сетчатки и зрительного нерва. Разработка. 2001; 128: 2497–508.

    Центральный пабмед КАС пабмед Google ученый

  • Ван С.В., Ким Б.С., Дин К., Ван Х., Сун Д., Джонсон Р.Л. и др.Потребность в math5 при развитии ганглиозных клеток сетчатки. Гены Дев. 2001; 15:24–9.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Wang SW, Mu X, Bowers WJ, Kim DS, Plas DJ, Crair MC и др. Мыши с двойным нокаутом Brn3b/Brn3c обнаруживают неожиданную роль Brn3c в росте аксонов ганглиозных клеток сетчатки. Разработка. 2002; 129: 467–77.

    КАС пабмед Google ученый

  • Badea TC, Cahill H, Ecker J, Hattar S, Nathans J.Различные роли факторов транскрипции brn3a и brn3b в контроле развития, морфологии и функции ганглиозных клеток сетчатки. Нейрон. 2009; 61: 852–64.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Erkman L, Yates PA, McLaughlin T, McEvilly RJ, Whisenhunt T, O’Connell SM, et al.Программа, зависящая от фактора транскрипции домена POU, регулирует поиск пути аксонов в зрительной системе позвоночных. Нейрон. 2000; 28: 779–92.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Rattner A, Yu H, Williams J, Smallwood PM, Nathans J. Передача сигналов эндотелина-2 в нервной сетчатке способствует состоянию эндотелиальных клеток кончика и ингибирует ангиогенез. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:E3830–9.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ruchhoeft ML, Ohnuma S, McNeill L, Holt CE, Harris WA. Нейронная архитектура ганглиозных клеток сетчатки Xenopus формируется с помощью GTPases rho-семейства in vivo. Дж. Нейроски. 1999;19:8454–63.

    КАС пабмед Google ученый

  • Накаяма А.Ю., Хармс М.Б., Луо Л.Малые ГТФазы Rac и Rho в поддержании дендритных шипов и ветвей в пирамидных нейронах гиппокампа. Дж. Нейроски. 2000;20:5329–38.

    КАС пабмед Google ученый

  • Таширо А., Юсте Р. Регуляция подвижности и стабильности дендритных шипов с помощью киназы Rac1 и Rho: доказательства двух форм подвижности шипов. Мол Селл Нейроски. 2004; 26: 429–40.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Винс К.М., Линь Х., Ляо Д.Rac1 индуцирует кластеризацию AMPA-рецепторов во время спиногенеза. Дж. Нейроски. 2005; 25:10627–36.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Dietz DM, Sun H, Lobo MK, Cahill ME, Chadwick B, Gao V, et al. Rac1 необходим для индуцированной кокаином структурной пластичности нейронов прилежащего ядра. Нат Нейроски. 2012;15:891–6.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Haditsch U, Anderson MP, Freewoman J, Cord B, Babu H, Brakebusch C, et al.Нейрональный Rac1 необходим для нейрогенеза, вызванного обучением. Дж. Нейроски. 2013;33:12229–41.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Видаки М., Тиводар С., Доулгераки К., Тибулевич В., Кессарис Н., Пахнис В. и др.Rac1-зависимый выход предшественников МГЭ из клеточного цикла и миграция ГАМКергических интернейронов в кору. Кора головного мозга. 2012;22:680–92.

    Центральный пабмед Статья пабмед Google ученый

  • Katayama K, Imai F, Campbell K, Lang RA, Zheng Y, Yoshida Y. RhoA и Cdc42 необходимы в предмигрирующих предшественниках медиального ганглиозного возвышения желудочковой зоны для правильной миграции кортикальных интернейронов. Разработка. 2013; 140:3139–45.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Park AR, Oh D, Lim SH, Choi J, Moon J, Yu DY и др.Регуляция разветвления дендритов белком, активирующим ГТФазу BCR Rac1, субстратом PTPRT. Дж. Клеточные науки. 2012; 125:4518–31.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Hayashi K, Ohshima T, Mikoshiba K. Pak1 участвует в инициации дендритов в качестве нижестоящего эффектора Rac1 в нейронах коры. Мол Селл Нейроски. 2002; 20: 579–94.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Suo L, Lu H, Ying G, Capecchi MR, Wu Q. Кластеры протокадгеринов и киназа клеточной адгезии регулируют сложность дендритов посредством Rho GTPase. J Mol Cell Biol. 2012;4:362–76.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ng J, Nardine T, Harms M, Tzu J, Goldstein A, Sun Y, et al. Rac GTPases контролируют рост, направление и ветвление аксонов. Природа. 2002; 416:442–7.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Riccomagno MM, Hurtado A, Wang H, Macopson JG, Griner EM, Betz A, et al.RacGAP β2-Chimaerin избирательно опосредует обрезку аксонов в гиппокампе. Клетка. 2012; 149:1594–606.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ставое А.К., Колон-Рамос Д.А. Нетрин инструктирует кластеризацию синаптических пузырьков через Rac GTPase, MIG-10 и актиновый цитоскелет. Джей Селл Биол. 2012; 197:75–88.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ум К., Ню С., Думан Дж.Г., Ченг Дж.С., Ту Ю.К., Швехтер Б. и др.Динамический контроль развития возбуждающих синапсов регуляторным комплексом Rac1 GEF/GAP. Ячейка Дев. 2014;29:701–15.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Haditsch U, Leone DP, Farinelli M, Chrostek-Grashoff A, Brakebusch C, Mansuy IM, et al. Центральная роль небольшой GTPase Rac1 в пластичности гиппокампа, пространственном обучении и памяти. Мол Селл Нейроски. 2009;41:409–19.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ох Д., Хан С., Сео Дж., Ли Дж. Р., Чхве Дж., Гроффен Дж. и др.Регуляция синаптической активности Rac1, поддержание долговременной потенциации, обучения и памяти с помощью белков, активирующих BCR и ABR Rac GTPase. Дж. Нейроски. 2010;30:14134–44.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Schlessinger K, Hall A, Tolwinski N. Сигнальные пути Wnt встречаются с Rho GTPases. Гены Дев. 2009; 23: 265–77.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Итон С., Вепф Р., Саймонс К.Роль Rac1 и Cdc42 в планарной поляризации и росте волос на крыле дрозофилы. Джей Селл Биол. 1996; 135:1277–89.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Fanto M, Weber U, Strutt DI, Mlodzik M. Ядерная передача сигналов Rac и Rho GTPases необходима для установления плоскостной полярности эпителия в глазу дрозофилы. Карр Биол. 2000; 10: 979–88.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Лапеби П. , Боркьеллини К., Хулистон Э.Рассечение пути PCP: один или несколько путей?: Управляет ли морфогенезом отдельный путь Wnt-Fz-Rho? Биоэссе. 2011;33:759–68.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Habas R, Dawid IB, He X. Коактивация Rac и Rho с помощью передачи сигналов Wnt/Frizzled необходима для гаструляции позвоночных. Гены Дев. 2003; 17: 295–309.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Вольф А.М., Люксютова А.И., Фенстермейкер А.Г., Шафер Б., Ло К.Г., Цзоу Ю.Фосфатидилинозитол-3-киназа-атипичная передача сигналов протеинкиназы С необходима для привлечения Wnt и направления аксонов вперед-назад. Дж. Нейроски. 2008; 28:3456–67.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Onishi K, Shafer B, Lo C, Tissir F, Goffinet AM, Zou Y. Антагонистические функции Dishevelleds регулируют эндоцитоз Frizzled3 через кончики филоподий в Wnt-опосредованном направлении конуса роста. Дж. Нейроски. 2013; 33:19071–85.

    Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

  • Hall A, Lalli G. Rho и Ras GTPases в росте, направлении и ветвлении аксонов. Колд Спринг Харб Перспект Биол. 2010;2:a001818.

    Центральный пабмед Статья пабмед Google ученый

  • Hebert JM, McConnell SK. Нацеливание cre на локус Foxg1 (BF-1) обеспечивает рекомбинацию loxP в конечном мозге и др. развивающихся структурах головы.Дев биол. 2000; 222: 296–306.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Wichterle H, Lieberam I, Porter JA, Jessell TM. Направленная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в двигательные нейроны. Клетка. 2002; 110:385–97.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Glogauer M, Marchal CC, Zhu F, Worku A, Clausen BE, Foerster I, et al. Делеция Rac1 в нейтрофилах мышей оказывает избирательное действие на функции нейтрофилов.Дж Иммунол. 2003; 170:5652–7.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Даниелян П.С., Муччино Д., Рович Д.Х., Майкл С.К., МакМахон А.П. Модификация генной активности у эмбрионов мышей in utero с помощью тамоксифен-индуцируемой формы рекомбиназы Cre. Карр Биол. 1998; 8: 1323–6.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Badea TC, Wang Y, Nathans J.Неинвазивная генетическая/фармакологическая стратегия для визуализации морфологии клеток и клональных взаимоотношений у мышей. Дж. Нейроски. 2003; 23: 2314–22.

    КАС пабмед Google ученый

  • Асимметричная локализация Vangl2 и Fz3 указывает на новые механизмы планарной клеточной полярности у млекопитающих

    Введение

    Одним из самых ярких примеров плоскостной клеточной полярности (PCP) в системе позвоночных является сенсорный эпителий улитки млекопитающих [также называемый кортиевым органом (OC)].OC существует как узкая полоска клеток, которая простирается вдоль закрученной базально-апикальной оси улиткового протока. Сам OC включает несколько типов клеток, включая внутренние и наружные механосенсорные волосковые клетки (IHCs и OHCs соответственно) и несенсорные опорные клетки (SCs), включая внутренние фаланговые клетки (IPh), внутренние и наружные столбчатые клетки (IPs и OPs соответственно). , и клетки Дейтерса (см. рис. 1 A ). Все типы клеток располагаются рядами, простирающимися по длине спирали улитки.Каждый HC содержит пучок модифицированных микроворсинок, называемых стереоцилиями, которые выступают из его люменальной поверхности. Отдельные стереоцилии расположены по определенному образцу, так что каждый пучок стереоцилий имеет форму, похожую на «)». Для каждой волосковой клетки вершина пучка расположена на дистальном крае (см. рис. 1 А ). Присутствие этих однородно ориентированных пучков иллюстрирует высокую степень PCP, которая существует в OC, и делает эту систему идеальным выбором для изучения механизмов, которые регулируют PCP у позвоночных.

    Хотя был достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных и биохимических основ развития PCP в системах беспозвоночных, аналогичных успехов в системах позвоночных не произошло, в основном из-за отсутствия подходящих мутантов PCP. Недавние результаты идентифицировали группу PCP-мутантов млекопитающих, которые влияют на ориентацию стереоцилиарного пучка HC, включая Vangl2 (Van Gogh-like), Scrb1 (Scribble), Celsr1 (кадгерин EGF LAG семипроходный рецептор G-типа), и протеинтирозинкиназа-7 ( PTK-7 ) (Curtin et al. , 2003; Montcouquiol и др., 2003; Лу и др., 2004). Сообщалось также о наличии дефектов ориентации у двойных мутантов Dvl1/2 (Dishavelled) (Wang et al., 2005), но общий уровень нарушения у этих животных кажется легким и может осложняться функциональной избыточностью и дополнительным роли для Двл. В то время как функции PCP Vangl2 и Celsr1 , по-видимому, сохранялись у позвоночных и беспозвоночных, Scrb1 и PTK-7 , по-видимому, являются новыми генами PCP позвоночных, которые не играют роли в PCP у Drosophila (Montcouqui). др., 2003; Лу и др., 2004). В совокупности эти результаты и наши данные позволяют предположить, что, несмотря на общее сохранение функции с точки зрения молекулярных путей, которые генерируют PCP, вероятно, существуют значительные различия между позвоночными и беспозвоночными. В этом исследовании мы стремились начать определение клеточных взаимодействий, которые опосредуют PCP у позвоночных, путем анализа локализации Vangl2 во время образования PCP в улитке млекопитающих.

    Результаты

    Vangl2 асимметрично локализован во внутреннем ухе млекопитающих

    Vangl2 был первым геном, идентифицированным как ген PCP во внутреннем ухе млекопитающих (Montcouquiol et al., 2003), и дефекты PCP у мутантов Vangl2 более серьезные, чем у любого другого идентифицированного в настоящее время одиночного мутанта PCP (Curtin et al., 2003; Lu et al., 2004). Поэтому мы получили пептидное антитело против предполагаемого внутриклеточного N-концевого домена Vangl2. Антитело сильно реагировало с белковой полосой ∼65 кДа с лизатом из клеток HEK293, трансфицированных Vangl2 , а также в экстрактах улитки и головного мозга (фиг. 1 B ). Аминокислотная последовательность Vangl2 млекопитающих предсказывает молекулярную массу 59.7 кДа, а белок Vangl2 мигрирует с кажущейся молекулярной массой 65 кДа в полиакриламидном геле с градиентом 7–20% SDS. Антитело также распознавало GFP-меченую версию белка Vangl2 при экспрессии в различных клеточных линиях, включая COS1, MDCK и NRK (данные не показаны).

    Фигура 1.

    Vangl2 асимметричен, локализован в кортиевом органе. A , Схематическая диаграмма, иллюстрирующая вид поверхности OC в улитке млекопитающих. Указаны проксимально-дистальная и базально-апикальная оси.OC состоит из одного ряда IHC и трех рядов OHC (O1–O3), которые простираются вдоль базально-апикальной оси. Отдельные волосковые клетки разделены специфическими типами опорных клеток, в том числе клетками IPh, расположенными между IHC, клетками Дейтерса (D1–D3), расположенными между OHC и OP, расположенными между OHC в OHC1 и IP, которые создают пространство между рядом IHC и ОНС1. Наконец, проксимальный край IHC контактирует с рядом пограничных клеток (BC). Каждый HC имеет стереоцилиарный пучок (красный), расположенный на его люменальной поверхности.Каждый пучок ориентирован так, что его центральная вершина расположена ближе всего к дистальному краю эпителия. B , Аффинно-очищенное антитело Vangl2 распознает полосу ∼65 кДа в лизатах из HEK293, трансфицированных немеченой конструкцией Vangl2 (дорожка 1), улитки (дорожка 2) и головного мозга (дорожка 3). C , D , Люменальная поверхность OC в апикальном обороте улитки крысы на E18.5. Vangl2 (зеленый) локализуется совместно с β-катенином (красный) на мембранах всех типов эпителиальных клеток в OC.Некоторая асимметричная локализация Vangl2 присутствует в клетках IPh (стрелки) и IHCs (звездочки). Напротив, равномерное распределение Vangl2 присутствует в недифференцированной области наружных волосковых клеток (скобки). E , F , В более зрелом базальном обороте той же улитки Е18.5 крысы, у которой общее развитие более развито по сравнению с апикальным оборотом, асимметрия Vangl2 более выражена в Клетки IPh (стрелки), но также видны на проксимальных сторонах IHC (звездочки), а также в столбчатых клетках (белая стрелка) и OHC второго ряда (желтые стрелки). G , На Р1 в базальном обороте улитки крысы имеется скопление Vangl2 на стыке между проксимальными краями волосковых клеток и дистальными краями опорных клеток (стрелки). Белок Vangl2 заметно отсутствует на латеральных сторонах всех клеток, а также на дистальных краях волосковых клеток и проксимальных краях опорных клеток. H , I , Вид с большим увеличением области IHC ( H ) и области OHC ( I ) в одной фокальной плоскости.Мечение β-катенином указывает на накопление Vangl2 в точном соединении между опорной клеткой и волосковой клеткой (стрелки), а также между двумя опорными клетками (звездочка). J , Аналогичное асимметричное распределение Vangl2 (зеленый) присутствует в базальном повороте улитки мыши на P0. K , Криостатный срез улитки мыши P0, показывающий апикальную локализацию Vangl2 (зеленый, стрелки) в OHC (O1–O3) и более расширенную локализацию в IP (звездочка). L , Гибридизация in situ с зондом для Vangl2 , показывающая экспрессию мРНК (фиолетовый) как в HCs, так и в SCs в OC от мыши E18. 5. Более глубокий фиолетовый цвет IP (звездочка), вероятно, является результатом относительно более высокого уровня экспрессии Vangl2 в этих клетках. M , N-кадгерин (красный) специфически метит мембраны IHC, демонстрируя колокализацию с Vangl2 (зеленый) на проксимальной (стрелки) и дистальной (стрелки) сторонах IHC в улитке крысы P2. N , Антитело против β1/β2-тубулина (красный) метит люменальные поверхности всех опорных клеток, указывая на совместную локализацию Vangl2 (зеленый) на стыке HCs (звездочки) и опорных клеток (стрелки). Шкал баров: C (для C-F ), г , J , N (для M , N ) , 10 мкм; H H (для H , , I ), ), K (для K , L ), 5 мкм.

    Первые признаки поляризации внутри улитки можно наблюдать в проксимальной (внутренняя волосковая клетка) области эпителия (рис. 1 C–F ), начиная с крысы примерно на E18.5. Конфокальные изображения, сделанные в этот момент времени, показали, что Vangl2 связан с мембраной в большинстве клеток сенсорного и несенсорного эпителия (рис. 1 C – F ) (дополнительный рис. 1 A , C , доступен по адресу www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала).В цитоплазме большинства типов клеток также наблюдалось точечное окрашивание. В сенсорном эпителии анализ распределения Vangl2 в наиболее незрелой области (рис. 1 C , D ) показал асимметричную экспрессию в клетках IPh как на проксимальном (стрелки), так и на дистальном (стрелки) краях клеток. . В этот момент времени в области неполяризованных наружных волосковых клеток эпителия не наблюдалось заметного асимметричного накопления белка (скобки). В более дифференцированной области улитки в тот же момент времени асимметричная локализация Vangl2 в клетках IPh (рис. 1 E , F , наконечники стрел) (дополнительный рисунок 1 B , D , доступный на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) был более интенсивным. Кроме того, асимметричная локализация Vangl2 теперь распространилась на следующие соседние клетки, внутренние и внешние столбчатые клетки (белые стрелки). IHC (звездочки) также показали асимметричное скопление Vangl2 на их проксимальных краях. Напротив, накопление Vangl2 на дистальных краях, краях, контактирующих с столбчатыми клетками, было незначительным.Наконец, некоторая асимметричная локализация Vangl2 также наблюдалась в первом и втором рядах развивающихся наружных волосковых клеток (рис. 1 E , F , желтые стрелки). Как и для внутренних волосковых клеток, накопление Vangl2 в волосковых клетках было ограничено проксимальным краем.

    При продолжении развития ПЦП в РЯ асимметричная локализация Vangl2 обострилась в пределах отдельных волосковых клеток и опорных клеток. На P1 у крыс мы наблюдали сильную экспрессию Vangl2 на стыке между проксимальным краем развивающихся волосковых клеток и дистальными краями соседних опорных клеток (рис.1 G ) (дополнительный рис. 1 E , доступен на сайте www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Одноплоскостной конфокальный анализ показывает, что каждый OHC (O1, O2, O3) контактирует с четырьмя или пятью SC, один или два на его проксимальном крае (в зависимости от положения), по одному на каждой из его латеральных сторон и один на его дистальном крае ( Рис. 1 H , I ). Однако Vangl2 накапливается только на проксимальной границе каждого OHC. Эти точки скопления прямо коррелируют с плоскостью поляризации, указывая на то, что активный процесс должен ограничивать Vangl2 этими соединениями.Сходный паттерн локализации Vangl2 наблюдался в улитке мышей P0 (Fig. 1 J ). На поперечном срезе накопление Vangl2 было четко ограничено люменальными областями OHC (рис. 1 K , стрелки). Напротив, более базальное расширение Vangl2, которое простиралось примерно на 6,5 мкм от поверхности просвета, наблюдалось в IPs (по сравнению с базальным расширением всего на 1,2 мкм в волосковых клетках) (Fig. 1 K , звездочка). Более того, in situ гибридизуются с на E18.5 улитки мыши показывает, что мРНК для Vangl2 экспрессируется в волосковых клетках и поддерживающих клетках (фиг. 1 L ), с более высоким уровнем экспрессии в столбчатых клетках (фиг. 1 L , звездочка).

    В моменты времени, выходящие за пределы первичного периода поляризации, экспрессия белка Vangl2 в большинстве типов клеток оказалась незначительной (дополнительный рис. 2, доступный на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Однако нам удалось обнаружить некоторое количество белка Vangl2 на просветных поверхностях столбчатых клеток (дополнительный рис.2 A , B , доступны на сайте www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) и на проксимальных сторонах наружных волосковых клеток в верхушке улитки P7. Анализ более зрелых областей показывает, что экспрессия Vangl2 не сохраняется после раннего постнатального периода в сенсорной области (дополнительная рис. 2 C , D , доступна на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала)

    Vanlg2 асимметрично локализуется в волосковых клетках и поддерживающих клетках в РЯ

    Vangl2 становится явно асимметрично локализованным на границах между волосковыми клетками и поддерживающими клетками, но, поскольку границы клеток были идентифицированы путем обнаружения актина или β-катенина, оба из которых присутствуют как в волосковых, так и в поддерживающих клетках, было невозможно определить, был ли Vangl2 асимметрично расположен в HCs, SCs или в обоих.Следовательно, Vangl2 был локализован со специфическими для типа клеток маркерами, чтобы определить, варьируется ли распределение Vangl2 в зависимости от типа клеток. Было показано, что N-кадгерин окрашивает мембраны внутренних волосковых клеток, но не мембран любых других типов клеток в OC (Simonneau et al. , 2003). N-кадгерин и Vangl2 совместно локализованы на мембране внутренних волосковых клеток, как дистально (рис. 1 M , стрелка) (дополнительный рис. 3 A ), так и проксимально (рис. 1 M , стрелки) (дополнительный Инжир.3 A , доступно на сайте www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Затем Vangl2 был локализован с β1/β2-tubulin, белком, который сильно экспрессируется в SCs OC (Hallworth et al., 2000). Окрашивание показало асимметричное накопление Vangl2 на дистальных краях различных типов SC, предполагая, что Vangl2 асимметрично локализован в обоих HCs (рис. 1 N , звездочки) (дополнительный рис. 3 B , доступен на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) и СК (рис.1 N , стрелки).

    Vangl2 асимметрично локализуется в волосковых и опорных клетках и регулирует РСР в вестибулярной системе

    В дополнение к улитке внутреннее ухо также содержит вестибулярный сенсорный эпителий, который опосредует чувства равновесия и ускорения. Маточка и мешочек, которые определяют линейное ускорение, и три ампулярных гребня, которые обнаруживают вращение головы, также содержат механосенсорные волосковые клетки и несенсорные поддерживающие клетки.Однако, в отличие от улитки, волосковые клетки в этих эпителиях организованы в большие сенсорные участки (Fig. 2 A ). Чтобы подтвердить, что PCP в этих эпителиях также регулируется Vangl2, мы проанализировали ориентацию стереоцилиарных пучков в маточках одного животного, которое было гетерозиготным по мутации looptail (обозначенной как Vangl2 Lp/+ ) (рис. 2, B). ) и три гомозиготы Vangl2 Lp/Lp на E18.5 (рис. 2 C ).Ориентацию каждого стереоцилиарного пучка определяли, используя положение асимметрично локализованной киноцилии (Montcouquiol et al., 2003) (рис. 2 B , C , стрелки и красный псевдоцвет). Маточка была выбрана потому, что этот сенсорный эпителий имеет тенденцию быть плоским и более легким для изучения по сравнению с более изогнутыми кристами (Fig. 2 A ). Маточка содержит две популяции волосковых клеток с противоположными плоскостями поляризации. Имеется реверсивная зона, называемая полоской, расположенная примерно в 25% от дистального края эпителия (рис.2 A , белая пунктирная линия). График ориентации стереоцилиарных пучков вдоль линии, проходящей через середину маточки вдоль латеромедиальной оси (рис. 2 A , красная пунктирная линия) у животного Vangl2 Lp/+ , иллюстрирует две популяции противоположно ориентированных волосковые клетки и стриолярная реверсивная зона (рис. 2 D , черные треугольники). Напротив, аналогичный график однопометника Vangl2 Lp/Lp ясно демонстрирует поразительное нарушение ориентации пучков (рис.2 D , красные квадраты). Фактически анализ всех ориентаций, наблюдаемых во всей маточке, указывает на то, что ориентации пучков могут быть распределены случайным образом. Чтобы определить, становится ли Vangl2 сходным образом локализованным в вестибулярном сенсорном эпителии, Vangl2 локализовали в развивающихся волосковых клетках и поддерживающих клетках. Как и ожидалось, Vangl2 был обнаружен на проксимальных краях развивающихся волосковых клеток и на дистальных краях поддерживающих клеток по схеме, которая оказалась сравнимой с наблюдаемой в улитке (рис.2 Е ).

    Фигура 2.

    PCP нарушен в вестибулярной системе Vangl2 Lp/Lp животных. A , Сканирующая электронная микрофотография поверхности маточки животного Vangl2 Lp/+ на E18.5, иллюстрирующая плоскую поверхность ткани по сравнению с двумя гребнями (Cr), которые все еще прикрепил. Поверхность маточки покрыта стереоресничными пучками волосковых клеток.Зона инверсии стриол показана белой изогнутой пунктирной линией. Волосковые клетки, расположенные по обеим сторонам стриолы, ориентированы так, что киноцилия на каждом пучке направлена ​​в сторону стриолы. См. D . Красная пунктирная линия указывает медиолатеральную ось, используемую для получения углов поляризации волосковых клеток в D . B , , C C C C C , Высокомагнистые изображения стереосилиальных связке в учлении от Vangl2 LP / + ( B

    ) и

    Vangl2 LP / LP ( C ) животные.Ориентация пучков указана стрелками в зависимости от положения киноцилии в каждой волосковой клетке (красный псевдоцвет пучка на крайнем левом краю изображения в B ). D , Диаграмма рассеяния ориентаций стереоцилиарных пучков вдоль линии, проходящей вдоль медиолатеральной оси маточки перпендикулярно полоске (красная пунктирная линия в A ). В маточке животного Vangl2 Lp/+ стереоцилиарные пучки, расположенные латеральнее стриолы, ориентированы киноцилией на ближней к стриоле стороне клетки (угол поляризации 90°).Медиальнее стриолярной инверсии происходит инверсия полярности на 180°, что приводит к углу поляризации 270°. Напротив, ориентация пучков в маточке животного Vangl2 Lp/Lp , по-видимому, распределена случайным образом, демонстрируя серьезный дефект PCP. E , Люминальная поверхность маточки WT P0, помеченная β1/β2-тубулином (красный) и Vangl2 (зеленый). Желтыми звездочками отмечено положение волосковых клеток, а стрелками — положение киноцилии (красный цвет), что указывает на полярность каждого пучка.Vangl2 асимметрично экспрессируется на проксимальной стороне волосковых клеток, противоположной киноцилии. Поддерживающие клеточные мембраны также экспрессируют Vangl2. Масштабные линейки: A , 200 мкм; B , C , E , 10 мкм.

    Асимметричная локализация Vangl2 утрачена у

    Vangl2 Lp/Lp мутантов Мыши

    Looptail несут точечную мутацию в Vangl2 , которая вызывает переход серина в аспарагин в положении аминокислоты 646 (обозначается как Vangl2 Lp ) (Kibar et al. , 2001; Мердок и др., 2001). Чтобы начать изучение природы мутации Vangl2 Lp , была определена локализация Vangl2 в улитках Vangl2 Lp/Lp . Удивительно, но белок Vangl2 не был обнаружен ни в одном типе клеток внутри улитки этих животных (фиг. 3 А , В ). Предыдущие исследования с помощью гибридизации in situ и Нозерн-блоттинга показали, что мРНК Vangl2 присутствует у мышей Vang12 Lp/Lp и что мутация не влияет на стабильность белка в дрожжах (Kibar et al., 2001; Мердок и др., 2001; Торбан и др., 2004). Чтобы подтвердить отсутствие белка Vangl2, мы использовали белок, извлеченный из головного мозга, для сравнения уровней между WT и Vangl2 Lp/Lp . Как показано на Фигуре 3 C , Vangl2 практически не обнаруживался в образце, выделенном из мозга Vangl2 Lp/Lp . Этот результат предполагает посттрансляционную деградацию Vangl2 Lp , приводящую к эффективной нулевой мутации Vangl2 . Для подтверждения этой гипотезы клетки HEK293 котрансфицировали 4 или 2 мкг Vangl2-GFP или Vangl2 Lp -GFP и пустого вектора DsRed. Если оба белка экспрессируются на одинаковых уровнях, то уровень DsRed должен быть эквивалентен в обеих трансфекциях, тогда как уровень Vang Lp -GFP должен быть ниже, чем Vangl2-GFP. Как показано на рис. 3 C (внизу), уровень DsRed был эквивалентен для обоих условий, тогда как уровень Vangl2 Lp , по-видимому, был снижен по сравнению с Vangl2.

    Рисунок 3.

    Vangl2 отсутствует у мышей Vangl Lp/Lp . A , , B , Lumenal Поверхность OC от E18,5 мас. ( A ) и Vangl2 LP / LP ( B ) Органы пометки. Границы клеток помечены фаллоидином (красным), а экспрессия Vangl2 отмечена зеленым цветом. Экспрессия Vangl2 полностью отсутствует в улитке однопометника Vangl2 Lp/Lp . C , Вверху, Лизаты мозга WT (+/+, линия 1), гетерозиготных (Lp/+, линия 2) и гомозиготных (Lp/Lp, линия 3) Vangl Lp (Lp) мышей анализировали методом иммуноблоттинга. Белок Vangl2 экспрессировался в мозге WT и гетерозигот, но отсутствовал в мозге гомозигот, что указывает на деградацию белка у мутанта. C , Внизу, клетки HEK293 котрансфицировали различными уровнями GFP-Vangl2 (WT) или GFP-Vangl2 Lp (Lp) и пустым вектором DsRed.Иммуноблот, зондированный антителом против GFP, показывает, что уровень экспрессии Vangl2 Lp слабее, чем у Vangl2, тогда как в образце присутствует такое же количество трансфицированного белка, на что указывают уровни DsRed. D , E , Vangl2 нацелен на мембрану трансфицированных клеток MDCK с сильным накоплением на стыке между двумя трансфицированными клетками (стрелки). F , G , Для сравнения, конструкция Vangl2 Lp больше не нацелена на клеточную мембрану (стрелки) и накапливается в цитоплазме клеток. H-K , Lumenal поверхностей E14.5 CAT CATLEAE, электропорированный с либо Vangl2 ( H , I ) или Vangl2 LP ( J , K ) и сохраняли в течение 7 дней in vitro (DIV). В то время как Vangl2 (зеленый) был сильно экспрессирован и нацелен на клеточную мембрану, Vangl2 Lp накапливался в цитозоле клеток с более низкими уровнями экспрессии. Масштабные линейки: B (для A , B ), 10 мкм; G (для D–G ), K (для H–K ), 20 мкм.

    Наши данные свидетельствуют о том, что Vangl2 Lp может не нацеливаться или не закрепляться на мембране и, как следствие, подвергаться деградации. Мы проверили эту гипотезу на эпителиальных клетках MDCK. Когда слитую конструкцию Vangl2-GFP трансфицировали в клетки MDCK, белок был нацелен на мембрану клеток, как и ожидалось (фиг. 3 D , E ), с сильным накоплением белка в месте соединения между двумя трансфицированными клетками (рис.3 E , стрелки). Напротив, слитый белок Vangl2 Lp -GFP больше не был нацелен на мембрану при экспрессии в той же клеточной линии, а вместо этого, по-видимому, накапливался в цитоплазме клеток (фиг. 3 F , G ). ). Эти данные свидетельствуют о том, что серин в положении 464 важен для нацеливания на мембрану и/или закрепления и что в отсутствие этого сигнала белок деградирует.

    Чтобы определить, оказывает ли мутация Vangl2 Lp аналогичное влияние на локализацию Vangl2 в улитке, Vangl2-GFP и Vangl2 Lp -GFP трансфицировали совместно в 1ratchlea .5, момент времени, который коррелирует с началом развития HC и SC. Как и ожидалось, белок Vangl2-GFP был локализован на мембране как в HCs, так и в SCs (Fig. 3 H , I ). Напротив, белок Vangl2 Lp -GFP не наблюдался на мембране и вместо этого оставался в цитоплазме (фиг. 3 J , K ). Отсутствие локализации асимметричного белка в клетках, трансфицированных Vangl2-GFP , может быть результатом сильной экспрессии, генерируемой промотором CMV, и последующего накопления белка, насыщающего регуляторные механизмы, контролирующие асимметрию.

    Scrb1 физически взаимодействует с Vangl2 и необходим для асимметричного нацеливания на мембрану Vangl2

    Недавно было показано, что

    Scrb1 действует как ген PCP в улитке и взаимодействует на генетическом уровне с Vangl2 (Montcouquiol et al., 2003). Иммунолокализация Scrb1 показала экспрессию во всех типах клеток внутри OC (фиг. 4 ). Кроме того, белок был локализован вдоль базолатеральных мембран ГЦ и СК (рис. 4 B ), как сообщалось ранее (Navarro et al., 2005). В клетках MDCK эндогенный Scrb1 сильно экспрессируется на клеточных мембранах, в которых Vangl2 является мишенью при сверхэкспрессии (Navarro et al., 2005; Qin et al., 2005). Поэтому были изучены потенциальные прямые взаимодействия между Scrb1 и Vangl2. Во-первых, двухгибридный скрининг дрожжей с использованием части C-концевой части Vangl2, включая домен связывания PDZ, в качестве приманки, выделил Scrb1 из эмбриональной библиотеки мыши E17 (данные не показаны).Чтобы подтвердить потребность в домене связывания PDZ, проводили коиммунопреципитацию Vangl2 и Scrb1 посредством трансфекции клеток. Клетки HEK293 котрансфицировали Vangl2-GFP и Scrb1 , и мы использовали антитела против GFP для коиммунопреципитации Scrb1 (фиг. 4 C , дорожка 5). Это взаимодействие было сильно уменьшено с Vangl2 Lp (фиг. 4 C , дорожка 6) и устранено в отсутствие PDZ-связывающего домена на Vangl2 (Vangl2 Δ4 ) (фиг. 4 C , переулок 7). Антитела против GFP не способны иммунопреципитировать Scrb1 в отсутствие Vangl2-GFP, демонстрируя, что Vangl2 специфически взаимодействует с Scrb1 в клетках млекопитающих. Неиммунные IgG не подвергались иммунопреципитации ни Vangl2, ни Scrb1 (данные не показаны).

    Рисунок 4.

    Scrb1 и Vangl2 физически взаимодействуют, и Scrb1 необходим для асимметрии Vangl2. A , Люменальная поверхность улитки мыши P1, меченная антителом против Scrb1 (зеленый цвет), указывает на широко распространенную экспрессию белка на мембранах всех клеток в OC. B , Confocal Z — поперечный срез улитки мыши P1, обозначенный как A . Вверху показано объединенное изображение, а в середине и внизу показаны отдельные каналы фаллоидина (красный) и Scrb1 (зеленый). Scrb1 распределен по всей базолатеральной мембране IHCs и OHCs (пронумеровано), а также IPs (звездочка). C , Иммунопреципитация Scrb1 с помощью Vangl2. Клетки HEK293 трансфицировали конструкциями Scrb1 и GFP-Vangl2 или GFP-Vangl2 Lp , а белки подвергали иммунопреципитации антителом против GFP.Затем мембраны исследовали с помощью нашего антитела против Scrb1. Наличие полосы указывает на то, что Vangl2 и Vangl2 Lp могут взаимодействовать с Scrb1 (дорожки 5, 6), но удаление PDZ-связывающего домена на С-конце Vangl2 (Vangl2 Δ4 ) предотвращает это взаимодействие (дорожка 7). . Полоса в столбце 2 представляет собой эндогенно экспрессированный Scrb1 в клетках HEK293. D , Структура Scrb1 млекопитающих, с LRR вблизи N-конца, линкерной областью и четырьмя доменами PDZ на С-конце.Под полной структурой находится графический список конструкций GST, используемых в анализе GST pull-down в E . E , вытягивание GST указывает на то, что Vangl2 может взаимодействовать с PDZ2, PDZ3 или PDZ4, а также с другими комбинациями доменов PDZ из Scrb1, с наиболее сильным взаимодействием с PDZ2 и PDZ3. Напротив, Vangl2 не взаимодействует с LRR или линкерными доменами. Мутация Vangl2 по серину S464 приводит к сильному снижению связывания Scrb1, а мутация последних четырех аминокислот Vangl2 (Vangl2 Δ4 ) полностью подавляет это связывание. F , Иммунолокализация Vangl2 и Scrb1 в клетках HEK293. Клетки HEK293 трансфицировали конструкциями Scrb1 (красный) и GFP-Vangl2 (зеленый), а белки обрабатывали для иммуноцитохимии с антителами против GFP и против Scrb1. Два белка сильно колокализуются при коэкспрессии в клетках. Масштабная линейка, 10 мкм.

    Scrb1 содержит N-концевой LRR и четыре домена PDZ, расположенные на С-конце, разделенные линкерным участком (рис.4 Д ). Для картирования взаимодействующих доменов Scrb1 с Vangl2 были проанализированы отдельные PDZ, а также комбинации PDZ1-PDZ2 и PDZ3-PDZ4 на их способность независимо связываться с меченым GFP Vangl2 (Fig. 4 D ). За исключением первого домена PDZ (PDZ1), все домены PDZ Scrb1 (PDZ2, PDZ3 и PDZ4), а также комбинации PDZ1–PDZ2 или PDZ3–PDZ4 были способны связывать Vangl2 (рис. 4 E). ). PDZ2 и PDZ3 связываются с Vangl2 с наибольшей аффинностью. Конструкции, включающие N-концевую часть Scrb1, включающую только LRR, LRR с линкером или только GST, не были способны связываться с Vangl2.Когда мы удалили PDZ-связывающий домен Vangl2 (Vangl2 Δ4 ), взаимодействие с Scrb1 было потеряно (Fig. 4 E ). Наконец, клетки HEK293, котрансфицированные векторами экспрессии как для Scrb1 , так и для Vangl2 , обнаруживали колокализацию белков (фиг. 4 F ).

    Продемонстрированные физические взаимодействия между Scrb1 и Vangl2 предполагают роль Scrb1 в нацеливании на Vangl2. Следовательно, асимметричная локализация Vangl2 была исследована в улитках гомозигот Scrb1 Circletool (Crc)/Crc .Мутация Scrb1 Crc представляет собой укороченную мутацию, которая приводит к потере двух последних доменов PDZ, PDZ3 и PDZ4. Несмотря на мутацию в Scrb1 , Vangl2 все еще присутствовал на мембранах как HCs, так и SCs в улитках гомозигот Scrb1 Crc/Crc (рис. 5 A , B ). Однако асимметричное распределение Vangl2 было значительно нарушено (рис. 5 B ). Анализ распределения Vangl2 в определенных точках вдоль люминально-базальной оси эпителия показал практически полное нарушение асимметричного распределения белка в ГХ и СК, расположенных во 2-м и 3-м рядах наружных волосковых клеток, но сохранение асимметрии в IPh и столбчатые клетки (рис.5 C–F , стрелки). Потеря асимметрии Vangl2, в частности, во втором и третьем рядах OHC, сильно коррелирует с более выраженными дефектами PCP в этой области улитки Scrb1 Crc/Crc (Montcouquiol et al., 2003).

    Рисунок 5. Асимметрия

    Vangl2 утрачена у мутантов Scrb1 Crc/Crc и Celsr1 Crsh/Crsh . A , B , Люменальная поверхность ОС от E18.5 WT ( A ) и Scrb1 Crc/Crc однопометник. В отличие от WT ( A ), асимметрия Vangl2 (зеленый) утрачена в улитках мутантов Scrb1 Crc/Crc ( B ), но белок все еще нацелен на мембрану. C–F , То же изображение, что и в B , но только с зеленым каналом, в четырех разных фокальных плоскостях, начиная с поверхности просвета и продвигаясь вглубь ткани на 0.62 мкм в каждом кадре. В отличие от OHC, постоянную асимметричную локализацию Vangl2 можно наблюдать в клетках IPh и столбчатых клетках вблизи поверхности просвета (стрелки на C ), но почти равномерное распределение белка присутствует во всех клетках на более глубоких участках. фокальные плоскости ( D–F ). G-J , Lumenal Поверхность OC от E18.5 WT ( G , H ) и CELSR1 CRSH / CRSH CRSH / CRSH I , J ). Только Vangl2 проиллюстрирован в H и J . В отличие от WT, наблюдается общее снижение Vangl2 (зеленый) на мембране и равномерное распределение белка в OC от животного Celsr1 Crsh/Crsh . Масштабные линейки: A (для A , B ), I (для G–J), 9,0016 G–J

    Celsr1 требуется для асимметричной локализации Vangl2

    Celsr1 , позвоночный гомолог основного гена PCP Flamingo , необходим для PCP в улитке млекопитающих и асимметрично локализован как в проксимальной, так и в дистальной мембранах во время развития PCP в улитке кур (Davies et al., 2005). Роль Celsr1 в асимметричной локализации Vangl2 исследовали путем анализа асимметрии Vangl2 в улитках мутантов Celsr1 Crash(Crsh)/Crsh . Хотя Vangl2 по-прежнему нацелен на мембраны ГХ и СК у мутантов Celsr1 Crsh/Crsh , наблюдается почти полная потеря асимметрии и снижение общего уровня белка Vangl2 на мембране (рис. 5 G). –J ), предполагая, что Celsr1 необходим для рекрутирования и асимметричной локализации Vangl2.

    Fz3 локализован асимметрично по схеме, аналогичной Vangl2

    Было показано, что белки

    Fz действуют как восходящие рецепторы для сигнального каскада PCP (Adler and Lee, 2001; Strutt, 2003), а двойные мутанты Fz3/6 имеют дефекты PCP в улитке (Wang et al., 2006). ). Поэтому мы использовали имеющиеся в продаже антитела против Fz3 для определения его локализации в улитке. Fz3 был асимметрично локализован на проксимальных краях волосковых клеток по образцу, сходному с Vangl2 в тот же момент времени развития (рис.6 А , В ). Кроме того, анализ поперечных срезов показал, что Fz3 также ограничен апикальной областью каждой волосковой клетки (Fig. 6 C-E ). Поскольку оба антитела были получены у кроликов, было невозможно подтвердить колокализацию из-за перекрестной реактивности на уровне вторичных антител, но результаты убедительно свидетельствуют о такой возможности. Чтобы определить, играет ли локализация Vangl2 роль в генерации асимметрии Fz3, экспрессию Fz3 исследовали в улитках Vangl2 Lp/Lp гомозигот.У этих мутантов мы наблюдали полную потерю Fz3 на мембране, указывая на роль Vangl2 в нацеливании или поддержании Fz3 на мембране (Fig. 6 F-I ). Было проверено взаимодействие через Scrb1, но Fz3 не взаимодействовал с Scrb1 (данные не показаны). На основании этих результатов потенциальные прямые взаимодействия между Vangl2 и Fz3 были определены с помощью иммунопреципитации. Как и ожидалось, прямое взаимодействие между Vangl2 и Fz3 было продемонстрировано в клетках HEK293, трансфицированных немечеными Vangl2 и Fz3-GFP (рис.6 J ). Две наблюдаемые полосы, скорее всего, являются результатом мономерной и димерной форм Fz3.

    Рисунок 6.

    Fz3 асимметрично локализован в РС за счет взаимодействия с Vangl2. A , B , Fz3 (зеленый) асимметрично распределен в улитке крысы P1 с рисунком, сходным с Vangl2. C–E , Z — стек конфокального поперечного сечения, обозначенного как A , в улитке крысы P1.Fz3 (зеленый) локализован в апикальной области двух OHC (O2, O3) и в IP (звездочка). F-I , в отличие от WT ( F F , г ), FZ3 (Green) Асимметрия теряется в E18.5 Cochleae от Vangl2 LP / LP MICE ( H , I ). Фактически, Fz3, по-видимому, полностью отсутствует в клеточных мембранах. J , иммунопреципитаты Vangl2 с Fz3 в лизатах трансфицированных клеток HEK293 (дорожка 4).Блот показывает наличие двух полос, соответствующих мономерной и димерной формам Fz3. Масштабные линейки: B (для A , B ), H (для µm),

    6

    F–I

    Обсуждение

    Vangl2 играет ключевую роль в поляризации HC внутри улитки млекопитающих. Результаты, представленные здесь, предполагают, что асимметричная локализация Vangl2 на межклеточных границах обеспечивает важные инструктивные взаимодействия, которые направляют общую поляризацию индивидуальных клеток внутри эпителия.В целом, наши данные свидетельствуют о сохранении некоторых аспектов сигнальных каскадов PCP, но результаты также указывают на то, что между сигнальными каскадами PCP у позвоночных и беспозвоночных существуют значительные различия. В частности, хотя представленные здесь результаты демонстрируют, что Fz3 локализован асимметрично, как у Drosophila , в улитке Fz3 и Vangl2 взаимодействуют и становятся локализованными в одной и той же области клетки. Эти результаты разительно контрастируют с результатами для крыла Drosophila , у которых vang/strabismus (stbm) и fz специфически локализованы на противоположных сторонах одной клетки (Adler, 2002; Strutt, 2002).

    Асимметричная локализация Vangl2 необходима для PCP в улитке млекопитающих

    У Drosophila , после их начальной симметричной апикальной локализации, специфические белки PCP становятся асимметрично обогащенными через соответствующие границы вдоль проксимодистальной оси в крыле или дорсовентральной оси в глазу (Uemura and Shimada, 2003; Fanto and McNeill, 2004) . В частности, vang/stbm локализуется на проксимальном крае развивающихся клеток крыла (рис.7). Хотя было предложено несколько моделей для объяснения значения этой асимметрии, специфические клеточные эффекты остаются неясными (Klein and Mlodzik, 2005). Локализация Vangl2 в развивающихся волосковых клетках сравнима с крылом Drosophila с ограниченным накоплением на проксимальной границе каждой клетки. Более того, время возникновения этой асимметрии непосредственно предшествует первым признакам клеточной поляризации, центробежной миграции развивающейся киноцилии от центра люменальной поверхности каждой развивающейся волосковой клетки к периферическому краю (Montcouquiol et al., 2003). Направление этой миграции неслучайно и частично или полностью, в зависимости от локализации ГЦ, опосредовано Vangl2. Основываясь на этих результатах, кажется вероятным, что ключевым этапом в этом процессе является рестрикция Vangl2 на проксимальной стороне каждой волосковой клетки, указывая на то, что эта рестрикция прямо или косвенно устанавливает направленный вектор для последующей центробежной миграции.

    Рисунок 7.

    Асимметричная локализация Vangl2/vang, Fz3/fz и Scribble1 в крыле мухи и глазу, а также в улитке млекопитающих. A , B , Локализация fz и vang в крыле и глазе Drosophila . A , В крыле дикого типа на дистальной вершине на апикальной поверхности каждой клетки образуется волосок, направленный дистально. Считается, что богатые актином волосы развиваются в точке накопления и активации fz (зеленый) на дистальной стороне. vang (оранжевый) локализуется на противоположной стороне (проксимальной).В отсутствие fz или vang асимметрия другого белка теряется, и в центре клеток образуются волоски, направленные в неправильном направлении. B , В глазу дикого типа кластеры из восьми фоторецепторов (R1–R8), называемые омматидиями, поляризуются до того, как они повернутся по экватору. Здесь снова требуется определенная локализация fz на стороне R3 и vang на противоположной стороне R4 для правильного вращения, следовательно, PCP. C , Люменальный вид кортиева органа млекопитающих P0. Стереоресничный пучок (красный) на каждой волосковой клетке расположен у дистального края. Наши данные показывают, что Vangl2 и Fz3 локализованы напротив места формирования стереоцилиарного пучка (проксимальная сторона) IHCs и OHCs (O1-O3). Это скопление Vangl2 и Fz3 соответствует зоне контакта между опорной и волосковой клеткой и особенно сильно для наружных волосковых клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что Vangl2 и Fz3 действительно локализованы на мембранах обоих типов клеток.Клетки IPh, а также IPs и Ops, по-видимому, экспрессируют Vangl2 и Fz3 как проксимально, так и дистально, тогда как клетки Дейтерса (D1-D3), по-видимому, имеют только дистальную экспрессию. Scrb1 экспрессируется во всех типах клеток.

    Эта гипотеза убедительно подтверждается наблюдением потери асимметрии Vangl2 как у мутантов Celsr1 Crshh/Crshh , так и у мутантов Scrb1 Crc/Crc . В частности, у мутантов Scrb1 Crc/Crc асимметрия Vangl2 утрачивается в ОНС, расположенных во 2-м и 3-м рядах, тогда как асимметричное распределение Vangl2 сохраняется в опорных клетках в ряду ВВК и первом ряду ОГК.Потеря асимметрии Vangl2 в рядах 2 и 3 OHC точно коррелирует с нарушением PCP в Scrb1 Crc/Crc , которое также ограничено рядами 2 и 3 OHC (Montcouquiol et al., 2003). Сходным образом, существует более распространенная потеря асимметрии Vangl2 у Celsr1 Crsh/Crsh , что коррелирует с большей степенью нарушения PCP (Curtin et al., 2003). Наконец, сравнение тяжести дефектов PCP при мутациях, при которых асимметрия Vangl2 утрачена ( Scrb1 Crc/Crc или Celsr1 Crsh/Crsh ), по сравнению с мутациями при полной утрате белка Vangl2 ( Vangl Lp/Lp ) предполагает, что локализованный в мембране Vangl2 сохраняет некоторую способность генерировать поляризующий сигнал даже в отсутствие асимметричной локализации, потому что общее нарушение PCP больше у мутантов Vangl2 Lp/Lp .

    Взаимодействия между Vangl2 и Scrb1 необходимы для асимметричной локализации

    Результаты, представленные здесь, также демонстрируют новую роль Scrb1 в формировании асимметрии белка. Анализ различных делеционных конструкций показывает, что последние три домена PDZ Scrb1 непосредственно взаимодействуют с С-концевым доменом, связывающим PDZ Vangl2, и что это взаимодействие необходимо для асимметричной локализации Vangl2. Интересно, что Vangl2 все еще нацелен на мембрану у мутантов Scrb1 Crc/Crc , хотя PDZ3 и PDZ4 утрачены.Однако, поскольку PDZ2 также взаимодействует с Vangl2, кажется возможным, что Scrb1 Crc все еще сохраняет некоторую функцию.

    Drosophila scrb ограничивает локализацию белков апикальным клеточным компартментом во время генерации апикально-базальной полярности, но результаты, представленные здесь, предполагают, что Scrb1 млекопитающих также может нацеливаться или поддерживать белки в специфической области мембраны. Планарная полярность и апикально-базальная полярность, вероятно, являются сопутствующими процессами, разделяющими молекулы и молекулярные каскады.Недавняя статья показала существование взаимодействия между Drosophila PALS-1, ассоциированным белком плотного соединения, белком из апикальной маргинальной области соединения, и fz1 в глазу Drosophila , предполагая, что молекулы, необходимые для апикально-базальной полярности и планарной полярности могут взаимодействовать (Djiane et al., 2005). В другой недавней статье проанализировано взаимодействие trilobite (tri)/stbm (аллель рыбок данио Vangl2) и scrb1 (Wada et al., 2005). Авторы полагают, что два белка могут образовывать функциональный комплекс, в котором tri/stbm может быть необходим для локализации scrb1 в специфическом месте мембраны, в котором они закреплены и функционируют.В нашем исследовании нарушение асимметрии Vangl2 у мутантов Scrb1 crc/crc предполагает, что Scrb1 может быть необходим для нацеливания или поддержания Vangl2 в специфической области клеточной мембраны. Присутствие четырех доменов PDZ в С-концевом хвосте Scrb1 убедительно свидетельствует о существовании большого молекулярного комплекса, включающего один или несколько дополнительных белков. Эти белки могут действовать в координации с Scrb1, чтобы контролировать асимметричную локализацию Vangl2. В будущем было бы важно идентифицировать такие молекулы и их потенциальную роль.

    Celsr1 требуется для асимметричной локализации Vangl2

    Демонстрация того, что Celsr1 необходим для рекрутирования Vangl2 на мембрану, согласуется с ролью Flamingo у Drosophila . Было показано, что Flamingo действует на вершине иерархии каскада PCP и отвечает за рекрутирование мембраны других белков PCP, включая fz и stbm/vang (Strutt, 2001; Basstock et al., 2003). Кроме того, недавнее исследование показало, что курица celsr1 становится асимметрично локализованной как на проксимальном, так и на дистальном краях развивающихся волосковых клеток базилярного сосочка курицы, функционального эквивалента улитки (Davies et al., 2005). Наконец, важно учитывать, что у нас, вероятно, нет полного понимания роли Celsr1 во внутреннем ухе. Геном млекопитающих содержит три отдельных гена Celsr , все из которых экспрессируются в улитке (Shima et al., 2002). Кроме того, аллель Celsr1 Crsh представляет собой точечную мутацию в одном из внеклеточных повторов кадгерина и, следовательно, скорее гипоморфен, чем полностью утратил функцию. В соответствии с этой гипотезой, общее нарушение PCP в улитке Celsr1 Crsh/Crsh не столь резкое, как у Vangl2 Lp/Lp (Curtin et al., 2003; Montcouquiol и др., 2003).

    Fz3 локализован асимметрично и взаимодействует с Vangl2

    Результаты, представленные здесь, наряду с результатами, представленными Wang et al. (2006), идентифицируют Fz3 и Fz6 как ключевые регуляторы PCP в улитке млекопитающих. Как обсуждалось, Fz3 и Fz6 имеют сильную структурную гомологию с Drosophila fz, fz, который регулирует PCP, а делеция Fz3 и Fz6 приводит к дефектам PCP во внутреннем ухе (Wang et al., 2006). Однако расположение Fz3 на проксимальных краях развивающихся волосковых клеток и зависимость от Vangl2 для этой асимметрии заметно отличаются от результатов, полученных на Drosophila . Кроме того, демонстрация физического взаимодействия между Vangl2 и Fz3 указывает на то, что потеря асимметрии Fz3 в отсутствие Vangl2 является результатом нарушения этого физического взаимодействия, а не вторичным эффектом общего нарушения клеточной поляризации. В предыдущей статье было показано, что MAGI-3 (ассоциированная с мембраной гуанилатциклаза с инвертированной ориентацией-3) может функционировать как каркасный белок для Fz4 и Vangl2, регулирующий N-концевой протеинкиназный каскад c-Jun.Однако, в то время как авт. идентифицировали прямое взаимодействие между MAGI-3 и Fz4 или Fz7, никакого взаимодействия не было продемонстрировано ни между MAGI-3 и Fz3 или Fz6, ни между Fz4 и Vangl2 (Yao et al., 2004).

    Наблюдение, что Fz3 (и, возможно, Fz6) колокализуется и взаимодействует непосредственно с Vangl2, указывает на фундаментальные изменения в молекулярных механизмах, которые регулируют PCP между позвоночными и беспозвоночными. Более того, это наблюдение противоречит недавней демонстрации того, что Dvl2 локализуется на дистальных мембранах развивающихся волосковых клеток (Wang et al., 2005), если только другие рецепторы Fz не присутствуют на дистальной стороне волосковых клеток. Однако результат Dvl2 был получен с использованием трансгенного животного, а не локализации эндогенного белка, и поэтому, вероятно, требует дополнительного изучения.

    Таким образом, представленные здесь результаты демонстрируют ключевую роль асимметричной локализации белка Vangl2 в образовании PCP в улитке млекопитающих. Мы также обнаружили новые взаимодействия между Fz3, Vangl2 и Scrb1 и существование белковых комплексов.Нацеливание этих комплексов на специфические границы внутри развивающегося уха может генерировать направленный вектор, который будет диктовать последующую поляризацию каждой клетки внутри структуры. Эти данные показывают, что, хотя многие аспекты передачи сигналов PCP сохранились у беспозвоночных, на клеточном уровне произошли значительные изменения с точки зрения того, как на самом деле генерируется поляризующий сигнал и как этот сигнал затем управляет фактической поляризацией конкретной клетки у млекопитающих.

    Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.